DESCRIPTION
L'invention est relative à un peptide immunogéne.
L'hépatite B est une maladie virale fréquente tout particuliérement en Afrique tropicale, en Asie du Sud-Est et en Extrême-Orient.
L'agent étiologique est un virus (HBV) ou particule de Dane, comprenant une enveloppe (antigène Australia ou antigène HBs), une capside (antigène HBc), une polymérase endogéne et une molécule d'ADN circulaire partiellement simple brin; le brin le plus long de cette molécule d'ADN comporte près de 3200 nucléotides [Summers J., O'Connell A. et Millman I. (1975), Proc. Nat. Acad.
Sci. USA 72, 4597-4601].
L'ADN polymérase endogène peut être utilisée pour réparer in vitro le brin le plus court (T. A. Landers, H. B. Greenbert et J. S. Robinson, J. Virol., 23, 1977, pp. 368-376).
L'analyse électrophorétique des protéines de l'enveloppe a montré la présence de 2 à 7 polypeptides dont les principaux sont appelés: polypeptide I et polypeptide II [Peterson D. L., Roberts
I. M. et Vyas G. N. (1977), Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74, 1530
1534, et Peterson D. L., Chien D. Y., Vyas G. N., Nitecki D. et
Bond H. (1978), in Viral Hepatitis, ed. G. Vyas, S. Cohen et
R. Schmid, The Franklin Institute Press, Philadelphie, 569-573].
Le polypeptide I a un poids moléculaire de 22000 à 26000 daltons. Le polypeptide II est glycosilé et a un poids moléculaire de 28000 à 30 000 daltons. La composition en acides aminés de ces deux polypeptides est très semblable; les séquences que forment, respectivement, leurs 15 premiers aminoacides (à partir de l'extrémité
N-terminale) et leurs 3 derniers aminoacides sont identiques, de sorte que l'hypothèse a été formulée que le polypeptide II pourrait ne différer du polypeptide I que par une glycosilation.
L'étude du virus est extrêmement difficile dans la mesure où l'on ne dispose d'aucun système de culture cellulaire permettant la propagation du virus. Cette difficulté a déjà en partie été contournée, plus particulièrement en ce qui concerne le sérotype ayw. L'ADN entier (génome) du virus a été identifié et cloné, notamment dans E.
coli, après son insertion préalable dans le site unique EcoRI d'un vecteur kgt.WES. kB, selon la technique par Fritsch A., Pourcel C.,
Charnay P. et Tiollais P. (1978), C. R. Acad. de Paris, 287, 14531456.
A ce jour, la séquence des polypeptides I et II eux-mêmes, la localisation dans l'ADN viral de la séquence codant ces peptides n'ont pas été réalisées.
L'invention a pour but l'obtention d'un peptide permettant, lorsqu'il est introduit dans l'organisme d'un hôte vivant, d'induire la fabrication par ce dernier d'anticorps susceptibles de protéger ultérieurement ce même hôte à l'égard du virus de l'hépatite virale B, notamment lorsque celui-ci se trouve à l'état virulent.
L'invention découle non seulement de l'analyse nucléotidique complète du génome de la particule de Dane, à laquelle ont procédé les inventeurs, mais de l'idée qu'ils ont eue, pour identifier le gène codant (ci-après dénommé gène S ) des susdits polypeptides, de rechercher, dans la structure nucléotidique complète ainsi préétablie du génome de la particule de Dane, celles des séquences de nucléotides susceptibles de coder les séquences peptidiques proximales et terminales connues de ces polypeptides.
On rappellera que Peterson et collaborateurs ont rapporté, notamment dans les articles dont les références ont été rappelées plus haut, que la séquence proximale (premier aminoacide N-terminal) des 15 premiers aminoacides s'analysait en principe comme suit: met glu asn ile thr ser gly phe leu gly pro leu leu val ser, et que la séquence terminale de ces mêmes polypeptides (dernier aminoacide Cterminal) était la suivante: val tyr ile.
La figure 1 est une carte schématique du génome de la particule de Dane. Celui-ci comporte deux brins b5 et b2, le plus court d'entre eux (b2) étant normalement dépourvu de la partie représentée par une ligne en trait interrompu dans le dessin.
Il est connu que cet ADN ne comporte qu'un seul site EcoRi.
La flèche fi donne le sens de la numérotation des nucléotides dont est composé le brin le plus long bl, et la flèche f2 donne le sens de la transcription de l'ADN du virus, notamment par la machinerie cellulaire des cellules envahies par le virus de l'hépatite B en ce qui concerne l'expression du gène S.
Le site EcoRI peut donc être numéroté 0 ou, comme on l'a maintenant déterminé de façon plus exacte pour celui des virus de l'hépatite B appartenant au sérotype ayw, 3 182.
Le cercle en trait plein intérieur e donne l'échelle en % de longueur de l'ADN et permet de préciser les positions de certaines de ses parties.
Les nombres 3', 5' et 5', 3' à la partie inférieure de la carte visent les extrémités terminales porteuses de mêmes nombres dans les représentations conventionnelles des extrémités des chaînes d'acide nucléique.
Il a été montré que le gène S constituait essentiellement le fragment du brin le plus long b1 situé entre les positions 73,6 et 95,1 de la carte schématique de la figure 1. Les abréviations Start et Stop représentent les points d'initiation et d'arrêt de la transcription du gène S .
Les figures 2A, 2B, 2C sont représentatives de la partie terminale du susdit génome, comprise notamment entre les positions 60,4 et 100 (en % de longueur de l'ADN). Chacune des lettres figurant dans la figure 2 correspond de façon conventionnelle à l'un des 4 nucléotides de base de l'ADN:
A: adénine
G: guanine
T: thymine
C: cytosine
Les lignes inférieures, dans chaque paire de lignes dont sont constituées les figures 2A? 2B, 2C, correspondent à l'acide nucléique correspondent à la chaîne nucléotidique b2.
La technique d'analyse utilisée pour établir la carte du génome plus détaillée dont témoignent les figures 2A, 2B, 2C sera brièvement rappelée ci-après.
La caractérisation de la séquence nucléotidique du gène S , dont les extrémités proximalep S et terminale t S sont indiquées dans les figures 2A, 2B, 2C, résulte de la constatation que: - les 14 premiers triplets (dans le sens de la lecture f2) à partir du nucléotide numéroté 3 030 vis-à-vis de l'extrémité terminale EcoRi sont respectivement capables de coder les 14 premiers aminoacides de la séquence proximale des 15 premiers aminoacides des susdits polypeptides; - les 4 derniers triplets GTA TAC ATT TAA lus sur la chaîne complémentaire b2 à la chaîne transcrite b1 correspondent respectivement aux 3 aminoacides terminaux des susdits polypeptides et à un codon d'arrêt;
; - cette séquence de nucléotides (678 nucléotides) ne comprend aucun codon d'arrêt, du moins lorsque l'on adopte le cadre de lecture impliquant que le premier triplet lu sur l'ADN par la machinerie cellulaire soit AUG (correspondant sur le brin complémentaire àATG); - la traduction complète de l'information génétique commençant avec le codon initial ATG conduit à un polypeptide théorique de 226 aminoacides, ayant un poids moléculaire de 25422 daltons.
La structure nucléotidique du gène S ainsi que la chaîne polypeptidique résultant de la traduction du gène S sont représentées aux figures 3A, 3B, 3C.
Ces valeurs sont tout à fait conformes aux données analytiques qui résultent de la mobilité électrophorétique du polypeptide I sur des gels de polyacrylamide qui ont déjà été décrits par les.auteurs précédents (références 9-12 selon la bibliographie figurant à la fin de la description de la présente demande de brevet).
La différence observée au niveau du 15' aminoacide de la séquence peptidique proximale du polypeptide I: leucine selon les cartes des figures 2A, 2B, 2C et 3A, 3B, 3C mentionnées ci-dessus, et non sérine selon les constatations des susdits auteurs, peut peut-être être attribuée au fait que ces auteurs ont travaillé avec un variant génétique différent de celui ayant fait l'objet de la présente étude. On notera que la différence peut d'ailleurs être rapportée à la substitution d'un seul nucléotide dans le triplet concerné TTA dans le gène S particulier représenté dans les cartes des figures 2A, 2B, 2C et 3A, 3B, 3C, au lieu de TCA , I'un des triplets susceptibles d'être traduits en sérine.
L'invention concerne un peptide contenant la totalité ou une partie de la séquence peptidique telle qu'elle est représentée à la figure 6.
De préférence, le peptide comporte les séquences peptidiques suivantes:
alanine - glutamine - glycine -thréonine - sérine
thréonine alanine - glutamine - glycine - thréonine sérine
thréonine - thréonine - alanine - glutamine - glycine - thréonine sérine
Dans le premier peptide sus-indiqué, I'extrémité alanine est
N-terminale et l'extrémité sérine est C-terminale.
Dans les deuxième et troisième peptides sus-indiqués, I'extrémité thréonine est N-terminale et l'extrémité sérine est C-terminale.
A titre d'exemple, on peut notamment préparer le pentapeptide en partant de la sérine C-terminale à laquelle on accroche la thréonine par la méthode de Castro décrite dans Tetrahedron Letters, 1975, N" 14, pp. 1219-1222. Ensuite, les acides aminés glycine, glutamine, alanine sont rajoutés par la méthode dite de l'anhydride mixte répétée (méthode rema) décrite par Beierman dans Chemistry and Biology ofPeptides, Ed. J. Meienhofer, Ann Arbor Science
Publ., Ann Arb. Mich. 351 (1972).
Les produits résultant de la fixation du pentapeptide sur une molécule porteuse plus grosse sont notamment de type polypeptide ou protéine, et on peut préparer des compositions contenant ce pentapeptide en produits de fixation, notamment en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, et plus particulièrement des vaccins contre l'hépatite B. Ces véhicules pharmaceutiques sont appropriés, de façon en soi classique, au mode d'administration choisi, notamment par voie orale, parentérale, rectale, ou par nébulisation sur des muqueuses, notamment nasales.
L'hexapeptide et le polypeptide à 7 acides aminés peuvent être synthétisés par des techniques de synthèse peptidique classiques.
Ces peptides sont tenus pour être le site antigénique des polypeptides de plus grande taille dont question plus haut et responsables du pouvoir vaccinant de l'enveloppe virale (Journal of Biol. Stand.
1976, 4, 295-304, Rao et Vyas, Biochemical Characterization of
Hepatitis B Surface Antigen in Relation to Serologic Activity ).
Les fragments d'ADN susceptibles de coder la production de tels pentapeptide, hexapeptide et polypeptide à 7 acides aminés sont: pour le pentapeptide, notamment du polynucléotide de formule:
5' GCT CAA GGA ACC TCT 3'
3' GGA GTT CCT TGG AGA 5' - pour l'hexapeptide, notamment du polynucléotide de formule:
5' ACT GCT CAA GGA ACC TCT 3'
3' TGA CGA GTT CCT TGG AGA 5' - pour le polypeptide à 7 acides aminés du polynucléotide de formule:
5' ACT ACT GCT CAA GGA ACC TCT 3'
3' TGA TGA CGA GTT CCT TGG AGA 5' ou, dans chacun des trois cas, du polynucléotide complémentaire relatif aux trois polynucléotides respectifs précédents, ou encore tout polynucléotide dans lequel chacun des triplets peut être remplacé par tout triplet analogue capable de coder la production du même aminoacide.
D'autres caractéristiques préférées de l'invention apparaîtront encore au cours de la description d'exemples préférés, en combinaison avec les dessins dans lesquels: - les figures la et 1h illustrent schématiquement les étapes successives de la fabrication d'un vecteur du type plasmide incorporant un fragment de HBV DNA, - les figures 2a à 2c illustrent schématiquement les structures initiale du vecteur utilisé (figure 2a), finale du vecteur modifié obtenu (figure 2b) et celle de la protéine hybride résultant de l'expression de ce vecteur modifié dans E. coli (figure 2c).
A) Séquences nucléotidîques
Les produits et méthodes utilisés - Les enzymes et les produits chimiques utilisés
Les enzymes de restriction utilisées: BamHI, HhaI, HincII,
HaeIII, XbaI, MboI, HinfI, HpaII, XhoI, sont celles fabriquées par
Biolabs. On a utilisé l'ADN-polymérase I de Boehringer. La phosphatase alcaline bactérienne et la polynucléotide-kinase ont été fournies par P. L. Biochemicals. Les agents chimiques étaient les sui vants:
Diméthylsulfate (Aldrich)
Hydrazine (Eastman Kodak)
Acrylamide et bisacrylamide (2 fois cristallisés - Serva)
Didéoxy-nucléotide-triphosphates et
déoxynucléotide-triphosphates (P. L.
Biochemicals)
Pipéridine (Merck) redistillée sous vide - Préparation d'ADNHBV
Le génome HBV entier (sous-type ayw) a été cloné dans E. coli en mettant enjeu le site unique de restriction EcoRI du vecteur kgt.WES. XB (14). L'ADN cloné est dénommé ci-après Eco HBV
DNA .
Le bactériophage recombinant a été amplifié en boîte de Pétri sur agar et on a extrait l'ADN recherché de façon en soi connue. Après digestion de l'ADN par l'enzyme de restriction EcoRI, on a purifié la séquence Eco HBV DNA par ultracentrifugation, dans un gradient de sucrose, selon la technique décrite dans les références bibliographiques (16, 17).
- Préparation de fragments d'ADN marqués 5t32p
10 à 20 picomoles d'Eco HBV DNA ont été complètement hydrolysés par les différentes enzymes de restriction, dans les conditions recommandées par le fabricant. Les fragments d'ADN ont été déphosphorylés par la phosphatase alcaline, celle-ci ayant ensuite été inactivée par un traitement alcalin. L'ADN a alors été précipité à l'éthanol, selon la technique décrite dans l'article (18). Après redissolution dans un tampon à base de spermidine, les ADN ont été marqués à leurs extrémités 5' avec un ATP (h 3ZP) (3 000 Ci/mM fabriqué par New England Nuclear) et avec de la polynucléotidekinase (selon la technique visée à l'article (19).
Les fragments d'ADN de restriction ont été séparés par l'électro phorése sur gel de polyacrylamide, puis élués. Les extrémités marquées ont fait l'objet de ségrégations par électrophorèse sur gel de polyacrylamide de façon connue en soi, après restriction avec une autre enzyme ou par dénaturation des fragments d'ADN du genre en question.
- Détevmination de la structure des séquences de nucléotide de l'ADN
La structure primaire des fragments d'ADN à double brin ou simple brin a été déterminée essentiellement selon la technique décrite par Maxam et Gilbert (19). L'on a aussi eu recours à la méthode des inhibiteurs terminaux de chaînes décrites par Sanger et al. (20) et adaptée par Maat et Smith (21), pour ce qui est des fragments à double brin marqués à l'une de leurs extrémités 5'.
Les produits de réaction chimique et enzymatique ont été analysés par électrophorèse dans des gels de séquence d'acrylamide à 8, 16 ou 25%, de 1 mm d'épaisseur.
Les techniques et les résultats de l'analyse
Afin de déterminer si le génome HBV est capable de coder les polypeptides I et II, tous les fragments HaeIII (sites de restriction
HaeIII du génome HBV représentés sur la figure 1 par de petites flèches) ont été marqués à leurs extrémités 5'. Des parties substantielles de leurs structures primaires ont été déterminées par la méthode de Maxam et Gilbert. Les séquences de nucléotides susceptibles de coder les séquences d'aminoacide proximales et terminales des polypeptides I et II ont été localisées dans les fragments HaeIII
E et HaeIII F, préalablement localisés sur la carte de restriction du génome HBV selon la technique décrite dans la référence (17).
Ce sont ces séquences de nucléotides qui ont été considérées comme consistant en les extrémités du gène S occupant elles-mêmes les positions 73,6 et 95,1 vis-à-vis du site de restriction EcoRI (figure 1) pour les raisons déjà indiquées.
La séquence de nucléotides entre ces deux positions a été analysée en ayant recours aux techniques chimiques connues, notamment par la méthode de dégradation chimique à l'hydrazinediméthylsulfate et la méthode des terminaisons de chaînes. On a eu recours, parmi les réactions chimiques variées proposées par Maxam et
Gilbert. à une dépurination partielle par l'acide formique et au clivage par la pipéridine, méthodes qui donnent des bandes d'intensité égale sur les autoradiogrammes pour les fragments terminés par une guanine et une adénine.
On a également utilisé les réactions à l'hydrazine suivies d'un clivage à la pipéridine, pour obtenir des bandes d'égale intensité, pour les nucléotides cytosine et thymidine: le fractionnement électrophorétique des produits de ces deux réactions donne pour toutes les bases une tache dans l'une ou l'autre des colonnes de gel utilisées. Cette procédure facilite la lecture de l'autoradiogramme du gel. La réaction à l'hydrazine en présence de chlorure de sodium spécifique pour la cytosine permet de distinguer ce nucléotide de la thymidine, et la réaction au diméthylsulfate suivie d'un clivage par la pipéridine spécifique de la guanine permet de distinguer ce dernier nucléotide de l'adénine.
De façon à s'assurer du degré de précision le plus grand possible, des séquences distinctes de nucléotides formant différents fragments se chevauchant mutuellement ont été produites par hydrolyse d'Eco
HBV DNA par diverses enzymes de restriction: BamHI, HinfI,
HpaII, HaeIII et HincII.
De cette façon, I'analyse de chacun des sites de restriction utilisés comme points de départ des premiers fragments étudiés a été confirmée par l'analyse des fragments distincts dans lesquels les sites de restriction des premiers fragments se trouvaient compris entre les nouvelles extrémités de ces fragments distincts.
Le gène S représenté aux figures 3A, 3B, 3C, qui commence par le codon d'initiation ATG, comprend 227 triplets, dont un codon d'arrêt TAA. Les 3 codons correspondant aux 3 acides aminés de l'extrémité carboxy terminale du polypeptide correspondant sont situés dans le même cadre de lecture, immédiatement avant le codon d'arrêt TAA. L'un des deux autres cadres de lecture (respectivement décalés vis-à-vis du précédent de 1 et 2 nucléotides) est également dépourvu de codon d'arrêt, mais code une protéine tout à fait différente des polypeptides I et II susmentionnés. Le troisième cadre de lecture comprend 10 codons d'arrêt (5 TAG, 4 TGA, 1 TAA). Sur l'autre brin d'ADN, les trois cadres de lecture se trouvent respectivement fermés par 11, 11 et 6 codons d'arrêt distribués le long de la séquence d'ADN.
Comme on l'a déjà indiqué plus haut, la traduction complète de l'information génétique débutant par le codon d'initiation ATG conduit à un polypeptide théorique de 226 aminoacides correspondant à un poids moléculaire de 25422 daltons.
Il est intéressant de souligner que la séquence nucléotidique correspondant au gène S devrait normalement être lue entièrement au cours de la traduction.
Les différents fragments qui ont été définis plus haut peuvent être obtenus à partir de la séquence d'ADN dite Eco HBV DNA, en ayant recours aux enzymes de restriction correspondantes et aux techniques de fractionnement connues des fragments d'ADN, notamment sur gel de polyacrylamide, et en mettant à profit leurs migrations sur des distances qui sont fonction de leurs poids moléculaires. Ainsi peut-on par exemple obtenir le fragment dont l'une des extrémités est délimitée par un site EcoRI et l'autre par un site Avalîl en opérant une restriction Eco HBV DNA par l'enzyme AvaIII, le fragment recherché consistant en le plus petit fragment obtenu (un seul site AvaIII dans Eco HBV DNA).
Le fragment délimité par des extrémités opposées EcoRI et HhaI est obtenu par hydrolyse d'Eco HBV DNA par EcoRI d'abord, puis par hydrolyse partielle par l'enzyme de restriction HhaI. L'on récupère alors parmi les produits de restriction celui qui contient le site
AvaIII.
Ces techniques de restriction n'ont évidemment été proposées qu'à titre d'exemple, étant bien entendu que le spécialiste est à même de déterminer les ordres de traitement par les enzymes de restriction pour isoler à partir notamment d'Eco HBV DNA les fragments ayant les extrémités de restriction utiles.
A toutes fins utiles, on rappellera que ces opérations de restriction peuvent être réalisées au sein d'un tampon Tris 10 mM; pH 7,8; MgCl2 6 mM; ss-mercaptoéthanol 6 mM, le même milieu contenant en outre et de préférence 50 mM de NaCI lorsque EcoRI est utilisé.
Les fragments d'ADN sus-décrits peuvent être utilisés à titre de sonde permettant le diagnostic de la présence, dans un sérum, de particules de Dane ou particules dérivées de la précédente, porteuses d'un ADN susceptible de coder une protéine immunogène caractéristique de l'hépatite B.
L'ADN peut être incorporé à un vecteur permettant, à condition que l'incorporation ait été réalisée en phase, l'expression de cet
ADN dans une bactérie, ou autre micro-organisme, ou dans des cellules eucaryotes.
B) Vecteurs contenant une séquence nucléotitique de l'antigène HBs
Construction d'un bactériophage recombinant hlac HBs-l
Les produits au niveau des différentes étapes de cette construction sont visés dans les figures la et lh. Ils sont également visés par les numéros la à lh.
On a indiqué dans la figure la les positions du gène S et de certains sites d'enzyme de restriction.
Après traitement de DNA + HBV avec l'enzyme de restriction
HhaI, on sépare un fragment d'ADN (lb) contenant 1084 paires de bases, et plus particulièrement la totalité du gène S , par électrophorèse sur gel d'agarose et électro-élution (figure lb). On prépare, à partir de ce sous-fragment, traité au préalable par l'endonuclèase S1, un sous-fragment (le) (figure lc), résultant de l'allongement du sousfragment (lb) à ses extrémités, par des éléments d'ADN dénommés EcoRI linkers de formule: 5' GGAATTCC
CCTTAAGG 3'
Le fragment obtenu est, après formation des extrémités cohésives
EcoRI, cloné dans le plasmide pBR322.
Le plasmide obtenu dénommé ci-après pBRHBs (figure ld) ne contient qu'un seul site de restriction XbaI situé à proximité de la tête du gène S .
Par digestion du plasmide recombinant pBRHBs avec un mélange d'enzymes EcoRI et XbaI, on produit un fragment d'ADN comprenant approximativement 980 paires de bases et comportant la majeure partie du gène S (figure le). Ce fragment est séparé et purifié par électrophorèse sur un gel d'agarose. Le fragment obtenu est à nouveau traité avec l'endonucléase Si, puis à nouveau pourvu d'extrémités EcoRI au moyen des susdits EcorI linkers , puis soumis à un traitement avec l'endonucléase EcoRI pour reformer les extrémités cohésives correspondantes.
Le fragment de la figure le qui comprend environ 980 paires de bases est alors inséré par fusion in vitro dans le site EcoRI du plasmide pBR322 pour former le plasmide pXbaHBs (figure lof). Ce plasmide est cloné de façon usuelle comme le plasmide pBR322.
Plusieurs clones ont été obtenus.
On extrait et purifie, après traitement avec EcoRI des ADN de trois de ces clones, pXbaHfls-l, pXbaHBs-2, pXbaHBs-3 (figure lg), les fragments appelés ci-après fragments HBs
(figure lh).
Les séquences nucléotidiques des extrémités des susdits fragments (normalement obtenues à l'intérieur du gène S ) sont déterminées en ayant recours à la procédure décrite par Maxam et
Gilbert [Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 74, 560-564 (1977)]. Ces déterminations ont révélé que les séquences des nucléotides des extrémités terminales correspondant au gène S n'étaient pas identiques dans les trois clones (figure 1 g); les différences sont vraisemblablement dues à des hétérogénéités produites au cours de la digestion par l'endonucléase S1.
Les deux fragments provenant de pXbaHBs-l et pXbaBHs-2
sont insérés par fusion in vitro dans le génome du bactériophage
Bplac 5-1 (21), lequel n'a qu'un seul site EcoRI situé à proximité de l'extrémité du gène lac Z. Du fait du cadre de lecture du gène lac Z,
tel qu'il peut être déduit de la séquence d'aminoacides de la -galac-
tosidase (23), on constate - et l'expérience le confirmera - que l'in
sertion du fragment HBs de pXbaHBs-l dans le site EcoRI du gène
lac Z de Xplac 5-1 doit conduire à la conservation de la phase de
lecture adéquate du gène S . Au contraire, l'insertion du fragment
HBs de pXbaHBs-2 devait se révéler ne pas pouvoir être insérée
dans le précédent vecteur avec conservation du cadre de lecture ap
proprié.
Il a néanmoins été utilisé comme témoin dans des expérien
ces postérieures.
Ces opérations ont été réalisées en ayant recours à des techniques
connues. En particulier les fragments HBs de pXbaHBs-l, pXbaHBs-2 ont été insérés au moyen d'une ligase dans l'ADN de
Bplac 5-1 qui avaient au préalable été clivés par EcoRI. Les mélan
ges des fragments d'ADN obtenus ont été ensuite utilisés pour trans
fecter la souche C600RecBC rk-mk- d'E. coli. Les clones de bacté
riophage devenus lac- du fait de l'insertion des fragments HBs dans
les sites EcoRI du gène lacZ sont amplifiés et purifiés selon la méthode décrite en (21).
Les ADN des différents bactériophages ont été extraits et les
orientations des fragments d'ADN insérés déterminés par analyse
électrophorétique de leurs fragments de restriction BamHI. L'on peut ainsi déterminer que deux phages appelés BlacHBs-l et
BlacHBs-2 correspondant au plasmide pXbaHBs-l et pXbaHBs-2
contenaient un fragment HBs correctement orienté.
La figure 2a est une carte schématique du vecteur Bplac 5-1 avant
sa modification par le fragment HBs-l issu du pXbaHBs-l.
La figure 2c est une carte schématique d'une partie de ce même
vecteur montrant la modification introduite dans son gène Z par in
sertion dans son site EcoRI du susdit fragment HBs-l.
La figure 2c schématise les structures du polypeptide hybride
obtenu comme résultat de l'expression du vecteur modifié de la
figure 2b.
L'expression a été obtenue par transfection d'une souche de bac
térie d'E. coti, notamment d'une souche HfrMacX74.
Des souches d'E. coli, notamment une souche d'E. coli
HfrAlacX74, ont été transformées par plac 5-1, BlacHBs-l et
BlacHBs-2 respectivement. Après culture, lescellules sont lysées et
les lysats obtenus analysés par électrophorèse sur gel de polyacryl
amide SDS (24), et les protéines sont détectées par exploration au bleu de coomassie.
On constate la présence d'une bande plus intense parmi les produits d'expression de Xplac 5-1 au niveau de la position correspondant, pour un témoin, à celle de la p-galactosidase (poids moléculaire de 116 248) et d'une bande distincte parmi les produits d'expression de BlacHBs-l (non présent parmi les produits d'expression de klacHBs-2) correspondant à une nouvelle protéine ayant un poids moléculaire de l'ordre de 135000-141 000.
Les protéines synthétisées par les bactéries transfectées tant par klacHBs-l que par Bplac 5-1 sont marquées par la (35S) méthionine.
La mise en présence de ces protéines avec un sérum anti-HBsAg et la réalisation d'un autoradiogramme du gel de polyacrylamide SDS révèlent la présence parmi les produits d'expression du seul BlacHBs-l d'une bande à laquelle ne correspond pas de bande équivalente parmi les produits d'expression des autres vecteurs. Cette bande disparaît de façon spécifique lorsque l'immunopréeipitation est réalisée en présence de HBsAg non marqué. On observe encore la même bande parmi les produits d'expression klacHBs-l, lorsque l'immunoprécipitation est réalisée avec un antisérum à l'égard de la p-galacto- sidase.
La structure présumée de la partie de protéine hybride obtenue, au niveau de la fusion entre le gène lacZ et le fragment HBs-l, résulte de la figure 2c qui fait apparaître le fragment B-gal , correspondant à la p-galactosidase (1005 acides aminés), le fragment
HBsAg (192 acides aminés), ces fragments étant séparés par un acide aminé prolyne, correspondant à une partie d' EcoRI linker contenu dans le vecteur hiacHBs-l.
C) Procédé de fabrication d'une molécule immunogène codée par le vecteur
L'invention peut par conséquent permettre la production d'une protéine de masse moléculaire plus faible que les polypeptides I et II susvisés, douée des mêmes propriétés immunogènes.
Les résultats démontrent qu'E. coli, ou tout autre micro-organisme approprié, tel qu'un bactérie ou une culture de cellule eucaryote, peut être infecté par le BlacHBs-l et synthétiser une protéine ayant un poids moléculaire de l'ordre de 138000 et possédant les déterminants antigéniques à la fois de HBsAg et de la p-galactosidase.
Cette molécule est représentative des polypeptides hybrides qui peuvent être obtenus par le procédé selon l'invention, dans lequel
HBsAg est relié à une protéine-support (résultant de la substitution partielle ou totale du fragment p-galactosidase), ces hybrides possédant néanmoins les propriétés antigéniques de HBsAg. Ces nouvelles molécules sont utiles pour la production de vaccins actifs contre l'hépatite virable B.
En annexe de cette description figure la bibliographie, et en particulier les références qui ont été citées dans le cadre de la présente description.
RÉFÉRENCES
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