CH663796A5 - Acide nucleique codant pour une sequence peptidique immunogene contenue dans l'antigene de surface du virus de l'hepatite b et son utilisation pour la modification de vecteurs. - Google Patents

Acide nucleique codant pour une sequence peptidique immunogene contenue dans l'antigene de surface du virus de l'hepatite b et son utilisation pour la modification de vecteurs. Download PDF

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CH663796A5 CH2854/81A CH285481A CH663796A5 CH 663796 A5 CH663796 A5 CH 663796A5 CH 2854/81 A CH2854/81 A CH 2854/81A CH 285481 A CH285481 A CH 285481A CH 663796 A5 CH663796 A5 CH 663796A5
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dna
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Pierre Tiollais
Patrick Charnay
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Pasteur Institut
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Description

L'invention est relative à un acide nucléique selon le préambule de la revendication I.
Elle concerne également une utilisation de l'acide nucléique. 15 L'hépatite B est une maladie virale fréquente tout particulièrement en Afrique tropicale, en Asie du Sud-Est et en Extrême-Orient.
L'agent étiologique est un virus (HBV) ou particule de Dane, comprenant une enveloppe (antigène Australia ou antigène HBs), une capside (antigène HBc), une polymérase endogène et une molé-20 cule d'ADN circulaire partiellement simple brin; le brin le plus long de cette molécule d'ADN comporte près de 3200 nucléotides (SUMMERS J., O'CONNELL A. et MILLMANI. (1975) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 72,4597-4601).
L'ADN polymérase endogène peut être utilisé pour réparer in 25 vitro le brin le plus court (T. A. LANDERS, H.B. GREENBERT et J.S. ROBINSON, J. VIROL., 23,1977, p. 368-376).
L'analyse électrophorétique des protéines de l'enveloppe a montré la présence de 2 à 7 polypeptides dont les principaux sont appelés: polypeptide I et polypeptide II (PETERSON D.L., so ROBERTS I.M. et VYAS G.N. (1977) Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 74,1 530-1 534, et PETERSON D.L., CHIEN D.Y., VYAS G.N., NITECKID, et BOND H. (1978) In Viral Hepatitis, ed. G. VYAS, S. COHEN et R. SCHMID, The Franklin Institute Press, Philadelphie, 569-573).
35 Le polypeptide I a un poids moléculaire de 22 000 à 26 000 dal-tons. Le polypeptide II est glycosilé et a un poids moléculaire de 28000 à 30000 daltons. La composition en acides aminés de ces deux polypeptides est très semblable, les séquences que forment, respectivement, leurs 15 premiers aminoacides (à partir de l'extrémité 40 N-terminale) et leurs 3 derniers aminoacides sont identiques, de sorte que l'hypothèse a été formulée que le polypeptide II pourrait ne différer du polypeptide I que par une glycosilation. Peterson D.L. et al. ne font aucune mention quant à la séquence de l'acide nucléique codant lesdits polypeptides.
45 L'étude du virus est extrêmement difficile dans la mesure où l'on ne dispose d'aucun système de culture cellulaire permettant la propagation du virus. Cette difficulté a déjà en partie été contournée, plus particulièrement en ce qui concerne le sérotype ayw. L'ADN entier (génome) du virus a été identifié et cloné, notamment dans E. so coli, après son insertion préalable dans le site unique EcoRI d'un vecteur Xgt.WES. XB, selon la technique par FRITSCH A., POURCEL C, CHARNAY P. et TIOLLAIS P. (1978) C.R. Acad. de Paris, 287,1453-1456.
A ce jour, la séquence des polypeptides I et II eux-mêmes, la lo-55 calisation dans l'ADN viral de la séquence codant ces peptides n'ont pas été réalisées. L'article de P. CHARNAY et al. publié dans Proc. Nat. Acad. Sci. (USA), vol. 76, N° 5, mai 1979, pages 2222-2226, fournit une carte de restriction du génome entier du virus de l'hépatite B, tel que cloné par FRITSCH A. et al. dans la publication dont 60 les références ont été rappelées plus haut. SNINSKY JJ. et al., Nature, vol. 279,24 mai 1979, pages 346-348, décrivent également une carte de restriction du génome entier du virus de l'hépatite virale B.
Comme les auteurs précédents, BURRELL C.J. et al., Nature, 65 vol. 279, 3 mai 1979, pages 43-47, ont fourni une carte de restriction du génome entier du virus de l'hépatite virale B. Ils ont en outre cloné certains fragments de ce génome. Certains de ces fragments clonés dans E. coli ont exprimé une protéine qui a été reconnue par
3
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des anticorps préalablement obtenus contre l'antigène (HBc antigène de capacité). BURRELL C.J. et al. reconnaissent cependant n'avoir pas obtenu avec certains des fragments clonés une véritable expression d'une protéine reconnue par des anticorps dirigés contre l'antigène HBs.
L'invention a pour but l'obtention d'une séquence d'ADN beaucoup plus petite que l'ADN viral lui-même, contenant la séquence apte à coder la séquence peptidique douée de propriétés immunogènes permettant, lorsqu'elle est introduite dans l'organisme d'un hôte vivant, d'induire la fabrication par ce dernier d'anticorps susceptibles de protéger ultérieurement ce même hôte à l'égard du virus de l'hépatite virale B, notamment lorsque celui-ci se trouve à l'état virulent.
L'invention découle non seulement de l'analyse nucléotidique complète du génome de la particule de Dane à laquelle ont procédé les inventeurs, mais à l'idée qu'ils ont eue pour identifier le gène codant (ci-après dénommé «gène S») des susdits polypeptides, de rechercher dans la structure nucléotidique complète ainsi préétablie du génome de la particule de Dane, celles des séquences de nucléotides susceptibles de coder les séquences peptidiques proximales et terminales connues de ces polypeptides.
On rappellera que PETERSON et collaborateurs ont rapporté, notamment dans les articles dont les références ont été rappelées plus haut, que la séquence proximale (premier aminoacide N-termi-nal) des 15 premiers aminoacides s'analysait en principe comme suit: met glu asn ile thr ser gly phe leu gly pro leu leu val ser et que la séquence terminale de ces mêmes polypeptides (dernier aminoacide C-terminal) était la suivante: val tyr ile.
La figure 1 est une carte schématique du génome de la particule de Dane. Celui-ci comporte deux brins bj et b2, le plus court d'entre eux (b2) étant normalement dépourvu de la partie représentée par une ligne en trait interrompu dans le dessin.
Il est connu que cet ADN ne comporte qu'un seul site EcoRI.
La flèche f! donne le sens de la numérotation des nucléotides dont est composé le brin le plus long b1( et la flèche f2 donne le sens de la transcription de l'ADN du virus, notamment par la machinerie cellulaire des cellules envahies par le virus de l'hépatite B, pour ce qui concerne l'expression du gène S.
Le site EcoRI peut donc être numéroté 0 ou, comme on l'a maintenant déterminé de façon plus exacte pour celui des virus de l'hépatite B appartenant au sérotype ayw, 3182.
Le cercle en trait plein intérieur e donne l'échelle en % de longueur de l'ADN et permet de préciser les positions de certaines de ses parties.
Les nombres 3', 5' et 5', 3' à la partie inférieure de la carte visent les extrémités terminales porteuses de mêmes nombres dans les représentations conventionnelles des extrémités des chaînes d'acide nucléique.
Il a été montré que le «gène S» constituait essentiellement le fragment du brin le plus long bj situé entre les positions 73,6 et 95,1 de la carte schématique de la figure 1. Les abréviations «Start» et «Stop» représentent les points d'initiation et d'arrêt de la transcription du «gène S».
Les figures 2A, 2B, 2C sont représentatives de la partie terminale du susdit génome, comprise notamment entre les positions 60,4 et 100 (en % de longueur de l'ADN). Chacune des lettres figurant dans la figure 2 correspond de façon conventionnelle à l'un des 4 nucléotides de base de l'ADN :
A: Adénine
G: Guanine
T: Thymine
C: Cytosine
Les lignes inférieures, dans chaque paire de lignes dont sont constituées les figures 2A, 2B, 2C, correspondent à l'acide nucléique correspondant à la chaîne nucléotidique b2.
La technique d'analyse utilisée, pour établir la carte du génome plus détaillée dont témoignent les figures 2A, 2B, 2C, sera brièvement rappelée ci-après.
La caractérisation de la séquence nucléotidique du «gène S», dont les extrémités proximalep «S» et terminale t «S» sont indiquées dans les figures 2A, 2B, 2C, résulte de la constatation que:
— les 14 premiers triplets (dans le sens de la lecture f2), à partir du nucléotide numéroté 3030 vis-à-vis de l'extrémité terminale EcoRI, sont respectivement capables de coder les 14 premiers aminoacides de la séquence proximale des 15 premiers aminoacides des susdits polypeptides,
— les 4 derniers triplets GTA TAC ATT TAA lus sur la chaîne complémentaire b2 à la chaîne transcrite bj correspondent respectivement aux 3 aminoacides terminaux des susdits polypeptides et à un codon d'arrêt;
— cette séquence de nucléotides (678 nucléotides) ne comprend aucun codon d'arrêt, du moins lorsque l'on adopte le cadre de lecture impliquant que le premier triplet «lu» sur l'ADN par la machinerie cellulaire soit AUG (correspondant sur le brin complémentaire à ATG);
— la traduction complète de l'information génétique commençant avec le codon initial ATG conduit à un polypeptide théorique de 226 aminoacides, ayant un poids moléculaire de 25 422 daltons.
La structure nucléotidique du «gène S» ainsi que la chaîne poly-peptidique résultant de la traduction du «gène S» sont représentées aux figures 3A, 3B, 3C.
Ces valeurs-sont tout à fait conformes aux données analytiques qui résultent de la mobilité électrophorétique du polypeptide I sur des gels de Polyacrylamide qui ont déjà été décrits par les auteurs précédents (références 9-12 selon la bibliographie figurant à la fin de la description de la présente demande de brevet).
La différence observée au niveau du 15e aminoacide de la séquence peptidique proximale du polypeptide I: leucine selon les cartes des figures 2A, 2B, 2C et 3A, 3B, 3C mentionnées ci-dessus, et non sérine selon les concentrations des susdits auteurs, peut peut-être être attribuée au fait que ces auteurs ont travaillé avec un variant génétique différent de celui ayant fait l'objet de la présente étude. On notera que la différence peut d'ailleurs être rapportée à la substitution d'un seul nucléotide dans le triplet concerné «ITA» dans le «gène S» particulier représenté dans les cartes des figures 2A, 2B, 2C et 3A, 3B, 3C, au lieu de «TCA», l'un des triplets susceptibles d'être traduits en sérine.
A ce titre, l'invention concerne donc un acide nucléique qui est défini dans la revendication 1.
De préférence, l'acide nucléique comporte une séquence nucléotidique désignée dans la revendication 2. Ces fragments étant plus particulièrement caractérisés en ce qu'ils contiennent la partie du «gène S» susceptible de coder la partie de la protéine de l'enveloppe du virus qui est responsable des propriétés immunologiques du virus de l'hépatite B. Les séquences nucléotidiques utilisées présentent l'une par rapport à l'autre une variabilité conduisant, lors de leur expression, à la formation de déterminants variant selon le sous-type du virus de l'hépatite B (sous-types d, w, y, r du groupe a).
Pour l'une des séquences peptidiques représentées aux figures 3A, 3B, 3C, on observera que le premier acide aminé de la séquence susdite: méthionine, est N-terminal et que l'aminoacide de l'extrémité opposée: isoleucine, est C-terminal. •
Une séquence nucléotidique préférée est représentée aux figures 4A, 4B. Elle code la séquence peptidique telle qu'elle résulte de la figure 5 ou toute séquence peptidique analogue douée de propriétés immunogènes équivalentes.
Il va de soi que par «séquence peptidique équivalente», mentionnée ci-dessus, il faut entendre toute séquence peptidique dans laquelle certaines parties peuvent n'être pas rigoureusement identiques aux parties correspondantes de la séquence peptidique représentée dans les figures 3A, 3B, 3C et 5, ces variations pouvant être dues à des mutations locales n'affectant pas le caractère immunogène général de la protéine ou à des modifications de structure tenant aux différents sérotypes sous lesquels les protéines du genre en question sont susceptibles de se présenter (notamment sérotypes adw, adr et ayr).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
663 796
4
La séquence nucléotidique peut contenir la séquence peptidique telle qu'elle est représentée à la figure 6 ou toute séquence peptidique analogue douée de propriétés immunogènes équivalentes.
Les séquences peptidiques suivantes sont aussi préférées:
Alamine-Glutamine-Glycine-Thréonine-Sérine
Thréonine-Alamine-Glutamine-Glycine-Thréonine-Sérine
Thréonine-Thréonine-Alamine-Glutamine-GYcine-Thréonme-
Sérine
Dans le premier peptide susindiqué, l'extrémité alanine est N-terminale et l'extrémité sérine est C-terminale.
Dans les deuxième et troisième peptides susindiqués, l'extrémité thréonine est N-terminale et l'extrémité sérine est C-terminale.
A titre d'exemple, on peut notamment préparer le pentapeptide en partant de la sérine C-terminale à laquelle on accroche la thréonine par la méthode de Castro décrite dans Tetrahedron Letters, 1975 N° 14, page 1219-1222. Ensuite, les acides aminés glycine, glu-tamine, alanine sont rajoutés par la méthode dite de l'anhydride mixte répétée (méthode rema) décrite par Beierman dans Chemistry and Biology of Peptides, Ed. J. Meienhofer, Ann. Arbour Science Pubi., Ann. Arb. Mich. 351 (1972).
Les produits résultant de la fixation du pentapeptide sur une molécule porteuse plus grosse sont notamment de type polypeptide ou protéine, et on peut préparer des compositions contenant ce pentapeptide en produits de fixation, notamment en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, et plus particulièrement des vaccins contre l'hépatite B. Ces véhicules pharmaceutiques sont appropriés, de façon en soi classique, au mode d'administration choisi, notamment par voie orale, parentérale, rectale ou par nébuli-sation sur des muqueuses, notamment nasales.
L'hexapeptide et le polypeptide à 7 acides aminés peuvent être synthétisés par des techniques de synthèse peptidique classiques.
Ces peptides sont tenus pour être le site antigénique des polypeptides de plus grande taille dont il est question plus haut et responsables du pouvoir vaccinant de l'enveloppe virale (Journal of Biol. Stand. 1976, 4, 295-304, RAO et VYAS «Biochemical Characteriza-tion of Hepatitis B Surface Antigen in Relation to Serologie Activ-ity»).
Les fragments d'ADN susceptibles de coder la production de tels pentapeptide, hexapeptide et polypeptide à 7 acides aminés sont:
— pour le pentapeptide, notamment du polynucléotide de formule:
5' GCT CAA GGA ACC TCT 3'
3' GGA GTT CCT TGG AGA 5'
— pour l'hexapeptide, notamment du polynucléotide de formule:
5' ACT GCT CAA GGA ACC TCT 3'
3' TGA CGA GTT CCT TGG AGA 5'
— pour le polypeptide à 7 acides aminés du polynucléotide de formule:
5'ACT ACT GCT CAA GGA ACC TCT 3'
3' TGA TGA CGA GTT CCT TGG AGA 5'
ou, dans chacun des trois cas, du polynucléotide complémentaire relatif aux trois polynucléotides respectifs précédents ou encore tout polynucléotide dans lequel chacun des triplets peut être remplacé par tout triplet analogue capable de coder la production du même aminoacide.
L'acide nucléique selon l'invention peut encore comporter au moins l'un des deux brins mutuellement complémentaire d'une séquence d'ADN telle que représentée dans les figures 4A, 4B (dans lesquelles figurent également les nombres correspondant aux positions des premiers nucléotides de chacun des fragments successifs de 10 nucléotides représentés vis-à-vis de la position EcoRI non représentée dans la figure: il va de soi que ces nombres n'interviennent pas au niveau de la caractérisation de la séquence nucléotidique du genre en question). Ce fragment d'ADN est délimité par deux sites HincII.
On appréciera que cette séquence nucléotidique correspond à l'information génétique dont la traduction conduit à la séquence peptidique représentée à la figure 5.
Les séquences nucléotidiques équivalentes à simple brin ou à double brin sont notamment le brin ayant la structure qui découle de la succession des lignes inférieures des figures 4A, 4B, l'ADN à double brin correspondant, ou les ARN messagers correspondants, 5 notamment celui représenté par les enchaînements complémentaires de nucléotides constitués par les lignes inférieures des paires de lignes des figures 4Aj 4B jsens de la flèche f^j.
De même entrent dans le champ de l'invention les chaînes nucléotidiques qui se différencient des précédentes par certains triplets io ou petites séquences de triplets, dans la mesure où ces séquences nucléotidiques restent aptes à coder un polypeptide conservant les activités immunogènes caractéristiques des virus de l'hépatite virale B. D'une façon générale, il s'agit de chaînes de nucléotides qui, le cas échéant, après dénaturation de l'ADN à double brin pour produire 15 les acides nucléiques à simple brin correspondants, restent susceptibles de s'hybrider sur au moins environ 90% de leur longueur avec l'un des brins de l'ADN des figures 4A, 4B.
Des acides nucléiques préférés selon l'invention sont encore ceux qui peuvent être excisés à partir de l'ADN de l'hépatite virale et qui, 20 lorsqu'ils sont à double brin, sont caractérisés par l'existence à l'un de leurs bouts d'une extrémité HincII, Hhal, Aval ou EcoRI et à leur autre bout par une extrémité Avalli, HincII ou Hhal.
Les positions de ces diverses extrémités vis-à-vis du site EcoRI sont schématisées dans les figures 2A, 2B, 2C.
25 L'invention concerne également l'utilisation de l'acide nucléique tel qu'il a été défini plus haut, pour l'utilisation définie dans la revendication 14.
L'acide nucléique selon l'invention peut également être utilisé comme sonde pour dépister la présence ou non dans des échantillons 30 de sang ou de sérum d'épreuve, de particule de Dane, d'antigène HBs ou de fragments de celui-ci, etc. (par technique classique d'hybridation ADN-ADN).
D'autres caractéristiques préférées de l'invention apparaîtront encore au cours de la description d'exemples préférés, en combinai-35 son avec les dessins dans lesquels:
— les figures la et 1 h illustrent schématiquement les étapes successives de la fabrication d'un vecteur du type plasmide incorporant un fragment de HBV DNA,
— les figures 2a à 2c illustrent schématiquement les structures initia-40 les du vecteur utilisé (figure 2a) final du vecteur modifié obtenu
(figure 2b) et celle de la protéine hybride résultant de l'expression de ce vecteur modifié dans E. coli (figure 2c).
A. Séquences nucléotidiques 45 Les produits et méthodes utilisés
Les enzymes et les produits chimiques utilisés
Les enzymes de restriction utilisées, BamHI, Hhal, HincII, HaelII, Xbal, Mbol, Hinfl, Hpall, Xhol, sont celles fabriquées par 50 BIOLABS. On a utilisé l'ADN-polymérase I de BOEHRINGER. La phosphatase alcaline bactérienne et la polynucléotide-kinase ont été fournies par P.L. BIOCHEMICALS. Les agents chimiques étaient les suivants:
Diméthyl sulfate (ALDRICH),
55 Hydrazine (EASTMAN KODAK),
Acrylamide et bis-acrylamide (2 fois cristallisés - SERVA), Didéoxy nucléotide triphosphates et déoxynucléotide triphosphates (P.L. BIOCHEMICALS), Pipéridine (MERCK) redistillée sous vide.
60
Préparation d'ADN HBV
Le génome HBV entier (sous-type ayw) a été cloné dans E. coli en mettant enjeu le site unique de restriction EcoRI du vecteur Xgt.WES. MB (14). L'ADN cloné est dénommé ci-après «Eco HBV 65 DNA».
Le bactériophage recombinant a été amplifié en boîte de Pétri sur Agar et on a extrait l'ADN recherché de façon en soi connue. Après digestion de l'ADN par l'enzyme de restriction EcoRI, on a purifié
5
663796
la séquence Eco HBV DNA par ultracentrifugation, dans un gradient de sucrose, selon la technique décrite dans les références bibliographiques (16, 17).
Préparation de fragments d'ADN marqués 5'32P
10 à 20 picomoles d'ECO HBV DNA ont été complètement hy-drolysées par les différentes enzymes de restriction, dans les conditions recommandées par le fabricant. Les fragments d'ADN ont été déphosphorylés par la phosphatase alcaline, celle-ci ayant ensuite été inactivée par un traitement alcalin. L'ADN a alors été précipité à l'éthanol, selon la technique décrite dans l'article (18). Après redissolution dans un tampon à base de spermidine, les ADN ont été marqués à leurs extrémités 5' avec un ATP {Ä,32P} (3000 Ci/mM fabriqué par NEW ENGLAND NUCLEAR) et avec de la polynu-cléotide-kinase (selon la technique visée à l'article (19).
Les fragments d'ADN de restriction ont été séparés par électro-phorèse sur gel de Polyacrylamide, puis élués. Les extrémités marquées ont fait l'objet de ségrégations par électrophorèse sur gel de Polyacrylamide de façon connue en soi, après restriction avec une autre enzyme ou par dénaturation des fragements d'ADN du genre en question.
Détermination de la structure des séquences de nucléotide de l'ADN
La structure primaire des fragments d'ADN à double brin ou simple brin a été déterminée essentiellement selon la technique décrite par MAXAM et GILBERT (19). L'on a aussi eu recours à la méthode des inhibiteurs terminaux de chaînes décrite par SANGER et al. (20) et adaptée par MAAT et SMITH (21), pour ce qui est des fragments à double brin marqués à l'une de leurs extrémités 5'.
Les produits de réaction chimique et enzymatique ont été analysés par électrophorèse dans des gels de séquence d'acrylamide à 8,16 ou 25%, de 1 mm d'épaisseur.
Les techniques et les résultats de l'analyse
Afin de déterminer si le génome HBV est capable de coder les polypeptides I et II, tous les fragments HaelII (sites de restriction HaelII du génome HBV représentés sur la figure 1 par de petites flèches) ont été marqués à leurs extrémités 5'. Des parties substantielles de leurs structures primaires ont été déterminées par la méthode de MAXAM et GILBERT. Les séquences de nucléotides susceptibles de coder les séquences d'aminoacide proximales et terminales des polypeptides I et II ont été localisées dans les fragments HaelII E et HaelII F, préalablement localisés sur la carte de restriction du génome HBV (selon la technique décrite dans la référence (17). Ce sont ces séquences de nucléotides qui ont été considérées comme consistant en les extrémités du «gène S» occupant elles-mêmes les positions 73,6 et 95,1 vis-à-vis du site de restriction EcoRI (figure 1) pour les raisons déjà indiquées.
La séquence de nucléotides entre ces deux positions a été analysée en ayant recours aux techniques chimiques connues, notamment par la méthode de dégradation chimique à l'hydrazine diméthyl sulfate et la méthode des terminaisons de chaînes. On a eu recours, parmi les réactions chimiques variées proposées par MAXAM et GILBERT, à une dépurination. partielle par l'acide formique et au clivage par la pipéridine, méthodes qui donnent des bandes d'intensité égale sur les autoradiogrammes pour les fragments terminés par une guanine et une adénine. On a également utilisé les réactions à l'hydrazine suivies d'un clivage à la pipéridine, pour obtenir des bandes d'égale intensité, pour les nucléotides cytosine et thymidine: le fractionnement électrophorétique des produits de ces deux réactions donne pour toutes les bases une tache dans l'une ou l'autre des colonnes de gel utilisées. Cette procédure facilite la lecture de l'auto-radiogramme du gel. La réaction à l'hydrazine en présence de chlorure de sodium spécifique pour la cytosine permet de distinguer ce nucléotide de la thymidine et la réaction au diméthyl sulfate suivie d'un clivage par la pipéridine spécifique de la guanine permet de distinguer ce dernier nucléotide de l'adénine.
De façon à s'assurer du plus grand possible degré de précision, des séquences distinctes de nucléotides formant différents fragments se chevauchant mutuellement ont été produites par hydrolyse d'Eco HBV DNA par diverses enzymes de restriction:
BamHi, Hinfï, Hpall, HaelII et HincII.
De cette façon, l'analyse de chacun des sites de restriction utilisés comme points de départ de premiers fragments étudiés a été confirmée par l'analyse des fragments distincts dans lesquels les sites de restriction des premiers fragments se trouvaient compris entre les nouvelles extrémités de ces fragments distincts.
Le «gène S» représenté aux figures 3A, 3B, 3C, qui commmence par le codon d'initiation ATG, comprend 227 triplets, dont un codon d'arrêt TAA. Les 3 codons correspondant aux 3 acides aminés de l'extrémité carboxy terminale du polypeptide correspondant sont situés dans le même cadre de lecture, immédiatement avant le codon d'arrêt TAA. L'un des deux autres cadres de lecture (respectivement décalés vis-à-dis du précédent de 1 et 2 nucléotides) est également dépourvu de codon d'arrêt, mais code une protéine tout à fait différente des polypeptides I et II susmentionnés. Le troisième cadre de lecture comprend 10 codons d'arrêt (5 TAG, 4 TGA, 1 TAA). Sur l'autre brin d'ADN, les trois cadres de lecture se trouvent respectivement fermés par 11, 11, et 6 codons d'arrêt distribués le long de la séquence d'ADN.
Comme on l'a déjà indiqué plus haut, la traduction complète de l'information génétique débutant par le codon d'initiation ATG conduit à un polypeptide théorique de 226 aminoacides correspondant à un poids moléculaire de 25 422 daltons.
Il est intéressant de souligner que la séquence nucléotidique correspondant au «gène S» devrait normalement être lue entièrement au cours de la traduction.
Sont également parties de l'invention des chaînes de nucléotides du type du «gène S» ci-dessus décrit, qui comporte de petites séquences supplémentaires pouvant contenir jusqu'à une centaine de nucléotides ou qui au contraire peuvent en être dépourvues, sans que soit pour autant altérée l'information génétique correspondante (22,23).
Les différents fragments de l'invention qui ont été définis plus haut peuvent être obtenus à partir de la séquence d'ADN dite Eco HBV DNA, en ayant recours aux enzymes de restriction correspondantes et aux techniques de fractionnement connues des fragments d'ADN, notamment surgel de Polyacrylamide et en mettant à profit leurs migrations sur des distances qui sont fonction de leurs poids moléculaires. Ainsi peut-on par exemple obtenir le fragment dont l'une des extrémités est délimitée par un site EcoRI et l'autre par un site Avalli en opérant une restriction Eco HBV DNA par l'enzyme Avalli, le fragment recherché consistant dans le plus petit fragment obtenu (un seul site Avalli dans Eco HBV DNA).
Le fragment délimité par des extrémités opposées EcoRI et Hhal est obtenu par hydrolyse d'Eco HBV DNA par EcoRI d'abord, puis par hydrolyse partielle par l'enzyme de restriction Hhal. L'on récupère alors parmi les produits de restriction celui qui contient le site Avalli.
Ces techniques de restriction n'ont évidemment été proposées qu'à titre d'exemple, étant bien entendu que le spécialiste est à même de déterminer les ordres de traitement par les enzymes de restriction pour isoler, à partir notamment d'Eco HBV DNA, les fragments ayant les extrémités de restriction utiles.
A toutes fins utiles, on rappellera que ces opérations de restriction peuvent être réalisées au sein d'un tampon Tris lOmM; pH 7,8; MgCl2 6mM; ß-mercaptoethanol 6mM, le même milieu contenant en outre et de préférence 50mM de NaCl lorsque EcoRI est utilisé.
Les fragments d'ADN susdécrits peuvent être utilisés à titre de sonde permettant le diagnostic de la présence dans un sérum de particules de Dane ou particules dérivées de la précédente, porteuses d'un ADN susceptible de coder une protéine immunogène caractéristique de l'hépatite B.
L'ADN selon l'nvention peut également être incorporé à un vecteur permettant, à condition que l'incorporation ait été réalisée en phase, l'expression de cet ADN dans une bactérie ou autre microorganisme, ou dans des cellules eucaryotes.
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B. Vecteurs contenant une séquence nucléotidique de l'antigène HBs Construction d'un bactériophage recombinant Xlac HBs-1
Les produits au niveau des différentes étapes de cette construction sont visés dans les figures la et lh. Ils sont également visés par les numéros la et lh.
On a indiqué dans la figure la les positions du «gène S» et de certains sites d'enzyme de restriction.
Après traitement de DNA + HBV avec l'enzyme de restriction Hhal, on sépare un fragment d'ADN (lb) contenant 1084 paires de bases, et plus particulièrement la totalité du «gène S», par électrophorèse sur gel d'agarose et électro-élution (figure lb). On prépare, à partir de ce sous-fragment, traité au préalable par l'endonucléase SI, un sous-fragment (le) (figure le), résultant de l'allongement du sous-fragment (lb) à ses extrémités, par des éléments d'ADN dénommés «EcoRI linkers» de formule:
5' GGAATTC
CCTTAAGG 3'
Le fragment obtenu est, après formation des extrémités cohésives EcoRI, cloné dans le plasmide pBR322.
Le plasmide obtenu, dénommé ci-après pBRHBs (figure ld), ne contient qu'un seul site de restriction Xbal situé à proximité de la tête du «gène S».
Par digestion du plasmide recombinant pBRHBs avec un mélange d'enzymes EcoRI et Xbal, on produit un fragment d'ADN comprenant approximativement 980 paires de bases et comportant la majeure partie du «gène S» (figure le). Ce fragment est séparé et purifié par électrophorèse sur un gel d'agarose. Le fragment obtenu est à nouveau traité vers l'endonucléase SI, puis à nouveau pourvu d'extrémités EcoRI au moyen des susdits «EcoRI linkers», puis soumis à un traitement avec l'endonucléase EcoRI pour reformer les extrémités cohésives correspondantes. Le fragment de la figure le qui comprend environ 980 paires de bases est alors inséré par fusion in vitro dans le site EcoRI du plasmide pBR322, pour former le plasmide pXbaHBs (figure lf). Ce plasmide est cloné de façon usuelle comme le plasmide pBR322.
Plusieurs clones ont été obtenus.
On extrait et purifie, après traitement avec EcoRI des ADN de trois de ces clones, pXbaHBs-1, pXbaHBs-2, pXbaHBs-3 (figure lg), les fragments appelés ci-après «fragments HBs»
(figure lh).
Les séquences nucléotidiques des extrémités des susdits fragments (normalement obtenues à l'intérieur du «gène S») sont déterminées en ayant recours à la procédure décrite par MAXAM et GILBERT (Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74, 560-564 (1977). Ces déterminations ont révélé que les séquences des nucléotides des extrémités terminales, correspondant au «gène S», n'étaient pas identiques dans les trois clones (figure lg), les différences sont vraisemblablement dues à des hétérogénéités produites au cours de la digestion par l'endonucléase SI.
Les deux fragments provenant de pXbaHBs-1 et pXbaBHs-2 sont insérés par fusion in vitro dans le génome du bactériophage Xplac 5-1 (21), lequel n'a qu'un seul site EcoRI situé à proximité de l'extrémité du gène lac Z. Du fait du cadre de lecture du gène lac Z, tel qu'il peut être produit de la séquence d'aminoacides de la ß-galactosidase (23), on constate — et l'expérience le confirme — que l'insertion du fragment HBs de pXbaHBs-1 dans le site EcoRI du gène lac Z de X.plac 5-1 doit conduire à la conservation de la phase de lecture adéquate du «gène S». Au contraire, l'insertion du fragment HBs de pXbaHBs-2 devait se révéler ne pas pouvoir être insérée dans le précédent vecteur avec conservation du cadre de lecture approprié. Il a néanmoins été utilisé comme témoin dans des expériences postérieures.
Ces opérations ont été réalisées en ayant recours à des techniques connues. En particulier, les «fragments HBs» de pXbaHBs-1, pXbaHBs-2 ont été insérés au moyen d'une ligase dans l'ADN de Xplac 5-1 qui avaient au préalable été clivés par EcoRI. Les mélanges des fragments d'ADN obtenus ont été ensuite utilisés pour trans-
fecter la souche CóOORecBC rk mk de E. coli. Les clones de bactériophage devenus lac- du fait de l'insertion des fragments HBs dans les sites EcoRI du gène lacZ sont amplifiés et purifiés selon la méthode décrite en (21).
s Les ADN des différents bactériophages ont été extraits et les orientations des fragments d'ADN insérés déterminées par analyse électrophorétique de leurs fragments de restriction BamHI. L'on peut ainsi déterminer que deux phages appelés MacHBs-1 et XlacHBs-2 correspondant au plasmide pXbaHBs-1 et pXbaHBs-2 io contenaient un fragment HBs correctement orienté.
La figure 2a est une carte schématique du vecteur Xplac 5-1 avant sa modification par le fragment HBs-1, issu du pXbaHBs-1.
La figure 2b est une carte schématique d'une partie de ce même vecteur montrant la modification introduite dans son gène Z par in-15 sertion dans son site EcoRI du susdit fragment HBs-1.
La figure 2c schématise les structures du polypeptide hybride obtenu comme résultat de l'expression du vecteur modifié de la figure 2b.
L'expression a été obtenue par transfection d'une souche de bac-20 térie de E. coli, notamment d'une souche HfrAlacX74.
Des souches de E. coli, notamment une souche de E. coli HfrAlacX74, ont été transformées par Xplac 5-1, XlacHBs-1 et X.lacHBs-2 respectivement. Après culture, les cellules sont lysées et les lysats obtenus analysés par électrophorèse sur gel de polyacryl-25 amide SDS (24) et les protéines sont détectées par coloration au bleu de coomassie. On constate la présence d'une bande plus intense parmi les produits d'expression de >„plac 5-1 au niveau de la position correspondante, pour un témoin, à celle de la ß-galactosidase (poids moléculaire de 116 248) et d'une bande distincte parmi les produits 30 d'expression de IlacHBs-1 (non présente parmi les produits d'expression de XlacHBs-2) correspondant à une nouvelle protéine ayant un poids moléculaire de l'ordre de 135 000-141 000.
Les protéines synthétisées par les bactéries transférées tant par MacHBs-1 que par A-plac 5-1 sont marquées par la (3SS) méthionine. 35 La mise en présence de ces protéines avec un sérum anti-HBsAg et la réalisation d'un autoradiogramme du gel de Polyacrylamide SDS révèlent la présence parmi les produits d'expression du seul XlacHBs-I d'une bande à laquelle ne correspond pas de bande équivalente parmi les produits d'expression des autres vecteurs. Cette bande dis-40 paraît de façon spécifique lorsque l'immunoprécipitation est réalisée en présence de HBs Ag non marqué. On observe encore la même bande parmi les produits d'expression XlacHBs-I, lorsque l'immunoprécipitation est réalisée avec un antisérum à l'égard de la ß-galacto-sidase.
45 La structure présumée de la partie de protéine hybride obtenue, au niveau de la fusion entre le gène lacZ et le fragment HBs-1,
résulte de la figure 2c qui fait apparaître le fragment «ß-gal», correspondant à la ß-galactosidase (1005 acides aminés), le fragment HBsAg (192 acides aminés), ces fragments étant séparés par un acide so aminé prolyne, correspondant à une partie de «EcoRI linker» contenu dans le vecteur XlacHBs-1.
C. Procédé de fabrication d'une molécule immunogène codée par 55 l'acide nucléique selon l'invention
L'invention peut par conséquent permettre la production d'une protéine de masse moléculaire plus faible que les polypeptides I ou II susvisés, douée des mêmes propriétés immunogènes.
Les résultats démontrent que E. coli, ou tout autre micro-orga-6o nisme approprié, tel qu'une bactérie ou une culture de cellule euca-ryote, peut être infecté par le /UacHBs-1 et synthétiser une protéine ayant un poids moléculaire de l'ordre de 138 000 et possédant les déterminants antigéniques à la fois de HBsAg et de la ß-galactosidase. Cette molécule est représentative des polypeptides hybrides qui 65 peuvent être obtenus par le procédé selon l'invention, dans lequel HBsAg est relié à une protéine support (résultant de la substitution partielle ou totale du fragment ß-galactosidase), ces hybrides possédant néanmoins les propriétés antigéniques de HBsAg. Ces nouvel
les molécules sont utiles pour la production de vaccins actifs contre l'hépatite virale B.
En annexe de cette description figure la bibliographie, et en particulier les références qui ont été citées dans le cadre de la présente description.
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25
30
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40
45
50
7 feuilles dessins

Claims (14)

663 796
1 J 1
'ordre de 1000-1100 nucléotides et qu'il est apte à coder une séquence peptidique immunogène, contenue dans l'antigène de surface de l'hépatite B et elle-même apte à induire in vivo la production d'anticorps actifs à l'égard du virus de l'hépatite B.
1. Acide nucléique, caractérisé en ce qu'il comprend au plus de
2. Acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte une séquence nucléotidique capable de coder la séquence peptidique représentée dans les figures 3A, 3B, 3C ou une séquence peptidique analogue douée de propriétés immunogènes équivalentes.
2
REVENDICATIONS
3. Acide nucléique selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comporte une séquence nucléotidique représentée aux figures 4A, 4B, capable de coder la séquence peptidique représentée dans la figure 5 ou une séquence peptidique analogue douée de propriétés immunogènes équivalentes.
4. Acide nucléique selon les revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comporte une séquence nucléotidique capable de coder la séquence peptidique représentée à la figure 6 ou une séquence peptidique analogue douée de propriétés immunogènes équivalentes représentée à la figure 6.
5. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il contient une séquence capable de coder la séquence peptidique:
Alanine (N-terminale) - Glutamine - Glycine - Thréonine - Sérine (C-terminale).
6. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il contient une séquence capable de coder la séquence peptidique:
Thréonine (N-terminale) - Alanine - Glutamine - Glycine - Thréonine - Sérine (C-terminale).
7. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il contient une séquence capable de coder la séquence peptidique:
Thréonine (N-terminale) - Thréonine - Alanine - Glutamine -Glycine - Thréonine - Sérine (C-terminale).
8. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il comporte au moins l'un des deux brins mutuellement complémentaires d'une séquence d'ADN telle que représentée dans les figures 4A, 4B ou un brin susceptible de s'hybrider avec le précédent.
9. Acide nucléique selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comporte au moins l'un des deux brins mutuellement complémentaires d'une séquence d'ADN telle que représentée dans les figures 3A, 3B, 3C ou un brin susceptible de s'hybrider avec le précédent.
10. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il est à double brin et en ce qu'il est délimité à l'un de ses bouts par une extrémité HincII, Hhal, Aval, ou Eco RI, et à son autre bout par une extrémité Avalli, HincII, ou Hhal.
11. Acide nucléique selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il contient la séquence 5' CGT CAA GGA ACC TCT 3' ou la séquence complémentaire de la précédente, ou encore une séquence dans laquelle l'un au moins des susdits triplets est remplacé par un autre triplet, cependant capable de coder le même aminoacide.
12. Acide nucléique selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il contient la séquence 5' ACT GCT CAA GGA ACC TCT 3', ou la séquence complémentaire de la précédente, ou encore une séquence dans laquelle l'un au moins des susdits triplets est remplacé par un autre triplet, cependant capable de coder le même aminoacide.
13. Acide nucléique selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il contient la séquence 5' ACT ACT GCT CAA GGA ACC TCT 3', ou la séquence complémentaire de la précédente, ou encore une séquence dans laquelle l'un au moins des susdits triplets est remplacé par un autre triplet, cependant capable de coder le même aminoacide.
14. Utilisation de l'acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 13, pour la modification d'un vecteur permettant l'expression d'une séquence d'acide nucléique étrangère à ce vecteur dans un micro-organisme ou dans une cellule eucaryote, celui-ci ou celle-ci 5 étant alors à son tour capable de produire une protéine comportant une séquence peptidique susceptible d'induire dans l'organisme d'un hôte vivant la production d'anticorps actifs contre l'hépatite virale B.
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