JP2024510421A - Ｖｌｐエンテロウイルスワクチン - Google Patents

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Abstract

本開示の態様は、メッセンジャーＲＮＡワクチンの組成物及びその投与方法に関する。本明細書に提供する組成物は、ピコルナウイルスカプシドポリタンパク質及びプロテアーゼをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含む。本明細書に提供する組成物は、少なくとも１つの他のＲＮＡまたはその産物の発現、構造または機能を調節する活性産物をコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含む。

Description

関連出願
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の定めにより、２０２１年３月５日に出願された米国仮出願第６３／１５７，５４３号、発明の名称「ＶＬＰ Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒａｌ Ｖａｃｃｉｎｅｓ」の利益を主張する。当該仮出願は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
ピコルナウイルス科のウイルスは、エンテロウイルス属を構成する最大のウイルス科の１つであり、ヒトにおける最も一般的な感染症のいくつかの原因となる多くの種の病原体、例えば、エンテロウイルス及びライノウイルス種を含む。非常に蔓延しているライノウイルス感染症を除き、米国だけで年間約１，０００万～１，５００万件の症候性エンテロウイルス感染症が発生していると推定されている（ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｉｎｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。
ワクチン接種は、ウイルス性疾患、細菌性疾患、及び／または寄生虫性疾患が挙げられるがこれらに限定されない感染性疾患、例えば、インフルエンザ、ＨＩＶ、肝炎ウイルス感染症、コレラ、マラリア及び結核、ならびに他の多くの疾患に対する予防的保護を提供する効果的な方法である。しかしながら、いくつかのエンテロウイルスを標的とするワクチンの開発は、標的化が困難で非常に可変性の高い領域がエンテロウイルス粒子の表面に露出している一方で、標的化に適した保存領域がエンテロウイルス粒子の相間に隠されていることから、少なくとも部分的に困難であることが判明している。
組み換えＤＮＡ技術の最近の進歩により、ワクチン開発での使用におけるウイルス様粒子（ＶＬＰ）の使用への関心が高まっている。ＶＬＰは、病原体の形態を模倣するウイルス構造タンパク質の自己組織化によって形成され、非感染性であること及び免疫原性が高いことの両方が分かっている。しかしながら、エンテロウイルスＶＬＰを生成するこれまでの試みは、エンテロウイルス病原体を模倣するＶＬＰを形成するために必要な構造タンパク質の適切な発現及び／またはフォールディングを達成することが困難であるため、限られた成功しか収めていない。
本開示は、ｍＲＮＡを使用して、触媒酵素タンパク質及び該酵素の複数の基質をコードするポリタンパク質の両方をコードすること及び送達することができる方法、及びその後、該酵素が、インビボで免疫原の役割を果たすようにＶＬＰの形態で高次構造の構築を促進することを可能にする方法を記載する。したがって、感染性疾患及び感染因子と闘うための新たなアプローチとして、エンテロウイルスワクチンとして使用するためのｍＲＮＡからエンテロウイルスＶＬＰを開発することは非常に興味深い。
ポリオワクチンを除いて、エンテロウイルスによって引き起こされる感染症に対して有効なワクチンが不足していることを考慮すると、他の種類のエンテロウイルス感染症を予防及び／または治療するために、すべての患者集団において安全かつ効果的なワクチンに対する大きなニーズがある。本明細書に記載するのは、核酸ワクチンの組成物及び方法である。特に、本明細書に記載するのは、核酸ワクチン（例えば、ｍＲＮＡワクチン）の組成物及び方法である。
本開示の態様は、（ｉ）ピコルナウイルスカプシドポリタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）であって、該カプシドポリタンパク質は、ウイルスＰ１前駆体ポリタンパク質を含むもの、及び（ｉｉ）脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む組成物に関する。
本開示のさらなる態様は、（ｉ）プロテアーゼをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）であって、該プロテアーゼは、ピコルナウイルス３Ｃプロテアーゼであるもの、及び（ｉｉ）脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む組成物に関する。
本開示のさらなる態様は、（ｉ）ピコルナウイルス３Ｃプロテアーゼをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）、（ｉｉ）ピコルナウイルスカプシドポリタンパク質をコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡであって、該カプシドポリタンパク質は、ウイルスＰ１前駆体ポリタンパク質を含むもの、及び（ｉｉｉ）脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む免疫原性組成物に関する。
いくつかの実施形態では、該前駆体ポリタンパク質は、２つ以上のカプシドタンパク質を含み、２つ以上のカプシドタンパク質の間にウイルスプロテアーゼに特異的な切断部位を有する。いくつかの実施形態では、該２つ以上のカプシドタンパク質は、ウイルスタンパク質０（ＶＰ０）、ウイルスタンパク質１（ＶＰ１）、及びウイルスタンパク質３（ＶＰ３）のうちの２つ以上を含む。いくつかの実施形態では、ＶＰ０はさらに、ウイルスタンパク質２（ＶＰ２）及びウイルスタンパク質４（ＶＰ４）を含み、ＶＰ２及びＶＰ４は、カプシド成熟のための切断部位を含む。
いくつかの実施形態では、該プロテアーゼは、ピコルナウイルス３Ｃ（３ＣＤ）である。いくつかの実施形態では、該３ＣＤは、ピコルナウイルス科のエンテロウイルス属の種に特異的である。いくつかの実施形態では、該３ＣＤは、ヒトライノウイルス（ＨＲＶ）Ａ、Ｂ、またはＣの種に特異的である。いくつかの実施形態では、該ＨＲＶ種は、ＨＲＶ－Ａ１６である。いくつかの実施形態では、該ＨＲＶ種は、ＨＲＶ－Ｂ１４である。いくつかの実施形態では、該３ＣＤは、エンテロウイルス種に特異的である。いくつかの実施形態では、該エンテロウイルス遺伝子型は、ＥＶ－Ｄ６８である。いくつかの実施形態では、該エンテロウイルス遺伝子型は、ＥＶ－Ａ７１である。
いくつかの実施形態では、該カプシドタンパク質は、プロトマーを形成する。いくつかの実施形態では、該プロトマーは、五量体を形成する。いくつかの実施形態では、該五量体は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を形成する。
いくつかの実施形態では、該ウイルスＰ１前駆体ポリタンパク質をコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡ及び該ピコルナウイルス３ＣプロテアーゼをコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡは、以下の比（Ｐ１：３ＣＤ）の１つで存在する：２０：１、１０：１、７：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１。いくつかの実施形態では、該ウイルスＰ１前駆体タンパク質をコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡと該ピコルナウイルス３ＣプロテアーゼをコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡの比は、１０：１である。いくつかの実施形態では、該ウイルスＰ１前駆体ポリタンパク質をコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡと該３Ｃプロテアーゼを３Ｃまたは３ＣＤのいずれかとしてコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡの比は、２：１である。いくつかの実施形態では、該プロテアーゼは、配列番号８または配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、該プロテアーゼは、配列番号８または配列番号１４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、該プロテアーゼは、配列番号２０または配列番号２６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、該プロテアーゼは、配列番号２０または配列番号２６のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、該カプシドポリタンパク質は、配列番号５、１１、１７、または２３のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、カプシドポリタンパク質は、配列番号５、１１、１７、または２３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、該ＶＬＰは、中和免疫原性（ＮＩｍ）部位を含む。
いくつかの実施形態では、該ＬＮＰは、イオン性アミノ脂質、ＰＥＧ修飾脂質、構造脂質及びリン脂質を含む。
いくつかの実施形態では、該ウイルスＰ１前駆体ポリタンパク質をコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡ及び該ピコルナウイルス３ＣプロテアーゼをコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡは、少なくとも１つのＬＮＰに共製剤化される。いくつかの実施形態では、該ウイルスＰ１前駆体ポリタンパク質をコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡ及び該ピコルナウイルス３ＣプロテアーゼをコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡは、各々別のＬＮＰに製剤化される。いくつかの実施形態では、該ウイルスＰ１前駆体ポリタンパク質をコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡ及び該ピコルナウイルス３ＣプロテアーゼをコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡとともに製剤化されるＬＮＰは、以下の比の１つで存在する：２０：１、１０：１、７：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１。いくつかの実施形態では、該ＬＮＰは、イオン性アミノ脂質、ステロール、中性脂質、及びＰＥＧ修飾脂質を含む。いくつかの実施形態では、該脂質ナノ粒子は、４０～５５ｍｏｌ％のイオン性アミノ脂質、３０～４５ｍｏｌ％のステロール、５～１５ｍｏｌ％の中性脂質、及び１～５ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を含む。いくつかの実施形態では、該脂質ナノ粒子は、４０～５０ｍｏｌ％のイオン性アミノ脂質、３５～４５ｍｏｌ％のステロール、１０～１５ｍｏｌ％の中性脂質、及び２～４ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を含む。いくつかの実施形態では、該脂質ナノ粒子は、４５ｍｏｌ％、４６ｍｏｌ％、４７ｍｏｌ％、４８ｍｏｌ％、４９ｍｏｌ％、または５０ｍｏｌ％のイオン性アミノ脂質を含む。いくつかの実施形態では、該イオン性アミノ脂質は、化合物２の構造を有する：
いくつかの実施形態では、該ステロールはコレステロールまたはそのバリアントである。いくつかの実施形態では、該中性脂質は、１，２ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）である。
本開示のさらなる態様は、対象に対して、（ｉ）ピコルナウイルスプロテアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含むメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）、及び（ｉｉ）前駆体タンパク質を含むカプシドポリタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含むメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）であって、該前駆体タンパク質が、２つ以上のカプシドタンパク質を含み、該２つ以上のカプシドタンパク質間に、該プロテアーゼに特異的な切断部位を有するものを含む免疫原性組成物を、エンテロウイルス属のメンバーからのウイルス感染に対する免疫応答を該対象において誘導するのに有効な量で投与することを含む方法に関する。
いくつかの実施形態では、該免疫応答としては、エンテロウイルス属のヒトライノウイルス種に対する結合抗体力価が挙げられる。いくつかの実施形態では、該免疫応答としては、エンテロウイルス属のヒトライノウイルス種に対する中和抗体力価が挙げられる。いくつかの実施形態では、該免疫応答としては、エンテロウイルス属のヒトライノウイルス種に対するＴ細胞応答が挙げられる。いくつかの実施形態では、該ヒトライノウイルス種のウイルスは、遺伝子型Ａ２、Ａ１６、Ｂ１４、及びＣ１５からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、該ヒトライノウイルス遺伝子型は、ヒトライノウイルス１６（ＨＲＶ１６）である。
いくつかの実施形態では、該免疫応答としては、エンテロウイルス属のヒトエンテロウイルス種に対する結合抗体力価が挙げられる。いくつかの実施形態では、該免疫応答としては、エンテロウイルス属のヒトエンテロウイルス種に対する中和抗体力価が挙げられる。いくつかの実施形態では、該免疫応答としては、エンテロウイルス属のヒトエンテロウイルス種に対するＴ細胞応答が挙げられる。いくつかの実施形態では、該ヒトエンテロウイルス種のウイルスは、ＲＶ－Ａ、ＲＶ－Ｂ、ＲＶ－Ｃ、ＥＶ－Ａ及びＥＶ－Ｄからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、該ヒトエンテロウイルス種のウイルスは、遺伝子型ＲＶ－Ａ１６、ＲＶ－Ｂ１４、ＲＶ－Ｃ１５、ＥＶ－Ａ７１及びＥＶ－Ｄ６８からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、該ヒトエンテロウイルス種のウイルスは、エンテロウイルスＤ６８（ＥＶ－Ｄ６８）である。いくつかの実施形態では、該ヒトエンテロウイルス種のウイルスは、エンテロウイルスＡ７１（ＥＶ－Ａ７１）である。
いくつかの実施形態では、（ｉ）のｍＲＮＡは、少なくとも１つの脂質ナノ粒子を含む組成物で製剤化される。いくつかの実施形態では、（ｉｉ）のｍＲＮＡは、少なくとも１つの脂質ナノ粒子を含む組成物で製剤化される。いくつかの実施形態では、（ｉ）のｍＲＮＡは、該対象に対して、（ｉｉ）のｍＲＮＡと同時に投与される。いくつかの実施形態では、（ｉ）及び（ｉｉ）のｍＲＮＡは、少なくとも１つの脂質ナノ粒子を含む組成物で製剤化される。いくつかの実施形態では、（ｉ）及び（ｉｉ）のｍＲＮＡは、２つの脂質ナノ粒子を含む組成物で製剤化される。
本開示のさらなる態様は、（ｉ）第一の産物をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む第一のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）、（ｉｉ）第二の産物をコードするＯＲＦを含む第二のｍＲＮＡ、及び（ｉｉｉ）脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む組成物に関し、該第一の産物は、活性タンパク質であり、該活性タンパク質は、該第二のｍＲＮＡ及び／または該第二の産物の発現、構造、または活性を調節することができる。いくつかの実施形態では、該組成物は、免疫原性組成物である。いくつかの実施形態では、該第一の産物は、触媒タンパク質である。いくつかの実施形態では、該第一の産物は、酵素タンパク質である。いくつかの実施形態では、該第一の産物は、結合タンパク質である。いくつかの実施形態では、該第一の産物は、ポリタンパク質である。いくつかの実施形態では、該第二の産物は、基質である。いくつかの実施形態では、該第一の産物は、ポリタンパク質である。
本開示の各制限は、本開示の様々な実施形態を包含し得る。したがって、任意の１つの要素または要素の組み合わせを伴う本開示の各制限は、本開示の各態様に含まれ得ることが予期される。本開示は、その適用において、以下の説明に記載されるまたは図面に例示される構成の詳細にも構成要素の配置にも限定されるものではない。本開示は、他の実施形態が可能であり、様々な方法で実践することまたは行うことができる。
添付の図面は、正確な縮尺で描画したわけではない。図面において、様々な図に示されている各々の同一またはほぼ同一の構成要素は、類似の数字によって表されている。わかりやすくするため、あらゆる構成要素があらゆる図面において標識されているとは限らない。
エンテロウイルスゲノムの概略図を示す。カプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、及びＶＰ４）ならびに非構造タンパク質（２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、及び３Ｄ）の相対的な大きさを示す概略図である。ポリタンパク質（Ｐ１、Ｐ２、及びＰ３）のプロテアーゼ切断部位は逆三角形で示されている。 得られる二十面体ビリオンの概略図を示す。ポリタンパク質のプロセシング及び組織化後に得られるエンテロウイルスの二十面体ビリオンを示す。カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３は、二十面体ビリオンの外側に示されている。 インビトロでの適切なＰ１プロセシングを実証し、マウスにおいて中和抗体力価を生成するＨＲＶ－Ａ１６ Ｐ１＋３ＣＤ ｍＲＮＡで構成されるｍＲＮＡワクチンを示す。示されるＰ１：３ＣＤモル比を与えるように２μｇのＨＲＶ－Ａ１６ Ｐ１ ｍＲＮＡ及び増加量のＨＲＶ－Ａ１６ ３ＣＤ ｍＲＮＡでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞からの細胞溶解物を示すウェスタンブロットである。結果は、Ｐ１がタンパク質分解により個々のＶＰタンパク質にプロセシングされることを示している。切断は、高分子量のＰ１バンドの消失及びＶＰ０に対応する低分子量バンドの出現によって証明される。野生型ＨＲＶ－Ａ１６ビリオン溶解物を分子量比較のために含め、矢印は、Ｐ１切断産物を示す。ＧＡＰＤＨについてブロットされた細胞溶解物は、ローディング対照として示されている。 インビトロでの適切なＰ１プロセシングを実証し、マウスにおいて中和抗体力価を生成するＨＲＶ－Ａ１６ Ｐ１＋３ＣＤ ｍＲＮＡで構成されるｍＲＮＡワクチンを示す。Ｐ１及び３ＣＤの共発現によって産生されたウイルス様粒子（ＶＬＰ）を示す。Ｅｘｐｉ２９３細胞に、Ｐ１及び３ＣＤをコードするプラスミドをトランスフェクトした。ＶＬＰを、ＰＥＧ沈殿とそれに続く陰イオン交換クロマトグラフィーによって上清から精製した。ＶＬＰを溶出させ、ネガティブ染色透過型電子顕微鏡を使用して画像化した。参考のために２００ｎｍのスケールバーが含まれている。 インビトロでの適切なＰ１プロセシングを実証し、マウスにおいて中和抗体力価を生成するＨＲＶ－Ａ１６ Ｐ１＋３ＣＤ ｍＲＮＡで構成されるｍＲＮＡワクチンを示す。ＨＲＶ－Ａ１６ Ｐ１：３ＣＤ ｍＲＮＡでのワクチン接種により、複製ウイルスの注射によって誘発されるものに匹敵するレベルでマウスにおいて検出可能な中和抗体力価が生成されることを示すグラフ。マウスに、１０μｇのＰ１ ｍＲＮＡ及びモル比１０：１及び２：１のＰ１：３ＣＤを構成する可変量の３ＣＤ ｍＲＮＡをワクチン接種した。マウスに、１日目及び２２日目にワクチン接種し、２１日目（投与１後、灰色）及び３５日目（投与２後、黒色）に血清を採取し、ＨＲＶ－Ａ１６中和アッセイで調べた。１日目及び２２日目に複製ＨＲＶ－Ａ１６の注射を受けたコットンラットからの血清を並行して調べた（コットンラットＨＲＶ－Ａ１６Ａ／Ｓ）。横棒は、幾何平均力価（ＧＭＴ）を表し、縦棒は、標準偏差を表す。点線は、アッセイ検出限界（ＬＯＤ）＝２５を表す。ＬＯＤ未満の動物には１２．５の力価を割り当てた。 インビトロでの適切なＰ１プロセシングを実証し、マウスにおいて中和抗体力価を生成するＨＲＶ－Ａ１６ Ｐ１＋３ＣＤ ｍＲＮＡで構成されるｍＲＮＡワクチンを示す。様々な比でのＥＶ－Ｄ６８ Ｐ１：３ＣＤ ｍＲＮＡによるワクチン接種により、２つの異種ウイルス分離株に対する中和抗体力価が生成されることを示すグラフである。マウスに、１０μｇのＰ１ ｍＲＮＡ及び最終モル比１０：１、５：１、２：１及び１：１のＰ１ ｍＲＮＡ：３ＣＤ ｍＲＮＡを構成する可変量の３ＣＤ ｍＲＮＡをワクチン接種した。マウスに、１日目及び２２日目にワクチン接種を行い、３５日目に採取した血清を群ごとにプールした。プールされた群の血清を、ＥＶ－Ｄ６８クレードＢ１分離株ＵＳ／ＭＯ／１４－１８９４７及びクレードＡ２分離株ＵＳ／ＫＹ／１４－１８９５３の中和について調べた。点線は、アッセイ定量限界（ＬＯＱ＝１００）を表す。 異なるエンテロウイルス種について、モル比２：１のＰ１＋３ＣＤ ｍＲＮＡでのワクチン接種に対する中和抗体応答を示すグラフである。ＨＲＶ－Ａ１６ Ｐ１＋３ＣＤ ｍＲＮＡによるワクチン接種が用量依存的な中和抗体の産生をもたらすことを示すグラフである。Ｘ軸は、各用量群に与えられたＰ１及び３ＣＤ ｍＲＮＡのμｇ量を示す。バーは、８匹のマウスの群のＧＭＴを表し、個々の動物は点で表される。エラーバーは標準偏差を表す。高度免疫モルモットからの市販のＨＲＶ－Ａ１６抗血清が、ベンチマーク対照（ＧＰ Ａ／Ｓ）として含まれている。Ｙ軸の点線は、アッセイＬＯＤ＝２５を表す。 異なるエンテロウイルス種について、モル比２：１のＰ１＋３ＣＤ ｍＲＮＡでのワクチン接種に対する中和抗体応答を示すグラフである。ＨＲＶ－Ｂ１４ Ｐ１＋３ＣＤ ｍＲＮＡによる用量５μｇ、１μｇ、及び０．２μｇのＰ１ ｍＲＮＡでのワクチン接種により、同様のレベルの中和抗体が得られ、市販の高度免疫抗血清の中和抗体力価を超えることを示すグラフである。Ｘ軸は、各用量群に与えられたＰ１及び３ＣＤ ｍＲＮＡのμｇ量を示す。バーは、８匹のマウスの群のＧＭＴを表し、個々の動物は点で表される。エラーバーは標準偏差を表す。高度免疫モルモットからの市販のＨＲＶ－Ｂ１４抗血清が、ベンチマーク対照（ＧＰ Ａ／Ｓ）として含まれている。Ｙ軸の点線は、アッセイＬＯＤ＝２５を表す。 異なるエンテロウイルス種について、モル比２：１のＰ１＋３ＣＤ ｍＲＮＡでのワクチン接種に対する中和抗体応答を示すグラフである。ＥＶ－Ｄ６８ Ｐ１＋３ＣＤ ｍＲＮＡによる用量５、１、及び０．２μｇのＰ１ ｍＲＮＡでのワクチン接種により、低用量であっても強力な中和抗体応答が引き起こされることを示すグラフである。血清を、ＥＶ－Ｄ６８クレードＢ１分離株ＵＳ／ＭＯ／１４－１８９４７及びクレードＡ２分離株ＵＳ／ＫＹ／１４－１８９５３の中和について調べた。Ｘ軸は、各群に与えられたＰ１及び３ＣＤ ｍＲＮＡのμｇ量を示す。バーは、８匹のマウスの群のＧＭＴを表し、個々の動物は点で表される。エラーバーは、標準偏差を示す。Ｙ軸の点線は、アッセイ検出限界（ＬＯＤ）＝２５を表す。力価がＬＯＤ未満の動物には１２．５の値を割り当てた。バーの陰影は凡例に対応し、調べたウイルス分離株を表す。 異なるエンテロウイルス種について、モル比２：１のＰ１＋３ＣＤ ｍＲＮＡでのワクチン接種に対する中和抗体応答を示すグラフである。ＥＶ－Ａ７１ Ｐ１＋３ＣＤ ｍＲＮＡによるワクチン接種により、急性弛緩性脊髄炎患者から回収された臨床分離株を中和することができる抗体の用量依存的な産生がもたらされることを示すグラフである。Ｘ軸は、各群に与えられたＰ１及び３ＣＤ ｍＲＮＡのμｇ量を示す。バーは、用量群ごとのＧＭＴを表す。エラーバーは、標準偏差を示す。Ｙ軸の点線は、アッセイＬＯＤ＝２０を表す。力価がＬＯＤ未満の動物には１０の力価を割り当てた。 Ａ～Ｂは、２つの異なる種からのＰ１＋３ＣＤの組み合わせが、インビトロでＰ１のプロセシングを実証し、インビボで免疫原性であることを示す。Ａは、２μｇのＰ１ ｍＲＮＡ±０．７５μｇの３ＣＤ ｍＲＮＡでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞からの細胞溶解物をＰ１プロセシングに関してブロットしたことを示すウェスタンブロットである。ブロット下部のレーンラベルは、トランスフェクトされたＰ１及び３ＣＤ ｍＲＮＡのＨＲＶ種を示す。ＨＲＶ－Ｂ１４ Ｐ１は、ＨＲＶ－Ｂ１４またはＨＲＶ－Ａ１６のいずれかからの３ＣＤ ｍＲＮＡと共トランスフェクトされた場合に切断される。切断は、Ｐ１に対応する高分子量のバンドの消失及びＶＰ１に対応する低分子量バンドの出現によって示される。ＧＡＰＤＨについてブロットされた細胞溶解物は、ローディング対照として示されている。Ｂは、ＨＲＶ－Ｂ１４ Ｐ１＋ＨＲＶ－Ａ１６ ３ＣＤ ｍＲＮＡの組み合わせによるワクチン接種により、抗ＨＲＶ－Ｂ１４中和抗体を産生することを示すグラフである。マウスに、１日目と２２日目、２．５μｇの示されたＰ１ ｍＲＮＡ＋０．９４μｇのＨＲＶ－Ａ１６ ３ＣＤをワクチン接種した。３５日目に採取した血清を、ＨＲＶ－Ａ１６またはＨＲＶ－Ｂ１４ウイルスのいずれかの中和について調べた。各ウイルスに対する市販の高度免疫抗血清をベンチマーク対照として含めた。塗りつぶしたバーは、８匹のマウスの群のＧＭＴを表し、個々の動物は点で表される。エラーバーは標準偏差を表す。ハッシュバーは、高度免疫抗血清の中和力価を表す。Ｙ軸の点線は、アッセイＬＯＤ＝２５を表す。 Ｐ１／３ＣＤ ｍＲＮＡの組み合わせによるワクチン接種により、コットンラットにおいて、ＨＲＶ１６接種からの用量依存的な保護がもたらされることを示すグラフである。Ｐ１／３ＣＤのプライム・ブーストレジメンでワクチン接種した動物が、用量依存的なｎＡｂの産生を示すことを示すグラフである。高用量のＰ１／３ＣＤ（２５、５、及び１μｇ）を受けた各用量群の５匹中４匹、及び生ＨＲＶ１６でワクチン接種された５匹中５匹の動物は、接種時に検出可能なＨＲＶ１６ｎＡｂを示した（ブースト後２週間）。０．２μｇのＰ１／３ＣＤでワクチン接種された動物、または陰性対照としてＰＢＳを投与された動物は、検出可能なｎＡｂ力価を有さなかった。 Ｐ１／３ＣＤ ｍＲＮＡの組み合わせによるワクチン接種により、コットンラットにおいて、ＨＲＶ１６接種からの用量依存的な保護がもたらされることを示すグラフである。Ｐ１／３ＣＤによるワクチン接種により、肺組織の用量依存的な保護がもたらされることを示すグラフである。肺組織におけるウイルス量を、ＨＲＶ１６接種の８時間後に測定した。２５μｇのＰ１／３ＣＤ ｍＲＮＡを投与された５匹中４匹、及び５μｇを投与された５匹中３匹が完全な保護を示し、１μｇでワクチン接種されたすべての動物は、ＰＢＳを接種された対照と比較して、ウイルス量の減少を示した。最低用量（０．２μｇ）を投与された動物では、肺組織の保護は見られなかった。生きたＨＲＶ１６のプライム・ブーストレジメンでワクチン接種された動物を、保護のための陽性対照及び比較対照として含めた。 Ｐ１／３ＣＤ ｍＲＮＡの組み合わせによるワクチン接種により、コットンラットにおいて、ＨＲＶ１６接種からの用量依存的な保護がもたらされることを示すグラフである。Ｐ１／３ＣＤによるワクチン接種により、最高用量で鼻組織の完全な保護がもたらされ、低用量ではある程度の保護がもたらされることを示すグラフである。２５μｇのＰ１／３ＣＤを投与された５匹の動物のうち５匹で、ＨＲＶ１６接種後８時間の時点で鼻組織に検出可能なウイルス量が存在しなかった。５μｇまたは１μｇをワクチン接種された動物は、５匹中２匹で完全な保護を示した。０．２μｇを投与された動物では鼻の保護は見られなかった。 Ｐ１／３ＣＤ ｍＲＮＡの組み合わせによるワクチン接種により、コットンラットにおいて、ＨＲＶ１６接種からの用量依存的な保護がもたらされることを示すグラフである。Ｐ１／３ＣＤによるワクチン接種により、ＨＲＶ１６（－）ｖＲＮＡに関するｑＰＣＲで測定して、肺のウイルス量の減少がもたらされることを示すグラフである。２５μｇのＰ１／３ＣＤを投与された５匹の動物のうちの５匹と、５μｇまたは１μｇを投与された一部の動物で肺のウイルス力価の大幅な減少が見られた。０．２μｇでワクチン接種された動物では減少は見られなかった。パネルごとに、バーは、５匹のコットンラットの群のＧＭＴを表し、個々の動物は点で表される。エラーバーは幾何標準偏差を表す。Ｙ軸の点線は、アッセイＬＯＤ＝２００を表す。 ＨＲＶ－Ａ１６ワクチン接種＋接種試験の個々のコットンラットのエンドポイントアッセイ結果を示す表である。
治療薬、診断薬、試薬、及び生物学的アッセイの分野において、インビトロ、インビボ、インサイチュまたはエキソビボを問わず、細胞内に核酸、例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）を設計、合成、及び送達することができること、例えば、該細胞、組織または器官にとって、及び最終的には生物にとって有益な生理学的アウトカムをもたらすことは非常に興味深い。１つの有益なアウトカムは、核酸の細胞内翻訳と、少なくとも１つのコードされた目的のペプチドまたはポリペプチドの産生を引き起こすことである。
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、構造的特徴及び抗原性が生ウイルスによく似た球形の粒子である。しかしながら、ＶＬＰは、ウイルスの遺伝物質を含まず、したがって非感染性であるという点で、生ウイルスとは区別される。ＶＬＰの抗原性の上に、非感染性であることから、ワクチン接種におけるＶＬＰの応用の探求に関心が高まっている。
現在、ＶＬＰの大部分は、組み換えまたはクローニング戦略を使用して生成されている。ＶＬＰは、自己組織化粒子であってもよい。自己組織化ＶＬＰの非限定的な例、ならびに該自己組織化ＶＬＰを作製する方法は、国際特許公開第ＷＯ２０１３１２２２６２号に記載されており、その内容は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
ＶＬＰは、構造ウイルスタンパク質（例えば、エンベロープタンパク質及び／またはカプシドタンパク質）の組織化から形成される。ＶＬＰのサイズ及び形態は、少なくとも部分的に、組織化時に粒子に組み込まれる特定の構造ウイルスタンパク質に依存する。エンベロープウイルスの構造ウイルスタンパク質から組織化されたＶＬＰは、例えば、１つ以上のエンベロープタンパク質及び１つ以上のカプシドタンパク質を含み得る。非エンベロープウイルスの構造ウイルスタンパク質から組織化されたＶＬＰは、例えば、１つ以上のカプシドタンパク質を含み得る。
複数のカプシドタンパク質は、同じ細胞内でバイシストロン性ベクターまたはマルチシストロン性ベクターからのカプシドタンパク質の共発現によって組織化され得る。同じ細胞内の異なるベクター上でウイルス構造タンパク質を発現させること及び／またはウイルス構造タンパク質とシャペロンタンパク質との融合タンパク質を設計することを含め、エンテロウイルス属のウイルスを模倣するＶＬＰを産生する試みがなされているが、得られるＶＬＰは、適切に形成されず、それらはエンテロウイルスＶＬＰの形態を模倣できない。
非常に驚くべきことに、本発明者らは、本発明の態様によれば、複数のＲＮＡを送達することができ、該ＲＮＡのうちの１つがタンパク質を産生し、これが、他のＲＮＡまたは該ＲＮＡによって産生されるタンパク質に作用して、細胞内で複雑な生理学的プロセスを達成することを発見した。例えば、場合によっては、ＶＬＰ等の複雑な構造は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）で送達されるメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）から細胞内で発現され、その後プロセシングされる１つ以上のカプシド前駆体ポリタンパク質から適切に組織化され得る。例えば、本発明者らは、ピコルナウイルスカプシドポリタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むｍＲＮＡ及びピコルナウイルス３ＣプロテアーゼをコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡとを含む組成物が、ウイルス様粒子の形成に十分であることを確認した。いくつかの態様では、該組成物は、１つ以上の脂質ナノ粒子に製剤化される。
本発明者らはまた、本発明の態様によれば、ピコルナウイルスカプシドポリタンパク質をコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡ及び任意にピコルナウイルス３ＣプロテアーゼをコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡを含む免疫原性組成物を、当該対象において、エンテロウイルス属のメンバーからのウイルス感染に対する免疫応答を誘導するのに有効な量投与することを含む方法も発見した。
本開示のさらなる態様は、２つ以上のｍＲＮＡが対象に送達される組成物に関し、該ｍＲＮＡは、体内で相互作用して最終結果を達成することができる少なくとも第一及び第二の産物をコードする。上の例では、１つの産物は前駆体タンパク質またはポリタンパク質（基質）であり、他方は酵素である。換言すれば、第一の産物は活性タンパク質であり、その活性タンパク質は、第二のｍＲＮＡ及び／または第二の産物の発現、構造、または活性を調節することができる。これら２つの産物は、基質と酵素のペアであり得る。代替的に、該第一の産物は、該第二のｍＲＮＡ翻訳プロセスまたは該第二の産物の機能に影響を与える結合タンパク質であってもよい。
本明細書に記載するのは、ピコルナウイルスカプシドポリタンパク質をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む組成物である。したがって、本発明は、一部には、ポリヌクレオチド、具体的には、１つ以上のピコルナウイルスカプシドポリタンパク質及び／またはその成分をコードするオープンリーディングフレームを含むメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を対象とする。いくつかの実施形態では、該ピコルナウイルスカプシドポリタンパク質は、２つ以上のカプシドタンパク質を含み、２つ以上のカプシドタンパク質の間にウイルスプロテアーゼに特異的な切断部位を有する。
さらに本明細書に記載するのは、ピコルナウイルス３Ｃプロテアーゼをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む組成物である。したがって、本発明は、一部には、ポリヌクレオチド、具体的には、ピコルナウイルス３Ｃプロテアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含むｍＲＮＡを対象とする。
さらに本明細書に記載するのは、ピコルナウイルスカプシドポリタンパク質をコードする１つ以上のポリヌクレオチド及びピコルナウイルス３Ｃプロテアーゼをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む組成物である。したがって、本発明は、一部には、ポリヌクレオチド、具体的には、ピコルナウイルスカプシドポリタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含むｍＲＮＡ及びピコルナウイルス３Ｃプロテアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含むｍＲＮＡを対象とする。
本発明のいくつかの実施形態では、前駆体ポリタンパク質は、カプシドポリタンパク質である。いくつかの実施形態では、該カプシドポリタンパク質は、ピコルナウイルスカプシドポリタンパク質である。いくつかの実施形態では、該ピコルナウイルスカプシドポリタンパク質は、ウイルスＰ１前駆体ポリタンパク質である。
ピコルナウイルスカプシドポリタンパク質は、単一のリボ核酸（ＲＮＡ）分子によってコードされる場合があり、これは、２つの別個のポリペプチド鎖をコードするバイシストロン性分子であっても、３つの別個のポリペプチド鎖をコードするポリシストロン性分子であってもよい（図１Ａ）。かかるＲＮＡ分子は、翻訳プロセスで２つまたは３つの別個のポリペプチドが産生されるように、該２つまたは３つのコード配列間にシグナル配列を含んでもよい。代替的に、該ＲＮＡ分子は、単一のカプシドタンパク質を産生し、これが、２つ以上の別個のカプシドタンパク質を産生するように切断部位での切断を介してプロセシングされ得るように、該カプシドタンパク質の間に切断部位（例えば、プロテアーゼ切断部位）をコードする配列を含んでもよい。代替的に、該カプシドタンパク質は、２つまたは３つの別個のＲＮＡ分子によってコードされてもよい。
いくつかの実施形態では、カプシドポリタンパク質は、２つ以上のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、該２つ以上のカプシドタンパク質は、ウイルスタンパク質０（ＶＰ０）、ウイルスタンパク質１（ＶＰ１）、及びウイルスタンパク質３（ＶＰ３）のうちの２つ以上を含む。いくつかの実施形態では、該ウイルスタンパク質０（ＶＰ０）はさらに、ウイルスタンパク質２（ＶＰ２）及びウイルスタンパク質４（ＶＰ４）を含む。
２つ以上のカプシドタンパク質を含むカプシドポリタンパク質はさらに、ウイルスプロテアーゼに特異的な１つ以上の切断部位を含み得る。例えば、本発明のいくつかの実施形態では、前駆体ポリタンパク質は、２つ以上のカプシドタンパク質を含み、２つ以上のカプシドタンパク質の間にウイルスプロテアーゼに特異的な切断部位を有する。いくつかの実施形態では、ＶＰ０、ＶＰ１、及びＶＰ３のうちの１つ以上の間に、ウイルスプロテアーゼに特異的な切断部位が存在する。カプシドポリタンパク質はさらに、カプシド成熟のための切断部位を含み得る。いくつかの実施形態では、ＶＰ０を含むカプシドタンパク質はさらに、ＶＰ２及びＶＰ４を含み、ＶＰ２及びＶＰ４は、カプシド成熟のための切断部位を含む（図１Ａ）。
いくつかの実施形態では、ピコルナウイルスカプシドポリタンパク質をコードするｍＲＮＡは、ヒトライノウイルス（ＨＲＶ）種に特異的である。いくつかの実施形態では、該ＨＲＶ種は、ＨＲＶ－Ａ１６である。いくつかの実施形態では、ピコルナウイルスカプシドポリタンパク質をコードするｍＲＮＡは、配列番号３と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を共有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ピコルナウイルスカプシドポリタンパク質をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド配列は、配列番号３を含む。いくつかの実施形態では、該ＨＲＶ種は、ＨＲＶ－Ｂ１４である。いくつかの実施形態では、ピコルナウイルスカプシドポリタンパク質をコードするｍＲＮＡは、配列番号１０と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を共有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ピコルナウイルスカプシドポリタンパク質をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド配列は、配列番号１０を含む。
いくつかの実施形態では、該ピコルナウイルスカプシドポリタンパク質は、ヒトライノウイルス（ＨＲＶ）種に特異的である。いくつかの実施形態では、該ＨＲＶ種は、ＨＲＶ－Ａ１６である。いくつかの実施形態では、該ピコルナウイルスカプシドポリタンパク質は、配列番号５と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を共有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、該ピコルナウイルスカプシドポリタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号５を含む。いくつかの実施形態では、該ＨＲＶ種は、ＨＲＶ－Ｂ１４である。いくつかの実施形態では、該ピコルナウイルスカプシドポリタンパク質は、配列番号１１と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を共有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、該ピコルナウイルスカプシドポリタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１１を含む。
いくつかの実施形態では、ピコルナウイルスカプシドポリタンパク質をコードするｍＲＮＡは、エンテロウイルス種に特異的である。いくつかの実施形態では、該エンテロウイルス種は、ＥＶ－Ｄ６８である。いくつかの実施形態では、ピコルナウイルスカプシドポリタンパク質をコードするｍＲＮＡは、配列番号１６と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を共有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ピコルナウイルスカプシドポリタンパク質をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド配列は、配列番号１６を含む。いくつかの実施形態では、該エンテロウイルス種は、ＥＶ－Ａ７１である。いくつかの実施形態では、ピコルナウイルスカプシドポリタンパク質をコードするｍＲＮＡは、配列番号２２と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を共有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ピコルナウイルスカプシドポリタンパク質をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド配列は、配列番号２２を含む。
いくつかの実施形態では、該ピコルナウイルスカプシドポリタンパク質は、エンテロウイルス種に特異的である。いくつかの実施形態では、該エンテロウイルス種は、ＥＶ－Ｄ６８である。いくつかの実施形態では、該ピコルナウイルスカプシドポリタンパク質は、配列番号１７と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を共有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、該ピコルナウイルスカプシドポリタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１７を含む。いくつかの実施形態では、該エンテロウイルス種は、ＥＶ－Ａ７１である。いくつかの実施形態では、該ピコルナウイルスカプシドポリタンパク質は、配列番号２３と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を共有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、該ピコルナウイルスカプシドポリタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２３を含む。
ＶＬＰの組織化の前に、カプシドポリタンパク質は、非構造ウイルスタンパク質（例えば、ウイルスプロテアーゼ）によってプロセシングまたは切断され得る。本明細書で使用される、ウイルスプロテアーゼとは、カプシドポリタンパク質内の１つ以上のカプシドタンパク質間のウイルスプロテアーゼに特異的な切断部位を認識し得るプロテアーゼを指す。いくつかの実施形態では、該ウイルスプロテアーゼは、ピコルナウイルス３Ｃ（３ＣＤ）プロテアーゼである。該ウイルスプロテアーゼ３ＣＤは、非構造ポリタンパク質Ｐ３の一部である（図１Ａ）。該ウイルスプロテアーゼ３ＣＤは、３Ｃと３Ｄに切断され得る。ピコルナウイルス３Ｃプロテアーゼは、３Ｃまたは３ＣＤによって供給され得る。いくつかの実施形態では、該ピコルナウイルス３Ｃプロテアーゼは、３Ｃによって供給される。いくつかの実施形態では、該３Ｃプロテアーゼは、３ＣＤによって供給される。いくつかの実施形態では、該３ＣＤプロテアーゼは、エンテロウイルス属の種に特異的である。
いくつかの実施形態では、ピコルナウイルス３Ｃプロテアーゼ（３ＣＤ）をコードするｍＲＮＡは、ヒトライノウイルス（ＨＲＶ）種に特異的である。いくつかの実施形態では、該ＨＲＶ種は、ＨＲＶ－Ａ１６である。いくつかの実施形態では、３ＣＤをコードするｍＲＮＡは、配列番号７と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を共有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該３ＣＤをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド配列は、配列番号７を含む。いくつかの実施形態では、該ＨＲＶ種は、ＨＲＶ－Ｂ１４である。いくつかの実施形態では、３ＣＤをコードするｍＲＮＡは、配列番号１３と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を共有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該３ＣＤをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド配列は、配列番号１３を含む。
いくつかの実施形態では、該３ＣＤプロテアーゼは、ヒトライノウイルス（ＨＲＶ）種に特異的である。いくつかの実施形態では、該ＨＲＶ種は、ＨＲＶ－Ａ１６である。いくつかの実施形態では、該３ＣＤプロテアーゼは、配列番号８と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を共有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、該３ＣＤプロテアーゼのアミノ酸配列は、配列番号８を含む。いくつかの実施形態では、該ＨＲＶ種は、ＨＲＶ－Ｂ１４である。いくつかの実施形態では、該３ＣＤプロテアーゼは、配列番号１４と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を共有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、該３ＣＤプロテアーゼのアミノ酸配列は、配列番号１４を含む。
いくつかの実施形態では、ピコルナウイルス３Ｃプロテアーゼ（３ＣＤ）をコードするｍＲＮＡは、エンテロウイルス種に特異的である。いくつかの実施形態では、該エンテロウイルス種は、ＥＶ－Ｄ６８である。いくつかの実施形態では、３ＣＤをコードするｍＲＮＡは、配列番号１９と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を共有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該３ＣＤをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド配列は、配列番号１９を含む。いくつかの実施形態では、該エンテロウイルス種は、ＥＶ－Ａ７１である。いくつかの実施形態では、３ＣＤをコードするｍＲＮＡは、配列番号２５と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を共有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該３ＣＤをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド配列は、配列番号２５を含む。
いくつかの実施形態では、該３ＣＤプロテアーゼは、エンテロウイルス種に特異的である。いくつかの実施形態では、該エンテロウイルス遺伝子型は、ＥＶ－Ｄ６８である。いくつかの実施形態では、該３ＣＤプロテアーゼは、配列番号２０と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を共有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、該３ＣＤプロテアーゼのアミノ酸配列は、配列番号２０を含む。いくつかの実施形態では、該エンテロウイルス遺伝子型は、ＥＶ－Ａ７１である。いくつかの実施形態では、該３ＣＤプロテアーゼは、配列番号２６と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を共有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、該３ＣＤプロテアーゼのアミノ酸配列は、配列番号２６を含む。
本発明によれば、該ポリヌクレオチドは、組成物で記載され、その中で、１つ以上のピコルナウイルスカプシドポリタンパク質及び／またはそのピコルナウイルス３Ｃプロテアーゼをコードするポリヌクレオチドは、特定の比で組成物に含まれる。本明細書で使用される、「比」とは、ＶＬＰを産生することが可能なピコルナウイルス３Ｃプロテアーゼとピコルナウイルスカプシドポリタンパク質との割合を表す。いくつかの実施形態では、比は、モル比を指す。いくつかの実施形態では、比は、質量比を指す。
いくつかの実施形態では、ピコルナウイルス３Ｃプロテアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含むｍＲＮＡと、ピコルナウイルスカプシドポリタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含むｍＲＮＡとの比は、少なくとも２０：１、少なくとも１０：１、少なくとも７：１、少なくとも５：１、少なくとも４：１、少なくとも３：１、少なくとも２：１、または少なくとも１：１である。いくつかの実施形態では、ピコルナウイルス３Ｃプロテアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含むｍＲＮＡと、ピコルナウイルスカプシドポリタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含むｍＲＮＡとの比は、１０：１である。いくつかの実施形態では、ピコルナウイルス３Ｃプロテアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含むｍＲＮＡと、ピコルナウイルスカプシドポリタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含むｍＲＮＡとの比は、２：１である。
いくつかの実施形態では、１つ以上のピコルナウイルスカプシドポリタンパク質及び／またはそのピコルナウイルス３Ｃプロテアーゼをコードするポリヌクレオチドは、カプシドタンパク質がプロトマーを形成するような比で組成物に含まれる。いくつかの実施形態では、該プロトマーは、五量体を形成する。いくつかの実施形態では、該五量体は、ＶＬＰを形成する。
中和抗体は、ウイルス粒子の表面露出領域に対して産生される。例えば、ヒトライノウイルス（ＨＲＶ）では、ウイルスタンパク質ＶＰ１がウイルスタンパク質の中で最も表面に露出しているため、最も免疫原性の高いウイルスタンパク質である。中和抗体は、多くの場合、ウイルス粒子上の中和免疫原性（ＮＩｍ）部位に向けられる。ＮＩｍ部位のアミノ酸配列は、ウイルス血清型間で大きく異なる。ウイルス粒子は高度に保存された領域を含むが、かかる高度に保存された領域は、通常、ウイルス粒子の内部に埋もれており、中和抗体に近づきにくい。本発明のいくつかの実施形態では、該ＶＬＰは、中和免疫原性（ＮＩｍ）部位を含む。
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、少なくとも１つの脂質ナノ粒子に製剤化される。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、２つの脂質ナノ粒子に製剤化される。
本発明のポリヌクレオチド及び／または組成物は、ウイルスまたはウイルス粒子を模倣し、対象に投与された場合に免疫原性反応を引き起こすＶＬＰを組織化するのに有用である。いくつかの実施形態では、該ウイルスは、ピコルナウイルス科のウイルスのメンバーである。
ピコルナウイルス科のウイルスは、２９属に分類され、そのうちの１つがエンテロウイルス属である。エンテロウイルス属はさらに、エンテロウイルスＡ～Ｄ、ライノウイルスＡ～Ｃ、及び動物種にのみ感染する５つのエンテロウイルス種を含む１２種に分類される（ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｉｎｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ヒトに感染するエンテロウイルス種（例えば、エンテロウイルスＡ～Ｄ及びライノウイルスＡ～Ｃ）は、単なる風邪から生命を脅かす疾患までの重症度に及ぶ感染症を引き起こす。
ライノウイルスの種は、風邪に伴う症状の原因となる。本発明のいくつかの実施形態では、ライノウイルスは、ヒトライノウイルス１６型（ＨＲＶ－Ａ１６）である。いくつかの実施形態では、ライノウイルスは、ヒトライノウイルス１４型（ＨＲＶ－Ｂ１４）である。
ヒトに感染するエンテロウイルスの種は、より重篤な症状及び疾患の原因となる。例えば、エンテロウイルスＡ種のウイルスの遺伝子型であるエンテロウイルスＡ７１（ＥＶ－Ａ７１）は、四肢麻痺を引き起こす急性弛緩性脊髄炎等の中枢神経系に影響を与えるポリオ様症状と関連している。別の例として、エンテロウイルスＢ（例えば、コクサッキーウイルスＢ３）種に由来するウイルスは、手足口病と関連付けられている。さらに別の例として、エンテロウイルスＣ種に由来するウイルスは、ポリオウイルス感染症（ポリオ疾患）と関連付けられている。さらに別の例として、エンテロウイルスＤ種のウイルスの遺伝子型であるエンテロウイルスＤ６８（ＥＶ－Ｄ６８）は、重度の呼吸器疾患及び／または急性弛緩性脊髄炎と関連付けられている。本発明のいくつかの実施形態では、エンテロウイルスは、ＥＶ－Ａ７１である。いくつかの実施形態では、エンテロウイルスは、ＥＶ－Ｄ６８である。
本発明の組成物または構築物の使用に対して免疫化され得るウイルスの例としては、以前はヒトエンテロウイルスＡと呼ばれていたエンテロウイルスＡ種のメンバー（例えば、血清型コクサッキーウイルスＡ２（ＣＶＡ２）、ＣＶＡ３、ＣＶＡ４、ＣＶＡ５、ＣＶＡ６、ＣＶＡ７、ＣＶＡ８、ＣＶＡ１０、ＣＶＡ１２、ＣＶＡ１４、ＣＶＡ１６、エンテロウイルスＡ７１（ＥＶ－Ａ７１）、ＥＶ－Ａ７６、ＥＶ－Ａ８９、ＥＶ－Ａ９０、ＥＶ－Ａ９１、ＥＶ－Ａ９２、ＥＶ－Ａ１１４、ＥＶ－Ａ１１９、ＥＶ－Ａ１２０、ＥＶ－Ａ１２１、ＥＶ－Ａ１２２（旧ＳＶ１９）、ＥＶ－Ａ１２３（旧ＳＶ４３）、ＥＶ－Ａ１２４（旧ＳＶ４６）、ＥＶ－１２５（旧ＢＡ１３））、以前はヒトエンテロウイルスＢと呼ばれていたエンテロウイルスＢ種のメンバー（例えば、血清型コクサッキーウイルスＢ１（ＣＶＢ１）、ＣＶＢ２、ＣＶＢ３、ＣＶＢ４（ブタ水疱症ウイルス２ ＳＶＤＶ－２を含む）、ＣＶＢ５（ＳＶＤＶ－１を含む）、ＣＶＢ６、ＣＶＡ９、エコーウイルス１（Ｅ１、Ｅ８を含む）、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７、Ｅ９（ＣＶＡ２３を含む）Ｅ１１、Ｅ１２、Ｅ１３、Ｅ１４、Ｅ１５、Ｅ１６、Ｅ１７、Ｅ１８、Ｅ１９、Ｅ２０、Ｅ２１、Ｅ２４、Ｅ２５、Ｅ２６、Ｅ２７、Ｅ２９、Ｅ３０、Ｅ３１、Ｅ３２、Ｅ３３、エンテロウイルスＢ６９（ＥＶ－Ｂ６９）、ＥＶ－Ｂ７３、ＥＶ－Ｂ７４、ＥＶ－Ｂ７５、ＥＶ－Ｂ７７、ＥＶ－Ｂ７８、ＥＶ－Ｂ７９、ＥＶ－Ｂ８０、ＥＶ－Ｂ８１、ＥＶ－Ｂ８２、ＥＶ－Ｂ８３、ＥＶ－Ｂ８４、ＥＶ－Ｂ８５、ＥＶ－Ｂ８６、ＥＶ－Ｂ８７、ＥＶ－Ｂ８８、ＥＶ－Ｂ９３、ＥＶ－Ｂ９７、ＥＶ－Ｂ９８、ＥＶ－Ｂ１００、ＥＶ－Ｂ１０１、ＥＶ－Ｂ１０６、ＥＶ－Ｂ１０７、ＥＶ－Ｂ１１０（チンパンジー由来）、ＥＶ－Ｂ１１１、ＥＶ－Ｂ１１２（チンパンジー由来）、ＥＶ－Ｂ１１３（マンドリル由来）及びＥＶ－Ｂ１１４（旧名ｓｉｍｉａｎ ａｇｅｎｔ５（ＳＡ５））、以前はヒトエンテロウイルスＣと呼ばれていたエンテロウイルスＣ種のメンバー（例えば、ポリオウイルス（ＰＶ）１、ＰＶ２、ＰＶ３、コクサッキーウイルスＡ１（ＣＶＡ１）、ＣＶＡ１１、ＣＶＡ１３、ＣＶＡ１７、ＣＶＡ１９、ＣＶＡ２０、ＣＶＡ２１、ＣＶＡ２２、ＣＶＡ２４、ＥＶ－Ｃ９５、ＥＶ－Ｃ９６、ＥＶ－Ｃ９９、ＥＶ－Ｃ１０２、ＥＶ－Ｃ１０４、ＥＶ－Ｃ１０５、ＥＶ－Ｃ１０９、ＥＶ－Ｃ１１３、ＥＶ－Ｃ１１６、ＥＶ－Ｃ１１７及びＥＶ－Ｃ１１８）、以前はヒトエンテロウイルスＤと呼ばれていたエンテロウイルスＤ種のメンバー（例えば、血清型ＥＶ－Ｄ６８、ＥＶ－Ｄ７０、ＥＶ－Ｄ９４、ＥＶ－Ｄ１１１（ヒトとチンパンジーの両方由来）及びＥＶ－Ｄ１２０（ゴリラ由来））、以前はヒトライノウイルスＡと呼ばれていたライノウイルスＡ種のメンバー（例えば、血清型ライノウイルス（ＲＶ）Ａ１、Ａ２、Ａ７、Ａ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１１、Ａ１２、Ａ１３、Ａ１５、Ａ１６、Ａ１８、Ａ１９、Ａ２０、Ａ２１、Ａ２２、Ａ２３、Ａ２４、Ａ２５、Ａ２８、Ａ２９、Ａ３０、Ａ３１、Ａ３２、Ａ３３、Ａ３４、Ａ３６、Ａ３８、Ａ３９、Ａ４０、Ａ４１、Ａ４３、Ａ４５、Ａ４６、Ａ４７、Ａ４９、Ａ５０、Ａ５１、Ａ５３、Ａ５４、Ａ５５、Ａ５６、Ａ５７、Ａ５８、Ａ５９、Ａ６０、Ａ６１、Ａ６２、Ａ６３、Ａ６４、Ａ６５、Ａ６６、Ａ６７、Ａ６８、Ａ７１、Ａ７３、Ａ７４、Ａ７５、Ａ７６、Ａ７７、Ａ７８、Ａ８０、Ａ８１、Ａ８２、Ａ８５、Ａ８８、Ａ８９、Ａ９０、Ａ９４、Ａ９６、Ａ１００、Ａ１０１、Ａ１０２、Ａ１０３、Ａ１０４、Ａ１０５、Ａ１０６、Ａ１０７、Ａ１０８、Ａ１０９）、以前はヒトライノウイルスＢと呼ばれていたライノウイルスＢ種のメンバー（例えば、血清型ライノウイルス（ＲＶ）Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ１４、Ｂ１７、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ３５、Ｂ３７、Ｂ４２、Ｂ４８、Ｂ５２、Ｂ６９、Ｂ７０、Ｂ７２、Ｂ７９、Ｂ８３、Ｂ８４、Ｂ８６、Ｂ９１、Ｂ９２、Ｂ９３、Ｂ９７、Ｂ９９、Ｂ１００、Ｂ１０１、Ｂ１０２、Ｂ１０３、Ｂ１０４、Ｂ１０５及びＢ１０６）、ならびに以前はヒトライノウイルスＣと呼ばれていたライノウイルスＣ種のメンバー（例えば、血清型Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ２１、Ｃ２２、Ｃ２３、Ｃ２４、Ｃ２５、Ｃ２６、Ｃ２７、Ｃ２８、Ｃ２９、Ｃ３０、Ｃ３１、Ｃ３２、Ｃ３３、Ｃ３４、Ｃ３５、Ｃ３６、Ｃ３７、Ｃ３８、Ｃ３９、Ｃ４０、Ｃ４１、Ｃ４２、Ｃ４３、Ｃ４４、Ｃ４５、Ｃ４６、Ｃ４７、Ｃ４８、Ｃ４９、Ｃ５０、及びＣ５１）が挙げられるがこれらに限定されない。
本開示の組成物は、エンテロウイルスの様々な病原性株に対して対象を免疫化する単一の予防的治療薬として設計され得る。
いくつかの態様では、本開示の方法は、本明細書に記載の免疫原性組成物を対象に投与することを含む。本明細書で使用される、「免疫原性組成物」とは、プロテアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含むｍＲＮＡ、及び前駆体タンパク質を含むカプシドポリタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含むｍＲＮＡであって、該前駆体タンパク質が、２つ以上のカプシドタンパク質を含み、該２つ以上のカプシド間に、該プロテアーゼに特異的な切断部位を有するものを、エンテロウイルス属のメンバーからのウイルス感染に対する免疫応答を当該対象において誘導するのに有効な量で含む組成物を指す。
免疫応答としては、ウイルスの種に対する結合抗体力価が挙げられる。いくつかの実施形態では、免疫応答としては、ヒトライノウイルス種のウイルス（例えば、ＨＲＶ－Ａ１６またはＨＲＶ－Ｂ１４）に対する結合抗体力価が挙げられる。いくつかの実施形態では、免疫応答としては、ヒトエンテロウイルス種のウイルス（例えば、ＥＶ－Ａ７１またはＥＶ－Ｄ６８）に対する結合抗体力価が挙げられる。
免疫応答としてはさらに、ウイルスの種に対する中和抗体力価が挙げられる。いくつかの実施形態では、免疫応答としては、ヒトライノウイルス種のウイルス（例えば、ＨＲＶ－Ａ１６またはＨＲＶ－Ｂ１４）に対する中和抗体力価が挙げられる。いくつかの実施形態では、免疫応答としては、ヒトエンテロウイルス種のウイルス（例えば、ＥＶ－Ａ７１またはＥＶ－Ｄ６８）に対する中和抗体力価が挙げられる。
免疫応答としてはさらに、ウイルスの種に対するＴ細胞応答が挙げられる。いくつかの実施形態では、免疫応答としては、ヒトライノウイルス種のウイルス（例えば、ＨＲＶ－Ａ１６またはＨＲＶ－Ｂ１４）に対するＴ細胞応答が挙げられる。いくつかの実施形態では、免疫応答としては、ヒトエンテロウイルス種のウイルス（例えば、ＥＶ－Ａ７１またはＥＶ－Ｄ６８）に対するＴ細胞応答が挙げられる。
本発明によれば、ポリヌクレオチドまたは構築物及びそれらに関連する組成物は、商業化が可能なワクチン、そのバリアントまたはその一部をインビボで産生するように設計され得る。
本発明のポリヌクレオチドは、ピコルナウイルス科のウイルスによって引き起こされる疾患が挙げられるがこれらに限定されない感染または疾患から幼児を保護するために使用され得る。本発明のピコルナウイルス科のウイルスによって引き起こされる疾患の例としては、無菌性髄膜炎（ＣＮＳの最も一般的な急性ウイルス疾患）、脳炎、上気道疾患、下気道疾患、風邪、発熱性発疹疾患（手足口病）、結膜炎、ヘルパンギーナ、筋炎及び心筋炎、肝炎、ポリオウイルス感染症、ポリオ様ウイルス性疾患、急性弛緩性脊髄炎（ＡＦＭ）、胃腸障害ならびに結膜炎が挙げられるがこれらに限定されない。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、対象に投与されるとＶＬＰを形成し、エンテロウイルス感染症の予防、管理、または治療のためにサブセクションを免疫化する少なくとも１つのピコルナウイルスカプシドポリタンパク質及び／またはピコルナウイルス３Ｃプロテアーゼをコードし得る。
１つの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であるか、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）として機能する。本明細書で使用される、「メッセンジャーＲＮＡ」（ｍＲＮＡ）という用語は、少なくとも１つの目的のペプチドまたはポリペプチドをコードし、インビトロ、インビボ、インサイチュまたはエキソビボで翻訳され、コードされた目的のペプチドポリペプチドを産生することが可能な任意のポリヌクレオチドを指す。
ｍＲＮＡ分子の主要成分としては、通常、少なくとも１つのコード領域、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、３’ＵＴＲ、５’キャップ、及びポリＡテールが挙げられる。本開示のポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡとして機能し得るが、核酸ベースの治療法を使用した効果的なポリペプチド発現の既存の問題を克服するのに役立つ機能的及び／または構造的設計特性において、野生型ｍＲＮＡと区別され得る。
本開示のポリヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、コドン最適化される。コドン最適化方法は、当技術分野で知られており、本明細書に示す通りに使用され得る。コドン最適化は、いくつかの実施形態では、標的及び宿主生物におけるコドン頻度を一致させ、適切なフォールディングを確保するため、ＧＣ含量にバイアスをかけてｍＲＮＡの安定性を高め、もしくは二次構造を低減するため、遺伝子構成もしくは発現を損ない得るタンデムリピートコドンもしくは塩基の連続を最小にするため、転写及び翻訳調節領域をカスタマイズするため、タンパク質輸送配列を挿入もしくは除去するため、コードされるタンパク質の翻訳後修飾部位（例えば、グリコシル化部位）を除去／付加するため、タンパク質ドメインを付加、除去、もしくは入れ替えるため、制限酵素認識部位を挿入もしくは削除するため、リボソーム結合部位及びｍＲＮＡ分解部位を修飾するため、翻訳速度を調節し、タンパク質の様々なドメインを正確にフォールドするため、または、該ポリヌクレオチド内の問題のある二次構造を低減もしくは取り除くために使用され得る。コドン最適化ツール、アルゴリズム及びサービスは、当技術分野で知られており、非限定的な例としては、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ ＣＡ）からのサービス、及び／または独自方法が挙げられる。いくつかの実施形態では、該オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列は、最適化アルゴリズムを用いて最適化される。
いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、自然発生または野生型配列（例えば、目的のポリペプチドもしくはタンパク質、例えば、ピコルナウイルスカプシドポリタンパク質及び／またはそのピコルナウイルス３Ｃプロテアーゼ）をコードする自然発生または野生型ｍＲＮＡ配列）に対して９５％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、自然発生または野生型配列（例えば、目的のポリペプチドもしくはタンパク質、例えば、ピコルナウイルスカプシドポリタンパク質及び／またはそのピコルナウイルス３Ｃプロテアーゼ）をコードする自然発生または野生型ｍＲＮＡ配列）に対して９０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、自然発生または野生型配列（例えば、目的のポリペプチドもしくはタンパク質、例えば、ピコルナウイルスカプシドポリタンパク質及び／またはそのピコルナウイルス３Ｃプロテアーゼ）をコードする自然発生または野生型ｍＲＮＡ配列）に対して８５％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、自然発生または野生型配列（例えば、目的のポリペプチドもしくはタンパク質、例えば、ピコルナウイルスカプシドポリタンパク質及び／またはそのピコルナウイルス３Ｃプロテアーゼ）をコードする自然発生または野生型ｍＲＮＡ配列）に対して８０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、自然発生または野生型配列（例えば、目的のポリペプチドもしくはタンパク質、例えば、ピコルナウイルスカプシドポリタンパク質及び／またはそのピコルナウイルス３Ｃプロテアーゼ）をコードする自然発生または野生型ｍＲＮＡ配列）に対して７５％未満の配列同一性を共有する。
いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、自然発生または野生型配列（例えば、目的のポリペプチドもしくはタンパク質、例えば、ピコルナウイルスカプシドポリタンパク質及び／またはそのピコルナウイルス３Ｃプロテアーゼ）をコードする自然発生または野生型ｍＲＮＡ配列）に対して６５％～８５％（例えば、約６７％～約８５％または約６７％～約８０％）の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、自然発生または野生型配列（例えば、目的のポリペプチドもしくはタンパク質、例えば、ピコルナウイルスカプシドポリタンパク質及び／またはそのピコルナウイルス３Ｃプロテアーゼ）をコードする自然発生または野生型ｍＲＮＡ配列）に対して６５％～７５または約８０％の配列同一性を共有する。
いくつかの実施形態では、コドン最適化ＲＮＡは、例えば、Ｇ／Ｃレベルが高められたものでよい。核酸分子のＧ／Ｃ含量は、ＲＮＡの安定性に影響を与え得る。グアニン（Ｇ）及び／またはシトシン（Ｃ）残基の量が増加したＲＮＡは、大量のアデニン（Ａ）及びチミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ）ヌクレオチドを含む核酸より機能的に安定であり得る。ＷＯ０２／０９８４４３は、翻訳領域における配列の修飾によって安定化されたｍＲＮＡを含む医薬組成物を開示している。遺伝暗号の縮退のため、該修飾は、得られるアミノ酸を変更することなくＲＮＡの安定性をさらに高めるものに既存のコドンを置換することによって機能する。該アプローチは、該ＲＮＡのコード領域に限定される。
ポリペプチドとしては、遺伝子産物、自然発生ポリペプチド、合成ポリペプチド、ホモログ、オルソログ、パラログ、断片及び他の均等物、バリアント、ならびに前述のもののアナログが挙げられる。ポリペプチドは、単一の分子であっても、多分子複合体、例えば、二量体、三量体、または四量体であってもよい。ポリペプチドはまた、単鎖ポリペプチドまたは多鎖ポリペプチド、例えば、抗体を含んでもよく、結合または連結されていてもよい。最も一般的には、ジスルフィド結合が多鎖ポリペプチドに見られる。このポリペプチドという用語は、少なくとも１つのアミノ酸残基が、対応する自然発生アミノ酸の人工の化学的アナログであるアミノ酸ポリマーにも適用され得る。
「ポリペプチドバリアント」という用語は、天然または参照配列とはアミノ酸配列が異なる分子を指す。該アミノ酸配列バリアントは、天然または参照配列と比較して、アミノ酸配列内のある特定の位置に置換、欠失、及び／または挿入を有し得る。通常、バリアントは、天然または参照配列に対して少なくとも５０％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、バリアントは、天然または参照配列と少なくとも８０％、または少なくとも９０％の同一性を共有する。
いくつかの実施形態では、「バリアント模倣体」が提供される。本明細書で使用される、「バリアント模倣体」という用語は、活性化配列を模倣する少なくとも１つのアミノ酸を含むものである。例えば、グルタミン酸は、ホスホロスレオニン及び／またはホスホロセリンの模倣体として機能し得る。代替的に、バリアント模倣体は、不活性化される場合もあれば、模倣体を含む不活化産物が生じる場合もあり、例えば、フェニルアラニンがチロシンの不活化置換として機能する場合もあれば、アラニンがセリンの不活化置換として機能する場合もある。
「オルソログ」は、種形成によって共通の祖先遺伝子から進化した異なる種における遺伝子を指す。通常、オルソログは、進化の過程で同じ機能を保持する。オルソログの同定は、新たに配列決定されたゲノムにおける遺伝子機能の確実な予測のために重要である。
「アナログ」は、親ポリペプチドまたは出発ポリペプチドの１つ以上の特性をなお維持している、１つ以上のアミノ酸の変更、例えば、アミノ酸残基の置換、付加または欠失によって異なるポリペプチドバリアントを含むことを意味する。
本開示は、バリアント及び誘導体を含めた、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに基づくいくつかのタイプの組成物を提供する。これらとしては、例えば、置換、挿入、欠失、ならびに共有結合バリアント及び誘導体が挙げられる。「誘導体」という用語は、「バリアント」という用語と同義で使用されるが、一般に、参照分子または出発分子に対して何らかの形で修飾及び／または変更された分子を指す。
そのため、参照配列、特に本明細書に開示するポリペプチド配列に関する置換、挿入、及び／または付加、欠失、及び共有結合修飾を含むペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、本開示の範囲内に含まれる。例えば、配列タグまたはアミノ酸、例えば、１つ以上のリジンをペプチド配列に（例えば、そのＮ末端またはＣ末端に）付加することができる。配列タグは、ペプチドの検出、精製または位置特定のために使用され得る。リジンは、ペプチドの溶解性を増大させるために、またはビオチン化を可能にするために使用され得る。代替的に、ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列のカルボキシ及びアミノ末端領域に位置するアミノ酸残基を任意に欠失させ、切断型配列をもたらすことができる。ある特定のアミノ酸（例えば、Ｃ末端またはＮ末端残基）を、代替的に、配列の用途、例えば、可溶性の、または固体支持体に連結されたより大きな配列の一部としての配列の発現に応じて欠失させてもよい。いくつかの実施形態では、シグナル配列、終止配列、膜貫通ドメイン、リンカー、多量体化ドメイン（例えば、フォールドオン領域）等のための（またはこれらをコードする）配列を、同じまたは類似の機能を達成する代替的な配列で置き換えてもよい。いくつかの実施形態では、タンパク質のコア内の空洞は、例えば、より大きなアミノ酸を導入することにより、充填して安定性を改善してもよい。他の実施形態では、埋もれた水素結合ネットワークを疎水性残基により置き換えて、安定性を改善してもよい。さらに他の実施形態では、グリコシル化部位を除去し、適切な残基で置き換えてもよい。かかる配列は、当業者には容易に識別可能である。
ポリペプチドに言及する場合の「置換バリアント」とは、天然配列または出発配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、その代わりに同じ位置に挿入された異なるアミノ酸を有するものである。置換は、分子内の１つのアミノ酸のみが置換される単一の場合もあれば、同じ分子内で２つ以上のアミノ酸が置換される複数の場合もある。
本明細書で使用される、「保存的アミノ酸置換」という用語は、配列中に通常存在するアミノ酸を、同様のサイズ、電荷、または極性の、異なるアミノ酸で置換することを指す。保存的置換の例としては、非極性（疎水性）残基、例えば、イソロイシン、バリン、及びロイシンを別の非極性残基に置換することが挙げられる。同様に、保存的置換の例としては、１つの極性（親水性）残基を別の残基で置換すること、例えば、アルギニンとリジン間、グルタミンとアスパラギン間、及びグリシンとセリン間の置換が挙げられる。さらに、リジン、アルギニンまたはヒスチジン等の塩基性残基を別のものに置換すること、またはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸等の酸性残基を別の酸性残基に置換することもまた、保存的置換のさらなる例である。非保存的置換の例としては、非極性（疎水性）アミノ酸残基、例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、メチオニンを極性（親水性）残基、例えば、システイン、グルタミン、グルタミン酸もしくはリジンで置換すること、または極性残基を非極性残基で置換することが挙げられる。
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに言及する場合の「特徴」は、それぞれ、異なるアミノ酸配列ベースまたはヌクレオチドベースの分子の成分として定義される。ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの特徴としては、表面発現、局所立体構造形状、フォールド、ループ、半ループ、ドメイン、半ドメイン、部位、末端、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
本明細書で使用される、ポリペプチドに言及する場合の「ドメイン」という用語は、１つ以上の識別可能な構造的または機能的特徴または特性（例えば、タンパク質間相互作用の部位として機能する結合能力）を有するポリペプチドのモチーフを指す。
本明細書で使用される、ポリペプチドに言及する場合のアミノ酸系の実施形態に関して「部位」という用語は、「アミノ酸残基」及び「アミノ酸側鎖」と同義で用いられる。本明細書で使用される、ポリヌクレオチドに言及する場合のヌクレオチド系の実施形態に関して「部位」という用語は、「ヌクレオチド」と同義で用いられる。ある部位は、当該ポリペプチドもしくはポリヌクレオチド系分子内で修飾、操作、変更、誘導体化、または変化され得るペプチド、もしくはポリペプチド、またはポリヌクレオチド内の位置を表す。
本明細書で使用される、ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドを指す場合の「末端（ｔｅｒｍｉｎｉ）」または「末端（ｔｅｒｍｉｎｕｓ）」という用語は、それぞれ、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの端を指す。かかる端は、該ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドの最初または最後の部位のみに限定されず、当該末端領域の追加のアミノ酸またはヌクレオチドも含み得る。ポリペプチド系分子は、Ｎ末端（遊離のアミノ基（ＮＨ２）を備えたアミノ酸で終端される）及びＣ末端（遊離のカルボキシル基（ＣＯＯＨ）を備えたアミノ酸で終端される）の両方を有することを特徴とし得る。タンパク質は、いくつかの場合では、ジスルフィド結合によって、または非共有結合力によって一緒にされた複数のポリペプチド鎖で構成される（例えば、マルチマー、オリゴマー）。これらのタンパク質は、複数のＮ及びＣ末端を有する。代替的に、ポリペプチドの末端は、それらが場合によっては、非ポリペプチド系部分、例えば、有機コンジュゲートで開始または終端するように修飾され得る。
当業者には認められるように、タンパク質断片、機能タンパク質ドメイン、及び相同タンパク質もまた、目的のポリペプチドの範囲内であると見なされる。例えば、本明細書に提供するのは、アミノ酸長が１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、または１００を超える、参照タンパク質の任意のタンパク質断片（参照ポリペプチド配列より少なくとも１アミノ酸残基短いがそれ以外は同一であるポリペプチド配列を意味する）である。別の例では、本明細書に記載の配列のいずれかに対して４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の２０、３０、４０、５０、または１００アミノ酸のストレッチを含む任意のタンパク質を、本開示に従って使用することができる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、本明細書に提供するまたは参照する配列のいずれかに示す通り、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれを超える突然変異を含む。別の例では、本明細書に記載の配列のいずれかに対して８０％超、９０％、９５％、または１００％同一の２０、３０、４０、５０、または１００アミノ酸のストレッチを含む任意のタンパク質であって、本明細書に記載の配列のいずれかに対して８０％、７５％、７０％、６５％、または６０％未満同一の５、１０、１５、２０、２５、または３０アミノ酸のストレッチを有するタンパク質を本開示に従って使用することができる。
本開示のポリペプチドまたはポリヌクレオチド分子は、参照分子（例えば、参照ポリペプチドまたは参照ポリヌクレオチド）と、例えば、当技術分野において記載されている分子（例えば、人工的に作り出されるまたは設計される分子または野生型分子）と、ある特定の配列類似性または同一性度を共有し得る。当技術分野で知られる「同一性」という用語は、２つ以上のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの配列間の関係を指し、該配列を比較して決定される。当技術分野では、同一性はまた、それらの間の配列相関性の程度も意味し、２つ以上のアミノ酸残基または核酸残基のストリング間の一致数によって決定される。同一性は、特定の数学的モデルまたはコンピュータプログラム（例えば、「アルゴリズム」）によって対処される、ギャップアラインメント（もしあれば）を有する２つ以上の配列の小さい方の間の完全な一致のパーセントを測定する。関連するペプチドの同一性は、既知の方法で容易に計算することができる。ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列に適用される「％同一性」は、当該配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入して最大パーセント同一性を達成した後の第二の配列のアミノ酸配列または核酸配列における残基と同一の、アミノ酸または核酸の候補配列における残基（アミノ酸残基または核酸残基）のパーセンテージと定義される。該アラインメントのための方法及びコンピュータプログラムは、当技術分野で周知である。同一性は、パーセント同一性の計算に依存するが、該計算に導入されるギャップ及びペナルティによって値が異なり得ることが理解される。一般に、特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチドのバリアントは、特定の参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対して、本明細書に記載の当業者に知られる配列アラインメントプログラム及びパラメータによって決定される、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％であるが１００％未満の配列同一性を有する。かかるアラインメント用のツールとしては、ＢＬＡＳＴスイート（Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ（１９９７），“Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２）のものが挙げられる。別のよく知られたローカルアラインメント技術は、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．Ｆ．＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｓ．（１９８１）“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｍｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５－１９７）を基にしている。動的計画法に基づく一般的なグローバルアラインメント技術は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（１９７０）“Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｗｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３．）である。より最近では、Ｆａｓｔ Ｏｐｔｉｍａｌ Ｇｌｏｂａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（ＦＯＧＳＡＡ）が開発されており、これは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを含めた他の最適グローバルアラインメント法よりも速く、ヌクレオチド及びタンパク質配列のグローバルアラインメントを意図的に生成する。他のツールは、とりわけ以下の「同一性」の定義において、本明細書に記載する。
本明細書で使用される、「相同性」という用語は、ポリマー分子間、例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／またはＲＮＡ分子）間及び／またはポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。一致する残基のアラインメントによって決定される類似性または同一性の閾値を共有するポリマー分子（例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／またはＲＮＡ分子）及び／またはポリペプチド分子）を相同と呼ぶ。相同性は、分子間の関係を示す定性的な用語であり、定量的な類似性または同一性を基にすることができる。類似性または同一性は、２つの比較配列間の配列の一致の程度を決める定量的な用語である。いくつかの実施形態では、ポリマー分子は、それらの配列が、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一または類似である場合に互いに「相同」であると見なされる。「相同」という用語は、必然的に、少なくとも２つの配列（ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列）間の比較を指す。２つのポリヌクレオチド配列は、それらがコードするポリペプチドが、少なくとも２０アミノ酸の少なくとも１つのストレッチについて、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはさらに９９％である場合に相同と見なされる。いくつかの実施形態では、相同ポリヌクレオチド配列は、少なくとも４～５個の独自に特定されるアミノ酸のストレッチをコードする能力を特徴とする。６０ヌクレオチド長未満のポリヌクレオチド配列については、相同性は、少なくとも４～５個の独自に特定されるアミノ酸のストレッチをコードする能力によって決定される。２つのタンパク質配列は、該タンパク質が、少なくとも２０アミノ酸の少なくとも１つのストレッチについて、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％同一である場合に相同であると見なされる。
相同性は、比較配列が共通の起源から進化中に枝分かれしたことを暗示する。「ホモログ」という用語は、共通の祖先配列からの系統が、第二のアミノ酸配列または核酸配列と関連する第一のアミノ酸配列または核酸配列（例えば、遺伝子（ＤＮＡもしくはＲＮＡ）またはタンパク質配列）を指す。「ホモログ」という用語は、種形成事象によって分離された遺伝子及び／またはタンパク質間の関係、または遺伝子複製事象によって分離された遺伝子及び／またはタンパク質間の関係に適用され得る。「オルソログ」は、種形成によって共通の祖先遺伝子（またはタンパク質）から進化した異なる種における遺伝子（またはタンパク質）である。通常、オルソログは、進化の過程で同じ機能を保持する。「パラログ」は、ゲノム内の複製によって関連付けられる遺伝子（またはタンパク質）である。オルソログは、進化の過程で同じ機能を保持するが、パラログは、たとえ本来の機能と関連していたとしても新たな機能を進化させる。
「同一性」という用語は、ポリマー分子間、例えば、ポリヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／またはＲＮＡ分子）間、及び／またはポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。２つのポリ核酸配列のパーセント同一性の計算は、例えば、最適な比較目的のために２つの配列を整列させることによって行うことができる（例えば、最適アラインメントのためにギャップを第一及び第二の核酸配列の一方または両方に導入してもよいし、非同一配列を比較目的のために無視してもよい）。ある特定の実施形態では、比較目的のために整列させた配列の長さは、比較配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％である。対応するヌクレオチド位置でのヌクレオチドを次に比較する。第一の配列における位置が、第二の配列の対応する位置と同じヌクレオチドで占められている場合、該分子はその位置で同一である。２つの配列間のパーセント同一性は、ギャップ数、及び、該２つの配列の最適アラインメントのために導入される必要がある各ギャップの長さを考慮に入れて、該配列によって共有される同一位置の数の関数である。配列の比較及び２つの配列間のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。例えば、２つの核酸配列間のパーセント同一性は、各々が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８、Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４、及びＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１に記載のもの等の方法を用いて決定することができる。例えば、２つの核酸配列間のパーセント同一性は、ＰＡＭ１２０重み付け残基表、ギャップ長ペナルティ１２及びギャップペナルティ４を用いたＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれた、Ｍｅｙｅｒｓ及びＭｉｌｌｅｒのアルゴリズム（ＣＡＢＩＯＳ，１９８９，４：１１－１７）を用いて決定することができる。２つの核酸配列間のパーセント同一性は、代替的に、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスを用いたＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを用いて決定することができる。配列間のパーセント同一性を決定するために一般的に使用される方法としては、参照により本明細書に組み込まれる、Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）に開示されているものが挙げられるが、これらに限定されない。同一性を決定するための技術は、公開されているコンピュータプログラムに体系化されている。２つの配列間の相同性を決定するための例示的なコンピュータソフトウェアとしては、ＧＣＧプログラムパッケージ、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２（１），３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０））が挙げられるがこれらに限定されない。
本開示のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）治療は、少なくとも１つの化学修飾を含むピコルナウイルスカプシドポリタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含み得る。本開示のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）治療は、少なくとも１つの化学修飾を含むピコルナウイルス３Ｃプロテアーゼをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含み得る。
「化学修飾」及び「化学修飾された」という用語は、それらの位置、パターン、パーセントまたは集団の少なくとも１つにおけるアデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、ウリジン（Ｕ）、チミジン（Ｔ）またはシチジン（Ｃ）リボヌクレオシドまたはデオキシリボヌクレオシドに関する修飾を指す。一般に、これらの用語は、自然発生５’末端ｍＲＮＡキャップ部分におけるリボヌクレオチド修飾を指さない。ポリペプチドに関して、「修飾」という用語は、標準的なセットの２０アミノ酸に対する修飾を指す。本明細書に提供するポリペプチドは、アミノ酸の置換、挿入、または置換と挿入の組み合わせを含む場合にも「修飾された」とみなされる。
ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、いくつかの実施形態では、様々な（複数の）異なる修飾を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの特定の領域は、１つ、２つ、またはそれ以上の（任意に異なる）ヌクレオシドまたはヌクレオチドの修飾を含む。いくつかの実施形態では、細胞または生物に導入された修飾ＲＮＡポリヌクレオチド（例えば、修飾ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、非修飾ポリヌクレオチドと比較して、それぞれ、細胞または生物において分解の減少を示す。いくつかの実施形態では、細胞または生物に導入された修飾ＲＮＡポリヌクレオチド（例えば、修飾ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、それぞれ、細胞または生物において、免疫原性の低下（例えば、生得的反応の低下）を示し得る。
ポリヌクレオチドの修飾としては、本明細書に記載のものが挙げられるがこれらに限定されない。ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、自然発生修飾、非自然発生修飾を含む場合もあれば、該ポリヌクレオチドは、自然発生修飾及び非自然発生修飾の組み合わせを含む場合もある。ポリヌクレオチドは、例えば、糖、核酸塩基、またはヌクレオシド間結合の任意の有用な修飾（例えば、結合リン酸に対する、ホスホジエステル結合に対するまたはホスホジエステル骨格に対する）を含み得る。
ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドの合成の過程で、または合成後に導入されて、所望の機能または特性を達成する非天然の修飾ヌクレオチドを含む。該修飾は、ヌクレオチド間結合、プリンもしくはピリミジン塩基、または糖に存在し得る。該修飾は、化学合成によって導入してもよいし、ポリメラーゼ酵素を用いて鎖の末端もしくは鎖中の任意の場所に導入してもよい。ポリヌクレオチドの任意の領域が化学的に修飾され得る。
本開示は、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）の修飾されたヌクレオシド及びヌクレオチドを提供する。「ヌクレオシド」とは、糖分子（例えば、ペントースもしくはリボース）またはその誘導体と、有機塩基（例えば、プリンもしくはピリミジン）またはその誘導体（本明細書では「核酸塩基」とも称される）との組み合わせを含む化合物を指す。「ヌクレオチド」とは、１つ以上のリン酸基を含むヌクレオシドを指す。修飾ヌクレオチドは、１つ以上の修飾または非天然ヌクレオシドを含めるため、任意の有用な方法で、例えば、化学的に、酵素的に、または組み換え的に合成され得る。ポリヌクレオチドは、連結されたヌクレオシドの領域（複数可）を含み得る。かかる領域は、可変骨格結合を有し得る。該結合は、標準的なホスホジエステル結合であってよく、この場合、該ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドの領域を含む。
修飾ヌクレオチドの塩基対合は、標準的なアデノシン－チミン、アデノシン－ウラシル、またはグアノシン－シトシン塩基対だけでなく、非標準または修飾塩基を含むヌクレオチド及び／または修飾ヌクレオチド間で形成される塩基対も包含し、ここで、水素結合供与体と水素結合受容体の配置により、非標準塩基と標準塩基間、または２つの相補的非標準塩基構造間の水素結合が可能になる。かかる非標準塩基対合の一例は、修飾ヌクレオチドイノシンとアデニン、シトシンまたはウラシル間の塩基対合である。塩基／糖またはリンカーの任意の組み合わせが、本開示のポリヌクレオチドに組み込まれ得る。
当業者には、特に断りのない限り、本出願に記載のポリヌクレオチド配列が、代表的なＤＮＡ配列において「Ｔ」を列挙するが、配列がＲＮＡを表す場合、「Ｔ」は「Ｕ」で置き換えられることが理解されよう。
本開示の組成物、方法及び合成プロセスにおいて有用なポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）の修飾としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：２－メチルチオ－Ｎ６－（ｃｉｓ－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－メチルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、Ｎ６－メチルアデノシン、Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン、１，２’－Ｏ－ジメチルアデノシン、１－メチルアデノシン、２’－Ｏ－メチルアデノシン、２’－Ｏ－リボシルアデノシン（リン酸）、２－メチルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン、２’－Ｏ－メチルアデノシン、２’－Ｏ－リボシルアデノシン（リン酸）、イソペンテニルアデノシン、Ｎ６－（ｃｉｓ－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６，２’－Ｏ－ジメチルアデノシン、Ｎ６，２’－Ｏ－ジメチルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６，２’－Ｏ－トリメチルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデノシン、Ｎ６－アセチルアデノシン、Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン、Ｎ６－メチル－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン、２－メチルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、７－デアザ－アデノシン、Ｎ１－メチル－アデノシン、Ｎ６，Ｎ６－（ジメチル）アデニン、Ｎ６－ｃｉｓ－ヒドロキシ－イソペンテニル－アデノシン、α－チオ－アデノシン、２－（アミノ）アデニン、２－（アミノプロピル）アデニン、２－（メチルチオ）－Ｎ６－（イソペンテニル）アデニン、２－（アルキル）アデニン、２－（アミノアルキル）アデニン、２－（アミノプロピル）アデニン、２－（ハロ）アデニン、２－（ハロ）アデニン、２－（プロピル）アデニン、２’－アミノ－２’－デオキシ－ＡＴＰ、２’－アジド－２’－デオキシ－ＡＴＰ、２’－デオキシ－２’－ａ－アミノアデノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ａ－アジドアデノシンＴＰ、６－（アルキル）アデニン、６－（メチル）アデニン、６－（アルキル）アデニン、６－（メチル）アデニン、７－（デアザ）アデニン、８－（アルケニル）アデニン、８－（アルキニル）アデニン、８－（アミノ）アデニン、８－（チオアルキル）アデニン、８－（アルケニル）アデニン、８－（アルキル）アデニン、８－（アルキニル）アデニン、８－（アミノ）アデニン、８－（ハロ）アデニン、８－（ヒドロキシル）アデニン、８－（チオアルキル）アデニン、８－（チオール）アデニン、８－アジド－アデノシン、アザアデニン、デアザアデニン、Ｎ６－（メチル）アデニン、Ｎ６－（イソペンチル）アデニン、７－デアザ－８－アザ－アデノシン、７－メチルアデニン、１－デアザアデノシンＴＰ、２’－フルオロ－Ｎ６－Ｂｚ－デオキシアデノシンＴＰ、２’－ＯＭｅ－２－アミノ－ＡＴＰ、２’－Ｏ－メチル－Ｎ６－Ｂｚ－デオキシアデノシンＴＰ、２’－ａ－エチニルアデノシンＴＰ、２－アミノアデニン、２－アミノアデノシンＴＰ、２－アミノ－ＡＴＰ、２’－ａ－トリフルオロメチルアデノシンＴＰ、２－アジドアデノシンＴＰ、２’－ｂ－エチニルアデノシンＴＰ、２－ブロモアデノシンＴＰ、２’－ｂ－トリフルオロメチルアデノシンＴＰ、２－クロロアデノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’，２’－ジフルオロアデノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ａ－メルカプトアデノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ａ－チオメトキシアデノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ｂ－アミノアデノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ｂ－アジドアデノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ｂ－ブロモアデノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ｂ－クロロアデノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ｂ－フルオロアデノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ｂ－ヨードアデノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ｂ－メルカプトアデノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ｂ－チオメトキシアデノシンＴＰ、２－フルオロアデノシンＴＰ、２－ヨードアデノシンＴＰ、２－メルカプトアデノシンＴＰ、２－メトキシ－アデニン、２－メチルチオ－アデニン、２－トリフルオロメチルアデノシンＴＰ、３－デアザ－３－ブロモアデノシンＴＰ、３－デアザ－３－クロロアデノシンＴＰ、３－デアザ－３－フルオロアデノシンＴＰ、３－デアザ－３－ヨードアデノシンＴＰ、３－デアザアデノシンＴＰ、４’－アジドアデノシンＴＰ、４’－カルボサイクリックアデノシンＴＰ、４’－エチニルアデノシンＴＰ、５’－ホモ－アデノシンＴＰ、８－アザ－ＡＴＰ、８－ブロモ－アデノシンＴＰ、８－トリフルオロメチルアデノシンＴＰ、９－デアザアデノシンＴＰ、２－アミノプリン、７－デアザ－２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－８－アザ－アデニン、７－デアザ－２－アミノプリン、２－チオシチジン、３－メチルシチジン、５－ホルミルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、５－メチルシチジン、Ｎ４－アセチルシチジン、２’－Ｏ－メチルシチジン、２’－Ｏ－メチルシチジン、５，２’－Ｏ－ジメチルシチジン、５－ホルミル－２’－Ｏ－メチルシチジン、リシジン、Ｎ４，２’－Ｏ－ジメチルシチジン、Ｎ４－アセチル－２’－Ｏ－メチルシチジン、Ｎ４－メチルシチジン、Ｎ４，Ｎ４－ジメチル－２’－ＯＭｅ－シチジンＴＰ、４－メチルシチジン、５－アザ－シチジン、プソイド－イソ－シチジン、ピロロ－シチジン、α－チオ－シチジン、２－（チオ）シトシン、２’－アミノ－２’－デオキシ－ＣＴＰ、２’－アジド－２’－デオキシ－ＣＴＰ、２’－デオキシ－２’－ａ－アミノシチジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ａ－アジドシチジンＴＰ、３－（デアザ）－５－（アザ）シトシン、３－（メチル）シトシン、３－（アルキル）シトシン、３－（デアザ）－５－（アザ）シトシン、３－（メチル）シチジン、４，２’－Ｏ－ジメチルシチジン、５－（ハロ）シトシン、５－（メチル）シトシン、５－（プロピニル）シトシン、５－（トリフルオロメチル）シトシン、５－（アルキル）シトシン、５－（アルキニル）シトシン、５－（ハロ）シトシン、５－（プロピニル）シトシン、５－（トリフルオロメチル）シトシン、５－ブロモ－シチジン、５－ヨード－シチジン、５－プロピニルシトシン、６－（アゾ）シトシン、６－アザ－シチジン、アザシトシン、デアザシトシン、Ｎ４－（アセチル）シトシン、１－メチル－１－デアザ－プソイドイソシチジン、１－メチル－プソイドイソシチジン、２－メトキシ－５－メチル－シチジン、２－メトキシ－シチジン、２－チオ－５－メチル－シチジン、４－メトキシ－１－メチル－プソイドイソシチジン、４－メトキシ－プソイドイソシチジン、４－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドイソシチジン、４－チオ－１－メチル－プソイドイソシチジン、４－チオ－プソイドイソシチジン、５－アザ－ゼブラリン、５－メチル－ゼブラリン、ピロロ－プソイドイソシチジン、ゼブラリン、（Ｅ）－５－（２－ブロモ－ビニル）シチジンＴＰ、２，２’－アンヒドロ－シチジンＴＰ塩酸塩、２’－フルオロ－Ｎ４－Ｂｚ－シチジンＴＰ、２’－フルオロ－Ｎ４－アセチル－シチジンＴＰ、２’－Ｏ－メチル－Ｎ４－アセチル－シチジンＴＰ、２’－Ｏ－メチル－Ｎ４－Ｂｚ－シチジンＴＰ、２’－ａ－エチニルシチジンＴＰ、２’－ａ－トリフルオロメチルシチジンＴＰ、２’－ｂ－エチニルシチジンＴＰ、２’－ｂ－トリフルオロメチルシチジンＴＰ、２’－デオキシ－２’，２’－ジフルオロシチジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ａ－メルカプトシチジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ａ－チオメトキシシチジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ｂ－アミノシチジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ｂ－アジドシチジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ｂ－ブロモシチジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ｂ－クロロシチジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ｂ－フルオロシチジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ｂ－ヨードシチジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ｂ－メルカプトシチジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ｂ－チオメトキシシチジンＴＰ、２’－Ｏ－メチル－５－（１－プロピニル）シチジンＴＰ、３’－エチニルシチジンＴＰ、４’－アジドシチジンＴＰ、４’－カルボサイクリックシチジンＴＰ、４’－エチニルシチジンＴＰ、５－（１－プロピニル）アラ－シチジンＴＰ、５－（２－クロロ－フェニル）－２－チオシチジンＴＰ、５－（４－アミノ－フェニル）－２－チオシチジンＴＰ、５－アミノアリル－ＣＴＰ、５－シアノシチジンＴＰ、５－エチニルアラ－シチジンＴＰ、５－エチニルシチジンＴＰ、５’－ホモ－シチジンＴＰ、５－メトキシシチジンＴＰ、５－トリフルオロメチル－シチジンＴＰ、Ｎ４－アミノ－シチジンＴＰ、Ｎ４－ベンゾイル－シチジンＴＰ、プソイドイソシチジン、７－メチルグアノシン、Ｎ２，２’－Ｏ－ジメチルグアノシン、Ｎ２－メチルグアノシン、ワイオシン、１，２’－Ｏ－ジメチルグアノシン、１－メチルグアノシン、２’－Ｏ－メチルグアノシン、２’－Ｏ－リボシルグアノシン（リン酸）、２’－Ｏ－メチルグアノシン、２’－Ｏ－リボシルグアノシン（リン酸）、７－アミノメチル－７－デアザグアノシン、７－シアノ－７－デアザグアノシン、アルケオシン、メチルワイオシン、Ｎ２，７－ジメチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２，２’－Ｏ－トリメチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２，７－トリメチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン、Ｎ２，７，２’－Ｏ－トリメチルグアノシン、６－チオ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、Ｎ１－メチル－グアノシン、α－チオ－グアノシン、２－（プロピル）グアニン、２－（アルキル）グアニン、２’－アミノ－２’－デオキシ－ＧＴＰ、２’－アジド－２’－デオキシ－ＧＴＰ、２’－デオキシ－２’－ａ－アミノグアノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ａ－アジドグアノシンＴＰ、６－（メチル）グアニン、６－（アルキル）グアニン、６－（メチル）グアニン、６－メチル－グアノシン、７－（アルキル）グアニン、７－（デアザ）グアニン、７－（メチル）グアニン、７－（アルキル）グアニン、７－（デアザ）グアニン、７－（メチル）グアニン、８－（アルキル）グアニン、８－（アルキニル）グアニン、８－（ハロ）グアニン、８－（チオアルキル）グアニン、８－（アルケニル）グアニン、８－（アルキル）グアニン、８－（アルキニル）グアニン、８－（アミノ）グアニン、８－（ハロ）グアニン、８－（ヒドロキシル）グアニン、８－（チオアルキル）グアニン、８－（チオール）グアニン、アザグアニン、デアザグアニン、Ｎ－（メチル）グアニン、Ｎ－（メチル）グアニン、１－メチル－６－チオ－グアノシン、６－メトキシ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－８－アザ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－グアノシン、６－チオ－７－メチル－グアノシン、７－デアザ－８－アザ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシン、Ｎ２，Ｎ２－ジメチル－６－チオ－グアノシン、Ｎ２－メチル－６－チオ－グアノシン、１－Ｍｅ－ＧＴＰ、２’－フルオロ－Ｎ２－イソブチル－グアノシンＴＰ、２’－Ｏ－メチル－Ｎ２－イソブチル－グアノシンＴＰ、２’－ａ－エチニルグアノシンＴＰ、２’－ａ－トリフルオロメチルグアノシンＴＰ、２’－ｂ－エチニルグアノシンＴＰ、２’－ｂ－トリフルオロメチルグアノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’，２’－ジフルオログアノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ａ－メルカプトグアノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ａ－チオメトキシグアノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ｂ－アミノグアノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ｂ－アジドグアノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ｂ－ブロモグアノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ｂ－クロログアノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ｂ－フルオログアノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ｂ－ヨードグア
ノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ｂ－メルカプトグアノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ｂ－チオメトキシグアノシンＴＰ、４’－アジドグアノシンＴＰ、４’－カルボサイクリックグアノシンＴＰ、４’－エチニルグアノシンＴＰ、５’－ホモ－グアノシンＴＰ、８－ブロモ－グアノシンＴＰ、９－デアザグアノシンＴＰ、Ｎ２－イソブチル－グアノシンＴＰ、１－メチルイノシン、イノシン、１，２’－Ｏ－ジメチルイノシン、２’－Ｏ－メチルイノシン、７－メチルイノシン、２’－Ｏ－メチルイノシン、エポキシキューオシン、ガラクトシル－キューオシン、マンノシルキューオシン、キューオシン、アリルアミノ－チミジン、アザチミジン、デアザチミジン、デオキシ－チミジン、２’－Ｏ－メチルウリジン、２－チオウリジン、３－メチルウリジン、５－カルボキシメチルウリジン、５－ヒドロキシウリジン、５－メチルウリジン、５－タウリノメチル－２－チオウリジン、５－タウリノメチルウリジン、ジヒドロウリジン、プソイドウリジン、（３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウリジン、１－メチル－３－（３－アミノ－５－カルボキシプロピル）プソイドウリジン、１－メチルプソイドウリジン、１－メチル－プソイドウリジン、２’－Ｏ－メチルウリジン、２’－Ｏ－メチルプソイドウリジン、２’－Ｏ－メチルウリジン、２－チオ－２’－Ｏ－メチルウリジン、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウリジン、３，２’－Ｏ－ジメチルウリジン、３－メチル－プソイド－ウリジンＴＰ、４－チオウリジン、５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン、５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジンメチルエステル、５，２’－Ｏ－ジメチルウリジン、５，６－ジヒドロ－ウリジン、５－アミノメチル－２－チオウリジン、５－カルバモイルメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－カルバモイルメチルウリジン、５－カルボキシヒドロキシメチルウリジン、５－カルボキシヒドロキシメチルウリジンメチルエステル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウリジン、５－カルバモイルメチルウリジンＴＰ、５－メトキシカルボニルメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－メトキシカルボニルメチル－２－チオウリジン、５－メトキシカルボニルメチルウリジン、５－メチルウリジン）、５－メトキシウリジン、５－メチル－２－チオウリジン、５－メチルアミノメチル－２－セレノウリジン、５－メチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－メチルアミノメチルウリジン、５－メチルジヒドロウリジン、５－オキシ酢酸－ウリジンＴＰ、５－オキシ酢酸－メチルエステル－ウリジンＴＰ、Ｎ１－メチル－プソイド－ウリジン、Ｎ１－エチルプソイドウリジン、ウリジン－５－オキシ酢酸、ウリジン－５－オキシ酢酸メチルエステル、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）－ウリジンＴＰ、５－（イソ－ペンテニルアミノメチル）－２－チオウリジンＴＰ、５－（イソ－ペンテニルアミノメチル）－２’－Ｏ－メチルウリジンＴＰ、５－（イソ－ペンテニルアミノメチル）ウリジンＴＰ、５－プロピニルウラシル、α－チオ－ウリジン、１－（アミノアルキルアミノ－カルボニルエチレニル）－２－（チオ）－プソイドウラシル、１－（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）－２，４－（ジチオ）プソイドウラシル、１－（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）－４－（チオ）プソイドウラシル、１－（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）－プソイドウラシル、１－（アミノカルボニルエチレニル）－２－（チオ）－プソイドウラシル、１－（アミノカルボニルエチレニル）－２，４－（ジチオ）プソイドウラシル、１－（アミノカルボニルエチレニル）－４－（チオ）プソイドウラシル、１－（アミノカルボニルエチレニル）－プソイドウラシル、１置換２－（チオ）－プソイドウラシル、１置換２，４－（ジチオ）プソイドウラシル、１置換４－（チオ）プソイドウラシル、１置換プソイドウラシル、１－（アミノアルキルアミノ－カルボニルエチレニル）－２－（チオ）－プソイドウラシル、１－メチル－３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）プソイドウリジンＴＰ、１－メチル－３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）プソイド－ＵＴＰ、１－メチル－プソイド－ＵＴＰ、２－（チオ）プソイドウラシル、２’－デオキシウリジン、２’－フルオロウリジン、２－（チオ）ウラシル、２，４－（ジチオ）プソイドウラシル、２’－メチル，２’－アミノ，２’－アジド，２’－フルオロ－グアノシン、２’－アミノ－２’－デオキシ－ＵＴＰ、２’－アジド－２’－デオキシ－ＵＴＰ、２’－アジド－デオキシウリジンＴＰ、２’－Ｏ－メチルプソイドウリジン、２’－デオキシウリジン、２’－フルオロウリジン、２’－デオキシ－２’－ａ－アミノウリジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ａ－アジドウリジンＴＰ、２－メチルプソイドウリジン、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウラシル、４－（チオ）プソイドウラシル、４－（チオ）プソイドウラシル、４－（チオ）ウラシル、４－チオウラシル、５－（１，３－ジアゾール－１－アルキル）ウラシル、５－（２－アミノプロピル）ウラシル、５－（アミノアルキル）ウラシル、５－（ジメチルアミノアルキル）ウラシル、５－（グアニジニウムアルキル）ウラシル、５－（メトキシカルボニルメチル）－２－（チオ）ウラシル、５－（メトキシカルボニル－メチル）ウラシル、５－（メチル）－２－（チオ）ウラシル、５－（メチル）－２，４－（ジチオ）ウラシル、５－（メチル）－４－（チオ）ウラシル、５－（メチルアミノメチル）－２－（チオ）ウラシル、５－（メチルアミノメチル）－２，４－（ジチオ）ウラシル、５－（メチルアミノメチル）－４－（チオ）ウラシル、５－（プロピニル）ウラシル、５－（トリフルオロメチル）ウラシル、５－（２－アミノプロピル）ウラシル、５－（アルキル）－２－（チオ）プソイドウラシル、５－（アルキル）－２，４（ジチオ）プソイドウラシル、５－（アルキル）－４－（チオ）プソイドウラシル、５－（アルキル）プソイドウラシル、５－（アルキル）ウラシル、５－（アルキニル）ウラシル、５－（アリルアミノ）ウラシル、５－（シアノアルキル）ウラシル、５－（ジアルキルアミノアルキル）ウラシル、５－（ジメチルアミノアルキル）ウラシル、５－（グアニジニウムアルキル）ウラシル、５－（ハロ）ウラシル、５－（１，３－ジアゾール－１－アルキル）ウラシル、５－（メトキシ）ウラシル、５－（メトキシカルボニルメチル）－２－（チオ）ウラシル、５－（メトキシカルボニル－メチル）ウラシル、５－（メチル）－２－（チオ）ウラシル、５－（メチル）－２，４－（ジチオ）ウラシル、５－（メチル）－４－（チオ）ウラシル、５－（メチル）－２－（チオ）プソイドウラシル、５－（メチル）－２，４－（ジチオ）プソイドウラシル、５－（メチル）－４－（チオ）プソイドウラシル、５－（メチル）プソイドウラシル、５－（メチルアミノメチル）－２－（チオ）ウラシル、５－（メチルアミノメチル）－２，４－（ジチオ）ウラシル、５－（メチルアミノメチル）－４－（チオ）ウラシル、５－（プロピニル）ウラシル、５－（トリフルオロメチル）ウラシル、５－アミノアリル－ウリジン、５－ブロモ－ウリジン、５－ヨード－ウリジン、５－ウラシル、６－（アゾ）ウラシル、６－（アゾ）ウラシル、６－アザ－ウリジン、アリルアミノ－ウラシル、アザウラシル、デアザウラシル、Ｎ３－（メチル）ウラシル、プソイド－ＵＴＰ－１－２－エタン酸、プソイドウラシル、４－チオ－プソイド－ＵＴＰ、１－カルボキシメチル－プソイドウリジン、１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、１－プロピニル－ウリジン、１－タウリノメチル－１－メチル－ウリジン、１－タウリノメチル－４－チオ－ウリジン、１－タウリノメチル－プソイドウリジン、２－メトキシ－４－チオ－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロプソイドウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－プソイドウリジン、４－メトキシ－２－チオ－プソイドウリジン、４－メトキシ－プソイドウリジン、４－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、４－チオ－プソイドウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、（±）１－（２－ヒドロキシプロピル）プソイドウリジンＴＰ、（２Ｒ）－１－（２－ヒドロキシプロピル）プソイドウリジンＴＰ、（２Ｓ）－１－（２－ヒドロキシプロピル）プソイドウリジンＴＰ、（Ｅ）－５－（２－ブロモ－ビニル）アラ－ウリジンＴＰ、（Ｅ）－５－（２－ブロモ－ビニル）ウリジンＴＰ、（Ｚ）－５－（２－ブロモ－ビニル）アラ－ウリジンＴＰ、（Ｚ）－５－（２－ブロモ－ビニル）ウリジンＴＰ、１－（２，２，２－トリフルオロエチル）－プソイド－ＵＴＰ、１－（２，２，３，３，３－ペンタフルオロプロピル）プソイドウリジンＴＰ、１－（２，２－ジエトキシエチル）プソイドウリジンＴＰ、１－（２，４，６－トリメチルベンジル）プソイドウリジンＴＰ、１－（２，４，６－トリメチル－ベンジル）プソイド－ＵＴＰ、１－（２，４，６－トリメチル－フェニル）プソイド－ＵＴＰ、１－（２－アミノ－２－カルボキシエチル）プソイド－ＵＴＰ、１－（２－アミノ－エチル）プソイド－ＵＴＰ、１－（２－ヒドロキシエチル）プソイドウリジンＴＰ、１－（２－メトキシエチル）プソイドウリジンＴＰ、１－（３，４－ビス－トリフルオロメトキシベンジル）プソイドウリジンＴＰ、１－（３，４－ジメトキシベンジル）プソイドウリジンＴＰ、１－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）プソイド－ＵＴＰ、１－（３－アミノ－プロピル）プソイド－ＵＴＰ、１－（３－シクロプロピル－プロパ－２－イニル）プソイドウリジンＴＰ、１－（４－アミノ－４－カルボキシブチル）プソイド－ＵＴＰ、１－（４－アミノ－ベンジル）プソイド－ＵＴＰ、１－（４－アミノ－ブチル）プソイド－ＵＴＰ、１－（４－アミノ－フェニル）プソイド－ＵＴＰ、１－（４－アジドベンジル）プソイドウリジンＴＰ、１－（４－ブロモベンジル）プソイドウリジンＴＰ、１－（４－クロロベンジル）プソイドウリジンＴＰ、１－（４－フルオロベンジル）プソイドウリジンＴＰ、１－（４－ヨードベンジル）プソイドウリジンＴＰ、１－（４－メタンスルホニルベンジル）プソイドウリジンＴＰ、１－（４－メトキシベンジル）プソイドウリジンＴＰ、１－（４－メトキシ－ベンジル）プソイド－ＵＴＰ、１－（４－メトキシ－フェニル）プソイド－ＵＴＰ、１－（４－メチルベンジル）プソイドウリジンＴＰ、１－（４－メチル－ベンジル）プソイド－ＵＴＰ、１－（４－ニトロベンジル）プソイドウリジンＴＰ、１－（４－ニトロ－ベンジル）プソイド－ＵＴＰ、１－（４－ニトロ－フェニル）プソイド－ＵＴＰ、１－（４－チオメトキシベンジル）プソイドウリジンＴＰ、１－（４－トリフルオロメトキシベンジル）プソイドウリジンＴＰ、１－（４－トリフルオロメチルベンジル）プソイドウリジンＴＰ、１－（５－アミノ－ペンチル）プソイド－ＵＴＰ、１－（６－アミノ－ヘキシル）プソイド－ＵＴＰ、１，６－ジメチル－プソイド－ＵＴＰ、１－［３－（２－｛２－［２－（２－アミノエトキシ）－エトキシ］－エトキシ｝－エトキシ）－プロピオニル］プソイドウリジンＴＰ、１－｛３－［２－（２－アミノエトキシ）－エトキシ］－プロピオニル｝プソイドウリジンＴＰ、１－アセチルプソイドウリジンＴＰ、１－アルキル－６－（１－プロピニル）－プソイド－ＵＴＰ、１－アルキル－６－（２－プロピニル）－プソイド－ＵＴＰ、１－アルキル－６－アリル－プソイド－ＵＴＰ、１－アルキル－６－エチニル－プソイド－ＵＴＰ、１－アルキル－６－ホモアリル－プソイド－ＵＴＰ、１－アルキル－６－ビニル－プソイド－ＵＴＰ、１－アリルプソ
イドウリジンＴＰ、１－アミノメチル－プソイド－ＵＴＰ、１－ベンゾイルプソイドウリジンＴＰ、１－ベンジルオキシメチルプソイドウリジンＴＰ、１－ベンジル－プソイド－ＵＴＰ、１－ビオチニル－ＰＥＧ２－プソイドウリジンＴＰ、１－ビオチニルプソイドウリジンＴＰ、１－ブチル－プソイド－ＵＴＰ、１－シアノメチルプソイドウリジンＴＰ、１－シクロブチルメチル－プソイド－ＵＴＰ、１－シクロブチル－プソイド－ＵＴＰ、１－シクロへプチルメチル－プソイド－ＵＴＰ、１－シクロへプチル－プソイド－ＵＴＰ、１－シクロヘキシルメチル－プソイド－ＵＴＰ、１－シクロヘキシル－プソイド－ＵＴＰ、１－シクロオクチルメチル－プソイド－ＵＴＰ、１－シクロオクチル－プソイド－ＵＴＰ、１－シクロペンチルメチル－プソイド－ＵＴＰ、１－シクロペンチル－プソイド－ＵＴＰ、１－シクロプロピルメチル－プソイド－ＵＴＰ、１－シクロプロピル－プソイド－ＵＴＰ、１－エチル－プソイド－ＵＴＰ、１－ヘキシル－プソイド－ＵＴＰ、１－ホモアリルプソイドウリジンＴＰ、１－ヒドロキシメチルプソイドウリジンＴＰ、１－イソ－プロピル－プソイド－ＵＴＰ、１－Ｍｅ－２－チオ－プソイド－ＵＴＰ、１－Ｍｅ－４－チオ－プソイド－ＵＴＰ、１－Ｍｅ－アルファ－チオ－プソイド－ＵＴＰ、１－メタンスルホニルメチルプソイドウリジンＴＰ、１－メトキシメチルプソイドウリジンＴＰ、１－メチル－６－（２，２，２－トリフルオロエチル）プソイド－ＵＴＰ、１－メチル－６－（４－モルホリノ）－プソイド－ＵＴＰ、１－メチル－６－（４－チオモルホリノ）－プソイド－ＵＴＰ、１－メチル－６－（置換フェニル）プソイド－ＵＴＰ、１－メチル－６－アミノ－プソイド－ＵＴＰ、１－メチル－６－アジド－プソイド－ＵＴＰ、１－メチル－６－ブロモ－プソイド－ＵＴＰ、１－メチル－６－ブチル－プソイド－ＵＴＰ、１－メチル－６－クロロ－プソイド－ＵＴＰ、１－メチル－６－シアノ－プソイド－ＵＴＰ、１－メチル－６－ジメチルアミノ－プソイド－ＵＴＰ、１－メチル－６－エトキシ－プソイド－ＵＴＰ、１－メチル－６－エチルカルボキシレート－プソイド－ＵＴＰ、１－メチル－６－エチル－プソイド－ＵＴＰ、１－メチル－６－フルオロ－プソイド－ＵＴＰ、１－メチル－６－ホルミル－プソイド－ＵＴＰ、１－メチル－６－ヒドロキシアミノ－プソイド－ＵＴＰ、１－メチル－６－ヒドロキシ－プソイド－ＵＴＰ、１－メチル－６－ヨード－プソイド－ＵＴＰ、１－メチル－６－イソ－プロピル－プソイド－ＵＴＰ、１－メチル－６－メトキシ－プソイド－ＵＴＰ、１－メチル－６－メチルアミノ－プソイド－ＵＴＰ、１－メチル－６－フェニル－プソイド－ＵＴＰ、１－メチル－６－プロピル－プソイド－ＵＴＰ、１－メチル－６－ｔｅｒｔ－ブチル－プソイド－ＵＴＰ、１－メチル－６－トリフルオロメトキシ－プソイド－ＵＴＰ、１－メチル－６－トリフルオロメチル－プソイド－ＵＴＰ、１－モルホリノメチルプソイドウリジンＴＰ、１－ペンチル－プソイド－ＵＴＰ、１－フェニル－プソイド－ＵＴＰ、１－ピバロイルプソイドウリジンＴＰ、１－プロパルギルプソイドウリジンＴＰ、１－プロピル－プソイド－ＵＴＰ、１－プロピニル－プソイドウリジン、１－ｐ－トリル－プソイド－ＵＴＰ、１－ｔｅｒｔ－ブチル－プソイド－ＵＴＰ、１－チオメトキシメチルプソイドウリジンＴＰ、１－チオモルホリノメチルプソイドウリジンＴＰ、１－トリフルオロアセチルプソイドウリジンＴＰ、１－トリフルオロメチル－プソイド－ＵＴＰ、１－ビニルプソイドウリジンＴＰ、２，２’－アンヒドロ－ウリジンＴＰ、２’－ブロモ－デオキシウリジンＴＰ、２’－Ｆ－５－メチル－２’－デオキシ－ＵＴＰ、２’－ＯＭｅ－５－Ｍｅ－ＵＴＰ、２’－ＯＭｅ－プソイド－ＵＴＰ、２’－ａ－エチニルウリジンＴＰ、２’－ａ－トリフルオロメチルウリジンＴＰ、２’－ｂ－エチニルウリジンＴＰ、２’－ｂ－トリフルオロメチルウリジンＴＰ、２’－デオキシ－２’，２’－ジフルオロウリジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ａ－メルカプトウリジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ａ－チオメトキシウリジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ｂ－アミノウリジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ｂ－アジドウリジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ｂ－ブロモウリジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ｂ－クロロウリジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ｂ－フルオロウリジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ｂ－ヨードウリジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ｂ－メルカプトウリジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ｂ－チオメトキシウリジンＴＰ、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、２－メトキシウリジン、２’－Ｏ－メチル－５－（１－プロピニル）ウリジンＴＰ、３－アルキル－プソイド－ＵＴＰ、４’－アジドウリジンＴＰ、４’－カルボサイクリックウリジンＴＰ、４’－エチニルウリジンＴＰ、５－（１－プロピニル）アラ－ウリジンＴＰ、５－（２－フラニル）ウリジンＴＰ、５－シアノウリジンＴＰ、５－ジメチルアミノウリジンＴＰ、５’－ホモ－ウリジンＴＰ、５－ヨード－２’－フルオロ－デオキシウリジンＴＰ、５－フェニルエチニルウリジンＴＰ、５－トリジュウテロメチル－６－ジュウテロウリジンＴＰ、５－トリフルオロメチル－ウリジンＴＰ、５－ビニルアラウリジンＴＰ、６－（２，２，２－トリフルオロエチル）－プソイド－ＵＴＰ、６－（４－モルホリノ）－プソイド－ＵＴＰ、６－（４－チオモルホリノ）－プソイド－ＵＴＰ、６－（置換－フェニル）－プソイド－ＵＴＰ、６－アミノ－プソイド－ＵＴＰ、６－アジド－プソイド－ＵＴＰ、６－ブロモ－プソイド－ＵＴＰ、６－ブチル－プソイド－ＵＴＰ、６－クロロ－プソイド－ＵＴＰ、６－シアノ－プソイド－ＵＴＰ、６－ジメチルアミノ－プソイド－ＵＴＰ、６－エトキシ－プソイド－ＵＴＰ、６－エチルカルボキシレート－プソイド－ＵＴＰ、６－エチル－プソイド－ＵＴＰ、６－フルオロ－プソイド－ＵＴＰ、６－ホルミル－プソイド－ＵＴＰ、６－ヒドロキシアミノ－プソイド－ＵＴＰ、６－ヒドロキシ－プソイド－ＵＴＰ、６－ヨード－プソイド－ＵＴＰ、６－イソ－プロピル－プソイド－ＵＴＰ、６－メトキシ－プソイド－ＵＴＰ、６－メチルアミノ－プソイド－ＵＴＰ、６－メチル－プソイド－ＵＴＰ、６－フェニル－プソイド－ＵＴＰ、６－フェニル－プソイド－ＵＴＰ、６－プロピル－プソイド－ＵＴＰ、６－ｔｅｒｔ－ブチル－プソイド－ＵＴＰ、６－トリフルオロメトキシ－プソイド－ＵＴＰ、６－トリフルオロメチル－プソイド－ＵＴＰ、アルファ－チオ－プソイド－ＵＴＰ、プソイドウリジン－１－（４－メチルベンゼンスルホン酸）ＴＰ、プソイドウリジン－１－（４－メチル安息香酸）ＴＰ、プソイドウリジンＴＰ－１－［３－（２－エトキシ）］プロピオン酸、プソイドウリジンＴＰ－１－［３－｛２－（２－［２－（２－エトキシ）－エトキシ］－エトキシ）－エトキシ｝］プロピオン酸、プソイドウリジンＴＰ－１－［３－｛２－（２－［２－｛２－（２－エトキシ）－エトキシ｝－エトキシ］－エトキシ）－エトキシ｝］プロピオン酸、プソイドウリジンＴＰ－１－［３－｛２－（２－［２－エトキシ］－エトキシ）－エトキシ｝］プロピオン酸、プソイドウリジンＴＰ－１－［３－｛２－（２－エトキシ）－エトキシ｝］プロピオン酸、プソイドウリジンＴＰ－１－メチルホスホン酸、プソイドウリジンＴＰ－１－メチルホスホン酸ジエチルエステル、プソイド－ＵＴＰ－Ｎ１－３－プロピオン酸、プソイド－ＵＴＰ－Ｎ１－４－ブタン酸、プソイド－ＵＴＰ－Ｎ１－５－ペンタン酸、プソイド－ＵＴＰ－Ｎ１－６－ヘキサン酸、プソイド－ＵＴＰ－Ｎ１－７－ヘプタン酸、プソイド－ＵＴＰ－Ｎ１－メチル－ｐ－安息香酸、プソイド－ＵＴＰ－Ｎ１－ｐ－安息香酸、ワイブトシン、ヒドロキシワイブトシン、イソワイオシン、ペルオキシワイブトシン、不完全修飾型（ｕｎｄｅｒｍｏｄｉｆｉｅｄ）ヒドロキシワイブトシン、４－デメチルワイオシン、２，６－（ジアミノ）プリン、１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェノキサジン－１－イル、１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェノチアジン－１－イル、１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェノキサジン－１－イル、１，３，５－（トリアザ）－２，６－（ジオキサ）－ナフタレン、２－（アミノ）プリン、２，４，５－（トリメチル）フェニル、２’－メチル，２’－アミノ，２’－アジド，２’－フルオロ－シチジン、２’－メチル，２’－アミノ，２’－アジド，２’－フルオロ－アデニン、２’－メチル，２’－アミノ，２’－アジド，２’－フルオロ－ウリジン、２’－アミノ－２’－デオキシリボース、２－アミノ－６－クロロ－プリン、２－アザ－イノシニル、２’－アジド－２’－デオキシリボース、２’－フルオロ－２’－デオキシリボース、２’－フルオロ－修飾塩基、２’－Ｏ－メチル－リボース、２－オキソ－７－アミノピリドピリミジン－３－イル、２－オキソ－ピリドピリミジン－３－イル、２－ピリジノン、３－ニトロピロール、３－（メチル）－７－（プロピニル）イソカルボスチリリル、３－（メチル）イソカルボスチリリル、４－（フルオロ）－６－（メチル）ベンゾイミダゾール、４－（メチル）ベンゾイミダゾール、４－（メチル）インドリル、４，６－（ジメチル）インドリル、５－ニトロインドール、５置換ピリミジン、５－（メチル）イソカルボスチリリル、５－ニトロインドール、６－（アザ）ピリミジン、６－（アゾ）チミン、６－（メチル）－７－（アザ）インドリル、６－クロロ－プリン、６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル、７－（アミノアルキルヒドロキシ）－１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェノチアジン－１－イル、７－（アミノアルキルヒドロキシ）－１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェノキサジン－１－イル、７－（アミノアルキルヒドロキシ）－１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェノキサジン－１－イル、７－（アミノアルキルヒドロキシ）－１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェノチアジン－１－イル、７－（アミノアルキルヒドロキシ）－１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェノキサジン－１－イル、７－（アザ）インドリル、７－（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）－１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェノキサジン－１－イル、７－（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）－１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェノチアジン－１－イル、７－（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）－１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェノキサジン－１－イル、７－（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）－１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェノキサジン－１－イル、７－（グアニジニウムアルキル－ヒドロキシ）－１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェノチアジン－１－イル、７－（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）－１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェノキサジン－１－イル、７－（プロピニル）イソカルボスチリリル、７－（プロピニル）イソカルボスチリリル、プロピニル－７－（アザ）インドリル、７－デアザ－イノシニル、７－置換１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェノキサジン－１－イル、７－置換１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェノキサジン－１－イル、９－（メチル）－イミジゾピリジニル、アミノインドリル、アントラセニル、ビス－オルト－（アミノアルキルヒドロキシ）－６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル、ビス－オルト－置換－６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル、ジフルオロトリル、ヒポキサンチン、イミジゾピリジニル、イノシニル、イソカルボスチリリル、イソグアニシン（Ｉｓｏｇｕａｎｉｓｉｎｅ）、Ｎ２－置換プリン、Ｎ６－メチル－２－アミノ－プリン、Ｎ６－置換プリン、Ｎ－アルキル化誘導体、ナフタレニル、ニトロベンゾイミダゾリル、ニトロイミダゾリル、ニトロインダゾリル、ニトロピラゾリル、ヌブラリン（Ｎｕｂｕｌａｒｉｎｅ）、Ｏ６－置換プリン、Ｏ－アルキル化誘導体、オルト－（アミノアルキルヒドロキシ）－６－フェニル－
ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル、オルト－置換－６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル、オキソホルミシンＴＰ、パラ－（アミノアルキルヒドロキシ）－６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル、パラ－置換－６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル、ペンタセニル、フェナントラセニル、フェニル、プロピニル－７－（アザ）インドリル、ピレニル、ピリドピリミジン－３－イル、ピリドピリミジン－３－イル、２－オキソ－７－アミノ－ピリドピリミジン－３－イル、ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル、ピロロピリミジニル、ピロロピリジニル、スチルベンジル、置換１，２，４－トリアゾール、テトラセニル、ツベルシジン、キサンチン、キサントシン－５’－ＴＰ、２－チオ－ゼブラリン、５－アザ－２－チオ－ゼブラリン、７－デアザ－２－アミノ－プリン、ピリジン－４－オンリボヌクレオシド、２－アミノ－リボシド－ＴＰ、ホルミシンＡＴＰ、ホルミシンＢ ＴＰ、ピロロシンＴＰ、２’－ＯＨ－アラ－アデノシンＴＰ、２’－ＯＨ－アラ－シチジンＴＰ、２’－ＯＨ－アラ－ウリジンＴＰ、２’－ＯＨ－アラ－グアノシンＴＰ、５－（２－カルボメトキシビニル）ウリジンＴＰ、及びＮ６－（１９－アミノ－ペンタオキサノナデシル）アデノシンＴＰ。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、前述の修飾核酸塩基のうちの少なくとも２つ（例えば、２つ、３つ、４つまたはそれ以上）の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）中の修飾核酸塩基は、プソイドウリジン（Ψ）、Ｎ１－メチルプソイドウリジン（ｍ１Ψ）、Ｎ１－エチルプソイドウリジン、２－チオウリジン、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロプソイドウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－プソイドウリジン、４－メトキシ－２－チオ－プソイドウリジン、４－メトキシ－プソイドウリジン、４－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、４－チオ－プソイドウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、５－メチルウリジン）、５－メトキシウリジン及び２’－Ｏ－メチルウリジンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、前述の修飾核酸塩基のうちの少なくとも２つ（例えば、２つ、３つ、４つまたはそれ以上）の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）中の修飾核酸塩基は、１－メチル－プソイドウリジン（ｍ１Ψ）、５－メトキシ－ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）、プソイドウリジン（Ψ）、α－チオ－グアノシン及びα－チオ－アデノシンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、前述の修飾核酸塩基のうちの少なくとも２つ（例えば、２つ、３つ、４つまたはそれ以上）の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、プソイドウリジン（Ψ）及び５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、１－メチル－プソイドウリジン（ｍ１Ψ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、１－メチル－プソイドウリジン（ｍ１Ψ）及び５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、２－チオウリジン及び５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、メトキシ－ウリジン（ｍｏ５Ｕ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、５－メトキシ－ウリジン（ｍｏ５Ｕ）及び５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、２’－Ｏ－メチルウリジンを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、２’－Ｏ－メチルウリジン及び５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、Ｎ６－メチル－アデノシン（ｍ６Ａ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、Ｎ６－メチル－アデノシン（ｍ６Ａ）及び５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、特定の修飾について均一に修飾される（例えば、完全に修飾される、全配列を通して修飾される）。例えば、ポリヌクレオチドは、５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）で均一に修飾され得る。つまり、当該ｍＲＮＡ配列のすべてのシトシン残基が５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）で置き換えられる。同様に、ポリヌクレオチドは、上記のもの等の修飾残基で置き換えることにより、当該配列に存在する任意のタイプのヌクレオシド残基に関して均一に修飾され得る。
修飾シトシンを有する例示的な核酸塩基及びヌクレオシドとしては、Ｎ４－アセチル－シチジン（ａｃ４Ｃ）、５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）、５－ハロ－シチジン（例えば、５－ヨード－シチジン）、５－ヒドロキシメチル－シチジン（ｈｍ５Ｃ）、１－メチル－プソイドイソシチジン、２－チオ－シチジン（ｓ２Ｃ）、及び２－チオ－５－メチル－シチジンが挙げられる。
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾ウリジンである。修飾ウリジンを有する例示的な核酸塩基及びヌクレオシドとしては、５－シアノウリジン、及び４’－チオウリジンが挙げられる。
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾アデニンである。修飾アデニンを有する例示的な核酸塩基及びヌクレオシドとしては、７－デアザ－アデニン、１－メチル－アデノシン（ｍ１Ａ）、２－メチル－アデニン（ｍ２Ａ）、及びＮ６－メチル－アデノシン（ｍ６Ａ）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾グアニンである。修飾グアニンを有する例示的な核酸塩基及びヌクレオシドとしては、イノシン（Ｉ）、１－メチル－イノシン（ｍ１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、７－デアザ－グアノシン、７－シアノ－７－デアザ－グアノシン（ｐｒｅＱ０）、７－アミノメチル－７－デアザ－グアノシン（ｐｒｅＱ１）、７－メチル－グアノシン（ｍ７Ｇ）、１－メチル－グアノシン（ｍ１Ｇ）、８－オキソ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシンが挙げられる。
本開示のポリヌクレオチドは、分子の全長に沿って部分的または完全に修飾され得る。例えば、本開示のポリヌクレオチド内、またはその所定の配列領域内（例えば、ポリＡテールを含むまたは除くｍＲＮＡ内）で、１つ以上もしくはすべてまたは所与のタイプのヌクレオチド（例えば、プリンもしくはピリミジン、またはＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのいずれか１つ以上もしくはすべて）が均一に修飾されてもよい。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（またはその所与の配列領域）内のすべてのヌクレオチドＸが、修飾ヌクレオチドであり、Ｘは、ヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのいずれか１つの場合もあれば、以下の組み合わせＡ＋Ｇ、Ａ＋Ｕ、Ａ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ、Ｇ＋Ｃ、Ｕ＋Ｃ、Ａ＋Ｇ＋Ｕ、Ａ＋Ｇ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ＋Ｃ、またはＡ＋Ｇ＋Ｃのいずれか１つの場合もある。
該ポリヌクレオチドは、約１％～約１００％修飾されたヌクレオチド（総ヌクレオチド含量に関して、もしくはヌクレオチドのタイプの１つ以上に関して、すなわち、Ａ、Ｇ、Ｕ、もしくはＣのいずれか１つ以上に関して）、またはその間の任意のパーセンテージ（例えば、１％～２０％、１％～２５％、１％～５０％、１％～６０％、１％～７０％、１％～８０％、１％～９０％、１％～９５％、１０％～２０％、１０％～２５％、１０％～５０％、１０％～６０％、１０％～７０％、１０％～８０％、１０％～９０％、１０％～９５％、１０％～１００％、２０％～２５％、２０％～５０％、２０％～６０％、２０％～７０％、２０％～８０％、２０％～９０％、２０％～９５％、２０％～１００％、５０％～６０％、５０％～７０％、５０％～８０％、５０％～９０％、５０％～９５％、５０％～１００％、７０％～８０％、７０％～９０％、７０％～９５％、７０％～１００％、８０％～９０％、８０％～９５％、８０％～１００％、９０％～９５％、９０％～１００％、及び９５％～１００％）を含み得る。残存パーセンテージは、未修飾Ａ、Ｇ、Ｕ、またはＣの存在によって説明されることが理解されよう。
該ポリヌクレオチドは、最低１％及び最大１００％の修飾ヌクレオチド、またはその間の任意のパーセンテージ、例えば、少なくとも５％の修飾ヌクレオチド、少なくとも１０％の修飾ヌクレオチド、少なくとも２５％の修飾ヌクレオチド、少なくとも５０％の修飾ヌクレオチド、少なくとも８０％の修飾ヌクレオチド、もしくは少なくとも９０％の修飾ヌクレオチドを含み得る。例えば、該ポリヌクレオチドは、修飾ピリミジン、例えば、修飾ウラシルまたはシトシンを含み得る。いくつかの実施形態では、当該ポリヌクレオチドのウラシルの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％が、修飾ウラシル（例えば、５－置換ウラシル）で置き換えられる。該修飾ウラシルは、単一の独自構造を有する化合物で置き換えられる場合もあれば、異なる構造を有する複数の化合物（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の独自の構造）で置き換えられる場合もある。いくつかの実施形態では、当該ポリヌクレオチドのシトシンの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％が、修飾シトシン（例えば、５－置換シトシン）で置き換えられる。該修飾シトシンは、単一の独自構造を有する化合物で置き換えられる場合もあれば、異なる構造を有する複数の化合物（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の独自の構造）で置き換えられる場合もある。
したがって、いくつかの実施形態では、該ＲＮＡ治療は、５’ＵＴＲ要素、任意にコドン最適化オープンリーディングフレーム、及び３’ＵＴＲ要素、ポリ（Ａ）配列及び／またはポリアデニル化シグナルを含み、該ＲＮＡは、化学修飾されない。
いくつかの実施形態では、該修飾核酸塩基は、修飾ウラシルである。修飾ウラシルを有する例示的な核酸塩基及びヌクレオシドとしては、プソイドウリジン（Ψ）、ピリジン－４－オンリボヌクレオシド、５－アザ－ウリジン、６－アザ－ウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ウリジン（ｓ２Ｕ）、４－チオ－ウリジン（ｓ４Ｕ）、４－チオ－プソイドウリジン、２－チオ－プソイドウリジン、５－ヒドロキシ－ウリジン（ｈｏ５Ｕ）、５－アミノアリル－ウリジン、５－ハロ－ウリジン（例えば、５－ヨード－ウリジンまたは５－ブロモ－ウリジン）、３－メチル－ウリジン（ｍ３Ｕ）、５－メトキシ－ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、ウリジン５－オキシ酢酸（ｃｍｏ５Ｕ）、ウリジン５－オキシ酢酸メチルエステル（ｍｃｍｏ５Ｕ）、５－カルボキシメチル－ウリジン（ｃｍ５Ｕ）、１－カルボキシメチル－プソイドウリジン、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウリジン（ｃｈｍ５Ｕ）、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウリジンメチルエステル（ｍｃｈｍ５Ｕ）、５－メトキシカルボニルメチル－ウリジン（ｍｃｍ５Ｕ）、５－メトキシカルボニルメチル－２－チオ－ウリジン（ｍｃｍ５ｓ２Ｕ）、５－アミノメチル－２－チオ－ウリジン（ｎｍ５ｓ２Ｕ）、５－メチルアミノメチル－ウリジン（ｍｎｍ５Ｕ）、５－メチルアミノメチル－２－チオ－ウリジン（ｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５－メチルアミノメチル－２－セレノ－ウリジン（ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ）、５－カルバモイルメチル－ウリジン（ｎｃｍ５Ｕ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオ－ウリジン（ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５－プロピニル－ウリジン、１－プロピニル－プソイドウリジン、５－タウリノメチル－ウリジン（τｍ５Ｕ）、１－タウリノメチル－プソイドウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ－ウリジン（τｍ５ｓ２Ｕ）、１－タウリノメチル－４－チオ－プソイドウリジン、５－メチル－ウリジン（ｍ５Ｕ、すなわち、核酸塩基デオキシチミンを有する）、１－メチル－プソイドウリジン（ｍ１Ψ）、５－メチル－２－チオ－ウリジン（ｍ５ｓ２Ｕ）、１－メチル－４－チオ－プソイドウリジン（ｍ１ｓ４Ψ）、４－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、３－メチル－プソイドウリジン（ｍ３Ψ）、２－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、ジヒドロウリジン（Ｄ）、ジヒドロプソイドウリジン、５，６－ジヒドロウリジン、５－メチル－ジヒドロウリジン（ｍ５Ｄ）、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロプソイドウリジン、２－メトキシ－ウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－プソイドウリジン、４－メトキシ－２－チオ－プソイドウリジン、Ｎ１－メチル－プソイドウリジン、Ｎ１－エチルプソイドウリジン、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウリジン（ａｃｐ３Ｕ）、１－メチル－３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）プソイドウリジン（ａｃｐ３Ψ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン（ｉｎｍ５Ｕ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）－２－チオ－ウリジン（ｉｎｍ５ｓ２Ｕ）、α－チオ－ウリジン、２’－Ｏ－メチル－ウリジン（Ｕｍ）、５，２’－Ｏ－ジメチル－ウリジン（ｍ５Ｕｍ）、２’－Ｏ－メチル－プソイドウリジン（Ψｍ）、２－チオ－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｓ２Ｕｍ）、５－メトキシカルボニルメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｍｃｍ５Ｕｍ）、５－カルバモイルメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｎｃｍ５Ｕｍ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕｍ）、３，２’－Ｏ－ジメチル－ウリジン（ｍ３Ｕｍ）、及び５－（イソペンテニルアミノメチル）－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｉｎｍ５Ｕｍ）、１－チオ－ウリジン、デオキシチミジン、２’－Ｆ－アラ－ウリジン、２’－Ｆ－ウリジン、２’－ＯＨ－アラ－ウリジン、５－（２－カルボメトキシビニル）ウリジン、及び５－［３－（１－Ｅ－プロペニルアミノ）］ウリジンが挙げられる。
いくつかの実施形態では、該修飾核酸塩基は、修飾シトシンである。修飾シトシンを有する例示的な核酸塩基及びヌクレオシドとしては、５－アザ－シチジン、６－アザ－シチジン、プソイドイソシチジン、３－メチル－シチジン（ｍ３Ｃ）、Ｎ４－アセチル－シチジン（ａｃ４Ｃ）、５－ホルミル－シチジン（ｆ５Ｃ）、Ｎ４－メチル－シチジン（ｍ４Ｃ）、５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）、５－ハロ－シチジン（例えば、５－ヨード－シチジン）、５－ヒドロキシメチル－シチジン（ｈｍ５Ｃ）、１－メチル－プソイドイソシチジン、ピロロ－シチジン、ピロロ－プソイドイソシチジン、２－チオ－シチジン（ｓ２Ｃ）、２－チオ－５－メチル－シチジン、４－チオ－プソイドイソシチジン、４－チオ－１－メチル－プソイドイソシチジン、４－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドイソシチジン、１－メチル－１－デアザ－プソイドイソシチジン、ゼブラリン、５－アザ－ゼブラリン、５－メチル－ゼブラリン、５－アザ－２－チオ－ゼブラリン、２－チオ－ゼブラリン、２－メトキシ－シチジン、２－メトキシ－５－メチル－シチジン、４－メトキシ－プソイドイソシチジン、４－メトキシ－１－メチル－プソイドイソシチジン、リシジン（ｋ２Ｃ）、α－チオ－シチジン、２’－Ｏ－メチル－シチジン（Ｃｍ）、５，２’－Ｏ－ジメチル－シチジン（ｍ５Ｃｍ）、Ｎ４－アセチル－２’－Ｏ－メチル－シチジン（ａｃ４Ｃｍ）、Ｎ４，２’－Ｏ－ジメチル－シチジン（ｍ４Ｃｍ）、５－ホルミル－２’－Ｏ－メチル－シチジン（ｆ５Ｃｍ）、Ｎ４，Ｎ４，２’－Ｏ－トリメチル－シチジン（ｍ４２Ｃｍ）、１－チオ－シチジン、２’－Ｆ－アラ－シチジン、２’－Ｆ－シチジン、及び２’－ＯＨ－アラ－シチジンが挙げられる。
いくつかの実施形態では、該修飾核酸塩基は、修飾アデニンである。修飾アデニンを有する例示的な核酸塩基及びヌクレオシドとしては、２－アミノ－プリン、２，６－ジアミノプリン、２－アミノ－６－ハロ－プリン（例えば、２－アミノ－６－クロロ－プリン）、６－ハロ－プリン（例えば、６－クロロ－プリン）、２－アミノ－６－メチル－プリン、８－アジド－アデノシン、７－デアザ－アデニン、７－デアザ－８－アザ－アデニン、７－デアザ－２－アミノ－プリン、７－デアザ－８－アザ－２－アミノ－プリン、７－デアザ－２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２，６－ジアミノプリン、１－メチル－アデノシン（ｍ１Ａ）、２－メチル－アデニン（ｍ２Ａ）、Ｎ６－メチル－アデノシン（ｍ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－メチル－アデノシン（ｍｓ２ｍ６Ａ）、Ｎ６－イソペンテニル－アデノシン（ｉ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニル－アデノシン（ｍｓ２ｉ６Ａ）、Ｎ６－（ｃｉｓ－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン（ｉｏ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－（ｃｉｓ－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン（ｍｓ２ｉｏ６Ａ）、Ｎ６－グリシニルカルバモイル－アデノシン（ｇ６Ａ）、Ｎ６－スレオニルカルバモイル－アデノシン（ｔ６Ａ）、Ｎ６－メチル－Ｎ６－スレオニルカルバモイル－アデノシン（ｍ６ｔ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－スレオニルカルバモイル－アデノシン（ｍｓ２ｇ６Ａ）、Ｎ６，Ｎ６－ジメチル－アデノシン（ｍ６２Ａ）、Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイル－アデノシン（ｈｎ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイル－アデノシン（ｍｓ２ｈｎ６Ａ）、Ｎ６－アセチル－アデノシン（ａｃ６Ａ）、７－メチル－アデニン、２－メチルチオ－アデニン、２－メトキシ－アデニン、α－チオ－アデノシン、２’－Ｏ－メチル－アデノシン（Ａｍ）、Ｎ６，２’－Ｏ－ジメチル－アデノシン（ｍ６Ａｍ）、Ｎ６，Ｎ６，２’－Ｏ－トリメチル－アデノシン（ｍ６２Ａｍ）、１，２’－Ｏ－ジメチル－アデノシン（ｍ１Ａｍ）、２’－Ｏ－リボシルアデノシン（リン酸）（Ａｒ（ｐ））、２－アミノ－Ｎ６－メチル－プリン、１－チオ－アデノシン、８－アジド－アデノシン、２’－Ｆ－アラ－アデノシン、２’－Ｆ－アデノシン、２’－ＯＨ－アラ－アデノシン、及びＮ６－（１９－アミノ－ペンタオキサノナデシル）－アデノシンが挙げられる。
いくつかの実施形態では、該修飾核酸塩基は、修飾グアニンである。修飾グアニンを有する例示的な核酸塩基及びヌクレオシドとしては、イノシン（Ｉ）、１－メチル－イノシン（ｍ１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、４－デメチル－ワイオシン（ｉｍＧ－１４）、イソワイオシン（ｉｍＧ２）、ウィブトシン（ｙＷ）、ペルオキシウィブトシン（ｏ２ｙＷ）、ヒドロキシウィブトシン（ＯｈｙＷ）、低修飾（ｕｎｄｅｒｍｏｄｉｆｉｅｄ）ヒドロキシウィブトシン（ＯｈｙＷ＊）、７－デアザ－グアノシン、キューオシン（Ｑ）、エポキシキューオシン（ｏＱ）、ガラクトシル－キューオシン（ｇａｌＱ）、マンノシル－キューオシン（ｍａｎＱ）、７－シアノ－７－デアザ－グアノシン（ｐｒｅＱ０）、７－アミノメチル－７－デアザ－グアノシン（ｐｒｅＱ１）、アルカエオシン（Ｇ＋）、７－デアザ－８－アザ－グアノシン、６－チオ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－８－アザ－グアノシン、７－メチル－グアノシン（ｍ７Ｇ）、６－チオ－７－メチル－グアノシン、７－メチル－イノシン、６－メトキシ－グアノシン、１－メチル－グアノシン（ｍ１Ｇ）、Ｎ２－メチル－グアノシン（ｍ２Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２－ジメチル－グアノシン（ｍ２２Ｇ）、Ｎ２，７－ジメチル－グアノシン（ｍ２，７Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２，７－ジメチル－グアノシン（ｍ２，２，７Ｇ）、８－オキソ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシン、１－メチル－６－チオ－グアノシン、Ｎ２－メチル－６－チオ－グアノシン、Ｎ２，Ｎ２－ジメチル－６－チオ－グアノシン、α－チオ－グアノシン、２’－Ｏ－メチル－グアノシン（Ｇｍ）、Ｎ２－メチル－２’－Ｏ－メチル－グアノシン（ｍ２Ｇｍ）、Ｎ２，Ｎ２－ジメチル－２’－Ｏ－メチル－グアノシン（ｍ２２Ｇｍ）、１－メチル－２’－Ｏ－メチル－グアノシン（ｍ１Ｇｍ）、Ｎ２，７－ジメチル－２’－Ｏ－メチル－グアノシン（ｍ２，７Ｇｍ）、２’－Ｏ－メチル－イノシン（Ｉｍ）、１，２’－Ｏ－ジメチル－イノシン（ｍ１Ｉｍ）、２’－Ｏ－リボシルグアノシン（リン酸）（Ｇｒ（ｐ））、１－チオ－グアノシン、Ｏ６－メチル－グアノシン、２’－Ｆ－アラ－グアノシン、及び２’－Ｆ－グアノシンが挙げられる。
本開示の抗体及びその抗原結合断片は、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡ（例えば、修飾ｍＲＮＡ）を含む。ｍＲＮＡは、例えば、「インビトロ転写鋳型」と呼ばれる鋳型ＤＮＡからインビトロで転写される。いくつかの実施形態では、インビトロ転写鋳型は、５’非翻訳（ＵＴＲ）領域をコードし、オープンリーディングフレームを含み、３’ＵＴＲ及びポリＡテールをコードする。インビトロ転写鋳型の特定の核酸配列組成及び長さは、該鋳型によってコードされるｍＲＮＡに依存する。
配列最適化
いくつかの実施形態では、本開示の抗原をコードするＯＲＦは、コドン最適化される。コドン最適化の方法は、当技術分野で知られている。例えば、本明細書に提供する配列のいずれか１つ以上のＯＲＦがコドン最適化され得る。コドン最適化は、いくつかの実施形態では、標的及び宿主生物におけるコドン頻度を一致させ、適切なフォールディングを確保するため、ＧＣ含量にバイアスをかけてｍＲＮＡの安定性を高め、もしくは二次構造を低減するため、遺伝子構成もしくは発現を損ない得るタンデムリピートコドンもしくは塩基の連続を最小にするため、転写及び翻訳調節領域をカスタマイズするため、タンパク質輸送配列を挿入もしくは除去するため、コードされるタンパク質の翻訳後修飾部位（例えば、グリコシル化部位）を除去／付加するため、タンパク質ドメインを付加、除去、もしくは入れ替えるため、制限酵素認識部位を挿入もしくは削除するため、リボソーム結合部位及びｍＲＮＡ分解部位を修飾するため、翻訳速度を調節し、タンパク質の様々なドメインを正確にフォールドするため、または、該ポリヌクレオチド内の問題のある二次構造を低減もしくは取り除くために使用され得る。コドン最適化ツール、アルゴリズム及びサービスは、当技術分野で知られており、非限定的な例としては、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ ＣＡ）からのサービス、及び／または独自方法が挙げられる。いくつかの実施形態では、該オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列は、最適化アルゴリズムを用いて最適化される。
いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、自然発生または野生型配列ＯＲＦ（例えば、ピコルナウイルスカプシドポリタンパク質及び／またはピコルナウイルス３Ｃプロテアーゼをコードする自然発生または野生型ｍＲＮＡ配列）に対して９５％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、自然発生または野生型配列（例えば、ピコルナウイルスカプシドポリタンパク質及び／またはピコルナウイルス３Ｃプロテアーゼをコードする自然発生または野生型ｍＲＮＡ配列）に対して９０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、自然発生または野生型配列（例えば、ピコルナウイルスカプシドポリタンパク質及び／またはピコルナウイルス３Ｃプロテアーゼをコードする自然発生または野生型ｍＲＮＡ配列）に対して８５％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、自然発生または野生型配列（例えば、ピコルナウイルスカプシドポリタンパク質及び／またはピコルナウイルス３Ｃプロテアーゼをコードする自然発生または野生型ｍＲＮＡ配列）に対して８０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、自然発生または野生型配列（例えば、ピコルナウイルスカプシドポリタンパク質及び／またはピコルナウイルス３Ｃプロテアーゼをコードする自然発生または野生型ｍＲＮＡ配列）に対して７５％未満の配列同一性を共有する。
いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、自然発生または野生型配列（例えば、ピコルナウイルスカプシドポリタンパク質及び／またはピコルナウイルス３Ｃプロテアーゼをコードする自然発生または野生型ｍＲＮＡ配列）に対して６５％～８５％（例えば、約６７％～約８５％または約６７％～約８０％）の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、自然発生または野生型配列（例えば、ピコルナウイルスカプシドポリタンパク質及び／またはピコルナウイルス３Ｃプロテアーゼをコードする自然発生または野生型ｍＲＮＡ配列）に対して６５％～７５％または約８０％の配列同一性を共有する。
いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、非コドン最適化配列によってコードされるピコルナウイルスカプシドポリタンパク質及び／またはピコルナウイルス３Ｃプロテアーゼと免疫原性が同じであるか、またはより免疫原性が高い（例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、または少なくとも２００％以上高い）ピコルナウイルスカプシドポリタンパク質及び／またはピコルナウイルス３Ｃプロテアーゼをコードする。
修飾ｍＲＮＡは、哺乳類宿主細胞にトランスフェクトされた場合、１２～１８時間、または１８時間超、例えば、２４、３６、４８、６０、７２時間、または７２時間超の安定性を有し、該哺乳類宿主細胞による発現が可能である。
いくつかの実施形態では、コドン最適化ＲＮＡとは、Ｇ／Ｃレベルが高められたものでよい。核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ）のＧ／Ｃ含量は、該ＲＮＡの安定性に影響を与え得る。グアニン（Ｇ）及び／またはシトシン（Ｃ）残基の量が増加したＲＮＡは、大量のアデニン（Ａ）及びチミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ）ヌクレオチドを含むＲＮＡより機能的に安定であり得る。例として、ＷＯ０２／０９８４４３は、翻訳領域における配列の修飾によって安定化されたｍＲＮＡを含む医薬組成物を開示している。遺伝暗号の縮退のため、該修飾は、得られるアミノ酸を変更することなくＲＮＡの安定性をさらに高めるものに既存のコドンを置換することによって機能する。該アプローチは、該ＲＮＡのコード領域に限定される。
化学修飾されていないヌクレオチド
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）は、化学的に修飾されておらず、アデノシン、グアノシン、シトシン、及びウリジンからなる標準的なリボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のヌクレオチド及びヌクレオシドは、標準的なヌクレオシド残基、例えば、転写ＲＮＡ内に存在する残基（例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＵ）を含む。いくつかの実施形態では、本開示のヌクレオチド及びヌクレオシドは、標準的なデオキシリボヌクレオシド、例えば、ＤＮＡ内に存在するデオキシリボヌクレオシド（例えば、ｄＡ、ｄＧ、ｄＣ、またはｄＴ）を含む。
化学修飾
本開示の組成物は、いくつかの実施形態では、コロナウイルス抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡを含み、該核酸は、標準的（非修飾）であっても当技術分野で知られているように修飾されてもよいヌクレオチド及び／またはヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のヌクレオチド及びヌクレオシドは、修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシドを含む。かかる修飾ヌクレオチド及びヌクレオシドは、自然発生修飾ヌクレオチド及びヌクレオシドであっても、非自然発生修飾ヌクレオチド及びヌクレオシドであってもよい。かかる修飾は、当技術分野で認識されているヌクレオチド及び／またはヌクレオシドの糖、骨格、または核酸塩基部分での修飾を含み得る。
いくつかの実施形態では、本開示の自然発生修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチドは、当技術分野で一般に知られているまたは認識されているものである。かかる自然発生修飾ヌクレオチド及びヌクレオチドの非限定的な例は、とりわけ、広く認識されているＭＯＤＯＭＩＣＳデータベースに見出すことができる。
いくつかの実施形態では、本開示の非自然発生修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシドは、当技術分野で一般に知られているまたは認識されているものである。かかる非自然発生修飾ヌクレオチド及びヌクレオシドの非限定的な例は、とりわけ、公開された米国出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５８５１９号、第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７５１７７号、第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５８８９７号、第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５８８９１号、第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０７０４１３号、第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／３６７７３号、第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／３６７５９号、第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／３６７７１号、または第ＰＣＴ／ＩＢ２０１７／０５１３６７号（これらのすべてが参照により本明細書に組み込まれる）に見出すことができる。
したがって、本開示の核酸（例えば、ＤＮＡ核酸及びＲＮＡ核酸、例えば、ｍＲＮＡ核酸）は、標準的なヌクレオチド及びヌクレオシド、自然発生ヌクレオチド及びヌクレオシド、非自然発生ヌクレオチド及びヌクレオシド、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。
本開示の核酸（例えば、ＤＮＡ核酸及びＲＮＡ核酸、例えば、ｍＲＮＡ核酸）は、いくつかの実施形態では、様々な（２つ以上の）異なるタイプの標準的な及び／または修飾ヌクレオチド及びヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、核酸の特定の領域は、１つ、２つ、またはそれ以上の（任意に異なる）タイプの標準的及び／または修飾ヌクレオチド及びヌクレオシドを含む。
いくつかの実施形態では、細胞または生物に導入された修飾ＲＮＡ核酸（例えば、修飾ｍＲＮＡ核酸）は、標準的なヌクレオチド及びヌクレオシドを含む非修飾核酸と比較して、それぞれ、細胞または生物において分解の減少を示す。
いくつかの実施形態では、細胞または生物に導入された修飾ＲＮＡ核酸（例えば、修飾ｍＲＮＡ核酸）は、標準的なヌクレオチド及びヌクレオシドを含む非修飾核酸と比較して、それぞれ、細胞または生物における免疫原性の減少（例えば、生得的反応の低下）を示し得る。
いくつかの実施形態では、核酸（例えば、ＲＮＡ核酸、例えば、ｍＲＮＡ核酸）は、核酸の合成の過程でまたは合成後に導入されて、所望の機能または特性を達成する非天然修飾ヌクレオチドを含む。該修飾は、ヌクレオチド間結合、プリンもしくはピリミジン塩基、または糖に存在し得る。該修飾は、化学合成によって導入してもよいし、ポリメラーゼ酵素を用いて鎖の末端もしくは鎖中の任意の場所に導入してもよい。核酸の任意の領域が化学的に修飾され得る。
本開示は、核酸（例えば、ＲＮＡ核酸、例えば、ｍＲＮＡ核酸）の修飾ヌクレオシド及びヌクレオチドを提供する。「ヌクレオシド」とは、糖分子（例えば、ペントースもしくはリボース）またはその誘導体と、有機塩基（例えば、プリンもしくはピリミジン）またはその誘導体（本明細書では「核酸塩基」とも称される）との組み合わせを含む化合物を指す。「ヌクレオチド」とは、リン酸基を含むヌクレオシドを指す。修飾ヌクレオチドは、１つ以上の修飾または非天然ヌクレオシドを含めるため、任意の有用な方法で、例えば、化学的に、酵素的に、または組み換え的に合成され得る。核酸は、連結されたヌクレオシドの領域（複数可）を含み得る。かかる領域は、可変骨格結合を有し得る。該結合は、標準的なホスホジエステル結合であることができ、その場合、該核酸は、ヌクレオチドの領域を含む。
修飾ヌクレオチドの塩基対合は、標準的なアデノシン－チミン、アデノシン－ウラシル、またはグアノシン－シトシン塩基対だけでなく、非標準または修飾塩基を含むヌクレオチド及び／または修飾ヌクレオチド間で形成される塩基対も包含し、ここで、水素結合供与体と水素結合受容体の配置により、非標準塩基と標準塩基間、または２つの相補的非標準塩基構造間の水素結合が、例えば、少なくとも１つの化学修飾を有する核酸において可能になる。かかる非標準的塩基対合の一例は、修飾ヌクレオチドイノシンとアデニン、シトシン、またはウラシルとの間の塩基対合である。塩基／糖またはリンカーの任意の組み合わせを本開示の核酸に組み込んでもよい。
いくつかの実施形態では、核酸（例えば、ＲＮＡ核酸、例えば、ｍＲＮＡ核酸）中の修飾核酸塩基は、１－メチル－プソイドウリジン（ｍ１Ψ）、１－エチル－プソイドウリジン（ｅ１Ψ）、５－メトキシ－ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）、及び／またはプソイドウリジン（Ψ）を含む。いくつかの実施形態では、核酸（例えば、ＲＮＡ核酸、例えば、ｍＲＮＡ核酸）中の修飾核酸塩基は、５－メトキシメチルウリジン、５－メチルチオウリジン、１－メトキシメチルプソイドウリジン、５－メチルシチジン及び／または５－メトキシシチジンを含む。いくつかの実施形態では、該ポリリボヌクレオチドは、前述の任意の修飾核酸塩基（限定されるものではないが、化学修飾を含む）のうちの少なくとも２つ（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、該核酸の１つ以上またはすべてのウリジン位置に１－メチル－プソイドウリジン（ｍ１Ψ）置換を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、該核酸の１つ以上またはすべてのウリジン位置に１－メチル－プソイドウリジン（ｍ１Ψ）置換、及び該核酸の１つ以上またはすべてのシチジン位置に５－メチルシチジン置換を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、該核酸の１つ以上またはすべてのウリジン位置にプソイドウリジン（Ψ）置換を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、該核酸の１つ以上またはすべてのウリジン位置にプソイドウリジン（Ψ）置換、及び該核酸の１つ以上またはすべてのシチジン位置に５－メチルシチジン置換を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、該核酸の１つ以上またはすべてのウリジン位置にウリジンを含む。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、特定の修飾について均一に修飾される（例えば、完全に修飾される、全配列を通して修飾される）。例えば、核酸は、１－メチル－プソイドウリジンで均一に修飾され得る。つまり、当該ｍＲＮＡ配列のすべてのウリジン残基が１－メチル－プソイドウリジンで置き換えられる。同様に、核酸は、上記のもの等の修飾残基で置き換えることにより、当該配列に存在する任意のタイプのヌクレオシド残基に関して均一に修飾され得る。
本開示の核酸は、分子の全長に沿って部分的に修飾される場合もあれば、完全に修飾される場合もある。例えば、本開示の核酸内、またはその所定の配列領域内（例えば、ポリ（Ａ）テールを含むまたは除くｍＲＮＡ内）で、１つ以上もしくはすべてまたは所与のタイプのヌクレオチド（例えば、プリンもしくはピリミジン、またはＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのいずれか１つ以上もしくはすべて）が均一に修飾されてもよい。いくつかの実施形態では、本開示の核酸（またはその配列領域）内のすべてのヌクレオチドＸが、修飾ヌクレオチドであり、Ｘは、ヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのいずれか１つの場合もあれば、以下の組み合わせ、Ａ＋Ｇ、Ａ＋Ｕ、Ａ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ、Ｇ＋Ｃ、Ｕ＋Ｃ、Ａ＋Ｇ＋Ｕ、Ａ＋Ｇ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ＋Ｃ、またはＡ＋Ｇ＋Ｃのいずれか１つの場合もある。
核酸は、約１％～約１００％の修飾ヌクレオチド（総ヌクレオチド含量に関して、もしくはヌクレオチドのタイプの１つ以上に関して、すなわち、Ａ、Ｇ、Ｕ、もしくはＣのいずれか１つ以上に関して）、またはその間の任意のパーセンテージ（例えば、１％～２０％、１％～２５％、１％～５０％、１％～６０％、１％～７０％、１％～８０％、１％～９０％、１％～９５％、１０％～２０％、１０％～２５％、１０％～５０％、１０％～６０％、１０％～７０％、１０％～８０％、１０％～９０％、１０％～９５％、１０％～１００％、２０％～２５％、２０％～５０％、２０％～６０％、２０％～７０％、２０％～８０％、２０％～９０％、２０％～９５％、２０％～１００％、５０％～６０％、５０％～７０％、５０％～８０％、５０％～９０％、５０％～９５％、５０％～１００％、７０％～８０％、７０％～９０％、７０％～９５％、７０％～１００％、８０％～９０％、８０％～９５％、８０％～１００％、９０％～９５％、９０％～１００％、及び９５％～１００％）を含み得る。残存パーセンテージは、未修飾Ａ、Ｇ、Ｕ、またはＣの存在によって説明されることが理解されよう。
該ｍＲＮＡは、最小１％から最大１００％までの修飾ヌクレオチド、またはその間の任意の範囲のパーセンテージ、例えば、少なくとも５％の修飾ヌクレオチド、少なくとも１０％の修飾ヌクレオチド、少なくとも２５％の修飾ヌクレオチド、少なくとも５０％の修飾ヌクレオチド、少なくとも８０％の修飾ヌクレオチド、もしくは少なくとも９０％の修飾ヌクレオチドを含み得る。例えば、該核酸は、修飾ピリミジン、例えば、修飾ウラシルまたはシトシンを含み得る。いくつかの実施形態では、該核酸内のウラシルの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％が、修飾ウラシル（例えば、５－置換ウラシル）で置き換えられる。該修飾ウラシルは、単一の独自構造を有する化合物で置き換えられる場合もあれば、異なる構造を有する複数の化合物（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の独自の構造）で置き換えられる場合もある。いくつかの実施形態では、該核酸内のシトシンの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％が、修飾シトシン（例えば、５－置換シトシン）で置き換えられる。該修飾シトシンは、単一の独自構造を有する化合物で置き換えられる場合もあれば、異なる構造を有する複数の化合物（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の独自の構造）で置き換えられる場合もある。
非翻訳領域（ＵＴＲ）
本開示のｍＲＮＡは、非翻訳領域として作用または機能する１つ以上の領域または部分を含み得る。ｍＲＮＡが少なくとも１つの目的の抗原をコードするように設計されている場合、該核酸は、これらの非翻訳領域（ＵＴＲ）のうちの１つ以上を含み得る。核酸の野生型非翻訳領域は、転写されるが翻訳はされない。ｍＲＮＡにおいて、５’ＵＴＲは、転写開始部位から始まり開始コドンまで続くが、該開始コドンを含まない。一方、３’ＵＴＲは、終止コドンの直後から始まり、転写終結シグナルまで続く。該核酸分子の安定性及び翻訳に関してＵＴＲが果たす調節的な役割について、多くの証拠が相次いでいる。ＵＴＲの調節機能は、特に分子の安定性を高めるために、本開示のポリヌクレオチドに組み込むことができる。また、転写産物が望ましくない器官の部位に誤って向けられた場合に備え、転写産物の下方制御を確実に制御するための特定の機能を組み込むこともできる。様々な５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ配列が当技術分野において知られており、利用可能である。
５’ＵＴＲとは、開始コドン（リボソームによって翻訳されるｍＲＮＡ転写産物の最初のコドン）からすぐ上流（５’）にあるｍＲＮＡの領域である。５’ＵＴＲは、タンパク質をコードしない（非コードである）。天然５’ＵＴＲは、翻訳開始で役割を果たす機能を有する。それらは、リボソームが多くの遺伝子の翻訳を開始するプロセスに関与することが一般に知られるコザック配列のようなシグネチャーを有する。コザック配列は、コンセンサスＣＣＲ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧ（配列番号２７）を有し、ここで、Ｒは、後ろに別の「Ｇ」が続く開始コドン（ＡＵＧ）の３塩基上流のプリン（アデニンまたはグアニン）である。５’ＵＴＲはまた、延長因子の結合に関与する二次構造を形成することでも知られている。
本開示のいくつかの実施形態では、５’ＵＴＲは、異種ＵＴＲであり、すなわち、異なるＯＲＦに関連する自然界で見出されるＵＴＲである。別の実施形態では、５’ＵＴＲは、合成ＵＴＲであり、すなわち、自然界には存在しない。合成ＵＴＲとしては、その特性を改善する、例えば、遺伝子発現を増大するために変異させたＵＴＲ、及び完全に合成のＵＴＲが挙げられる。例示的な５’ＵＴＲとしては、Ｘｅｎｏｐｕｓまたはヒト由来のａ－グロビンまたはｂ－グロビン（８２７８０６３、９０１２２１９）、ヒトシトクロムｂ－２４５ａポリペプチド、及びヒドロキシステロイド（１７ｂ）デヒドロゲナーゼ、ならびにタバコエッチウイルス（ＵＳ８２７８０６３、９０１２２１９）が挙げられる。ＣＭＶ前初期１（ＩＥ１）遺伝子（ＵＳ２０１４０２０６７５３、ＷＯ２０１３／１８５０６９）、配列ＧＧＧＡＵＣＣＵＡＣＣ（配列番号２８）（ＷＯ２０１４１４４１９６）も使用され得る。別の実施形態では、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲは、５’ＴＯＰモチーフ（オリゴピリミジントラクト）が欠如したＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲであり（例えば、ＷＯ／２０１５１０１４１４、ＷＯ２０１５１０１４１５、ＷＯ／２０１５／０６２７３８、ＷＯ２０１５０２４６６７、ＷＯ２０１５０２４６６７、リボソームタンパク質ラージ３２（Ｌ３２）遺伝子に由来する５’ＵＴＲ要素（ＷＯ／２０１５１０１４１４、ＷＯ２０１５１０１４１５、ＷＯ／２０１５／０６２７３８）、ヒドロキシステロイド（１７－β）デヒドロゲナーゼ４遺伝子（ＨＳＤ１７Ｂ４）の５’ＵＴＲに由来する５’ＵＴＲ要素（ＷＯ２０１５０２４６６７）、またはＡＴＰ５Ａ１の５’ＵＴＲに由来する５’ＵＴＲ要素（ＷＯ２０１５０２４６６７）が使用され得る。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲの代わりに配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）が使用される。
いくつかの実施形態では、本開示の５’ＵＴＲは、配列番号２を含む。
３’ＵＴＲは、終止コドン（翻訳終了をシグナル伝達するｍＲＮＡ転写産物のコドン）のすぐ下流（３’）にあるｍＲＮＡの領域である。３’ＵＴＲは、タンパク質をコードしない（非コードである）。天然または野生型の３’ＵＴＲは、アデノシンとウリジンのストレッチが埋め込まれていることが知られている。これらのＡＵリッチシグネチャーは、高い回転率を有する遺伝子内で特に広く見られる。配列の特徴及び機能的特性に基づいて、ＡＵリッチ要素（ＡＲＥ）は３つのクラスに分類することができ（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ，１９９５）、クラスＩのＡＲＥは、Ｕリッチ領域内にＡＵＵＵＡモチーフのいくつかの分散コピーを含む。Ｃ－Ｍｙｃ及びＭｙｏＤは、クラスＩのＡＲＥを含む。クラスＩＩのＡＲＥは２つ以上重複するＵＵＡＵＵＵＡ（Ｕ／Ａ）（Ｕ／Ａ）九量体を保有する。このタイプのＡＲＥを含む分子としては、ＧＭ－ＣＳＦ及びＴＮＦ－ａが挙げられる。クラスＩＩＩのＡＲＥはそれほど十分には定義されていない。これらのＵリッチ領域は、ＡＵＵＵＡモチーフを含まない。ｃ－Ｊｕｎ及びＭｙｏｇｅｎｉｎは、このクラスのなかでも十分に研究された２つの例である。ＡＲＥに結合する大部分のタンパク質は、メッセンジャーを不安定化することが知られているが、ＥＬＡＶファミリーのメンバー、とりわけＨｕＲは、ｍＲＮＡの安定性を増大させることが実証されている。ＨｕＲは、３つすべてのクラスのＡＲＥに結合する。ＨｕＲ特異的結合部位を核酸分子の３’ＵＴＲに組み込むと、ＨｕＲ結合が生じ、これによって、インビボでのメッセージが安定になる。
３’ＵＴＲのＡＵリッチ要素（ＡＲＥ）の導入、除去、または修飾を使用して、本開示の核酸（例えば、ＲＮＡ）の安定性を調節してもよい。特定の核酸を操作する場合、ＡＲＥの１つ以上のコピーを導入して、本開示の核酸の安定性を低下させ、それによって翻訳を抑制し、得られるタンパク質の産生を減少させることができる。同様に、ＡＲＥを同定し、除去または変異させることで細胞内の安定性を高め、結果として得られるタンパク質の翻訳及び産生を高めることができる。トランスフェクション実験は、本開示の核酸を使用して関連する細胞株で行うことができ、タンパク質産生は、トランスフェクション後の様々な時点でアッセイされ得る。例えば、細胞に様々なＡＲＥ操作分子をトランスフェクトし、ＥＬＩＳＡキットを関連タンパク質に使用して、トランスフェクションの６時間後、１２時間後、２４時間後、４８時間後、及び７日後に生成されたタンパク質をアッセイすることができる。
３’ＵＴＲは、異種であっても合成であってもよい。３’ＵＴＲについては、グロビンＵＴＲ（Ｘｅｎｏｐｕｓ β－グロビンＵＴＲ及びヒトβ－グロビンＵＴＲを含む）が当技術分野で知られている（８２７８０６３、９０１２２１９、ＵＳ２０１１００８６９０７）。２つの連続したヒトβグロビン３’ＵＴＲをヘッドトゥーテールでクローニングすることにより、いくつかの細胞型で安定性が増強された修飾βグロビン構築物が開発されており、当技術分野で周知である（ＵＳ２０１２／０１９５９３６、ＷＯ２０１４／０７１９６３）。加えて、ａ２－グロビン、ａ１－グロビン、ＵＴＲ及びこれらの変異体も当技術分野で知られている（ＷＯ２０１５１０１４１５、ＷＯ２０１５０２４６６７）。非特許文献においてｍＲＮＡ構築物で説明されている他の３’ＵＴＲとしては、ＣＹＢＡ（Ｆｅｒｉｚｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５）及びアルブミン（Ｔｈｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，２０１５）が挙げられる。他の例示的な３’ＵＴＲとしては、ウシまたはヒト成長ホルモンのもの（野生型または修飾）（ＷＯ２０１３／１８５０６９、ＵＳ２０１４０２０６７５３、ＷＯ２０１４１５２７７４）が挙げられ、ウサギβグロビン及びＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、α－グロビン３’ＵＴＲ及びウイルスＶＥＥＶ ３’ＵＴＲ配列も当技術分野で知られている。いくつかの実施形態では、配列ＵＵＵＧＡＡＵＵ（ＷＯ２０１４１４４１９６）が使用される。いくつかの実施形態では、ヒト及びマウスリボソームタンパク質の３’ＵＴＲが使用される。他の例としては、ｒｐｓ９ ３’ＵＴＲ（ＷＯ２０１５１０１４１４）、ＦＩＧ４（ＷＯ２０１５１０１４１５）、及びヒトアルブミン７（ＷＯ２０１５１０１４１５）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、本開示の３’ＵＴＲは、配列番号４を含む。
当業者には、異種または合成の５’ＵＴＲが、任意の所望の３’ＵＴＲ配列とともに使用され得ることが理解されよう。例えば、異種５’ＵＴＲを、合成３’ＵＴＲと、異種３”ＵＴＲとともに使用してもよい。
非ＵＴＲ配列もまた、核酸内の領域またはサブ領域として使用してもよい。例えば、イントロンまたはイントロンの一部の配列を本開示の核酸の領域に組み込んでもよい。イントロン配列の組み込みにより、タンパク質産生及び核酸のレベルが増加し得る。
特徴の組み合わせをフランキング領域に含めてもよいし、他の特徴の中に含めてもよい。例えば、該ＯＲＦは、強力なコザック翻訳開始シグナルを含み得る５’ＵＴＲ及び／またはポリＡテールの鋳型化付加のためのオリゴ（ｄＴ）配列を含み得る３’ＵＴＲによって隣接され得る。５’ＵＴＲは、同じ及び／または異なる遺伝子由来の第一のポリヌクレオチド断片及び第二のポリヌクレオチド断片を含み得る（例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１００２９３６２５号及びＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６９１５５に記載の５’ＵＴＲ）。
任意の遺伝子からの任意のＵＴＲを核酸の領域に組み込んでもよいことを理解されたい。さらに、任意の既知の遺伝子の複数の野生型ＵＴＲを利用してもよい。野生型領域のバリアントではない人工ＵＴＲを提供することも本開示の範囲内である。これらのＵＴＲまたはその一部は、それらが選択された転写産物と同じ方向に配置されてもよく、方向または位置を変更されてもよい。したがって、５’または３’ＵＴＲは、反転、短縮、延長されても、１つ以上の他の５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲと組み合わされてもよい。本明細書で使用される、ＵＴＲ配列に関して「変更された」という用語は、該ＵＴＲが参照配列に対して何らかの形で変更されていることを意味する。例えば、３’ＵＴＲまたは５’ＵＴＲは、上記で教示される方向もしくは位置の変化によって、野生型もしくは天然のＵＴＲに対して変更されてもよいし、追加のヌクレオチドの包含、ヌクレオチドの削除、ヌクレオチドの交換または転置によって変更されてもよい。「変更された」ＵＴＲ（３’または５’のいずれか）を産生するこれらの変化はいずれも、バリアントＵＴＲを含む。
いくつかの実施形態では、二重、三重、もしくは四重のＵＴＲ、例えば、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲが使用され得る。本明細書で使用される、「二重」ＵＴＲは、同じＵＴＲの２つのコピーが直列または実質的に直列にコードされるものである。例えば、二重ベータ－グロビンの３’ＵＴＲを、参照によりその内容が全体として本明細書に組み込まれる米国特許公開第２０１００１２９８７７号に記載の通りに使用してもよい。
パターン化されたＵＴＲを有することも本開示の範囲内である。本明細書で使用される、「パターン化されたＵＴＲ」とは、繰り返しまたは交互のパターン、例えば、ＡＢＡＢＡＢもしくはＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢもしくはＡＢＣＡＢＣＡＢＣ、または１回、２回、もしくは３回を超えて繰り返されるそれらのバリアントを反映するＵＴＲである。これらのパターンでは、各文字Ａ、Ｂ、またはＣは、ヌクレオチドレベルで異なるＵＴＲを表す。
いくつかの実施形態では、フランキング領域は、そのタンパク質が共通の機能、構造、特徴、または特性を共有する転写産物のファミリーから選択される。例えば、目的のポリペプチドは、特定の細胞、組織、または発生中のある時点で発現されるタンパク質のファミリーに属している場合がある。任意のこれらの遺伝子由来のＵＴＲを、同じまたは異なるタンパク質のファミリーの任意の他のＵＴＲと交換して、新たなポリヌクレオチドを創出してもよい。本明細書で使用される、「タンパク質のファミリー」は、少なくとも１つの機能、構造、特徴、局在、起源、または発現パターンを共有する２つ以上の目的のポリペプチドの群を指すために最も広い意味で使用される。
該非翻訳領域は、翻訳エンハンサー要素（ＴＥＥ）も含み得る。非限定的な例として、該ＴＥＥは、参照により全体として本明細書に組み込まれる米国出願第２００９０２２６４７０号に記載されているもの、及び当技術分野で知られているものを含み得る。
ＲＮＡのインビトロ転写
本明細書に記載のポリヌクレオチドをコードするｃＤＮＡは、インビトロ転写（ＩＶＴ）システムを用いて転写され得る。ＲＮＡのインビトロ転写は当技術分野で知られており、国際公開第ＷＯ／２０１４／１５２０２７号（参照により全体として本明細書に組み込まれる）に記載されている。いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡは、ＷＯ２０１８／０５３２０９及びＷＯ２０１９／０３６６８２（これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている方法のいずれか１つ以上に従って調製される。
いくつかの実施形態では、該ＲＮＡ転写産物は、該ＲＮＡ転写産物を生成するためのインビトロ転写反応で、増幅されていない直鎖化されたＤＮＡ鋳型を用いて生成される。いくつかの実施形態では、該鋳型ＤＮＡは、単離されたＤＮＡである。いくつかの実施形態では、該鋳型ＤＮＡは、ｃＤＮＡである。いくつかの実施形態では、該ｃＤＮＡは、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、限定されるものではないが、コロナウイルスｍＲＮＡの逆転写によって形成される。いくつかの実施形態では、細胞、例えば、細菌細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、例えば、ＤＨ－１細胞は、該プラスミドＤＮＡ鋳型を用いてトランスフェクトされる。いくつかの実施形態では、該トランスフェクトされた細胞は、該プラスミドＤＮＡを複製するために培養され、次いでこれが単離及び精製される。いくつかの実施形態では、該ＤＮＡ鋳型は、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、例えば、目的の遺伝子の５’側に位置し、目的の遺伝子に作動可能に連結されているＴ７プロモーターを含む。
いくつかの実施形態では、インビトロ転写鋳型は、５’非翻訳（ＵＴＲ）領域をコードし、オープンリーディングフレームを含み、３’ＵＴＲ及びポリ（Ａ）テールをコードする。インビトロ転写鋳型の特定の核酸配列組成及び長さは、該鋳型によってコードされるｍＲＮＡに依存する。
「５’非翻訳領域」（ＵＴＲ）とは、ポリペプチドをコードしない開始コドン（すなわち、リボソームによって翻訳されるｍＲＮＡ転写産物の最初のコドン）からすぐ上流（すなわち、５’）にあるｍＲＮＡの領域を指す。ＲＮＡ転写産物が生成されている場合、該５’ＵＴＲは、プロモーター配列を含み得る。かかるプロモーター配列は、当技術分野で知られている。本開示のワクチンにはかかるプロモーター配列が存在しないことを理解されたい。
「３’非翻訳領域」（ＵＴＲ）とは、ポリペプチドをコードしない終止コドン（すなわち、翻訳終了をシグナル伝達するｍＲＮＡ転写産物のコドン）からすぐ下流（すなわち、３’）にあるｍＲＮＡの領域を指す。
「オープンリーディングフレーム」とは、開始コドン（例えば、メチオニン（ＡＴＧ））で始まり、終止コドン（例えば、ＴＡＡ、ＴＡＧ、またはＴＧＡ）で終わるＤＮＡの連続的なストレッチであり、ポリペプチドをコードする。
「ポリ（Ａ）テール」とは、複数の連続したアデノシン一リン酸を含む３’ＵＴＲの下流、例えば、すぐ下流（すなわち、３’）にあるｍＲＮＡの領域である。ポリ（Ａ）テールは、１０～３００個のアデノシン一リン酸を含み得る。例えば、ポリ（Ａ）テールは、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、または３００個のアデノシン一リン酸を含み得る。いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）テールは、５０～２５０個のアデノシン一リン酸を含む。関連する生物学的環境（例えば、細胞内、インビボ）において、該ポリ（Ａ）テールは、（例えば、細胞質での）酵素分解からｍＲＮＡを保護し、転写終結、及び／または核からの該ｍＲＮＡの輸送及び翻訳を補助するように機能する。
いくつかの実施形態では、核酸は、２００～３，０００ヌクレオチドを含む。例えば、核酸は、２００～５００、２００～１０００、２００～１５００、２００～３０００、５００～１０００、５００～１５００、５００～２０００、５００～３０００、１０００～１５００、１０００～２０００、１０００～３０００、１５００～３０００、または２０００～３０００ヌクレオチドを含み得る。
インビトロ転写システムは通常、転写緩衝液、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）、ＲＮａｓｅ阻害剤及びポリメラーゼを含む。
該ＮＴＰは、社内で製造してもよく、供給業者から選択してもよく、本明細書に記載の通りに合成してもよい。該ＮＴＰは、天然及び非天然（修飾）ＮＴＰを含む本明細書に記載のものから選択してもよいが、これらに限定されない。
様々なＲＮＡポリメラーゼまたはバリアントが本開示の方法で使用され得る。該ポリメラーゼは、限定されるものではないが、ファージＲＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、及び／または変異体ポリメラーゼ、例えば、限定されるものではないが、化学修飾された核酸及び／またはヌクレオチドを含む、修飾核酸及び／または修飾ヌクレオチドを組み込み得るポリメラーゼから選択され得る。いくつかの実施形態は、ＤＮａｓｅの使用を除外する。
いくつかの実施形態では、該ＲＮＡ転写産物は、酵素キャッピングを介してキャッピングされる。いくつかの実施形態では、該ＲＮＡは、５’末端キャップ、例えば、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐを含む。
化学合成
固相化学合成。本開示の核酸は、固相技術を用いて、その全部または一部を製造してもよい。核酸の固相化学合成は、分子を固体支持体に固定し、反応溶液中で段階的に合成する自動化された方法である。固相合成は、核酸配列への化学修飾の部位特異的導入に役立つ。
液相化学合成。モノマー構成要素の連続添加による本開示の核酸の合成は、液相で実施され得る。
合成法の組み合わせ。上記の合成方法には、各々独自の利点及び制限がある。その制限を克服するために、これらの方法を組み合わせる試みが行われている。かかる方法の組み合わせは、本開示の範囲内である。固相または液相化学合成と酵素ライゲーションを併用すると、化学合成だけでは得ることができない長鎖核酸を生成する効率的な方法が提供される。
核酸領域またはサブ領域のライゲーション
リガーゼによる核酸の組織化も使用され得る。ＤＮＡまたはＲＮＡリガーゼは、ホスホジエステル結合の形成を介して、ポリヌクレオチド鎖の５’末端と３’末端の分子間ライゲーションを促進する。核酸、例えば、キメラポリヌクレオチド及び／または環状核酸は、１つ以上の領域またはサブ領域のライゲーションによって調製され得る。ＤＮＡ断片をリガーゼ触媒反応によって結合させることにより、異なる機能を有する組み換えＤＮＡが創出され得る。２つのオリゴデオキシヌクレオチド、すなわち、５’ホスホリル基を含むもの及び遊離３’ヒドロキシル基を含むものがＤＮＡリガーゼの基質として機能する。
精製
本明細書に記載の核酸の精製には、核酸のクリーンアップ、品質保証及び品質管理が含まれ得るが、これらに限定されない。クリーンアップは、限定されるものではないが、ＡＧＥＮＣＯＵＲＴ（登録商標）ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）、ポリＴビーズ、ＬＮＡ（商標）オリゴＴキャプチャープローブ（ＥＸＩＱＯＮ（登録商標）Ｉｎｃ，Ｖｅｄｂａｅｋ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、またはＨＰＬＣベースの精製方法、例えば、限定されるものではないが、強陰イオン交換ＨＰＬＣ、弱陰イオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、及び疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）等の当技術分野で知られている方法によって行われ得る。「精製された」という用語は、核酸に関連して、例えば、「精製された核酸」で使用される場合、少なくとも１つの夾雑物から分離されたものを指す。「夾雑物」とは、別のものを不適切なもの、不純なもの、または粗悪なものにする任意の物質である。したがって、精製された核酸（例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡ）は、それが自然界に見られるものとは異なる形態もしくは設定で、またはそれを処理もしくは精製方法に供する前に存在していたものとは異なる形態もしくは設定で存在する。
品質保証及び／または品質管理のチェックは、限定されるものではないが、ゲル電気泳動、ＵＶ吸光度、または分析的ＨＰＬＣ等の方法を用いて行われ得る。
いくつかの実施形態では、該核酸は、限定されるものではないが、逆転写酵素ＰＣＲを含む方法によって配列決定され得る。
定量化
いくつかの実施形態では、本開示の核酸は、エクソソームにおいて、または１つ以上の体液に由来する場合に定量化され得る。体液としては、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、痰、唾液、骨髄、滑液、房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー液または尿道球腺液、汗、糞便、髪、涙、嚢胞液、胸膜及び腹水、心膜液、リンパ液、粥状液、乳び、胆汁、間質液、月経、膿汁、皮脂、嘔吐物、膣分泌物、粘膜分泌物、便水、膵液、副鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、胚盤葉腔液、及び臍帯血が挙げられる。代替的に、エクソソームは、肺、心臓、膵臓、胃、腸、膀胱、腎臓、卵巣、精巣、皮膚、結腸、乳房、前立腺、脳、食道、肝臓、及び胎盤からなる群から選択される器官から回収され得る。
アッセイは、構築物特異的プローブ、サイトメトリー、ｑＲＴ－ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ＰＣＲ、フローサイトメトリー、電気泳動、質量分析、またはこれらの組み合わせを用いて行われてもよく、エクソソームは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）法等の免疫組織化学法を用いて単離され得る。エクソソームはまた、サイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配遠心法、分画遠心法、ナノ膜限外濾過、免疫吸着捕捉、アフィニティー精製、マイクロ流体分離、またはこれらの組み合わせによって単離され得る。
これらの方法により、研究者は、核酸の残留レベルまたは送達レベルをリアルタイムで観察することができる。これは、本開示の核酸が、いくつかの実施形態では、構造的または化学的な修飾により内因性形態とは異なるために可能である。
いくつかの実施形態では、該核酸は、限定されるものではないが、紫外線可視分光法（ＵＶ／Ｖｉｓ）等の方法を用いて定量化され得る。ＵＶ／Ｖｉｓ分光計の非限定的な例は、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（登録商標）分光計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）である。定量化された核酸は、該核酸が適切なサイズであり得るか否かを決定し、該核酸の分解が生じていないか確認するために分析され得る。該核酸の分解は、限定されるものではないが、アガロースゲル電気泳動、ＨＰＬＣベースの精製方法、例えば、限定されるものではないが、強陰イオン交換ＨＰＬＣ、弱陰イオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、及び疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）、液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣＭＳ）、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）及びキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）等の方法によって確認され得る。
脂質ナノ粒子製剤
いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に製剤化される。これは、本明細書ではＬＮＰ製剤化ｍＲＮＡワクチン（ｆＬＮＰ）と呼ばれる。本明細書で使用される、「脂質ナノ粒子」は、典型的には、イオン性カチオン性脂質、通常はイオン性アミノ脂質、非カチオン性脂質、ステロール及びＰＥＧ脂質成分と、目的の核酸カーゴを含む。本発明の脂質ナノ粒子は、当技術分野で一般に知られている成分、組成物、及び方法を使用して生成され得る。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５２３５２、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６８３００、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０３７５５１、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０２７４００、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４７４０６、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６０００１２９、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１４２８０、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１４２８０、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０３８４２６、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２７０７７、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５５３９４、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／５２１１７、ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６９６１０、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２７４９２、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５９５７５、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６９４９１、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６９４９３、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６６２４２を参照されたい。これらはすべて、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
本開示のワクチンは、通常、脂質ナノ粒子に製剤化される。いくつかの実施形態では、該脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのイオン性アミノ脂質、少なくとも１つの非カチオン性脂質、少なくとも１つのステロール、及び／または少なくとも１つのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質を含む。
いくつかの実施形態では、該脂質ナノ粒子は、他の脂質成分に対して、モル比２０～６０％のアミノ脂質を含む。例えば、該脂質ナノ粒子は、モル比２０～５０％、２０～４０％、２０～３０％、３０～６０％、３０～５０％、３０～４０％、４０～６０％、４０～５０％、または５０～６０％のアミノ脂質を含み得る。いくつかの実施形態では、該脂質ナノ粒子は、モル比２０％、３０％、４０％、５０、または６０％のアミノ脂質を含む。
いくつかの実施形態では、該脂質ナノ粒子は、他の脂質成分に対して、モル比５～２５％のリン脂質を含む。例えば、該脂質ナノ粒子は、モル比５～３０％、５～１５％、５～１０％、１０～２５％、１０～２０％、１０～２５％、１５～２５％、１５～２０％、２０～２５％、または２５～３０％のリン脂質を含み得る。いくつかの実施形態では、該脂質ナノ粒子は、モル比５％、１０％、１５％、２０％、２５％、または３０％の非カチオン性脂質を含む。
いくつかの実施形態では、該脂質ナノ粒子は、他の脂質成分に対して、モル比２５～５５％の構造脂質を含む。例えば、該脂質ナノ粒子は、モル比１０～５５％、２５～５０％、２５～４５％、２５～４０％、２５～３５％、２５～３０％、３０～５５％、３０～５０％、３０～４５％、３０～４０％、３０～３５％、３５～５５％、３５～５０％、３５～４５％、３５～４０％、４０～５５％、４０～５０％、４０～４５％、４５～５５％、４５～５０％、または５０～５５％の構造脂質を含み得る。いくつかの実施形態では、該脂質ナノ粒子は、モル比１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、または５５％の構造脂質を含む。
いくつかの実施形態では、該脂質ナノ粒子は、他の脂質成分に対して、モル比０．５～１５％のＰＥＧ脂質を含む。例えば、該脂質ナノ粒子は、モル比０．５～１０％、０．５～５％、１～１５％、１～１０％、１～５％、２～１５％、２～１０％、２～５％、５～１５％、５～１０％、または１０～１５％のＰＥＧ脂質を含み得る。いくつかの実施形態では、該脂質ナノ粒子は、モル比０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、または１５％のＰＥＧ脂質を含む。
いくつかの実施形態では、該脂質ナノ粒子は、モル比２０～６０％のアミノ脂質、５～２５％のリン脂質、２５～５５％の構造脂質、及び０．５～１５％のＰＥＧ脂質を含む。
いくつかの実施形態では、該脂質ナノ粒子は、モル比２０～６０％のアミノ脂質、５～３０％のリン脂質、１０～５５％の構造脂質、及び０．５～１５％のＰＥＧ脂質を含む。
アミノ脂質
いくつかの態様では、本開示のアミノ脂質は、式（Ｉ）の化合物：
もしくはそれらのＮ－オキシド、またはそれらの塩もしくは異性体のうちの１つ以上でよく、式中、
Ｒ１は、Ｃ５－３０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、ヘテロ環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、水素、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１－６アルキルからなる群から選択され、ここで、Ｑは、炭素環、ヘテロ環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは、独立して、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５は、独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は、独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’は、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－Ｍ”－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、ここで、Ｍ”は、結合、Ｃ１－１３アルキルまたはＣ２－１３アルケニルであり、
Ｒ７は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒ８は、Ｃ３－６炭素環及びヘテロ環からなる群から選択され、
Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１－６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ３－６炭素環及びヘテロ環からなる群から選択され、
各Ｒは、独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は、独立して、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は、独立して、Ｃ３－１５アルキル及びＣ３－１５アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は、独立して、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは、独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘは、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択され、ここで、Ｒ４が－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、または－ＣＱ（Ｒ）２の場合、（ｉ）Ｑは、ｎが１、２、３、４もしくは５の場合に－Ｎ（Ｒ）２ではなく、または（ｉｉ）Ｑは、ｎが１もしくは２の場合に５、６、もしくは７員のヘテロシクロアルキルではない。
ある特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、式（Ｉ－Ａ）：
もしくはそのＮ－オキシド、またはその塩もしくは異性体のものを含み、式中、ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され、ｍは、５、６、７、８、及び９から選択され、Ｍ１は、結合またはＭ’であり、Ｒ４は、水素、非置換Ｃ１－３アルキル、または－（ＣＨ２）ｎＱであり、ここで、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり、Ｍ及びＭ’は、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－Ｍ”－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、Ｒ２及びＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択される。例えば、ｍは、５、７、または９である。例えば、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、または－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２である。例えば、Ｑは、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、または－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒである。
ある特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、式（Ｉ－Ｂ）：
もしくはそのＮ－オキシド、またはその塩もしくは異性体のものを含み、式中、すべての可変要素は、本明細書で定義される通りである。例えば、ｍは、５、６、７、８、及び９から選択され、Ｒ４は、水素、非置換Ｃ１－３アルキル、または－（ＣＨ２）ｎＱであり、ここで、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり、Ｍ及びＭ’は、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－Ｍ”－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、Ｒ２及びＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択される。例えば、ｍは、５、７、または９である。例えば、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、または－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２である。例えば、Ｑは、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、または－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒである。
ある特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、式（ＩＩ）：
もしくはそのＮ－オキシド、またはその塩もしくは異性体のものを含み、式中、ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され、Ｍ１は、結合またはＭ’であり、Ｒ４は、水素、非置換Ｃ１－３アルキル、または－（ＣＨ２）ｎＱであり、ここで、ｎは、２、３、または４であり、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり、Ｍ及びＭ’は、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－Ｍ”－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、Ｒ２及びＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択される。
１つの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩａ）：
もしくはそれらのＮ－オキシド、またはそれらの塩もしくは異性体のものであり、式中、Ｒ４は、本明細書に記載の通りである。
別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｂ）：
もしくはそれらのＮ－オキシド、またはそれらの塩もしくは異性体のものであり、式中、Ｒ４は、本明細書に記載の通りである。
別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｃ）もしくは（ＩＩｅ）：
もしくはそれらのＮ－オキシド、またはそれらの塩もしくは異性体のものであり、式中、Ｒ４は、本明細書に記載の通りである。
別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｆ）：
もしくはそれらのＮ－オキシド、またはそれらの塩もしくは異性体のものであり、
式中、Ｍは、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－または－ＯＣ（Ｏ）－であり、Ｍ”は、Ｃ１－６アルキルまたはＣ２－６アルケニルであり、Ｒ２及びＲ３は、独立して、Ｃ５－１４アルキル及びＣ５－１４アルケニルからなる群から選択され、ｎは、２、３、及び４から選択される。
さらなる実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｄ）：
もしくはそれらのＮ－オキシド、またはそれらの塩もしくは異性体のものであり、式中、ｎは、２、３、または４であり、ｍ、Ｒ’、Ｒ”、及びＲ２～Ｒ６は、本明細書に記載の通りである。例えば、Ｒ２及びＲ３の各々は、独立して、Ｃ５－１４アルキル及びＣ５－１４アルケニルからなる群から選択され得る。
さらなる実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｇ）、
もしくはそれらのＮ－オキシド、またはそれらの塩もしくは異性体のものであり、式中、ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され、ｍは、５、６、７、８、及び９から選択され、Ｍ１は、結合またはＭ’であり、Ｍ及びＭ’は、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－Ｍ”－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、Ｒ２及びＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択される。例えば、Ｍ”は、Ｃ１－６アルキル（例えば、Ｃ１－４アルキル）またはＣ２－６アルケニル（例えば、Ｃ２－４アルケニル）である。例えば、Ｒ２及びＲ３は、独立して、Ｃ５－１４アルキル及びＣ５－１４アルケニルからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、該アミノ脂質は、米国出願第６２／２２０，０９１号、第６２／２５２，３１６号、第６２／２５３，４３３号、第６２／２６６，４６０号、第６２／３３３，５５７号、第６２／３８２，７４０号、第６２／３９３，９４０号、第６２／４７１，９３７号、第６２／４７１，９４９号、第６２／４７５，１４０号、及び第６２／４７５，１６６号ならびにＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５２３５２号に記載の化合物のうちの１つ以上である。
いくつかの実施形態では、該アミノ脂質は、化合物１：
またはその塩である。
いくつかの実施形態では、該アミノ脂質は、化合物２：
またはその塩である。
式（Ｉ）、（Ｉ－Ａ）、（Ｉ－Ｂ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、（ＩＩｅ）、（ＩＩｆ）、または（ＩＩｇ）の脂質の中心アミン部分は、生理的ｐＨでプロトン化され得る。したがって、脂質は、生理的ｐＨで正または部分正電荷を有し得る。かかるアミノ脂質は、カチオン性脂質、イオン性脂質、カチオン性アミノ脂質、またはイオン性アミノ脂質と呼ばれ得る。アミノ脂質はまた、双性イオン性、すなわち、正電荷及び負電荷の両方を有する中性分子であってもよい。
いくつかの態様では、本開示のアミノ脂質は、式（ＩＩＩ）の化合物：
またはその塩もしくは異性体のうちの１つ以上でよく、式中、
Ｗは、
であり、
環Ａは、
であり、
ｔは、１または２であり、
Ａ１及びＡ２は、各々独立して、ＣＨまたはＮから選択され、
Ｚは、ＣＨ２であるか、または存在せず、ここで、ＺがＣＨ２の場合、破線（１）及び（２）は、各々単結合を表し、Ｚが存在しない場合、破線（１）及び（２）は、ともに存在せず、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、独立して、Ｃ５－２０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ”ＭＲ’、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択され、
ＲＸ１及びＲＸ２は、各々独立して、ＨまたはＣ１－３アルキルであり、
各Ｍは、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｏ）－、アリール基、及びヘテロアリール基からなる群から選択され、
Ｍ＊は、Ｃ１－Ｃ６アルキルであり、
Ｗ１及びＷ２は、各々独立して、－Ｏ－及び－Ｎ（Ｒ６）－からなる群から選択され、
各Ｒ６は、独立して、Ｈ及びＣ１－５アルキルからなる群から選択され、
Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３は、独立して、結合、－ＣＨ２－、－（ＣＨ２）２－、－ＣＨＲ－、－ＣＨＹ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－（ＣＨ２）ｎ－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－（ＣＨ２）ｎ－、－（ＣＨ２）ｎ－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－（ＣＨ２）ｎ－、－（ＣＨ２）ｎ－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－（ＣＨ２）ｎ－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｃ（Ｓ）－、及び－ＣＨ（ＳＨ）－からなる群から選択され、
各Ｙは、独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｒ＊は、独立して、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒは、独立して、Ｃ１－３アルキル及びＣ３－６炭素環からなる群から選択され、
各Ｒ’は、独立して、Ｃ１－１２アルキル、Ｃ２－１２アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は、独立して、Ｃ３－１２アルキル、Ｃ３－１２アルケニル及び－Ｒ＊ＭＲ’からなる群から選択され、
ｎは、１～６の整数であり、
ここで、環Ａが
の場合、
ｉ）Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３のうちの少なくとも１つは、－ＣＨ２－ではなく、及び／または
ｉｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つは、－Ｒ”ＭＲ’である。
いくつかの実施形態では、該化合物は、式（ＩＩＩａ１）～（ＩＩＩａ８）のいずれかのものである：
いくつかの実施形態では、該アミノ脂質は、
またはその塩である。
式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ１）、（ＩＩＩａ２）、（ＩＩＩａ３）、（ＩＩＩａ４）、（ＩＩＩａ５）、（ＩＩＩａ６）、（ＩＩＩａ７）、または（ＩＩＩａ８）の脂質の中心アミン部分は、生理的ｐＨでプロトン化され得る。したがって、脂質は、生理的ｐＨで正または部分正電荷を有し得る。
リン脂質
本明細書に開示する脂質ナノ粒子組成物の脂質組成は、１つ以上のリン脂質、例えば、１つ以上の飽和もしくは（ポリ）不飽和リン脂質またはそれらの組み合わせを含み得る。一般に、リン脂質は、リン脂質部分及び１つ以上の脂肪酸部分を含む。
リン脂質部分は、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、２－リソホスファチジルコリン、及びスフィンゴミエリンからなる非限定的な群から選択され得る。
脂肪酸部分は、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、ミリストレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、アルファ－リノレン酸、エルカ酸、フィタン酸（ｐｈｙｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、アラキジン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ベヘン酸、ドコサペンタエン酸、及びドコサヘキサエン酸からなる非限定的な群から選択され得る。
特定のリン脂質は、膜への融合を容易にすることができる。例えば、カチオン性リン脂質は、膜（例えば、細胞膜または細胞内膜）の１つ以上の負電荷を有するリン脂質と相互作用し得る。リン脂質が膜に融合することで、脂質含有組成物（例えば、ＬＮＰ）の１つ以上の要素（例えば、治療薬）が膜を通過することが可能になる場合があり、例えば、１つ以上の要素の標的組織への送達が可能になる。
分岐、酸化、環化、及びアルキンを含めた修飾及び置換を有する天然種を含めた非天然リン脂質種もまた企図される。例えば、リン脂質は、１つ以上のアルキン（例えば、１つ以上の二重結合が三重結合で置き換えられているアルケニル基）で官能化または架橋され得る。適切な反応条件下で、アルキン基は、アジドへの曝露時に銅触媒による付加環化を受ける可能性がある。かかる反応は、膜浸透もしくは細胞認識を促進するためにナノ粒子組成物の脂質二重層を官能化するか、またはナノ粒子組成物を標的化もしくはイメージング部分（例えば、色素）等の有用な成分にコンジュゲートするのに有用であり得る。
リン脂質としては、グリセロリン脂質、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、及びホスファチジン酸が挙げられるがこれらに限定されない。リン脂質としてはまた、リンスフィンゴ脂質、例えば、スフィンゴミエリンも挙げられる。
いくつかの実施形態では、本発明のリン脂質は、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジウンデカノイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＵＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０ジエーテルＰＣ）、１－オレオイル－２－コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（Ｃ１６ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＭＥ１６．０ＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、スフィンゴミエリン、及びこれらの混合物を含む。
ある特定の実施形態では、本発明において有用であるか、または潜在的に有用であるリン脂質は、ＤＳＰＣのアナログまたはバリアントである。ある特定の実施形態では、本発明において有用であるか、または潜在的に有用であるリン脂質は、式（ＩＶ）の化合物：
またはその塩であり、式中、
各Ｒ１は、独立して、任意に置換されるアルキルであるか、または任意に、２つのＲ１が介在原子と一緒になって、任意に置換される単環式カルボシクリルもしくは任意に置換される単環式ヘテロシクリルを形成するか、または、任意に、３つのＲ１が介在原子と一緒になって、任意に置換される二環式カルボシクリルもしくは任意に置換される二環式ヘテロシクリルを形成し、
ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
ｍは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
Ａは、式：
のものであり、
Ｌ２の各例は、独立して、結合または任意に置換されるＣ１－６アルキレンであり、ここで、該任意に置換されるＣ１－６アルキレンの１つのメチレン単位は、任意に、Ｏ、Ｎ（ＲＮ）、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、またはＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）で置き換えられ、
Ｒ２の各例は、独立して、任意に置換されるＣ１－３０アルキル、任意に置換されるＣ１－３０アルケニル、または任意に置換されるＣ１－３０アルキニルであり、任意に、ここで、Ｒ２の１つ以上のメチレン単位は、独立して、任意に置換されるカルボシクリレン、任意に置換されるヘテロシクリレン、任意に置換されるアリーレン、任意に置換されるヘテロアリーレン、Ｎ（ＲＮ）、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、Ｓ（Ｏ）、ＯＳ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｏ、－ＯＳ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２Ｏ、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、または－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏで置き換えられ、
ＲＮの各例は、独立して、水素、任意に置換されるアルキル、または窒素保護基であり、
環Ｂは、任意に置換されるカルボシクリル、任意に置換されるヘテロシクリル、任意に置換されるアリール、または任意に置換されるヘテロアリールであり、
ｐは、１または２であるが、
ただし、該化合物は、下記式のものではない：
式中、Ｒ２の各例は、独立して、非置換アルキル、非置換アルケニル、または非置換アルキニルである。
いくつかの実施形態では、該リン脂質は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０３７９２２号に記載されているリン脂質の１つ以上であり得る。
構造脂質
本明細書に開示する医薬組成物の脂質組成物は、１つ以上の構造脂質を含み得る。本明細書で使用される、「構造脂質」という用語は、ステロールを指し、また、ステロール部分を含む脂質も指す。
該脂質ナノ粒子に構造脂質を組み込むことで、粒子内の他の脂質の凝集の軽減が促される可能性がある。構造脂質は、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、トマチン、ウルソル酸、アルファ－トコフェロール、ホパノイド、フィトステロール、ステロイド、及びそれらの混合物を含む群から選択することができるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、該構造脂質は、ステロールである。本明細書で定義される、「ステロール」は、ステロイドアルコールからなるステロイドの亜群である。ある特定の実施形態では、該構造脂質は、ステロイドである。ある特定の実施形態では、該構造脂質は、コレステロールである。ある特定の実施形態では、該構造脂質は、コレステロールのアナログである。ある特定の実施形態では、該構造脂質は、アルファ－トコフェロールである。
いくつかの実施形態では、該構造脂質は、米国出願第１６／４９３，８１４号に記載されている構造脂質の１つ以上であり得る。
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質
本明細書に開示する医薬組成物の脂質組成物は、１つ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質を含み得る。
本明細書で使用される、「ＰＥＧ脂質」という用語は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で修飾された脂質を指す。ＰＥＧ脂質の非限定的な例としては、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジン酸、ＰＥＧ－セラミドコンジュゲート（例えば、ＰＥＧ－ＣｅｒＣ１４またはＰＥＧ－ＣｅｒＣ２０）、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン及びＰＥＧ修飾１，２－ジアシルオキシプロパン－３－アミンが挙げられる。かかる脂質は、ＰＥＧ化脂質とも呼ばれる。例えば、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、またはＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質であり得る。
いくつかの実施形態では、該ＰＥＧ脂質としては、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロールメトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＰＥＧ－ＤＳＰＥ）、ＰＥＧ－ジステリル（ｄｉｓｔｅｒｙｌ）グリセロール（ＰＥＧ－ＤＳＧ）、ＰＥＧ－ジパルメトレイル（ｄｉｐａｌｍｅｔｏｌｅｙｌ）、ＰＥＧ－ジオレイル、ＰＥＧ－ジステアリル、ＰＥＧ－ジアシルグリカミド（ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃａｍｉｄｅ）（ＰＥＧ－ＤＡＧ）、ＰＥＧ－ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＤＰＰＥ）、またはＰＥＧ－１，２－ジミリスチルオキシプロピル－３－アミン（ＰＥＧ－ｃ－ＤＭＡ）が挙げられるがこれらに限定されない。
１つの実施形態では、該ＰＥＧ－脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、該ＰＥＧ修飾脂質は、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ（ＰＥＧ－ＤＯＭＧとも呼ばれる）、ＰＥＧ－ＤＳＧ及び／またはＰＥＧ－ＤＰＧである。
いくつかの実施形態では、該ＰＥＧ－脂質の脂質部分としては、約Ｃ１４～約Ｃ２２、好ましくは、約Ｃ１４～約Ｃ１６の長さを有するものが挙げられる。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分、例えば、ｍＰＥＧ－ＮＨ２は、約１０００、２０００、５０００、１０，０００、１５，０００、または２０，０００ダルトンのサイズを有する。１つの実施形態では、該ＰＥＧ－脂質は、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧである。
１つの実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子は、非拡散性ＰＥＧであるＰＥＧ脂質を含み得る。非拡散性ＰＥＧの非限定的な例としては、ＰＥＧ－ＤＳＧ及びＰＥＧ－ＤＳＰＥが挙げられる。
ＰＥＧ－脂質、例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第８１５８６０１号及び国際公開第ＷＯ２０１５／１３０５８４Ａ２号に記載のものは、当技術分野では既知である。
一般に、本明細書に記載の様々な式の他の脂質成分（例えば、ＰＥＧ脂質）のいくつかは、参照により全体として組み込まれる、２０１６年１２月１０日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０００１２９号、発明の名称「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｇｅｎｔｓ」に記載の通りに合成され得る。
脂質ナノ粒子組成物の脂質成分は、ポリエチレングリコール、例えば、ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を含む１つ以上の分子を含み得る。かかる種は、代替的にＰＥＧ化脂質と呼ばれることもある。ＰＥＧ脂質は、ポリエチレングリコールで修飾された脂質である。ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物を含む非限定的な群から選択され得る。例えば、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、またはＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質であり得る。
いくつかの実施形態では、該ＰＥＧ修飾脂質は、ＰＥＧ ＤＭＧの修飾形態である。ＰＥＧ－ＤＭＧは、以下の構造を有する：
１つの実施形態では、本発明に有用なＰＥＧ脂質は、参照によりその内容が全体として本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１２０９９７５５号に記載のＰＥＧ化脂質であり得る。本明細書に記載のこれら例示的なＰＥＧ脂質のいずれかを修飾して、該ＰＥＧ鎖にヒドロキシル基を含めてもよい。ある特定の実施形態では、該ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ＯＨ脂質である。本明細書で一般に定義される、「ＰＥＧ－ＯＨ脂質」（本明細書では、「ヒドロキシ－ＰＥＧ化脂質」とも呼ばれる）は、当該脂質に１つ以上のヒドロキシル（－ＯＨ）基を有するＰＥＧ化脂質である。ある特定の実施形態では、該ＰＥＧ－ＯＨ脂質は、当該ＰＥＧ鎖に１つ以上のヒドロキシル基を含む。ある特定の実施形態では、ＰＥＧ－ＯＨまたはヒドロキシ－ＰＥＧ化脂質は、当該ＰＥＧ鎖の末端に－ＯＨ基を含む。各可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。
ある特定の実施形態では、本発明に有用なＰＥＧ脂質は、式（ＩＩ）の化合物である。本明細書に提供するのは、式（Ｖ）の化合物：
またはそれらの塩であり、式中、
Ｒ３は、－ＯＲＯであり、
ＲＯは、水素、任意に置換されるアルキル、または酸素保護基であり、
ｒは、１及び１００を含めた１～１００の整数であり、
Ｌ１は、任意に置換されるＣ１－１０アルキレンであり、ここで、該任意に置換されるＣ１－１０アルキレンの少なくとも１つのメチレンは、独立して、任意に置換されるカルボシクリレン、任意に置換されるヘテロシクリレン、任意に置換されるアリーレン、任意に置換されるヘテロアリーレン、Ｏ、Ｎ（ＲＮ）、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、またはＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）で置き換えられ、
Ｄは、クリックケミストリーによって得られる部分、または生理的条件下で切断可能な部分であり、
ｍは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
Ａは、式：
のものであり、
Ｌ２の各例は、独立して、結合または任意に置換されるＣ１－６アルキレンであり、ここで、該任意に置換されるＣ１－６アルキレンの１つのメチレン単位は、任意に、Ｏ、Ｎ（ＲＮ）、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、またはＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）で置き換えられ、
Ｒ２の各例は、独立して、任意に置換されるＣ１－３０アルキル、任意に置換されるＣ１－３０アルケニル、または任意に置換されるＣ１－３０アルキニルであり、任意に、ここで、Ｒ２の１つ以上のメチレン単位は、独立して、任意に置換されるカルボシクリレン、任意に置換されるヘテロシクリレン、任意に置換されるアリーレン、任意に置換されるヘテロアリーレン、Ｎ（ＲＮ）、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、Ｓ（Ｏ）、ＯＳ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｏ、－ＯＳ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２Ｏ、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、または－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏで置き換えられ、
ＲＮの各例は、独立して、水素、任意に置換されるアルキル、または窒素保護基であり、
環Ｂは、任意に置換されるカルボシクリル、任意に置換されるヘテロシクリル、任意に置換されるアリール、または任意に置換されるヘテロアリールであり、
ｐは、１または２である。
ある特定の実施形態では、式（Ｖ）の化合物は、ＰＥＧ－ＯＨ脂質である（すなわち、Ｒ３は－ＯＲＯであり、ＲＯは水素である）。ある特定の実施形態では、式（Ｖ）の化合物は、式（Ｖ－ＯＨ）：
またはその塩のものである。
ある特定の実施形態では、本発明で有用なＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ化脂肪酸である。ある特定の実施形態では、本発明に有用なＰＥＧ脂質は、式（ＶＩ）の化合物である。本明細書に提供するのは、式（ＶＩ）の化合物：
またはその塩であり、式中、
Ｒ３は、－ＯＲＯであり、
ＲＯは、水素、任意に置換されるアルキルまたは酸素保護基であり、
ｒは、１及び１００を含めた１～１００の整数であり、
Ｒ５は、任意に置換されるＣ１０－４０アルキル、任意に置換されるＣ１０－４０アルケニル、または任意に置換されるＣ１０－４０アルキニルであり、任意に、Ｒ５の１つ以上のメチレン基は、任意に置換されるカルボシクリレン、任意に置換されるヘテロシクリレン、任意に置換されるアリーレン、任意に置換されるヘテロアリーレン、Ｎ（ＲＮ）、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、－ＮＲＮＣ（Ｏ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）、－ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、Ｓ（Ｏ）、ＯＳ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２Ｏ、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）、－Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、またはＮ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏで置き換えられ、
ＲＮの各例は、独立して、水素、任意に置換されるアルキル、または窒素保護基である。
ある特定の実施形態では、式（ＶＩ）の化合物は、式（ＶＩ－ＯＨ）：
またはその塩のものである。いくつかの実施形態では、ｒは、４０～５０である。
さらに他の実施形態では、式（ＶＩ）の化合物は：
またはその塩である。
１つの実施形態では、式（ＶＩ）の化合物は
である。
いくつかの態様では、本明細書に開示する医薬組成物の脂質組成物は、ＰＥＧ－脂質を含まない。
いくつかの実施形態では、該ＰＥＧ－脂質は、米国出願第ＵＳ１５／６７４，８７２号に記載されているＰＥＧ脂質の１つ以上であり得る。
いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰは、式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩのいずれかのアミノ脂質、ＤＳＰＣを含むリン脂質、構造脂質、及びＰＥＧ－ＤＭＧを含むＰＥＧ脂質を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰは、式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩのいずれかのアミノ脂質、ＤＳＰＣを含むリン脂質、構造脂質、及び式ＶＩを有する化合物を含むＰＥＧ脂質を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰは、式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩのアミノ脂質、式ＩＶを有する化合物を含むリン脂質、構造脂質、及び式ＶまたはＶＩを有する化合物を含むＰＥＧ脂質を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰは、式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩのアミノ脂質、式ＩＶを有する化合物を含むリン脂質、構造脂質、及び式ＶまたはＶＩを有する化合物を含むＰＥＧ脂質を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰは、式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩのアミノ脂質、式ＩＶを有するリン脂質、構造脂質、及び式ＶＩを有する化合物を含むＰＥＧ脂質を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰは、Ｎ：Ｐ比約２：１～約３０：１からなる。
いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰは、Ｎ：Ｐ比約６：１からなる。
いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰは、Ｎ：Ｐ比約３：１、４：１、または５：１からなる。
いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰは、該アミノ脂質成分と該ＲＮＡの重量／重量比約１０：１～約１００：１からなる。
いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰは、該アミノ脂質成分と該ＲＮＡの重量／重量比約２０：１からなる。
いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰは、該アミノ脂質成分と該ＲＮＡの重量／重量比約１０：１からなる。
いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰは、平均径約３０ｎｍ～約１５０ｎｍを有する。
いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰは、平均径約６０ｎｍ～約１２０ｎｍを有する。
本明細書で開示される、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、実質的に球形（すなわち、回転楕円体）の幾何学的形状に配置された脂質分子を含むナノスケール構築物（例えば、ナノ粒子、通常は直径１００ｎｍ未満）を指し、場合によっては、１つ以上のさらなる分子種を封入する。ＬＮＰは、アミノ脂質（例えば、イオン性アミノ脂質）、中性脂質、非カチオン性脂質、荷電脂質、ＰＥＧ修飾脂質、リン脂質、構造脂質及びステロールが挙げられるがこれらに限定されない１つ以上のタイプの脂質を含み得る。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、さらに、核酸（例えば、ｍＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ等）、小分子、タンパク質及びペプチドが挙げられるがこれらに限定されない１つ以上のカーゴ分子を含み得る。ＬＮＰは、単層構造を有する（すなわち、中心領域を囲む単一の脂質層または脂質二重層を有する）場合もあれば、多層構造を有する（すなわち、中心領域を囲む複数の脂質層または脂質二重層を有する）場合もある。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、リポソームであり得る。リポソームは、中心領域の周りに１つ以上の同心の脂質二重層に配置された脂質を含むナノ粒子である。該リポソームの中心領域は、水溶液、懸濁液、または他の水性組成物を含み得る。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、２つ以上の成分（例えば、アミノ脂質及び核酸、ＰＥＧ－脂質、リン脂質、構造脂質）を含み得る。例えば、脂質ナノ粒子は、アミノ脂質及び核酸を含み得る。該脂質ナノ粒子、例えば、本明細書に記載のものを含む組成物は、有害な先天性免疫応答を最小限に抑えた治療用ペイロードのステルス送達を含めた多種多様な用途に使用され得る。
核酸の効果的なインビボ送達は、継続的な医療の課題を象徴する。外因性核酸（すなわち、細胞または生物の外部に由来する）は、体内で、例えば、免疫系によって容易に分解される。したがって、細胞への核酸の効果的な送達には、多くの場合、粒子状担体（例えば、脂質ナノ粒子）の使用が必要である。該粒子状担体は、粒子の凝集が最小限に抑えられ、細胞内送達前に比較的安定し、核酸を細胞内に効果的に送達し、免疫応答がまったくないか最小限になるように処方されるべきである。最小限の粒子凝集及び送達前の安定性を達成するために、多くの従来の粒子状担体は、ある特定の成分（例えば、ＰＥＧ－脂質）の存在及び／または濃度に依存している。しかしながら、ある特定の成分が、封入された核酸（例えば、ｍＲＮＡ分子）の安定性を低下させる可能性があることが発見された。安定性の低下により、該粒子状担体の幅広い適用性が制限され得る。したがって、脂質ナノ粒子内に封入された核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の安定性を改善する方法に対する必要性が依然として存在する。
いくつかの実施形態では、該脂質ナノ粒子は、１つ以上のイオン性分子、ポリヌクレオチド、及び任意成分、例えば、構造脂質、ステロール、中性脂質、リン脂質及び粒子の凝集を減少させることができる分子（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＥＧ修飾脂質）、例えば上記のものを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＬＮＰは、１つ以上のイオン性分子（例えば、アミノ脂質またはイオン性脂質）を含み得る。イオン性分子は、荷電基を含み得るとともに、ある特定のｐＫａを有し得る。ある特定の実施形態では、該イオン性分子のｐＫａは、約６以上、約６．２以上、約６．５以上、約６．８以上、約７以上、約７．２以上、約７．５以上、約７．８以上、約８以上であり得る。いくつかの実施形態では、該イオン性分子のｐＫａは、約１０以下、約９．８以下、約９．５以下、約９．２以下、約９．０以下、約８．８以下、または約８．５以下であり得る。上で参照した範囲の組み合わせもまた可能である（例えば、６以上約８．５以下）。他の範囲もまた可能である。２種類以上のイオン性分子が粒子内に存在する実施形態では、各種類のイオン性分子は独立して、上記範囲の１つ以上のｐＫａを有し得る。
一般に、イオン性分子は、１つ以上の荷電基を含む。いくつかの実施形態では、イオン性分子は、正電荷を有しても負電荷を有してもよい。例えば、イオン性分子は、正電荷を有し得る。例えば、イオン性分子は、アミン基を含み得る。本明細書で使用される、「イオン性分子」という用語は、当技術分野におけるその通常の意味を有し、１つ以上の荷電部分を含む分子またはマトリックスを指す場合がある。本明細書で使用される、「荷電部分」とは、形式電子電荷、例えば、一価（＋１、または－１）、二価（＋２、または－２）、三価（＋３、または－３）等を有する化学部分である。該荷電部分は、アニオン性（すなわち、負電荷を有する）でもカチオン性（すなわち、正電荷を有する）でもよい。正電荷を有する部分の例としては、アミン基（例えば、１級、２級、及び／または３級アミン）、アンモニウム基、ピリジニウム基、グアニジン基、及びイミジゾリウム基が挙げられる。特定の実施形態では、該荷電部分はアミン基を含む。負電荷を有する基またはその前駆体の例としては、カルボキシレート基、スルホネート基、スルフェート基、ホスホネート基、ホスフェート基、ヒドロキシル基等が挙げられる。荷電部分の電荷は、場合によっては、環境条件によって変化する場合があり、例えば、ｐＨの変化は、該部分の電荷を変化させる場合、及び／または該部分を荷電または非荷電にする場合がある。一般に、該分子及び／またはマトリックスの電荷密度は、所望に応じて選択され得る。
場合によっては、イオン性分子（例えば、アミノ脂質またはイオン性脂質）は、荷電部分に変換され得る１つ以上の前駆体部分を含み得る。例えば、該イオン性分子は、荷電部分を形成するように加水分解され得る中性部分、例えば、上記のものを含み得る。非限定的な具体例として、該分子またはマトリックスは、それぞれ、加水分解されてアミンを形成し得るアミドを含み得る。当業者には、所与の化学部分が、形式電子電荷を有しているかどうかを（例えば、検査、ｐＨ滴定、イオン伝導度測定等により）、及び／または所与の化学部分が反応し（例えば、加水分解され）、形式電子電荷を有する化学部分を形成し得るかどうかを判断することが可能である。
イオン性分子（例えば、アミノ脂質またはイオン性脂質）は、任意の適切な分子量を有し得る。ある特定の実施形態では、イオン性分子の分子量は、約２，５００ｇ／ｍｏｌ以下、約２，０００ｇ／ｍｏｌ以下、約１，５００ｇ／ｍｏｌ以下、約１，２５０ｇ／ｍｏｌ以下、約１，０００ｇ／ｍｏｌ以下、約９００ｇ／ｍｏｌ以下、約８００ｇ／ｍｏｌ以下、約７００ｇ／ｍｏｌ以下、約６００ｇ／ｍｏｌ以下、約５００ｇ／ｍｏｌ以下、約４００ｇ／ｍｏｌ以下、約３００ｇ／ｍｏｌ以下、約２００ｇ／ｍｏｌ、または約１００ｇ／ｍｏｌ以下である。場合によっては、イオン性分子の分子量は、約１００ｇ／ｍｏｌ以上、約２００ｇ／ｍｏｌ以上、約３００ｇ／ｍｏｌ以上、約４００ｇ／ｍｏｌ以上、約５００ｇ／ｍｏｌ以上、約６００ｇ／ｍｏｌ以上、約７００ｇ／ｍｏｌ以上、約１０００ｇ／ｍｏｌ以上、約１，２５０ｇ／ｍｏｌ以上、約１，５００ｇ／ｍｏｌ以上、約１，７５０ｇ／ｍｏｌ以上、約２，０００ｇ／ｍｏｌ以上、または約２，２５０ｇ／ｍｏｌ以上である。上記範囲の組み合わせ（例えば、少なくとも約２００ｇ／ｍｏｌ及び２，５００ｇ／ｍｏｌ以下）も可能である。２種類以上のイオン性分子が粒子内に存在する実施形態では、各種類のイオン性分子は独立して、上記範囲の１つ以上の分子量を有し得る。
いくつかの実施形態では、粒子内の単一の種類のイオン性分子（例えば、アミノ脂質またはイオン性脂質）及び／またはすべての該イオン性分子のパーセンテージ（例えば、重量基準、またはモル基準）は、約１５％以上、約１６％以上、約１７％以上、約１８％以上、約１９％以上、約２０％以上、約２１％以上、約２２％以上、約２３％以上、約２４％以上、約２５％以上、約３０％以上、約３５％以上、約４０％以上、約４２％以上、約４５％以上、約４８％以上、約５０％以上、約５２％以上、約５５％以上、約５８％以上、約６０％以上、約６２％以上、約６５％以上、または約６８％以上であり得る。場合によっては、該パーセンテージ（例えば、重量基準、またはモル基準）は、約７０％以下、約６８％以下、約６５％以下、約６２％以下、約６０％以下、約５８％以下、約５５％以下、約５２％以下、約５０％以下、または約４８％以下でよい。上で参照した範囲の組み合わせもまた可能である（例えば、２０％以上及び約６０％以下、４０％以上及び約５５％以下等）。２種類以上のイオン性分子が粒子内に存在する実施形態では、各種類のイオン性分子は独立して、上記範囲の１つ以上のパーセンテージ（例えば、重量基準、またはモル基準）を有し得る。該パーセンテージ（例えば、重量基準、またはモル基準）は、乾燥した粒子から、該イオン性分子（複数可）を、例えば、有機溶媒を使用して抽出すること、及び当該薬剤の量を、高圧液体クロマトグラフィー（すなわち、ＨＰＬＣ）、液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、または質量分析（ＭＳ）を使用して測定することによって特定され得る。当業者は、上で参照した技術を使用して成分の量を特定する技術に精通しているであろう。例えば、ＨＰＬＣは、成分の量を、例えば、ＨＰＬＣクロマトグラムの曲線下面積を標準曲線と比較することによって定量化するために使用され得る。
「荷電」または「荷電部分」という用語は、分子の「部分負電荷」または「部分正電荷」を指さないことを理解されたい。「部分負電荷」及び「部分正電荷」という用語には、当技術分野におけるその通常の意味が与えられる。「部分負電荷」は、官能基が、電子密度が当該結合の１つの原子に向かって引き寄せられ、当該原子上に部分負電荷を形成するように分極される結合を含む場合に生じ得る。当業者には、一般に、このように分極され得る結合が認識されよう。
本明細書に記載の通り、いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、該ｍＲＮＡが少なくとも部分的にＬＮＰ内に包含されるように、該ＬＮＰとともに製剤化される。ＬＮＰで製剤化されたｍＲＮＡワクチン（ｆＬＮＰ）は、ｍＲＮＡの分解を引き起こす可能性のある環境成分から該ＲＮＡを保護する構造を含む。
挿入及び置換
本開示はまた、さらに挿入及び／または置換を含む本開示のポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドの５’ＵＴＲは、同じ塩基のヌクレオシドの少なくとも１つの領域及び／またはストリングの挿入によって置き換えられ得る。該ヌクレオチドの領域及び／またはストリングは、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７または少なくとも８個のヌクレオチドを含むがこれに限定されず、該ヌクレオチドは、天然及び／または非天然であり得る。非限定的な例として、該ヌクレオチドの群は、５～８個のアデニン、シトシン、チミン、本明細書に開示する他のヌクレオチドのいずれかのストリング及び／またはそれらの組み合わせを含み得る。
いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドの５’ＵＴＲは、２つの異なる塩基のヌクレオチド、例えば、これらに限定されないが、アデニン、シトシン、チミン、本明細書に開示する他のヌクレオチドのいずれか及び／またはそれらの組み合わせの少なくとも２つの領域及び／またはストリングの挿入によって置き換えることができる。例えば、該５’ＵＴＲは、５～８個のアデニン塩基を挿入した後、５～８個のシトシン塩基を挿入することによって置き換えられ得る。別の例では、該５’ＵＴＲは、５～８個のシトシン塩基を挿入した後、５～８個のアデニン塩基を挿入することによって置き換えられ得る。
いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、ＲＮＡポリメラーゼによって認識され得る転写開始部位の下流に少なくとも１つの置換及び／または挿入を含み得る。非限定的な例として、少なくとも１つの置換及び／または挿入は、該転写開始部位のすぐ下流の領域（例えば、これに限定されないが、＋１～＋６）での少なくとも１つの核酸を置換することによって、該転写開始部位の下流で行われ得る。転写開始部位のすぐ下流のヌクレオチド領域の変化は、開始速度に影響を及ぼし、見かけのヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）反応定数値を増加させ、初期転写を直す転写複合体からの短い転写産物の解離を増加させる可能性がある（Ｂｒｉｅｂａ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００２）４１：５１４４－５１４９、参照により全体として本明細書に組み込まれる）。少なくとも１つのヌクレオシドの修飾、置換及び／または挿入は、該配列のサイレント変異を引き起こす場合もあれば、該アミノ酸配列の変異を引き起こす場合もある。
いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２または少なくとも１３個のグアニン塩基の置換を該転写開始部位の下流に含み得る。
いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５または少なくとも６個のグアニン塩基の置換を該転写開始部位のすぐ下流の領域に含み得る。非限定的な例として、該領域におけるヌクレオチドがＧＧＧＡＧＡの場合、該グアニン塩基は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３または少なくとも４個のアデニンヌクレオチドによって置換され得る。別の非限定的な例として、該領域におけるヌクレオチドがＧＧＧＡＧＡの場合、該グアニン塩基は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３または少なくとも４個のシトシン塩基によって置換され得る。別の非限定的な例として、該領域におけるヌクレオチドがＧＧＧＡＧＡの場合、該グアニン塩基は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３または少なくとも４個のチミン、及び／または本明細書に記載のヌクレオチドのいずれかによって置換され得る。
いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、該開始コドンの上流に少なくとも１つの置換及び／または挿入を含み得る。明確にするために、当業者には、該開始コドンが該タンパク質のコード領域の最初のコドンであるのに対し、該転写開始部位は、転写が開始する部位であることが理解されよう。該ポリヌクレオチドは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７または少なくとも８個のヌクレオチド塩基の置換及び／または挿入を含み得るがこれらに限定されない。該ヌクレオチド塩基は、該開始コドンの上流の１、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４または少なくとも５つの位置に挿入または置換され得る。挿入及び／または置換されるヌクレオチドは、同じ塩基（例えば、すべてＡもしくはすべてＣもしくはすべてＴもしくはすべてＧ）、２つの異なる塩基（例えば、ＡとＣ、ＡとＴ、もしくはＣとＴ）、３つの異なる塩基（例えば、Ａ、Ｃ及びＴもしくはＡ、Ｃ及びＴ）または少なくとも４つの異なる塩基であり得る。
非限定的な例として、該ポリヌクレオチドのコード領域の上流のグアニン塩基は、アデニン、シトシン、チミン、または本明細書に記載のヌクレオチドのいずれかで置換され得る。別の非限定的な例では、該ポリヌクレオチドのグアニン塩基の置換は、該転写開始部位の下流かつ該開始コドンの前の領域に１つのグアニン塩基を残すように設計され得る（Ｅｓｖｅｌｔ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（２０１１）４７２（７３４４）：４９９－５０３参照、その内容は、参照により全体として本明細書に組み込まれる）。非限定的な例として、少なくとも５つのヌクレオチドは、該転写開始部位の下流であるが、該開始コドンの上流の１つの位置に挿入され得るとともに、該少なくとも５つのヌクレオチドは、同じ塩基型であり得る。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、２００～３，０００ヌクレオチドを含む。例えば、ポリヌクレオチドは、２００～５００、２００～１０００、２００～１５００、２００～３０００、５００～１０００、５００～１５００、５００～２０００、５００～３０００、１０００～１５００、１０００～２０００、１０００～３０００、１５００～３０００、または２０００～３０００ヌクレオチドを含み得る。
本明細書に提供するのは、ヒト及び他の哺乳類における疾患の予防及び／または治療のための組成物（例えば、医薬組成物）、方法、キット、及び試薬である。該組成物は、治療薬または予防薬として使用され得る。例えば、該組成物がピコルナウイルスカプシドポリタンパク質及び／またはピコルナウイルス３Ｃプロテアーゼを含む場合、かかるピコルナウイルスカプシドポリタンパク質及び／またはピコルナウイルス３ＣプロテアーゼをコードするＲＮＡは、ピコルナウイルス科感染症の予防的または治療的保護を提供するために使用される。ピコルナウイルス科感染症の予防的保護は、本開示の組成物（例えば、１つ以上のピコルナウイルスカプシドポリタンパク質及び／またはピコルナウイルス３Ｃプロテアーゼをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む組成物）の投与後に達成され得る。いくつかの実施形態では、該ピコルナウイルス科は、エンテロウイルス族のメンバーである。いくつかの実施形態では、該エンテロウイルスは、エンテロウイルスＡ～Ｄ種の任意のウイルスである。いくつかの実施形態では、該エンテロウイルスは、ライノウイルスＡ～Ｃ種の任意のウイルスである。組成物は、１回、２回、３回、４回またはそれ以上投与され得る。いくつかの態様では、該組成物は、感染者に投与することによって治療反応を達成することができる。用量は、適宜調整する必要があり得る。
人々が、複数の型の感染性因子の株による感染のリスクにさらされる状況があり得ることが想定される。ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）治療は、製造速度、認識される地理的脅威に合わせて治療を迅速に調整する能力等が挙げられるがこれらに限定されないいくつかの要因により、混合ワクチン接種アプローチに特に適している。複数のエンテロウイルス株からの保護のため、ピコルナウイルスカプシドポリタンパク質の少なくとも１つのポリペプチド（またはその一部）をコードするＲＮＡを含み、さらにピコルナウイルス３Ｃプロテアーゼの少なくとも１つのポリペプチド（またはその一部）をコードするＲＮＡを含む併用治療を施すことができる。ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、例えば、単一の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に共製剤化してもよいし、共投与のための別々のＬＮＰに製剤化してもよい。いくつかの実施形態では、該エンテロウイルスは、ＨＲＶ１６である。いくつかの実施形態では、該エンテロウイルスは、ＥＶ－Ｄ６８である。いくつかの実施形態では、該エンテロウイルスは、ＥＶ－Ａ７１である。
予防有効用量とは、臨床的に許容されるレベルでウイルス感染を予防する治療有効用量である。いくつかの実施形態では、該治療有効用量とは、当該治療の添付文書に記載されている用量である。本明細書で使用される予防療法とは、感染の増加をある程度防ぐ療法を指す。感染は、完全または部分的に予防され得る。
本発明の方法は、いくつかの態様では、哺乳類対象をインフルエンザウイルス感染に対して受動免疫化することを含む。該方法は、少なくとも１つのピコルナウイルスカプシドポリタンパク質及びピコルナウイルス３Ｃプロテアーゼをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドを含む組成物を該対象に投与することを含む。いくつかの態様では、本開示の方法は、エンテロウイルス感染に対する予防的治療を提供する。いくつかの実施形態では、該エンテロウイルスは、ＨＲＶ１６である。いくつかの実施形態では、該エンテロウイルスは、ＥＶ－Ｄ６８である。いくつかの実施形態では、該エンテロウイルスは、ＥＶ－Ａ７１である。
治療方法もまた本発明に含まれる。対象におけるエンテロウイルス感染症を治療する方法が、本開示の態様に提供される。該方法は、少なくとも１つのピコルナウイルスカプシドポリタンパク質及びピコルナウイルス３Ｃプロテアーゼをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドを含む組成物をインフルエンザウイルス感染症を有する対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、該エンテロウイルスは、ＨＲＶ１６である。いくつかの実施形態では、該エンテロウイルスは、ＥＶ－Ｄ６８である。いくつかの実施形態では、該エンテロウイルスは、ＥＶ－Ａ７１である。
本明細書で使用される、治療する、治療された、または治療することという用語は、障害、例えばウイルス感染症に関して使用される場合、当該疾患の発症に対する対象の耐性を増加させる治療、換言すれば、該ウイルスの感染に応答して該対象が該疾患を発症する可能性を減少させる治療、及び該対象が該疾患を発症した後に、該感染症と闘うため、または該感染症の悪化を防ぐための治療を指す。
本開示のＲＮＡ治療の「有効量」は、少なくとも一部には、標的組織、標的細胞型、投与手段、ポリヌクレオチドの物理的特性（例えば、サイズ、及び修飾ヌクレオシドの程度）、ならびに該ＲＮＡ治療の他の成分、ならびに他の決定基に基づいて提供される。抗体産生の増加は、細胞のトランスフェクションの増加（該ＲＮＡ治療でトランスフェクトされた細胞のパーセンテージ）、該ポリヌクレオチドからのタンパク質翻訳の増加、核酸分解の減少（例えば、修飾ポリヌクレオチドからのタンパク質翻訳の持続時間の増加によって示される）、または宿主細胞の応答の変化によって実証され得る。
いくつかの実施形態では、本開示に従うＲＮＡ治療（ポリヌクレオチド及びそれらのコードされたポリペプチドを含む）は、該疾患の治療に使用され得る。
ＲＮＡ治療は、健康な個体に対する能動免疫化スキームの一部として、または潜伏期の過程の感染初期もしくは症状の発現後の活動性感染症の過程で予防的または治療的に施され得る。いくつかの実施形態では、細胞、組織、または対象に提供される本開示のＲＮＡ治療の量は、免疫予防に有効な量であり得る。
ＲＮＡ治療は、他の予防または治療化合物とともに投与され得る。非限定的な例として、予防または治療化合物は、アジュバントまたはブースターの有無にかかわらず、ウイルス治療を含むワクチンであり得る。本明細書で使用される、予防的組成物、例えば、治療またはワクチンに言及する場合の「ブースター」という用語は、予防的組成物の追加投与を指す。ブースター（またはブースターワクチン）は、予防的組成物の前の投与後に投与され得る。予防的組成物の初回投与とブースターとの間の投与間隔は、限定されるものではないが、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１５分、２０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、１日、３６時間、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、１０日、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１年、１８ヶ月、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年、１１年、１２年、１３年、１４年、１５年、１６年、１７年、１８年、１９年、２０年、２５年、３０年、３５年、４０年、４５年、５０年、５５年、６０年、６５年、７０年、７５年、８０年、８５年、９０年、９５年、または９９年超であり得る。例示的な実施形態では、該予防的組成物の初回投与とブースターとの間の投与間隔は、限定されるものではないが、１週間、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、または１年であり得る。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ治療は、皮下、眼内、硝子体内、非経口、皮下、静脈内、脳室内、筋肉内、くも膜下腔内、経口、腹腔内、経口吸入もしくは経鼻吸入により、または１つ以上の細胞、組織もしくは器官への直接注射により投与され得る。
本明細書に提供するのは、ＲＮＡ治療ならびにＲＮＡ組成物及び／または複合体を任意に１つ以上の医薬的に許容される賦形剤と組み合わせて含む医薬組成物である。
ＲＮＡ治療は、１つ以上の医薬的に許容される賦形剤と組み合わせて製剤化または投与され得る。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも１つのさらなる活性物質、例えば、治療効果のある物質、予防効果のある物質、またはその両方の組み合わせ等を含む。治療組成物は、無菌、パイロジェンフリー、または無菌かつパイロジェンフリーであり得る。医薬品、例えば、治療組成物の製剤化及び／または製造における概論は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２１ｓｔ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５（参照により全体として本明細書に組み込まれる）に見出され得る。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ治療は、ヒト、ヒト患者、または対象に投与される。本開示の目的のため、「活性成分」という句は、一般に、該ＲＮＡ治療またはその中に含まれるポリヌクレオチド、例えば、ピコルナウイルスカプシドポリタンパク質及び／またはピコルナウイルス３ＣプロテアーゼをコードするＲＮＡポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）を指す。
本明細書に記載の組成物の製剤は、薬理学の分野で既知のまたは今後開発される任意の方法によって調製され得る。一般に、かかる調製方法は、該活性成分（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）と賦形剤及び／または１つ以上の他の補助成分を関連付けるステップと、その後、必要及び／または所望に応じて、該生成物を分割、成形及び／または包装して所望の単回または複数回投与単位にすることを含む。
本開示の医薬組成物における活性成分、医薬的に許容される賦形剤、及び／または任意のさらなる成分の相対量は、治療される対象の同一性、サイズ、及び／または状態によって、さらに該組成物が投与される経路によって変化する。例として、該組成物は、０．１％～１００％、例えば、０．５～５０％、１～３０％、５～８０％、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。
ＲＮＡ治療は、（１）安定性を高めるための、（２）細胞のトランスフェクションを増加させるための、（３）持続放出または遅延放出（例えば、デポー製剤から）させるための、（４）生体内分布を変化させる（例えば、特定の組織または細胞型に標的化する）ための、（５）コードされたタンパク質のインビボでの翻訳を増加させるための、及び／または（６）該コードされたタンパク質（例えば、ＨＣＡｂ）のインビボでの放出プロファイルを変化させるための１つ以上の賦形剤を用いて製剤化され得る。従来の賦形剤、例えば、ありとあらゆる溶媒、分散媒、希釈剤、または他の液体媒体に加えて、分散剤または懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、保存剤、賦形剤としては、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、コアシェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質、ＲＮＡ治療でトランスフェクトされた細胞（例えば、対象への移植用）、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子模倣物、及びそれらの組み合わせを挙げることができるがこれらに限定されない。
自然発生の真核生物ｍＲＮＡ分子は、これらに限定されないが、５’末端（５’ＵＴＲ）及び／または３’末端（３’ＵＴＲ）での非翻訳領域（ＵＴＲ）を含めた安定化要素を、他の構造的特徴、例えば、５’－キャップ構造または３’－ポリ（Ａ）テールに加えて含むことが分かっている。５’ＵＴＲと３’ＵＴＲはどちらも通常、ゲノムＤＮＡから転写され、未成熟ｍＲＮＡの要素である。成熟型ｍＲＮＡに特有の構造的特徴、例えば、５’－キャップ及び３’－ポリ（Ａ）テールは、通常はｍＲＮＡのプロセシング中に、転写された（未成熟）ｍＲＮＡに付加される。該３’－ポリ（Ａ）テールは通常、転写されたｍＲＮＡの３’末端に付加されたアデニンヌクレオチドのストレッチである。それは、最長約４００個のアデニンヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、該３’－ポリ（Ａ）テールの長さは、個々のｍＲＮＡの安定性に関して必須の要素であり得る。
いくつかの実施形態では、該ＲＮＡ治療は、１つ以上の安定化要素を含み得る。安定化要素は、例えば、ヒストンステムループを含み得る。ステムループ結合タンパク質（ＳＬＢＰ）という３２ｋＤａのタンパク質が特定されている。これは、核及び細胞質の両方におけるヒストンメッセージの３’末端にあるヒストンステムループと関連している。その発現レベルは、細胞周期によって調節され、Ｓ期にピークに達し、このときヒストンｍＲＮＡレベルも上昇する。このタンパク質は、Ｕ７ ｓｎＲＮＰによるヒストンプレｍＲＮＡの効率的な３’末端プロセシングに必須であることが示されている。ＳＬＢＰはプロセシング後も引き続きステムループと会合し、次いで、細胞質中で成熟型ヒストンｍＲＮＡからヒストンタンパク質への翻訳を促進する。ＳＬＢＰのＲＮＡ結合ドメインは、後生動物及び原生動物の全体にわたり保存されており、そのヒストンステムループとの結合は、該ループの構造に依存する。最小結合部位は、該ステムループの５’に少なくとも３ヌクレオチド及び３’に２ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、該ＲＮＡ治療は、コード領域、少なくとも１つのヒストンステムループ、及び任意にポリ（Ａ）配列またはポリアデニル化シグナルを含む。ポリ（Ａ）配列またはポリアデニル化シグナルは、概して、コードされたタンパク質の発現レベルを強化するはずである。コードされたタンパク質は、いくつかの実施形態では、ヒストンタンパク質、レポータータンパク質（例えば、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、β－ガラクトシダーゼ、ＥＧＦＰ）でもなく、マーカーでも選択タンパク質（例えば、アルファ－グロビン、ガラクトキナーゼ、及びキサンチン：グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＧＰＴ））でもない。
いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）配列またはポリアデニル化シグナルと少なくとも１つのヒストンステムループとの組み合わせは、いずれも本来は代替的機構に相当するが、相乗的に作用して、個々の要素のいずれかで観察されるレベルを上回ってタンパク質発現を増加させる。ポリ（Ａ）と少なくとも１つのヒストンステムループとの組み合わせによる相乗効果は、要素の順序またはポリ（Ａ）配列の長さには依存しないことが分かっている。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、直径約１ｎｍ～約１００ｎｍ、例えば、これらに限定されないが、約１ｎｍ～約２０ｎｍ、約１ｎｍ～約３０ｎｍ、約１ｎｍ～約４０ｎｍ、約１ｎｍ～約５０ｎｍ、約１ｎｍ～約６０ｎｍ、約１ｎｍ～約７０ｎｍ、約１ｎｍ～約８０ｎｍ、約１ｎｍ～約９０ｎｍ、約５ｎｍ～約１００ｎｍ、約５ｎｍ～約１０ｎｍ、約５ｎｍ～約２０ｎｍ、約５ｎｍ～約３０ｎｍ、約５ｎｍ～約４０ｎｍ、約５ｎｍ～約５０ｎｍ、約５ｎｍ～約６０ｎｍ、約５ｎｍ～約７０ｎｍ、約５ｎｍ～約８０ｎｍ、約５ｎｍ～約９０ｎｍ、約１０～約２０ｎｍ、約１０～約３０ｎｍ、約１０～約４０ｎｍ、約１０～約５０ｎｍ、約１０～約６０ｎｍ、約１０～約７０ｎｍ、約１０～約８０ｎｍ、約１０～約９０ｎｍ、約２０～約３０ｎｍ、約２０～約４０ｎｍ、約２０～約５０ｎｍ、約２０～約６０ｎｍ、約２０～約７０ｎｍ、約２０～約８０ｎｍ、約２０～約９０ｎｍ、約２０～約１００ｎｍ、約３０～約４０ｎｍ、約３０～約５０ｎｍ、約３０～約６０ｎｍ、約３０～約７０ｎｍ、約３０～約８０ｎｍ、約３０～約９０ｎｍ、約３０～約１００ｎｍ、約４０～約５０ｎｍ、約４０～約６０ｎｍ、約４０～約７０ｎｍ、約４０～約８０ｎｍ、約４０～約９０ｎｍ、約４０～約１００ｎｍ、約５０～約６０ｎｍ、約５０～約７０ｎｍ、約５０～約８０ｎｍ、約５０～約９０ｎｍ、約５０～約１００ｎｍ、約６０～約７０ｎｍ、約６０～約８０ｎｍ、約６０～約９０ｎｍ、約６０～約１００ｎｍ、約７０～約８０ｎｍ、約７０～約９０ｎｍ、約７０～約１００ｎｍ、約８０～約９０ｎｍ、約８０～約１００ｎｍ及び／または約９０～約１００ｎｍを有する脂質ナノ粒子に製剤化され得る。
いくつかの実施形態では、該脂質ナノ粒子は、直径約１０～５００ｎｍを有し得る。１つの実施形態では、該脂質ナノ粒子は、直径１００ｎｍ超、１５０ｎｍ超、２００ｎｍ超、２５０ｎｍ超、３００ｎｍ超、３５０ｎｍ超、４００ｎｍ超、４５０ｎｍ超、５００ｎｍ超、５５０ｎｍ超、６００ｎｍ超、６５０ｎｍ超、７００ｎｍ超、７５０ｎｍ超、８００ｎｍ超、８５０ｎｍ超、９００ｎｍ超、９５０ｎｍ超または１０００ｎｍ超を有し得る。
いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、より小さいＬＮＰを使用して送達され得る。かかる粒子は、直径０．１μｍ未満から１００ｎｍまで、例えば、これらに限定されないが、０．１μｍ未満、１．０μｍ未満、５μｍ未満、１０μｍ未満、１５ｕｍ未満、２０ｕｍ未満、２５ｕｍ未満、３０ｕｍ未満、３５ｕｍ未満、４０ｕｍ未満、５０ｕｍ未満、５５ｕｍ未満、６０ｕｍ未満、６５ｕｍ未満、７０ｕｍ未満、７５ｕｍ未満、８０ｕｍ未満、８５ｕｍ未満、９０ｕｍ未満、９５ｕｍ未満、１００ｕｍ未満、１２５ｕｍ未満、１５０ｕｍ未満、１７５ｕｍ未満、２００ｕｍ未満、２２５ｕｍ未満、２５０ｕｍ未満、２７５ｕｍ未満、３００ｕｍ未満、３２５ｕｍ未満、３５０ｕｍ未満、３７５ｕｍ未満、４００ｕｍ未満、４２５ｕｍ未満、４５０ｕｍ未満、４７５ｕｍ未満、５００ｕｍ未満、５２５ｕｍ未満、５５０ｕｍ未満、５７５ｕｍ未満、６００ｕｍ未満、６２５ｕｍ未満、６５０ｕｍ未満、６７５ｕｍ未満、７００ｕｍ未満、７２５ｕｍ未満、７５０ｕｍ未満、７７５ｕｍ未満、８００ｕｍ未満、８２５ｕｍ未満、８５０ｕｍ未満、８７５ｕｍ未満、９００ｕｍ未満、９２５ｕｍ未満、９５０ｕｍ未満、または９７５ｕｍ未満から構成され得る。
本明細書に記載のナノ粒子及びマイクロ粒子は、マクロファージ及び／または免疫応答を調節するように幾何学的に操作され得る。幾何学的に操作された粒子は、本明細書に記載のポリヌクレオチドを標的化送達、例えば、これに限定されないが、肺送達に組み込むための様々な形状、サイズ及び／または表面電荷を有し得る（例えば、国際公開第ＷＯ２０１３０８２１１１号参照。参照により全体として本明細書に組み込まれる）。該幾何学的に操作された粒子の他の物理的特徴としては、穿孔、傾斜アーム、非対称性及び表面粗さ、細胞及び組織との相互作用を変化させ得る電荷が挙げられ得るがこれらに限定されない。
ＲＮＡ治療は、治療効果のあるアウトカムをもたらす任意の経路で施され得る。これらとしては、皮内、筋肉内、及び／または皮下投与が挙げられるがこれらに限定されない。本開示は、ＲＮＡ治療を必要とする対象に対して、ＲＮＡ治療を施すことを含む方法を提供する。必要とされる正確な量は、当該対象の種、年齢、及び全身状態、疾患の重症度、特定の組成物、その投与方法、その作用様式等に応じて対象ごとに異なる。ＲＮＡ治療組成物は、通常、投与のしやすさ及び用量の均一性のために、単位剤形で製剤化される。しかしながら、ＲＮＡ治療組成物の１日の合計使用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医によって決定され得ることが理解されよう。任意の特定の患者に対する具体的な治療有効用量レベル、予防有効用量レベル、または適切なイメージング用量レベルは、治療される障害及び該障害の重症度、使用される特定の化合物の活性、使用される特定の組成物、患者の年齢、体重、全体の健康状態、性別及び食事、使用される特定の化合物の投与時間、投与経路、及び排泄率、治療の期間、使用される特定の化合物と組み合わせてまたは同時に使用される薬物、ならびに医学分野で周知の同様の因子を含めた様々な因子に依存する。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ治療組成物は、対象の体重の０．０００１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ～０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇ～０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ～０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ～０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ～４０ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ～３０ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ、または１ｍｇ／ｋｇ～２５ｍｇ／ｋｇを１日あたり、１日複数回、１週間あたり、１ヶ月あたり等、送達するのに十分な用量レベルで投与され、所望の治療的、診断的、予防的、またはイメージング効果を得てもよい（例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１３０７８１９９号に記載の単位用量の範囲参照）。該所望の用量は、１日３回、１日２回、１日１回、隔日、３日毎、毎週、２週間毎、３週間毎、４週間毎、２ヶ月毎、３ヶ月毎、６ヶ月毎等に送達され得る。ある特定の実施形態では、該所望の用量は、複数回投与（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４回、またはそれ以上の投与）を使用して送達され得る。複数回投与が採用される場合、分割投与レジメン、例えば、本明細書に記載のものが使用され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ治療組成物は、０．０００５ｍｇ／ｋｇ～０．０１ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．０００５ｍｇ／ｋｇ～約０．００７５ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．０００５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ、約０．００２ｍｇ／ｋｇ、約０．００３ｍｇ／ｋｇ、約０．００４ｍｇ／ｋｇまたは約０．００５ｍｇ／ｋｇを送達するのに十分な用量レベルで投与され得る。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ治療組成物は、０．０２５ｍｇ／ｋｇ～０．２５０ｍｇ／ｋｇ、０．０２５ｍｇ／ｋｇ～０．５００ｍｇ／ｋｇ、０．０２５ｍｇ／ｋｇ～０．７５０ｍｇ／ｋｇ、または０．０２５ｍｇ／ｋｇ～１．０ｍｇ／ｋｇを送達するのに十分な用量レベルで１回または２回（またはそれ以上）投与され得る。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ治療組成物は、合計用量０．０１００ｍｇ、０．０２５ｍｇ、０．０５０ｍｇ、０．０７５ｍｇ、０．１００ｍｇ、０．１２５ｍｇ、０．１５０ｍｇ、０．１７５ｍｇ、０．２００ｍｇ、０．２２５ｍｇ、０．２５０ｍｇ、０．２７５ｍｇ、０．３００ｍｇ、０．３２５ｍｇ、０．３５０ｍｇ、０．３７５ｍｇ、０．４００ｍｇ、０．４２５ｍｇ、０．４５０ｍｇ、０．４７５ｍｇ、０．５００ｍｇ、０．５２５ｍｇ、０．５５０ｍｇ、０．５７５ｍｇ、０．６００ｍｇ、０．６２５ｍｇ、０．６５０ｍｇ、０．６７５ｍｇ、０．７００ｍｇ、０．７２５ｍｇ、０．７５０ｍｇ、０．７７５ｍｇ、０．８００ｍｇ、０．８２５ｍｇ、０．８５０ｍｇ、０．８７５ｍｇ、０．９００ｍｇ、０．９２５ｍｇ、０．９５０ｍｇ、０．９７５ｍｇ、または１．０ｍｇを送達するのに十分な合計用量または用量レベルで、２回（例えば、０日目及び７日目、０日目及び１４日目、０日目及び２１日目、０日目及び２８日目、０日目及び６０日目、０日目及び９０日目、０日目及び１２０日目、０日目及び１５０日目、０日目及び１８０日目、０日目及び３ヶ月後、０日目及び６ヶ月後、０日目及び９ヶ月後、０日目及び１２ヶ月後、０日目及び１８ヶ月後、０日目及び２年後、０日目及び５年後、または０日目及び１０年後）投与され得る。より高い及びより低い用量ならびに投与頻度が本開示に包含される。例えば、ＲＮＡ治療組成物は、３回または４回投与され得る。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ治療組成物は、合計用量０．０１０ｍｇ、０．０２５ｍｇ、０．１００ｍｇまたは０．４００ｍｇを送達するのに十分な合計用量または用量レベルで、２回（例えば、０日目及び７日目、０日目及び１４日目、０日目及び２１日目、０日目及び２８日目、０日目及び６０日目、０日目及び９０日目、０日目及び１２０日目、０日目及び１５０日目、０日目及び１８０日目、０日目及び３ヶ月後、０日目及び６ヶ月後、０日目及び９ヶ月後、０日目及び１２ヶ月後、０日目及び１８ヶ月後、０日目及び２年後、０日目及び５年後、または０日目及び１０年後）投与され得る。
いくつかの実施形態では、対象の治療方法における使用のためのＲＮＡは、該対象に対して、１０μｇ／ｋｇ～４００μｇ／ｋｇの核酸治療の単回用量で、該対象を治療するのに有効な量投与される。いくつかの実施形態では、対象の治療方法における使用のためのＲＮＡ治療は、該対象に対して、１０μｇ～４００μｇの該核酸治療の単回用量で、該対象を治療するのに有効な量投与される。
本明細書に記載のＲＮＡ医薬組成物は、本明細書に記載の剤形、例えば、鼻腔内、気管内、または注射用（例えば、静脈内、眼内、硝子体内、筋肉内、皮内、心臓内、腹腔内、及び皮下）に製剤化され得る。
本開示は、その適用において、以下の説明に記載されるまたは図面に例示される構成の詳細にも構成要素の配置にも限定されるものではない。本開示は、他の実施形態が可能であり、様々な方法で実践することまたは行うことができる。また、本明細書で使用される表現及び用語は、説明を目的としており、限定的なものと見なされるべきではない。本明細書における「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、または「有する」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」及びこれらの変形の使用は、その後に列挙される項目及びそれらの均等物ならびに追加の項目を包含することを意味する。
実施例１：Ｐ１＋３ＣＤ ｍＲＮＡは、適切なＰ１プロセシングをインビトロで実証する
Ｐ１及び３ＣＤをコードするｍＲＮＡが、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を十分に産生するかどうかを調べるために、インビトロアッセイを以下の通りに行った。一方がヒトライノウイルス（ＨＲＶ）－Ａ１６ Ｐ１をコードし、他方がＨＲＶ－Ａ１６ ３ＣＤプロテアーゼをコードする２つのｍＲＮＡを細胞に共トランスフェクトし、ｉ）Ｐ１が発現するかどうか、ｉｉ）３ＣＤが発現するかどうか及び細胞内でＰ１の構成要素のＶＰタンパク質への切断を触媒することができるかどうか、ならびにｉｉｉ）３ＣＤによる細胞毒性を最小限に抑えながら、より効率的なＰ１の切断を促進する最適なＰ１：３ＣＤ比のｍＲＮＡが存在するかどうかを判断した。図２Ａでは、トランスフェクトするＰ１ ｍＲＮＡの量を２μｇで一定に保ち、示されたモル比のＰ１：３ＣＤを与えるように３ＣＤ ｍＲＮＡの量を増加させて共トランスフェクトした。ウェスタンブロットでは、細胞溶解物を、ＶＰ０及び未切断Ｐ１も認識する抗ＨＲＶ－Ａ１６ ＶＰ２抗体でブロットした。試験した量のいずれかで３ＣＤ ｍＲＮＡをトランスフェクションすることにより、細胞内でＰ１の切断が生じた。３ＣＤの量が増加すると、未切断Ｐ１を表す高分子量のバンドがより明確に消失し、個々のタンパク質（ＶＰ２）及びより小さいポリタンパク質（ＶＰ０）の低分子量のバンドの量が大幅に増加した。これらのバンドは、精製された野生型ＨＲＶ－Ａ１６ビリオンから調製された溶解物中に見られるバンドとサイズが一致し、おそらくは、最大から最小へ、ＶＰ０～ＶＰ３前駆体、ＶＰ０及びＶＰ２を表す（図２Ａ）。
３ＣＤ ｍＲＮＡの形でのタンパク質分解性３Ｃをコードするポリタンパク質を任意の量でトランスフェクションすることにより、明らかなＰ１の切断がもたらされたが、量を増やすと、Ｐ１からＶＰ０への「変換」が大きくなり、最大量では、サイズがＶＰ２に対応するバンドが出現した。しかしながら、大量の３ＣＤ ｍＲＮＡは同時に用量依存的に細胞毒性を増加させ、１：１比のＰ１：３ＣＤが最も高い細胞毒性を示した。３Ｃの過剰な細胞毒性の可能性を回避するために、３Ｃの代わりにポリタンパク質３ＣＤを使用した。
実施例２：Ｐ１＋３ＣＤの共発現によりウイルス様粒子が産生される
Ｐ１と３ＣＤの共発現がＶＬＰを産生するのに十分であるかどうかをさらに評価するために、それぞれ、ＨＲＶ－Ａ１６ Ｐ１及びＨＲＶ－Ａ１６ ３ＣＤをコードする２つのＤＮＡプラスミドを使用して大規模なトランスフェクション及び精製実験を行った。３ＣＤによる細胞毒性に起因する細胞死を遅らせることでＶＬＰ収量を増加させる可能性を目的として、４部のＰ１対１部の３ＣＤの質量比でプラスミドをトランスフェクトした。ＶＬＰを、ＰＥＧ沈殿とそれに続くサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、トランスフェクトした細胞の上清から精製した。ネガティブ染色透過型電子顕微鏡により、ライノウイルスビリオンに予想されるサイズの均一な粒子（直径約３０ナノメートル）が明らかになった（図２Ｂ）。これらのデータは、Ｐ１と３ＣＤの共発現により、Ｐ１の適切なプロセシングと、細胞外空間に放出され、形態学的に野生型ビリオンに似たウイルス様粒子への個々のＶＰタンパク質の組織化の両方がもたらされることを示している。
実施例３：Ｐ１＋３ＣＤ ｍＲＮＡを含むワクチンはマウスにおいて中和抗体力価を生成する
２つのポリタンパク質をコードするｍＲＮＡであるＰ１＋３ＣＤ ｍＲＮＡの投与が、免疫原性のＶＬＰの形成をもたらすことができるかどうか、及びＨＲＶＡ－１６中和抗体の産生をもたらすことができるかどうかを調べるために、インビボアッセイを以下の通りに行った。マウスに、１０μｇのＰ１ ｍＲＮＡと、毒性への懸念から、最終的なＰ１：３ＣＤモル比１０：１及び２：１をもたらす２つの異なる量の３ＣＤ ｍＲＮＡからなるプライムブーストワクチンレジメンを投与した。図２Ｃは、最初のワクチン接種の３週間後（投与１後）及びブーストの２週間後（投与２後）のＨＲＶ－Ａ１６中和抗体力価を示す。１０：１比と２：１比はどちらも検出可能な中和力価をもたらしたが、２：１比の単回投与により、１０：１比での２回投与よりも高い力価が得られた。生ＨＲＶ－Ａ１６を２回注射したコットンラットの血清をベンチマーク対照として含めた。驚くべきことに、Ｐ１：３ＣＤ ２：１比の組み合わせを２回注射すると、コットンラットにＩＭ投与した複製ＨＲＶ－Ａ１６を２回投与するよりも、マウスにおいてより高い中和力価が得られた。１０：１比または２：１比の投与後の有害事象はマウスでは観察されず、インビトロで３ＣＤ ｍＲＮＡのトランスフェクション後に見られた細胞毒性は、インビボでの影響を必ずしも予測するわけではないことが示唆された。
実施例４：Ｐ１＋３ＣＤ ｍＲＮＡはエンテロウイルス属内の他の種に対して免疫原性を示す
実施例２のＨＲＶ－Ａ１６に使用したアプローチに従って、一方が他方のタンパク質に対する酵素活性を有する２つのポリタンパク質であるＰ１及び３ＣＤをコードするｍＲＮＡを、エンテロウイルスＤ６８（ＥＶ－Ｄ６８）単離株ＵＳ／ＭＯ／１４－１８９５０から生成した。この分離株は、２０１４年に米国でＥＶ－Ｄ６８が流行した際にミズーリ州のヒト患者から収集されたものであり、クレードＢ１分離株である。この試験では、マウスに拡大されたＰ１：３Ｄ比のセットをワクチン接種した。Ｐ１ ｍＲＮＡの量を１０μｇで一定に保ち、３ＣＤ ｍＲＮＡの量を増加させて最終Ｐ１：３ＣＤモル比１０：１、５：１、２：１及び１：１を与えるように加えた。ワクチン接種は、ＨＲＶ－Ａ１６に使用したのと同じ２回投与スケジュールに従った。ブーストの２週間後に血清を収集し、群ごとにプールし、異なるクレードＢ１分離株（ＵＳ／ＭＯ／１４－１８９４７）及びクレードＡ２分離株（ＵＳ／ＫＹ／１４－１８９５３）の中和について調べた。分離株ごとに、中和力価は調べた４つのすべての比で同様であった（図２Ｄ）。中和力価は、クレードＢ１分離株ＭＯ／１４－１８９４７の方が約１対数高かった。Ｐ１ ｍＲＮＡの配列も２０１４年のミズーリ州のクレードＢ１分離株に由来しており、高度な配列相同性を共有しているため、これは予想されていた。しかしながら、より多様なクレードＡ２分離株に対しても、強力な中和力価が生成された。これは、ＥＶ－Ｄ６８の場合、単一のＰ１ ｍＲＮＡによるワクチン接種により、クレード全体で有効な中和抗体が生成されることを示唆している。この結果は、Ｐ１基質が異なるウイルス分離株及び種に由来する場合でもプロテアーゼが機能できることも示している。
これら２つの試験のデータを総合すると、ＬＮＰ中のポリタンパク質Ｐ１＋３ＣＤ ｍＲＮＡを、２部のＰ１対１部の３ＣＤのモル比で投与することが、高度に免疫原性であり、得られるＶＬＰに中和抗体を引き起こすのに効果的であることが示唆される。
より低用量で（２：１モル比を維持しながら）送達した場合のこのＰ１＋３ＣＤの組み合わせの有効性をさらに調べるために、エンテロウイルス種の拡大群にわたって用量範囲試験を行った。表１は、標的となるピコルナウイルスの種及び遺伝子型、Ｐ１及び３ＣＤ ｍＲＮＡの配列の設計に使用した分離株、マウスに投与される全ｍＲＮＡ（Ｐ１＋３ＣＤ）の用量、ならびに用量内のＰ１ ｍＲＮＡのそれぞれの量を示す。この用量範囲試験では、ｍＲＮＡを５倍希釈系列で希釈し、少なくとも３つの用量を調べた。
ワクチン接種スケジュールは以前の試験と同じであった。マウスに、１日目及び２２日目にワクチン接種し、投与１の３週間後（２１日目）及び投与２の２週間後（３５日目）に血清を収集した。投与２後の血清を、対応する中和アッセイで中和抗体力価について試験した。ＨＲＶ－Ａ１６及びＨＲＶ－Ｂ１４については、中和アッセイで使用したウイルスは、それぞれのＰ１及び３ＣＤ ｍＲＮＡに使用したウイルス配列と同一であった。ＥＶ－Ｄ６８及びＥＶ－Ａ７１については、ワクチン接種マウスの血清を、異なるクレードを代表する２つ以上の異種分離株にわたる中和について調べた。
図３Ａ～３Ｄは、２回目のワクチン接種後２週間（３５日目）の中和抗体力価を示す。図３Ａは、ＨＲＶ－Ａ１６ Ｐ１：３ＣＤでワクチン接種された動物の中和抗体力価を示す。動物には、５μｇ～０．０４μｇのＨＲＶ－Ａ１６ Ｐ１ ｍＲＮＡと、Ｐ１と３ＣＤの２：１比を維持するための対応する量のＨＲＶ－Ａ１６ ３ＣＤ ｍＲＮＡを投与した。高度免疫モルモットからの市販のＨＲＶ－Ａ１６抗血清を、ベンチマーク対照として含めた。調べたすべての用量ですべての動物が、アッセイの検出下限を超える中和抗体力価を生成し、力価は用量依存性を示した。どの用量もモルモットの高度免疫抗血清の力価と同等またはそれを超える力価には至らなかったが、５μｇの用量では、複製ＨＲＶ－Ａ１６を２回投与したコットンラットで生じた力価よりも高い力価が得られた（図２Ｃ）。
図３Ｂは、ＨＲＶ－Ｂ１４ Ｐ１：３ＣＤでワクチン接種された動物の中和抗体力価を示す。動物には、５μｇ～０．２μｇの用量のＨＲＶ－Ｂ１４ Ｐ１ ｍＲＮＡと、２：１比を維持するための対応する量のＨＲＶ－Ｂ１４ ３ＣＤ ｍＲＮＡを投与した。高度免疫モルモットからの市販のＨＲＶ－Ｂ１４抗血清を、ベンチマーク対照として含めた。驚くべきことに、ここでＨＲＶ－Ｂ１４について試験した３つの用量はすべて、同様のレベルの中和抗体をもたらし、すべての用量の幾何平均力価（ＧＭＴ）は、モルモットの高度免疫ＨＲＶ－Ｂ１４抗血清の力価を上回った。
図３Ｃでは、動物にＥＶ－Ｄ６８ Ｐ１＋３ＣＤ ｍＲＮＡで、５μｇ～０．２μｇの用量のＰ１ ｍＲＮＡを使用してワクチン接種した。これらの動物の血清を、クレードＢ１及びＡ２からの異種ＥＶ－Ｄ６８分離株の中和について調べた。
図３Ｄでは、動物にＥＶ－Ａ７１ Ｐ１＋３ＣＤ ｍＲＮＡで、５μｇ～０．２μｇの用量のＰ１ ｍＲＮＡを使用してワクチン接種した。これらの動物の血清を、ＥＶ－Ａ７１の異種遺伝子型の中和について調べた。ウイルスＵＳＡ／２０１８－２３０９２は、急性弛緩性脊髄炎（ＡＦＭ）患者の便から回収された臨床分離株である。
効果的なヒトライノウイルスワクチンは、３つのライノウイルスＡ、Ｂ、及びＣの各ライノウイルス種内の複数の血清型に対する保護を提供するはずである。Ｐ１の高い種内配列多様性を考慮すると、たとえ単一の種でも適切にカバーするには、多くの異なるＰ１ ｍＲＮＡが必要になる可能性がある。しかしながら、Ｐ１とは対照的に、３ＣＤプロテアーゼのアミノ酸配列は、種内の血清型間でよく保存されており、３つの種にわたって保存されている程度は低い。ライノウイルスＡ種の７９血清型及びライノウイルスＢ種の２６血清型の３ＣＤプロテアーゼの３Ｃ領域のコンセンサスアミノ酸配列を示すアラインメントは、Ｐ１結合部位の４Å以内の残基がＨＲＶ－ＡとＨＲＶ－Ｂの間で高度に保存されていること、及び５つの部位がＨＲＶ－ＡとＨＲＶ－Ｂの間で異なり、これらの部位のうち２つはＨＲＶ－Ｂ内で異なることを示している。これらの推定結合残基は、ライノウイルスＡとライノウイルスＢ内で高度に保存されており、場合によってはライノウイルスＡとライノウイルスＢ間で高度に保存されている。かかるアラインメントは、ＶＰ２－ＶＰ３切断部位（Ｑ－Ｇ－Ｌ－Ｐ）及びＶＰ３のＮ末端がＨＲＶ－ＡとＨＲＶ－Ｂの両方の間で高度に保存されていることをさらに示す。対照的に、ＶＰ３／ＶＰ１の切断部位及び末端は、ＨＲＶ－ＡとＨＲＶ－Ｂの間で異なるが、群内では保存されており、それぞれ、ＨＲＶ－ＡのＱ／Ｎ－Ｐ－［ＩＶ］－ＥとＨＲＶ－ＢのＡ－Ｌ－［ＥＭＰＴ］－Ｅ／Ｇ－［ＦＬ］のアミノ酸残基が保存されている。３ＣＤプロテアーゼはＰ１に結合し、ＶＰ２－ＶＰ３間、及びＶＰ３－ＶＰ１間の２つの場所でＰ１を切断する。これらの切断部位及びその周囲のＰ１アミノ酸配列を比較すると、配列が保存されている証拠が存在する。ＶＰ３－ＶＰ１切断部位領域は、種内の血清型間での保存を示すが、ＶＰ２－ＶＰ３切断部位は、ライノウイルスＡ種とライノウイルスＢ種間で高度な配列相同性を有する。
実施例５：［Ｐ１Ｂ１４＋３ＣＤＡ１６］の組み合わせは、［Ｐ１＋３ＣＤ］Ｂ１４の「一致した」組み合わせと同様のインビトロでのＰ１プロセシング及びインビボでの免疫原性を実証した
３ＣＤプロテアーゼのＰ１結合部位とＰ１自体の切断部位領域の両方における配列の保存は、「一致する」３ＣＤ ｍＲＮＡが各Ｐ１ ｍＲＮＡに提供される必要がない可能性があることを示唆している。また、単一の３ＣＤプロテアーゼが、種内の多くの血清型、または２つの異なる種の血清型にまたがるＰ１タンパク質をＶＬＰにプロセシングすることができる可能性があることも示唆される。［Ｐ１Ｂ１４＋３ＣＤＡ１６］の組み合わせが、以前に使用された［Ｐ１＋３ＣＤ］Ｂ１４の「一致した」組み合わせと同様のＰ１プロセシングをインビトロで示すかどうかを調べるために、インビトロアッセイを以下の通りに行った。Ｐ１Ａ１６及びＰ１Ｂ１４ ｍＲＮＡを、単独で、または示された３ＣＤ ｍＲＮＡとモル比２：１で組み合わせて、細胞にトランスフェクトした。細胞溶解物を汎ライノウイルス抗ＶＰ１抗体でブロットした。矢印は、切断されていないＰ１前駆体タンパク質及びＶＰ１に対応する低分子量バンドを示す（図４Ａ）。Ｐ１Ｂ１４の場合、３ＣＤＡ１６または３ＣＤＢ１４ ｍＲＮＡのいずれかを追加すると、Ｐ１バンドが消失し、ＶＰ１が出現する。ＶＰ１バンドの強度は、「一致した」３ＣＤＢ１４ ｍＲＮＡを使用するとＰ１切断がより効率的である可能性が高いことを示しているが、異種３ＣＤＡ１６プロテアーゼは依然としてＰ１Ｂ１４を構成要素のＶＰタンパク質にプロセシングすることが可能である。
［Ｐ１Ｂ１４＋３ＣＤＡ１６］の組み合わせが、以前に使用された［Ｐ１＋３ＣＤ］Ｂ１４の「一致した」組み合わせと同様の免疫原性をインビボで示すかどうかを調べるために、インビボアッセイを以下の通りに行った。マウスに、［Ｐ１＋３ＣＤ］Ａ１６ ｍＲＮＡ、または［Ｐ１Ｂ１４＋３ＣＤＡ１６］の混合組み合わせを２：１モル比のＰ１：３ＣＤ ｍＲＮＡ（２．５μｇのＰ１＋０．９４μｇの３ＣＤ）でワクチン接種した。ＶＬＰは、Ｐ１前駆体タンパク質のプロセシングとその後の成熟に由来するＶＰタンパク質のみから構成されるため、中和抗体応答の血清型特異性は、３ＣＤ配列ではなくＰ１配列によってのみ決定される。したがって、一致した［Ｐ１＋３ＣＤ］Ａ１６の組み合わせを、ＨＲＶ－Ａ１６の中和について調べ、一方、混合の［Ｐ１Ｂ１４＋３ＣＤＡ１６］の組み合わせを、ＨＲＶ－Ｂ１４の中和について調べた。図４Ｂは、ウイルスごとの市販の高度免疫抗血清をベンチマーク対照として含めた、それぞれの組み合わせの中和抗体力価を示す。予想どおり、［Ｐ１＋３ＣＤ］Ａ１６によるワクチン接種により、高いＨＲＶ－Ａ１６中和抗体力価が得られた。この群のＧＭＴ（２．５μｇのＰ１、ＧＭＴ＝１３０２４）は、図２ＡのＨＲＶ－Ａ１６の用量範囲試験の５μｇのＰ１及び１μｇのＰ１の用量群のＧＭＴに対応する（それぞれ、ＧＭＴ＝１８５４９、ＧＭＴ＝４１９８）。混合の［Ｐ１Ｂ１４＋３ＣＤＡ１６］の組み合わせによるワクチン接種でも、ＨＲＶ－Ｂ１４の中和抗体が産生されたが、一致した［Ｐ１＋３ＣＤ］Ｂ１４で見られるほどではなかった。２．５μｇのＨＲＶ－Ｂ１４ Ｐ１ ｍＲＮＡを投与された混合群のＧＭＴは２５３であった。対照的に、５、１、及び０．２μｇのＨＲＶ－Ｂ１４ Ｐ１ ｍＲＮＡを投与された群のＧＭＴは、それぞれ、１６１７、１５５４及び１５８２であった（図２Ｂ）。これは、「一致した」［Ｐ１＋３ＣＤ］Ｂ１４の組み合わせが、１／１０未満の用量であっても、混合の［Ｐ１Ｂ１４＋３ＣＤＡ１６］の組み合わせよりも効果的であることを示している。この損失は、図４Ａで見られるＰ１Ｂ１４のプロセシングの低下、またはなんらかの未知の下流効果、例えば、ＶＬＰの組織化の低下に起因する可能性がある。しかしながら、ＨＲＶ－Ａ１６ ３ＣＤを使用しても、ＨＲＶ－Ｂ１４中和抗体の産生が完全に阻止されなかったことは有望である。ライノウイルスＡ血清型の３ＣＤが、程度は低いものの、ライノウイルスＢ血清型のＰ１によって機能することができる場合、種内のすべての血清型をカバーするには、最小限の３ＣＤ配列、またはおそらくは投与されるＣＤ配列の慎重な選択が必要になる可能性が高くなる。ライノウイルスワクチンに含める必要がある可能性が高い大量のＰ１配列を考慮すると、各Ｐ１ ｍＲＮＡに「一致した」個々の３ＣＤ ｍＲＮＡではなく、いくつかの代表的またはコンセンサス３ＣＤ配列を含めることができれば非常に有用である。
実施例６：ＨＲＶ－Ａ１６ Ｐ１＋３ＣＤ ｍＲＮＡワクチン接種により、コットンラットＨＲＶ接種モデルにおいて感染からの保護がもたらされる
Ｐ１＋３ＣＤ ｍＲＮＡの組み合わせが、感染からの保護をもたらすことができるかどうかを調べるため、ＨＲＶ－Ａ１６ Ｐ１＋３ＣＤ ｍＲＮＡのワクチン接種の効果を、コットンラットのＨＲＶ接種モデルにおいて以下の通りに試験した。動物を、１日目及び２２日目に、ＨＲＶ－Ａ１６ Ｐ１／３ＣＤ ｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤の量を減らしてＩＭで免疫した。陽性対照として、１つの動物群に、同じスケジュールに従って、生複製ＨＲＶ－Ａ１６ウイルスの２回のＩＭ注射を行った。陰性対照群にはＰＢＳを投与した。３５日目に、動物に生ＨＲＶ－Ａ１６ウイルスを鼻腔内投与で接種した。接種から８時間後、肺及び鼻を採取し、ホモジナイズしてウイルス量を計算した。循環中和抗体レベルを測定するため、接種の直前に血清を収集した。Ｐ１／３ＣＤ ＬＮＰをコードするｍＲＮＡによるワクチン接種は、中和抗体の用量依存的な誘導をもたらし（図５Ａ）、２５μｇ及び５μｇ群の一部の動物は、生ＨＲＶ－Ａ１６を投与された動物のものに近い、またはそれを超える力価を有していた。３つの高用量のＰ１／３ＣＤごとに、検出可能な力価を示さなかった動物が各群に１匹存在し、最低用量群（０．２μｇ）の動物はいずれも、検出可能な力価を有さなかった。動物はまた、肺及び鼻のウイルス量の用量依存的な減少を示した。２５μｇ及び５μｇの群では、それぞれ、４／５及び３／５の動物が、肺組織の完全な保護を示した（図５Ｂ）。２５μｇ投与群の全動物、ならびに５μｇ及び１μｇ群の動物の２／５は、鼻組織の完全な保護を示した（図５Ｃ）。０．２μｇ用量群の動物は保護を示さず、肺及び鼻のウイルス量は、ＰＢＳ陰性対照群と同等であった。さらに、２５μｇを投与されたすべての動物、ならびにそれぞれ、５μｇまたは１μｇを投与された動物の４／５及び３／５において、肺のウイルスＲＮＡレベルの大幅な低下が検出された（図５Ｄ）。
図６は、各エンドポイントアッセイについて動物ごとに生成されたデータを含む。これらの結果は、ＨＲＶ－Ａ１６ Ｐ１＋３ＣＤ ｍＲＮＡによるワクチン接種が、ＨＲＶ－Ａ１６感染からの用量依存的な保護をもたらすこと、及び２５μｇの用量で達成される保護のレベルが、２回の複製ウイルスの注射で生じるものとほぼ同じであることを実証する。

さらなる材料及び方法
トランスフェクション及び免疫ブロッティング
Ｍｉｒｕｓ Ｔｒａｎｓ－Ｉｔトランスフェクションキットを使用して、２９３Ｔ細胞にｍＲＮＡをトランスフェクトした。細胞を２μｇのＰ１ ｍＲＮＡ及び示された量の３ＣＤ ｍＲＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションの約１６～２４時間後に細胞を回収し、ＲＩＰＡ緩衝液で溶解した。溶解物のタンパク質濃度をＢＣＡアッセイで定量し、還元剤（２５μｇ／レーン）とともに４～２０％ポリアクリルアミドゲルで泳動させ、ニトロセルロース膜に転写し、１μｇ／ｍｌ希釈の一次抗体で終夜ブロットした。使用した一次抗体は、マウス抗ＨＲＶ－Ａ１６ ＶＰ２及びウサギ抗汎ＨＲＶ ＶＰ１であった。ＨＲＰ結合抗マウス及び抗ウサギ二次抗体を１：１０，０００希釈で使用した。シグナルを、ＥＣＬ Ｐｒｉｍｅ検出試薬を使用して検出した。ＧＡＰＤＨの検出には、ローダミン結合抗ＧＡＰＤＨ Ｆａｂを使用した。
ウイルス様粒子の産生、精製及びイメージング
ＨＲＶ－Ａ１６ Ｐ１及び３ＣＤをコードするプラスミドを、Ｔｕｒｂｏ２９３トランスフェクション試薬（Ｓｐｅｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、Ｐ１と３ＣＤプラスミドの質量比４：１で３ｅ６／ｍＬの密度でＨＥＫ－２９３ｅｘｐｉ細胞に共トランスフェクトする。６日後、細胞培養上清を回収し（細胞ペレットは廃棄）、ＰＥＧ－６０００及び塩化ナトリウムをそれぞれ、最終濃度７％（ｗ／ｖ）及び２％（ｗ／ｖ）になるまで加える。ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）沈殿は、撹拌しながら４℃で１８時間行い、その後９，５００Ｋ、４℃で３０分間遠心分離する。その上清を廃棄し、沈殿を５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０（塩化ナトリウムを含まない）に再懸濁する。再懸濁した溶液を０．４５ｕｍのフィルターに通し、大きな破片を除去する。次いで、サンプルを、陰イオン交換クロマトグラフィーのため、Ａｋｔａ Ｐｕｒｅ（Ｃｙｔｉｖａ）のＨｉＴｒａｐ Ｑ（Ｃｙｔｉｖａ）カラムにロードする。ＨｉＴｒａｐ Ｑカラムに結合したＨＲＶ ＶＬＰを第一に、０．１Ｍの塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液ｐＨ７．０で洗浄して不純物を除去し、続いて０．２Ｍの塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液ｐＨ７．０を使用して溶出する。溶出したＨＲＶ ＶＬＰサンプルを使用して、ｎａｎｏ－Ｗネガティブ染色（Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ）で電子顕微鏡グリッドを調製し、Ｔｅｃｎａｉ Ｔ１２電子顕微鏡を使用して画像化する。
ワクチン接種及びインビボ試験
ワクチン接種の約１６時間前に、製剤化されたＰ１及び３ＣＤ製品を混合し、ＰＢＳで希釈して、所望のＰ１：３ＣＤ比及び最終ｍＲＮＡ濃度を得た。雌の８週齢のＢａｌｂ／ｃマウスに、１日目及び２２日目にワクチン接種した（５０μｌ注射量、ＩＭ）。最初の注射から３週間後（２１日目）、及び２回目の注射から２週間後（３５日目）に血清を採取した。３５日目の血清採取後にマウスをサクリファイスした。
中和アッセイ
ウイルス分離株及び滴定：ウイルスＨＲＶ－Ａ１６、ＨＲＶ－Ｂ１４、ＥＶ－Ｄ６８分離株ＵＳ／ＭＯ／１４－１８９４７、ＥＶ－Ｄ６８分離株ＵＳ／ＫＹ／１４－１８９５３は、ＡＴＣＣから購入した。ＥＶ－Ａ７１分離株ＵＳＡ／２０１８－２３０９２及びＴａｉｎａｎ／４６４３／１９９８は、ＢＥＩ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓから入手した。ウイルス力価を、終末点希釈によって測定し、リード・ミュンヒ統計法を使用して計算した。ＨＲＶ－Ａ１６及びＨＲＶ－Ｂ１４のストックをＭＲＣ－５細胞で力価測定し、ＥＶ－Ｄ６８及びＥＶ－Ａ７１分離株のストックをＲＤ細胞で力価測定した。各ウイルスストックのＴＣＩＤ５０を、感染から５日後に顕微鏡で細胞変性効果（ＣＰＥ）について細胞をスコアリングすることによって計算した。
ライノウイルス中和アッセイ：ＭＲＣ－５細胞を４８ウェルプレートに２ｘ１０４細胞／ウェルでプレーティングし、ウェルが約９０％コンフルエントに達するまで（通常、プレーティング後７日）ＭＥＭでインキュベートした。ワクチン接種したマウスの血清を５６℃で３０分間インキュベートして補体を不活化し、次いで６回希釈系列で４倍に希釈した。希釈した血清を１００ＴＣＩＤ５０のウイルスと１：２で混合し、最終体積１００μｌの血清＋ウイルスを得た。中和を可能にするために、血清＋ウイルスを３３℃で３時間インキュベートし、その間に培地を４８ウェルプレートから吸引し、３００μｌの新鮮なＭＥＭと交換した。３時間の中和後、血清＋ウイルスをプレートに添加した。最終体積は４００μｌ／ウェルであった。プレートを３３℃に配した。５日後、プレートを取り出し、顕微鏡でウェルのＣＰＥを記録した。各希釈は、８つの複製ウェルを含んでいた。その中和抗体力価（ＩＣ５０として報告）を、リード・ミュンヒ法を使用して計算した。
ＥＶ－Ｄ６８及びＥＶ－Ａ７１中和アッセイ：ＥＶ－Ｄ６８中和に関しては、ＲＤ細胞を９６ウェルプレートに、１００μｌのＤＭＥＭ中１０４細胞／ウェルにてプレーティングし、プレーティングの４８時間後、中和アッセイに使用した。ＥＶ－Ａ７１中和に関しては、Ｖｅｒｏ細胞を９６ウェルプレートに、１００μｌのＤＭＥＭ中１．５ｘ１０４細胞／ウェルにてプレーティングし、翌日、中和アッセイに使用した。ＲＤ細胞を、９６ウェルプレートに、１００μｌのＤＭＥＭ中１０４細胞／ウェルにてプレーティングした。プレーティングから４８時間後、ワクチン接種マウスからの熱不活化血清を６回希釈系列で４倍に希釈した。希釈した血清を１００ＴＣＩＤ５０のウイルスと１：２で混合し、最終体積１００μｌの血清＋ウイルスを得た。中和を可能にするために、血清＋ウイルスを、ＥＶ－Ｄ６８については３３’Ｃで、ＥＶ－Ａ７１については３７’Ｃで３時間インキュベートした。３時間のインキュベーション後、血清＋ウイルスをプレートに添加した。ウェルあたりの最終体積は２００μｌであった。エッジ効果を避けるために、内側の６０ウェルのみを使用した。外側の３６ウェルをＤＭＥＭで最終体積２００μｌまで増加させた。ＥＶ－Ｄ６８中和プレートを３３℃、ＥＶ－Ａ７１中和プレートを３７’Ｃに配した。５日後、プレートを取り出し、顕微鏡でウェルのＣＰＥを記録した。各希釈は、１０個の複製ウェルを含んでいた。その中和抗体力価（ＩＣ５０として報告）を、リード・ミュンヒ法を使用して計算した。
抗血清：ＨＲＶ－Ａ１６及びＨＲＶ－Ｂ１４に対するモルモットの高度免疫抗血清は、ＡＴＣＣから購入した。コットンラットのＨＲＶ－Ａ１６抗血清は、１０匹の雌コットンラットに１０５ＰＦＵの複製ＨＲＶ－Ａ１６を１日目及び２２日目に注射し、３５日目にワクチン接種動物から血清を収集してプールすることによって生成した。抗血清を５６℃で３０分間加熱処理して補体を不活化した。抗血清を希釈し、上記のように中和アッセイを行った。
コットンラットのＨＲＶ－Ａ１６接種試験
動物：４０（３６）匹の近交系、４～６週齢のＳｉｇｍｏｄｏｎ ｈｉｓｐｉｄｕｓ雌コットンラット（出典：Ｓｉｇｍｏｖｉｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ ＭＤ）を、国立衛生研究所のガイドライン及びＳｉｇｍｏｖｉｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの承認された動物事件プロトコル（ＩＡＣＵＣプロトコル＃２）に従って、獣医師の監督下で維持及び処理した。コットンラットを透明なポリカーボネートケージに収容し、標準的なげっ歯類の餌（Ｈａｒｌａｎ＃７００４）及び水道水を自由に与えた。
接種ウイルス：ヒトライノウイルス１６型（ＨＲＶ１６）（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を、欠陥のある干渉粒子を減らすための連続プラーク精製後、ＨｅＬａ Ｏｈｉｏ細胞で増殖させた。ウイルスストックをさらに精製するためにクロロホルム抽出した。約１．０ｘ１０８ｐｆｕ／ｍＬを含むＨＲＶ１６ ｐ５と呼ばれるウイルスのプールをこのインビボ実験に使用した。このウイルスのストックは、－８０℃の条件下で保存されており、コットンラットモデルでインビボで特性評価され、上気道及び下気道での複製が検証されている。
肺及び鼻のＨＲＶ１６ウイルス力価測定：肺及び鼻のホモジネートを遠心分離によって清澄化し、感染培地（ＥＭＥＭ、グルタミン、ピルビン酸、Ｎａ－重炭酸塩、Ｈｅｐｅｓ）で希釈した（肺、１／１０～１／１００希釈、鼻、ニート～１／１０希釈）。コンフルエントなＨｅｌａ Ｈ１単層を、２連で、ウェルあたり１００μｌで、第一の希釈から始め、その後希釈したホモジネートにより、６ウェルプレートで感染させる。５％ＣＯ２のインキュベーター内で、３３℃で１時間インキュベートした後、ウェルを０．７５％メチルセルロース培地で覆い、プレートを３３℃のインキュベーターに戻す。５日間のインキュベーション後、その覆いを除去し、細胞を０．１％クリスタルバイオレット染色液で１時間固定し、その後すすぎ、風乾する。プラークを計数し、ウイルス力価を組織１グラムあたりのプラーク形成単位として表す。群のウイルス力価を、所定の時点におけるその群内のすべての動物の幾何平均±標準誤差として計算する。
ＨＲＶ１６中和抗体アッセイ：血清サンプルを感染培地で１：１０に希釈し、さらに１：２に連続希釈する。希釈した血清サンプルをＨＲＶ１６（１０３ＴＣＩＤ５０）とともに５％ＣＯ２のインキュベーターにて、３３℃で２時間インキュベートする。ウイルス－抗体複合体を、９６ウェルプレート内のコンフルエントなＨｅｌａ Ｈ１細胞に移す。５日間のインキュベーション後、細胞を０．１％クリスタルバイオレットで１時間固定及び染色し、その後すすぎ、風乾する。中和抗体力価を、リード・ミュンヒ法によって、細胞単層を完全に保護するカットオフ希釈を特定することにより測定する。
リアルタイムＰＣＲウイルスＲＮＡ：ＲＮｅａｓｙ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、ホモジナイズした肺組織から全ＲＮＡを抽出する。ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ逆転写キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ｃＤＮＡを調製するために１μｇの全ＲＮＡを使用する。リアルタイムＰＣＲ反応では、ＱｕａｎｔｉＦａｓｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）を最終体積２５μｌ、最終プライマー濃度０．５μＭで使用する。反応は、９６ウェルトレイにセットアップする。増幅は、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ｉＣｙｃｌｅｒにて、９５℃で３分間を１サイクル、続いて９５℃で１０秒間、６０℃で１０秒間、及び７２℃で１５秒間を４０サイクル行う。ベースラインサイクル及びサイクル閾値（Ｃｔ）は、ｉＱ５ソフトウェアにより、ＰＣＲ Ｂａｓｅ Ｌｉｎｅ Ｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ Ｃｕｒｖｅ Ｆｉｔモードで計算される。ＤＮＡの相対定量をすべてのサンプルに適用する。標準曲線は、目的の転写産物が最も多く含まれる段階希釈ｃＤＮＡサンプル（例えば、ウイルス転写産物ｑＰＣＲについてはＨＲＶ１６感染日８時間からの肺）を使用して展開する。Ｃｔ値は、ｌｏｇ１０ｃＤＮＡ希釈倍率に対してプロットされる。これらの曲線は、様々なサンプルで得られたＣｔ値を相対的な発現単位に変換するために使用される。これらの相対的な発現単位は、対応するサンプルで発現されるβ－アクチンｍＲＮＡ（「ハウスキーピング遺伝子」）のレベルに対して正規化される。
均等物
いくつかの発明にかかる実施形態を本明細書に記載し、説明してきたが、当業者には、機能を実行するため、及び／またはその結果、及び／または本明細書に記載の１つ以上の利点を得るための様々な他の方法及び／または構造が容易に想起され、かかる変形及び／または変更の各々が、本明細書に記載の発明にかかる実施形態の範囲内であると見なされる。より一般的には、当業者には、本明細書に記載されるすべてのパラメータ、寸法、材料、及び構成が例示的であることを意図し、実際のパラメータ、寸法、材料、及び／または構成は、本発明の開示が使用される特定の用途（複数可）に依存することが容易に理解されよう。当業者には、通常の実験のみを用いて、本明細書に記載の特定の発明にかかる実施形態に対する多くの均等物が認識され、または、確認することができるであろう。それ故、前述の実施形態は、単なる例示として示され、添付の特許請求の範囲及びそれに対する均等物の範囲内で、発明にかかる実施形態は、具体的に記載及び請求されているものとは別の方法で実施され得ると理解されたい。本開示の発明にかかる実施形態は、本明細書に記載の個々の特徴、システム、物品、材料、キット、及び／または方法を対象とする。さらに、かかる特徴、システム、物品、材料、キット、及び／または方法が相互に矛盾しない場合、かかる特徴、システム、物品、材料、キット及び／または方法の２つ以上の任意の組み合わせが、本開示の発明の範囲内に含まれる。
本明細書で定義され、使用されるすべての定義は、辞書の定義、参照により組み込まれる文献における定義、及び／または定義される用語の通常の意味を制御すると理解されたい。
本明細書に開示するすべての参考文献、特許、及び特許出願は、各々が引用され、場合によっては当該文書の全体を包含し得る主題に関して参照により組み込まれる。
本明細書及び特許請求の範囲で使用される不定冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、明確に反対の指示がない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されたい。
本明細書及び特許請求の範囲で使用される「及び／または」という表現は、そのように結合された要素、すなわち、ある場合には接続的に存在し、他の場合には離接的に存在する要素の「どちらか一方または両方」を意味すると理解されたい。「及び／または」とともに列挙された複数の要素は、同じように、すなわち、そのように結合された要素の「１つ以上」と解釈されたい。具体的に特定された要素と関連するかどうかにかかわらず、「及び／または」節によって具体的に特定された要素以外の他の要素が任意に存在してもよい。したがって、非限定的な例として、「含む」等のオープンエンドな言語と併せて使用される場合、「Ａ及び／またはＢ」への言及は、１つの実施形態では、Ａのみ（任意に、Ｂ以外の要素を含む）、別の実施形態では、Ｂのみ（任意に、Ａ以外の要素を含む）、さらに別の実施形態では、ＡとＢの両方（任意に他の要素を含む）等に言及することができる。
本明細書及び特許請求の範囲で使用される「または」は、上記で定義した「及び／または」と同じ意味を有すると理解されたい。例えば、リストの中の項目を分離する場合、「または」もしくは「及び／または」は、包括的であること、すなわち、複数の要素または要素のリストのうちの少なくとも１つを含めることであるが、そのうちの複数、及び任意に、リストにないさらなる項目を含めることとして解釈するものとする。それとは反対に明確に示される表現、例えば、「ただ１つの」もしくは「厳密に１つの」、または、特許請求の範囲で使用される場合、「～からなる」のみが、複数の要素または要素のリストのうちの厳密に１つの要素を含めることを指す。一般に、本明細書で使用される「または」という用語は、排他的な用語、例えば、「どちらか一方」、「１つの」、「１つのみの」または「厳密に１つの」によって先行される場合にのみ、排他的な選択の可能性（すなわち、「一方または他方であるが両方でない」）を示すと解釈するものとする。「～から本質的になる」は、特許請求の範囲で使用される場合、特許法の分野で使用されるその通常の意味を有するものとする。
本明細書及び特許請求の範囲で使用される、１つ以上の要素のリストを参照した「少なくとも１つ」という表現は、該要素のリストにおける任意の１つ以上の要素から選択される少なくとも１つの要素を意味するが、必ずしも該要素のリスト内に具体的に列挙されたありとあらゆる要素のうちの少なくとも１つを含むとは限らず、該要素のリスト内の要素の任意の組み合わせを排除しないと理解されたい。本定義は、具体的に特定された要素と関連するかどうかにかかわらず、「少なくとも１つ」という表現が言及する要素のリスト内で具体的に特定される要素以外の要素が任意に存在し得ることも許可する。したがって、非限定的な例として、「Ａ及びＢの少なくとも１つ」（または、同等に、「ＡまたはＢの少なくとも１つ」、もしくは同等に、「Ａ及び／またはＢの少なくとも１つ」）は、１つの実施形態では、少なくとも１つの、任意に複数を含めたＡでＢが存在しない（及び任意にＢ以外の要素を含む）、別の実施形態では、少なくとも１つの、任意に複数を含めたＢでＡが存在しない（及び任意にＡ以外の要素を含む）、さらに別の実施形態では、少なくとも１つの、任意に複数を含めたＡ、及び少なくとも１つの、任意に複数を含めたＢ（及び任意に他の要素を含む）等に言及することができる。
明確に反対の指示がない限り、複数のステップまたは行為を含む本明細書における請求項にかかる任意の方法において、該方法の該ステップまたは行為の順序は、該方法の該ステップまたは行為が列挙される順序に必ずしも限定されないこともまた理解されたい。
特許請求の範囲、及び上記明細書において、すべての移行句、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｃａｒｒｙｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、「有する（ｈｏｌｄｉｎｇ）」、「～からなる（ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ）」等は、オープンエンドである、すなわち、含むが限定されないことを意味すると理解される。米国特許局特許審査便覧、第２１１１．０３条に記載の通り、「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」及び「～から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という移行句のみを、それぞれ、クローズドまたはセミクローズドの移行句であるものとする。オープンエンドの移行句（例えば、「含む」）を使用した本文書に記載の実施形態はまた、代替的な実施形態では、該オープンエンドの移行句によって記載された特徴「からなる」及び「から本質的になる」としても企図されることを理解されたい。例えば、本開示が「Ａ及びＢを含む組成物」を記載する場合、本開示は、「Ａ及びＢからなる組成物」ならびに「Ａ及びＢから本質的になる組成物」という代替実施形態も企図する。

Claims (64)

  1. （ｉ）ピコルナウイルスカプシドポリタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）であって、前記カプシドポリタンパク質は、ウイルスＰ１前駆体ポリタンパク質を含む、前記ｍＲＮＡ、及び
    （ｉｉ）脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）
    を含む組成物。
  2. （ｉ）プロテアーゼをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）であって、前記プロテアーゼは、ピコルナウイルス３Ｃプロテアーゼである、前記ｍＲＮＡ、及び
    （ｉｉ）脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）
    を含む組成物。
  3. （ｉ）ピコルナウイルス３Ｃプロテアーゼをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）、
    （ｉｉ）ピコルナウイルスカプシドポリタンパク質をコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡであって、前記カプシドポリタンパク質は、ウイルスＰ１前駆体ポリタンパク質を含む、前記ｍＲＮＡ、及び
    （ｉｉｉ）脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）
    を含む、免疫原性組成物。
  4. 前記前駆体ポリタンパク質が、２つ以上のカプシドタンパク質を含み、前記２つ以上のカプシドタンパク質の間にウイルスプロテアーゼに特異的な切断部位を有する、請求項１または３に記載の組成物。
  5. 前記２つ以上のカプシドタンパク質が、ウイルスタンパク質０（ＶＰ０）、ウイルスタンパク質１（ＶＰ１）、及びウイルスタンパク質３（ＶＰ３）のうちの２つ以上を含む、請求項４に記載の組成物。
  6. ＶＰ０がさらに、ウイルスタンパク質２（ＶＰ２）及びウイルスタンパク質４（ＶＰ４）を含み、ＶＰ２及びＶＰ４は、カプシド成熟のための切断部位を含む、請求項５に記載の組成物。
  7. 前記プロテアーゼが、ピコルナウイルス３Ｃ（３ＣＤ）である、請求項２～４及び６のいずれか１項に記載の組成物。
  8. 前記３ＣＤが、ピコルナウイルス科のエンテロウイルス属の種に特異的である、請求項７に記載の組成物。
  9. 前記３ＣＤが、ヒトライノウイルス（ＨＲＶ）Ａ、Ｂ、またはＣの種に特異的である、請求項７または８に記載の組成物。
  10. 前記ＨＲＶ種が、ＨＲＶ－Ａ１６である、請求項９に記載の組成物。
  11. 前記ＨＲＶ種が、ＨＲＶ－Ｂ１４である、請求項９に記載の組成物。
  12. 前記３ＣＤが、エンテロウイルス種に特異的である、請求項７または８に記載の組成物。
  13. 前記エンテロウイルスの遺伝子型が、ＥＶ－Ｄ６８である、請求項１２に記載の組成物。
  14. 前記エンテロウイルスの遺伝子型が、ＥＶ－Ａ７１である、請求項１２に記載の組成物。
  15. 前記カプシドタンパク質が、プロトマーを形成する、請求項１及び３～１４のいずれか１項に記載の組成物。
  16. 前記プロトマーが五量体を形成する、請求項１５に記載の組成物。
  17. 前記五量体が、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を形成する、請求項１６に記載の組成物。
  18. 前記ウイルスＰ１前駆体ポリタンパク質をコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡ及び前記ピコルナウイルス３ＣプロテアーゼをコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡ（Ｐ１：３ＣＤ）が、以下の比：２０：１、１０：１、７：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１の１つで存在する、請求項３～１７に記載の組成物。
  19. 前記ウイルスＰ１前駆体タンパク質をコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡと前記ピコルナウイルス３ＣプロテアーゼをコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡの比が、１０：１である、請求項１８に記載の組成物。
  20. 前記ウイルスＰ１前駆体ポリタンパク質をコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡと前記３Ｃプロテアーゼを３Ｃまたは３ＣＤのいずれかとしてコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡの比が、２：１である、請求項１８に記載の組成物。
  21. 前記プロテアーゼが、配列番号８または配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３～２０のいずれか１項に記載の組成物。
  22. 前記プロテアーゼが、配列番号８または配列番号１４のアミノ酸配列を含む、請求項２１に記載の組成物。
  23. 前記プロテアーゼが、配列番号２０または配列番号２６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３～２０のいずれか１項に記載の組成物。
  24. 前記プロテアーゼが、配列番号２０または配列番号２６のアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載の組成物。
  25. 前記カプシドポリタンパク質が、配列番号５、１１、１７、または２３のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１、及び３～２４のいずれか１項に記載の組成物。
  26. 前記カプシドポリタンパク質が、配列番号５、１１、１７、または２３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項２５に記載の組成物。
  27. 前記ＶＬＰが、中和免疫原性（ＮＩｍ）部位を含む、請求項１７～２６のいずれか１項に記載の組成物。
  28. 前記ＬＮＰが、イオン性アミノ脂質、ＰＥＧ修飾脂質、構造脂質及びリン脂質を含む、請求項１、２、または４～２７のいずれか１項に記載の組成物。
  29. 前記ウイルスＰ１前駆体ポリタンパク質をコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡ及び前記ピコルナウイルス３ＣプロテアーゼをコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡが、少なくとも１つのＬＮＰに共製剤化される、請求項３～２７のいずれか１項に記載の組成物。
  30. 前記ウイルスＰ１前駆体ポリタンパク質をコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡ及び前記ピコルナウイルス３ＣプロテアーゼをコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡが、各々別のＬＮＰに製剤化される、請求項３～２７のいずれか１項に記載の組成物。
  31. 前記ウイルスＰ１前駆体ポリタンパク質をコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡ及び前記ピコルナウイルス３ＣプロテアーゼをコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡとともに製剤化されるＬＮＰが、以下の比：２０：１、１０：１、７：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１の１つで存在する、請求項２９に記載の組成物。
  32. 前記ＬＮＰが、イオン性アミノ脂質、ステロール、中性脂質、及びＰＥＧ修飾脂質を含む、請求項２９～３１のいずれか１項に記載の組成物。
  33. 前記脂質ナノ粒子が、４０～５５ｍｏｌ％のイオン性アミノ脂質、３０～４５ｍｏｌ％のステロール、５～１５ｍｏｌ％の中性脂質、及び１～５ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を含む、請求項３２に記載の組成物。
  34. 前記脂質ナノ粒子が、４０～５０ｍｏｌ％のイオン性アミノ脂質、３５～４５ｍｏｌ％のステロール、１０～１５ｍｏｌ％の中性脂質、及び２～４ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を含む、請求項３３に記載の組成物。
  35. 前記脂質ナノ粒子が、４５ｍｏｌ％、４６ｍｏｌ％、４７ｍｏｌ％、４８ｍｏｌ％、４９ｍｏｌ％、または５０ｍｏｌ％のイオン性アミノ脂質を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  36. 前記イオン性アミノ脂質が、化合物２の構造を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物：
  37. ステロールが、コレステロールであるか、またはそのバリアントである、請求項２７～３１のいずれか１項に記載の組成物。
  38. 前記中性脂質が、１，２ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）である、請求項２７～３７のいずれか１項に記載の組成物。
  39. 対象に対して、
    （ｉ）ピコルナウイルスプロテアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含むメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）、及び
    （ｉｉ）前駆体タンパク質を含むカプシドポリタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含むメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）であって、前記前駆体タンパク質が、２つ以上のカプシドタンパク質を含み、前記２つ以上のカプシドタンパク質間に、前記プロテアーゼに特異的な切断部位を有する、前記ｍＲＮＡ
    を含む免疫原性組成物を、
    エンテロウイルス属のメンバーからのウイルス感染に対する免疫応答を前記対象において誘導するのに有効な量で投与することを含む方法。
  40. 前記免疫応答が、エンテロウイルス属のヒトライノウイルス種に対する結合抗体力価を含む、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記免疫応答が、エンテロウイルス属のヒトライノウイルス種に対する中和抗体力価を含む、請求項３９に記載の方法。
  42. 前記免疫応答が、エンテロウイルス属のヒトライノウイルス種に対するＴ細胞応答を含む、請求項３９に記載の方法。
  43. 前記ヒトライノウイルス種のウイルスが、遺伝子型Ａ２、Ａ１６、Ｂ１４、及びＣ１５からなる群から選択される、請求項４０～４２に記載の方法。
  44. 前記ヒトライノウイルスの遺伝子型がヒトライノウイルス１６（ＨＲＶ１６）である、請求項４１に記載の方法。
  45. 前記免疫応答が、エンテロウイルス属のヒトエンテロウイルス種に対する結合抗体力価を含む、請求項３９に記載の方法。
  46. 前記免疫応答が、エンテロウイルス属のヒトエンテロウイルス種に対する中和抗体力価を含む、請求項３９に記載の方法。
  47. 前記免疫応答が、エンテロウイルス属のヒトエンテロウイルス種に対するＴ細胞応答を含む、請求項３９に記載の方法。
  48. 前記ヒトエンテロウイルス種のウイルスが、ＲＶ－Ａ、ＲＶ－Ｂ、ＲＶ－Ｃ、ＥＶ－Ａ及びＥＶ－Ｄからなる群から選択される、請求項４５～４７に記載の方法。
  49. 前記ヒトエンテロウイルス種のウイルスが、遺伝子型ＲＶ－Ａ１６、ＲＶ－Ｂ１４、ＲＶ－Ｃ１５、ＥＶ－Ａ７１及びＥＶ－Ｄ６８からなる群から選択される、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記ヒトエンテロウイルス種のウイルスが、エンテロウイルスＤ６８（ＥＶ－Ｄ６８）である、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記ヒトエンテロウイルス種のウイルスが、エンテロウイルスＡ７１（ＥＶ－Ａ７１）である、請求項４９に記載の方法。
  52. 前記（ｉ）のｍＲＮＡが、少なくとも１つの脂質ナノ粒子を含む組成物で製剤化される、請求項３９に記載の方法。
  53. 前記（ｉｉ）のｍＲＮＡが、少なくとも１つの脂質ナノ粒子を含む組成物で製剤化される、請求項３９または５２に記載の方法。
  54. 前記（ｉ）のｍＲＮＡが、前記対象に対して、前記（ｉｉ）のｍＲＮＡと同時に投与される、請求項５３に記載の方法。
  55. 前記（ｉ）及び前記（ｉｉ）のｍＲＮＡが、少なくとも１つの脂質ナノ粒子を含む組成物で製剤化される、請求項３９に記載の方法。
  56. 前記（ｉ）及び前記（ｉｉ）のｍＲＮＡが、２つの脂質ナノ粒子を含む組成物で製剤化される、請求項５５に記載の方法。
  57. （ｉ）第一の産物をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む第一のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）、
    （ｉｉ）第二の産物をコードするＯＲＦを含む第二のｍＲＮＡ、及び
    （ｉｉｉ）脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）
    を含む組成物であって、
    前記第一の産物は活性タンパク質であり、前記活性タンパク質は、前記第二のｍＲＮＡ及び／または前記第二の産物の発現、構造、または活性を調節することができる、前記組成物。
  58. 前記組成物が、免疫原性組成物である、請求項５７に記載の組成物。
  59. 前記第一の産物が、触媒タンパク質である、請求項５７または５８に記載の組成物。
  60. 前記第一の産物が、酵素タンパク質である、請求項５７または５８に記載の組成物。
  61. 前記第一の産物が、結合タンパク質である、請求項５７または５８に記載の組成物。
  62. 前記第一の産物が、ポリタンパク質である、請求項５７または５８に記載の組成物。
  63. 前記第二の産物が、基質である、請求項５７または５８に記載の組成物。
  64. 前記第一の産物が、ポリタンパク質である、請求項５７または５８に記載の組成物。
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