SE462530B - Immunogena peptider, som inducerar in vivo produktion av aktiva antikroppar med avseende paa hepatit b-virus - Google Patents

Description

462 530 2 i E. coli, efter en inledande insättning därav på den unika po- sitionen EcoRI av en vektor lgt.WES. AB, enligt tekniken av FRITSCH A., POURCEL C., CHARNAY P. et TIOLLAIS P. (1978) C.R.

Acad. de Paris, 287, l 453-1 456).

Idag är sekvensen för polypeptiderna I och II desamma, varvid lokaliseringen i viral DNA.i den sekvens, som kodar des- sa peptider, inte har realiserats.

Syftet med uppfinningen har varit att åstadkomma en DNA- -sekvens, som är mycket kortare än ifrågavarande virala DNA i sig själv och som innehåller den sekvens som är lämpad för kod- ning av den peptidsekvens som ger de immunogena egenskaper som, när den införes i organismen till ett levande vårddjur, möjlig- gör inducering av framställning av det sistnämnda antikroppar med förmåga att så småningom skydda samma värddjur mot virala hepatit B-virus, speciellt när dessa befinner sig i virulent tillstånd.

Uppfinningen härrör inte enbart från den fullständiga nu- kleotidanalysen av celluppbyggnaden av Dane-partikeln, vilken föreliggande uppfinnare har utfört, utan från den idé som de har haft för att identifiera den gen (i fortsättningen benämnd "gen SU) som kodar nämnda polypeptider, att undersöka i den sålunda förut fastlagda fullständiga nukleotidstrukturen efter cellupp- byggnaden av Dane-partikeln, av sekvenserna för de nukleotider, som uppvisar förmåga att koda de för dessa polypeptider kända proximala och terminala sekvenserna.

Det är känt, att Peterson och medarbetare har rapporterat, speciellt i de ovan omtalade artiklarna, att den proximala se- kvensen (första N-terminala aminosyræü för de 15 första amino- syrorna i princip analyserades enligt följande: met-glu asn~ile- thr ser gly phe leu gly pro leu leu val ser och att den terminala sekvensen för samma polypeptider (sista C-terminala aminosyran) var följande: val tyr ile.

Figur 1 visar en schematisk bild av celluppbyggnaden för Dane-partikeln. Denna omfattar två trådar, fibrer eller strängar bl och bz, varvid den kortaste av dessa (bz) normalt är blottad i den del som representeras av en streckad linje på ritningen. 3 462 530 Det är känt, att denna DNA innefattar enbart ett säte EcoRI.

Pilen fl anger riktningen för numreringen av de nukleotider, av vilka den län_sta tråden bl består, och pilen fz anger rikt- ningen för transkríptionen av viruseß DNA, speciellt av cell- maskineriet för de celler, i vilka hepatit B-viruset intränger, vilket uttrycket gen S har avseende pâ.

Sätet eller stället EcoRI kan sålunda numreras 0 eller/som man nu har bestämt på ett mera exakt sätt för hepatit B-virus tillhörande serotyp 323, 3182.

Den heldragna inre cirkeln 9 ger skalan i procent för längden av DNA och gör det möjligt att precisera positionerna för vissa av dess delar.

Siffrorna 3', 5'och 5", 3' ler de terminala ändar som är bärare av samma siffror i de kon- ventionella-bilderna av ändarna av nukleínsyrakedjor.

I samband med' uppfinningen har det visats att "gen S" i huvudsak utgjorde det längsta fragmentet av tråden bl beläget mellan po- sitionerna 73,6 och 95,1 i den schematiska bilden visad i figur 1. Förkortningarna "Start" och "Stop" visar punkterna för början och slutet av transkriptionen av "gen S".

Figurerna ZA, 2B och 2C är representativa för den termina- la delen av nämnda celluppbyggnad, belägen speciellt mellan po- sitionerna 60,4 och 100 (i procent av längden av DNA). Var och en av bokstäverna i figur 2 motsvarar på konventionellt sätt nå- gon av de fyra nukleotider som utgör basen för DNA: i den inre delen av bilden gäl- A: Adenin G: Guanin T: Thymin C: Cytosin De nedre linjerna i varje par av linjer, varav figurerna ZA, 2B och 2C består, motsvarar den nukleinsyra som svarar mot nukleotidkedjan bz. ' Den analysteknik som har använts för att fastlägga den mera detaljerade bild, som figurerna ZA, ZB och 2C visar, kommer kort- fattat att beskrivas nedan.

Karakteriseringen av nukleotidsekvensen för "gen S", och vars proximala ändar p "S" och terminala ändar t "S" anges i figurerna ZA, ZB och ZC, resulterar i ett konstaterande att: 4 462 5350 - de 14 första tripletterna (i riktningen för pilen fz) utgående från nukleotiden numrerad 3030 relativt den termi- nala änden EcoRI, uppvisar förmåga att koda respektive 14 första aminosyror i den proximala sekvensen för de 15 första aminosyror- na i nämnda polypeptiderz - de 4 sista tripletterna GTA TAC ATT TAA som kan läsas på komplementkedjan bz till kedjan transkriberad bl motsvarar respektive 3 terminala aminosyror i nämnda polypeptider och ett slutkodon; - denna nukleotidsekvens (678 nukleotider) innefattar inte något slutkodon, åtminstone om man godkänner den lektyr som anger att den första tripletten "läst" på DNA av cellmaski- neriet är AUG (motsvarande komplementtråden till ATG); - den fullständiga översättningen av den genetiska in- formation som börjar med det ursprungliga ATG-kodonet leder till en teoretisk polypeptid med 226 aminosyror och med en molekyl- víkt av 25 422 dalton. l Nukleotidstrukturen för "gen S" liksom polypeptidkedjan härrörande från översättningen av “gen S" visas i figurerna SA, SB och 3C. _ Dessa värden är helt och hållet överensstämmande med an- givna analysvärden, som härrör från den elektroforetiska rörlig- heten hos polypeptid I i polyakrylamidgeler och som tidigare har beskrivits av de angivna författarna (referenserna 9-12 enligt den bibliografi som återfinnes i slutet av föreliggande beskriv- ning).

Den observerade skillnaden vid nivån för den femtonde ami- nosyran i den proximala peptidsekvensen för polypeptid I: leucin enligt figurerna 2A, ZB, ZC och 3A, 3B, SC omtalade ovan, och ej serin enligt vad nämnda författare har konstaterat, kan må- hända tillskrivas det faktum att dessa författare har arbetat med en annan genetisk variant än den som har varit föremål för föreliggande studium. Man kan konstatera, att skillnaden för öv- rigt kan anges som substitution av en enda nukleotid i triplet- ten "TTA" i "S-genen", som speciellt visas i figurerna ZA, ZB och 2C, och 3A, SB, 3C istället för "TCA", den ena av tripletter- na med förmåga att undergå translation till serin.

Mera speciellt är det fråga om de nukleinsyrafragment som kan skäras av från DNA i Dane-partikeln, varvid dessa fragment - 462 530 mera speciellt utmärkes av att de innehåller den del av "S-genen" som uppvisar förmåga att koda den del av proteinet i virusets hölje som är ansvarig för de immunologíska egenska- perna hos hepatit B-virus.

Som grund för uppfinningen ligger en, nukleinsyra innefat- tande högst av storleksordningen 1000-ll00 nukleotider, vilken är lämpad, eller uppvisar förmåga, att koda en immunogen pep- tidsekvens, som i sig självt kan inducera produktion in vivo av antikroppar, vilka är aktiva med avseende på hepatit B-vi- rus, varvid denna peptidsekvens i huvudsak innehåller den i figurerna SA, 3B, SC visade strukturen, eller vilken som helst annan peptidsekvens som uppvisar ekvivalenta immunogena egen- skaper.

För utvinning av nämnda nukleotidsekvens i en mikroorga- nism eller i eukariotceller kan en vektor användas med villkor att den genetiska sammanslagningen har åstadkommíts under beva- rande av fasen för läsning av "gen S".

De använda nukleotidsekvenserna uppvisar i förhållande till varandra en föränderlighet som, under dessas utvinning, leder till bildning av variantdeterminanter enligt undertypen av he- patit B-virus (undertyperna d, w, y, r, för grupp a).

För den ena av den i fig. SA, SB, SC visade peptidsekven- serna kan man observera, att den första aminosyran i nämnda se- kvens: metionin, är N-terminal och att aminosyran i den motsat- ta ändenzísoleucin, är C-terminal. g Bakom uppfinningen ligger dessutom mera speciellt den i fíg. 4A, 4B visade nukleotidsekvensen, som kodar peptidsekven- sen såsom den framgår av fíg. 5 eller vilken som helst analog peptidsekvens uppvisande ekvivalenta immunogena egenskaper.

Med det ovan använda uttrycket "ekvivalent peptidsekvens" förstås varje peptidsekvens, i vilken vissa delar inte kan vara exakt identiska med motsvarande delar i den i fíg. 3A, 3B, SC och 5 visade peptidsekvensen, varvid dessa variationer kan be- ro på lokala mutationer, som inte påverkar den generella immuno- gena karaktären hos proteinet, eller på strukturmodifikationer som beror på de olika serotyper, bland vilka proteinerna av i- frågavarande slag år benägna att uppträda (speciellt serumtyperna agg, ad: och azr). 462 550 6 Mera speciellt kan en nukleotidsekvens utnyttjas, vilken innehåller peptidsekvensen såsom den visas i fig. 6 eller vil- ken som helst analog peptidsekvens med ekvivalenta ímmunogena egenskaper.

Uppfinningen avser närmare bestämt följande peptidsek- venser: Alanin-Glutamin-G1ycin-Treonin-Serin Treonin-Alanin-Glutamin-Glycin-Treonin-Serin Treonín-Treonin-Alanin-Glutamín-Glycin-Treonin-Serin I den första av de ovan angivna peptiderna är alaninänden N-terminal och serinänden C-terminal. _ I den andra och tredje av de angivna peptiderna är treo- ninänden N-terminal och serin-änden C-terminal.

Uppfinningen avser vidare en peptid med den i fig. 6 vi- sade amínosyrasekvensen eller en del därav, vilken del innefat- tar åtminstone aminosyrasekvensen: A1anin-Glutamin-Glycin-Treonin-Serin.

Uppfinningen avser slutligen en immunogen peptidsekvens, som innefattar en sekvens av aminosyror ingående i någon av de ovan angivna sekvenserna, varvid nämnda peptid inducerar in vívo produktion av aktiva antikroppar med avseende på hepatit B-virus.

Som exempel kan nämnas att man speciellt kan framställa pentapeptiden utgående från den C-terminala serinen, till vilken man kopplar treoninen medelst metoden av Castro beskriven i Tëtra- heatet. Letters, 1975, nr 14 Q sia 1219-1222. Därefter keppier men på aminosyrorna glycin, glutamin och alanin enligt metoden kallad repeterad blandanhydrid (metod rema) och beskriven av Beierman i Chemistry and Biology of Peptides, Ed. J. Meienhofer, Ann. Arbour Science Publ., Ann. Arb. Mich. 351 (1972).

Uppfinningen hänför sig även till de produkter som blir resultatet av fixering av pentapeptiden vid en större bärarmole- kyl, speciellt av polypeptid- eller proteintyp, kompositionerna innehållande denna pentapeptid i fixeringsprodukter, speciellt tillsammans med en farmaceutiskt acceptabel bärare, och mera spe- ciellt vacciner mot hepatit B. Dessa farmaceutiska bärare är på känt sätt lämpade för det valda adminístrationssättet, speciellt för den orala, parenterala eller rektala vägen eller medelst nebul- lisation genom slemhinnor, speciellt näsans. 7 Hexapeptiden och polypeptiden med sju aminosv tiseras medelst kända metoder för peptidsyntes.

Dessa peptider är enligt föreliggande uppfinning hållna för att vara det antigena sätet eller reaktionsstället i de ovan om- talade polypeptiderna av större storlek och ansvariga för vacci- neringsförmågan hos virushöljet (Journal of Biol. Stand. 1976, 1, 295-304, RAO och VYAS "Biochemical Characterization of Hepa- titis B Surface Antigen in Relation to Serologic Activity").

För de DNA-fragment som uppvisar förmåga att koda produktio- nen av sådana pentapeptider, hexapeptider och polypeptider med sju aminosyror gäller speciellt att det rör sig om: - för pentapeptiden, polynukleotiden med formeln: ' GCT CAA GGA ACC TCT 3' ' 3' GGA GTT CCT TGG AGA S' - för hexapeptiden, polynukleotiden med formeln: ' ACT GCT CAA GGA ACC TCT 3' 3' TGA CGA GTT CCT TGG AGA 5' - för polypeptiden med sju aminosyror polynukleotiden med formeln: ' ACT ACT GCT CAA GGA ACC TCT 3' 3' TGA TGA CGA GTT CCT TGG AGA 5' eller i vart och ett av dessa tre fall, den polynukleotid som är komplementär i förhållande till respektive av de föregående tre polynukleotiderna, eller varje polynukleotid, i vilken var och en av tripletterna kan ersättas med varje analog triplett med förmåga att koda produktionen av samma aminosyra.

Nukleinsyran kan vidare karakteriseras av att den innefattar åtminstone en av de båda trådar som inbördes kompletterar var- andra i en DNA-sekvens såsom representeras i figurerna 4A, 4B (i vilka figurer siffrorna likaså motsvarar positionerna för de första nukleotiderna i vart och ett av de på varandra följande fragmenten av tio nukleotider representerade gentemot position EcoRI som ej visas i figuren: det är självklart att dessa tal inte stör nivån för karakteriseringen av nukleotidsekvensen av frågavarande slag). Detta DNA-fragment begränsas av två Hincll- -ställen.

Det torde sålunda observeras, att denna nukleotidsekvens motsvarar den genetiska information vars translation leder till den i fig. 5 representerade peptidsekvensen. 4a2 550 8 I samband med uppfinningen avses naturligtvis de ekviva- lenta nukleotidsekvenserna med enkeltråd eller dubbla trådar och speciellt tråden med den struktur som framgår av följden av nedre rader i figurerna 4A, 4B, DNA med motsvarande dubbel- tråd, eller motsvarande messenger-RNA, speciellt den som repre- senteras av de komplementära sammanlänkningarna av nukleoti- der som utgöres av de nedre linjerna av de olika par av linjer som finns i figurerna 4A, 4B (riktningen för pilen fz).

På samma sätt avses de nukleotidkedjor som skiljer sig från de föregående genom vissa tripletter eller små sekvenser av tripletter, under förutsättning att dessa nukleotidsekven- ser fortfarande uppvisar förmåga att koda en polypeptid under bevarande av de immunogena aktiviteter som år karakteristiska för viralt hepatit B-virus. Generellt rör det sig om kedjor av nukleotider som, om så erfordras, efter denaturering av dub- belstrångad DNA för framställning av nukleinsyror med motsva- rande enkelsträng fortfarande uppvisar förmåga att hybridise- ras över åtminstone cirka 90% av sin längd med en av DNA-trå- darna eller -strängarna i fígurerna~4A, 4B.

Föredragna nukleinsyror är de som kan utskäras ur DNA från viral hepatit och som, när de har dubbla strängar, utmärkes av närvaro i den ena av sina ändar av en ytterànde HincII Hhal, Aval eller EcoRI och på sin andra kant av en ytterânde Ava III, HincII eller HhaI.

Positionerna för dessa olika ytterändar relativt sätet EcoRI är schematiskt återgivna i figurerna ZA, 2B, 2C.

Nukleinsyran är avsedd att införlivas i en vektor som till- låter expression därav i en bakterie och i eukaryotceller spe- ciellt i syfte att producera ett protein eller en peptid med förmåga att i organismen till en levande värdcell inducera pro- duktion. av antikroppar, vilka år aktiva mot viralt hepatit B-virus. Proteinet eller peptiden enligt uppfinningen härröran- de från translationen av ifrågavarande nukleotidsekvens kan an- vändas som vaccineringsmedel eller som medel för användning inom diagnostiken.

Nukleinsyran kan likaså användas som sond eller detektor för att i blodprov eller serumprov påvisa närvaro av Dane-par- tikeln, HBs-antigen eller fragment av detta, etc. (medelst klassisk teknik för hybridisering DNA-DNA). 9 462 550 Andra utmärkande drag för uppfinningen kommer att fram- gå av den beskrivning som nu följer av metoder för analys, identifiering och produktion av DNA-fragment. Härvid kommer naturligtvis att hänvisas till bifogade ritningar, för vilka gäller att figurerna redan har presenterats ovan. Siffrorna inom parentes hänför sig till de bibliografiska referenser som återfinns i slutet av beskrivningen.

I samband med uppfinningen förekommer vidare speciella vektorer, som möjliggör expression av de ovan omtalade nukleo- tidsekvenserna, speciellt i form av ett hybridprotein, i vilket ett proteinfragment, som uppvisar den immunologiska karaktären för HBsAg, är anordnat nära eller kopplat till en bärarmolekyl som bibringar aggregatet immunogena eller immunoreaktiva egen- skaper, med förmåga att inducera produktion av skyddande anti- kroppar med avseende på viral infektion i organísmen hos värd- cellen, i vilken detta protein tidigare har introducerats.

Speciellt avses en vektor - fag eller plasmid - innehål- lande åtminstone en del laktosoperon, mera speciellt promotorn och Z-genen i denna operon, varvid denna vektor utmärkes av att den är modifierad för insättning eller införsel, i fas, i ett lämpligt säte av Z-genen, såsom sätet EcoRI hos vilken som helst av DNA-fragmenten enligt huvudpatentet, speciellt de som innehåller den största delen av "S-genen". Likaså avses de av dessa modifierade vektorer, i vilka åtminstone en del av det DNA-fragment som kodar den största delen av B-galaktosidaset är ersatt med ett DNA-fragment med förmåga att koda för varje annan icke immunogen bärarmolekyl, eller vars eventuella im- munologiska egenskaper, om sådana existerar, inte stör egenska- perna för den peptiddel som uppvisar de immunologiska egenska- perna för HBsAg, till exempel i huvudsak den som utbreder sig i läsriktningen utgående från dess säte Hhal.

Mera speciellt avses ett hybridprotein, som utmärkes av att det innehåller en polypeptidsekvens uppvisande de specifika immunologiska egenskaperna för HBsAg, nära en polypeptidsek- vens, vilken utgöres av huvuddelen av B-galaktosidas, som spe- lar rollen som proteinbärare.

Uppfinningen är emellertid tillämpbar inte enbart i sam- band med denna speciella hybridmolekyl, vars väsentliga roll är att utgöra en modell av ett protein konstruerat enligt genetisk 462 550 10 fackmannateknik och uppvisande immunogena och immunoreaktiva egenskaper, vilka är karakteristiska för antigenet HBsAg, utan även i samband med vilket som helst annat hybridprotein, i vilket hela eller en del av dess B-galaktosidasparti kan ersät- tas med vilken som helst annan icke ímmunogen bärarmolekyl, eller vars eventuella immunologiska egenskaper, om sådana exi- sterar, inte stör egenskaperna för den peptíddel som uppvisar de immunologiska egenskaperna för HBsAg.

Andra kännetecken för uppfinningen kommer att framgå av nedanstående beskrivning av föredragna utföringsexempel i kom- bination med ritningarna, på vilka: - figurerna la och lh schematiskt illustrerar de successiva stegen för framställning av en vektor av plasmidtyp under inför- livande av ett fragment av HBV DNA, - figurerna.2a och Zc schematiskt illustrerar de ursprung- liga strukturerna för den använda vektorn (figur Za) den slutli- gen erhållna modifierade vektorn (figur Zb) och den för det hy- bridprotein som blir resultatet av expression av denna modifie- rade vektor i E.co1i (figur Zc).

A NUKLBOTIDSEKVENSER Använda produkter och metoder - Aflxäada anime: ash keaiåka nrsdykzer.

De använda restriktíonsenzymerna: BamHI, Hhal, HincII, HaeIII, Xbal, Mbol, Hinfl, HpaII, XhoI, är de som tillverkas av Bíolabs. Man använder DNA-polymeras I från Boehringer. Det alkalíska bakteriefosfataset och polynukleotid-kínaset erhölls från P.L. Biochemicals. De kemiska medlen var följande: Dimetylsulfat (Aldrich) Hydrazin (Eastman Kodak) Akrylamid och bis-akrylamid (kristalliserad två gånger - SERVA) Dideoxínukleotidtrífosfater och deoxinukleotídtrifostater (P.L. Biochemicals), Piperidin (Merck) omdestillerad under vakuum, ' Ãfšmåtëllfiifiå šV_DÉA;HÉV_ Hela HBV-gencelluppbyggnaden (undertyp EXE) klonades i E. coli under utnyttjande av det unika restriktíonssätet EcoRI för vektorn Ägt.WES. ÄB (14). Denna klonade DNA benämnes i fort- 1 1 4 6 2 5 3 0 sättningen"Eco HBV DNA".

Rekombinantbakteriofagen utvecklades i Petriskål på agar och erhållen DNA utvanns på känt sätt. Efter digestion av DNA med restriktionsenzymet EcoRI renades sekvensen Eco HBV DNA ge- nom ultracentrifugering, i en sukrosgradient, enligt tekniken beskriven i de bibliografiska referenserna (16, 17). ' .Éfåmâtšllninå EKDÉALfEaEmEHE EäIkEa_5Ä3iP_ till 20 pikomol av Eco HBV DNA hydrolyserades fullstän- digt av de olika restriktionsenzymerna, under de betingelser som rekommenderas av fabrikanten. DNA-fragmenten defosforylerades med alkaliskt fosfatas¿ vilket sedan inaktiverades genom en alka- libehandling. DNA utfälldes sedan i etanol, enligt den teknik som beskrivs i artikel (18). Efter återupplösning i en buffert baserad på spermidín märktes DNA i sina ytterändar 5' med en ATP [lszp] (3000 Ci/mM tillverkad av New England Nuclear) och med polynukleotid-kinas (enligt tekniken beskriven i artikel (19).

Restriktíonsfragmenten av DNA separerades genom elektro- fores på polyakrylamidgel och eluerades därefter. De märkta ytterändarna avsëndrades genom elektrofores på polyakrylamid- gel på i och för sig känt sätt, efter restriktion med ett annat enzym eller genom denaturering av DNA-fragmenten av ifrågavaran- de slag. - åestëmaiaafl! atzukt2fsfl_fëlgflßkleetifisßkvsflsezna i .DNA Primärstrukturen för fragmenten av DNA med dubbelsträng eller enkelsträng bestämdes i huvudsak medelst tekniken beskri ven av Maxam och Gilbert (19). Vidare användes metoden med ter- minala kedjeinhibitorer beskriven av Sanger et al (20) och till- lämpad av Maat och Smith (21), vad beträffar de dubbelsträngade fragmenten märkta i en av sina ytterändar S'.

Produkterna av den kemiska och enzymatiska reaktionen ana- lyserades genom elektrofores i geler med akrylamidsekvens med 8, 16 eller 25 %, med 1 mm tjocklek.

Metoder för och resultat av analysen I syfte att bestämma om genuppbyggnaden HBV uppvisar för- måga att koda polypeptiderna I och II märktes samtliga fragment Haelll (restriktionssäten HaeIII för celluppbvggnaden HBV visa- de i fig. 1 med små pilar) i sina ytterändar S'. Väsentliga de- 462 550 12 lar av deras primärstrukturer bestämdes medelst metoden av Maxam och Gilbert. Nukleotidsekvenserna med förmåga att koda de proxi- mala och termínala aminosyrasekvenserna för polypeptiderna I och II lokaliserades i fragmenten HaeIIl E och HaeIII F, tidigare lokaliserade på restriktionsbilden för celluppbyggnaden HBV (enligt tekniken beskriven i referensen (17). Det är dessa nu- kleotidsekvenser som man har ansett utgöra ytterändarna av "gen S", som i sig själva upptar positionerna 73,6 och 95,1 gentemot restriktionssätet EcoRI (fig. 1) av redan angivna skäl.

Sekvensen av nukleotider mellan dessa båda positioner ana- lyserades under användning av kända kemiska metoder, speciellt med hjälp av metoden med kemisk nedbrytning med hydrazindimetyl- sulfat och metoden för kedjeterminering. Bland de olika kemiska reaktioner som har föreslagits av Maxam och Gilbert utvaldes en partiell rening med myrsyra och spjälkning med piperidin, vilket är metoder som ger band med lika stark intensitet på autoradiogram för de fragment som avslutas av en guanin och en adenin. Likaså användes reaktionerna med hydrazin följda av spaltning med piperidin, för erhållande av band med lika stor intensitet, för nukleotiderna cytosin och tymidin: den elektroforetiska fraktioneringen av produkterna från dessa båda reaktioner ger för samtliga baser en fläck i den ena el- ler den andra av de använda gelkolonnerna. Denna procedur underlättar läsningen av gelautoradiogrammet. Den hydrazin- reaktion i närvaro av natriumklorid som är specifik för cyto- sin gör det möjligt att skilja denna nukleotid från tymidin och reaktionen med dimetylsulfat följd av spjälkning av det specifika piperidinet för guanin gör det möjligt att skilja sistnämnda nukleotid från adenin.

För att man skall försäkra sig om största möjliga grad av precision framställdes distinkta sekvenser av nukleotider bildande olika fragment, som inbördes överlappar varandra, genom hydrolys av Eco HBV DNA medelst olika restriktions- enzymer: BamHi, Hinfl, Hpall, HaeIII och HincII.

På detta sätt bekräftades analysen av var och en av de restriktionssäten som användes som utgångspunkter för de första studerade fragmenten medelst analys av distinkta frag- 13 462. 550 ment, i vilka restriktionssätena för de första fragmenten be- fann sig mellan de nya ytterändarna av dessa distinkta frag- ment: "gen S" visad i fig. 3A, 3B, 3C, vilken börjar med initíeringskodonet ATG innefattar 227 tripletter, varav ett slutkodon TAA. De tre kodoner, som svarar mot de tre amino- syrorna i den terminala karboxiänden av motsvarande polypep- tid, är belägna inom samma läsområde eller -ram, omedelbart före slutkodonet TAA. Den ena av de båda andra läsområdena (borttagna från det föregående med l resp. 2 nukleotider) är likaså utblottad pàrslutkodon men kodar ett helt och hållet annorlunda protein av ovannämnda polypeptider I och II. Det tredje läsområdet innefattar 10 slutkodoner (5 TAG, 4 TGA, 1 TAA). I den andra DNA-strängen befinner sig de tre läsom- rådena stängda av respektive ll, ll och 6 stoppkodoner för- delade längs DNA-sekvensen.

Såsom redan har angivits ovan leder den fullständiga translationen av den genetiska information som börjar med initieríngskodonet ATG till en teoretisk polypeptíd med 226 aminosyror, vilket motsvarar en molekylvikt av 25 422 dalton.

Det bör betonas, att nukleotidfrekvensen motsvarande "gen S" normalt borde läsas helt och hållet under transla- tionen. _ - Inom uppfinningens ram ligger även nukleotidkedjor av den ovan beskrivna typen "gen S", vilken omfattar små komplet- terande sekvenser, vilka kan innehålla upp till ett hundratal nukleotider eller vilka tvärtom kan vara utarmade därpå, utan att motsvarande genetiska information förändras (22, 23).

De olika fragment som har definierats ovan kan erhållas utgående från DNA-frekvensen benämnd Eco HBV DNA, under ut- nyttjande av motsvarande restriktionsenzymer och av fraktio- neringsmetoder kända för DNA-fragment, speciellt på en poly- akrylamidgel och under utnyttjande att de migrerar eller vand- rar vissa avstånd, som är funktioner av deras molekylvikt. Så- lunda kan man t.ex. erhålla det fragment, vars ena ytterände är begränsad av ett säte EcoRI och vars andra är begränsad av ett säte AvaIII under utnyttjande av en restriktion Eco HBV DNA med enzymet AvaIlI, varvid det sökta fragmentet består i 462 550 det minsta erhållna fragmentet (ett enda säte AvaIII i Eco Hßv DNA) .

Det fragment, som avgränsas av de motsatta ytterändarna EcoRI och Hhal, erhålles genom att man först utför hydrolys av Eco HBV DNA med EcoRI och därefter utför partiell hydrolys med restriktionsenzymet Hhal. Man utvínner därvid bland re- stríktionsprodukterna den som innehåller sätet av AvaIII.

Dessa restriktionsmetoder har naturligtvis enbart beskri- vits i exemplifierande syfte, då det är uppenbart att fack- mannen på området är i stånd att bestämma ordningsföljden för behandlingen med restriktionsenzymerna för isolering, speci- ellt utgående från Eco HBV DNA, av de fragment som har de an- vända restriktionsytterändarna.

Det kan tilläggas att för alla använda tillämpningar dessa restriktionsoperationer kan utföras i en 10 mM Tris- -buffert; pH 7,8; MgCl 2 6 mM; B-merkaptoetanol 6 mM, varvid samma medium dessutom och företrädesvis innehåller 50 mM NaCl, när EcoRI användes. 14 Såsom redan har omtalats är de beskrivna DNA-fragmenten användbara som reagens, vilka möjliggör diagnostik av närvaro i ett serum av Dane-partiklar eller partiklar härledda däri- från, uppburna av en DNA med förmåga att koda ett immunogent protein som år karakteristiskt för hepatit B.

Ifrågavarande DNA kan likaså införlivas i en vektor, vil- ken tillåter, under förutsättning att införlivandet har åstad- kommíts i fas, expression av denna DNA i en bakterie eller annan mikroorganism eller i eukaryotceller.

B - VEKTORER INNEHÅLLANDE EN NUKLEOTIDSEKVENS AV ANTIGBNET EPE Konstruktion av en bakteriofag som rekombinerar Älak HBs-1 Produkterna för nivån för de olika stegen i denna kon- struktion äskådliggörs i fig. la och lh. De är likaså angivna med beteckningarna la till lh.

I fig. la har positionerna för "gen S" och för vissa restriktionsenzymsäten angivits.

Efter behandling av DNA + HBV med restriktíonsenzymet Hhal separerar man ett fragment av DNA (lb) innehållande 1 084 par baser, och mera speciellt hela "gen S", genom elektro- 462 530 fores med en agarosgel och elektroeluering (fig. lb). Man fram- ställer utgående från detta underfragment, som i förväg har behandlats med endonukleaset Sl, ett underfragment (lc) (fig. lc), som härrör från förlängning av underfragmentet (lb) i dess ytterändar med DNA-element betecknade "EcoRI línkers" med formeln: ' GGAATTCC CCTTAAGG 3' Det erhållna fragmentet klonas, efter bildning av de ko- hesiva ytterändarna,EcoRI, i plasmíden pBR322.

Den erhållna plasmíden, vilken nedan benämnes pBRHBs (fig. ld) innehåller ett enda restriktionssäte Xbal beläget i närheten av huvudet av "gen S".

Genom sönderdelning av den rekombinerandejplasmiden pBRHBs med en blandning av enzymer EcoRI och XbaI produceras ett DNA-fragment innehällande approximativt 980 baspar och omfattande huvuddelen av "gen S" (fig. le). Detta fragment av- skiljes och renas genom elektrofores över en agarosgel. Det erhållna fragmentet behandlas på nytt med endonukleaset S1 och förses därefter på nytt med ytterändar EcoRI med hjälp av nämnda "EcoRI línkers" och utsättes sedan för en behandling med endonukleaset EcoRI för återbildning av motsvarande ko- hesiva ytterändar. Fragmentet i fig. le, vilket innefattar ca 980 baspar, injíceras sedan genom smältning in vitro i sätet EcoRI i plasmíden pBR322, till bildning av plasmíden pXbaHBs (fig. lf). Denna plasmid klonas på vanligt sätt såsom plasmi- den pBR322.

Ett flertal kloner har erhållits.

Man extraherar och renar, efter behandling med EcoRI av DNA för tre av dessa kloner, pXbaHBs-1, pXbaHBs-2, pXbaHBs-3 (fig. lg), de fragment som nedan kommer att benämnas "HBs-fragment" (fig. lh).

Nukleotidsekvenserna för ytterändarna av dessa fragment (som normalt erhålles i det inre av "S-genen") bestämmes under användning av proceduren beskriven av MAXAM och GILBBRT (Proc.

Nat. Acad. Sci. USA li, 560-564 (1977). har visat, att nukleotidsekvenserna i de terminala ändarna, Dessa bestämningar svarande not "S-genen", inte var identiska i de tre klonerna 462 550 N (fig. lg), varvid skillnaderna sannolikt beror på heterogeni- teter bildade under digestionen med endonukleas Sl.

De båda fragment, som härrör från pXbaHBs-1 och pXbaBHs-2, injiceras genom smältning in vítro i celluppbygg- naden av bakteriofagen Åplac 5-1 (21), vilken enbart har ett enda säte EcoRI beläget i närheten av ytteränden av lak Z- -genen. Vad beträffar läsningen av genen lak Z, såsom den kan härledas från sekvensen av aminosyror i B-galaktosidas (23), kan man konstatera - vilket även erfarenheten bekräftar - att införandet av fragmentet HBs från pXbaHBs-1 i sätet EcoRI i _genen lak Z från Aplac 5-l bör leda till att läsningsfasen bi- behålles adekvat för "gen S". I motsats därtill skulle det komma att visa sig att ett införande av fragmentet HBs från pXbaHBs-2 inte kunde ske i föregående vektor under bibevarande av lämplig läsning. Det har icke desto mindre använts som bevis vid tidigare utförda försök.

Dessa operationer utfördes under användning av konven- tíonella metoder. Mera speciellt gäller att "HBs-fragmenten" från pXbaHBs-1, pXbaHBs-2 infördes med hjälp av ett lígas í DNA på Aplac 5-l som tidigare hade utsatts för klyvning med EcoRI. De erhållna blandningarna av DNA-fragmenten användes därefter för transfektering av stammen C600RecBC rk-mk' av E. coli. De bakteríekloner som bildade lak- som ett resultat av införandet av HBs-fragmenten i sätena EcoRI av genen lakZ förökades och renades enligt metoden beskriven i (21).

DNA från de olika bakteriofagerna utvanns och oriente- ringarna för de införda DNA-fragmenten bestämdes genom elektro- foretisk analys av deras restriktionsfragment BamHI. Man kunde därvid konstatera, att tvâ fager benämnda Ä-lakHBs-l och l1akHBs-2 svarande mot plasmiden pXbaHBs-l och pXbaHBs-2 inne- höll ett korrekt orienterat HBs-fragment., ' Pig. 2a är en schematísk bild av vektorn Äplac 5-1 före dess modifiering med fragmentet HBs-1 härrörande från pXbaHBs-1.

Fig. 2 är en schematisk bild av en del av samma vektor visande den modifikation som har introducerats i dess gen Z genom injicering i dess säte EcoRI av nämnda fragment HBs-l.

Fig. 2c visar schematiskt strukturerna för den erhållna hybridpolypeptiden som ett resultat av expressionen av den en- 17 462 550 ligt fig. 2b modifierade vektorn.

Expressionen erhölls genom transfektion av en bakterie- stam från E. coli, speciellt en stam HfrAlakX74.

Stammar av E. coli, speciellt en stam av E. coli HfrAlakX74 omvandlades av plac 5-1, AlakHBs-l respektive AlakHBs-2. Efter odling utsattes cellerna för lysis och er- hållna lysat analyserades genom elektrofores med en polyakryl- amidgel SDS (24), och proteinerna detekterades genom blåfärg- ning med coomassie. Man konstaterar närvaro av ett intensivare band bland expressionsprodukterna för Åplac 5-1 vid nivån för motsvarande position, för ett jämförelseprov, till den som gäl- ler för B-galaktosidas (molekylvikt 116 248) och ett distinkt band bland expressionsprodukterna för AlakHBs-l (ej närvarande bland expressionsprodukterna för AlakHBs-2), vilket motsvarar ett nytt protein med en molekylvikt av storleksordningen 135 000-141 000.

Proteinerna syntetiserade av bakterierna transfekterade såväl av AlakHBs-l som av Aplac 5-1 märkes med metionin (358). När dessa proteiner bringas i kontakt med ett anti- -HBsAg-serum och ett autoradiogram utföres på en polyakryl- amidgel SDS, kan man bland expressionsprodukterna enbart för A1akHBs-l konstatera närvaro av ett band, vilket inte motsva- ras av något ekvivalent band bland expressionsprodukterna för de övriga vektorerna. Detta band försvinner pä ett specifikt sätt när immunoutfällningen åstadkommes i närvaro av icke märkt HBsAg. Man observerar vidare samma band bland expressions- produkterna för ÅlakHBs-l, när immunoutfällningen utföres med ett antíserum med avseende på 6-galaktosidas.

Den antagna strukturen för den del av det erhållna hybrid- proteinet som ligger vid stället för sammansmältning mellan genen lakZ och fragmentet HBs-1 framgår av fíg. 2c, som visar fragmentet "B-gal", vilket motsvarar B-galaktosidas (1005 aminosyror), fragmentet HBsAg (192 aminosyror), varvid dessa fragment är separerade medelst en amínosyra prolin, som mot- svarar en del av "EcoRI linker" ingående i vektorn A1akHBs-1. 462 5230 18 C - FORFARANDE FOR FRAMSTÄLLNING AV EN IMMUNOGEN MOLEKYL UNDER ANVÄNDNING AV VEKTOR.

Av ovanstående framgår det att det sålunda är möjligt att framställa ett protein med lägre molekylvikt än för de ovan om- talade polypeptiderna I eller II, och med samma immunogena egen- skaper.

Resultaten visar att E. coli, eller vilken som helst annan lämplig mikroorganism, såsom en bakterie eller en kultur av eukaryotceller, kan infekteras med llakHBs-l och syntetisera ett protein med en molekylvikt av storleksordningen 138 000 samt uppvisande de antigena determínanterna för på samma gång HBsAg som 8-galaktosidas. Denna molekyl är representativ för de hybridpolypeptider som kan erhållas medelst det beskrivna förfarandet, i vilka HBsAg är bunden till en proteinbärare (härrörande från partiell eller total substitution av fragmen- tet B-galaktosidas), varvid dessa hybrider icke desto mindre uppvisar de antigena egenskaperna för HBsAg. Dessa nya moleky- ler är användbara för produktion av vacciner, vilka är aktiva mot viral hepatit B.

Såsom torde vara uppenbart, och såsom framgår av vad som redan har beskrivits ovan, är uppfinningen icke begränsad en- bart till de appliceringssätt och utföringsformer som har be- skrivits mera i detalj; den innefattar tvärt om alla tänkbara varianter därav.

Som bilaga till föreliggande beskrivning följer nu en bibliografi och speciellt de referenser som har omtalats in- om ramen för föreliggande uppfinning. 11 12 13 14 19 REFERENSER Blumberg, B. S. (1977) Science 121, 17-25 Dane D. S., Cameron C. H., and Brigss M. (1970) 695-698 Who Technical Report series, number 602 (1976) Summers J., O'Connel A., and Millman I. (1975) Proc.

Nat. Acad. Sci. USA 12, 4 597-4 601 Hruska J. F., Clayton D. A., Rubenstein J. L. R. and Robinson W. S. (1977) J. Virol. 21, 666-682 Landers T. A., Greenberg H. B. and Robinson W. S. (1977) J. viral. gg, 368-376 Charnay P., Pourcel C., Louise A., Fritsch A.

Tiollais P. (1979) Praa. Nat. Acaa. sei. usA, lg 2 222,2 226 ' Dreesman G. R., Hollinger F. B., Surians J. R., Fujioka R. B.. Brunschwig J. P. and Melnick J. L. (1972) J. Virol._¿Q, 469-476 Gerin J. L. (1974) in Mecanisms of virus disease Ed. W. S. Robinson, C. R. Fox pp 215-24 Menlo Park : w. A. Benjamin Lancet 1, and Dreesman G. R., Chairez R., Suarez M., Hollinger F. B.

Courtney R. J. and Melnick J. L. (1975) J. Virol. lá, 508-515 ' shih J. w. ànd Gerin J. L. 1 219-1 222 Peterson D. L., Roberts I. M. and Vyas G. N. (1977) Proc. Nat. Acad. Sci. USA li, 1 530-1 534 Peterson D. L., Chien D. Y., Vyas G. N., Nitecki D. and Bond H. (1978) in Viral Hepatitis, Ed. GJ Vyas.

S. Cohen and R. Schmid, The Franklin Institute Press, Philadelphia, S69-573 Fritsch A., Pourcel C., Charnay P. and Tiollais P. (1978) C. R. Acad. Sc. Paris gål, 1 453-1 456 Burrell C. J., Mackay P., Greenaway P. J., 21, (1977) J. Virol.

Hofschneider P. H. and Murray K. (1979) Nature 21_ 43-47 . 17 f 462 550 16 - Tiollais P., Perricaudet M., Pettersson U. and Philipson L. (1976) Gène 1, 49-63 Hérissé J., Courtois G., and Galibert F. (1978) Gene 1, 279-294 Kroeker W. D. and Laskowski M. S. R. (1977) Anal. 18 19 21 22 23 24 26 27 28 29 31 32 33 -Chow L. T., Gelinas R. E., Broker T. R., Biochem. 12, 63-72 I Maxam A. M. and Gilbert W. (1977) Proc. Nat. Acad. sei. usA 15, sso-564 Sanger F., Nicklen S. and Coulson A. R.

Nat. Acad. Sci. USA 14, 5 463-S 467 Maat J. and Smith A. J. W. (1978) Nucleic Acid. Res. sj 4 s3v_4 545 Berget S. M., Moore C. and Sharp P. A. (1977) Proc.

Nat. acad. Sci. USA 14; 3 171-3 175 (1977) Proc. and Roberts J. (1977). Cell 12, 1-8 . shiraishi H., xahama T., shirachi R. and Ishiaa N. (1977) J. Gen. Virol. åá, 207-210 Struck D. K., Lennarz W. J., and Brew K. (1978) J.

Biol. Chem. gâå, 5 786-5 794 Reddy V. B., Thimmappaya B., Dhar R., Subramanian K. N.

Zain B. S., Pan J., Celma C. L. and Weissman S. M. ' (1978) Science 220, 494-502 Fiers W., Contreras RJ, Hargeman G., Rogiers R., Van de Voorde A., Van Henverswyn H., Van Herreweghe J., Volchaerts G. and Ysebaert M. (1978) Nature 213, 113-117 Sanger F., Air M., Barrell B. G., Brown N.' L., Coulson A. R., Fïddes J. C.. Hutchison III C. A., Slocombe P. M. and Snith M.

U977)Nature gáå, 687-691 Barrell B. G., Shaw-D. C., Walker J. E Godson G. N. and Fiddes J. C. §, 63-67 I I Szmuness W., Am. J. Path. §¿, 629-649 (1975) Sninsky J. J., Siddiqui A.. Robinson W. S. and Cohen S. N.. Nature 212. 346-348 (1979) Valenzuela P. et al., Nature 282, 815-819 (1979) Charnay P. et al., Nucl. Acids Res. 1, 335-346 (1979) ., Northrop F. D., (1978) Biochem. Soc.

Trans. 34 36 37 38 39 40 41 42. 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 21 462 550 Fitoussi F., Tiollais P. 646-650 (1979) Galibert F., and Charnay P., Pasek M. et al., 575-579 (1979) Vyas G. N., Williams E. W., Klaus G. G. B.

J. Immunol. 1Q§, 1 114-1 118 (1972) B., Sanchez Y., Cabral G. and Melnick J. L., in Viral Hepatitis (Ed. vyas G. N.

Cohen S. N. and Schmid R.) Franklin Institute.

Philadelphia. (1978) Purcell R. H., and Gerin J. L.. 395-399 (1975) Hilleman M. R. et al., Am. J. Med. Sci. Zlg, 401-404 (1975) Maupas P., Coursaget P..'Goudeau A. and Drucker J., Lancef 1, 1 367-1 37o (1976) Emtage J. S. et al., Nature ggå, 171-174 (1980) Itakura K. et al.. Science 12§, 1 056-1 063 (1977) Goeddel D. V. et al., Prox. Nat. Acad. Sci. USA lå, Mandart E., Nature gål.

Nature 2§2. and Band. H.

Hollinger F. Dreesman G. R., 70, Am. J. Med. Sci. '1os-110 (1979) Pourcel C., Marchal C., Louise A., Fritsch A. and Tiollais P., Molec. Gén. Genet. Ålg, 161-169 (1979) Bolivar F. et al., Gene 2, 95-113 (1977) ¶ Fofiler A. V. and Zabin I., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 11, 1 507-1 510 (1977) Laemmli u. K., Nature ggl, eao-sas (1970) aurgess R. R., J. 9101. chem. g¿¿, 6 169-6 176 (1969) Bonner W. M. and Laskey R. A., Eur. J. Biochem. 16, 93-aa (1974) ' ' Laskey R. A. and Mills A. D., Eur. J. Biochem. âg, 335-341 (1975) ' Iwakura Y., 1to K. and Ishihama A., Molec. Gen. Genet. 133. 1-23 (1974) Talwai G. P., et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 13. 218-222 (1976)

Claims (5)

22 PÄ%Éš%KR§¿šÜ

1. Peptíd, k ä n n e t e c k n a d av att den består av sekvensen: alanin-g1utamín-glycin-treonín-serin, varvid alanin- änden är N-terminal och serinänden är C-terminal.

2. Peptid, k ä n n e t e c k n a d av att den består av sekvensen: treonin-a1anin-glutamin-g1ycin-treonin-serin, varvid treoninänden är N-terminal och serínänden är C-terminal.

3. Peptíd, k ä n n e t e c k n a d av att den består av sekvensen: treonin-treonín-alanin-g1utamin-g1ycin-treonín-serin, varvid treonínänden är N-terminal och serinänden är C-terminal.

4. Peptid, k ä n n e t e c k n a d av att den består av följande amínosyrasekvens eller en del därav: f .__-za seo Aee Aer Ter Tee Tce Tec ccr eer Tcc TcA AcA Acc Acc Ace eeA ccA sfinsfinrrmnmsrnræmerr Pno 390 420 Ace ecc Tee Ace TAc TeA TeA ccA err ccr Tee AeA TAc ATA eee Aee AcA Ace AcA Tee . Tec cec Acc Tec Are Aer Acr ecr cAA eeA Acc Ter ATe TAT ccc Tcc Ter Tec Ter Acc cvsmenmcrsrrarnmnmmernerrnmsanrærmrnosancrs crscrsnm Aso TTr eeA Aec cre ccr TTA Ace Tee AcA TAA eee TAe eer Aer Aee Acc ceA AAe ccr TTT AAA ccr Tce eAc eeA AAT Tec Acc Ter ATT ccc ATc ccA TcA Tcc Tee ecr TrceeA AAA Lrs Pno sfiRAsP e1YAsN crs Trmcrs 11:e PRo 11:e Pno SERSBRTRPATAPTTEGLY Lys AAG GNPAEC CHIAEC TTC CLATEG QMBTGG PHE LEU'H>GLU TRP vilken del av ovannämnda aminosyrasekvens innefattar åtminstone aminosyrasekvensen: a1anín-glutamin-glycin-treonín-serin.

5. Immunogen peptidsekvens, k ä n n e t e c k n a d av att den innefattar en sekvens av aminosyror ingående i sekvensen enligt något av kraven 1-4, vilken peptíd índucerar in vivo produktion av aktiva antikroppar med avseende på hepatit B-virus.