CN117355329A - Vlp肠道病毒疫苗 - Google Patents

Vlp肠道病毒疫苗 Download PDF

Info

Publication number
CN117355329A
CN117355329A CN202280033156.2A CN202280033156A CN117355329A CN 117355329 A CN117355329 A CN 117355329A CN 202280033156 A CN202280033156 A CN 202280033156A CN 117355329 A CN117355329 A CN 117355329A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mrna
composition
lipid
enterovirus
protease
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202280033156.2A
Other languages
English (en)
Inventor
布鲁克·博尔曼
加比·巴尔德翁·瓦克
安杰洛·库库扎
赖彦廷
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
ModernaTx Inc
Original Assignee
ModernaTx Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ModernaTx Inc filed Critical ModernaTx Inc
Publication of CN117355329A publication Critical patent/CN117355329A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/125—Picornaviridae, e.g. calicivirus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/5123—Organic compounds, e.g. fats, sugars
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/503—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from viruses
    • C12N9/506—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from viruses derived from RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/22—Cysteine endopeptidases (3.4.22)
    • C12Y304/22028—Picornain 3C (3.4.22.28)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5258—Virus-like particles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/575—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 humoral response
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32311—Enterovirus
    • C12N2770/32334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本公开的方面涉及信使RNA疫苗的组合物及其施用方法。本文提供的组合物包含一种或多种RNA多核苷酸，所述多核苷酸具有编码小核糖核酸病毒衣壳多蛋白和蛋白酶的开放阅读框。本文提供的组合物包含一种或多种RNA多核苷酸，所述多核苷酸具有编码调节至少一种其他RNA或其产物的表达、结构或功能的活性产物的开放阅读框。

Description

VLP肠道病毒疫苗
相关申请
本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求于2021年3月5日提交的名称为“VLPEnteroviral Vaccines”的美国临时申请序列号63/157,543的权益，其全文以引用方式并入本文。
背景技术
小核糖核酸病毒科病毒，包括肠道病毒属的最大的病毒科之一，含有许多病原体物种，诸如肠道病毒和鼻病毒物种，它们负责人中一些最常见的感染。据估计，仅在美国每年就发生约10-15百万症状性肠道病毒感染，不包括非常普遍的鼻病毒感染(van derLinden等人，2015)。
接种是提供针对感染性疾病的预防性保护的有效方式，这些感染性疾病包括但不限于病毒、细菌和/或寄生虫病，诸如流感、HIV、肝炎病毒感染、霍乱、疟疾和结核病以及许多其他疾病。然而，开发靶向某些肠道病毒的疫苗已被证明是困难的，至少部分是因为原本适于靶向的保守区隐藏在肠道病毒颗粒的间期，而难以靶向的高度可变区暴露于肠道病毒颗粒的表面。
由于重组DNA技术的最新进展，病毒样颗粒(VLP)的使用对于疫苗开发的应用越来越令人感兴趣。通过模拟病原体形态的自组装病毒结构蛋白形成的VLP已经显示为非感染性的和高度免疫原性的。然而，由于难以实现形成模拟肠道病毒病原体的VLP所需的结构蛋白的正确表达和/或折叠，先前生成肠道病毒VLP的尝试仅获得有限的成功。
本公开描述了mRNA如何可用于编码和递送催化性酶促蛋白和编码该酶的多种底物的多蛋白两者，并随后允许该酶促进VLP形式的更高级结构的构建以用作体内免疫原。因此，非常感兴趣的是从mRNA开发用作肠道病毒疫苗的肠道病毒VLP，作为对抗感染性疾病和感染原的新方法。
发明内容
鉴于除了脊髓灰质炎疫苗外，缺乏有效对抗由肠道病毒引起的感染的疫苗，因此非常需要在所有患者群体中安全和有效的疫苗，以预防和/或治疗其他类型的肠道病毒感染。本文描述了核酸疫苗的组合物和方法。特别地，本文描述了核酸疫苗(例如，mRNA疫苗)的组合物和方法。
本公开的方面涉及组合物，该组合物包含：(i)包含编码小核糖核酸病毒衣壳多蛋白的开放阅读框(ORF)的信使核糖核酸(mRNA)，其中该衣壳多蛋白包含病毒P1前体多蛋白；和(ii)脂质纳米颗粒(LNP)。
本公开的另外的方面涉及组合物，该组合物包含：(i)包含编码蛋白酶的开放阅读框(ORF)的信使核糖核酸(mRNA)，其中该蛋白酶是小核糖核酸病毒3C蛋白酶；和(ii)脂质纳米颗粒(LNP)。
本公开的另外的方面涉及免疫原性组合物，该免疫原性组合物包含：(i)包含编码小核糖核酸病毒3C蛋白酶的开放阅读框(ORF)的信使核糖核酸(mRNA)；(ii)包含编码小核糖核酸病毒衣壳多蛋白的ORF的mRNA，其中该衣壳多蛋白包含病毒P1前体多蛋白；和(iii)脂质纳米颗粒(LNP)。
在一些实施方案中，前体多蛋白包含两种或更多种衣壳蛋白，并且在该两种或更多种衣壳蛋白之间具有对病毒蛋白酶具有特异性的切割位点。在一些实施方案中，该两种或更多种衣壳蛋白包含病毒蛋白0(VP0)、病毒蛋白1(VP1)和病毒蛋白3(VP3)中的两种或更多种。在一些实施方案中，VP0还包含病毒蛋白2(VP2)和病毒蛋白4(VP4)，其中VP2和VP4包含用于衣壳成熟的切割位点。
在一些实施方案中，蛋白酶是小核糖核酸病毒3C(3CD)。在一些实施方案中，3CD对小核糖核酸病毒科中肠道病毒属的物种具有特异性。在一些实施方案中，3CD对人鼻病毒(HRV)A、B或C的物种具有特异性。在一些实施方案中，HRV物种是HRV-A16。在一些实施方案中，HRV物种是HRV-B14。在一些实施方案中，3CD对肠道病毒物种具有特异性。在一些实施方案中，肠道病毒基因型是EV-D68。在一些实施方案中，肠道病毒基因型是EV-A71。
在一些实施方案中，衣壳蛋白形成原体。在一些实施方案中，原体形成五聚体。在一些实施方案中，五聚体形成病毒样颗粒(VLP)。
在一些实施方案中，包含编码病毒P1前体多蛋白的ORF的mRNA和包含编码小核糖核酸病毒3C蛋白酶的ORF的mRNA(P1∶3CD)按以下比率之一存在：20∶1、10∶1、7∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1。在一些实施方案中，包含编码病毒P1前体蛋白的ORF的mRNA与包含编码小核糖核酸病毒3C蛋白酶的ORF的mRNA的比率为10∶1。在一些实施方案中，包含编码病毒P1前体多蛋白的ORF的mRNA与包含编码作为3C或3CD的3C蛋白酶的ORF的mRNA的比率为2∶1。在一些实施方案中，蛋白酶包含与SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：14的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，蛋白酶包含SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在一些实施方案中，蛋白酶包含与SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：26的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，蛋白酶包含SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：26的氨基酸序列。
在一些实施方案中，衣壳多蛋白包含与SEQ ID NO：5、11、17或23中任一项的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，衣壳多蛋白包含SEQ ID NO：5、11、17或23中任一项的氨基酸序列。在一些实施方案中，VLP包含中和免疫原性(NIm)位点。
在一些实施方案中，LNP包含可电离氨基脂质、PEG修饰的脂质、结构脂质和磷脂。
在一些实施方案中，包含编码病毒P1前体多蛋白的ORF的mRNA和包含编码小核糖核酸病毒3C蛋白酶的ORF的mRNA共配制在至少一种LNP中。在一些实施方案中，包含编码病毒P1前体多蛋白的ORF的mRNA和包含编码小核糖核酸病毒3C蛋白酶的ORF的mRNA各自配制在单独的LNP中。在一些实施方案中，用按以下比率之一存在的包含编码病毒P1前体多蛋白的ORF的mRNA和包含编码小核糖核酸病毒3C蛋白酶的ORF的mRNA配制LNP：20∶1、10∶1、7∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1。在一些实施方案中，LNP包含可电离氨基脂质、固醇、中性脂质和PEG修饰的脂质。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含40-55mol％可电离氨基脂质、30-45mol％固醇、5-15mol％中性脂质和1-5、mol％PEG修饰的脂质。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含40-50mol％可电离氨基脂质、35-45mol％固醇、10-15mol％中性脂质和2-4mol％PEG修饰的脂质。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含45mol％、46mol％、47mol％、48mol％、49mol％或50mol％可电离氨基脂质。在一些实施方案中，可电离氨基脂质具有化合物2的结构：
在一些实施方案中，固醇是胆固醇或其变体。在一些实施方案中，中性脂质是1，2二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)。
本公开的另外的方面涉及包括向受试者施用免疫原性组合物的方法，该免疫原性组合物包含：(i)包含编码小核糖核酸病毒蛋白酶的开放阅读框的信使核糖核酸(mRNA)；和(ii)包含编码包含前体蛋白的衣壳多蛋白的开放阅读框的信使核糖核酸(mRNA)，其中该前体蛋白包含两种或更多种衣壳蛋白并且在该两种或更多种衣壳蛋白之间具有对该蛋白酶具有特异性的切割位点，该免疫原性组合物的量在该受试者中有效诱导针对来自肠道病毒属成员的病毒感染的免疫应答。
在一些实施方案中，免疫应答包括针对肠道病毒属的人鼻病毒物种的结合抗体滴度。在一些实施方案中，免疫应答包括针对肠道病毒属的人鼻病毒物种的中和抗体滴度。在一些实施方案中，免疫应答包括针对肠道病毒属的人鼻病毒物种的T细胞应答。在一些实施方案中，病毒的人鼻病毒物种选自由基因型A2、A16、B14和C15组成的组。在一些实施方案中，人鼻病毒基因型是人鼻病毒16(HRV16)。
在一些实施方案中，免疫应答包括针对肠道病毒属的人肠道病毒物种的结合抗体滴度。在一些实施方案中，免疫应答包括针对肠道病毒属的人肠道病毒物种的中和抗体滴度。在一些实施方案中，免疫应答包括针对肠道病毒属的人肠道病毒物种的T细胞应答。在一些实施方案中，病毒的人肠道病毒物种选自由RV-A、RV-B、RV-C、EV-A和EV-D组成的组。在一些实施方案中，病毒的人肠道病毒物种选自由基因型RV-A16、RV-B14、RV-C15、EV-A71和EV-D68组成的组。在一些实施方案中，病毒的人肠道病毒物种是肠道病毒D68(EV-D68)。在一些实施方案中，病毒的人肠道病毒物种是肠道病毒A71(EV-A71)。
在一些实施方案中，(i)的mRNA配制在包含至少一种脂质纳米颗粒的组合物中。在一些实施方案中，(ii)的mRNA配制在包含至少一种脂质纳米颗粒的组合物中。在一些实施方案中，(i)的mRNA与(ii)的mRNA同时施用于受试者。在一些实施方案中，(i)和(ii)的mRNA配制在包含至少一种脂质纳米颗粒的组合物中。在一些实施方案中，(i)和(ii)的mRNA配制在包含两种脂质纳米颗粒的组合物中。
本公开的另外的方面涉及组合物，该组合物包含：(i)包含编码第一产物的开放阅读框(ORF)的第一信使核糖核酸(mRNA)；(ii)包含编码第二产物的ORF的第二mRNA；和(iii)脂质纳米颗粒(LNP)，其中该第一产物是活性蛋白质，并且其中该活性蛋白质能够调节第二mRNA和/或第二产物的表达、结构或活性。在一些实施方案中，组合物是免疫原性组合物。在一些实施方案中，第一产物是催化蛋白。在一些实施方案中，第一产物是酶促蛋白。在一些实施方案中，第一产物是结合蛋白。在一些实施方案中，第一产物是多蛋白。在一些实施方案中，第二产物是底物。在一些实施方案中，第一产物是多蛋白。
本公开的限制中的每一种可涵盖本公开的各种实施方案。因此，预期涉及任何一个要素或要素组合的本公开的限制中的每一种可包括在本公开的每个方面中。本公开在其应用中不限于在以下描述中阐述或在附图中示出的部件的构造和布置的细节。本公开能够具有其他实施方案并且能够以各种方式实践或执行。
附图说明
附图不是按比例绘制的。在附图中，在各个图中示出的每个相同或几乎相同的部件由相同的附图标记表示。为了清楚起见，不是每个部件都在每个附图中标记。在附图中：
图1A-图1B描绘了肠道病毒基因组和所得二十面体病毒体的示意图。图1A是描绘衣壳蛋白(VP1、VP2、VP3和VP4)和非结构蛋白(2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D)的相对比例的示意图。多蛋白(P1、P2和P3)上的蛋白酶切割位点用倒三角形表示。图1B描绘了多蛋白加工和组装后得到的肠道病毒二十面体病毒体。衣壳蛋白VP1、VP2和VP3示出在二十面体病毒体的外部。
图2A-图2D描绘了由HRV-A16 P1+3CD mRNA构成的mRNA疫苗，其证明了正确的体外P1加工并在小鼠中生成中和抗体滴度。图2A是描绘了来自为得到指定的P1∶3CD摩尔比用2μg HRV-A16 P1 mRNA和递增量的HRV-A16 3CD mRNA转染的293T细胞的细胞裂解物的蛋白质印迹。结果显示P1被蛋白水解加工成单个VP蛋白。切割通过高分子量P1条带的消失和对应于VP0的较低分子量条带的出现来证明。包括野生型HRV-A16病毒体裂解物用于分子量比较，其中箭头指示P1切割产物。用GAPDH印迹的细胞裂解物显示为上样对照。图2B描绘了通过共表达P1和3CD产生的病毒样颗粒(VLP)。用编码P1和3CD的质粒转染Expi293细胞。经由PEG沉淀和随后的阴离子交换色谱法从上清液中纯化VLP。洗脱VLP并使用负染色透射电子显微镜成像。包括200nm比例尺作为参考。图2C为描绘用HRV-A16 P1∶3CD mRNA接种在小鼠中生成可检测的中和抗体滴度的图，其水平与注射复制病毒引起的滴度相当。用10μg P1mRNA和不同量的3CD mRNA接种小鼠，以构成10∶1和2∶1 P1∶3CD的摩尔比。在第1天和第22天接种小鼠，并在第21天(给药后1，灰色)和第35天(给药后2，黑色)收集血清，并在HRV-A16中和测定中测试。平行测试来自在第1天、第22天接受复制型HRV-A16注射的棉鼠的血清(棉鼠HRV-A16 A/S)。水平横条表示几何平均滴度(GMT)，并且竖条表示标准偏差。虚线表示测定检测限(LOD)＝25。将＜LOD的动物指定为12.5的滴度。图2D是描绘用EV-D68P1∶3CD mRNA以不同比例接种生成针对两种异源病毒分离株的中和抗体滴度的图。用10μg P1 mRNA和不同量的3CD mRNA接种小鼠，以构成10∶1、5∶1、2∶1和1∶1 P1 mRNA∶3CD mRNA的最终摩尔比。在第1天和第22天接种小鼠，并且将在第35天收集的血清合并用于每组。测试合并组血清的EV-D68进化枝B1分离株US/MO/14-18947和进化枝A2分离株US/KY/14-18953的中和。虚线表示测定定量限(LOQ＝100)。
图3A-图3D是描绘四种不同肠道病毒物种对用摩尔比为2∶1的P1+3CD mRNA接种的中和抗体应答的图。图3A是描绘用HRV-A16 P1+3CD mRNA接种导致中和抗体的剂量依赖性产生的图。X轴指示每个剂量组所给予的P1和3CD mRNA的μg量。条表示8只小鼠的组的GMT，其中单个动物由点表示。误差条表示标准偏差。包括来自超免疫豚鼠的市售HRV-A16抗血清作为基准对照(GP A/S)。Y轴处的虚线表示测定LOD＝25。图3B是描绘用HRV-B14 P1+3CDmRNA以5μg、1μg和0.2μg P1 mRNA的剂量接种导致相似水平的中和抗体并超过市售超免疫抗血清的中和抗体滴度的图。X轴指示每个剂量组所给予的P1和3CD mRNA的μg量。条表示8只小鼠的组的GMT，其中单个动物由点表示。误差条表示标准偏差。包括来自超免疫豚鼠的市售HRV-B14抗血清作为基准对照(GP A/S)。Y轴处的虚线表示测定LOD＝25。图3C是描绘用EV-D68 P1+3CD mRNA以5、1和0.2μg P1 mRNA的剂量接种即使在低剂量下也会引起强烈的中和抗体应答的图。测试血清的EV-D68进化枝B1分离株US/MO/14-18947和进化枝A2分离株US/KY/14-18953的中和。X轴指示每个组所给予的P1和3CD mRNA的μg量。条表示8只小鼠的组的GMT，其中单个动物由点表示。误差条指示标准偏差。Y轴处的虚线表示测定检测限(LOD)＝25。将滴度＜LOD的动物指定为12.5的值。条阴影对应于图例并且表示所测试的病毒分离物。图3D是描绘用EV-A71 P1+3CD mRNA接种导致抗体的剂量依赖性产生的图，该抗体可中和从患有急性弛缓性脊髓炎的患者中回收的临床分离物。X轴指示每个组所给予的P1和3CD mRNA的μg量。条表示每个剂量组的GMT。误差条指示标准偏差。Y轴处的虚线表示测定LOD＝20。将滴度＜LOD的动物指定为10的滴度值。
图4A-图4B描绘来自两个不同物种的P1+3CD的组合证明了体外P1加工并且是体内免疫原性的。图4A是蛋白质印迹，其描绘来自用2μg P1 mRNA±0.75μg 3CD mRNA转染的293T细胞的细胞裂解物对P1加工进行印迹。印迹底部的泳道标记指示转染的P1和3CD mRNA的HRV物种。当与来自HRV-B14或HRV-A16的3CD mRNA共转染时，HRV-B14 P1被切割。切割通过对应于P1的高分子量条带的消失和对应于VP1的低分子量条带的出现来指示。用GAPDH印迹的细胞裂解物显示为上样对照。图4B是描绘用HRV-B14 P1+HRV-A16 3CD mRNA的组合接种产生抗HRV-B14中和抗体的图。在第1天和第22天用2.5μg指定的P1 mRNA+0.94μg HRV-A16 3CD接种小鼠。测试第35天收集的血清的HRV-A16或HRV-B14病毒的中和。每种病毒的市售超免疫抗血清作为基准对照。实心条表示8只小鼠的组的GMT，其中单个动物由点表示。误差条表示标准偏差。散列条表示超免疫抗血清的中和滴度。Y轴处的虚线表示测定LOD＝25。
图5A-图5D是描绘用P1/3CD mRNA的组合接种在棉鼠中提供对HRV16攻击的剂量依赖性保护的图。图5A是描绘用P1/3CD初免-加强方案接种的动物表现出剂量依赖性的nAb产生的图。在接受较高剂量P1/3CD(25、5和1μg)的每个剂量组中的五只动物中的四只和用活HRV16接种的5/5动物在攻击时(加强后2周)显示可检测的HRV16 nAb。用0.2μg P1/3CD接种的动物或接受PBS作为阴性对照的动物没有可检测的nAb滴度。图5B是描绘用P1/3CD接种导致对肺组织的剂量依赖性保护的图。HRV16攻击后8小时测量肺组织中的病毒载量。接受25μg P1/3CD mRNA的5只动物中的四只和接受5μg的3/5的动物显示完全保护，并且与PBS接种的对照相比，接种1μg的所有动物显示降低的病毒载量。在接受最低(0.2μg)剂量的动物中没有发现对肺组织的保护。包括用活HRV16初免-加强方案接种的动物作为阳性对照和用于保护的比较物。图5C是描绘用P1/3CD接种导致对鼻组织的在最高剂量下的完全保护和在较低剂量下的一些保护的图。接受25μg P1/3CD的5只动物中的五只在HRV16攻击后8小时在鼻组织中没有可检测的病毒载量。接种5μg或1μg的动物在2/5的动物中显示完全保护。在接受0.2μg的动物中未观察到鼻保护。图5D是描绘用P1/3CD接种导致肺病毒载量降低的图，如通过qPCR对HRV16(-)vRNA所测量的。在接受25μg P1/3CD的5/5的动物和接受5μg或1μg的一些动物中观察到肺病毒滴度的强烈减少。在接种0.2μg的动物中未观察到减少。对于每个面板，条表示5只棉鼠组的GMT，其中单个动物由点表示。误差条表示几何标准偏差。Y轴处的虚线表示测定LOD＝200。
图6是描绘HRV-A16接种+攻击研究的单个棉鼠终点测定结果的表。
具体实施方式
在治疗、诊断、试剂和生物测定领域中非常感兴趣的是能够在细胞内设计、合成和递送核酸，例如核糖核酸(RNA)，无论是体外、体内、原位还是离体，诸如以实现对细胞、组织或器官有益并最终对生物体有益的生理结果。一种有益的结果是引起核酸的细胞内翻译和产生至少一种编码的感兴趣的肽或多肽。
病毒样颗粒(VLP)是在结构特征和抗原性方面与活病毒非常相似的球形颗粒。然而，VLP与活病毒的区别在于VLP不包含任何病毒遗传物质，并且因此是非感染性的。由于它们的抗原性但非感染性性质，对探索VLP在接种中的应用存在增加的兴趣。
目前，大多数VLP是使用重组或克隆策略生成的。VLP可以是自组装颗粒。自组装VLP和制备自组装VLP的方法的非限制性实例描述于国际专利公开号WO2013122262中，其内容以引用方式全文并入本文。
VLP由结构病毒蛋白(例如包膜蛋白和/或衣壳蛋白)的组装形成。VLP的大小和形态至少部分取决于组装时掺入颗粒中的特定结构病毒蛋白。由包膜病毒的结构病毒蛋白组装的VLP可包含例如一种或多种包膜蛋白和一种或多种衣壳蛋白。由无包膜病毒的结构病毒蛋白组装的VLP可包含例如一种或多种衣壳蛋白。
通过在同一细胞中共表达来自双顺反子或多顺反子载体的衣壳蛋白，可组装多种衣壳蛋白。尽管已尝试产生模拟来自肠道病毒属的病毒的VLP，包括在同一细胞内的不同载体上表达病毒结构蛋白和/或设计病毒结构蛋白与伴侣蛋白的融合蛋白，但所得VLP没有正确形成，使得它们不能模拟肠道病毒VLP的形态。
非常令人惊奇的是，根据本发明的方面，本发明人已发现可递送多种RNA，使得RNA之一产生的蛋白质作用于另一种RNA或由该RNA产生的蛋白质，从而在细胞内实现复杂的生理过程。例如，在一些情况下，复杂结构诸如VLP可由一种或多种衣壳前体多蛋白正确组装，该一种或多种衣壳前体多蛋白由在脂质纳米颗粒(LNP)中递送的信使核糖核酸(mRNA)表达并随后在细胞中加工。例如，本发明人鉴定包含含有编码小核糖核酸病毒衣壳多蛋白的开放阅读框(ORF)的mRNA和含有编码小核糖核酸病毒3C蛋白酶的ORF的mRNA的组合物足以形成病毒样颗粒。在一些方面，组合物被配制成一种或多种脂质纳米颗粒。
根据本发明的方面，本发明人还发现了包括施用免疫原性组合物的方法，该免疫原性组合物包含含有编码小核糖核酸病毒衣壳多蛋白的ORF的mRNA和任选地含有编码小核糖核酸病毒3C蛋白酶的ORF的mRNA，该免疫原性组合物的量在受试者中有效诱导针对来自肠道病毒属成员的病毒感染的免疫应答。
本公开的另外的方面涉及其中将两种或更多种mRNA递送至受试者的组合物，其中该mRNA编码能够在体内相互作用并实现最终结果的至少第一产物和第二产物。在上述实例中，一种产物是前体蛋白或多蛋白(底物)，并且另一种是酶。换句话讲，第一产物是活性蛋白，并且该活性蛋白可调节第二mRNA和/或第二产物的表达、结构或活性。这两种产物可以是底物酶对。另选地，第一产物可以是影响第二mRNA翻译过程或第二产物功能的结合蛋白。
本文描述了包含一种或多种编码小核糖核酸病毒衣壳多蛋白的多核苷酸的组合物。因此，本发明部分地涉及多核苷酸，特别是包含编码一种或多种小核糖核酸病毒衣壳多蛋白和/或其组分的开放阅读框的信使核糖核酸(mRNA)。在一些实施方案中，小核糖核酸病毒衣壳多蛋白包含两种或更多种衣壳蛋白，并且在两种或更多种衣壳蛋白之间具有对病毒蛋白酶具有特异性的切割位点。
本文还描述了包含一种或多种编码小核糖核酸病毒3C蛋白酶的多核苷酸的组合物。因此，本发明部分地涉及多核苷酸，特别是包含编码小核糖核酸病毒3C蛋白酶的开放阅读框的mRNA。
本文还描述了包含一种或多种编码小核糖核酸病毒衣壳多蛋白的多核苷酸和一种或多种编码小核糖核酸病毒3C蛋白酶的多核苷酸的组合物。因此，本发明部分地涉及多核苷酸，特别是包含编码小核糖核酸病毒衣壳多蛋白的开放阅读框的mRNA和包含编码小核糖核酸病毒3C蛋白酶的开放阅读框的mRNA。
在本发明的一些实施方案中，前体多蛋白是衣壳多蛋白。在一些实施方案中，衣壳多蛋白是小核糖核酸病毒衣壳多蛋白。在一些实施方案中，小核糖核酸病毒衣壳多蛋白是病毒P1前体多蛋白。
小核糖核酸病毒衣壳多蛋白可由单个核糖核酸(RNA)分子编码，其可以是编码两条单独多肽链的双顺反子分子，或者可以是编码三条单独多肽链的多顺反子分子(图1A)。此类RNA分子可在两个或三个编码序列之间含有信号序列，使得在翻译过程中产生两个或三个单独多肽。另选地，RNA分子可包括编码衣壳蛋白之间的切割位点(例如，蛋白酶切割位点)的序列，使得其产生单个衣壳多蛋白，其可通过在切割位点切割来加工以产生两种或更多种单独的衣壳蛋白。另选地，衣壳蛋白可由两个或三个单独的RNA分子编码。
在一些实施方案中，衣壳多蛋白包含两种或更多种衣壳蛋白。在一些实施方案中，该两种或更多种衣壳蛋白包含病毒蛋白0(VP0)、病毒蛋白1(VP1)和病毒蛋白3(VP3)中的两种或更多种。在一些实施方案中，病毒蛋白0(VP0)还包含病毒蛋白2(VP2)和病毒蛋白4(VP4)。
包含两种或更多种衣壳蛋白的衣壳多蛋白还可包含一个或多个对病毒蛋白酶具有特异性的切割位点。例如，在本发明的一些实施方案中，前体多蛋白包含两种或更多种衣壳蛋白，并且在两种或更多种衣壳蛋白之间具有对病毒蛋白酶具有特异性的切割位点。在一些实施方案中，在VP0、VP1和VP3中的一者或多者之间存在对病毒蛋白酶具有特异性的切割位点。衣壳多蛋白还可包含用于衣壳成熟的切割位点。在一些实施方案中，包含VP0的衣壳多蛋白还包含VP2和VP4，其中VP2和VP4包含用于衣壳成熟的切割位点(图1A)。
在一些实施方案中，编码小核糖核酸病毒衣壳多蛋白的mRNA对人鼻病毒(HRV)物种具有特异性。在一些实施方案中，HRV物种是HRV-A16。在一些实施方案中，编码小核糖核酸病毒衣壳多蛋白的mRNA包含与SEQ ID NO：3共享至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码小核糖核酸病毒衣壳多蛋白的mRNA的核苷酸序列包含SEQ ID NO：3。在一些实施方案中，HRV物种是HRV-B14。在一些实施方案中，编码小核糖核酸病毒衣壳多蛋白的mRNA包含与SEQ ID NO：10共享至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码小核糖核酸病毒衣壳多蛋白的mRNA的核苷酸序列包含SEQ ID NO：10。
在一些实施方案中，小核糖核酸病毒衣壳多蛋白对人鼻病毒(HRV)物种具有特异性。在一些实施方案中，HRV物种是HRV-A16。在一些实施方案中，小核糖核酸病毒衣壳多蛋白包含与SEQ ID NO：5共享至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，小核糖核酸病毒衣壳多蛋白的氨基酸序列包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，HRV物种是HRV-B14。在一些实施方案中，小核糖核酸病毒衣壳多蛋白包含与SEQ ID NO：11共享至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，小核糖核酸病毒衣壳多蛋白的氨基酸序列包含SEQ ID NO：11。
在一些实施方案中，编码小核糖核酸病毒衣壳多蛋白的mRNA对肠道病毒物种具有特异性。在一些实施方案中，肠道病毒物种是EV-D68。在一些实施方案中，编码小核糖核酸病毒衣壳多蛋白的mRNA包含与SEQ ID NO：16共享至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码小核糖核酸病毒衣壳多蛋白的mRNA的核苷酸序列包含SEQ ID NO：16。在一些实施方案中，肠道病毒物种是EV-A71。在一些实施方案中，编码小核糖核酸病毒衣壳多蛋白的mRNA包含与SEQ ID NO：22共享至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码小核糖核酸病毒衣壳多蛋白的mRNA的核苷酸序列包含SEQ ID NO：22。
在一些实施方案中，小核糖核酸病毒衣壳多蛋白对肠道病毒物种具有特异性。在一些实施方案中，肠道病毒物种是EV-D68。在一些实施方案中，小核糖核酸病毒衣壳多蛋白包含与SEQ ID NO：17共享至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，小核糖核酸病毒衣壳多蛋白的氨基酸序列包含SEQ ID NO：17。在一些实施方案中，肠道病毒物种是EV-A71。在一些实施方案中，小核糖核酸病毒衣壳多蛋白包含与SEQ IDNO：23共享至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，小核糖核酸病毒衣壳多蛋白的氨基酸序列包含SEQ ID NO：23。
在VLP组装之前，衣壳多蛋白可被非结构病毒蛋白(例如，病毒蛋白酶)加工或切割。如本文所用，病毒蛋白酶是指可识别衣壳多蛋白内的一种或多种衣壳蛋白之间的病毒蛋白酶特异性切割位点的蛋白酶。在一些实施方案中，病毒蛋白酶是小核糖核酸病毒3C(3CD)蛋白酶。病毒蛋白酶3CD是非结构多蛋白P3的一部分(图1A)。病毒蛋白酶3CD可被切割成3C和3D。小核糖核酸病毒3C蛋白酶可由3C或3CD提供。在一些实施方案中，小核糖核酸病毒3C蛋白酶由3C提供。在一些实施方案中，3C蛋白酶由3CD提供。在一些实施方案中，3CD蛋白酶对肠道病毒属中的物种具有特异性。
在一些实施方案中，编码小核糖核酸病毒3C蛋白酶(3CD)的mRNA对人鼻病毒(HRV)物种具有特异性。在一些实施方案中，HRV物种是HRV-A16。在一些实施方案中，编码3CD的mRNA包含与SEQ ID NO：7共享至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码3CD的mRNA的核苷酸序列包含SEQ ID NO：7。在一些实施方案中，HRV物种是HRV-B14。在一些实施方案中，编码3CD的mRNA包含与SEQ ID NO：13共享至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码3CD的mRNA的核苷酸序列包含SEQ ID NO：13。
在一些实施方案中，3CD蛋白酶对人鼻病毒(HRV)物种具有特异性。在一些实施方案中，HRV物种是HRV-A16。在一些实施方案中，3CD蛋白酶包含与SEQ ID NO：8共享至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，3CD蛋白酶的氨基酸序列包含SEQ ID NO：8。在一些实施方案中，HRV物种是HRV-B14。在一些实施方案中，3CD蛋白酶包含与SEQ ID NO：14共享至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，3CD蛋白酶的氨基酸序列包含SEQ ID NO：14。
在一些实施方案中，编码小核糖核酸病毒3C蛋白酶(3CD)的mRNA对肠道病毒物种具有特异性。在一些实施方案中，肠道病毒物种是EV-D68。在一些实施方案中，编码3CD的mRNA包含与SEQ ID NO：19共享至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码3CD的mRNA的核苷酸序列包含SEQ ID NO：19。在一些实施方案中，肠道病毒物种是EV-A71。在一些实施方案中，编码3CD的mRNA包含与SEQ ID NO：25共享至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码3CD的mRNA的核苷酸序列包含SEQ ID NO：25。
在一些实施方案中，3CD蛋白酶对肠道病毒物种具有特异性。在一些实施方案中，肠道病毒基因型是EV-D68。在一些实施方案中，3CD蛋白酶包含与SEQ ID NO：20共享至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，3CD蛋白酶的氨基酸序列包含SEQ ID NO：20。在一些实施方案中，肠道病毒基因型是EV-A71。在一些实施方案中，3CD蛋白酶包含与SEQ ID NO：26共享至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，3CD蛋白酶的氨基酸序列包含SEQ ID NO：26。
根据本发明，多核苷酸在组合物中描述，其中编码一种或多种小核糖核酸病毒衣壳多蛋白和/或其小核糖核酸病毒3C蛋白酶的多核苷酸以特定比率存在于组合物中。如本文所用，“比率”描述了能够产生VLP的小核糖核酸病毒3C蛋白酶与小核糖核酸病毒衣壳多蛋白的比例。在一些实施方案中，比率是指摩尔比。在一些实施方案中，比率是指质量比。
在一些实施方案中，包含编码小核糖核酸病毒3C蛋白酶的开放阅读框的mRNA与包含编码小核糖核酸病毒衣壳多蛋白的开放阅读框的mRNA的比率为至少20∶1、至少10∶1、至少7∶1、至少5∶1、至少4∶1、至少3∶1、至少2∶1或至少1∶1。在一些实施方案中，包含编码小核糖核酸病毒3C蛋白酶的开放阅读框的mRNA与包含编码小核糖核酸病毒衣壳多蛋白的开放阅读框的mRNA的比率为10∶1。在一些实施方案中，包含编码小核糖核酸病毒3C蛋白酶的开放阅读框的mRNA与包含编码小核糖核酸病毒衣壳多蛋白的开放阅读框的mRNA的比率为2∶1。
在一些实施方案中，编码一种或多种小核糖核酸病毒衣壳多蛋白和/或其小核糖核酸病毒3C蛋白酶的多核苷酸以一定比率存在于组合物中，使得衣壳蛋白形成原体。在一些实施方案中，原体形成五聚体。在一些实施方案中，五聚体形成VLP。
可产生针对病毒颗粒的表面暴露区域的中和抗体。例如，在人鼻病毒(HRV)中，病毒蛋白VP1是病毒蛋白的最表面暴露的，并且因此是最具免疫原性的病毒蛋白。中和抗体通常针对病毒颗粒上的中和免疫原性(NIm)位点。NIm位点的氨基酸序列在病毒血清型之间是高度可变的。尽管病毒颗粒包含高度保守区，但此类高度保守区通常被包埋在病毒颗粒的内部，并且不能被中和抗体接近。在本发明的一些实施方案中，VLP包含中和免疫原性(NIm)位点。
在一些实施方案中，本发明的组合物配制在至少一种脂质纳米颗粒中。在一些实施方案中，本发明的组合物配制在两种脂质纳米颗粒中。
本发明的多核苷酸和/或组合物可用于组装VLP，该VLP模拟病毒或病毒颗粒并且当施用于受试者时引发免疫原性应答。在一些实施方案中，病毒是小核糖核酸病毒科病毒的成员。
小核糖核酸病毒科病毒分为29个属，其中一个是肠道病毒属。肠道病毒属进一步分为12个物种，包括肠道病毒A-D、鼻病毒A-C和五种仅感染动物物种的肠道病毒物种(vander Linden等人，2015)。感染人的肠道病毒物种(例如，肠道病毒A-D和鼻病毒A-C)导致严重程度从简单的普通感冒到危及生命的疾病的感染。
鼻病毒的物种是与普通感冒相关的症状的原因。在本发明的一些实施方案中，鼻病毒是人鼻病毒16型(HRV-A16)。在一些实施方案中，鼻病毒是人鼻病毒14型(HRV-B14)。
感染人的肠道病毒物种是造成更严重症状和疾病的原因。例如，肠道病毒A71(EV-A71)，一种来自肠道病毒A物种的病毒的基因型，已与影响中枢神经系统的脊髓灰质炎样症状诸如急性弛缓性脊髓炎相关，从而导致肢体麻痹。又例如，来自肠道病毒B(例如，柯萨奇病毒B3)物种的病毒与手、足和口腔疾病有关。又例如，来自肠道病毒C物种的病毒与脊髓灰质炎(脊髓灰质炎疾病)有关。又例如，肠道病毒D68(EV-D68)(一种来自肠道病毒D物种的病毒的基因型)已与严重呼吸疾病和/或急性弛缓性脊髓炎有关。在本发明的一些实施方案中，肠道病毒是EV-A71。在一些实施方案中，肠道病毒是EV-D68。
可使用本发明的组合物或构建体免疫抵抗的病毒的实例包括但不限于肠道病毒A物种的成员，以前称为人肠道病毒A(例如，血清型柯萨奇病毒A2(CVA2)、CVA3、CVA4、CVA5、CVA6、CVA7、CVA8、CVA10、CVA12、CVA14、CVA16、肠道病毒A71(EV-A71)、EV-A76、EV-A89、EV-A90、EV-A91、EV-A92、EV-A114、EV-A119、EV-A120、EV-A121、EV-A122(以前为SV19)、EV-A123(以前为SV43)、EV-A124(以前为SV46)和EV-125(以前为BA13))；肠道病毒B物种的成员，以前称为人肠道病毒B(例如血清型柯萨奇病毒B1(CVB1)、CVB2、CVB3、CVB4(包括猪水泡病病毒2 SVDV-2、CVB5(包括SVDV-1)、CVB6、CVA9、艾柯病毒1(E1；包括E8)、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E9(包括CVA23)E11、E12、E13、E14、E15、E16、E17、E18、E19、E20、E21、E24、E25、E26、E27、E29、E30、E31、E32、E33、肠道病毒B69(EV-B69)、EV-B73、EV-B74、EV-B75、EV-B77、EV-B78、EV-B79、EV-B80、EV-B81、EV-B82、EV-B83、EV-B84、EV-B85、EV-B86、EV-B87、EV-B88、EV-B93、EV-B97、EV-B98、EV-B100、EV-B101、EV-B106、EV-B107、EV-B110(来自黑猩猩)、EV-B111、EV-B112(来自黑猩猩)、EV-B113(来自山魈)和EV-B114(以前称为猿猴剂5(SA5))；肠道病毒C物种的成员，以前称为人肠道病毒C(例如，脊髓灰质炎病毒(PV)1、PV2、PV3、柯萨奇病毒A1(CVA1)、CVA11、CVA13、CVA17、CVA19、CVA20、CVA21、CVA22、CVA24、EV-C95、EV-C96、EV-C99、EV-C102、EV-C104、EV-C105、EV-C109、EV-C113、EV-C116、EV-C117和EV-C118)；肠道病毒D物种的成员，以前称为人肠道病毒D(例如血清型EV-D68、EV-D70、EV-D94、EV-D111(来自人和黑猩猩两者)和EV-D120(来自大猩猩))；鼻病毒A物种的成员，以前称为人鼻病毒A(例如血清型鼻病毒(RV)A1、A2、A7、A8、A9、A10、A11、A12、A13、A15、A16、A18、A19、A20、A21、A22、A23、A24、A25、A28、A29、A30、A31、A32、A33、A34、A36、A38、A39、A40、A41、A43、A45、A46、A47、A49、A50、A51、A53、A54、A55、A56、A57、A58、A59、A60、A61、A62、A63、A64、A65、A66、A67、A68、A71、A73、A74、A75、A76、A77、A78、A80、A81、A82、A85、A88、A89、A90、A94、A96、A100、A101、A102、A103、A104、A105、A106、A107、A108、A109)；鼻病毒B物种的成员，以前称为人鼻病毒B(例如血清型鼻病毒(RV)B3、B4、B5、B6、B14、B17、B26、B27、B35、B37、B42、B48、B52、B69、B70、B72、B79、B83、B84、B86、B91、B92、B93、B97、B99、B100、B101、B102、B103、B104、B105和B106)；和鼻病毒C物种的成员，以前称为人鼻病毒C(例如血清型C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21、C22、C23、C24、C25、C26、C27、C28、C29、C30、C31、C32、C33、C34、C35、C36、C37、C38、C39、C40、C41、C42、C43、C44、C45、C46、C47、C48、C49、C50和C51)。
本公开的组合物可被设计成使受试者对肠道病毒的多种致病株免疫的单一预防性治疗剂。
在一些方面，本公开的方法包括向受试者施用本文所述的免疫原性组合物。如本文所用，“免疫原性组合物”是指包含含有编码蛋白酶的开放阅读框的mRNA和含有编码包含前体蛋白的衣壳多蛋白的开放阅读框的mRNA的组合物，其中该前体蛋白包含两种或更多种衣壳并且在该两种或更多种衣壳之间具有对蛋白酶具有特异性的切割位点，该组合物的量在受试者中诱导针对来自肠道病毒属成员的病毒感染的免疫应答，有效量的该组合物在受试者中诱导针对来自肠道病毒属成员的病毒感染的免疫应答。
免疫应答包括对病毒物种的结合抗体滴度。在一些实施方案中，免疫应答包括对病毒的人鼻病毒物种(例如，HRV-A16或HRV-B14)的结合抗体滴度。在一些实施方案中，免疫应答包括对病毒的人肠道病毒物种(例如，EV-A71或EV-D68)的结合抗体滴度。
免疫应答还包括对病毒物种的中和抗体滴度。在一些实施方案中，免疫应答包括对病毒的人鼻病毒物种(例如，HRV-A16或HRV-B14)的中和抗体滴度。在一些实施方案中，免疫应答包括对病毒的人肠道病毒物种(例如EV-A71或EV-D68)的中和抗体滴度。
免疫应答还包括对病毒物种的T细胞应答。在一些实施方案中，免疫应答包括对病毒的人鼻病毒物种(例如，HRV-A16或HRV-B14)的T细胞应答。在一些实施方案中，免疫应答包括对病毒的人肠道病毒物种(例如，EV-A71或EV-D68)的T细胞应答。
根据本发明，多核苷酸或构建体及其相关组合物可被设计成在体内产生可商购获得的疫苗、其变体或部分。
本发明的多核苷酸可用于保护婴儿免受感染或疾病，包括但不限于由小核糖核酸病毒科中的病毒引起的疾病。由本发明的小核糖核酸病毒科中的病毒引起的疾病的实例包括但不限于无菌性脑膜炎(CNS的最常见急性病毒性疾病)、脑炎、上呼吸道疾病、下呼吸道疾病、普通感冒、发热性皮疹疾病(手足口病)、结膜炎、疱疹性咽峡炎、肌炎和心肌炎、肝炎、脊髓灰质炎、脊髓灰质炎样病毒性疾病、急性弛缓性脊髓炎(AFM)、胃肠紊乱和结膜炎。
在一些实施方案中，本发明的多核苷酸可编码至少一种小核糖核酸病毒衣壳多蛋白和/或小核糖核酸病毒3C蛋白酶，当施用于受试者时，该小核糖核酸病毒衣壳多蛋白和/或小核糖核酸病毒3C蛋白酶形成VLP并使受试者免疫以预防、控制或治疗肠道病毒感染。
在一个实施方案中，本发明的多核苷酸是信使RNA(mRNA)或作为信使RNA起作用。如本文所用，术语“信使RNA”(mRNA)是指编码至少一种感兴趣的肽或多肽并且能够在体外、体内、原位或离体翻译以产生所编码的感兴趣的肽或多肽的任何多核苷酸。
mRNA分子的基本组分通常包括至少一个编码区、5′非翻译区(UTR)、3′UTR、5′帽和聚-A尾。本公开的多核苷酸可作为mRNA起作用，但可在其功能和/或结构设计特征方面与野生型mRNA区分，该功能和/或结构设计特征用于克服使用基于核酸的治疗剂的有效多肽表达的现有问题。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸是密码子优化的。密码子优化方法是本领域已知的并且可如本文提供的使用。在一些实施方案中，密码子优化可用于匹配靶标和宿主生物体中的密码子频率以确保正确折叠；使GC含量偏倚以增加mRNA稳定性或减少二级结构；使可能损害基因构建或表达的串联重复密码子或碱基运转最小化；定制转录和翻译控制区；插入或去除蛋白质运输序列；去除/添加所编码的蛋白质中的翻译后修饰位点(例如，糖基化位点)；添加、去除或改组蛋白质结构域；插入或缺失限制性位点；修饰核糖体结合位点和mRNA降解位点；调节翻译速率以允许蛋白质的各种结构域正确折叠；或以减少或消除多核苷酸内二级结构的问题。密码子优化工具、算法和服务在本领域中是已知的一非限制性实例包括来自GeneArt(Life Technologies)、DNA2.0(Menlo Park CA)的服务和/或专有方法。在一些实施方案中，使用优化算法优化开放阅读框(ORF)序列。
在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在的或野生型序列(例如，编码感兴趣的多肽或蛋白质的天然存在的或野生型mRNA序列，诸如小核糖核酸病毒衣壳多蛋白和/或其小核糖核酸病毒3C蛋白酶)具有小于95％的序列同一性。在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在的或野生型序列(例如，编码感兴趣的多肽或蛋白质的天然存在的或野生型mRNA序列，诸如小核糖核酸病毒衣壳多蛋白和/或其小核糖核酸病毒3C蛋白酶)具有小于90％的序列同一性。在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在的或野生型序列(例如，编码感兴趣的多肽或蛋白质的天然存在的或野生型mRNA序列，诸如小核糖核酸病毒衣壳多蛋白和/或其小核糖核酸病毒3C蛋白酶)具有小于85％的序列同一性。在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在的或野生型序列(例如，编码感兴趣的多肽或蛋白质的天然存在的或野生型mRNA序列，诸如小核糖核酸病毒衣壳多蛋白和/或其小核糖核酸病毒3C蛋白酶)具有小于80％的序列同一性。在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在的或野生型序列(例如，编码感兴趣的多肽或蛋白质的天然存在的或野生型mRNA序列，诸如小核糖核酸病毒衣壳多蛋白和/或其小核糖核酸病毒3C蛋白酶)具有小于75％的序列同一性。
在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在的或野生型序列(例如，编码感兴趣的多肽或蛋白质的天然存在的或野生型mRNA序列，例如小核糖核酸病毒衣壳多蛋白和/或其小核糖核酸病毒3C蛋白酶)共享65％与85％之间(例如，约67％与约85％之间或约67％与约80％之间)的序列同一性。在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在的或野生型序列(例如，编码感兴趣的多肽或蛋白质的天然存在的或野生型mRNA序列，例如小核糖核酸病毒衣壳多蛋白和/或其小核糖核酸病毒3C蛋白酶)共享65％与75％之间或约80％的序列同一性。
在一些实施方案中，密码子优化的RNA可以是例如其中G/C水平增强的RNA。核酸分子的G/C含量可影响RNA的稳定性。具有增加量的鸟嘌呤(G)和/或胞嘧啶(C)残基的RNA在功能上比含有大量腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)核苷酸的核酸更稳定。WO02/098443公开了含有通过翻译区中的序列修饰而稳定的mRNA的药物组合物。由于遗传密码的简并性，修饰通过用现有密码子取代那些促进更大的RNA稳定性而不改变所得氨基酸的密码子来起作用。该方法限于RNA的编码区。
多肽包括基因产物、天然存在的多肽、合成多肽、同源物、直系同源物、旁系同源物、片段和前述的其他等同物、变体和类似物。多肽可以是单分子，或者可以是多分子复合物，诸如二聚体、三聚体或四聚体。多肽还可包含单链或多链多肽，诸如抗体，并且可以是缔合的或连接的。最常见的是，二硫键联存在于多链多肽中。术语多肽也可适用于氨基酸聚合物，其中至少一个氨基酸残基是对应天然存在的氨基酸的人工化学类似物。
术语“多肽变体”是指其氨基酸序列不同于天然或参考序列的分子。与天然或参考序列相比，氨基酸序列变体可在氨基酸序列内的某些位置处具有取代、缺失和/或插入。通常，变体与天然或参考序列具有至少50％的同一性。在一些实施方案中，变体与天然或参考序列共享至少80％或至少90％同一性。
在一些实施方案中，提供了“变体模拟物”。如本文所用，术语“变体模拟物”是含有至少一个模拟活化序列的氨基酸的模拟物。例如，谷氨酸可用作磷酸-苏氨酸和/或磷酸-丝氨酸的模拟物。另选地，变体模拟物可导致失活或导致含有模拟物的失活产物，例如苯丙氨酸可充当酪氨酸的失活取代；或丙氨酸可充当丝氨酸的失活取代。
“直系同源物”是指不同物种中通过物种形成从共同祖先基因进化而来的基因。通常，直系同源物在进化过程中保持相同的功能。直系同源物的鉴定对于新测序的基因组中基因功能的可靠预测是关键的。
“类似物”意指包括多肽变体，其区别在于一个或多个氨基酸改变，例如氨基酸残基的取代、添加或缺失，其仍然保持亲本或起始多肽的一种或多种特性。
本公开提供了基于多核苷酸或多肽的几种类型的组合物，包括变体和衍生物。这些包括例如取代、插入、缺失和共价变体和衍生物。术语“衍生物”与术语“变体”同义使用，但通常是指相对于参考分子或起始分子以任何方式修饰和/或改变的分子。
因此，编码含有相对于参考序列，特别是本文公开的多肽序列的取代、插入和/或添加、缺失和共价修饰的肽或多肽的多核苷酸包括在本公开的范围内。例如，可将序列标签或氨基酸，诸如一个或多个赖氨酸，添加到肽序列中(例如，在N-末端或C-末端)。序列标签可用于肽检测、纯化或定位。赖氨酸可用于增加肽溶解度或允许生物素化。另选地，位于肽或蛋白质的氨基酸序列的羧基和氨基末端区域的氨基酸残基可任选地缺失以提供截短的序列。某些氨基酸(例如，C-末端或N-末端残基)可另选地根据序列的用途而缺失，如例如作为可溶的或连接到固体载体的较大序列的一部分的序列的表达。在一些实施方案中，用于(或编码)信号序列、终止序列、跨膜结构域、接头、多聚化结构域(例如，折叠区)等的序列可用实现相同或相似功能的另选序列取代。在一些实施方案中，可填充蛋白质核心中的空腔以改善稳定性，例如通过引入较大的氨基酸。在其他实施方案中，可用疏水残基置换包埋的氢键网络以改善稳定性。在其他实施方案中，糖基化位点可被去除并用适当的残基置换。本领域技术人员可容易地鉴定此类序列。
当提及多肽时，“取代变体”是指在天然或起始序列中去除至少一个氨基酸残基并在其位置的相同位置插入不同氨基酸的那些。取代可以是单一的，其中在分子中仅一个氨基酸被取代，或者它们可以是多重的，其中在同一分子中两个或更多个氨基酸被取代。
如本文所用，术语“保守氨基酸取代”是指通常存在于序列中的氨基酸被具有相似大小、电荷或极性的不同氨基酸取代。保守取代的实例包括用非极性(疏水)残基诸如异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸取代另一个非极性残基。同样，保守取代的实例包括用一个极性(亲水)残基取代另一个极性(亲水)残基，诸如在精氨酸和赖氨酸之间、在谷氨酰胺和天冬酰胺之间以及在甘氨酸和丝氨酸之间。另外，碱性残基诸如赖氨酸、精氨酸或组氨酸对另一个碱性残基的取代，或酸性残基诸如天冬氨酸或谷氨酸对另一个酸性残基的取代是保守取代的附加实例。非保守取代的实例包括用非极性(疏水)氨基酸残基诸如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸取代极性(亲水)残基诸如半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或赖氨酸和/或用极性残基取代非极性残基。
当提及多肽或多核苷酸时，“特征”分别被定义为分子的不同的基于氨基酸序列或基于核苷酸的组分。由多核苷酸编码的多肽的特征包括表面表现形式、局部构象形状、折叠、环、半环、结构域、半结构域、位点、末端或它们的任何组合。
如本文所用，当提及多肽时，术语“结构域”是指具有一个或多个可鉴别的结构或功能特征或特性(例如，结合能力、充当蛋白质-蛋白质相互作用的位点)的多肽的基序。
如本文所用，当提及多肽时，术语“位点”在其涉及基于氨基酸的实施方案时与“氨基酸残基”和“氨基酸侧链”同义使用。如本文所用，当提及多核苷酸时，术语“位点”在其涉及基于核苷酸的实施方案时与“核苷酸”同义使用。位点表示肽或多肽或多核苷酸内的位置，其可在基于多肽或多核苷酸的分子内被修饰、操纵、改变、衍生或变化。
如本文所用，当提及多肽或多核苷酸时，术语“末端(termini或terminus)”分别指多肽或多核苷酸的末端。此类末端不仅限于多肽或多核苷酸的第一个或最后一个位点，而且可在末端区域包括附加的氨基酸或核苷酸。基于多肽的分子可被表征为具有N-末端(由具有游离氨基(NH2)的氨基酸封端)和C-末端(由具有游离羧基(COOH)的氨基酸封端)两者。在一些情况下，蛋白质由通过二硫键或非共价力结合在一起的多个多肽链组成(例如，多聚体、寡聚体)。这些蛋白质具有多个N-末端和C-末端。另选地，多肽的末端可被修饰，使得它们在可能的情况下以基于非多肽的部分诸如有机缀合物开始或结束。
如本领域技术人员所认识到的，蛋白质片段、功能性蛋白质结构域和同源蛋白质也被认为在感兴趣的多肽的范围内。例如，本文提供的是长度为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或大于100个氨基酸的参考蛋白质的任何蛋白质片段(意指比参考多肽序列短至少一个氨基酸残基但在其他方面相同的多肽序列)。在另一个实例中，可根据本公开利用包含与本文所述的序列中的任一种具有40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％同一性的20、30、40、50、或100个氨基酸的链段的任何蛋白质。在一些实施方案中，多肽包含如本文提供或参考的序列中的任一种中所示的2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个突变。在另一个实例中，可根据本公开利用包含与本文所述的序列中的任一种具有大于80％、90％、95％或100％同一性的20、30、40、50或100个氨基酸的链段的任何蛋白质，其中该蛋白质具有与本文所述的序列中的任一种具有小于80％、75％、70％，65％或60％同一性的5、10、15、20、25或30个氨基酸的链段。
本公开的多肽或多核苷酸分子可与参考分子(例如，参考多肽或参考多核苷酸)，例如与本领域描述的分子(例如，工程化或设计的分子或野生型分子)共享一定程度的序列相似性或同一性。如本领域已知的术语“同一性”是指两个或更多个多肽或多核苷酸的序列之间的关系，如通过比较序列所确定的。在本领域中，同一性也指它们之间的序列相关性程度，如通过两个或更多个氨基酸残基或核酸残基的串之间的匹配数目所确定的。同一性测量由特定数学模型或计算机程序(例如，“算法”)处理的具有缺口比对(如果有的话)的两个或更多个序列中较小序列之间的同一性匹配的百分比。相关肽的同一性可通过已知方法容易地计算。当应用于多肽或多核苷酸序列时，“％同一性”被定义为候选氨基酸或核酸序列中与第二序列的氨基酸序列或核酸序列中的残基相同的残基(氨基酸残基或核酸残基)在比对序列并引入缺口(如果需要)以实现最大百分比同一性后的百分比。用于比对的方法和计算机程序在本领域中是公知的。应当理解，同一性取决于同一性百分比的计算，但由于计算中引入的缺口和罚分，值可能不同。通常，如通过本文所述和本领域技术人员已知的序列比对程序和参数所确定的，特定多核苷酸或多肽的变体与该特定参考多核苷酸或多肽具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％但小于100％的序列同一性。用于比对的此类工具包括BLAST套件的那些(Stephen F.Altschul等人(1997)，“Gapped BLAST and PSI-BLAST：anew generation of protein database search programs”，Nucleic Acids Res.25：3389-3402)。另一种流行的局部比对技术是基于Smith-Waterman算法(Smith，T.F.&Waterman，M.S.(1981)“Identification of common molecular subsequences.”J.Mol.BioL147：195-197)。基于动态编程的通用全局比对技术是Needleman-wunsch算法(Needleman，S.B.&Wunsch，C.D.(1970)“A general method applicable to the searchfor similarities in the amino acid sequences of two proteins.”J.Mol.Biol.48：443-453.)。最近，已开发了快速最佳全局序列比对算法(FOGSAA)，据称其比其他最佳全局比对方法(包括Needleman-Wunsch算法)更快地产生核苷酸和蛋白质序列的全局比对。本文描述了其他工具，具体地在以下“同一性”的定义中。
如本文所用，术语“同源性”是指聚合物分子之间，例如核酸分子(例如，DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。通过比对匹配残基确定的共享相似性或同一性阈值水平的聚合物分子(例如，核酸分子(例如，DNA分子和/或RNA分子)和/或多肽分子)被称为同源的。同源性是描述分子之间关系的定性术语，并且可基于定量相似性或同一性。相似性或同一性是定义两个比较序列之间的序列匹配程度的定量术语。在一些实施方案中，如果聚合物分子的序列至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％相同或相似，则认为它们彼此“同源”。术语“同源的”必然指至少两个序列(多核苷酸或多肽序列)之间的比较。如果它们编码的多肽对于至少20个氨基酸的至少一个链段是至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或甚至99％相同的，则认为这两个多核苷酸序列是同源的。在一些实施方案中，同源多核苷酸序列的特征在于编码至少4-5个独特指定氨基酸的链段的能力。对于长度小于60个核苷酸的多核苷酸序列，同源性由编码至少4-5个独特指定氨基酸的链段的能力决定。如果两个蛋白质序列对于至少20个氨基酸的至少一个链段是至少50％、60％、70％、80％或90％相同的，则认为这两个蛋白质序列是同源的。
同源性意味着所比较的序列在进化上偏离共同起源。术语“同源物”是指通过从共同的祖先序列遗传而与第二氨基酸序列或核酸序列相关的第一氨基酸序列或核酸序列(例如，基因(DNA或RNA)或蛋白质序列)。术语“同源物”可应用于通过物种形成事件分离的基因和/或蛋白质之间的关系，或应用于通过遗传复制事件分离的基因和/或蛋白质之间的关系。“直系同源物”是不同物种中通过物种形成从共同的祖先基因(或蛋白质)进化而来的基因(或蛋白质)。通常，直系同源物在进化过程中保持相同的功能。“旁系同源物”是通过基因组内的复制而相关的基因(或蛋白质)。直系同源物在进化过程中保持相同的功能，而旁系同源物进化新的功能，即使这些功能与原始功能相关。
术语“同一性”是指聚合物分子之间，例如多核苷酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。例如，两个多核酸序列的同一性百分比的计算可通过将两个序列比对用于最佳比较目的来进行(例如，可在第一核酸序列和第二核酸序列中的一者或两者中引入缺口用于最佳比对，并且为了比较的目的可忽略不相同的序列)。在某些实施方案中，为了比较目的而比对的序列的长度是参考序列长度的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％。然后比较对应核苷酸位置的核苷酸。当第一个序列中的一个位置被与第二个序列中相应位置处相同的核苷酸占据时，则分子在那个位置处是相同的。考虑到为了两个序列的最佳比对需要引入的缺口的数量和每个缺口的长度，两个序列之间的百分比同一性是序列共享的相同位置的数量的函数。可以使用数学算法实现序列的比较和两个序列之间的同一性百分比的确定。例如，两个核酸序列之间的百分比同一性可使用诸如在以下文献中描述的那些方法来确定：Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.编辑，Oxford University Press，NewYork，1988；Biocomputing：Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.编辑，Academic Press，New York，1993；Sequence Analysis in Molecular Biology，vonHeinje，G.，Academic Press，1987；Computer Analysis of Sequence Data，第I部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编辑，Humana Press，New Jersey，1994；以及SequenceAnalysis Primer，Gribskov，M.和Devereux，J.编辑，M Stockton Press，New York，1991；其各自以引用方式并入本文。例如，两个核酸序列之间的同一性百分比可使用Meyers和Miller(CABIOS，1989，4：11-17)的算法，使用PAM120权重残基表、12的缺口长度罚分、4的缺口罚分来确定，该算法已被并入ALIGN程序(2.0版)中。另选地，两个核酸序列之间的同一性百分比可使用GCG软件包中的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩阵来确定。通常用于确定序列之间的同一性百分比的方法包括但不限于Carillo，H.和Lipman，D.，SIAM.J AppliedMath.，48：1073(1988)中公开的那些；以引用方式并入本文。用于确定同一性的技术被编码在公开可获得的计算机程序中。确定两个序列之间同源性的示例性计算机软件包括但不限于GCG程序包(Devereux，J.等人，Nucleic Acids Research，12(1)，387(1984))、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S.F.等人，J.Molec.Biol.，215，403(1990))。
本公开的RNA(例如，mRNA)处理可包含至少一种核糖核酸(RNA)多核苷酸，其具有编码包含至少一种化学修饰的小核糖核酸病毒衣壳多蛋白的开放阅读框。本公开的RNA(例如，mRNA)处理可包含至少一种核糖核酸(RNA)多核苷酸，其具有编码包含至少一种化学修饰的小核糖核酸病毒3C蛋白酶的开放阅读框。
术语“化学修饰”和“化学修饰的”是指关于腺苷(A)、鸟苷(G)、尿苷(U)、胸苷(T)或胞苷(C)核糖核苷或脱氧核糖核苷在其位置、模式、百分比或群体中的至少一个方面的修饰。通常，这些术语不是指天然存在的5′-末端mRNA帽部分中的核糖核苷酸修饰。关于多肽，术语“修饰”是指相对于规范组20个氨基酸的修饰。如本文所提供的多肽，如果它们含有氨基酸取代、插入或取代和插入的组合，则也被认为是“经修饰的”。
在一些实施方案中，多核苷酸(例如，RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)包含各种(多于一种)不同的修饰。在一些实施方案中，多核苷酸的特定区域含有一个、两个或更多个(任选不同的)核苷或核苷酸修饰。在一些实施方案中，引入细胞或生物体的经修饰的RNA多核苷酸(例如，经修饰的mRNA多核苷酸)相对于未修饰的多核苷酸分别在细胞或生物体中表现出降低的降解。在一些实施方案中，引入细胞或生物体中的经修饰的RNA多核苷酸(例如，经修饰的mRNA多核苷酸)可分别在细胞或生物体中表现出降低的免疫原性(例如，降低的先天应答)。
多核苷酸的修饰包括但不限于本文所述的那些。多核苷酸(例如，RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)可包含天然存在的、非天然存在的修饰，或多核苷酸可包含天然存在的和非天然存在的修饰的组合。多核苷酸可包括任何有用的修饰，例如，糖、核碱基或核苷间键联(例如，与连接的磷酸、与磷酸二酯键联或与磷酸二酯主链)的修饰。
在一些实施方案中，多核苷酸(例如，RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)包含在多核苷酸的合成期间或合成后引入以实现期望的功能或特性的非天然经修饰的核苷酸。修饰可存在于核苷酸间键联、嘌呤或嘧啶碱基或糖上。可用化学合成或用聚合酶在链的末端或链中的任何其他地方引入修饰。可化学修饰多核苷酸的任何区域。
本公开提供了多核苷酸(例如，RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)的经修饰的核苷和核苷酸。“核苷”是指含有与有机碱(例如，嘌呤或嘧啶)或其衍生物(本文中也称作“核碱基”)组合的糖分子(例如，戊糖或核糖)或其衍生物的化合物。“核苷酸”是指包含一个或多个磷酸基团的核苷。修饰的核苷酸可以通过诸如化学、酶促或重组的任何有用方法合成，以包括一个或多个修饰的或非天然的核苷。多核苷酸可包含连接的核苷的一个或多个区域。此类区域可能具有可变的主链键联。键联可以是标准的磷酸二酯键联，在这种情况下，多核苷酸将包含核苷酸区域。
经修饰的核苷酸碱基配对不仅涵盖标准的腺苷-胸腺嘧啶、腺苷-尿嘧啶或鸟苷-胞嘧啶碱基对，而且涵盖核苷酸和/或包含非标准或经修饰的碱基的经修饰的核苷酸之间形成的碱基对，其中氢键供体和氢键接受体的排列允许非标准碱基与标准碱基之间或两个互补的非标准碱基结构之间的氢键结。此类非标准碱基配对的一个实例是修饰的核苷酸肌苷与腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶之间的碱基配对。碱基/糖或接头的任何组合可以并入本公开的多核苷酸中。
本领域技术人员将理解，除非另有说明，本申请中提出的多核苷酸序列将在代表性DNA序列中列举“T”，但当该序列代表RNA时，“T”将取代“U”。
可用于本公开的组合物、方法和合成过程的多核苷酸(例如，RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)的修饰包括但不限于以下：2-甲硫基-N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷、2-甲硫基-N6-甲基腺苷、2-甲硫基-N6-苏氨酰氨基甲酰基腺苷、N6-甘氨酰氨基甲酰基腺苷、N6-异戊烯基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-苏氨酰氨基甲酰基腺苷、1，2′-O-二甲基腺苷、1-甲基腺苷、2′-O-甲基腺苷、2′-O-核糖腺苷(磷酸盐)、2-甲基腺苷、2-甲硫基-N6异戊烯基腺苷、2-甲硫基-N6-羟基正缬氨酰氨基甲酰基腺苷、2′-O-甲基腺苷、2′-O-核糖腺苷(磷酸盐)、异戊烯基腺苷、N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷、N6，2′-O-二甲基腺苷、N6，2′-O-二甲基腺苷、N6，N6，2′-O-三甲基腺苷、N6，N6-二甲基腺苷、N6-乙酰基腺苷、N6-羟基正缬氨酰氨基甲酰基腺苷、N6-甲基-N6-苏氨酰氨基甲酰基腺苷、2-甲基腺苷、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺苷、7-脱氮-腺苷、N1-甲基-腺苷、N6，N6(二甲基)腺嘌呤、N6-顺式-羟基-异戊烯基-腺苷、α-硫代-腺苷、2(氨基)腺嘌呤、2(氨基丙基)腺嘌呤、2(甲硫基)N6(异戊烯基)腺嘌呤、2-(烷基)腺嘌呤、2-(氨基烷基)腺嘌呤、2-(氨基丙基)腺嘌呤、2-(卤代)腺嘌呤、2-(卤代)腺嘌呤、2-(丙基)腺嘌呤、2′-氨基-2′-脱氧-ATP、2′-叠氮基-2′-脱氧-ATP、2′-脱氧-2′-a-氨基腺苷TP、2′-脱氧-2′-a-叠氮基腺苷TP、6(烷基)腺嘌呤、6(甲基)腺嘌呤、6-(烷基)腺嘌呤、6-(甲基)腺嘌呤、7(脱氮)腺嘌呤、8(烯基)腺嘌呤、8(炔基)腺嘌呤、8(氨基)腺嘌呤、8(硫代烷基)腺嘌呤、8-(烯基)腺嘌呤、8-(烷基)腺嘌呤、8-(炔基)腺嘌呤、8-(氨基)腺嘌呤、8-(卤代)腺嘌呤、8-(羟基)腺嘌呤、8-(硫代烷基)腺嘌呤、8-(硫醇)腺嘌呤、8-叠氮基-腺苷、氮杂腺嘌呤、脱氮腺嘌呤、N6(甲基)腺嘌呤、N6-(异戊基)腺嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-腺苷、7-甲基腺嘌呤、1-脱氮腺苷TP、2′-氟-N6-Bz-脱氧腺苷TP、2′-OMe-2-氨基-ATP、2′-O-甲基-N6-Bz-脱氧腺苷TP、2′-a-乙炔基腺苷TP、2-氨基腺嘌呤、2-氨基腺苷TP、2-氨基-ATP、2′-a-三氟甲基腺苷TP、2-叠氮基腺苷TP、2′-b-乙炔基腺苷TP、2-溴腺苷TP、2′-b-三氟甲基腺苷TP、2-氯腺苷TP、2′-脱氧-2′，2′-二氟腺苷TP、2′-脱氧-2′-a-巯基腺苷TP、2′-脱氧-2′-a-硫代甲氧基腺苷TP、2′-脱氧-2′-b-氨基腺苷TP、2′-脱氧-2′-b-叠氮基腺苷TP、2′-脱氧-2′-b-溴腺苷TP、2′-脱氧-2′-b-氯腺苷TP、2′-脱氧-2′-b-氟腺苷TP、2′-脱氧-2′-b-碘腺苷TP、2′-脱氧-2′-b-巯基腺苷TP、2′-脱氧-2′-b-硫代甲氧基腺苷TP、2-氟腺苷TP、2-碘腺苷TP、2-巯基腺苷TP、2-甲氧基-腺嘌呤、2-甲硫基-腺嘌呤、2-三氟甲基腺苷TP、3-脱氮-3-溴腺苷TP、3-脱氮-3-氟腺苷TP、3-脱氮-3-氟腺苷TP、3-脱氮-3-碘腺苷TP、3-脱氮腺苷TP、4′-叠氮基腺苷TP、4′-碳环腺苷TP、4′-乙炔基腺苷TP、5′-同型腺苷TP、8-氮杂-ATP、8-溴-腺苷TP、8-三氟甲基腺苷TP、9-脱氮腺苷TP、2-氨基嘌呤、7-脱氮-2，6-二氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2，6-二氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2-氨基嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-腺嘌呤，7-脱氮-2-氨基嘌呤、2-硫代胞苷、3-甲基胞苷、5-甲酰基胞苷、5-羟基甲基胞苷、5-甲基胞苷、N4-乙酰基胞苷、2′-O-甲基胞苷、2′-O-甲基胞苷、5，2′-O-二甲基胞苷、5-甲酰基-2′-O-甲基胞苷、赖西丁、N4，2′-O-二甲基胞苷、N4-乙酰基-2′-O-甲基胞苷、N4-甲基胞苷、N4，N4-二甲基-2′-OMe-胞苷TP、4-甲基胞苷、5-氮杂-胞苷、假-异-胞苷、吡咯-胞苷、α-硫代-胞苷、2-(硫代)胞嘧啶、2′-氨基-2′-脱氧-CTP、2′-叠氮基-2′-脱氧-CTP、2′-脱氧-2′-a-氨基胞苷TP、2′-脱氧-2′-a-叠氮基胞苷TP、3(脱氮)5(氮杂)胞嘧啶、3(甲基)胞嘧啶、3-(烷基)胞嘧啶、3-(脱氮)5(氮杂)胞嘧啶、3-(甲基)胞苷、4，2′-O-二甲基胞苷、5(卤代)胞嘧啶、5(甲基)胞嘧啶、5(丙炔基)胞嘧啶、5(三氟甲基)胞嘧啶、5-(烷基)胞嘧啶、5-(炔基)胞嘧啶、5-(卤代)胞嘧啶、5-(丙炔基)胞嘧啶、5-(三氟甲基)胞嘧啶、5-溴-胞苷、5-碘-胞苷、5-丙炔基胞嘧啶、6-(偶氮)胞嘧啶、6-氮杂-胞苷、氮杂胞嘧啶、脱氮胞嘧啶、N4(乙酰基)胞嘧啶、1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、1-甲基-假异胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、2-甲氧基-胞苷、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷、4-甲氧基-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-假异胞苷、4-硫代-假异胞苷、5-氮杂-泽布拉林、5-甲基-泽布拉林、吡咯-假异胞苷、泽布拉林、(E)-5-(2-溴-乙烯基)胞苷TP、2，2′-脱水-胞苷TP盐酸盐、2′氟-N4-Bz-胞苷TP、2′氟-N4-乙酰基-胞苷TP、2′-O-甲基-N4-乙酰基-胞苷TP、2′O-甲基-N4-Bz-胞苷TP、2′-a-乙炔基胞苷TP、2′-a-三氟甲基胞苷TP、2′-b-乙炔基胞苷TP、2′-b-三氟甲基胞苷TP、2′-脱氧-2′，2′-二氟胞苷TP、2′-脱氧-2′-a-巯基胞苷TP、2′-脱氧-2′-a-硫代甲氧基胞苷TP、2′-脱氧-2′-b-氨基胞苷TP、2′-脱氧-2′-b-叠氮基胞苷TP、2′-脱氧-2′-b-溴胞苷TP、2′-脱氧-2′-b-氯胞苷TP、2′-脱氧-2′-b-氟胞苷TP、2′-脱氧-2′-b-碘胞苷TP、2′-脱氧-2′-b-巯基胞苷TP、2′-脱氧-2′-b-硫代甲氧基胞苷TP、2′-O-甲基-5-(1-丙炔基)胞苷TP、3′-乙炔基胞苷TP、4′-叠氮基胞苷TP、4′-碳环胞苷TP、4′-乙炔基胞苷TP、5-(1-丙炔基)阿糖-胞苷TP、5-(2-氯-苯基)-2-硫代胞苷TP、5-(4-氨基-苯基)-2-硫代胞苷TP、5-氨基烯丙基-CTP、5-氰基胞苷TP、5-乙炔基阿糖-胞苷TP、5-乙炔基胞苷TP、5′-同型胞苷TP、5-甲氧基胞苷TP、5-三氟甲基-胞苷TP、N4-氨基-胞苷TP、N4-苯甲酰-胞苷TP、假异胞苷、7-甲基鸟苷、N2，2′-O-二甲基鸟苷、N2-甲基鸟苷、怀俄苷、1，2′-O-二甲基鸟苷、1-甲基鸟苷、2′-O-甲基鸟苷、2′-O-核糖鸟苷(磷酸盐)、2′-O-甲基鸟苷、2′-O-核糖鸟苷(磷酸盐)、7-氨基甲基-7-脱氮鸟苷、7-氰基-7-脱氮鸟苷、古嘌苷(Archaeosine)、甲基怀俄苷、N2，7-二甲基鸟苷、N2，N2，2′-O-三甲基鸟苷、N2，N2，7-三甲基鸟苷、N2，N2-二甲基鸟苷、N2，7，2′-O-三甲基鸟苷、6-硫代-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、8-氧代-鸟苷、N1-甲基-鸟苷、α-硫代-鸟苷、2(丙基)鸟嘌呤、2-(烷基)鸟嘌呤、2′-氨基-2′-脱氧-GTP、2′-叠氮基-2′-脱氧-GTP、2′-脱氧-2′-a-氨基鸟苷TP、2′-脱氧-2′-a-叠氮基鸟苷TP、6(甲基)鸟嘌呤、6-(烷基)鸟嘌呤、6-(甲基)鸟嘌呤、6-甲基-鸟苷、7(烷基)鸟嘌呤、7(脱氮)鸟嘌呤、7(甲基)鸟嘌呤、7-(烷基)鸟嘌呤、7-(脱氮)鸟嘌呤、7-(甲基)鸟嘌呤、8(烷基)鸟嘌呤、8(炔基)鸟嘌呤、8(卤代)鸟嘌呤、8(硫代烷基)鸟嘌呤、8-(烯基)鸟嘌呤、8-(烷基)鸟嘌呤、8-(炔基)鸟嘌呤、8-(氨基)鸟嘌呤、8-(卤代)鸟嘌呤、8-(羟基)鸟嘌呤、8-(硫代烷基)鸟嘌呤、8-(硫醇)鸟嘌呤、氮杂鸟嘌呤、脱氮鸟嘌呤、N(甲基)鸟嘌呤、N-(甲基)鸟嘌呤、1-甲基-6-硫代-鸟苷、6-甲氧基-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-鸟苷、6-硫代-7-甲基-鸟苷、7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷、N2，N2-二甲基-6-硫代-鸟苷、N2-甲基-6-硫代-鸟苷、1-Me-GTP、2′氟-N2-异丁基-鸟苷TP、2′O-甲基-N2-异丁基-鸟苷TP、2′-a-乙炔基鸟苷TP、2′-a-三氟甲基鸟苷TP、2′-b-乙炔基鸟苷TP、2′-b-三氟甲基鸟苷TP、2′-脱氧-2′，2′-二氟鸟苷TP、2′-脱氧-2′-a-巯基鸟苷TP、2′-脱氧-2′-a-硫代甲氧基鸟苷TP、2′-脱氧-2′-b-氨基鸟苷TP、2′-脱氧-2′-b-叠氮基鸟苷TP、2′-脱氧-2′-b-溴鸟苷TP、2′-脱氧-2′-b-氯鸟苷TP、2′-脱氧-2′-b-氟鸟苷TP、2′-脱氧-2′-b-碘鸟苷TP、2′-脱氧-2′-b-巯基鸟苷TP、2′-脱氧-2′-b-硫代甲氧基鸟苷TP、4′-叠氮基鸟苷TP、4′-碳环鸟苷TP、4′-乙炔基鸟苷TP、5′-同型鸟苷TP、8-溴-鸟苷TP、9-脱氮鸟苷TP、N2-异丁基-鸟苷TP、1-甲基肌苷、肌苷、1，2′-O-二甲基肌苷、2′-O-甲基肌苷、7-甲基肌苷、2′-O-甲基肌苷、环氧辫苷、半乳糖基-辫苷、甘露糖基辫苷、辫苷、烯丙氨基-胸苷、氮杂胸苷、脱氮胸苷、脱氧-胸苷、2′-O-甲基尿苷、2-硫代尿苷、3-甲基尿苷、5-羧甲基尿苷、5-羟基尿苷、5-甲基尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代尿苷、5-牛磺酸甲基尿苷、二氢尿苷、假尿苷、3-(3-氨基-3-羧丙基)尿苷、1-甲基-3-(3-氨基-5-羧丙基)假尿苷、1-甲基假尿苷、1-甲基-假尿苷、2′-O-甲基尿苷、2′-O-甲基假尿苷、2′-O-甲基尿苷、2-硫代-2′-O-甲基尿苷、3-(3-氨基-3-羧丙基)尿苷、3，2′-O-二甲基尿苷、3-甲基-假-尿苷TP、4-硫代尿苷、5-(羧基羟基甲基)尿苷、5-(羧基羟基甲基)尿苷甲基酯、5，2′-O-二甲基尿苷、5，6-二氢-尿苷、5-氨基甲基-2-硫代尿苷、5-氨基甲酰基甲基-2′-O-甲基尿苷、5-氨基甲酰基甲基尿苷、5-羧基羟基甲基尿苷、5-羧基羟基甲基尿苷甲基酯、5-羧甲基氨基甲基-2′-O-甲基尿苷、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿苷、5-氨基甲酰基甲基尿苷TP、5-甲氧基羰基甲基-2′-O-甲基尿苷、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代尿苷、5-甲氧基羰基甲基尿苷、5-甲基尿苷、5-甲氧基尿苷、5-甲基-2-硫代尿苷、5-甲基氨基甲基-2-硒代尿苷、5-甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-甲基氨基甲基尿苷、5-甲基二氢尿苷、5-氧乙酸-尿苷TP、5-氧乙酸-甲基酯-尿苷TP、N1-甲基-假-尿苷、N1-乙基假尿苷、尿苷5-氧乙酸、尿苷5-氧乙酸甲基酯、3-(3-氨基-3-羧丙基)-尿苷TP、5-(异-戊烯基氨基甲基)-2-硫代尿苷TP、5-(异-戊烯基氨基甲基)-2′-O-甲基尿苷TP、5-(异-戊烯基氨基甲基)尿苷TP、5-丙炔基尿嘧啶、α-硫代-尿苷、1(氨基烷基氨基-羰基乙烯基)-2(硫代)-假尿嘧啶、1(氨基烷基氨基羰基乙烯基)-2，4-(二硫代)假尿嘧啶、1(氨基烷基氨基羰基乙烯基)-4(硫代)假尿嘧啶、1(氨基烷基氨基羰基乙烯基)-假尿嘧啶、1(氨基羰基乙烯基)-2(硫代)-假尿嘧啶、1(氨基羰基乙烯基)-2，4-(二硫代)假尿嘧啶、1(氨基羰基乙烯基)-4(硫代)假尿嘧啶、1(氨基羰基乙烯基)-假尿嘧啶、1取代2(硫代)-假尿嘧啶、1取代2，4-(二硫代)假尿嘧啶、1取代4(硫代)假尿嘧啶、1取代假尿嘧啶、1-(氨基烷基氨基-羰基乙烯基)-2-(硫代)-假尿嘧啶、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧丙基)假尿苷TP、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧丙基)假-UTP、1-甲基-假-UTP、2(硫代)假尿嘧啶、2′脱氧尿苷、2′氟尿苷、2-(硫代)尿嘧啶、2，4-(二硫代)假尿嘧啶、2′甲基，2′氨基，2′叠氮基，2′氟-鸟苷、2′-氨基-2′-脱氧-UTP、2′-叠氮基-2′-脱氧-UTP、2′-叠氮基-脱氧尿苷TP、2′-O-甲基假尿苷、2′脱氧尿苷、2′氟尿苷、2′-脱氧-2′-a-氨基尿苷TP、2′-脱氧-2′-a-叠氮基尿苷TP、2-甲基假尿苷、3(3氨基-3羧丙基)尿嘧啶、4(硫代)假尿嘧啶、4-(硫代)假尿嘧啶、4-(硫代)尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5(1，3-二唑-1-烷基)尿嘧啶、5(2-氨基丙基)尿嘧啶、5(氨基烷基)尿嘧啶、5(二甲基氨基烷基)尿嘧啶、5(烷基胍)尿嘧啶、5(甲氧基羰基甲基)-2-(硫代)尿嘧啶、5(甲氧基羰基-甲基)尿嘧啶、5(甲基)2(硫代)尿嘧啶、5(甲基)2，4(二硫代)尿嘧啶、5(甲基)4(硫代)尿嘧啶、5(甲基氨基甲基)-2(硫代)尿嘧啶、5(甲基氨基甲基)-2，4(二硫代)尿嘧啶、5(甲基氨基甲基)-4(硫代)尿嘧啶、5(丙炔基)尿嘧啶、5(三氟甲基)尿嘧啶、5-(2-氨基丙基)尿嘧啶、5-(烷基)-2-(硫代)假尿嘧啶、5-(烷基)-2，4(二硫代)假尿嘧啶、5-(烷基)-4(硫代)假尿嘧啶、5-(烷基)假尿嘧啶、5-(烷基)尿嘧啶、5-(炔基)尿嘧啶、5-(烯丙基氨基)尿嘧啶、5-(氰基烷基)尿嘧啶、5-(二烷基氨基烷基)尿嘧啶、5-(二甲基氨基烷基)尿嘧啶、5-(烷基胍)尿嘧啶、5-(卤代)尿嘧啶、5-(1，3-二唑-1-烷基)尿嘧啶、5-(甲氧基)尿嘧啶、5-(甲氧基羰基甲基)-2-(硫代)尿嘧啶、5-(甲氧基羰基-甲基)尿嘧啶、5-(甲基)2(硫代)尿嘧啶、5-(甲基)2，4(二硫代)尿嘧啶、5-(甲基)4(硫代)尿嘧啶、5-(甲基)-2-(硫代)假尿嘧啶、5-(甲基)-2，4(二硫代)假尿嘧啶、5-(甲基)-4(硫代)假尿嘧啶、5-(甲基)假尿嘧啶、5-(甲基氨基甲基)-2(硫代)尿嘧啶、5-(甲基氨基甲基)-2，4(二硫代)尿嘧啶、5-(甲基氨基甲基)-4-(硫代)尿嘧啶、5-(丙炔基)尿嘧啶、5-(三氟甲基)尿嘧啶、5-氨基烯丙基-尿苷、5-溴-尿苷、5-碘-尿苷、5-尿嘧啶、6(偶氮)尿嘧啶、6-(偶氮)尿嘧啶、6-氮杂-尿苷、烯丙氨基-尿嘧啶、氮杂尿嘧啶、脱氮尿嘧啶、N3(甲基)尿嘧啶、假-UTP-1-2-乙酸、假尿嘧啶、4-硫代-假-UTP、1-羧甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮-假尿苷、1-丙炔基-尿苷、1-牛磺酸甲基-1-甲基-尿苷、1-牛磺酸甲基-4-硫代-尿苷、1-牛磺酸甲基-假尿苷、2-甲氧基-4-硫代-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、(±)1-(2-羟基丙基)假尿苷TP、(2R)-1-(2-羟基丙基)假尿苷TP、(2S)-1-(2-羟基丙基)假尿苷TP、(E)-5-(2-溴-乙烯基)阿糖-尿苷TP、(E)-5-(2-溴-乙烯基)尿苷TP、(Z)-5-(2-溴-乙烯基)阿糖-尿苷TP、(Z)-5-(2-溴-乙烯基)尿苷TP、1-(2，2，2-三氟乙基)-假-UTP、1-(2，2，3，3，3-五氟丙基)假尿苷TP、1-(2，2-二乙氧基乙基)假尿苷TP、1-(2，4，6-三甲基苄基)假尿苷TP、1-(2，4，6-三甲基-苄基)假-UTP、1-(2，4，6-三甲基-苯基)假-UTP、1-(2-氨基-2-羧乙基)假-UTP、1-(2-氨基-乙基)假-UTP、1-(2-羟基乙基)假尿苷TP、1-(2-甲氧基乙基)假尿苷TP、1-(3，4-双-三氟甲氧基苄基)假尿苷TP、1-(3，4-二甲氧基苄基)假尿苷TP、1-(3-氨基-3-羧丙基)假-UTP、1-(3-氨基-丙基)假-UTP、1-(3-环丙基-丙-2-炔基)假尿苷TP、1-(4-氨基-4-羧丁基)假-UTP、1-(4-氨基-苄基)假-UTP、1-(4-氨基-丁基)假-UTP、1-(4-氨基-苯基)假-UTP、1-(4-叠氮基苄基)假尿苷TP、1-(4-溴苄基)假尿苷TP、1-(4-氟苄基)假尿苷TP、1-(4-氟苄基)假尿苷TP、1-(4-碘苄基)假尿苷TP、1-(4-甲磺酰基苄基)假尿苷TP、1-(4-甲氧基苄基)假尿苷TP、1-(4-甲氧基-苄基)假-UTP、1-(4-甲氧基-苯基)假-UTP、1-(4-甲基苄基)假尿苷TP、1-(4-甲基-苄基)假-UTP、1-(4-硝基苄基)假尿苷TP、1-(4-硝基-苄基)假-UTP、1(4-硝基-苯基)假-UTP、1-(4-硫代甲氧基苄基)假尿苷TP、1-(4-三氟甲氧基苄基)假尿苷TP、1-(4-三氟甲基苄基)假尿苷TP、1-(5-氨基-戊基)假-UTP、1-(6-氨基-己基)假-UTP、1，6-二甲基-假-UTP、1-[3-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酰基]假尿苷TP、1-{3-[2-(2-氨基乙氧基)-乙氧基]-丙酰基}假尿苷TP、1-乙酰基假尿苷TP、1-烷基-6-(1-丙炔基)-假-UTP、1-烷基-6-(2-丙炔基)-假-UTP、1-烷基-6-烯丙基-假-UTP、1-烷基-6-乙炔基-假-UTP、1-烷基-6-同型烯丙基-假-UTP、1-烷基-6-乙烯基-假-UTP、1-烯丙基假尿苷TP、1-氨基甲基-假-UTP、1-苯甲酰假尿苷TP、1-苄氧基甲基假尿苷TP、1-苄基-假-UTP、1-生物素基-PEG2-假尿苷TP、1-生物素基假尿苷TP、1-丁基-假-UTP、1-氰基甲基假尿苷TP、1-环丁基甲基-假-UTP、1-环丁基-假-UTP、1-环庚基甲基-假-UTP、1-环庚基-假-UTP、1-环己基甲基-假-UTP、1-环己基-假-UTP、1-环辛基甲基-假-UTP、1-环辛基-假-UTP、1-环戊基甲基-假-UTP、1-环戊基-假-UTP、1-环丙基甲基-假-UTP、1-环丙基-假-UTP、1-乙基-假-UTP、1-己基-假-UTP、1-同型烯丙基假尿苷TP、1-羟基甲基假尿苷TP、1-异-丙基-假-UTP、1-Me-2-硫代-假-UTP、1-Me-4-硫代-假-UTP、1-Me-α-硫代-假-UTP、1-甲磺酰基甲基假尿苷TP、1-甲氧基甲基假尿苷TP、1-甲基-6-(2，2，2-三氟乙基)假-UTP、1-甲基-6-(4-吗啉代)-假-UTP、1-甲基-6-(4-硫代吗啉代)-假-UTP、1-甲基-6-(取代苯基)假-UTP、1-甲基-6-氨基-假-UTP、1-甲基-6-叠氮基-假-UTP、1-甲基-6-溴-假-UTP、1-甲基-6-丁基-假-UTP、1-甲基-6-氯-假-UTP、1-甲基-6-氰基-假-UTP、1-甲基-6-二甲基氨基-假-UTP、1-甲基-6-乙氧基-假-UTP、1-甲基-6-羧酸乙酯-假-UTP、1-甲基-6-乙基-假-UTP、1-甲基-6-氟-假-UTP、1-甲基-6-甲酰基-假-UTP、1-甲基-6-羟基氨基-假-UTP、1-甲基-6-羟基-假-UTP、1-甲基-6-碘-假-UTP、1-甲基-6-异-丙基-假-UTP、1-甲基-6-甲氧基-假-UTP、1-甲基-6-甲基氨基-假-UTP、1-甲基-6-苯基-假-UTP、1-甲基-6-丙基-假-UTP、1-甲基-6-叔丁基-假-UTP、1-甲基-6-三氟甲氧基-假-UTP、1-甲基-6-三氟甲基-假-UTP、1-吗啉代甲基假尿苷TP、1-戊基-假-UTP、1-苯基-假-UTP、1-新戊酰假尿苷TP、1-炔丙基假尿苷TP、1-丙基-假-UTP、1-丙炔基-假尿苷、1-对甲苯基-假-UTP、1-叔丁基-假-UTP、1-硫代甲氧基甲基假尿苷TP、1-硫代吗啉代甲基假尿苷TP、1-三氟乙酰基假尿苷TP、1-三氟甲基-假-UTP、1-乙烯基假尿苷TP、2，2′-脱水-尿苷TP、2′-溴-脱氧尿苷TP、2′-F-5-甲基-2′-脱氧-UTP、2′-OMe-5-Me-UTP、2′-OMe-假-UTP、2′-a-乙炔基尿苷TP、2′-a-三氟甲基尿苷TP、2′-b-乙炔基尿苷TP、2′-b-三氟甲基尿苷TP、2′-脱氧-2′，2′-二氟尿苷TP、2′-脱氧-2′-a-巯基尿苷TP、2′-脱氧-2′-a-硫代甲氧基尿苷TP、2′-脱氧-2′-b-氨基尿苷TP、2′-脱氧-2′-b-叠氮基尿苷TP、2′-脱氧-2′-b-溴尿苷TP、2′-脱氧-2′-b-氯尿苷TP、2′-脱氧-2′-b-氟尿苷TP、2′-脱氧-2′-b-碘尿苷TP、2′-脱氧-2′-b-巯基尿苷TP、2′-脱氧-2′-b-硫代甲氧基尿苷TP、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、2-甲氧基尿苷、2′-O-甲基-5-(1-丙炔基)尿苷TP、3-烷基-假-UTP、4′-叠氮基尿苷TP、4′-碳环尿苷TP、4′-乙炔基尿苷TP、5-(1-丙炔基)阿糖-尿苷TP、5-(2-呋喃基)尿苷TP、5-氰基尿苷TP、5-二甲基氨基尿苷TP、5′-同型尿苷TP、5-碘-2′-氟-脱氧尿苷TP、5-苯基乙炔基尿苷TP、5-三氘代甲基-6-氘代尿苷TP、5-三氟甲基-尿苷TP、5-乙烯基阿糖尿苷TP、6-(2，2，2-三氟乙基)-假-UTP、6-(4-吗啉代)-假-UTP、6-(4-硫代吗啉代)-假-UTP、6-(取代苯基)-假-UTP、6-氨基-假-UTP、6-叠氮基-假-UTP、6-溴-假-UTP、6-丁基-假-UTP、6-氯-假-UTP、6-氰基-假-UTP、6-二甲基氨基-假-UTP、6-乙氧基-假-UTP、6-羧酸乙酯-假-UTP、6-乙基-假-UTP、6-氟-假-UTP、6-甲酰基-假-UTP、6-羟基氨基-假-UTP、6-羟基-假-UTP、6-碘-假-UTP、6-异-丙基-假-UTP、6-甲氧基-假-UTP、6-甲基氨基-假-UTP、6-甲基-假-UTP、6-苯基-假-UTP、6-苯基-假-UTP、6-丙基-假-UTP、6-叔丁基-假-UTP、6-三氟甲氧基-假-UTP、6-三氟甲基-假-UTP、α-硫代-假-UTP、假尿苷1-(4-甲基苯磺酸)TP、假尿苷1-(4-甲基苯甲酸)TP、假尿苷TP 1-[3-(2-乙氧基)]丙酸、假尿苷TP 1-[3-{2-(2-[2-(2-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基)-乙氧基}]丙酸、假尿苷TP 1-[3-{2-(2-[2-{2(2-乙氧基)-乙氧基}-乙氧基]-乙氧基)-乙氧基}]丙酸、假尿苷TP 1-[3-{2-(2-[2-乙氧基]-乙氧基)-乙氧基}]丙酸、假尿苷TP 1-[3-{2-(2-乙氧基)-乙氧基}]丙酸、假尿苷TP 1-甲基膦酸、假尿苷TP1-甲基膦酸二乙基酯、假-UTP-N1-3-丙酸、假-UTP-N1-4-丁酸、假-UTP-N1-5-戊酸、假-UTP-N1-6-己酸、假-UTP-N1-7-庚酸、假-UTP-N1-甲基-对苯甲酸、假-UTP-N1-对苯甲酸、怀丁苷(Wybutosine)、羟基怀丁苷、异怀俄苷、过氧怀丁苷、修饰不足的羟基怀丁苷、4-脱甲基怀俄苷、2，6-(二氨基)嘌呤、1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噁嗪-1-基：1，3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噻嗪-1-基、1，3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基、1，3，5-(三氮杂)-2，6-(二氧杂)-萘、2(氨基)嘌呤、2，4，5-(三甲基)苯基、2′甲基，2′氨基，2′叠氮基，2′氟-胞苷、2′甲基，2′氨基，2′叠氮基，2′氟-腺嘌呤、2′甲基，2′氨基，2′叠氮基、2′氟-尿苷、2′-氨基-2′-脱氧核糖、2-氨基-6-氯-嘌呤、2-氮杂-肌苷基、2′-叠氮基-2′-脱氧核糖、2′氟-2′-脱氧核糖、2′-氟-修饰碱基、2′-O-甲基-核糖、2-氧代-7-氨基吡啶并嘧啶-3-基、2-氧代-吡啶并嘧啶-3-基、2-吡啶酮、3硝基吡咯、3-(甲基)-7-(丙炔基)异喹诺酮基、3-(甲基)异喹诺酮基、4-(氟)-6-(甲基)苯并咪唑、4-(甲基)苯并咪唑、4-(甲基)吲哚基、4，6-(二甲基)吲哚基、5硝基吲哚、5取代嘧啶、5-(甲基)异喹诺酮基、5-硝基吲哚、6-(氮杂)嘧啶、6-(偶氮)胸腺嘧啶、6-(甲基)-7-(氮杂)吲哚基、6-氯-嘌呤、6-苯基-吡咯-嘧啶-2-酮-3-基、7-(氨基烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噻嗪-1-基、7-(氨基烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噁嗪-1-基、7-(氨基烷基羟基)-1，3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基、7-(氨基烷基羟基)-1，3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噻嗪-1-基、7-(氨基烷基羟基)-1，3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基、7-(氮杂)吲哚基、7-(烷基胍羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噁嗪1-基、7-(烷基胍羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噻嗪-1-基、7-(烷基胍羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噁嗪-1-基、7-(烷基胍羟基)-1，3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基、7-(烷基胍-羟基)-1，3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噻嗪-1-基、7-(烷基胍羟基)-1，3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基、7-(丙炔基)异喹诺酮基、7-(丙炔基)异喹诺酮基、丙炔基-7-(氮杂)吲哚基、7-脱氮-肌苷基、7-取代1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噁嗪-1-基、7-取代1，3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基、9-(甲基)-咪唑并吡啶基、氨基吲哚基、蒽基、双-邻-(氨基烷基羟基)-6-苯基-吡咯-嘧啶-2-酮-3-基、双-邻取代-6-苯基-吡咯-嘧啶-2-酮-3-基、二氟甲苯基、次黄嘌呤、咪唑并吡啶基、肌苷基、异喹诺酮基、异鸟苷、N2-取代嘌呤、N6-甲基-2-氨基-嘌呤、N6-取代嘌呤、N-烷基化衍生物、萘基、硝基苯并咪唑基、硝基咪唑基、硝基吲唑基、硝基吡唑基、Nubularine、O6-取代嘌呤、O-烷基化衍生物、邻-(氨基烷基羟基)-6-苯基-吡咯-嘧啶-2-酮-3-基、邻取代-6-苯基-吡咯-嘧啶-2-酮-3-基、氧代间型霉素(Oxoformycin)TP、对-(氨基烷基羟基)-6-苯基-吡咯-嘧啶-2-酮-3-基、对取代-6-苯基-吡咯-嘧啶-2-酮-3-基、并五苯基、菲基、苯基、丙炔基-7-(氮杂)吲哚基、芘基、吡啶并嘧啶-3-基、吡啶并嘧啶-3-基、2-氧代-7-氨基-吡啶并嘧啶-3-基、吡咯-嘧啶-2-酮-3-基、吡咯并嘧啶基、吡咯并吡嗪基、芪基(Stilbenzyl)、取代1，2，4-三唑、并四苯基、杀结核菌素(Tubercidine)、黄嘌呤、黄嘌呤核苷-5′-TP、2-硫代-泽布拉林、5-氮杂-2-硫代-泽布拉林、7-脱氮-2-氨基-嘌呤、吡啶-4-酮核糖核苷、2-氨基-核苷-TP、间型霉素A TP、间型霉素B TP、吡咯苷TP、2′-OH-阿糖-腺苷TP、2′-OH-阿糖-胞苷TP、2′-OH-阿糖-尿苷TP、2′-OH-阿糖-鸟苷TP、5-(2-甲酯基乙烯基)尿苷TP和N6-(19-氨基-五氧杂十九烷基)腺苷TP。
在一些实施方案中，多核苷酸(例如，RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)包括至少两种(例如，2、3、4或更多种)前述经修饰的核碱基的组合。
在一些实施方案中，多核苷酸(例如，RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)中的经修饰的核碱基选自由以下组成的组：假尿苷(ψ)、N1-甲基假尿苷(m1ψ)、N1-乙基假尿苷、2-硫代尿苷、4′-硫代尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲基尿苷、5-甲氧基尿苷和2′-O-甲基尿苷。在一些实施方案中，多核苷酸(例如，RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)包括至少两种(例如，2、3、4或更多种)前述经修饰的核碱基的组合。
在一些实施方案中，多核苷酸(例如，RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)中的经修饰的核碱基选自由以下组成的组：1-甲基-假尿苷(m1ψ)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、5-甲基-胞苷(m5C)、假尿苷(ψ)、α-硫代-鸟苷和α-硫代-腺苷。在一些实施方案中，多核苷酸包括至少两种(例如，2、3、4或更多种)前述经修饰的核碱基的组合。
在一些实施方案中，多核苷酸(例如，RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)包含假尿苷(ψ)和5-甲基-胞苷(m5C)。在一些实施方案中，多核苷酸(例如，RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)包含1-甲基-假尿苷(m1ψ)。在一些实施方案中，多核苷酸(例如，RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)包含1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-胞苷(m5C)。在一些实施方案中，多核苷酸(例如，RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)包含2-硫代尿苷(s2U)。在一些实施方案中，多核苷酸(例如，RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)包含2-硫代尿苷和5-甲基-胞苷(m5C)。在一些实施方案中，多核苷酸(例如，RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)包含甲氧基-尿苷(mo5U)。在一些实施方案中，多核苷酸(例如，RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)包含5-甲氧基-尿苷(mo5U)和5-甲基-胞苷(m5C)。在一些实施方案中，多核苷酸(例如，RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)包含2′-O-甲基尿苷。在一些实施方案中，多核苷酸(例如，RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)包含2′-O-甲基尿苷和5-甲基-胞苷(m5C)。在一些实施方案中，多核苷酸(例如，RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)包含N6-甲基-腺苷(m6A)。在一些实施方案中，多核苷酸(例如，RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)包含N6-甲基-腺苷(m6A)和5-甲基-胞苷(m5C)。
在一些实施方案中，对于特定修饰，多核苷酸(例如，RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)被统一修饰(例如，完全修饰，在整个序列中修饰)。例如，多核苷酸可用5-甲基-胞苷(m5C)统一修饰，这意味着mRNA序列中的所有胞嘧啶残基均被5-甲基-胞苷(m5C)置换。类似地，多核苷酸可以通过用经修饰的残基(诸如上文所阐述的那些残基)置换而针对存在于序列中的任何类型的核苷残基进行统一修饰。
具有经修饰的胞嘧啶的示例性核碱基和核苷包括N4-乙酰基-胞苷(ac4C)、5-甲基-胞苷(m5C)、5-卤代-胞苷(例如，5-碘-胞苷)、5-羟甲基-胞苷(hm5C)、1-甲基-假异胞苷、2-硫代-胞苷(s2C)和2-硫代-5-甲基-胞苷。
在一些实施方案中，经修饰的核碱基是经修饰的尿苷。具有经修饰的尿苷的示例性核碱基和核苷包括5-氰基尿苷和4′-硫代尿苷。
在一些实施方案中，经修饰的核碱基是经修饰的腺嘌呤。具有经修饰的腺嘌呤的示例性核碱基和核苷包括7-脱氮-腺嘌呤、1-甲基-腺苷(m1A)、2-甲基-腺嘌呤(m2A)和N6-甲基-腺苷(m6A)。
在一些实施方案中，经修饰的核碱基是经修饰的鸟嘌呤。具有经修饰的鸟嘌呤的示例性核碱基和核苷包括肌苷(I)、1-甲基-肌苷(m1I)、怀俄苷(imG)、甲基怀俄苷(mimG)、7-脱氮-鸟苷、7-氰基-7-脱氮-鸟苷(preQ0)、7-氨基甲基-7-脱氮-鸟苷(preQ1)、7-甲基-鸟苷(m7G)、1-甲基-鸟苷(m1G)、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷。
本公开的多核苷酸可以沿着分子的整个长度被部分或完全修饰。例如，在本公开的多核苷酸中，或在其给定的预定序列区域中(例如，在包括或不包括聚A尾的mRNA中)，可统一修饰一种或多种或所有或给定类型的核苷酸(例如，嘌呤或嘧啶，或A、G、U、C中的任何一种或多种或所有)。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸中(或其给定序列区域中)的所有核苷酸X都是经修饰的核苷酸，其中X可以是核苷酸A、G、U、C中的任一种，或组合A+G、A+U、A+C、G+U、G+C、U+C、A+G+U、A+G+C、G+U+C或A+G+C中的任一种。
多核苷酸可以含有约1％至约100％的经修饰的核苷酸(相对于总核苷酸含量，或相对于一种或多种类型的核苷酸，即，A、G、U或C中的任何一者或多者)或任何中间百分比(例如，1％至20％、1％至25％、1％至50％、1％至60％、1％至70％、1％至80％、1％至90％、1％至95％、10％至20％、10％至25％、10％至50％、10％至60％、10％至70％、10％至80％、10％至90％、10％至95％、10％至100％、20％至25％、20％至50％、20％至60％、20％至70％、20％至80％、20％至90％、20％至95％、20％至100％、50％至60％、50％至70％、50％至80％、50％至90％、50％至95％、50％至100％、70％至80％、70％至90％、70％至95％、70％至100％、80％至90％、80％至95％、80％至100％、90％至95％、90％至100％和95％至100％)。应当理解，任何剩余的百分比都是由未修饰的A、G、U或C的存在所占的。
多核苷酸可含有最少1％和最多100％的经修饰的核苷酸，或任何中间百分比，诸如至少5％的经修饰的核苷酸、至少10％的经修饰的核苷酸、至少25％的经修饰的核苷酸、至少50％的经修饰的核苷酸、至少80％的经修饰的核苷酸、或至少90％的经修饰的核苷酸。例如，多核苷酸可含有经修饰的嘧啶，诸如经修饰的尿嘧啶或胞嘧啶。在一些实施方案中，多核苷酸中至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少80％、至少90％或100％的尿嘧啶被经修饰尿的嘧啶(例如，5-取代的尿嘧啶)置换。经修饰的尿嘧啶可被具有单一独特结构的化合物置换，或者可被具有不同结构(例如，2、3、4或更多个独特结构)的多种化合物置换。在一些实施方案中，多核苷酸中至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少80％、至少90％或100％的胞嘧啶被经修饰的胞嘧啶(例如，5-取代的胞嘧啶)置换。经修饰的胞嘧啶可被具有单一独特结构的化合物置换，或者可被具有不同结构(例如，2、3、4或更多个独特结构)的多种化合物置换。
因此，在一些实施方案中，RNA治疗物包含5′UTR元件、任选密码子优化的开放阅读框和3′UTR元件、聚(A)序列和/或聚腺苷酸化信号，其中RNA未被化学修饰。
在一些实施方案中，经修饰的核碱基是经修饰的尿嘧啶。具有经修饰的尿嘧啶的示例性核碱基和核苷包括假尿苷(ψ)、吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮杂-尿苷、6-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-尿苷(s2U)、4-硫代-尿苷(s4U)、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基-尿苷(ho5U)、5-氨基烯丙基-尿苷、5-卤代-尿苷(例如，5-碘-尿苷或5-溴-尿苷)、3-甲基-尿苷(m3U)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、尿苷5-氧乙酸(cmo5U)、尿苷5-氧乙酸甲基酯(mcmo5U)、5-羧甲基-尿苷(cm5U)、1-羧甲基-假尿苷、5-羧基羟基甲基-尿苷(chm5U)、5-羧基羟基甲基-尿苷甲基酯(mchm5U)、5-甲氧基羰基甲基-尿苷(mcm5U)、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代-尿苷(mcm5s2U)、5-氨基甲基-2-硫代-尿苷(nm5s2U)、5-甲基氨基甲基-尿苷(mnm5U)、5-甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷(mnm5s2U)、5-甲基氨基甲基-2-硒代-尿苷(mnm5se2U)、5-氨基甲酰基甲基-尿苷(ncm5U)、5-羧甲基氨基甲基-尿苷(cmnm5U)、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷(cmnm5s2U)、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-尿苷(τm5U)、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷(τm5s2U)、1-牛磺酸甲基-4-硫代-假尿苷、5-甲基-尿苷(m5U，即，具有核碱基脱氧胸腺嘧啶)、1-甲基-假尿苷(m1ψ)、5-甲基-2-硫代-尿苷(m5s2U)、1-甲基-4-硫代-假尿苷(m1s4ψ)、4-硫代-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m3ψ)、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、二氢尿苷(D)、二氢假尿苷、5，6-二氢尿苷、5-甲基-二氢尿苷(m5D)、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基-尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、N1-甲基-假尿苷、N1-乙基假尿苷、3-(3-氨基-3-羧丙基)尿苷(acp3U)、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧丙基)假尿苷(acp3ψ)、5-(异戊烯基氨基甲基)尿苷(inm5U)、5-(异戊烯基氨基甲基)-2-硫代-尿苷(inm5s2U)、α-硫代-尿苷、2′-O-甲基-尿苷(Um)、5，2′-O-二甲基-尿苷(m5Um)、2′-O-甲基-假尿苷(ψm)、2-硫代-2′-O-甲基-尿苷(s2Um)、5-甲氧基羰基甲基-2′-O-甲基-尿苷(mcm5Um)、5-氨基甲酰基甲基-2′-O-甲基-尿苷(ncm5Um)、5-羧甲基氨基甲基-2′-O-甲基-尿苷(cmnm5Um)、3，2′-O-二甲基-尿苷(m3Um)和5-(异戊烯基氨基甲基)-2′-O-甲基-尿苷(inm5Um)、1-硫代-尿苷、脱氧胸苷、2′-F-阿糖-尿苷、2′-F-尿苷、2′-OH-阿糖-尿苷、5-(2-甲酯基乙烯基)尿苷以及5-[3-(1-E-丙烯基氨基)]尿苷。
在一些实施方案中，经修饰的核碱基是经修饰的胞嘧啶。具有经修饰的胞嘧啶的示例性核碱基和核苷包括5-氮杂-胞苷、6-氮杂-胞苷、假异胞苷、3-甲基-胞苷(m3C)、N4-乙酰基-胞苷(ac4C)、5-甲酰基-胞苷(f5C)、N4-甲基-胞苷(m4C)、5-甲基-胞苷(m5C)、5-卤代-胞苷(例如，5-碘-胞苷)、5-羟基甲基-胞苷(hm5C)、1-甲基-假异胞苷、吡咯-胞苷、吡咯-假异胞苷、2-硫代-胞苷(s2C)、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫代-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、泽布拉林、5-氮杂-泽布拉林、5-甲基-泽布拉林、5-氮杂-2-硫代-泽布拉林、2-硫代-泽布拉林、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假异胞苷、4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷、赖西丁(k2C)、α-硫代-胞苷、2′-O-甲基-胞苷(Cm)、5，2′-O-二甲基-胞苷(m5Cm)、N4-乙酰基-2′-O-甲基-胞苷(ac4Cm)、N4，2′-O-二甲基-胞苷(m4Cm)、5-甲酰基-2′-O-甲基-胞苷(f5Cm)、N4，N4，2′-O-三甲基-胞苷(m42Cm)、1-硫代-胞苷、2′-F-阿糖-胞苷、2′-F-胞苷和2′-OH-阿糖-胞苷。
在一些实施方案中，经修饰的核碱基是经修饰的腺嘌呤。具有经修饰的腺嘌呤的示例性核碱基和核苷包括2-氨基-嘌呤、2、6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-卤代-嘌呤(例如，2-氨基-6-氯-嘌呤)、6-卤代-嘌呤(例如，6-氯-嘌呤)、2-氨基-6-甲基-嘌呤、8-叠氮基-腺苷、7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-腺嘌呤、7-脱氮-2-氨基-嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2-氨基-嘌呤、7-脱氮-2，6-二氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2，6-二氨基嘌呤、1-甲基-腺苷(m1A)、2-甲基-腺嘌呤(m2A)、N6-甲基-腺苷(m6A)、2-甲硫基-N6-甲基-腺苷(ms2m6A)、N6-异戊烯基-腺苷(i6A)、2-甲硫基-N6-异戊烯基-腺苷(ms2i6A)、N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷(io6A)、2-甲硫基-N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷(ms2io6A)、N6-甘氨酰氨基甲酰基-腺苷(g6A)、N6-苏氨酰氨基甲酰基-腺苷(t6A)、N6-甲基-N6-苏氨酰氨基甲酰基-腺苷(m6t6A)、2-甲硫基-N6-苏氨酰氨基甲酰基-腺苷(ms2g6A)、N6，N6-二甲基-腺苷(m62A)、N6-羟基正缬氨酰氨基甲酰基-腺苷(hn6A)、2-甲硫基-N6-羟基正缬氨酰氨基甲酰基-腺苷(ms2hn6A)、N6-乙酰基-腺苷(ac6A)、7-甲基-腺嘌呤、2-甲硫基-腺嘌呤、2-甲氧基-腺嘌呤、α-硫代-腺苷、2′-O-甲基-腺苷(Am)、N6，2′-O-二甲基-腺苷(m6Am)、N6，N6，2′-O-三甲基-腺苷(m62Am)、1，2′-O-二甲基-腺苷(m1Am)、2′-O-核糖腺苷(磷酸盐)(Ar(p))、2-氨基-N6-甲基-嘌呤、1-硫代-腺苷、8-叠氮基-腺苷、2′-F-阿糖-腺苷、2′-F-腺苷、2′-OH-阿糖-腺苷和N6-(19-氨基-五氧杂十九烷基)-腺苷。
在一些实施方案中，经修饰的核碱基是经修饰的鸟嘌呤。具有经修饰的鸟嘌呤的示例性核碱基和核苷包括肌苷(I)、1-甲基-肌苷(m1I)、怀俄苷(imG)、甲基怀俄苷(mimG)、4-脱甲基-怀俄苷(imG-14)、异怀俄苷(imG2)、怀丁苷(yW)、过氧怀丁苷(o2yW)、羟基怀丁苷(OhyW)、修饰不足的羟基怀丁苷(OhyW*)、7-脱氮-鸟苷、辫苷(Q)、环氧辫苷(oQ)、半乳糖基-辫苷(galQ)、甘露糖基-辫苷(manQ)、7-氰基-7-脱氮-鸟苷(preQ0)、7-氨基甲基-7-脱氮-鸟苷(preQ1)、古嘌苷(G+)、7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、6-硫代-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-鸟苷(m7G)、6-硫代-7-甲基-鸟苷、7-甲基-肌苷、6-甲氧基-鸟苷、1-甲基-鸟苷(m1G)、N2-甲基-鸟苷(m2G)、N2，N2-二甲基-鸟苷(m22G)、N2，7-二甲基-鸟苷(m2，7G)、N2、N2，7-二甲基-鸟苷(m2，2，7G)、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷、1-甲基-6-硫代-鸟苷、N2-甲基-6-硫代-鸟苷、N2，N2-二甲基-6-硫代-鸟苷、α-硫代-鸟苷、2′-O-甲基-鸟苷(Gm)、N2-甲基-2′-O-甲基-鸟苷(m2Gm)、N2，N2-二甲基-2′-O-甲基-鸟苷(m22Gm)、1-甲基-2′-O-甲基-鸟苷(m1Gm)、N2，7-二甲基-2′-O-甲基-鸟苷(m2，7Gm)、2′-O-甲基-肌苷(Im)、1，2′-O-二甲基-肌苷(m1Im)、2′-O-核糖鸟苷(磷酸盐)(Gr(p))、1-硫代-鸟苷、O6-甲基-鸟苷、2′-F-阿糖-鸟苷和2′-F-鸟苷。
本公开的抗体及其抗原结合片段包含至少一种RNA多核苷酸，例如mRNA(例如，经修饰的mRNA)。例如，mRNA从模板DNA体外转录，称为“体外转录模板”。在一些实施方案中，体外转录模板编码5′非翻译(UTR)区，含有开放阅读框，并编码3′UTR和聚A尾。体外转录模板的特定核酸序列组成和长度将取决于模板所编码的mRNA。
序列优化
在一些实施方案中，编码本公开的抗原的ORF是密码子优化的。密码子优化方法是本领域已知的。例如，本文提供的序列中的任何一种或多种的ORF可以是密码子优化的。在一些实施方案中，密码子优化可用于匹配靶标和宿主生物体中的密码子频率以确保正确折叠；使GC含量偏倚以增加mRNA稳定性或减少二级结构；使可能损害基因构建或表达的串联重复密码子或碱基运转最小化；定制转录和翻译控制区；插入或去除蛋白质运输序列；去除/添加所编码的蛋白质中的翻译后修饰位点(例如，糖基化位点)；添如、去除或改组蛋白质结构域；插入或缺失限制性位点；修饰核糖体结合位点和mRNA降解位点；调节翻译速率以允许蛋白质的各种结构域正确折叠；或减少或消除多核苷酸内二级结构的问题。密码子优化工具、算法和服务在本领域中是已知的一非限制性实例包括来自GeneArt(LifeTechnologies)、DNA2.0(Menlo Park CA)的服务和/或专有方法。在一些实施方案中，使用优化算法优化开放阅读框(ORF)序列。
在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在的或野生型序列ORF(例如，编码小核糖核酸病毒衣壳多蛋白和/或小核糖核酸病毒3C蛋白酶的天然存在的或野生型mRNA序列)共享小于95％的序列同一性。在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在的或野生型序列(例如，编码小核糖核酸病毒衣壳多蛋白和/或小核糖核酸病毒3C蛋白酶的天然存在的或野生型mRNA序列)共享小于90％的序列同一性。在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在的或野生型序列(例如，编码小核糖核酸病毒衣壳多蛋白和/或小核糖核酸病毒3C蛋白酶的天然存在的或野生型mRNA序列)共享小于85％的序列同一性。在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在的或野生型序列(例如，编码小核糖核酸病毒衣壳多蛋白和/或小核糖核酸病毒3C蛋白酶的天然存在的或野生型mRNA序列)共享小于80％的序列同一性。在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在的或野生型序列(例如，编码小核糖核酸病毒衣壳多蛋白和/或小核糖核酸病毒3C蛋白酶的天然存在的或野生型mRNA序列)共享小于75％的序列同一性。
在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在的或野生型序列(例如，编码小核糖核酸病毒衣壳多蛋白和/或小核糖核酸病毒3C蛋白酶的天然存在的或野生型mRNA序列)共享65％与85％之间(例如，约67％与约85％之间或约67％与约80％之间)的序列同一性。在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在的或野生型序列(例如，编码小核糖核酸病毒衣壳多蛋白和/或小核糖核酸病毒3C蛋白酶的天然存在的或野生型mRNA序列)共享65％与75％之间或约80％的序列同一性。
在一些实施方案中，密码子优化的序列编码的小核糖核酸病毒衣壳多蛋白和/或小核糖核酸病毒3C蛋白酶的免疫原性与由非密码子优化的序列编码的小核糖核酸病毒衣壳多蛋白和/或小核糖核酸病毒3C蛋白酶的免疫原性相同，或免疫原性比其更高(例如，高至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少100％或至少200％)。
当转染到哺乳动物宿主细胞中时，经修饰的mRNA具有12-18小时之间、或大于18小时(例如，24、36、48、60、72或大于72小时)的稳定性，并且能够由哺乳动物宿主细胞表达。
在一些实施方案中，密码子优化的RNA可以是其中G/C水平增强的RNA。核酸分子(例如，mRNA)的G/C含量可影响RNA的稳定性。具有增加量的鸟嘌呤(G)和/或胞嘧啶(C)残基的RNA在功能上比含有大量腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)核苷酸的RNA更稳定。作为实例，WO02/098443公开了含有通过翻译区中的序列修饰而稳定的mRNA的药物组合物。由于遗传密码的简并性，修饰通过用现有密码子取代那些促进更大的RNA稳定性而不改变所得氨基酸的密码子来起作用。该方法限于RNA的编码区。
未经化学修饰的核苷酸
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)未被化学修饰，并且包含由腺苷、鸟苷、胞嘧啶和尿苷组成的标准核糖核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核苷酸和核苷包含标准核苷残基，诸如存在于转录的RNA中的那些(例如A、G、C或U)。在一些实施方案中，本公开的核苷酸和核苷包含标准脱氧核糖核苷，诸如存在于DNA中的那些(例如dA、dG、dC或dT)。
化学修饰
在一些实施方案中，本公开的组合物包含具有编码冠状病毒抗原的开放阅读框的RNA，其中该核酸包含可以是标准的(未修饰的)或如本领域已知的经修饰的核苷酸和/或核苷。在一些实施方案中，本公开的核苷酸和核苷包括经修饰的核苷酸或核苷。此类经修饰的核苷酸和核苷可以是天然存在的经修饰的核苷酸和核苷或非天然存在的经修饰的核苷酸和核苷。此类修饰可包括如本领域所公认的在核苷酸和/或核苷的糖、主链或核碱基部分的那些修饰。
在一些实施方案中，本公开的天然存在的经修饰的核苷酸或核苷是如本领域通常已知或公认的核苷酸或核苷。此类天然存在的经修饰的核苷酸和核苷的非限制性实例尤其可见于广泛认可的MODOMICS数据库中。
在一些实施方案中，本公开的非天然存在的经修饰的核苷酸或核苷是本领域通常已知或公认的核苷酸或核苷。此类非天然存在的经修饰的核苷酸和核苷的非限制性实例尤其可见于公布的美国申请号PCT/US2012/058519、PCT/US2013/075177、PCT/US2014/058897、PCT/US2014/058891、PCT/US2014/070413、PCT/US2015/36773、PCT/US2015/36759、PCT/US2015/36771或PCT/IB2017/051367中，其全部以引用方式并入本文。
因此，本公开的核酸(例如，DNA核酸和RNA核酸，诸如mRNA核酸)可包含标准核苷酸和核苷、天然存在的核苷酸和核苷、非天然存在的核苷酸和核苷或它们的任何组合。
在一些实施方案中，本公开的核酸(例如，DNA核酸和RNA核酸，诸如mRNA核酸)包含各种(多于一种)不同类型的标准和/或经修饰的核苷酸和核苷。在一些实施方案中，核酸的特定区域含有一种、两种或更多种(任选地不同)类型的标准和/或经修饰的核苷酸和核苷。
在一些实施方案中，引入细胞或生物体的经修饰的RNA核酸(例如，经修饰的mRNA核酸)相对于包含标准核苷酸和核苷的未修饰的核酸分别在细胞或生物体中表现出降低的降解。
在一些实施方案中，引入细胞或生物体的经修饰的RNA核酸(例如，经修饰的mRNA核酸)相对于包含标准核苷酸和核苷的未修饰的核酸分别在细胞或生物体中表现出降低的免疫原性(例如，降低的先天应答)。
在一些实施方案中，核酸(例如，RNA核酸，诸如mRNA核酸)包含在核酸的合成期间或合成后引入以实现期望的功能或特性的非天然经修饰的核苷酸。修饰可存在于核苷酸间键联、嘌呤或嘧啶碱基或糖上。可用化学合成或用聚合酶在链的末端或链中的任何其他地方引入修饰。可化学修饰核酸的任何区域。
本公开提供了核酸(例如，RNA核酸，诸如mRNA核酸)的经修饰的核苷和核苷酸。“核苷”是指含有与有机碱(例如，嘌呤或嘧啶)或其衍生物(本文中也称作“核碱基”)组合的糖分子(例如，戊糖或核糖)或其衍生物的化合物。“核苷酸”是指核苷，包括磷酸基团。修饰的核苷酸可以通过诸如化学、酶促或重组的任何有用方法合成，以包括一个或多个修饰的或非天然的核苷。核酸可以包含连接的核苷的一个或多个区域。此类区域可能具有可变的主链键联。键联可以是标准的磷酸二酯键联，在这种情况下，核酸将包含核苷酸区域。
修饰的核苷酸碱基配对不仅涵盖标准的腺苷-胸腺嘧啶、腺苷-尿嘧啶或鸟苷-胞嘧啶碱基对，而且涵盖核苷酸和/或包含非标准或修饰碱基的修饰核苷酸之间形成的碱基对，其中氢键供体和氢键接受体的排列允许非标准碱基与标准碱基之间或两个互补的非标准碱基结构之间的氢键结，例如，在具有至少一个化学修饰的那些核酸中。此种非标准碱基配对的一个实例是修饰的核苷酸肌苷与腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶之间的碱基配对。碱基/糖或连接子的任何组合可以并入本公开的核酸中。
在一些实施方案中，核酸(例如，RNA核酸，诸如mRNA核酸)中的经修饰的核碱基包括1-甲基-假尿苷(m1ψ)、1-乙基-假尿苷(e1ψ)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、5-甲基-胞苷(m5C)和/或假尿苷(ψ)。在一些实施方案中，核酸(例如，RNA核酸，诸如mRNA核酸)中的修饰核碱基包括5-甲氧基甲基尿苷、5-甲硫基尿苷、1-甲氧基甲基假尿苷、5-甲基胞苷和/或5-甲氧基胞苷。在一些实施方案中，多核糖核苷酸包括至少两种(例如，2种、3种、4种或更多种)任何前述经修饰的核碱基的组合，包括但不限于化学修饰。
在一些实施方案中，本公开的mRNA包含在核酸的一个或多个或所有尿苷位置处的1-甲基-假尿苷(m1ψ)取代。
在一些实施方案中，本公开的mRNA包含在核酸的一个或多个或所有尿苷位置处的1-甲基-假尿苷(m1ψ)取代和在核酸的一个或多个或所有胞苷位置处的5-甲基胞苷取代。
在一些实施方案中，本公开的mRNA包含在核酸的一个或多个或所有尿苷位置处的假尿苷(ψ)取代。
在一些实施方案中，本公开的mRNA包含在核酸的一个或多个或所有尿苷位置处的假尿苷(ψ)取代和在核酸的一个或多个或所有胞苷位置处的5-甲基胞苷取代。
在一些实施方案中，本公开的mRNA包含在核酸的一个或多个或所有尿苷位置处的尿苷。
在一些实施方案中，对于特定修饰，mRNA被统一修饰(例如，完全修饰，在整个序列中修饰)。例如，核酸可用1-甲基-假尿苷统一修饰，这意味着mRNA序列中的所有尿苷残基均被1-甲基-假尿苷置换。类似地，核酸可以通过用修饰的残基(诸如上文所阐述的那些残基)置换而针对存在于序列中的任何类型的核苷残基进行统一修饰。
本公开的核酸可以沿着分子的整个长度被部分或完全修饰。例如，在本公开的核酸中，或在其预定序列区域中(例如，在包括或不包括聚(A)尾的mRNA中)，可统一修饰一种或多种或全部或给定类型的核苷酸(例如，嘌呤或嘧啶，或A、G、U、C中的任何一种或多种或所有)。在一些实施方案中，本公开的核酸中(或其序列区域中)的所有核苷酸X都是经修饰的核苷酸，其中X可以是核苷酸A、G、U、C中的任一种，或组合A+G、A+U、A+C、G+U、G+C、U+C、A+G+U、A+G+C、G+U+C或A+G+C中的任一种。
核酸可含有约1％至约100％的经修饰的核苷酸(相对于总核苷酸含量，或相对于一种或多种类型的核苷酸，即，A、G、U或C中的任何一者或多者)或任何中间百分比(例如，1％至20％、1％至25％、1％至50％、1％至60％、1％至70％、1％至80％、1％至90％、1％至95％、10％至20％、10％至25％、10％至50％、10％至60％、10％至70％、10％至80％、10％至90％、10％至95％、10％至100％、20％至25％、20％至50％、20％至60％、20％至70％、20％至80％、20％至90％、20％至95％、20％至100％、50％至60％、50％至70％、50％至80％、50％至90％、50％至95％、50％至100％、70％至80％、70％至90％、70％至95％、70％至100％、80％至90％、80％至95％、80％至100％、90％至95％、90％至100％和95％至100％)。应当理解，任何剩余的百分比都是由未修饰的A、G、U或C的存在所占的。
mRNA可含有最少1％和最多100％的经修饰的核苷酸，或任何中间百分比，诸如至少5％的经修饰的核苷酸、至少10％的经修饰的核苷酸、至少25％的经修饰的核苷酸、至少50％的经修饰的核苷酸、至少80％的经修饰的核苷酸、或至少90％的经修饰的核苷酸。例如，核酸可含有经修饰的嘧啶，诸如经修饰的尿嘧啶或胞嘧啶。在一些实施方案中，核酸中至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少80％、至少90％或100％的尿嘧啶被经修饰尿的嘧啶(例如，5-取代的尿嘧啶)置换。经修饰的尿嘧啶可被具有单一独特结构的化合物置换，或者可被具有不同结构(例如，2、3、4或更多个独特结构)的多种化合物置换。在一些实施方案中，核酸中至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少80％、至少90％或100％的胞嘧啶被经修饰的胞嘧啶(例如，5-取代的胞嘧啶)置换。经修饰的胞嘧啶可被具有单一独特结构的化合物置换，或者可被具有不同结构(例如，2、3、4或更多个独特结构)的多种化合物置换。
非翻译区(UTR)
本公开的mRNA可包含一个或多个充当或起非翻译区作用的区域或部分。当mRNA被设计为编码至少一种感兴趣的抗原时，核酸可包含这些非翻译区(UTR)中的一个或多个。核酸的野生型非翻译区被转录但不被翻译。在mRNA中，5′UTR在转录起始位点开始并延续至起始密码子，但不包括起始密码子；而3′UTR在终止密码子后立即开始并延续直至转录终止信号。越来越多的证据表明UTR在核酸分子的稳定性和翻译方面所起的调节作用。UTR的调节特征可掺入本公开的多核苷酸中以尤其增强分子的稳定性。也可掺入特定特征以确保在转录物被错误导向不期望的器官位点的情况下转录物的受控下调。多种5′UTR和3′UTR序列是本领域已知和可获得的。
5′UTR是mRNA的直接在起始密码子(核糖体翻译的mRNA转录物的第一个密码子)上游(5′)的区域。5′UTR不编码蛋白质(是非编码的)。天然5′UTR具有在翻译起始中起作用的特征。它们具有签名，如通常已知参与核糖体启动许多基因翻译的过程的Kozak序列。Kozak序列具有共有CCR(A/G)CCAUGG(SEQ ID NO：27)，其中R是起始密码子(AUG)上游的嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤)三碱基，其后接另一个‘G’。还已知5′UTR形成参与延伸因子结合的二级结构。
在本公开的一些实施方案中，5′UTR是异源UTR，即是在自然界中发现的与不同ORF相关的UTR。在另一个实施方案中，5′UTR是合成UTR，即在自然界中不存在。合成的UTR包括已被突变以改善其特性的UTR，例如增加基因表达的UTR以及完全合成的UTR。示例性5′UTR包括非洲爪蟾(Xenopus)或人来源的a-珠蛋白或b-珠蛋白(8278063；9012219)、人细胞色素b-245a多肽和羟基类固醇(17b)脱氢酶、以及烟草蚀刻病毒(US8278063，9012219)。还可使用CMV立即早期1(IE1)基因(US20140206753、WO2013/185069)、序列GGGAUCCUACC(SEQ IDNO：28)(WO2014144196)。在另一个实施方案中，TOP基因的5′UTR是TOP基因的缺乏5′TOP基序(寡嘧啶序列段)的5′UTR(例如，WO/2015101414、WO2015101415、WO/2015/062738、WO2015024667、WO2015024667)；可使用衍生自核糖体蛋白大32(L32)基因(WO/2015101414、WO2015101415、WO/2015/062738)的5′UTR元件、衍生自羟基类固醇(17-β)脱氢酶4基因(HSD1784)的5′UTR的5′UTR元件(WO2015024667)，或衍生自ATP5A1的5′UTR的5′UTR元件(WO2015024667)。在一些实施方案中，使用内部核糖体进入位点(IRES)代替5′UTR。
在一些实施方案中，本公开的5′UTR包含SEQ ID NO：2。
3′UTR是mRNA的直接在终止密码子(mRNA转录物的发出翻译终止信号的密码子)下游(3′)的区域。3′UTR不编码蛋白质(是非编码的)。已知天然或野生型3′UTR具有嵌入其中的腺苷和尿苷的链段。这些富含AU的签名在具有高转换率的基因中特别普遍。基于它们的序列特征和功能特性，可将富含AU的元件(ARE)分成三类(Chen等人，1995)：I类ARE在富含U的区域内含有AUUUA基序的几个分散拷贝。C-Myc和MyoD含有I类ARE。II类ARE具有两个或更多个重叠的UUAUUUA(U/A)(U/A)九聚体。含有这种类型ARE的分子包括GM-CSF和TNF-a。III类ARE定义不太明确。这些富含U的区域不含有AUUUA基序。c-Jun和肌细胞生成素是这一类的两个充分研究的实例。已知与ARE结合的大多数蛋白质使信使不稳定，而据记载ELAV家族的成员，最著名的是HuR，增加mRNA的稳定性。HuR与所有三类ARE结合。将HuR特异性结合位点工程化到核酸分子的3′UTR中将导致HuR结合，并因此导致体内信息的稳定。
3′UTR AU富集元件(ARE)的引入、去除或修饰可用于调节本公开的核酸(例如，RNA)的稳定性。当工程化特定的核酸时，可引入ARE的一个或多个拷贝以使得本公开的核酸不那么稳定，并且由此缩减翻译并减少所得蛋白质的产生。同样地，ARE可被鉴定和去除或突变以增加细胞内稳定性并因此增加所得蛋白质的翻译和生产。转染实验可在相关细胞系中使用本公开的核酸进行，并且可在转染后的不同时间点测定蛋白质产生。例如，可用不同的ARE工程分子转染细胞，并通过使用ELISA试剂盒检测相关蛋白质，并测定在转染后6小时、12小时、24小时、48小时和7天产生的蛋白质。
3′UTR可以是异源的或合成的。关于3′UTR，珠蛋白UTR，包括非洲爪蟾β-珠蛋白UTR和人β-珠蛋白UTR是本领域已知的(8278063、9012219、US20110086907)。通过首尾相连地克隆两个连续的人β-珠蛋白3′UTR，已开发了在一些细胞类型中具有增强的稳定性的经修饰的β-珠蛋白构建体，并且其是本领域公知的(US2012/0195936，WO2014/071963)。此外，a2-珠蛋白、a1-珠蛋白、UTR及其突变体也是本领域已知的(WO2015101415、WO2015024667)。非专利文献中的mRNA构建体中描述的其他3′UTR包括CYBA(Ferizi等人，2015)和白蛋白(Thess等人，2015)。其他示例性3′UTR包括牛或人生长激素(野生型或经修饰的)(WO2013/185069、US20140206753、WO2014152774)、兔β珠蛋白和乙型肝炎病毒(用3V)、α-珠蛋白3′UTR和病毒VEEV 3′UTR序列也是本领域已知的。在一些实施方案中，使用序列UUUGAAUU(WO2014144196)。在一些实施方案中，使用人和小鼠核糖体蛋白的3′UTR。其他实例包括rps9 3’UTR(WO2015101414)、图4(WO2015101415)和人白蛋白7(WO2015101415)。
在一些实施方案中，本公开的3’UTR包含SEQ ID NO：4。
本领域普通技术人员将理解，异源或合成的5′UTR可与任何期望的3′UTR序列一起使用。例如，异源5′UTR可与具有异源3”UTR的合成3′UTR一起使用。
非UTR序列也可用作核酸内的区域或亚区。例如，可将内含子或内含子序列的部分掺入本公开的核酸的区域中。内含子序列的掺入可增加蛋白质生产以及核酸水平。
特征的组合可包含在侧翼区中并且可包含在其他特征内。例如，ORF的侧翼可以是5′UTR，其可含有强Kozak翻译起始信号，和/或3′UTR，其可包括用于以模板添加聚-A尾的寡(dT)序列。5′UTR可包含来自相同和/或不同基因的第一多核苷酸片段和第二多核苷酸片段，诸如美国专利申请公开号20100293625和PCT/US2014/069155中所述的5′UTR，全文以引用方式并入本文。
应当理解，来自任何基因的任何UTR可掺入核酸的区域。此外，可利用任何已知基因的多个野生型UTR。提供不是野生型区域变体的人工UTR也在本公开的范围内。这些UTR或其部分可与它们从中选择的转录物中相同的取向放置，或者可以在取向或位置上改变。因此，5′或3′UTR可被反转、缩短、延长，用一个或多个其他5′UTR或3′UTR制成。如本文所用，当涉及UTR序列时，术语“改变的”意指UTR相对于参考序列以某种方式改变。例如，3′UTR或5′UTR可通过如上文教导的取向或位置的改变而相对于野生型或天然UTR改变，或者可通过包含附加的核苷酸、缺失核苷酸、交换或转座核苷酸而改变。产生“改变的”UTR(无论3′或5′)的这些改变中的任一种都包含变体UTR。
在一些实施方案中，可使用双重、三重或四重UTR，诸如5′UTR或3′UTR。如本文所用，“双重”UTR是其中相同UTR的两个拷贝串联或基本上串联编码的UTR。例如，可如美国专利公开20100129877中所述使用双β-珠蛋白3′UTR，其内容全文以引用方式并入本文。
具有模式化UTR也在本公开的范围内。如本文所用，“模式化UTR”是反映重复或交替模式的那些UTR，诸如重复一次、两次或多于3次的ABABAB或AABBAABBAABB或ABCABCABC或其变体。在这些模式中，每个字母A、B或C代表核苷酸水平的不同UTR。
在一些实施方案中，侧翼区选自其蛋白质共享共同功能、结构、特征或特性的转录物家族。例如，感兴趣的多肽可属于在特定细胞、组织中或在发育期间的某个时间表达的蛋白质家族。来自任何这些基因的UTR可与相同或不同蛋白质家族的任何其他UTR交换以产生新的多核苷酸。如本文所用，“蛋白质家族”在最广泛的意义上用于指共享至少一种功能、结构、特征、定位、起源或表达模式的两种或更多种感兴趣多肽的组。
非翻译区也可包括翻译增强子元件(TEE)。作为非限制性实例，TEE可包括在美国申请号20090226470中描述的那些和本领域中已知的那些，该美国申请全文以引用方式并入本文。
RNA的体外转录
编码本文所述的多核苷酸的cDNA可使用体外转录(IVT)系统转录。RNA的体外转录是本领域已知的，并且描述于国际公布WO2014/152027中，其全文以引用方式并入本文。在一些实施方案中，本公开的RNA根据WO 2018/053209和WO 2019/036682中描述的任一种或多种方法制备，其各自以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，在体外转录反应中使用非扩增的线性化DNA模板生成RNA转录物，以生成RNA转录物。在一些实施方案中，模板DNA是分离的DNA。在一些实施方案中，模板DNA是cDNA。在一些实施方案中，cDNA通过RNA多核苷酸例如但不限于冠状病毒mRNA的逆转录形成。在一些实施方案中，用质粒DNA模板转染细胞，例如细菌细胞，例如大肠杆菌，例如DH-1细胞。在一些实施方案中，培养转染的细胞以复制质粒DNA，然后将其分离和纯化。在一些实施方案中，DNA模板包括RNA聚合酶启动子，例如位于感兴趣的基因的5′并与之可操作地连接的T7启动子。
在一些实施方案中，体外转录模板编码5′非翻译(UTR)区，含有开放阅读框，并编码3′UTR和聚(A)尾。体外转录模板的特定核酸序列组成和长度将取决于模板所编码的mRNA。
“5′非翻译区”(UTR)是指mRNA中不编码多肽的直接在起始密码子(即核糖体翻译的mRNA转录物的第一个密码子)上游(即5′)的区域。当生成RNA转录物时，5′UTR可包含启动子序列。此类启动子序列是本领域已知的。应当理解，此类启动子序列将不存在于本公开的疫苗中。
“3′非翻译区”(UTR)是指mRNA中不编码多肽的直接在终止密码子(即mRNA转录物的发出翻译终止信号的密码子)下游(即3′)的区域。
“开放阅读框”是以起始密码子(例如，甲硫氨酸(ATG))开始并以终止密码子(例如，TAA、TAG或TGA)结束并编码多肽的DNA的连续链段。
“聚(A)尾”是mRNA中在3′UTR下游，例如直接在下游(即3′)的含有多个连续的单磷酸腺苷的区域。聚(A)尾可含有10-300个单磷酸腺苷。例如，聚(A)尾可包含10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300个单磷酸腺苷。在一些实施方案中，聚(A)尾含有50至250个单磷酸腺苷。在相关的生物学环境中(例如，在细胞中，在体内)，聚(A)尾起到保护mRNA免于例如在细胞质中酶促降解的作用，并且有助于转录终止，和/或mRNA从细胞核输出和翻译。
在一些实施方案中，核酸包括200至3,000个核苷酸。例如，核酸可包括200至500、200至1000、200至1500、200至3000、500至1000、500至1500、500至2000、500至3000、1000至1500、1000至2000、1000至3000、1500至3000或2000至3000个核苷酸。
体外转录系统通常包括转录缓冲液、核苷三磷酸(NTP)、RNA酶抑制剂和聚合酶。
NTP可在内部制造，可选自供应商，或可如本文所述合成。NTP可选自但不限于本文所述的那些，包括天然和非天然(经修饰的)NTP。
在本公开的方法中可使用任何数量的RNA聚合酶或变体。聚合酶可选自但不限于噬菌体RNA聚合酶，例如T7 RNA聚合酶、T3RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶和/或突变聚合酶，诸如但不限于能够掺入经修饰的核酸和/或经修饰的核苷酸(包括经化学修饰的核酸和/或核苷酸)的聚合酶。一些实施方案排除了DNA酶的使用。
在一些实施方案中，RNA转录物经由酶促加帽来加帽。在一些实施方案中，RNA包含5′末端帽，例如7mG(5’)ppp(5’)NlmpNp。
化学合成
固相化学合成。本公开的核酸可使用固相技术全部或部分地制造。核酸的固相化学合成是一种自动化方法，其中分子被固定在固体载体上并在反应物溶液中逐步合成。固相合成可用于核酸序列中化学修饰的位点特异性引入。
液相化学合成。通过顺序添加单体结构单元合成本公开的核酸可在液相中进行。
合成方法的组合。上述合成方法各自具有其自身的优点和限制。已进行了尝试来组合这些方法以克服这些限制。这些方法的组合在本公开的范围内。固相或液相化学合成与酶连接的组合使用提供了产生不能通过单独的化学合成获得的长链核酸的有效方式。
核酸区域或亚区的连接
也可使用通过连接酶组装核酸。DNA或RNA连接酶通过形成磷酸二酯键促进多核苷酸链的5′和3′端的分子间连接。核酸嵌诸如合多核苷酸和/或环状核酸可通过连接一个或多个区域或亚区来制备。DNA片段可通过连接酶催化的反应接合以产生具有不同功能的重组DNA。两个寡脱氧核苷酸，一个具有5′磷酰基基团，另一个具有游离的3′羟基基团，用作DNA连接酶的底物。
纯化
本文所述的核酸的纯化可包括但不限于核酸净化、质量保证和质量控制。可通过本领域已知的方法进行净化，诸如但不限于珠(Beckman CoulterGenomics，Danvers，MA)、聚-T珠、LNATM寡聚-T捕获探针(/>Inc，Vedbaek，Denmark)或基于HPLC的纯化方法，诸如但不限于强阴离子交换HPLC、弱阴离子交换HPLC、反相HPLC(RP-HPLC)和疏水相互作用HPLC(HIC-HPLC)。术语“纯化的”当与核酸诸如“纯化的核酸”相关使用时，是指与至少一种污染物分离的核酸。“污染物”是使另一种物质不适合、不纯或劣质的任何物质。因此，纯化的核酸(例如，DNA和RNA)以与其在自然界中发现的形式或设置不同的形式或设置存在，或以与其在对其进行处理或纯化方法之前存在的形式或设置不同的形式或设置存在。
质量保证和/或质量控制检查可使用诸如但不限于凝胶电泳、UV吸收或分析HPLC的方法进行。
在一些实施方案中，可通过包括但不限于逆转录酶-PCR的方法对核酸进行测序。
定量
在一些实施方案中，本公开的核酸可在外泌体中或当衍生自一种或多种体液时被定量。体液包括外周血、血清、血浆、腹水、尿液、脑脊液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耳垢、乳汁、支气管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、考珀液或预射精液、汗液、粪便物、毛发、泪液、囊液、胸膜液和腹膜液、心包液、淋巴液、食糜、乳糜、胆汁、间质液、经血、脓液、皮脂、呕吐物、阴道分泌物、粘膜分泌物、大便水、胰液、窦腔灌洗液、支气管肺抽吸物、囊胚腔液和脐带血。另选地，外泌体可从选自由肺、心脏、胰腺、胃、肠、膀胱、肾、卵巢、睾丸、皮肤、结肠、乳腺、前列腺、脑、食道、肝和胎盘组成的组的器官回收。
可使用构建体特异性探针、细胞计量术、qRT-PCR、实时PCR、PCR、流式细胞术、电泳、质谱或它们的组合进行测定，而可使用免疫组织化学方法诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)方法分离外泌体。外泌体还可通过尺寸排阻色谱法、密度梯度离心、差速离心、纳米膜超滤、免疫吸附捕获、亲和纯化、微流体分离或它们的组合来分离。
这些方法为研究者提供了实时监测剩余或递送的核酸水平的能力。这是可能的，因为在一些实施方案中，本公开的核酸由于结构或化学修饰而不同于内源形式。
在一些实施方案中，可使用诸如但不限于紫外可见光谱(UV/Vis)的方法定量核酸。UV/Vis分光计的非限制性实例是分光计(ThermoFisher，Waltham，MA)。可分析所定量的核酸以便确定核酸是否具有正确的大小，检查核酸没有发生降解。核酸的降解可通过方法诸如但不限于琼脂糖凝胶电泳、基于HPLC的纯化方法(诸如但不限于强阴离子交换HPLC、弱阴离子交换HPLC、反相HPLC(RP-HPLC)和疏水相互作用HPLC(HIC-HPLC)、液相色谱-质谱(LCMS)、毛细管电泳(CE)和毛细管凝胶电泳(CGE))来检查。
脂质纳米颗粒制剂
在一些实施方案中，本公开的RNA(例如，mRNA)配制在脂质纳米颗粒(LNP)中。这在本文中称为LNP配制的mRNA疫苗(fLNP)。如本文所用，“脂质纳米颗粒”通常包含可电离阳离子脂质，通常为可电离氨基脂质、非阳离子脂质、固醇和PEG脂质组分以及感兴趣的核酸运载物。本发明的脂质纳米颗粒可使用本领域通常已知的组分、组合物和方法产生，参见例如PCT/US2016/052352、PCT/US2016/068300、PCT/US2017/037551、PCT/US2015/027400、PCT/US2016/047406、PCT/US2016000129、PCT/US2016/014280、PCT/US2016/014280、PCT/US2017/038426、PCT/US2014/027077、PCT/US2014/055394、PCT/US2016/52117、PCT/US2012/069610、PCT/US2017/027492、PCT/US2016/059575、PCT/US2016/069491、PCT/US2016/069493和PCT/US2014/066242，其全部以引用方式全文并入本文。
本公开的疫苗通常配制在脂质纳米颗粒中。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含至少一种可电离氨基脂质、至少一种非阳离子脂质、至少一种固醇和/或至少一种聚乙二醇(PEG)修饰的脂质。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含相对于其他脂质组分，摩尔比为20-60％的氨基脂质。举例来说，脂质纳米颗粒可以包含摩尔比为20-50％、20-40％、20-30％、30-60％、30-50％、30-40％、40-60％、40-50％或50-60％的氨基脂质。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含摩尔比为20％、30％、40％、50或60％的氨基脂质。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含相对于其它脂质组分，摩尔比为5-25％的磷脂。举例来说，脂质纳米颗粒可以包含摩尔比为5-30％、5-15％、5-10％、10-25％、10-20％、10-25％、15-25％、15-20％、20-25％或25-30％的磷脂。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含摩尔比为5％、10％、15％、20％、25％或30％的非阳离子脂质。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含相对于其它脂质组分，摩尔比为25-55％的结构脂质。举例来说，脂质纳米颗粒可以包含摩尔比为10-55％、25-50％、25-45％、25-40％、25-35％、25-30％、30-55％、30-50％、30-45％、30-40％、30-35％、35-55％、35-50％、35-45％、35-40％、40-55％、40-50％、40-45％、45-55％、45-50％或50-55％的结构脂质。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含摩尔比为10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或55％的结构脂质。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含相对于其它脂质组分，摩尔比为0.5-15％的PEG脂质。举例来说，脂质纳米颗粒可以包含摩尔比为0.5-10％、0.5-5％、1-15％、1-10％、1-5％、2-15％、2-10％、2-5％、5-15％、5-10％或10-15％的PEG脂质。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含摩尔比为0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％的PEG-脂质。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含摩尔比为20-60％的氨基脂质、5-25％的磷脂、25-55％的结构脂质和0.5-15％的PEG脂质。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含摩尔比为20-60％的氨基脂质、5-30％的磷脂、10-55％的结构脂质和0.5-15％的PEG脂质。
氨基脂质
在一些方面，本公开的氨基脂质可以是式(I)化合物中的一者或多者：
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中：
R1选自由C5-30烷基、C5-20烯基、-R*YR”、-YR”和
-R”M’R’组成的组；
R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR”、-YR”和-R*OR”组成的组，或R2和R3连同其所附接的原子形成杂环或碳环；
R4选自由氢、C3-6碳环、-(CH2)nQ、
-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2和未取代的C1-6烷基组成的组，其中Q选自碳环、杂环、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-N(R)2、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-N(R)R8、-N(R)S(O)2R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(＝NR9)N(R)2、-N(R)C(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(＝NR9)N(R)2、-N(OR)C(＝CHR9)N(R)2、-C(＝NR9)N(R)2、-C(＝NR9)R、-C(O)N(R)OR和-C(R)N(R)2C(O)OR，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5；
每个R5独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
每个R6独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)-M”-C(O)O-、
-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、芳基基团和杂芳基基团，其中M”是键、C1-13烷基或C2-13烯基；
R7选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
R8选自由C3-6碳环和杂环组成的组；
R9选自由H、CN、NO2、C1-6烷基、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2-6烯基、C3-6碳环和杂环组成的组；
每个R独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
每个R’独立地选自由C1-18烷基、C2-18烯基、
-R*YR”、-YR”和H组成的组；
每个R″独立地选自由C3-15烷基和C3-15烯基组成的组；
每个R*独立地选自由C1-12烷基和C2-12烯基组成的组；
每个Y独立地是C3-6碳环；
每个X独立地选自由F、Cl、Br和I组成的组；并且
m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13；并且其中当R4是-(CH2)nQ、
-(CH2)nCHQR、-CHQR或-CQ(R)2时，则(i)当n是1、2、3、4或5时，Q不是-N(R)2，或(ii)当n是1或2时，Q不是5、6或7元杂环烷基。
在某些实施方案中，式(I)化合物的子集包括式(I-A)的那些：
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中l选自1、2、3、4和5；m选自5、6、7、8和9；M1是键或M’；R4是氢、未取代的C1-3烷基或-(CH2)nQ，其中Q是OH、-NHC(S)N(R)2、-NHC(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、
-N(R)R8、-NHC(＝NR9)N(R)2、-NHC(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、杂芳基或杂环烷基；M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、
-OC(O)-M”-C(O)O-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、-S-S-、芳基基团和杂芳基基团；并且R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基和C2-14烯基组成的组。例如，m是5、7或9。例如，Q是OH、-NHC(S)N(R)2或-NHC(O)N(R)2。例如，Q是-N(R)C(O)R或-N(R)S(O)2R。
在某些实施方案中，式(I)化合物的子集包括式(I-B)的那些：
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中所有变量如本文所定义。例如，m选自5、6、7、8和9；R4是氢、未取代的C1-3烷基或-(CH2)nQ，其中Q是OH、-NHC(S)N(R)2、
-NHC(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)R8、-NHC(＝NR9)N(R)2、-NHC(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、杂芳基或杂环烷基；M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)-M”-C(O)O-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、-S-S-、芳基基团和杂芳基基团；并且R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基和C2-14烯基组成的组。例如，m是5、7或9。例如，Q是OH、-NHC(S)N(R)2或-NHC(O)N(R)2。例如，Q是-N(R)C(O)R或-N(R)S(O)2R。
在某些实施方案中，式(I)化合物的子集包括式(II)的那些：
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中l选自1、2、3、4和5；M1是键或M’；R4是氢、未取代的C1-3烷基或-(CH2)nQ，其中n是2、3或4，并且Q是OH、-NHC(S)N(R)2、
-NHC(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)R8、-NHC(＝NR9)N(R)2、-NHC(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、杂芳基或杂环烷基；M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)-M”-C(O)O-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、-S-S-、芳基基团和杂芳基基团；并且R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基和C2-14烯基组成的组。
在一个实施方案中，式(I)化合物具有式(IIa)，
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中R4如本文所描述。
在另一个实施方案中，式(I)化合物具有式(IIb)，
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中R4如本文所描述。
在另一个实施方案中，式(I)化合物具有式(IIc)或(IIe)：
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中R4如本文所描述。
在另一个实施方案中，式(I)化合物具有式(IIf)：
或其N-氧化物，或其盐或异构体，
其中M是-C(O)O-或-OC(O)-，M″是C1-6烷基或C2-6烯基，R2和R3独立地选自由C5-14烷基和C5-14烯基组成的组，并且n选自2、3和4。
在又一个实施方案中，式(I)化合物具有式(IId)，
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中n为2、3或4；并且m、R′、R”和R2至R6如本文所述。举例来说，R2和R3中的每一者可以独立地选自由C5-14烷基和C5-14烯基组成的组。
在又一个实施方案中，式(I)化合物具有式(IIg)，
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中l选自1、2、3、4和5；m选自5、6、7、8和9；M1是键或M’；M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)-M”-C(O)O-、-C(O)N(R’)-、
-P(O)(OR’)O-、-S-S-、芳基基团和杂芳基基团；并且R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基和C2-14烯基组成的组。例如，M”是C1-6烷基(例如，C1-4烷基)或C2-6烯基(例如C2-4烯基)。在一些实施方案中，R2和R3独立地选自由C5-14烷基和C5-14烯基组成的组。
在一些实施方案中，氨基脂质是美国申请号62/220,091、62/252,316、62/253,433、62/266,460、62/333,557、62/382,740、62/393,940、62/471,937、62/471,949、62/475,140和62/475,166以及PCT申请号PCT/US2016/052352中所描述的化合物中的一者或多者。
在一些实施方案中，氨基脂质是化合物1：
或其盐。
在一些实施方案中，氨基脂质是化合物2：
或其盐。
根据式(I)、(I-A)、(I-B)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IIf)或(IIg)的脂质的中心胺部分可在生理pH下质子化。因此，脂质在生理pH下可具有正电荷或部分正电荷。此类氨基脂质可称为阳离子脂质、可电离脂质、阳离子氨基脂质或可电离氨基脂质。氨基脂质还可以是两性离子的，即，具有正电荷和负电荷两者的中性分子。
在一些方面，本公开的氨基脂质可以是式(III)化合物中的一者或多者，
或其盐或异构体，其中
W是
环A为
t为1或2；
A1和A2各自独立地选自CH或N；
Z是CH2或不存在，其中当Z是CH2时，虚线(1)和(2)各自表示单键；并且当Z不存在时，虚线(1)和(2)都不存在；
R1、R2、R3、R4和R5独立地选自由C5-20烷基、C5-20烯基、-R″MR′、-R*YR″、-YR″和-R*OR″组成的组；
RX1和RX2各自独立地是H或C1-3烷基；
每个M独立地选自由-C(O)O-、-OC(O)-、
-OC(O)O-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、
-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-C(O)S-、-SC(O)-、芳基基团和杂芳基基团组成的组；
M*是C1-C6烷基，
W1和W2各自独立地选自由-O-和-N(R6)-组成的组；
每个R6独立地选自由H和C1-5烷基组成的组；
X1、X2和X3独立地选自由键、-CH2-、-(CH2)2-、-CHR-、-CHY-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-(CH2)n-C(O)-、-C(O)-(CH2)n-、-(CH2)n-C(O)O-、-OC(O)-(CH2)n-、-(CH2)n-OC(O)-、-C(O)O-(CH2)n-、-CH(OH)-、-C(S)-和-CH(SH)-组成的组；
每个Y独立地是C3-6碳环；
每个R*独立地选自由C1-12烷基和C2-12烯基组成的组；
每个R独立地选自由C1-3烷基和C3-6碳环组成的组；
每个R′独立地选自由C1-12烷基、C2-12烯基和H组成的组；
每个R″独立地选自由C3-12烷基、C3-12烯基和-R*MR′组成的组；并且
n是1-6的整数；
其中当环A为时，则
i)X1、X2和X3中的至少一者不是-CH2-；和/或
ii)R1、R2、R3、R4和R5中的至少一者是-R″MR′。
在一些实施方案中，化合物具有式(IIIa1)-(IIIa8)中的任一者：
/>
在一些实施方案中，氨基脂质是
或其盐。
式(III)、(IIIa1)、(IIIa2)、(IIIa3)、(IIIa4)、(IIIa5)、(IIIa6)、(IIIa7)或(IIIa8)的脂质的中心胺部分可以在生理pH下质子化。因此，脂质在生理pH值下可以具有正电荷或部分正电荷。
磷脂
本文所公开的脂质纳米颗粒组合物的脂质组合物可以包含一种或多种磷脂，例如，一种或多种饱和或(多)不饱和磷脂或它们的组合。一般来说，磷脂包含磷脂部分和一个或多个脂肪酸部分。
磷脂部分可选自例如由磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、2-溶血磷脂酰胆碱和鞘磷脂组成的非限制性组。
脂肪酸部分可选自例如由月桂酸、肉豆蔻酸、肉豆蔻油酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚麻油酸、α-次亚麻油酸、芥子酸、植烷酸、花生酸、花生油酸、二十碳五烯酸、山嵛酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸组成的非限制性组。
特定磷脂可促进与膜的融合。举例来说，阳离子磷脂可以与膜(例如，细胞膜或细胞内膜)的一种或多种带负电荷的磷脂相互作用。磷脂与膜的融合可以允许含脂质的组合物(例如，LNP)的一种或多种要素(例如，治疗剂)通过膜，从而允许例如将所述一种或多种要素递送至靶组织。
还预期非天然磷脂物质，包括具有包括支链、氧化、环化和炔烃在内的修饰和取代的天然物质。举例来说，磷脂可以被一种或多种炔烃(例如，其中一个或多个双键被三键置换的烯基)官能化或与所述一种或多种炔烃交联。在适当反应条件下，炔烃基团可以在暴露于叠氮化物后经历铜催化的环加成。此类反应可用于官能化纳米粒子组合物的脂质双层以促进膜渗透或细胞识别，或者可用于使纳米粒子组合物缀合于可用组分，诸如靶向或成像部分(例如染料)。
磷脂包括但不限于甘油磷脂，诸如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油和磷脂酸。磷脂还包括磷酸鞘脂，诸如鞘磷脂。
在一些实施方案中，本发明的磷脂包含1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE)、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1，2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DMPC)、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1，2-二(十一烷酰基)-sn-甘油-磷酸胆碱(DUPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1，2-二-O-十八烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18：0二醚PC)、1-油酰基-2胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16 Lyso PC)、1，2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1，2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1，2-二(二十二碳六烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1，2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME 16.0 PE)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二(二十二碳六烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-外消旋-(1-甘油)钠盐(DOPG)、鞘磷脂和它们的混合物。
在某些实施方案中，在本发明中有用或可能有用的磷脂是DSPC的类似物或变体。在某些实施方案中，可用于或潜在可用于本发明的磷脂是式(IV)化合物：
或其盐，其中：
每个R1独立地是任选取代的烷基；或者任选地两个R1与间插原子连接在一起以形成任选取代的单环碳环基或任选取代的单环杂环基；或者任选地三个R1与间插原子连接在一起以形成任选取代的双环碳环基或任选取代的双环杂环基；
n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
m是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
A具有下式：
L2在每种情况下独立地是键或任选取代的C1-6亚烷基，其中任选取代的C1-6亚烷基的一个亚甲基单元任选地被O、N(RN)、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O或NRNC(O)N(RN)置换；
R2在每种情况下独立地是任选取代的C1-30烷基、任选取代的C1-30烯基或任选取代的C1-30炔基；任选地其中R2的一个或多个亚甲基单元独立地被任选取代的亚碳环基、任选取代的亚杂环基、任选取代的亚芳基、任选取代的亚杂芳基、N(RN)、O、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、NRNC(O)N(RN)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O、C(O)S、SC(O)、C(＝NRN)、C(＝NRN)N(RN)、NRNC(＝NRN)、NRNC(＝NRN)N(RN)、C(S)、C(S)N(RN)、NRNC(S)、NRNC(S)N(RN)、S(O)、OS(O)、S(O)O、OS(O)O、OS(O)2、S(O)2O、OS(O)2O、N(RN)S(O)、S(O)N(RN)、N(RN)S(O)N(RN)、OS(O)N(RN)、N(RN)S(O)O、S(O)2、N(RN)S(O)2、S(O)2N(RN)、N(RN)S(O)2N(RN)、OS(O)2N(RN)或N(RN)S(O)2O置换；
RN在每种情况下独立地是氢、任选取代的烷基或氮保护基；
环B是任选取代的碳环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基；并且
p是1或2；
前提条件是所述化合物不具有下式：
其中R2的每个示例独立地为未取代的烷基、未取代的烯基或未取代的炔基。
在一些实施方案中，磷脂可以是PCT申请号PCT/US2018/037922中描述的磷脂中的一种或多种。
结构脂质
本文所公开的药物组合物的脂质组合物可以包含一种或多种结构脂质。如本文所用，术语“结构脂质”是指固醇并且还指含有固醇部分的脂质。
在脂质纳米粒子中并入结构脂质可帮助减轻粒子中的其他脂质的聚集。结构脂质可选自包括但不限于以下的组：胆固醇、粪固醇、谷甾醇、麦角固醇、菜油甾醇、豆甾醇、菜子甾醇、番茄碱(tomatidine)、番茄素(tomatine)、熊果酸、α-生育酚、藿烷、植物固醇、类固醇以及它们的混合物。在一些实施方案中，结构脂质为固醇。如本文所定义，“固醇”是由类固醇类醇组成的类固醇子组。在某些实施方案中，结构脂质是类固醇。在某些实施方案中，结构脂质是胆固醇。在某些实施方案中，结构脂质是胆固醇的类似物。在某些实施方案中，结构脂质是α-生育酚。
在一些实施方案中，结构脂质可以是美国申请号16/493,814中所描述的一种或多种结构脂质。
聚乙二醇(PEG)-脂质
本文所公开的药物组合物的脂质组合物可以包含一种或多种聚乙二醇(PEG)脂质。
如本文所用，术语“PEG-脂质”是指聚乙二醇(PEG)修饰的脂质。PEG-脂质的非限制性实例包括PEG修饰的磷脂酰乙醇胺和磷脂酸、PEG-神经酰胺缀合物(例如，PEG-CerC14或PEG-CerC20)、PEG修饰的二烷基胺和PEG修饰的1，2-二酰氧基丙-3-胺。此类脂质也被称作聚乙二醇化脂质。举例来说，PEG脂质可以是PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC或PEG-DSPE脂质。
在一些实施方案中，PEG-脂质包括但不限于1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇(PEG-DMG)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)](PEG-DSPE)、PEG-二硬脂基甘油(PEG-DSG)、PEG-二棕榈油烯基、PEG-二油烯基、PEG-二硬脂基、PEG-二酰基甘酰胺(PEG-DAG)、PEG-二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(PEG-DPPE)或PEG-1，2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-胺(PEG-c-DMA)。
在一个实施方案中，PEG-脂质选自由PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG修饰的二烷基甘油和它们的混合物组成的组。在一些实施方案中，PEG修饰的脂质是PEG-DMG、PEG-c-DOMG(也称作PEG-DOMG)、PEG-DSG和/或PEG-DPG。
在一些实施方案中，PEG-脂质的脂质部分包括长度为约C14至约C22、优选约C14至约C16的那些。在一些实施方案中，PEG部分(例如，mPEG-NH2)的大小为约1000、2000、5000、10,000、15,000或20,000道尔顿。在一个实施方案中，PEG-脂质是PEG2k-DMG。
在一个实施方案中，本文所述的脂质纳米粒子可包含PEG脂质，其为不可扩散PEG。不可扩散PEG的非限制性实例包括PEG-DSG和PEG-DSPE。
PEG-脂质是本领域中已知的，诸如美国专利号8158601和国际公布号WO 2015/130584 A2中所描述的那些，所述文献以全文引用的方式并入本文中。
一般来说，本文所述的各式的一些其他脂质组分(例如PEG脂质)可如2016年12月10日提交的标题为“Compositions and Methods for Delivery of Therapeutic Agents”的国际专利申请第PCT/US2016/000129号中所述合成，所述专利申请通过引用整体并入。
脂质纳米颗粒组合物的脂质组分可以包括一种或多种包含聚乙二醇的分子，诸如PEG或PEG修饰的脂质。此类物质可替代地称为PEG化脂质。PEG脂质是用聚乙二醇修饰的脂质。PEG脂质可选自包括PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG修饰的二烷基甘油以及它们的混合物的非限制性组。举例来说，PEG脂质可以是PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC或PEG-DSPE脂质。
在一些实施方案中，PEG修饰的脂质是PEG DMG的修饰形式。PEG-DMG具有以下结构：
在一个实施方案中，可用于本发明的PEG脂质可为描述于国际公布第WO2012099755号中的PEG化脂质，所述公布的内容通过引用整体并入本文。本文所述的这些示例性PEG脂质中的任一者均可经修饰为在PEG链上包含羟基。在某些实施方案中，PEG脂质是PEG-OH脂质。如本文一般所定义，“PEG-OH脂质”(本文中也称为“羟基-PEG化脂质”)是在脂质上具有一个或多个羟基(-OH)基团的PEG化脂质。在某些实施方案中，PEG-OH脂质包含在PEG链上的一个或多个羟基。在某些实施方案中，PEG-OH或羟基-PEG化脂质包含在PEG链的末端的-OH基团。每种可能性代表本发明的单独实施方案。
在某些实施方案中，可用于本发明的PEG脂质是式(II)化合物。本文提供了式(V)化合物：
或其盐，其中：
R3是-ORO；
RO是氢、任选取代的烷基或氧保护基；
r是介于1与100之间的整数，首尾包括在内；
L1是任选取代的C1-10亚烷基，其中任选取代的C1-10亚烷基的至少一个亚甲基独立地被任选取代的亚碳环基、任选取代的亚杂环基、任选取代的亚芳基、任选取代的亚杂芳基、O、N(RN)、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O或NRNC(O)N(RN)置换；
D是通过点击化学获得的部分或在生理条件下可裂解的部分；
m是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
A具有下式：
L2在每种情况下独立地是键或任选取代的C1-6亚烷基，其中任选取代的C1-6亚烷基的一个亚甲基单元任选地被O、N(RN)、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O或NRNC(O)N(RN)置换；
R2在每种情况下独立地是任选取代的C1-30烷基、任选取代的C1-30烯基或任选取代的C1-30炔基；任选地其中R2的一个或多个亚甲基单元独立地被任选取代的亚碳环基、任选取代的亚杂环基、任选取代的亚芳基、任选取代的亚杂芳基、N(RN)、O、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、NRNC(O)N(RN)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O、C(O)S、SC(O)、C(＝NRN)、C(＝NRN)N(RN)、NRNC(＝NRN)、NRNC(＝NRN)N(RN)、C(S)、C(S)N(RN)、NRNC(S)、NRNC(S)N(RN)、S(O)、OS(O)、S(O)O、OS(O)O、OS(O)2、S(O)2O、OS(O)2O、N(RN)S(O)、S(O)N(RN)、N(RN)S(O)N(RN)、OS(O)N(RN)、N(RN)S(O)O、S(O)2、N(RN)S(O)2、S(O)2N(RN)、N(RN)S(O)2N(RN)、OS(O)2N(RN)或N(RN)S(O)2O置换；
RN在每种情况下独立地是氢、任选取代的烷基或氮保护基；
环B是任选取代的碳环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基；并且
p是1或2。
在某些实施方案中，式(V)化合物是PEG-OH脂质(即，R3是-ORO，并且RO是氢)。在某些实施方案中，式(V)化合物具有式(V-OH)：
或其盐。
在某些实施方案中，可用于本发明的PEG脂质是PEG化的脂肪酸。在某些实施方案中，可用于本发明的PEG脂质是式(VI)化合物。本文提供了式(VI)化合物：
或其盐，其中：
R3是-ORO；
RO是氢、任选取代的烷基或氧保护基；
r是介于1与100之间的整数，首尾包括在内；
R5是任选取代的C10-40烷基、任选取代的C10-40烯基或任选取代的C10-40炔基；并且任选地R5的一个或多个亚甲基被任选取代的亚碳环基、任选取代的亚杂环基、任选取代的亚芳基、任选取代的亚杂芳基、N(RN)、O、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、NRNC(O)N(RN)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O、C(O)S、SC(O)、C(＝NRN)、C(＝NRN)N(RN)、NRNC(＝NRN)、NRNC(＝NRN)N(RN)、C(S)、C(S)N(RN)、NRNC(S)、NRNC(S)N(RN)、S(O)、OS(O)、S(O)O、OS(O)O、OS(O)2、S(O)2O、OS(O)2O、N(RN)S(O)、S(O)N(RN)、N(RN)S(O)N(RN)、OS(O)N(RN)、N(RN)S(O)O、S(O)2、N(RN)S(O)2、S(O)2N(RN)、N(RN)S(O)2N(RN)、OS(O)2N(RN)或N(RN)S(O)2O置换；并且
RN在每种情况下独立地是氢、任选取代的烷基或氮保护基。
在某些实施方案中，式(VI)化合物具有式(VI-OH)：
或其盐。在一些实施方案中，r是40-50。
在其他实施方案中，式(VI)化合物是：
或其盐。
在一个实施方案中，式(VI)化合物是
在一些方面，本文所公开的药物组合物的脂质组合物不包含PEG-脂质。
在一些实施方案中，PEG-脂质可以是美国申请号US15/674,872中所描述的一种或多种PEG脂质。
在一些实施方案中，本发明的LNP包含式I、II或III中任一种的氨基脂质、包含DSPC的磷脂、结构脂质和包含PEG-DMG的PEG脂质。
在一些实施方案中，本发明的LNP包含式I、II或III中任一种的氨基脂质、包含DSPC的磷脂、结构脂质和包含具有式VI的化合物的PEG脂质。
在一些实施方案中，本发明的LNP包含式I、II或III的氨基脂质、包含具有式IV的化合物的磷脂、结构脂质和包含具有式V或VI的化合物的PEG脂质。
在一些实施方案中，本发明的LNP包含式I、II或III的氨基脂质、包含具有式IV的化合物的磷脂、结构脂质和包含具有式V或VI的化合物的PEG脂质。
在一些实施方案中，本发明的LNP包含式I、II或III的氨基脂质、具有式IV的磷脂、结构脂质和包含具有式VI的化合物的PEG脂质。
在一些实施方案中，本发明的LNP包含约2∶1至约30∶1的N∶P比。
在一些实施方案中，本发明的LNP包含约6∶1的N∶P比。
在一些实施方案中，本发明的LNP包含约3∶1、4∶1或5∶1的N∶P比。
在一些实施方案中，本发明的LNP包含约10∶1至约100∶1的氨基脂质组分与RNA的重量/重量比。
在一些实施方案中，本发明的LNP包含约20∶1的氨基脂质组分与RNA的重量/重量比。
在一些实施方案中，本发明的LNP包含约10∶1的氨基脂质组分与RNA的重量/重量比。
在一些实施方案中，本发明的LNP具有约30nm至约150nm的平均直径。
在一些实施方案中，本发明的LNP具有约60nm至约120nm的平均直径。
如本文所公开的，脂质纳米颗粒(LNP)是指纳米级构建体(例如，纳米颗粒，通常直径小于100nm)，其包含以基本上球形(即，球状体)几何形状排列的脂质分子，有时包封一种或多种附加的分子种类。LNP可包含一种或多种类型的脂质，包括但不限于氨基脂质(例如，可电离的氨基脂质)、中性脂质、非阳离子脂质、带电荷脂质、PEG修饰的脂质、磷脂、结构脂质和固醇。在一些实施方案中，LNP还可包含一种或多种运载物分子，包括但不限于核酸(例如，mRNA、质粒DNA、DNA或RNA寡核苷酸、siRNA、shRNA、snRNA、snoRNA、lncRNA等)、小分子、蛋白质和肽。LNP可具有单层结构(即，具有围绕中心区域的单个脂质层或脂质双层)或多层结构(即，具有围绕中心区域的多于一个脂质层或脂质双层)。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒可以是脂质体。脂质体是包含脂质的纳米颗粒，这些脂质围绕中心区域排列成一个或多个同心脂质双层。脂质体的中心区域可包含水溶液、悬浮液或其他水性组合物。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒可包含两种或更多种组分(例如，氨基脂质和核酸、PEG-脂质、磷脂、结构脂质)。例如，脂质纳米颗粒可包含氨基脂质和核酸。包含脂质纳米颗粒(诸如本文所述的那些)的组合物可用于多种应用，包括治疗有效负载的隐身递送、具有最小的不良先天免疫应答。
核酸的有效体内递送代表了持续的医学挑战。外源核酸(即，源自细胞或生物体的外部)在体内容易例如被免疫系统降解。因此，将核酸有效递送至细胞通常需要使用颗粒载体(例如，脂质纳米颗粒)。颗粒载体应被配制成具有最小的颗粒聚集，在细胞内递送前相对稳定，在细胞内有效递送核酸，并且无免疫应答或免疫应答最小。为了实现最小的颗粒聚集和递送前稳定性，许多常规颗粒载体依赖于某些组分(例如，PEG-脂质)的存在和/或浓度。然而，已发现某些组分可降低包封的核酸(例如，mRNA分子)的稳定性。降低的稳定性可能限制颗粒载体的广泛适用性。因此，仍然需要改善包封在脂质纳米颗粒内的核酸(例如，mRNA)的稳定性的方法。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含一种或多种可电离分子、多核苷酸和任选的组分，例如结构脂质、固醇、中性脂质、磷脂和能够减少颗粒聚集的分子(例如，聚乙二醇(PEG)、PEG修饰的脂质)，诸如上述那些。
在一些实施方案中，本文所述的LNP可包含一种或多种可电离分子(例如，氨基脂质或可电离脂质)。可电离分子可包含带电荷基团并且可具有一定的pKa。在某些实施方案中，可电离分子的pKa可大于或等于约6、大于或等于约6.2、大于或等于约6.5、大于或等于约6.8、大于或等于约7、大于或等于约7.2、大于或等于约7.5、大于或等于约7.8、大于或等于约8。在一些实施方案中，可电离分子的pKa可以小于或等于约10、小于或等于约9.8、小于或等于约9.5、小于或等于约9.2、小于或等于约9.0、小于或等于约8.8、或小于或等于约8.5。上述范围的组合也是可能的(例如，大于或等于6且小于或等于约8.5)。其他范围也是可能的。在多于一种类型的可电离分子存在于颗粒中的实施方案中，每种类型的可电离分子可独立地具有在一个或多个上述范围内的pKa。
一般来说，可电离分子包含一个或多个带电荷基团。在一些实施方案中，可电离分子可以是带正电荷或带负电荷的。例如，可电离分子可以是带正电荷的。例如，可电离分子可包含胺基团。如本文所用，术语“可电离分子”具有其在本领域中的普通含义，并且可指包含一个或多个带电荷部分的分子或基质。如本文所用，“带电荷部分”是携带形式电子电荷的化学部分，例如为单价(+1或-1)、二价(+2或-2)、三价(+3或-3)等。带电荷部分可以是阴离子的(即，带负电荷)或阳离子的(即，带正电荷)。带正电荷部分的实例包括胺基团(例如，伯胺、仲胺和/或叔胺)、铵基团、吡啶鎓基团、胍鎓基团和咪唑鎓基团。在一个特定实施方案中，带电荷部分包含胺基。带负电荷的基团或其前体的实例包括羧酸根基团、磺酸根基团、硫酸根基团、膦酸根基团、磷酸根基团、羟基基团等。带电荷部分的电荷在一些情况下可随环境条件而变化，例如，pH的变化可改变所述部分的电荷，和/或使所述部分变得带电荷或不带电荷。一般来说，可根据需要选择分子和/或基质的电荷密度。
在一些情况下，可电离分子(例如，氨基脂质或可电离脂质)可包括一个或多个可被转化成带电荷部分的前体部分。例如，可电离分子可包括可水解形成带电荷部分的中性部分，诸如上述那些。作为非限制性具体实例，分子或基质可包括酰胺，其可分别水解形成胺。本领域普通技术人员将能够确定给定的化学部分是否携带形式电荷(例如，通过检查、pH滴定、离子电导率测量等)，和/或给定的化学部分是否可反应(例如，水解)以形成携带形式电荷的化学部分。
可电离分子(例如，氨基脂质或可电离脂质)可具有任何合适的分子量。在某些实施方案中，可电离分子的分子量小于或等于约2,500g/mol、小于或等于约2,000g/mol、小于或等于约1,500g/mol、小于或等于约1,250g/mol、小于或等于约1,000g/mol、小于或等于约900g/mol、小于或等于约800g/mol、小于或等于约700g/mol、小于或等于约600g/mol、小于或等于约500g/mol、小于或等于约400g/mol、小于或等于约300g/mol、小于或等于约200g/mol或小于或等于约100g/mol。在一些情况下，可电离分子的分子量大于或等于约100g/mol、大于或等于约200g/mol、大于或等于约300g/mol、大于或等于约400g/mol、大于或等于约500g/mol、大于或等于约600g/mol、大于或等于约700g/mol、大于或等于约1000g/mol、大于或等于约1,250g/mol、大于或等于约1,500g/mol、大于或等于约1,750g/mol、大于或等于约2,000g/mol或大于或等于约2,250g/mol。上述范围的组合(例如，至少约200g/mol且小于或等于约2,500g/mol)也是可能的。在多于一种类型的可电离分子存在于颗粒中的实施方案中，每种类型的可电离分子可独立地具有在一个或多个上述范围内的分子量。
在一些实施方案中，颗粒内单一类型的可电离分子(例如，氨基脂质或可电离脂质)和/或所有可电离分子的百分比(例如，按重量计或按摩尔计)可大于或等于约15％、大于或等于约16％、大于或等于约17％、大于或等于约18％、大于或等于约19％、大于或等于约20％、大于或等于约21％、大于或等于约22％、大于或等于约23％、大于或等于约24％、大于或等于约25％、大于或等于约30％、大于或等于约35％、大于或等于约40％、大于或等于约42％、大于或等于约45％、大于或等于约48％、大于或等于约50％、大于或等于约52％、大于或等于约55％、大于或等于约58％、大于或等于约60％、大于或等于约62％、大于或等于约65％或大于或等于约68％。在一些情况下，百分比(例如，按重量计或按摩尔计)可小于或等于约70％、小于或等于约68％、小于或等于约65％、小于或等于约62％、小于或等于约60％、小于或等于约58％、小于或等于约55％、小于或等于约52％、小于或等于约50％或小于或等于约48％。上述范围的组合也是可能的(例如，大于或等于20％且小于或等于约60％、大于或等于40％且小于或等于约55％等)。在多于一种类型的可电离分子存在于颗粒中的实施方案中，每种类型的可电离分子可独立地具有在一个或多个上述范围内的百分比(例如，按重量计或按摩尔计)。百分比(例如，按重量计或按摩尔计)可通过使用例如有机溶剂从干燥颗粒中提取可电离分子，并使用高压液相色谱(即，HPLC)、液相色谱-质谱(LC-MS)、核磁共振(NMR)或质谱(MS)测量试剂的量来确定。本领域普通技术人员知道使用上述技术确定组分的量的技术。例如，HPLC可用于通过例如将HPLC色谱图曲线下面积与标准曲线进行比较来定量组分的量。
应当理解，术语“带电荷的”或“带电荷部分”不是指分子上的“部分负电荷”或“部分正电荷”。术语“部分负电荷”和“部分正电荷”被赋予它们在本领域中的普通含义。“部分负电荷”可在官能团包含键时产生，该键被极化使得电子密度被拉向该键的一个原子，从而在该原子上产生部分负电荷。一般来说，本领域普通技术人员通常将认识到可以这种方式变得极化的键。
如本文所述，在一些实施方案中，mRNA用LNP配制，使得mRNA至少部分地被涵盖在LNP内。LNP配制的mRNA疫苗(fLNP)包括保护RNA免受可能导致mRNA降解的环境组分影响的结构。
插入和取代
本公开还包括进一步包含插入和/或取代的本公开的多核苷酸。
在一些实施方案中，多核苷酸的5′UTR可通过插入相同碱基的核苷的至少一个区域和/或串而被置换。核苷酸的区域和/或串可包括但不限于至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个或至少8个核苷酸，并且核苷酸可以是天然的和/或非天然的。作为非限制性实例，核苷酸的组可包括5-8个腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、本文公开的任何其他核苷酸的串和/或它们的组合。
在一些实施方案中，多核苷酸的5′UTR可通过插入两个不同碱基的核苷酸的至少两个区域和/或串而被置换，碱基诸如但不限于腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、本文公开的任何其他核苷酸和/或它们的组合。例如，5′UTR可通过插入5-8个腺嘌呤碱基，随后插入5-8个胞嘧啶碱基来置换。在另一个实例中，5′UTR可通过插入5-8个胞嘧啶碱基，随后插入5-8个腺嘌呤碱基来置换。
在一些实施方案中，多核苷酸可包括至少一个可被RNA聚合酶识别的转录起始位点下游的取代和/或插入。作为非限制性实例，通过取代转录起始位点正下游的区域(诸如但不限于+1至+6)中的至少一个核酸，在转录起始位点下游可发生至少一个取代和/或插入。改变转录起始位点正下游的核苷酸区域可影响起始速率，增加表观核苷三磷酸(NTP)反应常数值，并增加短转录物与固化初始转录的转录复合物的解离(Brieba等人，Biochemistry(2002)41：5144-5149；其全部内容以引用方式并入本文)。至少一个核苷的修饰、取代和/或插入可引起序列的沉默突变或可引起氨基酸序列中的突变。
在一些实施方案中，多核苷酸可包括转录起始位点下游的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个或至少13个鸟嘌呤碱基的取代。
在一些实施方案中，多核苷酸可在转录起始位点正下游的区域中包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少6个鸟嘌呤碱基的取代。作为非限制性实例，如果该区域中的核苷酸是GGGAGA，则鸟嘌呤碱基可被至少1个、至少2个、至少3个或至少4个腺嘌呤核苷酸取代。在另一个非限制性实例中，如果该区域中的核苷酸是GGGAGA，则鸟嘌呤碱基可被至少1个、至少2个、至少3个或至少4个胞嘧啶碱基取代。在另一个非限制性实例中，如果该区域中的核苷酸是GGGAGA，则鸟嘌呤碱基可被至少1个、至少2个、至少3个或至少4个胸腺嘧啶和/或本文所述的任何核苷酸取代。
在一些实施方案中，多核苷酸可包括起始密码子上游的至少一个取代和/或插入。为了清楚起见，本领域技术人员将理解起始密码子是蛋白质编码区的第一个密码子，而转录起始位点是转录开始的位点。多核苷酸可以包括但不限于至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个或至少8个核苷酸碱基的取代和/或插入。核苷酸碱基可在起始密码子上游的1个、至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个位置处插入或取代。插入和/或取代的核苷酸可以是相同的碱基(例如，全A或全C或全T或全G)、两种不同的碱基(例如，A和C、A和T或C和T)、三种不同的碱基(例如，A、C和T或A、C和T)或至少四种不同的碱基。
作为非限制性实例，多核苷酸中编码区上游的鸟嘌呤碱基可被腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或本文所述的任何核苷酸取代。在另一个非限制性实例中，可设计多核苷酸中鸟嘌呤碱基的取代，以便在转录起始位点下游和起始密码子之前的区域中留下一个鸟嘌呤碱基(参见Esvelt等人Nature(2011)472(7344)：499-503；其全部内容以引用方式并入本文)。作为非限制性实例，可在转录起始位点下游但起始密码子上游的1个位置处插入至少5个核苷酸，并且至少5个核苷酸可以是相同的碱基类型。
在一些实施方案中，多核苷酸包括200至3,000个核苷酸。例如，多核苷酸可包括200至500、200至1000、200至1500、200至3000、500至1000、500至1500、500至2000、500至3000、1000至1500、1000至2000、1000至3000、1500至3000或2000至3000个核苷酸。
本文提供了用于预防和/或治疗人和其他哺乳动物的疾病的组合物(例如，药物组合物)、方法、试剂盒和试剂。该组合物可用作治疗剂或预防剂。例如，当组合物包含小核糖核酸病毒衣壳多蛋白和/或小核糖核酸病毒3C蛋白酶时，编码此类小核糖核酸病毒衣壳多蛋白和/或小核糖核酸病毒3C蛋白酶的RNA用于提供针对小核糖核酸病毒科感染的预防性或治疗性保护。在施用本公开的组合物(例如，包含编码一种或多种小核糖核酸病毒衣壳多蛋白和/或小核糖核酸病毒3C蛋白酶的一种或多种多核苷酸的组合物)后，可实现针对小核糖核酸病毒科感染的预防性保护。在一些实施方案中，小核糖核酸病毒科是肠道病毒属的成员。在一些实施方案中，肠道病毒是来自肠道病毒A-D物种的任何病毒。在一些实施方案中，肠道病毒是来自鼻病毒A-C物种的任何病毒。组合物可施用一次、两次、三次、四次或更多次。在一些方面，可将组合物施用于受感染的个体以实现治疗反应。可能需要相应地调整剂量。
可以设想，可能存在这样的情况，其中人有被多于一种感染原类型的株感染的风险。RNA(mRNA)治疗性治疗特别适合于组合接种方法，这是由于许多因素，包括但不限于生产速度、快速定制治疗以适应所感知的地理威胁的能力等。为了保护抵抗超过一种肠道病毒株，可施用组合治疗，其包括编码小核糖核酸病毒衣壳多蛋白的至少一种多肽(或其部分)的RNA，并且进一步包括编码小核糖核酸病毒3C蛋白酶的至少一种多肽(或其部分)的RNA。RNA(mRNA)可共同配制在例如单个脂质纳米颗粒(LNP)中或可配制在旨在共同施用的单独LNP中。在一些实施方案中，肠道病毒是HRV16。在一些实施方案中，肠道病毒是EV-D68。在一些实施方案中，肠道病毒是EV-A71。
预防有效剂量是在临床上可接受的水平上防止病毒感染的治疗有效剂量。在一些实施方案中，治疗有效剂量是在用于治疗的包装插页中列出的剂量。本文所用的预防性疗法是指在一定程度上防止感染增加的疗法。可完全或部分地防止感染。
在一些方面，本发明的方法涉及被动免疫哺乳动物受试者以抵抗流感病毒感染。该方法包括向受试者施用包含至少一种具有编码至少一种小核糖核酸病毒衣壳多蛋白和小核糖核酸病毒3C蛋白酶的开放阅读框的RNA多核苷酸的组合物。在一些方面，本公开的方法提供针对肠道病毒感染的预防性治疗。在一些实施方案中，肠道病毒是HRV16。在一些实施方案中，肠道病毒是EV-D68。在一些实施方案中，肠道病毒是EV-A71。
治疗的治疗性方法也包括在本发明内。在本公开的方面提供了治疗受试者中肠道病毒感染的方法。该方法包括向具有流感病毒感染的受试者施用包含至少一种具有编码至少一种小核糖核酸病毒衣壳多蛋白和小核糖核酸病毒3C蛋白酶的开放阅读框的RNA多核苷酸的组合物。在一些实施方案中，肠道病毒是HRV16。在一些实施方案中，肠道病毒是EV-D68。在一些实施方案中，肠道病毒是EV-A71。
如本文所用，术语“治疗(treat、treated或treating)”当关于障碍诸如病毒感染使用时，是指增加受试者对疾病发展的抗性或换句话讲降低受试者将响应于病毒感染而发展疾病的可能性的治疗，以及在受试者已发展疾病之后用以对抗感染或防止感染变得更糟的治疗。
本公开的RNA治疗物的“有效量”至少部分基于靶组织、靶细胞类型、施用方式、多核苷酸的物理特性(例如，经修饰的核苷的大小和程度)和RNA治疗物的其他组分以及其他决定因素来提供。增加的抗体产生可通过增加的细胞转染(用RNA治疗物转染的细胞的百分比)、增加的从多核苷酸的蛋白质翻译、减少的核酸降解(如例如通过增加的从经修饰的多核苷酸的蛋白质翻译的持续时间所证明的)或改变的宿主细胞的应答来证明。
在一些实施方案中，根据本公开的RNA治疗物(包括多核苷酸及其编码的多肽)可用于治疗疾病。
RNA治疗物可作为主动免疫方案的一部分预防性或治疗性地施用于健康个体，或者在潜伏期的感染早期或在症状出现后的活跃感染期间施用。在一些实施方案中，提供给细胞、组织或受试者的本公开的RNA治疗物的量可以是有效用于免疫预防的量。
RNA治疗物可与其他预防性或治疗性化合物一起施用。作为非限制性实例，预防性或治疗性化合物可以是含有用或不用佐剂或加强剂的病毒治疗的疫苗。如本文所用，当提及预防性组合物诸如治疗或疫苗时，术语“加强剂”是指预防性组合物的额外施用。加强剂(或加强疫苗)可在预防性组合物的较早施用之后给予。预防性组合物的初始施用与加强剂之间的施用时间可以是但不限于1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、15分钟、20分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、1天、36小时、2天、3天、4天、5天、6天、1周、10天、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、18个月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、11年、12年、13年、14年、15年、16年、17年、18年、19年、20年、25年、30年、35年、40年、45年、50年、55年、60年、65年、70年、75年、80年、85年、90年、95年或超过99年。在示例性实施方案中，在预防性组合物的初始施用和加强剂之间的施用时间可以是但不限于1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、6个月或1年。
在一些实施方案中，RNA治疗物可皮下、眼内、玻璃体内、肠胃外、皮下、静脉内、脑室内、肌内、鞘内、口服、腹膜内、通过口服或经鼻吸入，或通过直接注射到一种或多种细胞、组织或器官来施用。
本文提供了药物组合物，其包含任选地与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合的RNA治疗物和RNA组合物和/或复合物。
RNA治疗物可与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合配制或施用。在一些实施方案中，组合物包含至少一种附加的活性物质，诸如例如治疗活性物质、预防活性物质或两者的组合。治疗组合物可以是无菌的、无热原的或无菌的和无热原的。在药剂诸如治疗组合物的配制和/或制备中的一般考虑可见于例如Remington：The Science and Practice ofPharmacy第21版，Lippincott Williams&Wilkins，2005(全文以引用方式并入本文)。
在一些实施方案中，对人、人类患者或受试者施用RNA治疗物。出于本公开的目的，短语“活性成分”通常是指RNA治疗物或其中包含的多核苷酸，例如编码小核糖核酸病毒衣壳多蛋白和/或小核糖核酸病毒3C蛋白酶的RNA多核苷酸(例如，mRNA多核苷酸)。
本文所述的组合物的制剂可通过药理学领域中已知或此后开发的任何方法制备。一般来说，此类制备方法包括以下步骤：使活性成分(例如，mRNA多核苷酸)与赋形剂和/或一种或多种其他辅助成分缔合，并且然后，如果必要和/或需要，将产物分割、成型和/或包装成期望的单剂量单位或多剂量单位。
根据本公开的药物组合物中的活性成分、药学上可接受的赋形剂和/或任何额外成分的相对量将取决于所治疗的受试者的身份、体型和/或状况并且进一步取决于组合物的施用途径而变化。举例来说，组合物可包含0.1％与100％之间，例如0.5％与50％之间、1％-30％之间、5％-80％之间、至少80％(w/w)之间的活性成分。
RNA治疗物可使用一种或多种赋形剂来配制以：(1)增加稳定性；(2)增加细胞转染；(3)允许持续或延迟释放(例如，从贮库制剂)；(4)改变生物分布(例如，靶向特定组织或细胞类型)；(5)增加所编码的蛋白质的体内翻译；和/或(6)改变所编码的蛋白质(例如，HCAb)的体内释放概况。除了传统的赋形剂诸如任何和所有溶剂、分散介质、稀释剂或其他液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂外，赋形剂可包括但不限于类脂质、脂质体、脂质纳米颗粒、聚合物、脂质复合物、核-壳纳米颗粒、肽、蛋白质、用RNA治疗物转染的细胞(例如，用于移植到受试者中)、透明质酸酶、纳米颗粒模拟物以及它们的组合。
已发现天然存在的真核mRNA分子除了其他结构特征诸如5′-帽结构或3′-聚(A)尾外，还含有稳定元件，包括但不限于在其5′-端(5′UTR)和/或在其3′-端(3′UTR)的非翻译区(UTR)。5′UTR和3′UTR通常都从基因组DNA转录并且是未成熟mRNA的元件。成熟mRNA的特征性结构特征如5′-帽和3′-聚(A)尾通常在mRNA加工期间添加到转录的(未成熟的)mRNA中。3′-聚(A)尾通常是添加到转录的mRNA的3′-端的腺嘌呤核苷酸链段。它可包含多达约400个腺嘌呤核苷酸。在一些实施方案中，3′-聚(A)尾的长度对于单个mRNA的稳定性可能是必需的要素。
在一些实施方案中，RNA治疗物可包括一个或多个稳定元件。稳定元件可包括例如组蛋白茎-环。已鉴定了茎-环结合蛋白(SLBP)，一种32kDa蛋白质。它与细胞核和细胞质两者中组蛋白信使的3′-端的组蛋白茎-环相关。其表达水平受细胞周期调节；当组蛋白mRNA水平也升高时，它在S期达到峰值。该蛋白质已被证明是U7 snRNP对组蛋白前mRNA的有效3′-端加工所必需的。SLBP在加工后继续与茎-环结合，然后刺激成熟组蛋白mRNA在细胞质中翻译成组蛋白。SLBP的RNA结合域经后生动物和原生动物保守；其与组蛋白茎-环的结合取决于环的结构。最小结合位点包括相对于茎-环的至少三个核苷酸5′和两个核苷酸3′。
在一些实施方案中，RNA治疗物包括编码区、至少一个组蛋白茎-环和任选的聚(A)序列或聚腺苷酸化信号。聚(A)序列或聚腺苷酸化信号通常应增强所编码蛋白质的表达水平。在一些实施方案中，所编码的蛋白质不是组蛋白蛋白质、报告蛋白质(例如萤光素酶、GFP、EGFP、β-半乳糖苷酶、EGFP)、或标记或选择蛋白(例如，α-珠蛋白、半乳糖激酶和黄嘌呤：鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(GPT))。
在一些实施方案中，聚(A)序列或聚腺苷酸化信号和至少一种组蛋白茎-环的组合，即使两者在性质上代表了另选的机制，协同作用以增加蛋白质表达超过用任一单个元件观察到的水平。已发现，聚(A)和至少一种组蛋白茎-环的组合的协同效应不依赖于元件的顺序或聚(A)序列的长度。
在一些实施方案中，本文所述的多核苷酸可配制在具有约1nm至约100nm诸如但不限于约1nm至约20nm、约1nm至约30nm、约1nm至约40nm、约1nm至约50nm、约1nm至约60nm、约1nm至约70nm、约1nm至约80nm、约1nm至约90nm、约5nm至约100nm、约5nm至约10nm、约5nm至约20nm、约5nm至约30nm、约5nm至约40nm、约5nm至约50nm、约5nm至约60nm、约5nm至约70nm、约5nm至约80nm、约5nm至约90nm、约10至约20nm、约10至约30nm、约10至约40nm、约10至约50nm、约10至约60nm、约10至约70nm、约10至约80nm、约10至约90nm、约20至约30nm、约20至约40nm、约20至约50nm、约20至约60nm、约20至约70nm、约20至约80nm、约20至约90nm、约20至约100nm、约30至约40nm、约30至约50nm、约30至约60nm、约30至约70mm、约30至约80nm、约30至约90nm、约30至约100nm、约40至约50nm、约40至约60nm、约40至约70nm、约40至约80nm、约40至约90nm、约40至约100nm、约50至约60nm、约50至约70nm about 50至约80nm、约50至约90nm、约50至约100nm、约60至约70nm、约60至约80nm、约60至约90nm、约60至约100nm、约70至约80nm、约70至约90nm、约70至约100nm、约80至约90nm、约80至约100nm和/或约90至约100nm直径的脂质纳米颗粒中。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒可具有约10至500nm的直径。在一个实施方案中，脂质纳米颗粒可具有大于100nm、大于150nm、大于200nm、大于250nm、大于300nm、大于350nm、大于400nm、大于450nm、大于500nm、大于550nm、大于600nm、大于650nm、大于700nm、大于750nm、大于800nm、大于850nm、大于900nm、大于950nm或大于1000nm的直径。
在一些实施方案中，可使用较小的LNP递送多核苷酸。此类颗粒可具有从低于0.1μm到高达100nm的直径，诸如但不限于，小于0.1μm、小于1.0μm、小于5μm、小于10μm、小于15um、小于20um、小于25um、小于30um、小于35um、小于40um、小于50um、小于55um、小于60um、小于65um、小于70um、小于75um、小于80um、小于85um、小于90um、小于95um、小于100um、小于125um、小于150um、小于175um、小于200um、小于225um、小于250um、小于275um、小于300um、小于325um、小于350um、小于375um、小于400um、小于425um、小于450um、小于475um、小于500um、小于525um、小于550um、小于575um、小于600um、小于625um、小于650um、小于675um、小于700um、小于725um、小于750um、小于775um、小于800um、小于825um、小于850um、小于875um、小于900um、小于925um、小于950um或小于975um。
本文所述的纳米颗粒和微米颗粒可以被几何工程化以调节巨噬细胞和/或免疫应答。几何工程化的颗粒可具有不同的形状、大小和/或表面电荷以掺入本文所述的多核苷酸用于靶向递送，诸如但不限于肺部递送(参见例如国际公开号WO2013082111，其全部内容以引用方式并入本文)。几何工程化颗粒的其他物理特征可包括但不限于开窗、成角度的臂、不对称性和表面粗糙度、可改变与细胞和组织相互作用的电荷。
RNA治疗物可通过导致治疗有效结果的任何途径施用。这些包括但不限于皮内、肌内和/或皮下施用。本公开提供了包括向有需要的受试者施用RNA治疗物的方法。所需的确切量将根据受试者的物种、年龄和一般状况、疾病的严重程度、特定组合物、其施用模式、其活性模式等而在受试者之间变化。RNA治疗物组合物通常被配制成剂量单位形式，以便于施用和剂量均匀。然而，应当理解，RNA治疗物组合物的总日用量可由主治医师在合理的医学判断范围内决定。对于任何特定患者的具体治疗有效、预防有效或适当的成像剂量水平将取决于多种因素，包括所治疗的障碍和障碍的严重程度；所用特定化合物的活性；所采用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所用特定化合物的施用时间、施用途径和排泄速率；治疗的持续时间；与所用的特定化合物组合或同时使用的药物；以及医学领域公知的类似因素。
在一些实施方案中，RNA治疗物组合物可以足以递送受试者体重每天0.0001mg/kg至100mg/kg、0.001mg/kg至0.05mg/kg、0.005mg/kg至0.05mg/kg、0.001mg/kg至0.005mg/kg、0.05mg/kg至0.5mg/kg、0.01mg/kg至50mg/kg、0.1mg/kg至40mg/kg、0.5mg/kg至30mg/kg、0.01mg/kg至10mg/kg、0.1mg/kg至10mg/kg或1mg/kg至25mg/kg的剂量水平，每天、每周、每月一次或多次等施用，以获得期望的治疗、诊断、预防或成像效果(参见例如，在国际公开WO2013078199中描述的单位剂量范围，其全文以引用方式并入本文)。期望剂量可每天三次、每天两次、每天一次、每隔一天、每三天、每周、每两周、每三周、每四周、每2个月、每三个月、每6个月等递送。在某些实施方案中，所需剂量可使用多次施用(例如，两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次或更多次施用)进行递送。当采用多次施用时，可使用分开给药方案，诸如本文所述的那些。在示例性实施方案中，RNA治疗物组合物可以足以递送0.0005mg/kg至0.01mg/kg，例如约0.0005mg/kg至约0.0075mg/kg，例如约0.0005mg/kg、约0.001mg/kg、约0.002mg/kg、约0.003mg/kg、约0.004mg/kg或约0.005mg/kg的剂量水平施用。
在一些实施方案中，RNA治疗物组合物可以足以递送0.025mg/kg至0.250mg/kg、0.025mg/kg至0.500mg/kg、0.025mg/kg至0.750mg/kg、或0.025mg/kg至1.0mg/kg的剂量水平施用一次或两次(或更多次)。
在一些实施方案中，RNA治疗物组合物可以总剂量或足以递送0.0100mg、0.025mg、0.050mg、0.075mg、0.100mg、0.125mg、0.150mg、0.175mg、0.200mg、0.225mg、0.250mg、0.275mg、0.300mg、0.325mg、0.350mg、0.375mg、0.400mg、0.425mg、0.450mg、0.475mg、0.500mg、0.525mg、0.550mg、0.575mg、0.600mg、0.625mg、0.650mg、0.675mg、0.700mg、0.725mg、0.750mg、0.775mg、0.800mg、0.825mg、0.850mg、0.875mg、0.900mg、0.925mg、0.950mg、0.975mg或1.0mg的总剂量的剂量水平施用两次(例如，第0天和第7天、第0天和第14天、第0天和第21天、第0天和第28天、第0天和第60天、第0天和第90天、第0天和第120天、第0天和第150天、第0天和第180天、第0天和3个月后、第0天和6个月后、第0天和9个月后、第0天和12个月后、第0天和18个月后、第0天和2年后、第0天和5年后或第0天和10年后)。本公开涵盖更高和更低的剂量和施用频率。例如，RNA治疗物组合物可施用三次或四次。
在一些实施方案中，RNA治疗物组合物可以总剂量或足以递送0.010mg、0.025mg、0.100mg或0.400mg的总剂量的剂量水平施用两次(例如，第0天和第7天、第0天和第14天、第0天和第21天、第0天和第28天、第0天和第60天、第0天和第90天、第0天和第120天、第0天和第150天、第0天和第180天、第0天和3个月后、第0天和6个月后、第0天和9个月后、第0天和12个月后、第0天和18个月后、第0天和2年后、第0天和5年后或第0天和10年后)。
在一些实施方案中，在治疗受试者的方法中使用的RNA以治疗受试者的有效量的10μg/kg与400μg/kg之间的核酸治疗物的单一剂量施用于受试者。在一些实施方案中，在治疗受试者的方法中使用的RNA治疗物以治疗受试者的有效量的10μg与400μg之间的核酸治疗物的单一剂量施用于受试者。
本文所述的RNA药物组合物可被配制成本文所述的剂型，诸如鼻内、气管内或可注射的(例如，静脉内、眼内、玻璃体内、肌内、皮内、心内、腹膜内和皮下)。
本公开在其应用中不限于在以下描述中阐述或在附图中示出的部件的构造和布置的细节。本公开能够具有其他实施方案并且能够以各种方式实践或执行。而且，本文使用的措辞和术语是为了描述的目的，而不应被认为是限制性的。本文中“包括”、“包含”或“具有”、“含有”、“涉及”及其变体的使用意在涵盖其后列出的项目及其等同物以及附加项目。
实施例
实施例1：P1+3CD mRNA证明了正确的体外P1加工
为了研究编码P1和3CD的mRNA是否足以产生病毒样颗粒(VLP)，如下进行体外测定。将两种mRNA，一种编码人鼻病毒(HRV)-A16 P1，另一种编码HRV-A163CD蛋白酶，共转染到细胞中以确定i)P1是否表达；ii)3CD是否表达并能够催化P1在细胞内切割为组成性VP蛋白；和iii)是否存在促进P1的更有效切割同时使3CD驱动的细胞毒性最小化的P1∶3CD mRNA的最佳比率。在图2A中，转染的P1 mRNA的量保持恒定在2μg，而共转染的3CD mRNA的量增加，得到所示的P1∶3CD摩尔比。在蛋白质印迹中，用抗HRV-A16 VP2抗体对细胞裂解物进行印迹，该抗体也识别VP0和未切割的P1。以任何测试量转染3CD mRNA导致P1的细胞内切割。增加3CD的量导致代表未切割的P1的高分子量条带的更明显的损失和单个蛋白质(VP2)和较小的多蛋白(VP0)的较低分子量条带量的更大增加。这些条带在大小上对应于从纯化的野生型HRV-A16病毒体制备的裂解物中所见的条带，并且可能从最大到最小代表VP0-VP3前体、VP0和VP2(图2A)。
以3CD mRNA形式转染任何量的编码蛋白水解3C的多蛋白导致可证明的P1切割，但增加的量导致P1更多的“转化”为VP0，并且在最高量时，出现大小对应于VP2的条带。然而，较大量的3CD mRNA以剂量依赖性方式伴随增加的细胞毒性，其中1∶1比率的P1∶3CD证明细胞毒性最大。使用多蛋白3CD代替3C以避免3C的可能的过度细胞毒性。
实施例2：通过共表达P1+3CD产生病毒样颗粒
为了进一步评价P1和3CD的共表达是否足以产生VLP，使用分别编码HRV-A16 P1和HRV-A163CD的两种DNA质粒进行大规模转染和纯化实验。将质粒以4份P1比1份3CD的质量比转染，目的是通过减缓由3CD驱动的细胞毒性导致的细胞死亡而潜在地增加VLP产量。使用PEG沉淀，随后使用尺寸排阻色谱法从转染细胞的上清液中纯化VLP。负染色透射电子显微揭示了鼻病毒病毒体预期大小的均匀颗粒(直径约30纳米)(图2B)。这些数据证明，P1和3CD共表达导致P1的正确加工和单个VP蛋白组装成病毒样颗粒，该病毒样颗粒释放到胞外空间并在形态学上类似于野生型病毒体。
实施例3：包含P1+3CD mRNA的疫苗在小鼠中生成中和抗体滴度
为了研究施用编码两种多蛋白P1+3CD mRNA的mRNA是否可导致免疫原性的VLP的形成并且可导致HRVA-16中和抗体的产生，如下进行体内测定。小鼠接受由10μg P1 mRNA组成的初免-加强疫苗方案，并且由于对毒性的担心，接受两种不同量的3CD mRNA，导致最终P1∶3CD摩尔比为10∶1和2∶1。图2C示出了首次接种后三周(给药后1)和加强后两周(给药后2)的HRV-A16中和抗体滴度。10∶1和2∶1比率均导致可检测的中和滴度，但是2∶1比率的单一剂量比10∶1比率的两个剂量导致更高的滴度。来自注射2X活HRV-A16的棉鼠的血清作为基准对照。令人惊奇的是，P1∶3CD 2∶1比率组合的两次注射在小鼠中产生的中和滴度比IM施用于棉鼠的两个剂量的复制型HRV-A16的中和滴度高。在施用10∶1或2∶1比率后，在小鼠中未观察到不良事件，表明转染3CD mRNA后体外观察到的细胞毒性不一定预示体内作用。
实施例4：P1+3CD mRNA证明对肠道病毒属内的其他物种具有免疫原性
按照实施例2中用于HRV-A16的方法，从肠道病毒D68(EV-D68)分离株US/MO/14-18950中产生编码两种多蛋白即P1和3CD的mRNA，其中一种多蛋白对另一种多蛋白具有酶活性。该分离株收集自在美国2014年EV-D68爆发期间从密苏里州(Missouri)的一名人类患者，并且是一种进化枝B1分离株。对于该研究，用P1∶3D比率的扩展组接种小鼠。将P1 mRNA的量保持恒定在10μg，同时添加增加量的3CD mRNA以得到10∶1、5∶1、2∶1和1∶1的最终P1∶3CD摩尔比。接种遵循用于HRV-A16的相同的双剂量时间表。加强后两周收集血清，每组合并，然后测试不同进化枝B1分离株(US/MO/14-18947)和进化枝A2分离株(US/KY/14-18953)的中和。对于每种分离株，所有四种测试比率之间的中和滴度相似(图2D)。对于进化枝B1分离株MO/14-18947，中和滴度高约一个对数。这是预期的，因为P1 mRNA的序列也衍生自从Missuri 2014分离的进化枝B1分离株，并且因此具有高度的序列同源性。然而，针对更趋异的进化枝A2分离株也生成了强的中和滴度。这表明在EV-D68的情况下，用单一P1 mRNA接种将生成跨进化枝有效的中和抗体。该结果还表明，当P1底物来自不同的病毒分离株和物种时，蛋白酶可起作用。
来自这两项研究的组合数据表明，以2份P1比1份3CD的摩尔比在LNP中施用多蛋白P1+3CD mRNA是高度免疫原性的并且有效诱导针对所得VLP的中和抗体。
为了进一步研究这种P1+3CD组合在以较低剂量(同时保持2∶1摩尔比)递送时的效力，对肠道病毒物种的扩展组进行剂量范围研究。表1列出了所靶向的小核糖核酸病毒物种和基因型、用于设计P1和3CD mRNA序列的分离株、施用于小鼠的总mRNA(P1+3CD)的剂量以及剂量内P1 mRNA的相应量。对于该剂量范围研究，以5倍稀释系列稀释mRNA，并测试至少三个剂量。
表1：用于剂量范围研究的肠道病毒物种的扩展组
接种时间表与先前的研究相同。在第1天和第22天接种小鼠，并在给药后1三周(第21天)和给药后2两周(第35天)收集血清。在对应的中和测定中测试给药后2血清的中和抗体滴度。对于HRV-A16和HRV-B14，中和测定中所用的病毒与P1和3CD mRNA中所用的病毒序列相同。对于EV-D68和EV-A71，测试来自接种小鼠的血清在代表不同进化枝的两种或更多种异源分离株之间的中和。
图3A-图3D示出了第二次接种后两周(第35天)的中和抗体滴度。图3A示出了用HRV-A16 P1∶3CD接种的动物的中和抗体滴度。动物接受的剂量范围为5μg至0.04μg HRV-A16 P1 mRNA，加上对应量的HRV-A16 3CD mRNA以维持P1和3CD的2∶1比率。包括来自超免疫豚鼠的市售HRV-A16抗血清作为基准对照。在所有测试剂量下，所有动物生成的中和抗体滴度均高于测定的检测下限，并且滴度表现出剂量依赖性。尽管没有剂量导致滴度等于或超过豚鼠超免疫抗血清的滴度，但5μg剂量导致滴度高于接受两个剂量的复制型HRV-A16的棉鼠中生成的滴度(图2C)。
图3B示出了用HRV-B14 P1∶3CD接种的动物的中和抗体滴度。动物接受的剂量范围为5μg至0.2μg HRV-B14 P1 mRNA和对应量的HRV-B14 3CD mRNA以维持2∶1的比率。包括来自超免疫豚鼠的市售HRV-B14抗血清作为基准对照。令人惊奇的是，在此测试HRV-B14的三个剂量均产生相似水平的中和抗体，并且所有剂量的几何平均滴度(GMT)超过豚鼠超免疫HRV-B14抗血清的滴度。
在图3C中，用EV-D68 P1+3CD mRNA接种动物，剂量范围为5μg至0.2μg P1 mRNA。测试来自这些动物的血清中和进化枝B1和A2的异源EV-D68分离株。
在图3D中，用EV-A71 P1+3CD mRNA接种动物，剂量范围为5μg至0.2μg P1 mRNA。测试来自这些动物的血清中和EV-A71的异源基因型。病毒USA/2018-23092是从患有急性弛缓性脊髓炎(AFM)的患者粪便中回收的临床分离物。
有效的人鼻病毒疫苗应提供针对三种鼻病毒物种中的每一种内的多种血清型的保护：鼻病毒A、B和C。考虑到P1的高度物种内序列多样性，即使是单一物种的充分覆盖也可能需要许多不同的P1mRNA。然而，与P1相反，3CD蛋白酶的氨基酸序列在一个物种内的血清型之间是充分保守的，并且在三个物种之间保守程度较低。描述鼻病毒A物种的79种血清型和鼻病毒B物种的26种血清型的3CD蛋白酶的3C区的共有氨基酸序列的比对显示，在P1结合位点的4A内的残基在HRV-A和HRV-B之间高度保守，并且在HRV-A和HRV-B之间五个位点不同，而在HRV-B内这些位点中的两个位点不同。这些推定的结合残基在鼻病毒A和鼻病毒B内并且在某些情况下在它们之间高度保守。此类比对进一步显示VP2-VP3切割位点(Q-G-L-P)和VP3 N-末端在HRV-A和HRV-B两者之间高度保守。相反，VP3/VP1的切割位点和末端在HRV-A和HRV-B之间不同，但在组内是保守的，其中保守氨基酸残基分别是HRV-A中的Q/N-P-[IV]-E和HRV-B中的A-L-[EMPT]-E/G-[FL]。3CD蛋白酶结合P1并在两个位置切割它：VP2-VP3之间，以及VP3-VP1之间。当比较那些切割位点处及其周围的P1氨基酸序列时，有序列保守的证据。VP3-VP1切割位点区域在物种内的血清型之间表现出保守性，而VP2-VP3切割位点在鼻病毒A和鼻病毒B物种之间具有高度的序列同源性。
实施例5：[P1B14+3CDA16]的组合证明了与[P1+3CD]B14的“匹配”组合相似的体外P1 加工和体内免疫原性
在3CD蛋白酶的P1结合位点和P1本身的切割位点区域两者中的序列保守性表明，不需要为每个P1 mRNA提供“匹配的”3CD mRNA。这也表明单一的3CD蛋白酶可能能够将P1蛋白加工成来自一个物种内的许多血清型或甚至来自两个不同物种的血清型的VLP。为了研究[P1B14+3CDA16]的组合是否证明与先前使用的[P1+3CD]B14的“匹配”组合相似的体外P1加工，如下进行体外测定。将P1A16和P1B14 mRNA单独或与指定的3CD mRNA以2∶1的摩尔比组合转染到细胞中。用泛鼻病毒抗VP1抗体对细胞裂解物进行印迹。箭头指示未切割的P1前体蛋白和对应于VP1的较低分子量条带(图4A)。对于P1B14，添加3CDA16或3CDB14 mRNA导致P1条带的消失和VP1的出现。VP1条带的强度指示，使用“匹配的”3CDB14 mRNA，P1切割可能更有效，但异源3CDA16蛋白酶仍然能够将P1B14加工成组成型VP蛋白。
为了研究[P1B14+3CDA16]的组合是否证明了与先前使用的[P1+3CD]B14的“匹配”组合相似的体内免疫原性，如下进行体内测定。用[P1+3CD]A16 mRNA或[P1B14+3CDA16]的混合组合以2∶1摩尔比的P1∶3CD mRNA(2.5μg P1+0.94μg 3CD)接种小鼠。因为VLP仅由衍生自P1前体蛋白的加工和随后成熟的VP蛋白组成，所以中和抗体应答的血清型特异性仅由P1序列而不是3CD序列决定。因此，测试匹配的[P1+3CD]A16组合对HRV-A16的中和，而测试混合的[P1B14+3CDA16]组合对HRV-B14的中和。图4B示出了各组合的中和抗体滴度，其中包括每种病毒的市售超免疫抗血清作为基准对照。如所预期的，用[P1+3CD]A16接种导致高HRV-A16中和抗体滴度。该组的GMT(2.5μg P1；GMT＝13024)对应于图2A中HRV-A16剂量范围研究的5μgP1和1μg P1剂量组的GMT(分别为GMT＝18549，GMT＝4198)。用混合的[P1B14+3CDA16]组合接种也产生HRV-B14中和抗体，但未达到用匹配的[P1+3CD]B14所观察到的程度。接受2.5μgHRV-B14 P1 mRNA的混合组的GMT为253。相反，接受5、1和0.2μg HRV-B14 P1 mRNA的组的GMT分别为1617、1554和1582(图2B)。这指示“匹配的”[P1+3CD]B14组合比混合的[P1B14+3CDA16]组合更有效，甚至在小于1/10的剂量下也是如此。这种缺陷可能是由于图4A中观察到的P1B14加工的减少，或由于一些未知的下游效应，诸如VLP组装减少。然而，令人鼓舞的是，使用HRV-A163CD不能完全消除HRV-B14中和抗体的产生。如果来自鼻病毒A血清型的3CD可与来自鼻病毒B血清型的P1起作用，甚至在降低的程度上起作用，则非常可能物种内所有血清型的覆盖将需要最少的3CD序列或可能需要仔细选择待施用的CD序列。考虑到鼻病毒疫苗中可能需要包含大量的P1序列，能够包含一些代表性或共有3CD序列，而不是与每个P1mRNA“匹配”的单独3CD mRNA将是极其有用的。
实施例6：HRV-A16 P1+3CD mRNA接种在棉鼠HRV攻击模型中提供了免受感染的保 护
为了研究P1+3CD mRNA组合是否能够提供免受感染的保护，如下在棉鼠HRV攻击模型中测试HRV-A16 P1+3CD mRNA接种的功效。在第1天和第22天用减少量的HRV-A16 P1/3CDmRNA-LNP药物产品IM免疫动物。作为阳性对照，一组动物按照相同的时间表接受两次IM注射活的复制型HRV-A16病毒。阴性对照组接受PBS。在第35天用鼻内施用的活HRV-A16病毒攻击动物。在攻击后八小时，收获肺和鼻并匀浆以计算病毒载量。在攻击前立即收集血清以测量循环中和抗体水平。用编码P1/3CD LNP的mRNA接种导致中和抗体的剂量依赖性诱导(图5A)，其中25μg和5μg组中的一些动物具有接近或超过接受活HRV-A16的动物的滴度。对于3个较高剂量的P1/3CD中的每一者，每组中有一只动物没有可检测的滴度，并且最低剂量组(0.2μg)中没有一只动物具有可检测的滴度。动物还表现出肺和鼻病毒载量的剂量依赖性降低。对于25μg和5μg组，4/5和3/5的动物分别显示对肺组织的完全保护(图5B)。25μg剂量组的所有动物以及5μg和1μg组的2/5的动物显示对鼻组织的完全保护(图5C)。0.2μg剂量组中的动物没有表现出保护作用，并且具有与PBS阴性对照组相当的肺和鼻病毒载量。此外，在接受25μg的所有动物以及接受5μg或1μg的4/5和3/5的动物中分别检测到肺病毒RNA水平的强烈降低(图5D)。
图6包括对于每个终点测定的每个动物生成的数据。这些结果证明用HRV-A16 P1+3CD mRNA接种导致对HRV-A16感染的剂量依赖性保护，并且用25μg剂量实现的保护水平与两次注射复制型病毒所生成的保护水平几乎相同。
表2：序列
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
附加材料和方法
转染和免疫印迹
使用Mirus Trans-It转染试剂盒用mRNA转染293T细胞。用2μg P1 mRNA和指定量的3CD mRNA转染细胞。转染后约16-24小时收获细胞并用RIPA缓冲液裂解。通过BCA测定定量裂解物的蛋白质浓度，在4％-20％聚丙烯酰胺凝胶上用还原剂(25μg/泳道)电泳，转移到硝酸纤维素膜上，并用1μg/ml稀释度的一抗印迹过夜。所用的一抗是小鼠抗HRV-A16 VP2和兔抗泛HRV VP1。以1∶10,000稀释度使用HRP缀合的抗小鼠和抗兔二抗。使用ECL Prime检测试剂检测信号。罗丹明缀合的抗GAPDH Fab用于GAPDH检测。
病毒样颗粒产生、纯化和成像
使用Turbo293转染试剂(Speed Biosystems)将编码HRV-A16 P1和3CD的质粒以3e6/mL的密度共转染到HEK-293expi细胞中，P1和3CD质粒之间的质量比为4∶1。六天后，收获细胞培养物上清液(弃去细胞沉淀)，然后添加PEG-6000和氯化钠至终浓度分别为7％(w/v)和2％(w/v)。在4℃搅拌下进行PEG(聚乙二醇)沉淀18小时，然后在4℃下以9,500K离心30分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于50mM磷酸盐缓冲液中，pH 7.0(无氯化钠)。将重悬的溶液通过0.45um过滤器以去除大的碎片。然后将样品上样到Akta Pure(Cytiva)上的HiTrap Q(Cytiva)柱上，用于阴离子交换色谱法。首先用pH 7.0磷酸盐缓冲液中的0.1M氯化钠洗涤与HiTrap Q柱结合的HRV VLP以去除杂质，随后使用pH 7.0磷酸盐缓冲液中的0.2M氯化钠洗脱。洗脱的HRV VLP样品用于制备具有纳米W负染色(Nanoprobes)的电子显微镜网格，并使用Tecnai T12电子显微镜成像。
接种和体内研究
接种前约16小时，将配制的P1和3CD产物混合并用PBS稀释以达到期望的P1∶3CD比和最终mRNA浓度。在第1天和第22天给雌性8周龄Balb/c小鼠接种(50μl注射体积，IM)。在第一次注射后3周(第21天)和第二次注射后2周(第35天)收集血清。在第35天收集血清后处死小鼠。
中和测定
病毒分离株和滴定：病毒HRV-A16、HRV-B14、EV-D68分离株US/MO/14-18947、EV-D68分离株US/KY/14-18953购自ATCC。EV-A71分离株USA/2018-23092和Tainan/4643/1998接收自BEI Resources。通过终点稀释测量病毒滴度并使用Reed-Muench统计方法计算。将HRV-A16和HRV-B14储液在MRC-5细胞上滴定，并将EV-D68和EV-A71分离株储液在RD细胞上滴定。通过在感染后五天经由显微镜对细胞的细胞病变效应(CPE)进行评分来计算每种病毒储液的TCID50。
鼻病毒中和测定：将MRC-5细胞以2x104个细胞/孔接种于48孔板中，并在MEM中孵育直至孔达到约90％融合度(通常在铺板后七天)。将来自接种的小鼠的血清在56℃下孵育30分钟以灭活补体，然后以一系列六个稀释度稀释四倍。将稀释的血清与100 TCID50病毒以1∶2混合，得到100μl血清+病毒的最终体积。为了允许中和，将血清+病毒在33℃下孵育3小时，在此期间从48孔板中吸出培养基并用300μl新鲜MEM替换。中和3小时后，向板中添加血清+病毒。最终体积为400μl/孔。将板置于33℃。五天后，取出板并经由显微镜对孔的CPE进行评分。每个稀释度含有八个重复孔。使用Reed-Muench方法计算中和抗体滴度(报告为IC50)。
EV-D68和EV-A71中和测定：对于EV-D68中和，将RD细胞以104个细胞/孔铺板在96孔板中的100μl DMEM中，并在铺板后48小时用于中和测定。对于EV-A71中和，将Vero细胞以1.5x104个细胞/孔铺板在96孔板中的100μl DMEM中，并在第二天用于中和测定。将RD细胞以104个细胞/孔铺板在96孔板中的100μlDMEM中。在铺板后四十八小时，将来自接种小鼠的热灭活血清以一系列六个稀释度稀释四倍。将稀释的血清与100 TCID50病毒以1∶2混合，得到100μl血清+病毒的最终体积。为了允许中和，将血清+病毒对于EV-D68在33℃下并且对于EV-A71在37℃下孵育3小时。孵育3小时后，向板中添加血清+病毒。最终体积/孔为200μl。仅使用内部60个孔以避免边缘效应。用DMEM将外部36个孔的最终体积提升至200μl。将EV-D68中和板置于33℃，并将EV-A71中和板置于37℃。五天后，取出板并经由显微镜对孔的CPE进行评分。每个稀释度含有十个重复孔。使用Reed-Muench方法计算中和抗体滴度(报告为IC50)。
抗血清：HRV-A16和HRV-B14的豚鼠超免疫抗血清购自ATCC。通过在第1天和第22天给10只雌性棉鼠注射105 PFU复制型HRV-A16并在第35天收集和合并来自接种动物的血清来生成棉鼠HRV-A16抗血清。将抗血清在56℃下热处理30分钟以灭活补体。稀释抗血清并在如上所述的中和测定中运行。
棉鼠HRV-A16攻击研究
动物：根据国家卫生研究院指南和Sigmovir机构动物护理和使用委员会批准的动物研究方案(IACUC方案#2)，在兽医监督下维持和处理四十(36)只近交、4-6周龄的刚毛棉花鼠(Sigmodon hispidus)雌性棉鼠(来源：Sigmovir Biosystems，Inc.，Rockville MD)。将棉鼠圈养在透明的聚碳酸酯笼中，并任意提供标准啮齿动物食物(Harlan#7004)和自来水。
攻击病毒：将人鼻病毒16型(HRV16)(ATCC，Manassas，VA)在连续噬斑纯化以减少缺陷干扰颗粒后在HeLa Ohio细胞中繁殖。将病毒储液用氯仿提取以进一步纯化。将含有约1.0x108pfu/mL的命名为HRV16 p5的病毒库用于该体内实验。将该病毒储液储存在-80℃条件下并且已在棉鼠模型中进行了体内表征并且针对上呼吸道和下呼吸道复制进行了验证。
肺和鼻HRV16病毒滴定：通过离心澄清肺和鼻匀浆物并在感染培养基(EMEM、谷氨酰胺、Pyrubate、碳酸氢钠、Hepes)中稀释(肺，1/10-1/100稀释度；鼻，纯-1/10稀释度)。将融合的Hela H1单层以100μl/孔一式两份感染，以第一稀释度开始，随后在6孔板中稀释匀浆物。在5％CO2培养箱中于33℃孵育1小时后，用0.75％甲基纤维素培养基覆盖孔，并将板恢复到33℃培养箱中。孵育5天后，去除覆盖层，并将细胞用0.1％结晶紫染料固定一小时，然后冲洗并风干。对噬斑进行计数，并且病毒滴度表示为每克组织的噬斑形成单位。组中的病毒滴度计算为在给定时间该组中所有动物的几何平均值±标准误差。
HRV16中和抗体测定：用感染培养基以1∶10稀释血清样品，并进一步以1∶2连续稀释。将稀释的血清样品与HRV16(103TCID50)在33℃下在5％CO2培养箱中孵育2小时。将病毒-抗体复合物转移到96孔板中的融合Hela H1细胞中。孵育5天后，将细胞固定并用0.1％结晶紫染色1小时，然后冲洗并风干。通过Reed和Muench方法确定完全保护细胞单层的截止稀释度来确定中和抗体滴度。
实时PCR病毒RNA：使用RNeasy纯化试剂盒(QIAGEN)从匀浆的肺组织中提取总RNA。使用QuantiTect逆转录试剂盒(Qiagen)使用1μg总RNA制备cDNA。对于实时PCR反应，使用QuantiFast SYBR Green PCR剂盒(Qiagen)，最终体积为25μl，最终引物浓度为0.5μM。在96孔托盘中进行反应。扩增在Bio-Rad iCycler上进行，95℃ 3分钟1个循环，然后95℃ 10秒、60℃ 10秒和72℃ 15秒40个循环。基线循环和循环阈值(Ct)通过iQ5软件在PCR基线扣除曲线拟合模式中计算。对所有样品进行DNA的相对定量。使用最富集感兴趣的转录物的连续稀释的cDNA样品(例如，对于病毒转录物qPCR来自第8小时HRV16感染的肺)绘制标准曲线。将Ct值对log10 cDNA稀释因子作图。这些曲线用于将对于不同样品获得的Ct值转化为相对表达单位。然后将这些相对表达单位归一化为对应样品中表达的β-肌动蛋白mRNA(“管家基因”)的水平。
等效方案
虽然本文已描述和示出了若干发明实施方案，但本领域普通技术人员将容易地设想用于执行本文所述的功能和/或获得结果和/或一个或多个优点的多种其他手段和/或结构，并且此类变化和/或修改中的每一者被认为在本文所述的发明实施方案的范围内。更一般地，本领域技术人员将容易地理解，本文描述的所有参数、大小、材料和构造旨在是示例性的，并且实际的参数、大小、材料和/或构造将取决于使用本发明教导的一个或多个具体应用。本领域技术人员将认识到或能够使用不超过常规实验确定本文所述的具体发明实施方案的许多等同物。因此，应当理解，前述实施方案仅以实例的方式呈现，并且在所附权利要求及其等同物的范围内，可以不同于具体描述和要求保护的方式来实践发明实施方案。本公开的发明实施方案涉及本文所述的每个单独的特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法。此外，如果这些特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法不是相互矛盾的，则两个或更多个此类特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法的任何组合均包括在本公开的发明范围内。
如本文所定义和使用的所有定义应理解为控制字典定义、以引用方式并入的文献中的定义和/或所定义术语的普通含义。
本文公开的所有参考文献、专利和专利申请均以引用方式并入本文，就其各自所引用的主题而言，其在一些情况下可涵盖整个文献。
除非明确地相反指示，否则如本文在说明书和权利要求中所用的不定冠词“一”和“一个”应理解为意指“至少一个”。
如本文在说明书和权利要求中所用的短语“和/或”应理解为意指如此结合的要素中的“任一者或两者”，即在一些情况下结合地存在而在其他情况下分离地存在的要素。用“和/或”列出的多个要素应以相同的方式解释，即如此结合的要素中的“一者或多者”。除了由“和/或”条款具体指明的要素外，可任选地存在其他要素，无论与具体指明的那些要素相关还是不相关。因此，作为非限制性实例，对“A和/或B”的引用在结合诸如“包含”等开放式语言使用时在一个实施方案中可仅指A(任选地包括除B以外的要素)；在另一个实施方案中，仅指B(任选地包括除A以外的要素)；在另一个实施方案中，指A和B(任选地包括其他要素)；等等。
如本文在说明书和权利要求中所用，“或”应理解为具有与如上所定义的“和/或”相同的含义。例如，当分离列表中的项目时，“或”或“和/或”应被解释为包括性的，即包括多个要素或要素列表中的至少一个，但也包括多于一个，以及任选地，附加的未列出的项目。仅有明确相反指示的术语，诸如“仅一个”或“正好一个”，或当在权利要求中使用时，“由......组成”，将是指包括多个要素或要素列表中的正好一个要素。一般来说，如本文所用的术语“或”在其之前有排他性术语，诸如“任一个”、“其中一个”，“仅其中一个”或“正好其中一个”时应仅被解释为指示排他性替代(即，“一个或另一个但不是两者”)。当在权利要求中使用时，“基本上由......组成”应具有在专利法领域中使用的其普通含义。
如本文在说明书和权利要求中所用，关于一个或多个要素的列表的短语“至少一个”应理解为意指选自要素列表中的任何一个或多个要素的至少一个要素，但不一定包括要素列表内具体列出的每个要素中的至少一个，并且不排除要素列表中的要素的任何组合。该定义还允许除了在短语“至少一个”所指的要素列表内具体标识的要素之外的要素可任选地存在，无论与具体标识的那些要素相关还是不相关。因此，作为非限制性实例，“A和B中的至少一个”(或等效地，“A或B中的至少一个”，或等效地，“A和/或B中的至少一个”)在一个实施方案中可指至少一个，任选地包括多于一个A而不存在B(并且任选地包括除B以外的元件)；在另一个实施方案中，指至少一个、任选地包括多于一个B而不存在A(并且任选地包括除A以外的要素)；在又一个实施方案中，指至少一个、任选地包括多于一个A和至少一个、任选地包括多于一个B(并且任选地包括其他要素)；等等。
还应当理解，除非明确地相反指示，否则在本文要求保护的包括多于一个步骤或动作的任何方法中，该方法的步骤或动作的顺序不必限于所叙述方法的步骤或动作的顺序。
在权利要求以及以上说明书中，所有过渡性短语诸如“包含”、“包括”、“携带”、“具有”、“含有”、“涉及”、“持有”、“由......构成”等应理解为开放式的，即意指包括但不限于。仅过渡性短语“由......组成”和“基本上由......组成”应分别是如美国专利局专利审查程序手册第2111.03节所述的封闭式或半封闭式过渡性短语。应当理解，在另选的实施方案中，本文档中使用开放式过渡性短语(例如，“包含”)描述的实施方案也被设想为“由开放式过渡性短语描述的特征组成”和“基本上由开放式过渡性短语描述的特征组成”。例如，如果本公开描述“包含A和B的组合物”，则本公开还设想另选的实施方案“由A和B组成的组合物”和“基本上由A和B组成的组合物”。

Claims (64)

1.一种组合物，其包含：
(i)包含编码小核糖核酸病毒衣壳多蛋白的开放阅读框(ORF)的信使核糖核酸(mRNA)，其中所述衣壳多蛋白包含病毒P1前体多蛋白；以及
(ii)脂质纳米颗粒(LNP)。
2.一种组合物，其包含：
(i)包含编码蛋白酶的开放阅读框(ORF)的信使核糖核酸(mRNA)，其中所述蛋白酶是小核糖核酸病毒3C蛋白酶；以及
(ii)脂质纳米颗粒(LNP)。
3.一种免疫原性组合物，其包含：
(i)包含编码小核糖核酸病毒3C蛋白酶的开放阅读框(ORF)的信使核糖核酸(mRNA)；
(ii)包含编码小核糖核酸病毒衣壳多蛋白的ORF的mRNA，其中所述衣壳多蛋白包含病毒P1前体多蛋白；以及
(iii)脂质纳米颗粒(LNP)。
4.如权利要求1或3所述的组合物，其中所述前体多蛋白包含两种或更多种衣壳蛋白，并且在所述两种或更多种衣壳蛋白之间具有对病毒蛋白酶具有特异性的切割位点。
5.如权利要求4所述的组合物，其中所述两种或更多种衣壳蛋白包含病毒蛋白0(VP0)、病毒蛋白1(VP1)和病毒蛋白3(VP3)中的两种或更多种。
6.如权利要求5所述的组合物，其中VP0还包含病毒蛋白2(VP2)和病毒蛋白4(VP4)，并且其中VP2和VP4包含用于衣壳成熟的切割位点。
7.如权利要求2-4和6中任一项所述的组合物，其中所述蛋白酶是小核糖核酸病毒3C(3CD)。
8.如权利要求7所述的组合物，其中所述3CD对小核糖核酸病毒科中肠道病毒属的物种具有特异性。
9.如权利要求7或8所述的组合物，其中所述3CD对人鼻病毒(HRV)A、B或C的物种具有特异性。
10.如权利要求9所述的组合物，其中所述HRV物种是HRV-A16。
11.如权利要求9所述的组合物，其中所述HRV物种是HRV-B14。
12.如权利要求7或8所述的组合物，其中所述3CD对肠道病毒物种具有特异性。
13.如权利要求12所述的组合物，其中所述肠道病毒的基因型是EV-D68。
14.如权利要求12所述的组合物，其中所述肠道病毒的基因型是EV-A71。
15.如权利要求1和3-14中任一项所述的组合物，其中所述衣壳蛋白形成原体。
16.如权利要求15所述的组合物，其中所述原体形成五聚体。
17.如权利要求16所述的组合物，其中所述五聚体形成病毒样颗粒(VLP)。
18.如权利要求3-17所述的组合物，其中包含编码所述病毒P1前体多蛋白的所述ORF的所述mRNA和包含编码所述小核糖核酸病毒3C蛋白酶的所述ORF的所述mRNA(P1：3CD)按以下比率之一存在：20∶1、10∶1、7∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1。
19.如权利要求18所述的组合物，其中包含编码所述病毒P1前体蛋白的所述ORF的所述mRNA与包含编码所述小核糖核酸病毒3C蛋白酶的所述ORF的所述mRNA的比率为10∶1。
20.如权利要求18所述的组合物，其中包含编码所述病毒P1前体多蛋白的所述ORF的所述mRNA与包含编码作为3C或3CD的3C蛋白酶的所述ORF的所述mRNA的比率为2∶1。
21.如权利要求3-20中任一项所述的组合物，其中所述蛋白酶包含与SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：14的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
22.如权利要求21所述的组合物，其中所述蛋白酶包含SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：14的氨基酸序列。
23.如权利要求3-20中任一项所述的组合物，其中所述蛋白酶包含与SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：26的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
24.如权利要求23所述的组合物，其中所述蛋白酶包含SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：26的氨基酸序列。
25.如权利要求1和3-24中任一项所述的组合物，其中所述衣壳多蛋白包含与SEQ IDNO：5、11、17或23中任一项的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
26.如权利要求25所述的组合物，其中所述衣壳多蛋白包含SEQ ID NO：5、11、17或23中任一项的氨基酸序列。
27.如权利要求17-26中任一项所述的组合物，其中所述VLP包含中和免疫原性(NIm)位点。
28.如权利要求1、2或4-27中任一项所述的组合物，其中所述LNP包含可电离氨基脂质、PEG修饰的脂质、结构脂质和磷脂。
29.如权利要求3-27中任一项所述的组合物，其中包含编码所述病毒P1前体多蛋白的所述ORF的所述mRNA和包含编码所述小核糖核酸病毒3C蛋白酶的所述ORF的所述mRNA共配制在至少一种LNP中。
30.如权利要求3-27中任一项所述的组合物，其中包含编码所述病毒P1前体多蛋白的所述ORF的所述mRNA和包含编码所述小核糖核酸病毒3C蛋白酶的所述ORF的所述mRNA各自配制在单独的LNP中。
31.如权利要求29所述的组合物，其中用按以下比率之一存在的包含编码所述病毒P1前体多蛋白的所述ORF的所述mRNA和包含编码所述小核糖核酸病毒3C蛋白酶的所述ORF的所述mRNA配制所述LNP：20∶1、10∶1、7∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1。
32.如权利要求29-31中任一项所述的组合物，其中所述LNP包含可电离氨基脂质、固醇、中性脂质和PEG修饰的脂质。
33.如权利要求32所述的组合物，其中所述脂质纳米颗粒包含40-55mol％
可电离氨基脂质、30-45mol％固醇、5-15mol％中性脂质和1-5mol％PEG修饰的脂质。
34.如权利要求33所述的组合物，其中所述脂质纳米颗粒包含40-50mol％可电离氨基脂质、35-45mol％固醇、10-15mol％中性脂质和2-4mol％PEG修饰的脂质。
35.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述脂质纳米颗粒包含45mol％、46mol％、47mol％、48mol％、49mol％或50mol％可电离氨基脂质。
36.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述可电离氨基脂质具有化合物2的结构：
37.如权利要求27-31中任一项所述的组合物，其中所述固醇是胆固醇或
其变体。
38.如权利要求27-37中任一项所述的组合物，其中所述中性脂质是1，2
二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)。
39.一种方法，其包括向受试者施用免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含：
(i)包含编码小核糖核酸病毒蛋白酶的开放阅读框的信使核糖核酸(mRNA)；以及
(ii)包含编码包含前体蛋白的衣壳多蛋白的开放阅读框的信使核糖核酸(mRNA)，其中所述前体蛋白包含两种或更多种衣壳蛋白并且在所述两种或更多种衣壳蛋白之间具有对所述蛋白酶具有特异性的切割位点，
所述免疫原性组合物的量在所述受试者中有效诱导针对来自所述肠道病毒属成员的病毒感染的免疫应答。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述免疫应答包括对所述肠道病毒属的人鼻病毒物种的结合抗体滴度。
41.如权利要求39所述的方法，其中所述免疫应答包括对所述肠道病毒属的人鼻病毒物种的中和抗体滴度。
42.如权利要求39所述的方法，其中所述免疫应答包括对所述肠道病毒属的人鼻病毒物种的T细胞应答。
43.如权利要求40-42所述的方法，其中病毒的所述人鼻病毒物种选自由基因型A2、A16、B14和C15组成的组。
44.如权利要求41所述的方法，其中所述人鼻病毒的基因型是人鼻病毒16(HRV16)。
45.如权利要求39所述的方法，其中所述免疫应答包括对所述肠道病毒属的人肠道病毒物种的结合抗体滴度。
46.如权利要求39所述的方法，其中所述免疫应答包括对所述肠道病毒属的人肠道病毒物种的中和抗体滴度。
47.如权利要求39所述的方法，其中所述免疫应答包括对所述肠道病毒属的人肠道病毒物种的T细胞应答。
48.如权利要求45-47所述的方法，其中病毒的所述人肠道病毒物种选自由RV-A、RV-B、RV-C、EV-A和EV-D组成的组。
49.如权利要求48所述的方法，其中病毒的所述人肠道病毒物种选自由基因型RV-A16、RV-B14、RV-C15、EV-A71和EV-D68组成的组。
50.如权利要求49所述的方法，其中病毒的所述人肠道病毒物种是肠道病毒D68(EV-D68)。
51.如权利要求49所述的方法，其中病毒的所述人肠道病毒物种是肠道病毒A71(EV-A71)。
52.如权利要求39所述的方法，其中(i)的所述mRNA配制在包含至少一种脂质纳米颗粒的组合物中。
53.如权利要求39或52所述的方法，其中(ii)的所述mRNA配制在包含至少一种脂质纳米颗粒的组合物中。
54.如权利要求53所述的方法，其中将(i)的所述mRNA与(ii)的所述mRNA同时施用于所述受试者。
55.如权利要求39所述的方法，其中(i)和(ii)的所述mRNA配制在包含至少一种脂质纳米颗粒的组合物中。
56.如权利要求55所述的方法，其中(i)和(ii)的所述mRNA配制在包含两种脂质纳米颗粒的组合物中。
57.一种组合物，其包含：
(i)包含编码第一产物的开放阅读框(ORF)的第一信使核糖核酸(mRNA)；
(ii)包含编码第二产物的ORF的第二mRNA；以及
(iii)脂质纳米颗粒(LNP)，
其中所述第一产物是活性蛋白质，并且其中所述活性蛋白质能够调节所述第二mRNA和/或所述第二产物的表达、结构或活性。
58.如权利要求57所述的组合物，其中所述组合物是免疫原性组合物。
59.如权利要求57或58所述的组合物，其中所述第一产物是催化蛋白。
60.如权利要求57或58所述的组合物，其中所述第一产物是酶促蛋白。
61.如权利要求57或58所述的组合物，其中所述第一产物是结合蛋白。
62.如权利要求57或58所述的组合物，其中所述第一产物是多蛋白。
63.如权利要求57或58所述的组合物，其中所述第二产物是底物。
64.如权利要求57或58所述的组合物，其中所述第一产物是多蛋白。
CN202280033156.2A 2021-03-05 2022-03-04 Vlp肠道病毒疫苗 Pending CN117355329A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163157543P 2021-03-05 2021-03-05
US63/157,543 2021-03-05
PCT/US2022/019014 WO2022187698A1 (en) 2021-03-05 2022-03-04 Vlp enteroviral vaccines

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117355329A true CN117355329A (zh) 2024-01-05

Family

ID=83155602

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202280033156.2A Pending CN117355329A (zh) 2021-03-05 2022-03-04 Vlp肠道病毒疫苗

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20240100145A1 (zh)
EP (1) EP4301405A1 (zh)
JP (1) JP2024510421A (zh)
CN (1) CN117355329A (zh)
AU (1) AU2022230446A1 (zh)
CA (1) CA3212664A1 (zh)
IL (1) IL305644A (zh)
WO (1) WO2022187698A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116064531A (zh) * 2022-09-07 2023-05-05 昆明理工大学 一种抑制cvb5病毒复制的长链非编码rna及应用

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MA47016A (fr) 2015-10-22 2018-08-29 Modernatx Inc Vaccins contre les virus respiratoires
US10925958B2 (en) 2016-11-11 2021-02-23 Modernatx, Inc. Influenza vaccine
US11752206B2 (en) 2017-03-15 2023-09-12 Modernatx, Inc. Herpes simplex virus vaccine
WO2018187590A1 (en) 2017-04-05 2018-10-11 Modernatx, Inc. Reduction or elimination of immune responses to non-intravenous, e.g., subcutaneously administered therapeutic proteins
MA49421A (fr) 2017-06-15 2020-04-22 Modernatx Inc Formulations d'arn
EP3668971B8 (en) 2017-08-18 2024-05-29 ModernaTX, Inc. Rna polymerase variants
WO2019036683A1 (en) 2017-08-18 2019-02-21 Modernatx, Inc. ANALYTICAL METHODS BY HPLC
WO2019046809A1 (en) 2017-08-31 2019-03-07 Modernatx, Inc. METHODS OF MANUFACTURING LIPID NANOPARTICLES
EP3746090A4 (en) 2018-01-29 2021-11-17 ModernaTX, Inc. RSV RNA Vaccines

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150044257A1 (en) * 2012-03-23 2015-02-12 Fred Hutchinson Cancer Research Center Baculovirus-based enterovirus 71 vlp as a vaccine
CN106794239B (zh) * 2014-04-29 2020-10-30 财团法人卫生研究院 对抗肠病毒感染的基于腺病毒载体的疫苗
JP7384512B2 (ja) * 2015-10-22 2023-11-21 モデルナティエックス インコーポレイテッド 広域インフルエンザウイルスワクチン
WO2018067000A1 (en) * 2016-10-07 2018-04-12 Sentinext Therapeutics Sdn Bhd Expression cassettes and methods for obtaining enterovirus virus-like particles
EP3532094A1 (en) * 2016-10-26 2019-09-04 CureVac AG Lipid nanoparticle mrna vaccines

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116064531A (zh) * 2022-09-07 2023-05-05 昆明理工大学 一种抑制cvb5病毒复制的长链非编码rna及应用
CN116064531B (zh) * 2022-09-07 2024-04-02 昆明理工大学 一种抑制cvb5病毒复制的长链非编码rna及应用

Also Published As

Publication number Publication date
JP2024510421A (ja) 2024-03-07
US20240100145A1 (en) 2024-03-28
AU2022230446A9 (en) 2023-10-12
IL305644A (en) 2023-11-01
EP4301405A1 (en) 2024-01-10
WO2022187698A1 (en) 2022-09-09
CA3212664A1 (en) 2022-09-09
AU2022230446A1 (en) 2023-09-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240100145A1 (en) Vlp enteroviral vaccines
US20230338506A1 (en) Respiratory virus immunizing compositions
US20220202934A1 (en) Respiratory virus nucleic acid vaccines
US11911453B2 (en) RSV RNA vaccines
US20230108894A1 (en) Coronavirus rna vaccines
US20220323572A1 (en) Coronavirus rna vaccines
US20200282047A1 (en) Epstein-barr virus vaccines
EP3538146A2 (en) Influenza vaccine
WO2023283651A1 (en) Pan-human coronavirus vaccines
JP2024514183A (ja) エプスタイン－バーウイルスｍＲＮＡワクチン
WO2022266010A1 (en) Mrna vaccines encoding flexible coronavirus spike proteins
WO2022266012A1 (en) Coronavirus glycosylation variant vaccines
WO2023283642A2 (en) Pan-human coronavirus concatemeric vaccines
WO2023092069A1 (en) Sars-cov-2 mrna domain vaccines and methods of use
WO2023069498A1 (en) Mrna vaccine composition
WO2024015890A1 (en) Norovirus mrna vaccines

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination