CH646456A5

CH646456A5 - Procede de production d'un adn comprenant le genome du virus de l'hepatite b et vecteur le comportant.

Info

Publication number: CH646456A5
Application number: CH1099879A
Authority: CH
Inventors: Pierre Tiollais; Alex Fritsch; Christine Pourcel; Patrick Charnay
Original assignee: Pasteur Institut; Inst Nat Sante Rech Med
Priority date: 1978-12-18
Filing date: 1979-12-12
Publication date: 1984-11-30
Also published as: GB2034323A; OA06416A; DE2950995A1; BE880670A; GB2034323B; FR2444713A1; DE2950995C2; FR2444713B1

Description

L'invention est relative à un procédé de production d'un ADN (acide désoxyribonucléique) comprenant le génome caractéristique de celui du virus de l'hépatite B. Elle concerne également des ADN, dont un fragment est constitué par un ADN double brin correspondant à celui de l'hépatite virale B. Elle est enfin relative à des vecteurs et compositions comportant de tels ADN, en vue de la mise en œuvre de leurs propriétés biologiques.

L'hépatite B est une maladie virale fréquente, tout particulièrement en Afrique tropicale, en Asie du Sud-Est et en Extrême-Orient où environ 10% des individus sont porteurs de l'antigène viral de surface ou antigène HBs.

Si l'affection se traduit souvent par une forme aiguë sans lendemain, elle peut également être à l'origine d'une hépatite chronique, d'une cirrhose, voire d'une nécrose hépatique mortelle. Cela explique l'importance des études consacrées à la biologie du virus, et la récente mise au point d'un vaccin dont l'efficacité a été démontrée sur des malades et des membres du personnel de centres d'hémodia-lyse (Ph. Maupas, A. Goudeau, P. Coursaget, J. Drucker et Ph. Ba-gros, «Intervirol.», 10, 1978, pp. 196-208). La particule de Dane (D. S. Dane, C. H. Cameron et M. Briggs, «Lancet. i.» 1970, pp. 695-698) est considérée actuellement comme l'agent viral étiolo-gique. Cette particule, qui peut être mise en évidence par observation au microscope électronique, a un diamètre de 42 mm. Le sérum de malade à la phase préictérique en contient jusqu'à 10® voire 1010/ml. Elle possède une enveloppe (antigène Australia ou antigène HBs), une capside (antigène Hbc), une polymérase endogène et une molécule d'ADN (J. L. Melnick, G. R. Dreesman et F. B. Hollinger,

«Sc. Amer.», 237,1977, pp. 44-52). Observé au microscope électronique, le génome apparaît comme un cercle d'ADN bicaténaire possédant une région monocaténaire, dont la longueur varie d'une molécule à l'autre (J. Summers, A. O'Connell et I. Millman, «Proc. Nat. Acad. Se.», 72,1975, pp. 4597-4601 ; W. S. Robinson, «Ann. Rep. Microbiol.», 31, 1977). Ce cercle est constitué de deux molécules linéaires appariées et de longueurs inégales (comme schématique-ment représenté à la fig. 1). C'est le plus petit génome viral connu chez les mamifères. Le brin le plus long contient environ 3200 bases. L'ADN polymérase endogène peut être utilisée pour réparer in vitro la région simple brin (bj à la fig. 1) du brin le plus court (T. A. Landers, H. B. Greenberg et W. S. Robinson, «J. Virol.», 23, 1977, pp. 368-376). Toutes ces propriétés très particulières de la particule de Dane augmentent encore l'intérêt d'étudier la biologie de ce virus.

L'étude du virus est cependant à ce jour rendue particulièrement difficile en raison des difficultés d'approvisionnement en sérum contenant des particules de Dane et même un sérum riche ne permet pas de préparer de grandes quantités d'ADN (de l'ordre de 1 y d'ADN par volume de 500 ml de sérum). Il est donc nécessaire de rassembler des sérums d'origines diverses correspondant à plusieurs variants génétiques (J.P. Soulier et A. M. Courouce-Pauty, «Vox Sang.», 25, 1973, pp. 212-235), ce qui rend aléatoire une étude de la structure primaire du génome. La présence de la région simple brin rend, par ailleurs, difficile l'établissement d'une carte physique par des enzymes de restriction.

Le problème de l'isolement de quantités relativement importantes de particules virales revêt une importance encore accrue, lorsque l'on souhaite disposer de quantités suffisantes de particules virales, plus particulièrement de leurs antigènes HBs, lesquels paraissent porter un antigène de surface (protéine) ayant des propriétés vaccinantes. Les méthodes actuelles de vaccination, si elles ont démontré leur efficacité, ne sont cependant pas absolument dépourvues d'inconvénients. En particulier, les préparations de HBs, utilisées comme vaccin, peuvent contenir des composants antigéniques provenant des cellules hépatiques, qui peuvent être à l'origine d'une réponse auto-immunitaire (B. S. Blumberg, «Science», 197,1977, pp. 17-24).

L'invention a donc pour but de remédier notamment à ces difficultés, plus particulièrement de fournir un procédé permettant l'obtention d'ADN du virus de l'hépatite B (ou de la particule de Dane), en quantités suffisantes pour la réalisation des études susdites, et dans un état de pureté tel que son utilisation puisse être envisagée, même en vue d'applications thérapeutiques.

L'invention met à profit le fait que l'ADN de la particule de Dane possède, après réparation in vitro en présence de nucléotides précurseurs et d'une polymérase, un site unique de reconnaissance à l'égard de certaines endonucléases, notamment enzymes de restriction, telles que l'enzyme EcoRI ou Xho.

Le procédé de production d'un ADN comprenant le génome caractéristique de celui de l'ADN du virus de l'hépatite B se caractérise par le clonage dans une bactérie d'un ADN double brin, formé à partir de l'ADN virus de l'hépatite B, notamment après réparation de celui-ci in vitro comme indiqué ci-dessus. Cet ADN double brin sera ci-après désigné ADN-HVB. De préférence, la polymérase utilisée est la polymérase endogène du virus de l'hépatite B lui-même.

De préférence, l'ADN à cloner a, au préalable, été clivé par une endonucléase telle que ci-dessus définie, notamment par l'enzyme de restriction EcoRI.

Pour réaliser le clonage, on a avantageusement recours à un vecteur, notamment phage ou plasmide, dans lequel l'ADN double brin, préalablement clivé en son site unique, aura au préalable été inséré.

A titre d'exemple de phage permettant le clonage aisé de l'ADN double brin préalablement ouvert par EcoRI, on peut mentionner À,gtWES-XB (décrit par P. Leder, D. Tiemeier et L. Enquist, «Science», 196 (1977), pp. 175-179) qui ne comprend que deux sites EcoRI (sites EcoRI XI et EcoRI X2). Ceux-ci permettent l'insertion de la totalité de l'ADN du virus de l'hépatite B dans le génome de ce

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phage, en lieu et place du fragment interne à ce virus et antérieurement situé entre ces deux sites EcoRI.

Il va naturellement de soi que tout autre vecteur comprenant deux sites EcoRI, ou même un seul site EcoRI, dans une partie non essentielle à sa propre réplication, peut être mis en œuvre aux mêmes fins.

Ainsi, le procédé de clonage selon l'invention peut-il comprendre les étapes essentielles suivantes:

— la réparation de l'ADN de l'hépatite virale B en présence des nucléotides précurseurs et d'une polymérase pour former l'ADN-HVB;

— la coupure de l'ADN-HVB par l'enzyme choisie, notamment EcoRI;

— la coupure de l'ADN du vecteur, récupération des parties de cet ADN (deux ou trois selon que le vecteur comportait un ou deux sites EcoRI), séparation et isolement, notamment par ultracentrifu-gation des deux parties de cet ADN, qui contenaient en particulier respectivement les gènes de tête et de queue du phage et les gènes de réplication du phage (les deux opérations qui précèdent pouvant être effectuées simultanément);

— le mélange de ces deux parties de l'ADN-vecteur et de l'ADN-HVB et leur réaction en présence d'une ADN-ligase, notamment telle que la T4DNA-ligase;

— la transfection ou transformation d'une culture de bactéries-hôtes par les produits obtenus et, après incubation de la culture, la récupération des phages, l'extraction de leurs ADN recombinants, ci-après désignés par X-HVB1, qui contiennent alors l'ADN-HVB inséré dans leurs génomes et, le cas échéant, le traitement de ces derniers par l'enzyme EcoRI et l'isolement, notamment par ultracentri-fugation, de l'ADN-HVB, qui est repérable par électrophorèse en gel d'agarose, du fait qu'il migre comme la fraction la plus lente et dont la taille peut alors être évaluée à environ 3200 paires de bases.

On obtient donc des produits nouveaux qui sont d'une application directe dans plusieurs domaines.

Les ADN ainsi produits — avant ou après séparation de l'ADN-HVB, notamment par coupure avec EcoRI — sont utilisables comme sonde pour le diagnostic in vitro de la présence dans des échantillons biologiques de virus de l'hépatite B. A cet effet, ces ADN peuvent être marqués de toute façon en soi connue par un radioélément. L'utilisation de tels ADN marqués est particulièrement avantageuse en ce qu'elle ne requiert pas de prélèvements sanguins importants chez les personnes chez qui la présence de virus de l'hépatite B est suspectée.

A titre d'exemple, on peut souligner l'intérêt que revêt cette application pour l'étude des cas contagieux d'hépatite B ou de la détection de virus de l'hépatite B chez les personnes traitées dans des centres d'hémodialyse. De même, cette méthode de diagnostic est appropriée à la vérification des échantillons de sang devant être l'objet de transfusions sanguines.

L'invention concerne encore, à titre de produits nouveaux, les vecteurs dans lesquels est inséré un ADN double brin correspondant à celui de l'hépatite virale.

Dans un autre mode d'application de l'invention, on peut induire l'expression des vecteurs, telle qu'indiquée ci-dessus, dans une bactérie, en vue d'induire la synthèse d'une protéine hybride contenant en particulier l'antigène HBs, en vue de l'étude et de la préparation de vaccins à l'égard de l'hépatite virale B.

Dans cette optique, il peut être avantageux d'utiliser à titre de vecteur un bactériophage X modifié comprenant en combinaison:

— des mutations ayant pour effet de prévenir ou de retarder l'expression des gènes tardifs, particulièrement de régulation de la production des protéines nécessaires à l'encapsidation de cet ADN modifié dans une bactérie, notamment E. coli, pourvue de suppresseurs de ladite mutation;

— un fragment d'ADN comportant une partie au moins du gène Z de E. coti et un promoteur de l'opéron lactose (ou d'un opéron bactérien analogue) inséré dans une partie non essentielle du génome du phage, et

— un site de coupure par une endonucléase dans la susdite partie du gène Z, à l'exclusion de tout autre site de coupure par la même endonucléase dans le susdit ADN modifié.

Avantageusement, l'opéron bactérien considéré est l'opéron lactose de E. coli, les mutations des susdits gènes tardifs affectent les gènes Q et S et le site de coupure unique est un site EcoRI.

Un tel phage est décrit dans «Molec. Gen. Genet.», 170, pp. 171-178 (1979).

On peut alors procéder à la fabrication de la susdite protéine hybride contenant la protéine correspondant à l'ADN-HVB. Ce procédé est alors caractérisé en ce que l'on procède à l'infection avec ledit phage modifié d'une bactérie, notamment E. coli, non pourvue de suppresseurs des mutations des gènes tardifs de ce phage, et en ce que l'on procède à la culture de la souche bactérienne, le cas échéant en présence d'un inducteur de ß-galactosidase, la protéine hybride étant alors récupérable à partir des protéines cellulaires formées.

Si besoin, le vecteur utilisé (qu'il s'agisse du vecteur identifié ci-dessus à titre d'exemple ou de tout autre phage ou plasmide vecteur) peut être modifié pour assurer la lecture en phase correcte de l'ADN-HVB inséré dans ce vecteur. Cela peut être réalisé notamment en ayant recours à la technique consistant à insérer dans le vecteur en question soit deux paires, soit quatre paires de bases supplémentaires entre le point d'initiation de la traduction du fragment d'ADN dont l'expression est recherchée et la première paire de bases du site de reconnaissance proximal de l'enzyme de restriction, notamment d'EcoRI, qui est destiné à constituer la liaison entre la partie correspondante du vecteur et l'extrémité proximale de l'ADN-HVB qui doit être inséré. Les paires de bases ajoutées doivent naturellement être telles que ne soient pas introduits dans le vecteur des triplets de bases qui formeraient un codon non sens, dont l'effet serait d'interrompre la traduction. On obtient ainsi que les paires de bases, qui formaient trois à trois dans le premier vecteur les premières paires de bases de chacun des codons successivement traduits, deviennent dans au moins une partie des deux autres vecteurs, respectivement les deuxièmes et troisièmes paires (ou vice versa) des codons dont la traduction sera effectuée dans le même hôte, préalablement transfecté ou transformé par ces autres vecteurs. Il est ainsi possible de disposer d'un jeu de vecteurs permettant les trois phases de lecture possible.

Partant d'un premier vecteur comportant un site EcoRI à une distance déterminée du point d'initiation de la traduction, on peut obtenir l'un des deux autres vecteurs sus-indiqués, par exemple en mettant en œuvre le procédé qui consiste:

— à couper le premier vecteur au moyen de l'enzyme EcoRI au niveau de ce site,

— à recueillir celui des deux fragments de phage qui comprend le point d'initiation de la traduction,

— à rogner le brin monocaténaire de son extrémité cohésive EcoRI au moyen d'une endonucléase appropriée, par exemple l'en-donucléase SI,

— à recombiner le fragment ainsi modifié, au niveau de l'extrémité franche formée avec un fragment tel que celui dénommé linker de formule p5'GGAATTCC '

CCTTAAGG5'p qui possède lui-même un site de reconnaissance pour l'enzyme de restriction EcoRI,

— à produire la digestion du fragment de vecteur modifié en présence de EcoRI, ce qui conduit à l'obtention d'un fragment de vecteur dont la première paire de bases de l'extrémité cohésive EcoRI se trouve désormais décalée de deux paires de bases supplémentaires vis-à-vis de la position qu'elle occupait auparavant par rapport au point d'initiation de la traduction, et enfin

— à recombiner ce fragment ainsi modifié avec l'autre, notamment en présence d'une ADN-ligase, notamment la T4DNA-ligase.

L'opération qui vient d'être décrite peut être répétée une seconde fois pour produire un décalage semblable supplémentaire conduisant à l'obtention de la troisième phase possible de lecture.

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Après insertion de l'ADN-HVB dans chacun de ces trois vecteurs, on comprend que l'un de ces trois vecteurs sera en tout état de cause apte à être traduit correctement par les bactéries-hôtes appropriées, avec pour conséquence la production d'une protéine hybride contenant celle qui correspond à l'ADN-HVB.

D'autres caractéristiques de l'invention apparaîtront encore au cours de la description qui suit d'un exemple de clonage du génome du virus de l'hépatite B dans le phage A.gtWES-XB.

Référence sera faite aux dessins, dans lesquels:

— la fig. 1 est la représentation schématique d'un ADN-HVB naturel, tel que déjà visé dans le préambule;

— la fig. 2 est un schéma dérivé d'une photographie de trois molécules d'ADN-HVB prise en microscopie électronique, dont deux sont partiellement monocaténaires;

— les fig. 3 à 6 sont des reproductions tirées de photographies effectuées sous microscope électronique d'hétéroduplexes entre recombinant de l'ADN du phage X et de celui des ADN de l'hépatite virale, d'une part, et de l'ADN provenant directement des particules de Dane, d'autre part.

La fig. 1 représente schématiquement un ADN viral, tel qu'obtenu à partir d'une particule de Dane. Il comprend une région à simple brin b! et une région à double brin b2.

Ces régions b! et b2 sont repérées dans les schémas de la fig. 2 par des lignes respectivement fines et plus épaisses.

1. Purification et réparation de l'ADN du virus de l'hépatite B (ADN-

HVB).

400 ml de sérum riche en particules de Dane, répartis en douze fractions de 25 ml, ont été déposés sur des gradients de saccharose 10-30% (poids/volume) dans le tampon tris-HCl 10 mM pH 8, EDTA 10 mM, NaCl 1M (tampon TEN). La centrifugation a été effectuée dans un rotor Beckman SW27 à 5° C à 25 000 tr/min pendant 15 h. Chaque culot (contenant les particules de Dane) a été repris dans 0,5 ml de tampon TEN et traité aux ultrasons. La suspension (6 ml) a été déposée sur deux gradients de saccharose 10-30% et centrifugée dans un rotor Beckman SW50-1 à 5° C à 50 000 tr/min pendant 2 h. Les culots ont été repris dans 1 ml de tampon TEN, contenant du CsCl de telle façon à obtenir une densité de 1,23 g/ml. Cette suspension a été centrifugée dans un rotor Beckman SW60 à 20° C à 55 000 tr/min pendant 15 h. Le gradient a été récolté en fraction de 50 pl. La détection des particules de Dane a été effectuée par dosage de la polymérase endogène à partir d'aliquots de 1 pl. L'activité polymérasique a été détectée par mesure de l'incorporation d'ATP et TTP a32P dans un matériel acidoprécipitable décrit par W. S. Robinson («Ann. Rev. Microbiol.», 31,1977) ou par T. A. Landers et coll. («J. Virol.», 23,1977, pp. 368-376).

Les fractions dans lesquelles l'incorporation de 32P était maximale avaient une densité de 1,23 g/ml. Ces fractions (contenant les particules de Dane) ont été marquées dans les mêmes conditions par un mélange d'ATP et TTP a32P, ayant une activité spécifique dix fois plus petite (cela pour éviter de dégrader l'ADN). Ces fractions ont été incubées pendant 1 h à 37° C en présence de pronase (10 mg/ ml) et de sodiumdodécylsulfate (1%), puis l'ADN a été extrait par deux traitements successifs avec un mélange phénol/chloroforme (1 vol./l vol.). L'ADN a été précipité par l'addition de deux volumes d'éthanol à —20° C, puis dissous dans 100 pl de tampon TEN. La concentration en ADN a été déterminée en tenant compte de l'activité spécifique des précurseurs triphosphates, de la proportion d'ADN simple brin qui est en moyenne de 30% et du fait que l'ADN polymérase endogène répare environ la moitié de la région simple brin. L'estimation de la concentration en ADN a été confirmée par une analyse électrophorétique en gel d'agarose. Les 100 pl (correspondant à 400 ml de plasma) contenaient environ 1 pg d'ADN. L'examen au microscope électronique a montré que la préparation contenait effectivement de l'ADN circulaire de longueur attendue et dont la plupart des molécules possédait une région simple brin, de longueur variable. La proportion de molécules linéaires de même longueur que l'ADN circulaire était environ de 10%.

2. Frabrication in vitro de recombinants entre l'ADN-HVB et deux fragments du vecteur XgtWES-XB.

30 ng d'ADN-HVB ont été mélangés avec 500 ng de fragment vecteur (ce qui correspond à un rapport moléculaire voisin de 1) et sont traités par l'endonucléase EcoRI. L'hydrolyse de l'ADN-HVB en présence de l'ADN vecteur permet la dilution par celui-ci d'éventuelles activités nucléasiques contaminantes. Après hydrolyse, on sépare les fragments par électrophorèse sur gel de Polyacrylamide (gradient de gel ayant des concentrations en acrylamide variant de 2,5 à 7,5%). Les fractions obtenues sont concentrées par Chromatographie sur l'hydroxylapatite comme décrit antérieurement (Tiollais et coll., «Febs. letters», 48 (1974), 96-100). Les concentrats obtenus sont dialysés contre une solution de tris-HCl 50 mM pH 7,5, contenant 60 mM de chlorure de sodium.

On procède ensuite à la ligation des fragments par la technique décrite par Murray et Murray, «Nature», 251 (1974), 476-481, sous réserve de quelques modifications. En particulier, les solutions d'ADN contenant 30 pg/pl d'ADN (le rapport molaire entre les fragments de vecteur et les fragments à insérer étant compris entre 2 et 6) au sein d'un tampon tris-HCl, pH 7,5, et contenant 60 mM de chlorure de sodium, sont chauffées pendant 5 min à 50° C, pour dissocier les extrémités cohésives. On introduit alors dans le mélange les constituants ci-après désignés pour obtenir des concentrations finales en ceux-ci, respectivement de 10 nM MgCl2,10 nM de di-thiothreitol, de 0,1 mM ATP et de 50 pg/ml de sérum albumine bovine. On ajoute alors une polynucléotide ligase T4 (notamment celle produite par Miles Laboratories, Ltd.) et l'on incube le milieu à 0° C pendant 20 h.

3. Clonage dans la souche C600 reBC rk~mk~.

On procède alors à la transfection de la souche identifiée ci-dessus selon la méthode décrite par Cameron et coll., «Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A.», 72 (1975), 3416-3420. La souche a ensuite été étalée sur milieu Mac Conkey lactose. Huit clones indépendants ont été amplifiés dans la souche DP50 Sup F (C.N.C.M. N° 1-077). L'ADN a ensuite été coupé par l'enzyme EcoRI et les fragments ont été analysés par électrophorèse en gel d'agarose. Dans tous les cas, celle-ci a révélé la présence d'un fragment EcoRI qui migre comme la fraction la plus lente. Celle-ci est formée par l'ADN-HVB, et dont la taille peut être évaluée à environ 3200 paires de bases.

4. Identification parmi les ADN clonés du fragment correspondant à

l'ADN-HVB.

L'ADN du bactériophage recombinant (X-HVB1) a été hybridé avec l'ADN-HVB initial dans le rapport de trois molécules d'ADN-HVB pour une molécule d'ADN Ä.-HVB1.

Les molécules hétéroduplexes observées contiennent une boucle bicaténaire de taille égale à celle du ADN-HVB bicaténaire, et située à l'emplacement prévu dans le génome du bactériophage. Deux types de boucles sont observés: soit une boucle entièrement bicaténaire, soit une boucle portant une région monocaténaire située dans la région centrale du fragment EcoRI inséré (fig. 3 et 4). Lorsque les deux brins du vecteur s'apparient, on observe deux boucles (fig. 5 et 6).

Différents arguments montrent que le DNA cloné est bien du ADN-HVB.

Après digestion de l'ADN du bactériophage X hybride (HVB1) par l'endonucléase EcoRI, l'analyse électrophorétique montre la présence d'un fragment de longueur égale à celle du ADN-HVB. De même, les boucles hétéroduplexes observées après hybridation possèdent la même longueur. L'existence de boucles bicaténaires portées par de l'ADN monocaténaire prouve que l'ADN qui a été inséré était circulaire avant la coupure par l'enzyme EcoRI. La présence de deux types de boucles (entièrement et partiellement bicaténaires) prouve que l'ADN d'origine était formé de deux chaînes appariées et de taille inégale. Ces caractéristiques correspondent bien à celles du génome de l'hépatite B.

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L'abondance de molécules hétéroduplexes possédant la structure attendue est très grande. Cela est incompatible avec le clonage d'un fragment d'ADN contaminant puisque, dans la préparation d'ADN-HVB, la microscopie électronique permettait d'estimer cette contamination à moins de 1%. 5

L'ADN cloné représente vraisemblablement la totalité du génome des particules de Dane. En effet, la structure des molécules hétéroduplexes indique que la partie la plus fragile de l'ADN-HVB, à savoir la région monocaténaire, a bien été incorporée. Par ailleurs, la longueur de l'ADN cloné montre que, si celui-ci devait être plus io court que l'ADN des particules de Dane, la différence de longueur serait inférieure aux erreurs de mesure, soit environ 150 paires de bases. L'ensemble des résultats précédents confirme également l'existence d'un seul site de restriction EcoRI dans l'ADN-HVB.

L'ADN-HVB ainsi cloné peut être marqué in vitro, notamment is avec un isotope radioactif 32P. Il est avantageusement appliqué en tant que sonde pour détecter la présence de particules de Dane, par exemple dans un sérum humain. On peut à cet effet avoir recours à toute technique classique d'hybridation ADN-ADN.

L'invention concerne naturellement aussi un procédé pour la production d'une protéine hybride contenant un fragment de protéine ayant une activité vaccinante contre l'hépatite B, qui consiste à introduire un vecteur dans lequel est inclus l'ADN du virus de l'hépatite B, tel qu'il a été défini ci-dessus, dans une bactérie dans laquelle il est susceptible d'être exprimé, à induire la production de ladite protéine hybride chez cette bactérie et à récupérer la protéine hybride formée contenue dans les protéines produites par la bactérie.

Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application et de réalisation qui ont été plus spécialement envisagés; elle en embrasse au contraire toutes les variantes, notamment celles dans lesquelles on aurait recours pour le clonage selon l'invention à d'autres variantes génétiques de l'ADN du virus de l'hépatite B.

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1 feuille dessins

Claims

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1. ADN hybride clonable dans une bactérie et contenant un ADN double brin dérivé de l'ADN du virus de l'hépatite B.

2. ADN hydride selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'ADN double brin dérivé de celui du virus de l'hépatite B est délimité par des extrémités EcoRI.

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REVENDICATIONS

3. ADN hybride selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'ADN double brin dérivé de celui du virus de l'hépatite B est délimité par des extrémités Xho.

4. ADN hybride selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il constitue un vecteur contenant le susdit ADN double brin.

5. Procédé pour la production de l'ADN hybride de la revendication 1, caractérisé en ce que, partant de l'ADN double brin du virus de l'hépatite B préalablement réparé in vitro en présence d'une polymérase et des nucléotides précurseurs correspondants, on le linéarise au moyen d'une enzyme de restriction, on insère le fragment linéarisé dans un site approprié d'un vecteur pour obtenir le susdit ADN hybride susceptible d'être cloné.

6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'ADN double brin de l'hépatite B est linéarisé par une endonucléase, pour laquelle il n'existe qu'un seul site de coupure dans l'ADN du virus de l'hépatite B.

7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la linéarisation est effectuée par l'enzyme EcoRI.

8. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la linéarisation est effectuée par l'enzyme Xho.

9. Utilisation de l'ADN hybride selon l'une des revendications 1 à 4 en tant que sonde de détection de la présence de virus de l'hépatite virale dans un échantillon biologique, par hybridation de l'ADN hybride et de l'ADN contenu dans l'échantillon biologique.

10. Utilisation de l'ADN hybride selon l'une des revendications 1 à 4 à la transformation d'une bactérie, en vue de la rendre capable de produire une protéine hybride contenant un fragment de protéine ayant une activité vaccinante contre l'hépatite B.