CA1163585A - Sequence nucleotidique codant l'antigene de surface du virus de l'hepatite b, vecteur contenant ladite sequence nucleotidique procede permettant son obtention et antigene obtenu - Google Patents

Sequence nucleotidique codant l'antigene de surface du virus de l'hepatite b, vecteur contenant ladite sequence nucleotidique procede permettant son obtention et antigene obtenu

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CA1163585A
CA1163585A CA000359303A CA359303A CA1163585A CA 1163585 A CA1163585 A CA 1163585A CA 000359303 A CA000359303 A CA 000359303A CA 359303 A CA359303 A CA 359303A CA 1163585 A CA1163585 A CA 1163585A
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Pierre Tiollais
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Abstract

Acide nucléique de taille réduite et vecteur contenant ladite séquence nucléotidique dont l'ADN une séquence peptidique immunogène capable d'induire la production d'anticorps à l'égard du virus de l'hépatite virale B. Il comprend en totalité ou en partie la séquence de nucléotides représentée à la figure 3. Application à la production par clônage dans une bactérie d'une protéine immunogène vaccinante à l'é gard de l'hépatite B ou à l'obtention de sondes pour le diagnostic de la présence de particules de Dane dans un sérum.

Description

~s~

"SEQUENCE NUCBEOTIDIQUE CODANT L'ANTIGENE DE SURFACE DU
VIRUS DE L'~EPATITE B, VECTEUR CONTENANT LADITE SEQUENCE
NUCLEOTITIQUE, PROCEDE PERMETTANT SON OBTENTION ET ANTIGENE
OBTENU 1' L'invention est relative à un acide nucléique comprenant une séquence nucléotidique capable de coder une séquence peptidique immunogène correspondant à l'antigène de surface du virus de l'hépatite virale B, et aux poly-5 peptides et peptides obtenus.
EIle concerne également un procédé permettant d'obtenir un tel acide nucléique.
L'hépatite B est une maladie virale fréquente tout particulièrement en Afrique Tropicale, en Asie du 10 Sud-Est et en Extrême-Orient.
L'agent étiologique est un virus (HBV) ou par-ticule de Dane, comprenant une enveloppe (antigène Australia ou antigène HBs), une capside (antigène HBc), une polymérase endogène et une molécule d'ADN circulaire 15 partiellement simple brin , le brin le plus long de cette molécule d'ADN comporte près de 3 200 nucléotides (SUMMERS
J., O'CONNELL A. et MILLMAN I. (1975) Proc. Nat. Acad.
Sci. USA 72, 4 597-4 601).
L'ADN polymérase endogène peut être utilisée 20 pour réparer in vitro le brin le plus court (T. A. LANDERS, H. B. GREENBERT et J. S. ROBINSON, J. VIROL., 23, 1977, p. 368-376).
L'anaiyse électrophorétique des protéines de l'enveloppe a montré la présence de 2 à 7 polypeptides 25 dont les principaux sont appelés : polypeptide I et poly-peptide II tPETERSON D. L., ROBERTS I. M. et VYAS G. N.
(1977) Pr~.Nat. Acad. Sci., USA, 74, 1 530-1 534, et PETERSON D. L., CHIEN D.~Y., VYAS G. N., NITECKI D. et BOND H. (1978) In Viral Hepatitis, ed. G. VYAS, S. COHEN
30 et R. SC~MID, The Franklin Ins~itute Press, Philadelphie, 569-573) ., ~

:: :

Le polypeptide I a un poids moléculaire de 22 000 à 26 000 daltons. Le polypeptide II est glycosilé et a un poids moléculaire de 28 000 à 30 000 daltons. La composi-tion en acides aminés de ces deux polypeptides est très semblable, les séquences ~ue forment, respectivement, leurs 15 premiers amino-acides (à partir de l'ex-tremité N-terminale) et leurs 3 derniers amino-acides sont identiques, de sorte que l'hypothèse a été ~or-mulée que le polypeptide II pourrait ne différer du polypeptide I que par une glycosilation.
L'étude du virus est extrêmement di-ficile dans la mesure où l'on ne dispose d'aucun système de culture cellulaire permettant la propagation du virus.
Cette difficulté a déjà en partie été contournée, plus particulièrement en ce qui concerne le sérotype 3y~.
~ 'ADN entier (génome) du virus a été iden-tifié et clôné, notamment dans E. coli, après son insertion préala-ble dans le site unique EcoRI~d'un vecteur ~gt.WES. ~B,selon la technique par FRITSCH A., POURCEL C., CHARNAY P. et TIOLLAIS P. (1978) C. R. Acad. de Paris, 287, 1 453-1 456).
A ce ~our,la séquence des polypeptides I
et II eux-memes, la localisation dans l'ADN viral de la séquence codant ces peptides n'ont pas été réalisées.
L'invention a pour but l'obtention d'une séquen-ce d'ADN beaucoup plus petite que l'ADN viral lui-meme, contenant la séquence apte à coder la séquence peptidique douée de propriétés immunogènes permettant, lorsqu'elle est introduite dans l'organisme d'un hote vivant, d'in-duire la fabrication par ce dernier d'anticorps suscepti-bles de protéger ultérieurement ce même hôte à l'égard du vi~us de l'hépatite virale B, notamment lorsque celui-ci se trouve à l'état virulent.
L'invention découle non seulement de l'analyse nucléotidique complete du génome de la particule de Dane ~358~ ~

à laquelle ont procédé les inventeurs, mais à l'ldée qu'ils ont eue pour identifier le gène codant (ci-après dénommé
"gène S") des susdits polypeptides, de rechercher dans la ~:
structure nucléotidique complète ainsi préétablie du gé- -nome de la particule de Dane, celles des séquences de nu-cléotides susceptibles de coder les séquences peptidiques proximales et terminales connues de ces polypeptides.
On rappellera que PETERSON et collaborateurs ont rapporté, notamment dans les articles dont les réfé-rences ont été rappelées plus haut, que la séquence proxi-male ~premier amino-acide N-terminal) des 15 premiers amino-acides s'analysait en principe comme suit :
met glu asn ile thr ser gly phe leu gly pro leu leu valser et que la séquence terminale de ces mêmes polypeptides ~ :
(dernier amino-acide C-terminal) était la suivante :
val tyr ile La figure 1 est une carte schématique du génome ;
de la particule de Dane. Celui-ci comporte deux brins b1 et b2 ; le plus court d'entre eux (b2) étant normalement 20 dépourvu de la partie représentée par une ligne entrait :
interrompu dans le dessin.
Il est connu que cet ~DN ne comporte qu'un seul site EcoRI.
La flèche fl donne le sens de la numérotation des nucléotides dont est composé le brin le plus long b1, et la flèche f2 donne le sens de la transcription de l'ADN
~ du virus,~notamment par la machinerie cellulaire des cel-: lules envahies par lè virus de l'hépatite B, pour ce qui ::
concerne l'expression du gène S. :
Le site EcoRI peut donc etre numéroté 0 ou, c~omme on l'a maintenant déterminé de façon plus exacte ~ pour celui des virus de l'hépatite B appartenant au séro- ~:
: ~type aYW~ 3 182.
Le cercle en trait plein intérieur e donne l'é-chelle en ~ de longueur de l!ADN et permet de préciser les - :
- : '.`' , ~, ~.

, ., . ~ .

~L163~S

positions de certaines de ses parties.
Les nombres 3', 5' et 5', 3' à la partie infé-rieure de la carte visent les extrémités terminales por-teuses de mêmes nombres dans les représentations conven-tionnelles des extrémités des chalnes d'acide nucléique.
Selon l'invention, il a été montré que le ~gène S" constituait essentiellement le fragment du brin le plus long b1 situé entre les positions 73,6 et 95,1 de la carte schématique de la figure 1. Les abréviations "Start" et "Stop" représentent les points d'initiation et d'arrêt de la transcription du "gène S".
La fi~ure 2 est représentative de la partie terminale du susdit génome, comprise notamment entre les positions 60,4 et 100 (en % de longueur de l'ADN~. Chacune des lettres figurant dans la figure 2 correspond de façon conventionnelle à l'un des 4 nucléotides de base de l'ADN :
A : Adénine G : Guanine T : Thymine C : C~tosine Les lignes inférieures, dans chaque paire de li-gnes dont est constituée la figure 2, correspondent à
l'acide nucléique correspondant à la cha~ne nucléotidique b2 . .
La technique d'analyse utilisée pour établir la carte plus détaillée dont témoigne la figure 2, sera briè-~: vement rappelée ci-après.
La caractérisation de la séquence nucléotidique du "gène S" telle qu'elle est proposée dans le cadre de ~ :
la présente invention, et dont les extrémités proximale p "S" et terminale t "S" sont indiquées dans la figure 2, résulte de la constatation que :
- les ~4 premierstriplets tdans le sens de la lecture f2) à partir du nucléotide numéroté 3 030 vis-à-3S .is de l'extrémlte terminale EcorI , s~nt re~pec~i.ement ~ ~6358~i capables de ~ er les 14 pr ~ ers amino-acides de la séquence proxi-male des 15 premiers amino-acides des susdits polypeptides, - les 4 derniers triplets GTA TAC ATT TAA lus sur la chaine complémentaire b2 à la chaine transcrite b correspondent respectivement aux 3 amino-acides terminaux des susdits polypeptides et à un codon d'arrêt ;
- cette séquence de nucléotides (678 nucleotides) ne comprend aucun codon d'arrêt, du moins lorsque l'on adopte le cadre de lecture impliquant que le premier tri-plet "lu" sur l'ADN par la machinerie cellulaire soit AUG,(correspondant sur le brin complémentaire à ATG) ;
- la traduction complète de l'information géné-tique commen,cant avec le codon initial ATG conduit à un polypeptide théorique de 226 amino-acides, ayant un poids moléculaire de 25 422 daltons.
La structure nucléotidique du "gène S" ainsi que la chaine polypeptidique résultant de la traduction du "gène S" sont représentées à la Eigure 3.
Ces valeurs sont tout à fait conformes aux don-nées analytiques qui résultent de la mobilité électropho-rétique du polypeptide I sur des gels de polyacrylamide qui ont dé~à été décrits par les auteurs précédents (ré- ~ -férences 9-12 selon la bibliographie figurant à la fin de la description de la présente demande de brevet).
La différence observée au niveau du 15ème amino-acide de la séquence peptidique proximale du polypeptide I o leucine selon les cartes des figures 2 et 3 mentionnées ci-dessus, et non sérine selon les constatations des sus-o dits auteurs, peut peut-être être attribuée au fait que ces auteurs ont travaillé avec un variant génétique diffé-rent de celui ayant fait l'obiet de la présente étude. On notera que la différence peut d'ailIeurs être rapportée à
la substitution d'un seul nucléotide dans le triplet con-cerné "TTA" dans le "gène S" particulier représenté dans les cartes des figur-s 2 et 3, au lieu de "TCA", 1'un des . ~6~S~.5 triplets susceptibles d'être traduits en sérine.
L'invention concerne donc plus particulièrement les fragments d'acide nucléique qui peuvent etre excisés de l'ADN de la particule de Dane, ces fragments étant plus particulièrement caractérisés en ce qu'ils contiennent la partie du "gène S" susceptible de coder la partie de la protéine de l'enveloppe du virus qui est responsable des propriétés immunologiques du virus de l'hépatite B.
A ce titre, l'invention concerne donc un acide nucléique comportant au plus de l'ordre de 1 000-1 100 nu-cléotides, plus particulièrement caractérisé en ce qu'il est apte à coder une séquence peptidique immunogène, elle-meme apte à induire in vivo la production d'anticorps ac-tifs à l'égard du virus de l'hépatite B, cette séquence peptidique contenant essentiellement la structure repré-sentée à la figure 3, ou toute séquence peptidique ayant des propriétés immunogènes équivalentes.
L'invention concerne également un vecteur en vue de l'expression de ladite séquence nucléotidique dans un micro-organisme ou dans des ce].lules eucaryotes à con-dition que la fusion génétique ait: été effectuée en con-servant la phase de lecture du "gene S".
Les séquences nucléotidi.ques utilisées confor-mes à l'invention présentent l'une par rapport à l'autre une variabilité conduisant, lors de leur expression, à la formation de déterminants variant selon le sous-type du virus de l'hépatite B (sous-types d, w, y, r du groupe a).
Pour l'une des séquences peptidiques représen-tées à la figure 3, on observera que le premier acide ami-né de la séquence susdite : méthionine, est N-terminal et que l'amino-acide de l'extrémité opposée : isoleucine~ -est C-terminal.
L'invention concerne encore, plus particulière-ment, la séquence nucléotidique représentée à la figure 4 codant la séquence peptidique telle qu'elle résulte de la ~ ;3S~3S

figure 5 ou toute séquence peptidique analogue douée de propriétés immunogènes équivalentes.
Il va de soi que par "séquence peptidique équi-valente", mentionnée ci-dessus, il faut entendre toute sé-quence peptidique dans laquelle certaines parties peuventn'etre pas rigoureusement identiques aux parties corres-pondantes de la séquence peptidique représentée dans les figures 3 et 5, ces variations pouvant etre dues à des mu-tations locales n'afEectant pas le caractère immunogène général de la protéine ou à des modifications de structure tenant aux différents sérotypes sous lesquels les protéi-nes du genre en question sont susceptibles de se présenter (notamment sérotypes adw, adr et ayr).
L'invention concerne plus particulièrement la séquence nucléotidique contenant la séquence peptidique telle qu'elle est représentée à la figure 6 ou toute sé-quence peptidique analogue douée de propriétés immunogènes équivalentes.
L'invention concertie plus particulièrement encore les séquences peptidiques suivantes :
Alanine-Glutamine Glycine-Thréonine-Sérine Thréonine-Alanine-Glutamine-Glycine-Thréonine-Sérine qhréonine-Thréonine-Planine-Glutamine-Glycine-Thréonine-Sérine Dans le premier peptide sus-indiqué l'extrémité
alanine est N-terminale et l`extrémité sérine est C-terminale.
Dans le deuxième et troisième peptides sus-indiqués~, l'extrémité thréonine est N-terminale et l'extré-mité sérine est C-terminale.
A titre d'exemple, on peut notamment préparer le pentapeptide en partant de la sérine C-terminale à laquelle on accroche la thréonine par la méthode de Castro décrite dans Tétrahédron Letters, 1975, n14, page 1219-1222. Ensuite les aci-des aminés glycine, glutamine, alanine sont rajou-tés par la méthode dite de l'anhydride mixte répétee (m~thode rema) décrite par Beierman dans Chenustry and Biology~of Peptides, Ed. J. ~eienhofer, Ann. Arbour .

~.

3~

Science Publ., ~nn. Arb. Mich. 351 (1972).
L'invention concerne également les produits résul-tant de la fixation du pentapeptide sur une molécule porteu-se plus grosse, notamment de type polypeptide ou protéine, les ccmpositions contenant ce pentapeptide en produits de fixation, no-tamment en association avec un véhicule phar~aceutiquement acceptable, et plus particulièrement des vaccins contre l'hepati-te B. Ces véhicules pha ~ ceuti~les sont appropriés, de fa~on en soi classique, au mode d'ad-ministration choisi, no~ ent par voie orale, parentérale, rec-tale ou par nébulisation sur des muqueuses, notamment nasales.
L'hexapeptide et le polypeptide à 7 acides aminés peuvent etre synthétisés par des techniques de synthèse peptidique classiques.
Ces peptides sont, selon la présente invention, tenus pour etre le site antigénique des polypeptides de plus grande taille dont question plus haut et responsables du pouvoir vaccinant de l'enveloppe virale (Journal of Biol. Stand. 1976, 4, 295-304, RAO et VYAS "Biochemical Characterization of Hepatitis B Surface Antigen in Relation to Serologic Activity").
L'invention concerne égalemeht encore les frag-ments d'ADN susceptibles de coder la production de tels pentapeptide, hexapeptide et polypeptide à 7 acides aminés.
Il s'agit : -- pour le pentapeptide, notamment du polynucléo-tide de formule:
5' GCT CAA GGA ACC TCT 3 ' 3' GGA GTT CCT TGG AGA 5' - pour 1'hexapeptide, notamment du polynucléoti-de de formule :
5' ACT GCT CAA GGA ACC TCT 3' 3' TGA CGA GTT CCT TGG AGA 5' - pour le polypeptide à 7 acides aminés du poly-nucléotide de formule :
5' ACT ACT GCT CAA GGA ACC TCT 3' :

,, , 3' TGA TGA CGA GTT CCT TGG AGA 5' ou dans chacun des trois cas, du polynucléotide complémen- :
taire relatif aux trois polynucléotides respectifs précé-dents ou encore tout polynucléotide dans lequel chacun des triplets peut être remplacé par tout triplet analogue capable de coder la production du même amino-acide.
L'acide nucléique selon l'invention peut encore être caractérisé en ce qu'il comporte au moins l'un des !~
deu~ brins mutuellement complémentaire d'une séquence ~ :.
10 d'ADN telle que représentée dans la figure 4 (dans laquel- ;~
le figurent également les nombres correspondant aux posi-tions des premiers nucléotides de chacun des fragments suc-cessifs de 10 nucléotides représentés vis-à-vis de la po-sition EcoRI non représentée dans la figure : il va de soi que ces nombres n'interviennent pas au niveau de la caractérisation de la séquence nucléotidique du genre en question). Ce fragment d'ADN est délimité par deux sites HincII.
On appréciera que cette séquence nucléotidique correspond à l'information génétique dont la traduction conduit à la séquence peptidique représentée à la figure 5.
L'invention concerne naturellement les séquences nucléotidiques équivalentes à simple brin ou à doubIe brin, dont notamment le brin ayant la st:ructure qui découle de la succession des lignes inférieures de la figure 4, l'ADN
à:double brin correspondant, ou les ARN messagers corres-pondants, notamment celui:représenté par les enchalnements complémentaires de nucléotides constitués par les lignes :~
:~ inférieures des paires de lignes de la figure 4 (sens de la flèche f ).
: 2 ~ De:même entrent dans le champ de l'invention les:
.
chaines nucléotidiques qui se différenc1ent des précéden-`
tes par certains triplets;ou petites séquences de triplets:, :
dans la mesure où ces séquences nucléotidiques restent 35 aptes à coder un polypeptlde conservant les activités ::
~ ~:

:~ ~

s~s immunogènes caractéristiques des virus de l'hépatite vi- `
rale B. D'une façon générale, il s'agit de chaines de nu-cléotides qui, le cas échéant, après dénaturation de l'ADN
à double brin pour produire les acides nucléiques à simple brin correspondants, restent suceptibles de s'hybrider sur au moins environ 90 % de leur longueur avec l'un des brins de l'ADN de la figure 4.
Des acides nucléiques preférés selon l'invention sont encore ceux qui peuvent être excisés à partir de l'ADN de l'hépatite virale et qui, lorsqu'ils sont à dou-ble brin, sont caractérisés par l'existence à l'un de leurs bouts d'une extrémité HincII, HhaI, AvaI ou EcoRI
et à leur autre bout par une extrémité AvaIII, HincII ou HhaI.
Les positions de ces diverses extrémités vis-à-vis du site ~coRI sont schématisées dans la figure 2.
L'acide nucléique selon l'invention est destiné
à l'incorporation dans un vecteur permettant son expres- `
sion dans une bactérie et dans les cellules eucaryotes, notamment en vue de la production d'une protéine ou d'un peptide susceptible d'induire dans l'organisme d'un hote vivant la production d'anticorps actifs contre le virus de l'hépatite virale B. La protéine ou le peptide résul-tant de la traduction de la séquence nucléotidi~ue selon l'invention peuvent être utilisés comme agent vaccinant où comme agent servant pour le diagnostic.
L'acide nucléique selon l'invention peut égale-ment êtr~ utilisé comme sonde pour dépister la présence ou non dans des échantillons de sang ou de sérum d'épreuve, de particule de Dane, d'antigène ~Bs ou de fragments de celui-ci, etc. (par technique classique d'hybridation ADN- ~:
ADN).
D'autres caractéristiques de l'invention résul-teront encore de la description brève qui suit des techni-ques d'analyse, d'identiflcation et d'obtention de ~ .

:

~3~i~S
11 `
fragments d'ADN conformes à l'invention. Référence sera natureliement faite aux dessins dont les figures ont déjà
été prises en considération dans ce qui précède. Les chif-fres ou nombres entre parenthèses correspondent aux réfé- :
S rences de la bibliographie annexée à la présente descrip-tion.
L'invention concerne aussi des vecteurs particu-liers permettant l'expression des séquences nucléotidiques décrites ci-dessus, notamment sous la forme d'une protéine hybride dans laquelle un fragment protéique présentant les caractères immunologiques de HBsA~ ~ouxte une molécule porteuse conférant à l'ensemble des propriétés immunogènes ou immunoréactives, susceptibles d'induire la production d'anticorps protecteurs à l'égard de l'infection virale 15 dans l'organisme de l'hôte dans lequel cette protéine a ~-au préalable été introduite.
En particulier, l~invention concerne un vecteur -phage ou plasmide - contenant au moins une partie de l'o-péron lactose, plus particulièrement le promoteur et le gène Z de cet opéron, ce vecteur étant caractérisé en ce qu'il est modifié pour l'insertion, en phase, dans un site app.roprié du gène Z, tel que le site EcoRI de l'un quel-conque des fragments d'ADN du brevet principal, notamment ceux contenant la plus grande partie du"gène S". Elle con-cerne également ceux de ces vecteurs modifiés, dans les-quels une partie au moins du fragment d'ADN codant pour ~:: la plu9 grande partie de la B-galactosidase serait rempla-cée par un fragment d:'ADN apte à coder pour toute~autre molécule porteuse non immunogène, ou dont les éventuelles ~ ~
. 30 :~propriétés immunologiques, si celles-ci existent, n'inter- :
fèrent pas avec celles de la partie peptidique présentant ; ~ les propriétés immunologiques de HBsAg, par exemple essen- :~
: tielIement-celle qui s'étend dans la direction de la lec-ture à partir de son site HhaI.
L'invèntion est également plus~particulièrement .

.. . .

~635~

relative à une protéine hybride caractérisée en ce qu'elle contient une séquence polypeptidique présentant les proprié-tés immunologiques spécifiques de HBsAg, jouxtant une sé-quence polypeptidique constituée par la majeure partie de la ~-galactosidase, qui joue le rôle de protéine-porteuse.
L'invention ne s'étend pas-seulement à cette mo-lécule hybride particulière, dont le rôle essentiel est de constituer un modèle d'une protéine construite selon les techniques du génie génétique et douée des propriétés irnmunogènes et immunoréactives caractéristiques de l'anti-gène HBsAg, mais également à toute autre protéine hybride dans laquelle tout ou partie de la partie ~-galactosidase peut être remplacée par toute autre molécule porteuse non imrnunogène, ou dont les éventuelles propriétés immunologi-ques, si celles-ci existent, n'interfèrent pas avec celles de la partie peptidique présentant les propriétés immuno-logiques de HBsAg.
D'autres caractéristiques de l'invention appa-raItront encore au cours de Ia description d'exemples pré-férés, en combinaison avec les dessins dans lesquels :
- les figures la et lh illustrent schématique-ment les étapes successives de la fabrication d'un vecteur du type plasmide incorporant un fragment de HBV DNA, -les figures 2a à 2c illustrent schématiquement les structures initiales du vecteur utilisé (figure 2a) final du vecteur modifié obtenu (figure 2b) et celle de la protéine hybride résultant de l'expression de ce vec-teur modifié dans E~ coli (figure 2c).
A - SEQUENCES NUCLEOTIDIOUES
Les produits et méthodes utilisés - Les enzymes et les produits chirniques utilises Les enzyrnes de restriction utilisées : BamHI, HhaI, HincII, HaeIII, XbaI, MboI, HinfI, HpaII, XhoI, sont celles fabriquées par BIOLABS. On a utilisé l'ADN-polymé-rase I de BOEHRINGER. La phosphatase alcaline bactérienne li~35BS

et la polynucléotide-kinase ont été fournies par P. L. BIOCHEMICALS. Les agents chimiques étaient les sui-vants :
. Diméthyl sulfate (ALDRICH), . Hydrazine (EASTMAN KODAK), . Acrylamide et bis-acrylamide (2 fois cristal-lisés - SERVA), . Dideoxy nucléotide triphosphates et deoxynucléotide triphosphates (P. L.
BIOCHEMICALS), . Pipéridine (MERCK) redistillée sous vide.
- Préparation d'ADN HBV
______.______________ Le génome HBV entier (sous-type ayw) a été clô-né dans E. coli en mettant en jeu le site unique de res-triction EcoRI du vecteur ~gt.WES. ~B (14). L'ADN clônéest dénommé ci-après "Eco HBV DMA".
Le bactériophage recombinant a été amplifié en bolte de Pétri sur Agar et on a extrait l'ADN recherché
de façon en soi connue. Après digestion de l'ADN par l'en-zyme de restriction EcoRI , on a purifié la séquence Eco HBV DNA par ultracentrifugation, dans un gradient de sU-crose, selon la technique décrite dans les références bi-b~iographiques (16, 17).
- Preparation de fragments d'ADN marques 5~32p 10 à 20 picomoles d'Eco HBV DNA ont été complè-tement hydrolysés par les différentes enzymes de restric-;~ ~ tion, dans les conditions recommandées par le fabricant.;
Les~fragments d'ADN ont été déphosphorylés par la phos-phatase alcaline, celle-ci ayant ensuite été inactivée par un traitement alcalin. L'~DN a alors été précipité
~à l'éthanol, selon la technique décrite dans l'article (18). Après redissolution dans un tampon à base de sper midine, les ADN ont été marqués à leurs extrémités 5' avec un ATP {~32p} (3 000 Ci/mM fàbri~ué par NEW ENGLAND
NUCLEAR) et avec de là polynucléotide-kinase (selon la - , ' ~ :
~ '' ~3~

technique visée à l'article (19).
Les fragments d'ADN de restriction ont été sépa-rés par électrophorèse sur gel de pol~acrylamide, puis élués~ Les extrémités marquées ont fait l'objet de ségré-gatiorspar électrophorèse sur gel de polyacrylamide defaçon connue en soi, après restriction avec une autre en-zyme ou par dénaturation des fragments d'ADN du genre en question.
- Détermination de la structure des séquences ___________________________________ _______ de nucleotide de l'ADN
La structure primaire des fragments d'ADN à dou-ble brin ou simple brin a été determinée essentiellement selon la technique décrite par MAXAM et GILBERT (19).
L'on a aussi eu.recours à la méthode des inhibiteurs ter-minaux de chalnes décrites par SANGER et al. (20) et adap-tée par MAAT et SMITH (21), pour ce qui est des fragments à double brin marqués à l'une de leurs extrémités 5'.
Les produits de réaction chimique et enzymati-que ont été analysés par électrophorèse dans des gels de séquence d'acrylamide à 8,16 ou 25 %, de 1 mm d'épaisseur.
Les techni~ues et les résultats de l'analyse Afin de déterminer si le génome HBV est capa-ble de coder les polypeptides I et II, tous les fragments HaeIII (sites de`restriction HaeIII du génome HBV repré-sentés sur la figure i par de petites flèches) ont`étémarqués à leurs extrémités 5'. Des parties substantielles de leurs structures primaires ont été déterminées par la méthode de MAXAM et GILBERT. Les séquences de nucléotides susceptibles de coder les séquences d'amino-acide proxi-males et terminales des polypeptides I et II ont été lo-calisées dans les fragments HaeIII E et HaeIII F, préala-blement localisés sur la carte de restriction du génome HBV (selon la technique décrite dans la référence (17).
Ce sont ces séquences de nucléotides qui ont été considé-rées comme consistant en les extrémités du "gène S"

- ~i63S8S~

occupant elles-memes les positions 73,6 et 95,1 vis-à-vis du site de restriction EcoRI (figure 1) pour les raisons dé~à indiquées.
La séquence de nucléotides entre ces deux posi-tions a été analysée en ayant recours aux techniques chi-miques connues, notamment par la méthode de dégradation chimique à l'hydrazine diméthyl sulfate et la méthode des terminaisons de chaines. On a eu recours, parmi les réac-tions chimiques variées proposées par MAXAM et GILBERT à
une dépurina~ion partielle par l'acide formique et au cli-vage par la pipéridine, méthodes qui donnent des bandes d'intensité égale sur les autoradiogrammes pour les frag-ments terminés par une guanine et une adénine. On a éga-lement utilisé les réactions à l'hydrazine suivies d'un clivage à la pipéridine, pour obtenir des bandes d'égale intensité, pour les nucléotides cytosine et thymidine :
le fractionnement électrophorétique des produits de ces deux réactions donne pour toutes les bases une tache dans l'une ou l'autre des colonnes de gel utilisées. Cette procédure facilite la lecture de l'autoradiogramme du gel.
La réaction à l'hydrazine en présence de chlorure de so-dium spéciEique pour la cytosine permet de distinguer ce nucléotide de la thymidine et la réaction au diméthyl sulfa-te suivie d'un clivage par la pipéridine spécifique de la guanine permet de distinguer ce dernier nucléoti-de de l'adénine.
e façon à s'assurer du plus grand possible de-~gré de précision, des séquences distinctes de nucleoti-des formant différents fragments se chevauchant mutuelle-ment ont été produites par hydrolyse d'Eco HBV DNA pardiverses enzymes de restriction :
BamHi, HinfI, HpaII, HaeIII et HincII.
De cette ~açon l'analyse de chacun des sites de restriction utilisés comme points de départ de premiers fragments étudiés a ét~ conti~mée par l'analyse des :~ :

~.i~'~ t l~3~B~

~ragments distincts dans lesquels les sites de restriction des premiers fragments se trouvaient compris entre les nouvelles extrémites de ces fragments distincts.
Le "gène S" représenté à la figure 3, qui com-mence par le codon d'initiation ATG, comprend 227 triplets, dont un codon d'arret TAA. Les 3 codons correspondant aux 3 acides aminés de l'extrémité carboxy terminale du poly-peptide correspondant sont situés dans le meme cadre de lecture, immédiatement avant le codon d'arrêt TAA. L' un des deux autres cadres de lecture (respectivement décalés vis-à-vis du précédent de 1 e-t 2 nucléotides) est égale-ment dépourvu de codon d'arrêt, mais code une protéine tout à fait différente des polypeptidesI et II sus-mentionnés. Le troisième cadre de lecture comprend 10 co- -dons d'arrêt (5 TAG, 4 TGA, 1 TAA). Sur l'autre brin d' ADN, les trois cadres de lecture se trouvent respective-ment fermés par 11, 11, et 6 codons d'arrêt distribués le long de la séquence d'ADN.
Comme on l'a déjà indiqué plus haut, la traduc-tion complète de l'information génétique débutant par le codon d'initiation ATG conduit à Ull polypeptide théori-que de 226 amino-acides correspondant à un poids molécu-laire de 25 422 daltons.
Il est intéressant de souligner que la séquence nucléotidique correspondant au "gène S" devrait normale-ment être lue entièrement au cours de la tradu~tion.
Sont également parties de l'invention des chal-nes de nucléotides du type du "gène S" ci-dessus décrit, qui comporte depetites séquences supplémentaires pouvant contenir jusqu'à une centaine de nucléotides ou qui au contraire peuvent en être dépourvues, sans que soit pour autant altérée l'information génétique correspondante t22, 23).
Les différents fragments de l'invention qui ont été définis plus haut peuvent être obtenus à partir de la séquence d' ADN dite Eco HBV DNA, en ayant recours aux .

s enzymes de restriction correspondantes et aux techniques de fractionnement connues des fragments d'ADN, notamment sur gel de polyacrylamide et en mettant à profit leurs migrations sur des distances qui sont fonction de leurs poids moléculaires. Ainsi peut-on par exemple obtenir le fragment dont l'une des extrémités est délimitée par un site EcoRI et l'autre par un site AvaIII en opérant une restriction Eco HBV DNA par l'enzyme AvaIII, le frag-ment recherché consistant dans le plus petit fragment obtenu (un seul site AvaIII dans Eco HBV DNA~.
Le fragment délimité par des extrémités opposées Eco~I et HhaI est obtenu par hydrolyse d'Eco HBV DNA par EcoRI d'abord, puis par hydrolyse partielle par l'enzyme de restriction HhaI. L'on récupère alors parmi les pro-duits de restriction celui qui contient le site AvaIII.
Ces techniques de restriction n'ont évidemmentété proposées qu'à titre d'exemple, étant bien entendu que le spécialiste est à meme de cléterminer les ordres de traitement par les enzymes de restriction pour isoler, à partir notamment d'Eco HBV DNA, les fragments ayant les extrémités de restriction utiles.
A toutes fins utiles, on rappellera que ces opérations de restriction peuvent etre réalisées au sein d'un tampon Tris 10 mM ; pH 7,8 ; MgC12 6 mM ; ~-mercapto-éthanol 6 mM, le meme milieu contenant en outre et de pré-férence 50 mM de NaCl lorsque EcoRI est utilisé.
Comme il a déjà été dit, l'invention concerne l'utilisation des fragments d'ADN décrits à titre de son-de permettant le diagnostic de la présence dans un sérum de particules de Dane ou particules dérivées de la pré-cédente, porteuses d'un ADN susceptible de coder une pro-téine immunogène caractéristique de l'hépatite B.
L'ADN selon l'invention peut également être in-corporé à un vecteur permettant, à condition que l'incor-poration ait été réalisée en phase, l'expression de cet 35~35 18ADN dans une bactérie ou autre micro-organisme, ou dans des cellules eucaryotes.
B - VECTEURS CONTENANT UNE SEQUENCE NUCLEOTIDIQUE DE
L'ANTIGENE HBs Construction d'un bactériophaae recombinant ~lac HBs-1 Les produits au niveau des différentes étapes de cette construction sont visés dans les figures la et lh.
Ils sont également visés par les numéros la à lh.
On a indiqué dans la figure la les positions du 10 "gène S" et de certains sites d'enzyme de restriction.
Après traitement de DNA + HBV avec l'enzyme de restriction HhaI, on sépare un fragment d'ADN (lb) conte-nant 1 084 paires de bases, et plus particulièrement la totalité du "gène S", par électrophorèse sur gel d'agarose 15 et électro-élution (figure lb). On prépare, à partir de ce sous-fragment, traité au préalable par l'endonucléase S1, un sous-fragment (lc) (figure lc), résultant de l'al-longement du sous-fragment (lb) à ses extrémités, par des éléments d'ADN dénommés 'iEcoRI linkers" de formule :
5' GGAATTCC
CCTTAAGG 3' Le fragment obtenu est, après formation des extrémités cohésives EcoRI, clôné dans le plasmide pBR322.
~Le plasmide obtenu dénommé ci-après pBRHBs (fi-25 gure ld), ne contient qu'un seul site de restriction XbaI
situé à proximité de la tête du"gène S".
Par digestion du plasmide recombinant pBRHBs avec un mélange d'enzymes EcoRI et XbaI on produit un fragment d'ADN comprenant approximativement 930 paires 30 de bases et comportant la majeure partie du "gène S"
(figure le). Ce fragment est séparé et purifié par élec-trophorèse sur un gel d'agarose. Le fragment obtenu est-à nouveau traité avec l' endonucléase S1, puis à nouveau pourvu d'extrémités EcoRI au moyen des susdits "EcoRI
35 linkers", puis soumis à un traitement avec l'endonucléase ~3~i8~

EcoRI pour reformer les extrémités cohésives correspon-dantes. Le fragment de la figure le qui comprend environ 980 paires de bases est alors insére par fusion in vitro dans le site EcoRI du plasmide pBR322, pour former le plasmide pXbaHBs (~igure lf). Ce plasmide est cloné de façon usuellecomme le plasmide pBR322.
Plusieurs clones ont été obtenus.
On extrait et purifie, après traitement avec EcoRI des ADN de trois de ces clones, pXbaHBs-1, pXbaHBs-2 pXbaHBs-3 (figure 1~), les fragments appelés ci-après "fragments HBs" (figure lh).
Les séquences nucléotidiques des extrémités des susdits fragments (normalement obtenues à l'intérieur du "gène S") sont déterminées en ayant recours à la procédure décrite par MAXAM et GI~BERT (Proc. Nat. Acad. Sci. USA
74, 560-564 (1977). Ces déterminations ont révélé que les séquences des nucléotides des extrémités terminales, cor-respondant au "gène S" n'étaient pas identiques dans les trois clones (figure lg), les différences sont vraisem-blablement dues à des hétérogénéités produites au coursde la digestion par l'endonucléase S1.
Les deux fragments provenant de pXbaHBs-1 et pXbaBWs-2 sont insérés par fuslon in vitro dans le génome du bactériophage ~plac 5-1 (21), lequel n'a qu'un seul site EcoRI situé à proximité de l'extrémité du gène lac Z.
Du fait du cadre de lecture du gène lac Z, tel qu'il peut etre déduit de la séquence d'amino-acides de la ~-galactosidase (23), on constate -et l'expérience le con-firmera- que l'insertion du fragment HBs de pXbaHBs-1 dans le site EcoRI du gène lac Z de ~plac 5-1 doit condui-re à Ia conservation de la phase de lecture adéquate du "gène S". ~u contraire, l'insertion du fragment HBs de pXbaHBs-2 devait se révéler ne pas pouvoir etre insérée dans le précédent vecteur avèc conservation du cadre de lecture approprié. Il a néanmoins été utilisé comme .

.

l~i35~35 témoin dans des expériences postérieures.
Ces opérations ont été réalisées en ayant re-cours à des techniques connues. En particulier les "frag-ments HBs" de pXbaHBs-l, pXbaHBs-2 ont été insérés au moyen 5 d'une ligase dans l'ADN de ~plac 5-l qui avaient au préa-lable été clivés par EcoRI. Les mélanges des fragments de ADN obtenus ont été ensuite utilisés pour transfecter la souche C600RecBC rk mk de E. coli. Les clônes de bacté-riophage devenus lac du fait de l'insertion des fragments lO HBs dans les sites EcoRI du gène lacZ sont amplifiés et purifiés selon la méthode décrite en 121).
Les ADN des différents bactériophages ont été
extraits et les orientations des fragments d'ADN insérés déterminées par analyse électrophorétique de leurs frag-15 ments de restriction BamHI. L'on peut ainsi déterminer quedeux phages appelés ~lacHBs-1 et ~lacHBs-2 corres-pondant au plasmide pXbaHBs-l et pXbaHBs-2 contenaient un fragment HBs correctement orienté.
La figure 2a est une carte schématique du vec-20 teur ~plac 5-l avant sa modification par le fragment HBs-l, issu du pXbaHBs-l.
La figure 2c est une carte schématique d'une partie de ce même vecteur montrant la modification intro-duite dans son gène Z par insertion dans son site EcoRI du 25 susdit fragment HBs-l.
La figure 2c schématise les structures du po-lypeptidehybride obtenu comme résultat de l'expression du vecteur modifié de la figure 2b.
L'expression a été obtenu par transfection d'une 30 souche de bactérie de E. coli, notamment d'une souche Hfr~lacX74.
;~ Des souches de E. coli, notamment une souche de E. coli Hfr~lacX74 ont été transformées par plac 5-l, ~lacHBs-l et ~lacHBs-2 respectivement. Après culture les 35 cellules sont lysées et les-lysats obtenus analysés par .

~L3L63S8~

électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS (24) et les protéines sont détectées par coloration au bleu de coomas-sie. On constate la présence d'une bande plus intense parmi les produits d'expression de ~plac 5-1 au niveau de la po-5 sition correspondante, pour un témoin, à celle de la ~-galactosidase (poids moléculaire de 116 248) et d'une ban-de distincte parmi les produits d'expression de ~lacHBs-1 (non présent parmi les produits d'expression de ~lacHBs-2) correspondant à une nouvelle protéine ayant un poids molé-10 culaire de l'ordre de 13~ 000-141 000.
Les protéines synthétisées par les bactéries transfectées tant par ~lacHss-l que par ~plac 5-1 sont marquées par la (35S) méthi~nine. La mise en présence de ces protéines avec un s~rum anti-HBsAg et la réalisation d'un 15 autoradiogramme du gel de polyacrylamide SDS révèlent la présence parmi les produits d~expression du seul ~lacHBs-l d'une bande à laquelle ne correspond pas de bande équiva-lente parmi les produits d'expression des autres vecteurs.
Cette bande disparalt de facon spécifique lorsque l'immuno-20 précipitation est réallsée en présence de HBsAg non marqué.On observe encore la meme bande parmi les produits d'ex-pression ~lacHBs-1, lorsque l'immunoprécipitation est réa-lisée avec un antisérum à l'égard de la ~-galactosidase.
L,a structure présumée de la partie de protéine 25 hybride obtenue, au niveau de la fusion entre le gène lacZ
et le fragment H~s-1 résulte de la figure 2c qui fait appa-raltre le fragment "~-gal", correspondant à la ~-galactosi-dase (1 005 acides aminés), le fragment HssAg ~192 acides amines), ces fragments étant séparés par un acide aminé
30 prolyne, correspondant à une partie de "EcoRI linker" con-tenu dans le vecteur ~lacHBs-1.
C - PROCEDE DE FA~RICATION D'UNE MOLECULE IMMUNOGENEMETTANT

.

l~LWS~

EN OEUVRE LE VECTEUR SELON L,'INVENTION
L' invention peut par conséquent permettre la production d'une protéine de masse moléculaire plus faible que les polypeptides I ou II susvisés, douée des mêmes 5 propriétés immunogènes.
Les résultats démontrent que E. coli, ou tout autre micro-organisme approprié, tel qu'une bactérie ou une culture de cellule eucaryote, peut être infecté par le ~lacHBs-1 et synthétiser une protéine ayant un poids 10 moléculaire de l'ordre de 138 000 et possédant les déter-minants antigéniques à la fois de HBsAg et de la R-galac-tosidase. Cette molécule est représentative des polypep-tides hybrides qui peuvent être obtenus par le procédé
selon l'invention, dans lequel HssAg est relié à une pro-15 téine support (résultant de la substitution partielle ou totale du fragment R-galactosidase), ces hybrides possé-dant néanmoins les propriétés antigéniques de HBsAg. Ces nouvelles molécules sont utiles pour la production de vac-cins actifs contre l'hépatite-virale B.
Comme il va de soi, et comme il résulte d'ail-leurs déjà de ce qui précede, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'àpplication et de réalisa-tion qui ont été'plus spécialement e.nvisagés ; elle en em-brasse, au contraire, toutes les variantes.
En annexe de cette description figure la biblio-graphie, et en particulier-les références qui ont été ci-tées dans le ca~re de la pré,ente d scrlptio~.

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Claims (18)

Les réalisations de l'invention au sujet des-quelles un droit exclusif de propriété ou de privilège est revendiqué, sont définies comme il suit:
1. Un vecteur modifié contenant une insertion d'un acide nucléique caractérisé en ce qu'il comporte au plus 1,100 nucléotides apte à coder une séquence pepti-dique immunogène ayant des propriétés immunologiques équivalentes à celles de l'antigène HBs, ledit acide nucléique contenant une séquence capable de coder la sé-quence peptidique: L-Alanine (N-terminale)-L-Glutamine-Glycine-L-Thréonine-L-Sérine (C-terminale).
2. Vecteur selon la revendication 1, caracté-risé en ce que l'acide nucléique contient une séquence codante pour la séquence peptidique: L-Thréonine (N-terminale)-L-Alanine-L-Glutamine-Glycine-L-Thréonine-L-Sérine (C-terminale).
3. Vecteur selon la revendication 1, caracté-risé en ce que l'acide nucléique contient une séquence codante pour la séquence peptidique: L-Thréonine (N-terminale)-L-Thréonine-L-Alanine-L-Glutamine-Glycine-L-Thréonine-L-Sérine (C-terminale).
4. Vecteur selon la revendication 1, caracté-risé en ce que l'acide nucléique comprend une séquence nucléotidique capable de coder la séquence peptidique représentée dans la Figure 6.
5. Vecteur selon la revendication 1, caracté-risé en ce que l'acide nucléique comprend une séquence nucléotidique illustrée dans la Figure 4.
6. Vecteur selon la revendication 1, caracté-risé en ce que l'acide nucléique comprend une séquence nucléotidique capable de coder la séquence peptidique illustrée dans la Figure 3.
7. Vecteur selon la revendication 5, caracté-risé en ce que l'acide nucléique comprend la séquence d'ADN illustrée dans la Figure 4.
8. Vecteur selon la revendication 2, caracté-risé en ce que l'acide nucléique comprend la séquence d'ADN illustrée dans la Figure 3.
9. Vecteur selon la revendication 6, caracté-risé en ce que l'acide nucléique est délimité à l'un de ses bouts par une extrémité HincII, HhaI, AvaI, ou EcoRI, et à son autre bout par une extrémité AvaIII, HincII, ou HhaI.
10. Vecteur selon la revendication 1, caracté-risé en ce que l'acide nucléique contient la séquence 5' GCT CAA GGA ACC TCT 3', ou une séquence dans laquelle l'un au moins des susdits triplets est remplacé par un autre triplet, cependant capable de coder le même amino-acide.
11. Vecteur selon la revendication 2, caracté-risé en ce que l'acide nucléique contient la séquence 5' ACT GCT CAA GGA ACC TCT 3 ', ou une séquence dans laquelle l'un au moins des susdits triplets est remplacé
par un autre triplet, cependant capable de coder le même amino-acide.
12. Vecteur selon la revendication 3, caracté-risé en ce que l'acide nucléique contient la séquence 5' ACT GCT CAA GGA ACC TCT 3 ', ou dans laquelle au moins l'un des susdits triplets est remplacé par un autre triplet, cependant capable de coder le même amino-acide.
13. Vecteur modifié selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il contient le promoteur de l'opé-ron lactose et au moins une partie du gène Z codant pour .beta.-galactosidase de l'opéron, ladite insertion y étant incorporée en phase avec le gène Z.
14. Vecteur selon la revendication 13, carac-térisé en ce que ladite insertion est insérée dans le site EcoRI du gène Z.
15. Vecteur selon la revendication 14, carac-térisé en ce qu'au moins une partie du fragment d'ADN
codant pour la plus grande partie de la .beta.-galactosidase est remplacée par un fragment d'ADN apte à coder pour toute autre molécule porteuse non immunogène, ou pour une molécule, dont les éventuelles propriétés immuno-~ 9 logiques n'interfèrent pas avec celles de la portion peptique ayant les propriétés immunologiques de HBsAg.
16. Vecteur selon la revendication 15, carac-térisé en ce que le susdit fragment d'ADN de remplace-ment s'étend dans la direction de la lecture à partir du site HhaI antérieurement contenu dans le fragment de l'ADN pour la plus grande partie de la .beta.-galactosidase.
17. Vecteur selon l'une des revendication 14, 15 et 16, caractérisé en ce que le vecteur est dérivé du plasmide pBR322.
18. Procédé d'utilisation des vecteurs selon la revendication 1, 5 ou 6, caractérisé par la mise en contact de ces vecteurs, dans des conditions permettant l'hybridation éventuelle de ces vecteurs avec des acides nucléiques issus d'échantillons de sang ou sérum porteur de particules de Dane, d'antigènes HBs ou de fragments de celui-ci, susceptibles de coder une protéine immuno-gène caractéristique de l'hépatite B.
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