SE463459B - Vektor innehaallande dna-sekvens kodande foer ett ytantigen hos hepatit b virus - Google Patents

Vektor innehaallande dna-sekvens kodande foer ett ytantigen hos hepatit b virus

Info

Publication number
SE463459B
SE463459B SE8102726A SE8102726A SE463459B SE 463459 B SE463459 B SE 463459B SE 8102726 A SE8102726 A SE 8102726A SE 8102726 A SE8102726 A SE 8102726A SE 463459 B SE463459 B SE 463459B
Authority
SE
Sweden
Prior art keywords
ser
leu
pro
thr
gly
Prior art date
Application number
SE8102726A
Other languages
English (en)
Other versions
SE460727B (sv
Inventor
F Galibert
P Tiollais
P Charnay
Original Assignee
Pasteur Institut
Inst Nat Sante Rech Med
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from FR7921811A external-priority patent/FR2464269B1/fr
Application filed by Pasteur Institut, Inst Nat Sante Rech Med filed Critical Pasteur Institut
Publication of SE460727B publication Critical patent/SE460727B/sv
Publication of SE463459B publication Critical patent/SE463459B/sv

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/29—Hepatitis virus
    • A61K39/292—Serum hepatitis virus, hepatitis B virus, e.g. Australia antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10111—Atadenovirus, e.g. ovine adenovirus D
    • C12N2710/10134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/808—Materials and products related to genetic engineering or hybrid or fused cell technology, e.g. hybridoma, monoclonal products
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/82—Proteins from microorganisms
    • Y10S530/826—Viruses
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/22—Viral peptide or viral protein
    • Y10S930/223—Hepatitis related

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

BS 2 46šerfi1ä9av viruset. Denna svårighet har redan delvis kringgåtts, mera speciellt vad beträffar serotypen ayy. Hela DNA (cellupp- byggnad) från viruset har identifierats och klonats, speciellt i E. coli, efter en inledande insättning därav på den unika po- sitionen EcoRI av en vektor lgt.WES. AB, enligt tekniken av FRITSCH A., POURCEL C., CHARNAY P. et TIOLLAIS P. (1978) C.R.
Acad. de Paris, 287, l 453-1 456).
Idag är sekvensen för polypeptiderna I och II desamma, varvid lokaliseringen i viral DNA i den sekvens, som kodar dessa peptider, inte har realiserats.
Syftet med uppfinningen är att åstadkomma en DNA-sekvens som är mycket kortare än den virala DNA i sig själv, innehållan- de den sekvens som är lämpad för kodning av den peptidsekvens som ger de immunogena egenskaper som, när den införes i organism- en till ett levande värddjur, möjliggör inducering av framställ- ning av det sistnämnda antikroppar med förmåga att så småningom skydda samma värddjur mot virala hepatit B-virus, speciellt när detta befinner sig i virulent tillstånd.
Uppfinningen härrör inte enbart från den fullständiga nu- kleotidanalysen av celluppbyggnaden av Dane-partikeln, vilken föreliggande uppfinnare har utfört, utan från den idé som de har haft för att identifiera den gen (i fortsättningen benämnd "gen S9) som kodar nämnda polypeptider, att undersöka i den sålunda förut fastlagda fullständiga nukleotidstrukturen efter cellupp- byggnaden av Dane-partikeln, av sekvenserna för de nukleotider, som uppvisar förmåga att koda de för dessa polypeptider kända proximala och terminala sekvenserna.
Det är känt, att Peterson och medarbetare har rapporterat, speciellt i de ovan omtalade artiklarna, att den proximala se- kvensen (första N-terminala aminosyra) för de 15 första amino- syrorna i princíp analyserades enligt följande: met glu asn ile thr-ser gly phe leu gly pro leu leu val ser och att den terminala sekvensen för samma polypeptider (sista C-termínala aminosyra) var följande: val tyr ile.
Figur 1 visar en schematísk bild av celluppbyggnaden för Dane-partikeln. Denna omfattar två trådar, fibrer eller strängar bl och bz, varvid den kortaste av dessa (bz) normalt är blottad i den del som representeras av en streckad linje på ritningen. _I\ 10 15 20 3 465 459 Det är känt, att denna DNA innefattar enbart ett säte EcoRI.
Pilen fl anger riktningen för numreríngen av de nukleotider, av vilka den längsta tråden bl består, och pilen fz anger rikt- ningen för transkriptíonen av viruseß DNA, speciellt av cell- maskineriet för de celler, i vilka hepatit B-viruset intränger, vilket uttrycket gen S har avseende på.
Sätet eller stället EcoRI kan sålunda numreras 0 eller,som man nu har bestämt på ett mera exakt sätt för hepatit B-virus tillhörande serotyp axy, 3182.
Den heldragna inre cirkeln g ger skalan i procent för längden av DNA och gör det möjligt att precisera positionerna för vissa av dess delar.
Siffrorna 3", 5'och 5', 3' i den inre delen av bilden gäl- ler de terminala ändar som är bärare av samma siffror i de kon- ventionella bilderna av ändarna av nukleinsyrakedjor.
Enligt uppfinningen har det visats att "gen S" i huvudsak utgjorde det längsta fragmentet av tråden bl beläget mellan po- sitionerna 73,6 och 95,1 i den schematiska bilden visad i figur l. Pörkortningarna "Start" och "Stop" visar punkterna för början och slutet av transkriptionen av "gen S".
Figurerna ZA, ZB och ZC är representativa för den termina- la delen av nämnda celluppbyggnad, belägen speciellt mellan po- sitionerna 60,4 och 100 (i procent av längden av DNA). Var och en av bokstäverna i figur 2 motsvarar på konventionellt sätt nå- gon av de fyra nukleotider som utgör basen för DNA: A: Adenin G: Guanin T: Thymín C: Cytosin De nedre linjerna i varje par av linjer, varav figurerna 2A, ZB och ZC består, motsvarar den nukleinsyra som svarar mot nukleotidkedjan bz.
Den analysteknik som har använts för att fastlägga den mera detaljerade bild, som figurerna ZA, ZB och ZC visar, kommer kort- fattat att beskrivas nedan.
Karakteriseringen av nukleotidsekvensen för “gen S", så- som den gäller inom ramen för föreliggande uppfinning, och vars proximala ändar p "S" och terminala ändar t "S" anges i figurerna ZA, ZB och ZC, resulterar i ett konstaterande av att: 10 15 20 55 465 459 - de 14 första tripletterna (i riktningen för pilen fz) utgående från nukleotiden numrerad 3030 relativt den termi- nala änden EcoRI, uppvisar förmåga att koda respektive 14 första aminosyror i den proximala sekvensen för de 15 första aminosyror- na i nämnda polypeptider: * - de 4 sista tripletterna GTA TAC ATT TAA som kan läsas på komplementkedjan bz till kedjan transkriberad bl motsvarar = respektive 3 terminala aminosyror i nämnda polypeptider och ett slutkodon; - denna nukleotidsekvens (678 nukleotíder) innefattar inte något slutkodon, åtminstone om man godkänner den lektyr som anger att den första tripletten "läst" på DNA av cellmaskif neriet är AUG (motsvarande komplementtråden till ATG); - den fullständiga översättningen av den genetiska in- formation som börjar med det ursprungliga ATG-kodonet leder till en teoretisk polypeptid med 226 aminosyror och med en molekyl- vikt av 25 422 dalton.
Nukleotidstrukturen för "gen S" liksom polypeptidkedjan härrörande från översättningen av "gen S" visas i figurerna SA, 3B och SC.
Dessa värden är helt och hållet överensstämmande med an- givna analysvärden, som härrör från den elektroforetiska rörlig- heten hos polypeptid I i polyakrylamidgeler och som tidigare har beskrivits av de angivna författarna (referenserna 9-12 enligt den bibliografi som återfinnes i slutet av föreliggande beskriv- ning).
Den observerade skillnaden vid nivån för den femtonde ami- nosyran i den proximala peptidsekvensen för polypeptid I: leucin enligt figurerna 2A, ZB, 2C och 3A, 3B, SC omtalade ovan, och ej serin enligt vad nämnda författare har konstaterat, kan må- hända tillskrivas det faktum att dessa författare har arbetat med en annan genetisk variant än den som har varit föremål för föreliggande studium. Man kan konstatera, att skillnaden för öv- rigt kan anges som substitution av en enda nukleotid i triplet- ten "TTA" i "S-genen", som speciellt visas i figurerna ZA, ZB och ZC, och 3A, 3B, 3C istället för "TCA", den ena av tripletter- na med förmåga att undergå translation till serin.
Uppfinníngen avser sålunda mera speciellt en vektor enligt patentkraven 1-4 innehållande de nukleinsyrafragment som kan 10 15 20 ¿“,Z5 40 5 463 459 skäras av från DNA i Dane-partikeln, varvid dessa fragment mera speciellt utmärkes av att de innehåller den del av "S-genen" som uppvisar förmåga att koda den del av proteinet i virusets hölje som är ansvarig för de ímmunologíska egenskaperna hos hepatit B-virus.
Sålunda hänför sig uppfinningen till en vektor innehållande en nukleinsyra innefattande högst av storleksordningen 1000-1100 nukleotíder, varvid den mera speciellt utmärkes av att den är lämpad, eller uppvisar förmåga, att koda en immunogen peptidsek- vens, som i sig självt kan índucera produktion in vivo av anti- kroppar, vilka är aktiva med avseende.på hepatit B-virus, varvid denna peptidsekvens i huvudsak innehåller den i fig. SA, SB, 3C visade strukturen, eller vilken som helst annan peptidsekvens som uppvisar ekvivalenta immunogena egenskaper.
Uppfinningen hänför sig sålunda till en vektor för utveck- ling av nämnda nukleotidsekvens i en mikroorganism eller i eukariotceller med villkor att den genetiska sammanslagningen har åstadkommits under bevarande av fasen för läsning av "gen S".
De enligt uppfinningen använda nukleotidsekvenserna upp- visar i förhållande till varandra en föränderlighet som, under dessas utvnnfing, leder till bildning av variantdeterminanter en- ligt undertypen av hepatit B-virus (undertyperna d, w, y, r, för grupp al- .
För den ena av den i fig. 3A, SB, SC visade peptidsekven- serna kan man observera, att den första aminosyran i nämnda se- kvens: metionin, är N-terminal och att aminosyran i den motsatta änden:isoleucin, är C-terminal.
Uppfinningen avser dessutom mera speciellt den i fig 4A, 4B visade nukleotidsekvensen, som kodar peptidsekvensen såsom den framgår av fig. 5 eller vilken som helst analog peptidse- kvens uppvisande ekvivalenta immunogena egenskaper.
Med det ovan använda uttrycket "ekvivalent peptidsekvens" förstås varje peptidsekvens, i vilken vissa delar inte kan vara fexakt identiska med motsvarande delar i den i fig. 3A, SB, 3C och 5 visade peptidsekvensen, varvid dessa variationer kan be- ro på lokala mutationer, som inte påverkar den generella immuno- gena karaktären hos proteinet, eller på strukturmodifikationer som beror på de olika serotyper, bland vilka proteinerna av i- frågavarande slag år benägna att uppträda (speciellt serumtyperna adw, adr och avr). 10 20 30 463 459 Uppfinningen avser mera speciellt nukleotidsekvensen inne- hållande peptidsekvensen såsom den visas i fig. 6 eller vilken som helst analog peptidsekvens med ekvivalenta immunogena egenskaper.
Uppfinningen avser närmare bestämt följande peptidsekvenser: Alanin~Glutamin-Glycin-Treonin-Serin Treonin-Alanin-Glutamin-Glycin-Treonin-Serin Treonin-Treonin-Alanin-Glutamin-Glycin-Treonin-Serin I den första av de ovan angivna peptiderna är alaninänden N-terminal och serinänden C-terminal.
I den andra och tredje av de angivna peptiderna är treonin- änden N-terminal och serin-änden C-terminal.
Som exempel kan nämnas att man speciellt kan framställa pentapeptiden utgående från den C-terminala serinen, till vilken man kopplar treoninen medelst metoden av Castro beskriven i Tëtra- hëdron Letters, 1975, nr 14, sid 1219-1222. Därefter kopplar man på aminosyrorna glycin, glutamin och alanin enligt metoden kallad repeterad blandanhydrid (metod rema) och beskriven av Beierman i Chemistry and Biology of Peptides, Ed. J. Meienhofer, Ann. Arbour Science Publ., Ann. Arb. Mich. 351 (1972).
Pentapeptiden kan ge produkter som är resultatet av fixe- ring av pentapeptiden vid en större bärarmolekyl, speciellt av polypeptid- eller proteintyp, kompositioner innehållande denna pentapeptíd i fixeríngsprodukter, speciellt tillsammans med en farmaceutiskt acceptabel bärare, och mera speciellt vacciner mot hepatit B. Dessa farmaceutiska bärare år pà känt sätt lämpade för det valda administratíonssättet, speciellt för den orala, parenterala eller rektala vägen eller medelst nebulisation genom slemhinnor, speciellt näsans.
Hexapeptiden och polypeptíden med sju aminosyror kan syn- tetiseras medelst kända metoder för peptidsyntes.
Dessa peptider är hållna för att vara det antigena sätet eller reaktionsstället i de ovan omtalade polypeptiderna av större storlek och ansvariga för vaccineringsförmågan hos virushöljet (Journal of Biol. Stand. 1976, 5, 295-304, RAO och VYAS "Bio- chemical Characterization of Hepatitis B Surface Antigen in Relation to Serologic Actívity").
De DNA-fragment som uppvisar förmåga att koda produktionen av sådana pentapeptider, hexapeptider och polypeptider med sju aminosyror är: 10 15 20 35 7 465 459 - för pentapeptiden, speciellt polynukleotiden med formeln: 5' GCT CAA GGA ACC TCT 3' 3' GGA GTT CCT TGG AGA 5' - för hexapeptiden, speciellt polynukleotiden med formeln: 5' ACT GCT CAA GGA ACC TCT 3' 3' TGA CGA GTT CCT TGG AGA 5' - för polypeptiden med sju aminosyror polynukleotiden med formeln: 5' ACT ACT GCT CAA GGA ACC TCT 3' 3' TGA TGA CGA GTT CCT TGG AGA 5' eller i vart och ett av dessa tre fall, den polynukleotid som är komplementär i förhållande till respektive av de föregående tre polynukleotiderna, eller varje polynukleotid, i vilken var och en av trípletterna kan ersättas med varje analog triplett med förmåga att koda produktionen av samma_aminosyra.
Nukleinsyran kan vidare karakteriseras av att den innefat- tar åtminstone en av de båda trådar som inbördes kompletterar varandra i en DNA-sekvens såsom representeras i fig. 4A, 4B (i vilka figurer siffrorna likaså motsvarar positionerna för de första nukleotiderna i vart och ett av de på varandra följande fragmenten av tio nukleotider representerade gentemot position EcoRI som ej visas i figuren: det är självklart att dessa tal inte stör nivån för karakteriseringen av nukleotidsekvensen av ifrågavarande slag). Detta DNA-fragment begränsas av två Híncll- -ställen. A Det torde sålunda observeras, att denna nukleotidsekvens motsvarar den genetiska information vars translation leder till den i fig. S representerade peptidsekvensen.
På sedvanligt sätt möjliggör de ekvivalenta nukleotidsek- venserna med enkeltrâd eller dubbla trådar, varav speciellt trå- den med den struktur som framgår av följden av nedre rader i fig. 4A, 4B, DNA med motsvarande dubbeltråd, eller motsvarande messenger-RNA, speciellt den som representeras av de komplemen- tära sammanlänkningarna av nukleotider som utgöres av de nedre linjerna av de olika par av linjer som finns i fig. 4A, 4B (rikt- ningen för pílen fz).
På samma sätt ligger inom uppfínningens ram de nukleotid- kedjor som skiljer sig från de föregående genom vissa triplet- UI 10 15 20 30 bl Un 463 459 ter eller små sekvenser av tripletter, under förutsättning att dessa nukleotidsekvenser fortfarande uppvisar förmåga att koda en polypeptid under bevarande av de immunogena aktiviteter som är karakteristiska för viralt hepatit B-virus. Generellt rör det sig om kedjor av nukleotider som, om så erfordras, efter denature- ring av dubbelsträngad DNA för framställning av nukleinsyror med motsvarande enkelsträng fortfarande uppvisar förmåga att hybri- diseras över åtminstone cirka 90% av sin längd med en av DNA- -trådarna eller -strängarna i figurerna 4A,_{§¿_ Föredragna nukleinsyror är de som kan utskäras ur DNA från viral hepatit och som, när de har dubbla strängar, utmärkes av närvaro i den ena av sina ändar av en ytterände Hincll Hhal, Aval eller EcoRI och på sin andra kant av en ytterände AvaIII, HíncII eller Hhal.
Positionerna för dessa olika ytterändar relativt sätet EcoRI är schematískt återgivna i fig, ZA, ZB, ZC.
Nukleinsyran är avsedd att införlivas i en vektor som till- låter expression därav i en bakterie och i eukariotceller speci- ellt i syfte att producera ett protein eller en peptid med för- måga att i organismen till en levande värdcell inducera produk- tion av antikroppar, vilka är aktiva mot viralt hepatit B-virus.
Proteinet eller peptiden härfiïande från translatíonen av nukleo- tidsekvensen enligt uppfinningen kan användas som vaccinerings- medel eller som medel för användning inom diagnostiken. g Nukleinsyran kan likaså användas som sond eller detektor för att i blodprover eller serumprov påvisa närvaro av Dane-par- tikeln, HBs-antigen eller fragment av detta, etc. (medelst klas- sisk teknik för hybridisering DNA-DNA).
Andra utmärkande drag för uppfinningen kommer att fram- gå av den beskrivning som nu följer av metoder för analys, iden- tifiering och produktion av DNA-fragment enligt uppfinningen.
Härvid kommer naturligtvis att hänvisas till bifogade ritningar, för vilka gäller att figurerna redan har presenterats ovan. Siff- rorna inom parentes hänför sig till de bibliografiska referenser som återfinns i slutet av beskrivningen.
Uppfinningen hänför således till speciella vektorer, som möjliggör expression av de ovan omtalade nukleotidsekvenser- na, speciellt i form av ett hybridprotein, i vilket ett protein- 4 A» 10 15 20 .zs 465 459 fragment, som uppvisar den immunologiska karaktären för HBsAg, är anordnat nära eller kopplat till en bärarmolekyl som bibring- ar aggregatet immunogena eller immunoreaktiva egenskaper, med förmåga att inducera produktion av skyddande antikroppar med av- seende på viral infektion i organismen hos värdcellen, i vilken detta protein tidigare har introducerats.
Speciellt avser uppfinningen en vektor - fag eller plas- mid - innehållande åtminstone en del laktosoperon, mera speciellt ,promotorn och Z-genen i denna operon, varvid denna vektor utmär- kes av att den är modifierad för insättning eller införsel, i fas, i ett lämpligt säte av Z-genen, såsom sätet EcoRI hos vilken som helst av DNA-fragmenten enligt huvudpatentet, spe- ciellt de som innehåller den största delen av "S-genen". Den hänför sig likaså till de av dessa modifierade vektorer, i vil- ka åtminstone en del av det DNA-fragment som kodar den största delen av B-galaktosidaset är ersatt med ett DNA-fragment med förmåga att koda för varje annan icke immunogen bärarmolekyl, eller vars eventuella immunologiska egenskaper, om sådana exi- sterar, inte stör egenskaperna för den peptiddel som uppvisar de immunologiska egenskaperna för HBsAg, till exempel i huvudsak den som utbreder sig i läsriktníngen utgående från dess säte Hhal.
Uppfinníngen möjliggör framställning av ett hybridpro- tein, som utmärkes av att det innehåller en polypeptídsekvens uppvisande de specifika immunologiska egenskaperna för HBsAg, nära en polypeptidsekvens, vilken utgöres av huvuddelen av ß-galaktosidase, som spelar rollen som proteinbärare.
Härmed avses emellertid inte enbart denna speciella hybridmolekyl, vars väsentliga roll är att utgöra en modell av ett protein konstruerat enligt genetisk fackmannateknik och upp- visande immunogena och immunoreaktiva egenskaper, vilka är ka- rakteristiska för antigenet HBsAg, utan även vilket som helst annat hybridprotein, i vilket hela eller en del av dess B-ga- laktosidasparti kan ersättas med vilken som helst annan icke immunogen bärarmolekyl, eller vars eventuella immunologiska egen- skaper, om sådana existerar, inte stör egenskaperna för den pep- tiddel som uppvisar de immunologiska egenskaperna för HBsAg.
Andra kännetecken för uppfinningen kommer att framgå av nedanstående beskrivning av föredragna utföringsexempel i kom- bination med ritningarna, på vilka: 10 463 459 - figurerna la och lh schematiskt illustrerar de successiva stegen för framställning av en vektor av plasmidtyp under inför- livande av ett fragment av HBV DNA, - figurerna Za och 2c schematiskt illustrerar de ursprung- liga strukturerna för den använda vektorn (figur Za) den slutli- gen erhållna modifierade vektorn (figur Zb) och den för det hy- bridprotein som blir resultatet av expression av denna modifie- rade vektor i E.coli (figur Zc).
A NUKLEOTIDSEKVENSER Använda produkter och metoder - Anxäafïs. sflavae: ash kemiska nfsdakzß: De använda restriktionsenzymerna: BamHI, Hhal, Hincll, HaeIII, Xbal, Mbol, Hinfl, Hpall, Xhol, är de som tillverkas av Biolabs. Man använder DNA-polymeras I från Boehringer. Det alkaliska bakteriefosfataset och polynukleotid-kínaset erhölls från P.L. Biochemicals. De kemiska medlen var följande: Dimetylsulfat (Aldrich) Hydrazin (Eastman Kodak) Akrylamid och bis-akrylamid (kristalliserad två gånger - SERVA) Dideoxinukleotidtrifosfater och deoxinukleotidtrifostater (P.L. Biochemicals), Piperidin (Merck) omdestillerad under vakuum, - šramstëllning av_DNA;H§Y_ Hela HBV-gencelluppbyggnaden (undertyp avg) klonades i E. coli under utnyttjande av det unika restriktionssätet EcoRI (för vektorn Ägt.WES. ÄB (14). Denna klonade DNA benämnes i fort- sättningen"Eco HBV DNA". ' Rekombinantbakteriofagen utvecklades i Petriskâl på agar och erhållen DNA utvanns på känt sätt. Efter digestion av DNA med restriktionsenzymet EcoRI renades sekvensen Eco HBV DNA ge- nom ultracentrífugering, i en sukrosgradient, enligt tekniken beskriven i de bibliografiska referenserna (16, 17).
- Efamåfšllflifls avßfikfzflsmsfl: mä:1<.ta_SL3fP_ 10 till 20 pikomol av Eco HBV DNA hydrolyserades fullstän- digt av de olika restriktionsenzymerna, under de betingelser som rekommenderas av fabrikanten. DNA-fragmenten defosforylerades med alkaliskt fosfatas, vilket sedan inaktiverades genom en alka- líbehandling. DNA utfälldes sedan i etanol, enligt den teknik 10 15 20 30 11 465 459 som beskrivs i artikel (18). Efter återupplösning i en buffert baserad på spermidin märktes DNA i sina ytterändar 5' med en ATP [Ä32p] (3000 Cí/mM tillverkad av New England Nuclear) och med polynukleotid-kinas (enligt tekniken beskriven i artikel (19).
Restriktionsfragmenten av DNA separerades genom elektro- fores på polyakrylamidgel och eluerades därefter. De märkta ytterändarna avsöndrades genom elektrofores på polyakrylamid- gel på i och för sig känt sätt, efter restriktion med ett annat enzym eller genom denaturering av DNA-fragmenten av ifrågavaran- de slag. ' §eštÉmEíE3_aI åtluktäfån.fÉï_nEkÄe2tldâeÄVÉnåeIUå Å ÉNÉ Primärstrukturen för fragmenten av DNA med dubbelsträng eller enkelsträng bestämdes i huvudsak medelst tekniken beskri- ven av Maxam och Gilbert (19). Vidare användes metoden med ter- minala kedjeinhibitorer beskriven av Sanger et al (20) och till- lämpad av Maat och Smith (21), vad beträffar de dubbelsträngade fragmenten märkta i en av sina ytterändar 5”.
Produkterna av den kemiska och enzymatiska reaktionen ana- lyserades genom elektrofores i geler med akrylamidsekvens med 8, 16 eller 25 %, med l mm tjocklek.
Metoder för och resultat av analysen I syfte att bestämma om genuppbyggnaden HBV uppvisar för- måga att koda polypeptiderna I och II märktes samtliga fragment HaeIII (restriktionssäten HaeIII för celluppbyggnaden HBV visa- de í fig. 1 med små pilar) i sina ytterändar 5”. Väsentliga de- lar av deras primärstrukturer bestämdes medelst metoden av Maxam och Gilbert. Nukleotidsekvenserna med förmåga att koda de proxi- mala och terminala aminosyrasekvenserna för polypeptiderna I och II lokaliserades i fragmenten HaeIII E och HaeIII F, tidigare lokaliserade på restriktionsbilden för celluppbyggnaden HBV (enligt tekniken beskriven i referensen (17). Det är dessa nu- kleotidsekvenser som man har ansett utgöra ytterändarna av "gen S", som i sig själva upptar positionerna 73,6 och 95,1 gentemot restriktionssätet EcoRI (fig. 1) av redan angivna skäl.
Sekvensen av nukleotider mellan dessa båda positioner ana- lyserades under användning av kända kemiska metoder, speciellt med hjälp av metoden med kemisk nedbrytning med hydrazindimetyl- sulfat och metoden för kedjetermineríng. Bland de olika kemiska v _,, r _ 12 465 459 reaktioner som har föreslagits av Maxam och Gilbert utvaldes en partiell rening med myrsyra och spjälkning med piperidin, vilket är metoder som ger band med lika stark intensitet på autoradiogram för de fragment som avslutas av en guanin och en adenin. Likaså användes reaktionerna med hydrazín följda av spaltning med piperidin, för erhållande av band med lika stor intensitet, för nukleotíderna cytosin och tymidin: den elektroforetiska fraktioneringen av produkterna från dessa båda reaktioner ger för samtliga baser en fläck i den ena el- ler den andra av de använda gelkolonnerna. Denna procedur underlättar läsningen av gelautoradiogrammet. Den hydrazin- reaktion i närvaro av natriumklorid som är specifik för cyto- sin gör det möjligt att skilja denna nukleotid från tymidín och reaktionen med dimetylsulfat följd av spjälkning av det specifika piperidinet för guanin gör det möjligt att skilja sistnämnda nukleotid från adenin.
För att man skall försäkra sig om största möjliga grad av precision framställdes distinkta sekvenser av nukleotíder bildande olika fragment, som inbördes överlappar varandra, genom hydrolys av Eco HBV DNA medelst olika restriktions-_ enzymer: BamHi, Hinfl, HpaII, HaeIII och HincII.
På detta sätt bekräftades analysen av var och en av de restriktionssäten som användes som utgångspunkter för de första studerade fragmenten medelst analys av distinkta frag- ment, i vilka restriktionssätena för de första fragmenten be- fann sig mellan de nya ytterändarna av dessa distinkta frag- ment; "gen S" visad i fig. SA, 3B, SC, vilken börjar med initieringskodonet ATG innefattar 227 tripletter, varav ett slutkodon TAA. De tre kodoner, som svarar mot de tre amino- syrorna i den terminala karboxiänden av motsvarande polypep- tid, är belägna inom samma läsområde eller -ram, omedelbart före slutkodonet TAA. Den ena av de båda andra läsområdena (borttagna från det föregående med l resp. 2 nukleotider) är likaså utblottad på slutkodon men kodar ett helt och hållet annorlunda protein av ovannämnda polypeptider I och II. Det tredje läsområdet innefattar 10 slutkodoner (5 TAG, 4 TGA, 1 TAA). I den andra DNA-strängen befinner sig de tre läsom- 10 15 20 25 30 13 463 459 rådena stängda av respektive 11, 11 och 6 stoppkodoner för- delade längs DNA-sekvensen.
Såsom redan har angivits ovan leder den fullständiga translatíonen av den genetiska information som börjar med initieringskodonet ATG till en teoretisk polypeptíd med 226 aminosyror, vilket motsvarar en molekylvikt av 25 422 dalton.
Det bör betonas, att nukleotidfrekvensen motsvarande "gen S" normalt borde läsas helt och hållet under transla- tionen.
Inom uppfinningens ram ligger även nukleotidkedjor av den ovan beskrivna typen "gen S", vilken omfattar små komplet- terande sekvenser, vilka kan innehålla upp till ett hundratal nukleotíder eller vilka tvärtom kan vara utarmade därpå, utan att motsvarande genetiska information förändras (22, 23).
De olika fragment av uppfinningen som har definierats ovan kan erhållas utgående från DNA-frekvensen benämnd Eco HBV DNA, under utnyttjande av motsvarande restriktionsenzymer och av fraktioneringsmetoder kända för DNA-fragment, speciellt på en polyakrylamidgel och under utnyttjande aüzde migrerar eller vandrar vissa avstånd, som är funktioner av deras mole- kylvikt. Sålunda kan man t.ex. erhålla det fragment, vars ena ytterände är begränsad av ett säte EcoRI och vars andra är be- gränsad av ett säte AvaIII under utnyttjande av en restriktion_ Eco HBV DNA med enzymet AvaIII, varvid det sökta fragmentet består i det minsta erhållna fragmentet (ett enda säte AvaIII i Eco HBV DNA).
Det fragment, som avgränsas av de motsatta ytterändarna EcoRI och Hhal, erhålles genom att man först utför hydrolys av Eco HBV DNA med EcoRI och därefter utför partiell hydrolys med restriktionsenzymet Hhal. Man utvínner därvid bland re- striktionsprodukterna den som innehåller sätet av AvaIII.
Dessa restríktionsmetoder har naturligtvis enbart beskri- vits i exemplifierande syfte, då det är uppenbart att fack- mannen på området är i stånd att bestämma ordningsföljden för behandlingen med restriktionsenzymerna för isolering, speci- ellt utgående från Eco HBV DNA, av de fragment som har de an- vända restríktionsytterändarna.
Det kan tilläggas att för alla använda tillämpningar dessa restriktionsoperationer kan utföras i en 10 mM Tris- 14 465 459 10 15 20 ZS 30 -buffert; pH 7,8; MgCl 2 6 mM; B-merkaptoetanol 6 mM, varvid samma medium dessutom och företrädesvis innehåller 50 mM NaCl, när EcoRI användes.
Såsom redan har omtalats, avser uppfinningen användning av de beskrivna DNA-fragmenten som reagens, vilka möjliggör diagnostik av närvaro i ett serum av Dane-partiklar eller partiklar härledda därifrån, uppburna av en DNA med förmåga att koda ett immunogent protein som är karakteristiskt för hepatit_B.
Ifrågavarande DNA enligt uppfinningen kan likaså inför- livas i en vektor, vilken tillåter, under förutsättning att införlivandet har åstadkommits i fas, expression av denna DNA i en bakterie eller annan mikroorganísm eller i eucaryot- celler.
B - 'VEKTORER INNEHÅLLANDE EN NUKLEOTIDSEKVENS AV ANTIGENET HBs;__ Konstruktion av en bakteriofag som rekombinerar Älak HBs-l Produkterna för nivån för de olika stegen i denna kon- struktion âskådlíggörs i fig. la och lh. De är likaså angivna med beteckningarna la till lh.
I fig. la har positionerna för "gen S" och för vissa restríktionsenzymsäten angivits.
Efter behandling av DNA + HBV med restriktionsenzymet Hhal separerar man ett fragment av DNA (lb) innehållande l 084 par baser, och mera speciellt hela "gen S", genom elektro- fores med en agarosgel och elektroeluering (fig. lb). Man fram- ställer utgående från detta underfragment, som i förväg har behandlats med endonukleaset Sl, ett underfragment (lc) (fig. lc), som härrör från förlängning av underfragmentet (lb) i dess ytterändar med DNA-element betecknade "EcoRI linkers" med formeln: 5' GGAATTCC CCTTAAGG 3' Det erhållna fragmentet klonas, efter bildning av de ko- hesiva ytterändarna EcoRI, i plasmiden pBR322.
Den erhållna plasmiden, vilken nedan benämnes pBRHBs (fig. ld) innehåller ett enda restriktionssäte Xbal beläget i närheten av huvudet av “gen S".
Genom sönderdelning av den rekombinerande plasmiden 10 15 20 25 30 35 15 463 459 pBRHBs med en blandning av enzymer EcoRI och XbaI produceras ett DNA-fragment innehållande approximativt 980 baspar och omfattande huvuddelen av "gen S" (fig. le). Detta fragment av- Åskiljes och renas genom elektrofores över en agarosgel. Det erhållna fragmentet behandlas på nytt med endonukleaset S1 och förses därefter på nytt med ytterändar EcoRI med hjälp av nämnda "EcoRI linkers" och utsättes sedan för en behandling med endonukleaset EcoRI för återbildning av motsvarande ko- hesiva ytterändar. Fragmentet i fig. le, vilket innefattar ca 980 baspar, ínjíceras sedan genom smältning in vitro i sätet EcoRI i plasmiden pBR322, till bildning av plasmiden pXbaHBs (fig. lf). Denna plasmid klonas på vanligt sätt såsom plasmi- den pBR322.
Ett flertal kloner har erhållits.
Man extraherar och renar, efter behandling med EcoRI av DNA för tre av dessa kloner, pXbaHBs-l, pXbaHBs-2, pXbaHBs-3 (fig. lg), de fragment som nedan kommer att benämnas "HBS-fragment" (fig. lh).
Nukleotidsekvenserna för ytterändarna av dessa fragment (som normalt erhålles i det inre av "S-genen") bestämmes under användning av proceduren beskriven av MAXAM och GILBERT (Proc.
Nat. Acad. Sci. USA li, 560-564 (1977). har visat, att nukleotídsekvenserna i de terminala ändarna, svarande mot "S-genen", inte var identiska i de tre klonerna Dessa bestämningar (fig. lg), varvid skillnaderna sannolikt beror på heterogeni- teter bildade under digestionen med endonukleas-S1.
De båda fragment, som härrör från pXbaHBs-1 och pXbaBHs-2, ínjíceras genom smältning in vitro i celluppbygg- naden av bakteriofagen Äplac 5-l (21), vilken enbart har ett enda säte BcoRI beläget i närheten av ytteränden av lak Z- -genen. Vad beträffar läsningen av genen lak Z, såsom den kan härledas från sekvensen av aminosyror i ß-galaktosidas (23), kan man konstatera - vilket även erfarenheten bekräftar - att införandet av fragmentet HBs från pXbaHBs-1 i sätet EcoRI i genen lak Z från lplac 5-l bör leda till att läsningsfasen bi- behålles adekvat för "gen S". I motsats därtill skulle det komma att visa sig att ett införande av fragmentet HBs från pXbaHBs-2 inte kunde ske i föregående vektor under bibevarande av lämplig läsning. Det har icke desto mindre använts som 16 463 459 10 15 20 25 LI UI bevis vid tidigare utförda försök.
Dessa operationer utfördes under användning av konven- Mera speciellt gäller att "HBs-fragmenten" från pXbaHBs-l, pXbaHBs-2 infördes med hjälp av ett ligas i DNA på lplac EcoRI. De erhållna blandningarna av DNA-fragmenten användes därefter för transfektering av stammen C600RecBC rk_mk_ av E. coli. tionella metoder. 5-1 som tidigare hade utsatts för klyvning med De bakteriekloner som bildade lak- som ett resultat av införandet av HBS-fragmenten i sätena EcoRI av genen lakZ förökades och renades enligt metoden beskriven i (Zl).
DNA från de olika bakteriofagerna utvanns och oriente- ringarna för de införda DNA-fragmenten bestämdes genom elektro- foretisk analys av deras restriktionsfragment BamHI. Man kunde därvid konstatera, att två fager benämnda Ä-lakHBs-1 och AlakHBs-2 svarande mot plasmiden pXbaHBs-l och pXbaHBs-2 inne- höll ett korrekt orienterat HBs-fragment.
Pig. Za är en schematisk bild av vektorn Äplac 5-l före dess modifiering med fragmentet HBs-1 härrörande från pXbaHBs-l.
Pig. 2 är en schematisk bild av en del av samma vektor W visande den modifikation som har introducerats i dess gen Z genom injicering i dess säte EcoRI av nämnda fragment HBs-l.
Pig. 2c visar schematiskt strukturerna för den erhållna hybridpolypeptiden som ett resultat av expressionen av den en- ligt figQ Zb modifierade vektorn.
Expressionen erhölls genom transfektion av en bakterie- stam från E. coli, speciellt en stam HfrA1akX74.
Stammar av E. coli, speciellt en stam av E. coli HfrAlakX74 omvandlades av plac 5-1, ÄlakHBs-l respektive AlakHBs-2. Efter odling utsattes cellerna för lysis och er- hållna lysat analyserades genom elektrofores med en polyakryl- amidgel SDS (24), och proteinerna detekterades genom blåfärg- ning med coomassie. Nan konstaterar närvaro av ett intensivare band bland expressionsprodukterna för Äplac 5-l vid nivån för motsvarande position, för ett jämförelseprov, till den som gäl- ler för 6-galaktosidas (molekylvikt 116 248) och ett distinkt band bland expressionsprodukterna för ÅlakHBs-1 (ej närvarande bland expressionsprodukterna för l1akHBs-2), vilket motsvarar ett nytt protein med en molekylvikt av storleksordningen 135 000-141 000. 10 20 ZS 17 465 459 Proteinerna syntetiserade av bakterierna transfekterade såväl av ÄlakHBs-1 som av Äplac 5-1 märkes med metionin (355). När dessa proteiner bringas i kontakt med ett anti- -HBsAg-serum och ett autoradiogram utföres på en polyakryl- amidgel SDS, kan man bland expressionsprodukterna enbart för AlakHBs-l konstatera närvaro av ett band, vilket inte motsva- ras av något ekvívalent band bland expressionsprodukterna för de övriga vektorerna. Detta band försvinner på ett specifikt sätt när immunoutfällningen åstadkommes i närvaro av icke märkt HBsAg. Man observerar vidare samma band bland expressions- produkterna för ÄlakHBs-l, när immunoutfällningen utföres med ett antiserum med avseende på 6-galaktosidas.
Den antagna strukturen för den del av det erhållna hybrid- proteinet som ligger vid stället för sammansmältning mellan genen lakZ och fragmentet HBs-l framgår av fig. Zc, som visar fragmentet "B-gal", vilket motsvarar B-galaktosidas (1005 aminosyror), fragmentet HBsAg (192 aminosyror), varvid dessa fragment är separerade medelst en aminosyra prolin, som mot- svarar en del av "EcoRI linker" ingående i vektorn ÅlakHBs-l.
C - FURFARANDE FÖR FRAMSTÄLLNING AV EN IMMUNOGEN MOLEKYL UNDER ANVÄNDNING AV VEKTORN ENLIGT UPPFINNINGEN Enligt uppfinningen är det sålunda möjligt att framställa ett protein med lägre molekylvikt än för de ovan omtalade po- lypeptiderna I eller II, och med samma immunogena egenskaper.
Resultaten visar att E. coli, eller vilken som helst annan lämplig mikroorganism, såsom en bakterie eller en kultur av eukaryotceller, kan infekteras med llakHBs-1 och syntetise- ra ett protein med en molekylvikt av storleksordningen 138 000 samt uppvisande de antigena determinanterna för på samma gång HBsAg som ß-galaktosidas. Denna molekyl är representativ för de hybridpolypeptider som kan erhållas medelst förfarandet en- ligt uppfinningen, i vilka HBsAg är bunden till en protein- bärare (härrörande från partíell eller total substitution av fragmentet B-galaktosidas), varvid dessa hybrider icke desto mindre uppvisar de antigena egenskaperna för HBsAg. Dessa nya molekyler är användbara för produktion av vacciner, vilka är aktiva mot viral hepatit B.
Såsom torde vara uppenbart, och såsom framgår av vad som redan har beskrivits ovan, är uppfinningen icke begränsad 465 459 18 enbart till de appliceríngssätt och utföringsformer som har beskrivits mera i detalj; den innefattar tvärt om alla tänkbara varianter därav.
Som bilaga till föreliggande beskrivning följer nu en 5 bibliografi och speciellt de referenser som har omtalats inom ramen för föreliggande uppfinning. 10 15 20 25 30 10 11 12 13 14 lig 1 U 465 45é REFEREN§§g_ siumbesg, s. s. (1977) s :ense 121, 17-25 Dane D. S., Cameron C. H., and Brigss M. (1970) Lancet 1, 695-698 Who Technical Report series, number 602 (1976) Summers J., O'Connel A., and Millman I. (1975) Proc.
Nat. Acad. Sci. USA 12, 4 597-4 601 Hruska J. F., Clayton D. A., Rubenstein J. L. R. and Robinson W. S. (1977) J. Virol. 21, 666-682 Landers T. A., Greenberg H. B. and Robinson W. S. (1977) J. Virol. gå, 368-376 Charnay P., Pourcel C., Louise A., Fritsch A. and Tiollais P. (1979) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 26 2 222-2 226 Dreesman G. R., Hollinger F. B., Surians J. R., Fujioka R. B., Brunschwig J. P. and Melnick J. L. (1972) J. Vírol. 12, 469-476 Gerin J. L. (1974) in Mecanisms of virus disease Ed. W. S. Robinson, C. R. Fox pp 215-24 Menlo Park : W. A. Benjamin Dreesman G. R., Chairez R., Suarez M., Hollinger F. B.
Courtney R. J. and Melnick J. L. (1975) J. Virol. 16, soa-515 " shih J. w. and cerin J. L. (1977) J. viral. _;, 1 219-1 222 Peterson D. L., Roberts I. M. and Vyas G. N. (1977) Proc. Nat. Acad. Sci. USA li, 1 530-1 534 Peterson D. L., Chien D. Y., Vyas G. N., Nitecki D. and Bond H. (1978) in Viral Hepatitis, Ed. G. Vyas, S. Cohen and R. Schmid, The Franklin Institute Press, Philadelphia, 569-573 Fritsch A., Pourcel C., Charnay P. and Tiollais P. (1978) C. R. Acad. Sc. Paris gål, 1 453-1 456 Burrell C. J., Mackay P., Greenaway P. J., (1979) Nature 27 í-:p Eofschneider P. H. and Murray K. 43-47 4655 10 15 20 25 30 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 32 33 20 4559 - Tiollais P., Perricaudet M., Pettersson U. and Philipson L. (1976) Gène 1, 49-63 _ Hérissé J., Courtois G.. and Galibert F. (1978) Gène A, 279-294 - Kroeker W. D. and Laskowski M. S. R. (1977) Anal.
Biochem. 12, 63-72 - Maxam A. M. and Gilbert W. (1977) Proc. Nat. Acad.
Sci. USA 1_, S60-564 - Sanger F., Nicklen S. and Coulson A. R. (1977) Proc.
Nat. Acad. Sci. USA li, 5 463-5 467 - Maat J. and Smith A. J. W. (1978) Nucleic Acid. Res. gj 4 s37_4 545 - Berget S. M., Moore C. and Sharp P. A. (1977) Proc.
Nat. acad. Sci. USA lg, 3 171-3 175 -Chow L. T., Gelinas R. E., Broker T. R., and Roberts J. (1977). cell ¿g. 1-8 Shiraishi H., Kohama T..'Shirachi R. (1977) J. Gen. Virol. åg, 207-210 Struck D. K., Lennarz W. J., Biol. Chem. gâå, 5 786-5 794 Reddy V. B., Thimmappaya B., Dhar R., Zain B. S., Pan J., Celma C. L. (1978) Science ggg, 494-502 Fiers W.. and Ishida N. and Brew K. (1978) J.
Subramanian K. N. and Weissman S. M.' Contreras RJ. de Voorde A., Van Henverswyn H., Volchaerts G. and Ysebaert M. 113-117 Sanger'F2. Air G. M., Barrell B. G., Brown NJ L., Coulson A. R., Fiddes J. C., Hutchison III C. A.. Slocombe P. M. and Smith M.
H977)Nature gåâ, 687-691 Barrell B. G., Shaw D. C., Walker J. E., Godson G. N. and Fiddes J. C. 6, 63-67 Hargeman G., Rogiers R., Van Van Herreweghe J., (1978) Nature 273, Northrop F. D.. (1978) Biochem. Soc.
Trans.
Am. J. Path.
Sninsky J. J..
Cohen S. N..
Valenzuela P. 1. 629-649 (1975) Siddiqui A., Robinson W. S. and Nature glg, 346-348 (1979) et al., Nature gåg, 815-819 (1979) Nucl. Acids Res. 1, 335-346 (1979) Szmuness W..
Charnay P. et al.. 465 459 34 - Galibert F., Mandart E., Fitoussi F., Tiollais P. and Charnay P., Nature lål. 645-650 (1979) 35 - Pasek M. et al., Nature ggg, 575-579 (1979) 36 - Vyas G. N., Williams E. W., Klaus G. G. B. and Bond. H. 5 J. 1mmuno1. igg, 1 114-1 118 (1972) 37 - Hollinger F. B., Dreesman G. R., Sanchez Y., Cabral G. and Melnick J. L., in Viral Hepatitis (Ed. Vyas G. N. cohen s. N. and schmid R.) Franklin Institute.
Philadelphia, (1978) 10 38 - Purcell R. H., and Gerin J. L., Am. J. Med. Sci. 210, 395-399 (1975) 39 - Hilleman M. R. et al., Am. J. Med. Sci. 270, 401-404 21 . (1975) 40 - Maupas P., Coursaqet P..'Goudeau A. and Drucker J., 15 Lancet 1, 1 367-1 370 (1976) 41 - Emtage J. s. et al., Nature ggg, 171-174 (1980) 42 - Itakura K. et al., Science låg, 1 056-1 063 (1977) 43 - Goeddel D. V. et al., Prox. Nat. Acad. Sci. USA 16, '1os-110 (1979) ZÛ 44 - Pourcel C., Marchal C., Louise A., Fritsch A. and Tiollais P., Holec. Gén. Genet. 110, 161-169 (1979) 45 - Bolivar F. et al., Gene 2, 95-113 (1977) 46 - Fowler A. V. and Zabin I., Proc. Nat. Acad. Sci. USA _ 1_4_, -1 507-1 510 (1977) O 25 47 - Laemmli U. K., Nature ga, 680-685 (1970) 48 - Burgess R. R., J. Biol. Chem. 244, 6 168-6 176 (1969) 49 - Bcnner W. M. and Laskey R. A., Eur. J. Biochem. gå, 83-88 (1974) 50 - Laskey R. A. and Mills A. D., Eur. J. Biochem. åfi, 30 335-341 (1975) 51 - Iwakura Y., lto K. and Ishihama A., Molec. Gen. Genet. ¿;;, 1-23 (1974) S2 - Talwai G. P., et al., Prcc. Nat. Acad. Sci. USA 13, 218-222 (1976)

Claims (4)

”__ “_ _” U , 22, *lóšàmåålåtv
1. Vektor för omvandling av en mikroorganism, vilken vektor är modifierad medelst en DNA-insats härrörande från en klonad DNA, som i sin tur är erhållen från en polymeras-repa- rerad DNA för ett hepatit B-virus, vilken vektor på känt sätt sammanställts och försetts med nämnda DNA-insats, k ä n n e - t e c k n a d av att nämnda insats består antingen av ett nukleín- syrafragment, som i sig självt ingår i följande nukleotíd- sekvens: _ MßßGUC/ß. Åva 111121161) 1930 » 1000000000 0000010100 10.10 0101666001 GTCACCCCCA 2UÉO 1110000010 3 7110 GCUAGÅTTG - 0000101000 2170 - 0000000111 ' 0000100111 2230 19110 ÅGCCGNVVVS 1000011110 2000 1000101000 0000001001 “ 2000 0101101110 0110000001 - 2120 00101 1000 1101011001 2190 0000100100 1000111101 22110 V 1N\T/1ßGN\G TTTTCTNW1- ATTATCCTTC _NVV\G!\1T1T . ' 2290 2300 0000011000 1000010000 1000101101 0001100101 2350 " 2360 AMATCC 11 ATITACÅTAT . 0011000010 10110000V1R10/v1101010 21110 1000110100 Nm /-.-..ff011000 1101000000 2020 0101010000 0010101010 210-11 ' 0000001010 0111000001 t 081/ 1.3, _. . 1050 0110000601 0000010001 ' 2010 0000011000 1101000000 2070 0010000100 0101011100 3 2130 1000010010 0101110001 ' 2190 1 CCCACIWTC 0001011000 2250 0011011100 0100001001 2310 1000000100 0110001011 2370 0000100000 0001110101 21130 åk 1000 11 0010010 0 0000100 2020 0000000100 1010100000 2020 00000001 æmmnm 21110 1' TCMCGCNSG AGTTGCGTCC 2200 TTGACATAC CTGTATG .3 2200 463 459 3 Hi0011(2191_) 111121111952) 1070 0001100110", 0000100100 7 2030 0001100000 0000000000 2000 1000010000 0000010111 21.50 /11/1/111111111 1011001010 2210 1110010100 0010011001 2270 I 1 1 1 1 101111 GATGTGTTCT AÅÅAÅAUXTA 01/10101/15/1 2320 2330 ÅATUAGAGÅ GTMCCCCAT TTNÄATCTCT 0010000111 2380 2390 1030 NWCCCIAGC ' 1106000103 20110 'GÜVWGGGGT CGTTGCCCCÅ 2100 0101000001 0001110000 2101 1010111000 0000111110 2220 ' ATAGGCCTGT 1010000000 2280 1616001000 1 ÅCÅCCGTTCC 23110 CTCTITGTU GÅGNXÅCAM 21100 NV1GMMT1 GGT/VKAGCG GT/WVX/XGGG TITCTTTTAA CEATTGTCGC 211110 21150 TTGGCCCCCÅ ÅTÅCCÅCÅTC /1100/11111/111- MCCGGGÛGT 1/1106101/10 1/\001'f-1!\1'1 0/101110001 21111.) 25111) 7511) (0/1110171010. MCMATGGC /101/16111/1111. 110110010/112 TTGTTTACCG 10/111111110 ACTCGGTCCT CATHTTCCC 21100 010/1/1/100111 2571) TGAGCCÅGGA 465 459 - -w _... 2530 GAÅACGGGCT CTFTGCCCGA 2590 . ÅATACAGGTG TTATGTfLAC 2650 7 TCßTfGßßCA PGGAACTCGT 2710 ' PATTPGAGGA 'ITAATCTCCT 2770 GCATAGCAGC CGTATCGTCG 2830 AGGACAAGTT TCCTGTTCAA 2890 GCCAÅGÅCAC CGGTFCTGTG 2950 ' CTGCGGTATT GACGCCATAA 3010 TCCTßßGAAT 0 AGGATCCTTA 3070 GATIGACGAT CTAACTGCTA ÅCGGTAGTTC 24 . 2500 0000000000 0000000000 2000 0000000000 0000000000 0 2000 0000000000 0000000000 2720 0000000000 0000000000 2700 0000000000 0000000000 2000 0000000000 0000000000 2900 2550 0000000000 0000000000 2010 0000000000 0000000000 2070 0000000000 0000000000 . 2730 0000000000 0000000000 2790 0000000000 0000000000 0 2050 0000000000 0000000000 0 2910 0000000000 0000000000 0000000000 2900 2970 0000000000 0000000000 3020 0000000000 0000000000 3080 0000000000 0000000000 TGTTCTCCAT ACÅAGAGGTA 3090 GTCÅTUWTC Hin 0 11(2963) CÅGTAGTCAG - 2560 TITTCCGAM ÅAMGGCTIT 2620 GGTACÅGCÅA CCATGTCGTT 2680 T6GTCCCGTG ACCAGGGCAC 2740 ATAGTCCÅGÅ TATCAGGTCT 280) AÅAÅCGCCGC TITTGCGGCG 2860 GTGATTGGAG CACTAACCTC 2920 ATTG/ÄGAGAA TAACTCTCTT 2980 GAAAAACCCC 2570 Q 2580 GCCCAGGATG ATGGGATGGG CGGGTCCTAC TACCCTACCC 2630 26140 CAGGAGGGAT ACATAGAGGT GTCCTCCCTA TGTATCTCCA 2690 2700 CTGGTTGTTG AGGÅTCCTGG GACC/JACMC TCCTAGGACC 2750 2760 ÅGAÅCCÅACA ßGMGATGAG TCTTGGTTGT 2810 AGACACATCC TCTGTGTÅGG 2870 GTTGGGGACT CAACCCCTGA 2930 GTCCACCACG CNSGTGGTGC 2991 GCCTGTAÅCA' _CGGA('.Å1TGT' _ 3050 GGGTCCCUÄA CCCAGGGISTT 3110 ACTGHIÉCTG TGAC/Vßfíflß 2820 AGCGATAÅCC TCGCTATTGG 2880 GCGAAUWTG CGCTTAAAAC 29140 AGTCTAGACT TCAGÅTCTGA CGAGAÅGG GCTCTFCCCC 3060 TC CGAGAA AG GCTCTT 3120 MCTGGAGCC TTGACCTCGG š , HhaIÖÜÉÖ) p 5 Åva 03053) TCTTCTACTC ' _3000' ._25 463 459 eller av.ett nukleinsyrafragment, som ingår i en nukleotíd- sekvens vilken kodar för följande peptídsekvens: ..._ ..,.._-_.___,v ._ __, _»- 3! 5! f; ___/i, TAC ATG ecG ccc PRo AAC TTG .ICA AGT C SER PPE GTT 'GLN AGT TCA C SER CCA GGT GLY CTC GAG GLU GAA CTT LHJ AAC TTG LEU GAT CTA LEU GAT CT A LEU TTA AAT ASN GGT ccA - PRO ATA TAT TYR TTG AAC ASN GAG CTC LEU TGT ACA TTTR CTG GAC -ASP ccc ess GLY Aec" TCG SER TGG ACC TTTR (TCG CCC ARG TAG ATC ILE CAC GTG VAL TCT AGC TCG SER CCT GGA GLY GTC GLN AGA m SER Acc TGG T RP TGT ACA THR AAT TTA TAG ATC ILE ACC TGG TRP TGA ACT THR TCC SER ACA TGT CYS TAC ATG TYET AGT TCA SER GTC GLN GAG CTC ACC TGG TRP TGG' ACC THR GGT CCA PRO GGA CCT PRO ACA TGT CYS CCT GGA GLY CGC GCG ALA TGT ACA THR TGA ACT TTTR CAC GTG VAL TGG ACC THR GGT CCA PRO GAC CTG LEU TTC PHE CCC GGG GLY TAT ATA ILE AGA TCT .SER ACA TGT CYS . AGG TCC SER 'TGA AcT THR GCC CCG ARG GAT CTA PHE GGC CCG PRO GAG CTC GAA CTT TTA AAT ASN ACA TGT CYS GCA CGT ARG CCT GGA GLY AAG TTC PRE GTC CAG GLN 120 TTA AAT ASN 150 CCG “ GGC GLY 180 GTG CAC HIS ZTO GGA ' CCT PRO 2AO AAA T T I PT T ' 463 459 ._ _. ..- - J. - ».-.. . ...T~....~_....---..,.,.. TAG_ ATC ILE GAG CTC LEU GTT CAA GLN GGT CCA PRO ACG TGC CY S 'Tee ACC 'THR TIT ' AAA Lvs eee ccc Peo me ATC ~_ m: TAG ATC ILE CCA GGT eLy MET Slteßa CCT GGA TCC GLY GCC CGG ARG AGA TCT SER GGA CCT PRO TAG ATC _ ILE 'me TTC PHE AAG TTC PHE TAC ATG AGG SER - TGG ACC' THR TAC ATG O VET Aec Ice ecR GGT CCA PRO GAG CTC LEU AAC TTG LEU AAC TTG TCA SER ACG TGC CYS ATA TAT . TYR CTG GAC ASP AGT TCA SER -Lcu mHI Aer Aße Hc PHE AAC TTG LEU GGG CCC PRO TGT ACA THR TAC ATG VET GGG CCC PRO CCT GGA GLY AGG TCC SER 26 TAG ATC ILE GTT VAL GTT VAL TGG ACC THR TGA ACT THR TCC SER TTA AAT ACC TGG TRP GAC CTG LEU GAA CTT ACA TGT CYS Ice P AGC SER TGA ACT THR ACA TGT CYS ACG TGC CYS CGA GCT ALA GAC CTG LEU GAC CTG GGA CCT PRO TGC ACG THR CGA GCT ALA AGG TGC CYS TGG ACC THR MG TIC PIIE GAT CTA Lfll CTG GAC ASP GAT CTA CCT GGA GLY GTT GLN ACA TGT CYS ACA TGT CYS fn GGA GLY 7.70 ACG TGC CYS 300 ATA TAT TYR 330 TAA ATT I LE 360 GGT CCA PRO 390 CCT GGA GLY A20 TGG ACC THR use TAA ATT ILE A80 T TT IYS 27_w 510 465 459 i AAe eAT Acc cTe Acc eee AeT cee ecA AAe TTc eTA Tee eAe Teeecc TcA ecc eeT TTc Site Ha eTTT TRP ALA sER ALA ARe RRE sAo ' Aee Acc eAe TcA AAT eAT cAc eeT AAA eAA T Tcc Tee cTe AeT TTA eTA eTe ccA TTT eTT T sER TRP LEu sER LEu LEU vAL PRo PRE vAL T 570 eTe Acc AAe cAT ccc eAA Aee eee TeA eAA cAe Tee TTc eTA eee cTT Tcc cec AcT eTT i euT TRP RRE vAc eLy LEu sER RRo TRR vAc . eee Acc eAA AeT cAA TAT Acc TAe TAc Ace ATA Tee cTT TcA eTT ATA Tee ATe ATe Tee TAT TRP LEu sER vAL TLE TRR AET RET TRP TTR eso Acc eee e_eT TcA eAc ATe Tce TAe AAe TeA 'Tee eee ccA AeT cTe TAc Aee ATc -TTe AeT TRR ecY PRo sER LEu TYR sER TLE LEu sERm eee AAA AAT eee eAc AAT eeT TAA AAe AAA cec TTT TTA cce cTe TTA ccA ATT TTc TTT T PRo PRE LEu RRo LEu LEu PRo TLE PRE RRE PHE LEU TRP GLU ACA GAA ACE CAT ATG TAA ATT 5' TGT CTT TGG GTA TAC ATT TAA 3' CYS LEU TTTP VAl_ TYR IUÉ STOP och att nämnda insats kodar för en immunogen peptid, som ingår i ett hepatit B-ytantigen och framkallar antikroppar in vivo mot ifrågavarande hepatit B-virus, varvid nämnda insats är in- förlívad i vektorn för att möjliggöra expression av insatsen i en lämplig bakterie eller eukaryot cell, när vektorn inför- lívas däri.
2. Vektor enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a d av att DNA-insatsen innefattar upp till 1200 nukleotíder i korrekt E28. 463 459 fasarrangemang i vektorn för att koda en polypeptid med de immunogena egenskaperna hos följande polypeptidsekvens: _20 A 2 S0 ARG 1LE LE0 mR 1LE PR0 em SER LE0 RSR SER TRR 00 ' 50 TRP THR SER LEU ASN PHE LEU GLY GLY THR THR \'AL CYS LEU GLY_ GO GLN ASN SER GUV SER PRO THR SER ASN HIS SER PRO THR SER CYS 70 80 _ 90 ILEEILEPHELEUPLEILELEULEULEUCYSLEUILEPHELEULEU VA.L LEU UÉU ASP TYR GLN GLY MEY LEU PRO VAL CYS PRO- LEU ILE 120 ' BO ' lAO THR THR ALA GLNP GLY THR SER MET TYR PRO SER CYS CYS CYS THR ' 150 ' 160 _ ' 170 130 L SER TRP LEU SER LEU LEU VAL PRO PHE VAL GLN TRP PHE VAL GLY 190 S _ 200 LE0 SER PR0 THR vRL TRP LEu .SER vAL 1LE TRP REE HET TRR TYR . _ 210 _ TRP GLY RR0 SER LE0 WR SER 1LE LE0 SER RR0 RLE LE0 RR0 LEu E 220 220 S LEU PR0 LLE PHE REE cYS LEu TRP vAL TYR ILE
3. Vektor enligt krav 1 eller 2, k ä n n e t e c k n a d av att DNA-insatsen innehåller en sekvens med formeln: { PRO PRO THR CYS PRO GLY TYR ARG TRP MEL- CYS LEU ARG ARG PHE S 100 . e i l 110 PRO GLY SER SER »THR THR SER THR GLY PRO CYS ARG THR 'CYS NET S LY_S PRO SER ASP GLY ASN GYS THR CYS ILE PRO ILE PRO SER SER TRP ALA PHE GLY LYS PHE LEU TRP GLU TRP ALA SER ALA PHZ - 3' TAC 5' ATG GCG CCC PRO AAC TTG - TCA AGT SER PPE en ' GLN pm TcA SER cm GGT GLY CTC GAG GLU GAA CTT AAC TTG GAT CT LEU GAT CTA TTA AAT ASN GGT CCA - PRO ATA TAT TYR TTG AAC ASN GAG CTC LEU TGT ACA THR CTG GAC -ASP CCC GGG AGC TCG SER TGG ACC THR GCG -CGC ARG TAG ATC I LE CAC GTG VAL TCT AGA ARG AGC TCG SER CCT GGA GLY GTC CAG GLN AGA TCT SER ACC T GG T RP TGT ACA THR AAT . TTA TAG ATC ILE ACC TGG TRP TGA ACT THR AGG TCC SER ACA TGT CYS TAC ATG PTET EN . ilD AGT TCA SER GTC 'CAG GLN GAG CTC ACC TGG TRP TGG" ACC THR GGT. CCA PRO GGA CCT PRO ACA T GT CYS CCT GGA GLY CGI GCG ALA TGT ACA THR TGA ACT THR CAC GTG VAL TGG ACC THR GGT CCA PRO GAC CT G LEU TTC PHE CCC GGG GLY TAT ATA I LE AGA TCT SER ACA TGT CYS _ AGG TCC SER "mA ACT THR GCC CCG ARG GAT CTA LEU PHE GGC CCG PRO GAG CTC LEU GAA CTT TTA AAT ASN ACA TGT CYS GCA CGT ARG 4 6 3 4 5 9 30 . CCT GGA GLY BO AAG TTC PHE 9O GTC CAG GLN 120 TTA AAT ASN l5O CCG GGC GLY 180 GTG CAC HIS 210 GGA CCT PRO 2110 N\A 'I T l IT T' 465' 459 . .-..,....«....~....._.__..........._........T.., ....,.. . M ma ATC I LE GAG CTC LEU GTT CAA GLN ßßï ccA PRO ACG TGC CY S TGG ACC THR TTT ' AAA LYS GGG CCC PRO TAG ATC I LE TAG ATC ILE CCA GGT GLY MKT STteBa CCT GGA AAG TTC PHE AAG. TTC PHE TAC ATG AGG TCC GLY GCC CGG ARG AGA TCT SER GGA CCT PRO TAG ATC . ILE SER -TGG ACC TT-TR TAC 'TG T-'ET AGC TCG SER GGT CCA PRO GAG CTC LEU AAC TTG LEU AAC TTG LEU mHI Aßï TCA SER ACG TGC CYS ATA TAT TYR CTG GAC ASP AGT TCA SER 3_O AAG TTC PHE AAC TTG LEU GGG CCC PRO TGT ACA THR TAC ATG HET GGG CCC PRO ccï GGA GLY AGG TCC SER TAG ATC ILE GTT VAL GTT VAL TGG ACC THR TGA ACT THR AGG TCC SER TTA AAT ASN ACC TRP GAC CTG LEU GAA CTT ACA TGT CYS Its Aer: si-:R TGA ACT THR ACA TGT CYS ACG TGC CYS COA GCT ATA GAC CTG LEU GAC CTG LEU GGA CCT PRO TGC ACG THR CGA GCT ACG TGC CYS TGG ACC THR NTG T IC PI IE GAT CTA LEU CTG GAC ASP GAT CTA CCT GGA GLY GTT GLN ACA TGT cYs ACA TGT CYS CCT GOA GLY 270 ACG TGC CYS 300 ATA TAT TYR 330 TAA ATT I LE 360 GGT CCA PRO 390 CCT GGA GLY A20 TGG ACC THR uso_ TAA ATT ILE A80 T I I' NV\ I YS 519 465 459 AAG GAT Act CTC Acc ceß Aer CGG SCA AAß I TTC CTA TGG GAG TGG. GCC TCA GCC CGT TTC § Site Ha eTTT PHE LEU TRP GLU TRP ALA SER ALA ARG PHE SLTÛ AGG ACC GAG TCA AAT GAT CAC GGT AAA CAA Tcc TGS ETC AST TTA cTA ßTß ccA TH GTI SER TRP LEU SER LEU LEU VAL PRÛ PHE VAL 57Û ' STC Act AAß CAT ccc GAA AGS GGG TGA CAA CAG TGG TTC GTA GGG CTT TCC CCC ACT GTT GLN TRP PHE VAL GLY LEU SER PRO THR VAL - GÛÛ AC-C GAA AGT CAA TAT ACC TAC TAC ACC ATA TGG CTT TCA GTT ATA TGG ATG ATG TGG TAT TRP LTÉU SER VAL ILE TRP HET MGT TRP TVR S30 ACC CCC GGT TCA GAC ATG TCG TAG AAC TCA 'TGG GGG CCA AGT CTG TAC AGC ATC -TTG AGT TRP GLY PRO SER LEU TYR SER ILE LEu SER , A S90 Ges AAA AAT SEC ßAc AAT GGT TAA AAG AAA CCC TTT TTA CCGCTG TTA CCA ATT TTC' TTT PRÛ PHE LEU PRO LEU LEU PRÛ TLE PHE PHF. ACA GAA ACC CAT ATG TAA ATT 5' TGT CTT TGG GTA TAC /\TT T/\/\ 3' CYS LEU TRP VAL TYR IUÉ STOP
4. Vektor enligt något av de föregående kraven, k ä n n e t e c k n a d av att den består av en plasmid inne- fattande åtminstone en del av laktosoperonen, inkluderande pro- motorn och åtminstone en del av Z-genen av denna operon, varvid DNA-insatsen är insatt i nämnda del av Z-genen.
SE8102726A 1979-08-30 1981-04-29 Vektor innehaallande dna-sekvens kodande foer ett ytantigen hos hepatit b virus SE463459B (sv)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR7921811A FR2464269B1 (fr) 1979-08-30 1979-08-30 Sequence nucleotidique codant l'antigene de surface du virus de l'hepatite b, procede permettant son obtention et antigene obtenu
FR8009039A FR2480779B2 (fr) 1979-08-30 1980-04-22 Vecteur contenant une sequence nucleotidique de l'antigene de surface du virus de l'hepatite b et procede de fabrication d'une molecule immunogene mettant en oeuvre ce vecteur
PCT/FR1980/000133 WO1981000577A1 (fr) 1979-08-30 1980-08-29 Sequence nucleotidique codant l'antigene de surface du virus de l'hepatite b, vecteur contenant ladite sequence nucleotidique, procede permettant son obtention et antigene obtenu

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SE460727B SE460727B (sv) 1989-11-13
SE463459B true SE463459B (sv) 1990-11-26

Family

ID=26221334

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SE8102726D SE8102726L (sv) 1979-08-30 1981-04-29 Nukleotidsekvens som kodar ytantigenet av hepatit b-virus,vektor innehallande nemda nukleotidsekvens,forfarande for erhallande derav samt erhallet antigen
SE8102726A SE463459B (sv) 1979-08-30 1981-04-29 Vektor innehaallande dna-sekvens kodande foer ett ytantigen hos hepatit b virus
SE8303463A SE462530B (sv) 1979-08-30 1983-06-16 Immunogena peptider, som inducerar in vivo produktion av aktiva antikroppar med avseende paa hepatit b-virus

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SE8102726D SE8102726L (sv) 1979-08-30 1981-04-29 Nukleotidsekvens som kodar ytantigenet av hepatit b-virus,vektor innehallande nemda nukleotidsekvens,forfarande for erhallande derav samt erhallet antigen

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SE8303463A SE462530B (sv) 1979-08-30 1983-06-16 Immunogena peptider, som inducerar in vivo produktion av aktiva antikroppar med avseende paa hepatit b-virus

Country Status (12)

Country Link
US (1) US4428941A (sv)
JP (1) JPS6362198B2 (sv)
BE (1) BE884988A (sv)
CA (1) CA1163585A (sv)
CH (1) CH663796A5 (sv)
DE (1) DE3049831C2 (sv)
FR (1) FR2480779B2 (sv)
GB (1) GB2070621B (sv)
LU (1) LU88365I2 (sv)
NL (1) NL192880C (sv)
SE (3) SE8102726L (sv)
WO (1) WO1981000577A1 (sv)

Families Citing this family (76)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6416996B1 (en) * 1978-12-18 2002-07-09 Institut Pasteur Nucleotide sequence comprising the genome of hepatitis b virus, nucleotide sequence coding the surface antigen of the hepatitis b virus, vectors containing the nucleotide sequences, process for the preparation thereof, and antigen obtained thereby
ES487106A0 (es) * 1978-12-22 1981-05-16 Biogen Nv Un metodo para producir al menos un polipeptido que muestra antigenicidad de hbv
EP0182442B2 (en) * 1978-12-22 1996-04-03 Biogen, Inc. Recombinant DNA molecules and their method of production
US6297355B1 (en) 1978-12-22 2001-10-02 Biogen, Inc. Polypeptides displaying HBV antigenicity or hbv antigen specificity
US5196194A (en) * 1979-05-24 1993-03-23 The Regents Of The University Of California Vaccines containing Hepatitis B S-protein
IE52036B1 (en) * 1979-05-24 1987-05-27 Univ California Non-passageable viruses
USRE34705E (en) * 1979-08-30 1994-08-23 Institut Pasteur Nucleotidic sequence coding the surface antigen of the hepatitis B virus, vector containing said nucleotidic sequence, process allowing the obtention thereof and antigen obtained thereby
EP0038765B1 (fr) * 1980-04-22 1987-09-02 Institut Pasteur Vaccin contre l'hépatite virale B, procédé et cellules eucaryotes transformées pour la production de ce vaccin
NZ199722A (en) * 1981-02-25 1985-12-13 Genentech Inc Dna transfer vector for expression of exogenous polypeptide in yeast;transformed yeast strain
US4769238A (en) 1981-08-04 1988-09-06 The Regents Of The University Of California Synthesis of human virus antigens by yeast
ZW18282A1 (en) * 1981-08-31 1983-03-23 Genentech Inc Preparation of polypeptides in vertebrate cell culture
US4741901A (en) * 1981-12-03 1988-05-03 Genentech, Inc. Preparation of polypeptides in vertebrate cell culture
EP0082789B1 (en) * 1981-12-22 1987-04-08 Baylor College of Medicine Immunological composition and method for hepatitis b virus
US4593002A (en) * 1982-01-11 1986-06-03 Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. Viruses with recombinant surface proteins
JPS5931799A (ja) * 1982-08-16 1984-02-20 Science & Tech Agency Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子を組込んだ組換えプラスミド
US4820642A (en) * 1983-04-04 1989-04-11 The Regents Of The University Of California Amplified expression vector
US4575495A (en) * 1983-05-12 1986-03-11 New York Blood Center, Inc. Synthetic antigenic peptide derived from Hepatitis B surface antigen
US4847080A (en) * 1984-03-07 1989-07-11 New York Blood Center, Inc. Pre-S gene coded peptide hepatitis B immunogens, vaccines, diagnostics, and synthetic lipide vesicle carriers
US5324513A (en) * 1984-03-07 1994-06-28 Institut Pasteur Composition useful for the fabrication of vaccines
US4861588A (en) * 1985-02-05 1989-08-29 New York Blood Center, Inc. Pre-S gene coded peptide hepatitis B immunogens, vaccines, diagnostics, and synthetic lipid vesicle carriers
US5204096A (en) * 1984-03-07 1993-04-20 New York Blood Center, Inc. Pre-S gene coded peptide hepatitis B immunogens, vaccines, diagnostics, and synthetic lipid vesicle carriers
US4599231A (en) * 1984-03-09 1986-07-08 Scripps Clinic And Research Foundation Synthetic hepatitis B virus vaccine including both T cell and B cell determinants
US4599230A (en) * 1984-03-09 1986-07-08 Scripps Clinic And Research Foundation Synthetic hepatitis B virus vaccine including both T cell and B cell determinants
WO1985004103A1 (en) * 1984-03-09 1985-09-26 Scripps Clinic And Research Foundation Synthetic hepatitis b virus vaccine including both t cell anc b cell determinants
SU1470739A1 (ru) * 1984-07-16 1989-04-07 Всесоюзный кардиологический научный центр АМН СССР Гексапептид, обладающий гепатопротективным действием
US4743553A (en) * 1984-07-18 1988-05-10 W. R. Grace & Co. Synthetic genes for bovine parainfluenza virus
US4722840A (en) * 1984-09-12 1988-02-02 Chiron Corporation Hybrid particle immunogens
JPH0745514B2 (ja) * 1985-08-20 1995-05-17 武田薬品工業株式会社 新規蛋白質およびその製造法
US4895800A (en) * 1985-11-26 1990-01-23 Phillips Petroleum Company Yeast production of hepatitis B surface antigen
WO1987007896A1 (en) * 1986-06-20 1987-12-30 Scripps Clinic And Research Foundation T and b cell epitopes of the pre-s region of hepatitis b virus surface antigen
US4778784A (en) * 1987-01-07 1988-10-18 Baylor College Of Medicine Cyclic peptide and method of use for inducing an immunological response to hepatitis B virus
ATE207535T1 (de) * 1987-06-22 2001-11-15 Medeva Holdings Bv Hepatitis-b-oberflächenantigen enthaltendes peptid
US5162226A (en) 1987-08-24 1992-11-10 University Of Tennessee Research Corp. (U.T.R.C.) Therapeutic compositions against streptococcal infections, transformed hosts, methods of immunization and genetically engineered products
US5359100A (en) * 1987-10-15 1994-10-25 Chiron Corporation Bifunctional blocked phosphoramidites useful in making nucleic acid mutimers
DE68928124T2 (de) 1988-09-02 1997-10-16 Chiron Corp., Emeryville, Calif. Makrophagenabgeleiteter entzündungsmediator(mip-2)
CA2065287C (en) * 1989-09-15 1999-12-21 Tatsuo Miyamura New hcv isolates
EP0491077A1 (en) * 1990-12-19 1992-06-24 Medeva Holdings B.V. A composition used as a therapeutic agent against chronic viral hepatic diseases
US20010053367A1 (en) * 1991-08-26 2001-12-20 Prodigene, Inc. Vaccines expressed in plants
US5484719A (en) 1991-08-26 1996-01-16 Edible Vaccines, Inc. Vaccines produced and administered through edible plants
US6419931B1 (en) * 1991-08-26 2002-07-16 Epimmune Inc. Compositions and methods for eliciting CTL immunity
US6322789B1 (en) 1991-08-26 2001-11-27 Epimmune, Inc. HLA-restricted hepatitis B virus CTL epitopes
US5780036A (en) * 1991-08-26 1998-07-14 The Scripps Research Institute Peptides for inducing cytotoxic T lymphocyte responses to hepattis B virus
US5612487A (en) * 1991-08-26 1997-03-18 Edible Vaccines, Inc. Anti-viral vaccines expressed in plants
US6607727B1 (en) 1991-08-26 2003-08-19 The Scripps Research Institute Peptides for inducing cytotoxic T lymphocyte responses to hepatitus B virus
US6689363B1 (en) 1992-01-29 2004-02-10 Epimmune Inc. Inducing cellular immune responses to hepatitis B virus using peptide and nucleic acid compositions
US7611713B2 (en) * 1993-03-05 2009-11-03 Pharmexa Inc. Inducing cellular immune responses to hepatitis B virus using peptide compositions
US20110097352A9 (en) * 1992-01-29 2011-04-28 Pharmexa Inc. Inducing cellular immune responses to hepatitis B virus using peptide and nucleic acid compositions
US6235288B1 (en) * 1992-08-26 2001-05-22 The Scripps Research Institute Peptides for inducing cytotoxic T lymphocyte responses to hepatitis B virus
WO1994020079A1 (en) 1993-03-10 1994-09-15 Smithkline Beecham Corporation Human brain phosphodiesterase
WO1997010347A1 (en) * 1995-09-15 1997-03-20 Howard John A Expression cassettes and methods for delivery of animal vaccines
US6087128A (en) 1998-02-12 2000-07-11 Ndsu Research Foundation DNA encoding an avian E. coli iss
WO2002080848A2 (en) * 2001-04-09 2002-10-17 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods and materials for cancer treatment
US8025873B2 (en) 2002-06-20 2011-09-27 Paladin Labs, Inc. Chimeric antigens for eliciting an immune response
US8029803B2 (en) 2002-06-20 2011-10-04 Paladin Labs, Inc. Chimeric antigens for eliciting an immune response
US20040057969A1 (en) * 2002-09-20 2004-03-25 Smith Mark L Compositions containing stabilized hepatitis antigen and methods of their use
US8007805B2 (en) * 2003-08-08 2011-08-30 Paladin Labs, Inc. Chimeric antigens for breaking host tolerance to foreign antigens
ZA200804078B (en) * 2005-10-13 2009-09-30 Virexx Medical Corp Chimeric hepatitis C virus antigens for eliciting an immune response
US8969033B2 (en) 2005-11-02 2015-03-03 Battelle Energy Alliance, Llc Alteration and modulation of protein activity by varying post-translational modification
JP4685674B2 (ja) * 2006-03-20 2011-05-18 株式会社東海理化電機製作所 ウエビング巻取装置
US8492114B2 (en) 2008-01-25 2013-07-23 Battelle Energy Alliance, Llc Methods of combined bioprocessing and related microorganisms, thermophilic and/or acidophilic enzymes, and nucleic acids encoding said enzymes
US9732330B2 (en) 2008-01-25 2017-08-15 Battelle Energy Alliance, Llc Methods of combined bioprocessing and related microorganisms, thermophilic and/or acidophilic enzymes, and nucleic acids encoding said enzymes
US7923234B2 (en) 2008-01-25 2011-04-12 Battelle Energy Alliance, Llc Thermal and acid tolerant beta-xylosidases, genes encoding, related organisms, and methods
US8497110B2 (en) 2008-01-31 2013-07-30 Battelle Energy Alliance, Llc Thermophilic and thermoacidophilic biopolymer-degrading genes and enzymes from alicyclobacillus acidocaldarius and related organisms, methods
US8557557B2 (en) 2008-01-31 2013-10-15 Battelle Energy Alliance, Llc Thermophilic and thermoacidophilic biopolymer-degrading genes and enzymes from Alicyclobacillus acidocaldarius and related organisms, methods
MX2010008250A (es) 2008-01-31 2010-11-09 Battelle Energy Alliance Llc Genes que degradan el biopolimero termofilico y termoacidofilico y enzimas a partir de alicyclobacillus acidocaldarius, metodos y organismos relacionados.
US8426185B2 (en) 2008-01-31 2013-04-23 Battelle Energy Alliance, Llc Thermophilic and thermoacidophilic biopolymer-degrading genes and enzymes from Alicyclobacillus acidocaldarius and related organisms, methods
MX2010008575A (es) 2008-02-22 2010-12-07 Battelle Energy Alliance Llc Control transcripcional en alicyclobacillus acidocaldarius y genes, proteinas y metodos asociados.
CA2712101A1 (en) 2008-02-26 2009-12-03 Battelle Energy Alliance, Llc Thermophilic and thermoacidophilic sugar transporter genes and enzymes from alicyclobacillus acidocaldarius and related organisms, methods
MX2010008249A (es) 2008-02-27 2010-11-12 Battelle Energy Alliance Llc Genes de glicosilacion termofilica y termoacidofilica y enzimas a partir de alicyclobacillus acidocaldarius y metodos, organismos relacionados.
AU2009251767A1 (en) 2008-02-28 2009-12-03 Battelle Energy Alliance, Llc Thermophilic and thermoacidophilic metabolism genes and enzymes from Alicyclobacillus acidocaldarius and related organisms
US8858952B2 (en) 2009-02-19 2014-10-14 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods and materials for generating T cells
EP2409155A1 (en) 2009-03-15 2012-01-25 Technion Research and Development Foundation, Ltd. Soluble hla complexes for use in disease diagnosis
US20110275135A1 (en) 2010-05-05 2011-11-10 Battelle Energy Alliance, Llc Genetic elements, proteins, and associated methods including application of additional genetic information to gram (+) thermoacidophiles
AU2013221309B2 (en) 2012-02-17 2017-03-30 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods and materials for generating CD8+ T cells having the ability to recognize cancer cells expressing a HER2/neu polypeptide
WO2013140393A1 (en) 2012-03-21 2013-09-26 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Peptides derived from the d1 - domain of nkp46
MX2022003658A (es) 2019-09-30 2022-04-25 Gilead Sciences Inc Vacunas contra el virus de la hepatitis b (vhb) y metodos para tratar el vhb.

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
YU257278A (en) * 1977-11-08 1984-02-29 Genentech Inc Process for obtaining a recombinat clone carrier
FR2422685A1 (fr) * 1978-04-14 1979-11-09 Pasteur Institut Vecteurs, derives du bacteriophage lambda, permettant l'insertion et l'expression d'un gene, procaryote ou eucaryote, sous le controle du promoteur et de l'operateur de l'operon lactose de la bacterie escherichia coli
FR2428075A1 (fr) * 1978-06-08 1980-01-04 Pasteur Institut Procede de production de proteines par expression des genes correspondants dans des bacteries et vecteurs susceptibles d'etre mis en oeuvre dans de tels procedes
FR2444713A1 (fr) * 1978-12-18 1980-07-18 Pasteur Institut Procede de production d'un adn comprenant le genome du virus de l'hepatite b et vecteur le comportant
ES487106A0 (es) * 1978-12-22 1981-05-16 Biogen Nv Un metodo para producir al menos un polipeptido que muestra antigenicidad de hbv
IE52036B1 (en) * 1979-05-24 1987-05-27 Univ California Non-passageable viruses

Also Published As

Publication number Publication date
US4428941A (en) 1984-01-31
SE462530B (sv) 1990-07-09
SE8303463L (sv) 1983-06-16
GB2070621B (en) 1983-05-18
SE460727B (sv) 1989-11-13
DE3049831T1 (sv) 1982-06-16
NL192880B (nl) 1997-12-01
NL192880C (nl) 1998-04-02
CA1163585A (fr) 1984-03-13
JPS6362198B2 (sv) 1988-12-01
FR2480779A2 (fr) 1981-10-23
LU88365I2 (fr) 1994-05-04
WO1981000577A1 (fr) 1981-03-05
SE8303463D0 (sv) 1983-06-16
CH663796A5 (fr) 1988-01-15
SE8102726L (sv) 1981-04-29
JPS56501128A (sv) 1981-08-13
FR2480779B2 (fr) 1986-07-18
BE884988A (fr) 1981-03-02
GB2070621A (en) 1981-09-09
NL8020315A (nl) 1981-07-01
DE3049831C2 (de) 1992-08-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SE463459B (sv) Vektor innehaallande dna-sekvens kodande foer ett ytantigen hos hepatit b virus
CA1341643C (en) Non-passageable viruses
DK171727B1 (da) Rekombinante hepatitis B virus DNA-molekyler, værtsorganismer transformeret hermed, HBV-antigenspecifikke polypeptider, DNA-sekvenser kodende for HBV-antigenspecifikke polypeptider, metoder til påvisning af hepatitis B virus-antistoffer, metoder til fremstilling af nævnte DNA-molekyler, fremgangsmåder til fremstilling af nævnte polypeptider og midler til påvisning af HBV-infektion
JP3334876B2 (ja) 組換え単純ヘルペスウイルスワクチン及び方法
US7635466B1 (en) DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing human fibroblast interferon-like polypeptides
US7045136B1 (en) Methods of immunization using recombinant poxviruses having foreign DNA expressed under the control of poxvirus regulatory sequences
DE3788902T2 (de) Hepatitis-Delta-Diagnostika und Impfstoffe, ihre Herstellung und Verwendung.
US4935235A (en) Non-passageable viruses
Morimoto et al. Physical mapping of genes on yeast mitochondrial DNA: localization of antibiotic resistance loci, and rRNA and tRNA genes
DK175194B1 (da) Rekombinante DNA-molekyler, interferon-omega-type gener, transformerede værter indeholdende DNA-informationen, ekspressionsplasmider for interferon-omega-typer, E. coli transformeret hermed, humane interferoner af type I, fremgangsmåde.......
EP0182442B2 (en) Recombinant DNA molecules and their method of production
IE60387B1 (en) Hepatitis B virus vaccine
EP0753577A1 (en) Cell-surface polypeptide gene
Greco et al. Charaterization by two‐dimensional gel electrophoresis of host proteins whose synthesis is sustained or stimulated during the course of herpes simplex virus type 1 infection
US6096879A (en) Nucleotide sequence comprising the genome of hepatitis B virus, nucleotide sequence coding the surface antigen of the hepatitis B virus, vectors containing the nucleotide sequences, process for the preparation thereof, and antigen obtained thereby
USRE34705E (en) Nucleotidic sequence coding the surface antigen of the hepatitis B virus, vector containing said nucleotidic sequence, process allowing the obtention thereof and antigen obtained thereby
US6270955B1 (en) Pharmaceutical compositions and methods for producing antibodies to hepatitis b virus and kits and methods for detecting antibodies to hepatitis b virus
US6416996B1 (en) Nucleotide sequence comprising the genome of hepatitis b virus, nucleotide sequence coding the surface antigen of the hepatitis b virus, vectors containing the nucleotide sequences, process for the preparation thereof, and antigen obtained thereby
DE3781049T2 (de) Verfahren zur herstellung von hepatitis-b-virus-innenkoerperantigen (hbcag) in hefe.
JPS6345227A (ja) Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原蛋白質
Lang et al. Lack of actin III in fibrillar flight muscle of flightless Drosophila mutant raised
JP2843048B2 (ja) 新規な組換リンホトキシン誘導体
CA1341644C (en) Recombinant dna molecules and their method of production
CA1203763A (fr) Proteine hybride codee par un fragment d&#39;adn
JPS62181786A (ja) 融合蛋白質の製造法

Legal Events

Date Code Title Description
NUG Patent has lapsed

Ref document number: 8102726-0