NL8020315A - Nucleotidereeks, die het antigeen van het oppervlak van hepatitis b virus codeert, vector, die genoemde nucleotidereeks bevat, werkwijze voor het verkrijgen daarvan en het verkregen antigeen. - Google Patents

Description

< 8020315 y -1- | [ i

: I

: I

! ! ! ! ' i i ! i i : ! |

Nucleotidereeks , die het antigeen van het | oppervlak van hepatitis B virus codeert, vector, die genoemde nucleotidereeks bevat, j werkwijze voor het verkrijgen daarvan en | het verkregen antigeen.

| De uitvinding heeft betrekking op een nucleïnezuur, dat | een nucleotidereeks omvat, die een immunogene peptidereeks kan | coderen, die overeenkomt met het antigeen van het oppervlak van ; i hepatitis B virus en op de verkregen polyneptiden en pentiden.

! ! | 5 Zij heeft ook betrekking op een werkwijze voor het ver- | krijgen van een dergelijk nucleïnezuur. j ! Hepatitis B is een vaak voorkomende virusziekte, vooral | | in tropisch Afrika, Zuid-Oost Azië en het Verre Oosten.

Het etiologisch agens is een virus (HBV) of deeltje van ! 10 Dane, dat een omhulling (Australië antigeen of antigeen HBs), i I | een capside (antigeen HBc), een endogeen polymerase en een cirkelvormig ADn molecuul, dat gedeeltelijk eenvoudig vertakt is: omvat; de langste vertakking van dit ADn molecuul bevat ongeveer: 3200 nucleotiden (SUMMERS J., O'CONNELL A. en MILLMAN I. (1975) j : 15 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 72, h 597-1* 601).

Het endogene ADN polymerase kan worden gebruikt voor het ! in vitro herstellen van de kortste keten (T.A, LANDERS, H.B. GREENBERT en J.S. ROBINSON, J. VIROL., 23, 1977, blz. 368-376). ! Elektroforetische analyse van de proteïnen van de om-20 hulling heeft de aanwezigheid aangetoond van 2 tot 7 polypeptiden,

waarvan de voornaamste heten: polypeptide I en polypeptide II (PETERSON D.L., ROBERTS I.M. en VYAS G.N. (1977) Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 7U 1 530-1 53^, en PETERSON D.L., CHIEN D.Y., VYAS

G.N., NITECKI D. en BOND H. (1978) In Viral Hepatitis, ed. G.VYAS, 25 S. COHEN en R. SCHMID, The Franklin Institute Press,Philadelphia, 8020315 ·< ( -2- ! 569-573). 1 I Polypeptide I heeft een molecuulgewicht van 22000 tot ! ! 26000 dalton. Polypeptide II is geglycoliseerd en heeft een j molecuulgewicht van 28000 tot 30000 dalton. De samenstelling in i 5 aminozuren van deze twee polypeptiden is zeer gelijkend; de reeksen, die respectievelijk hun 15 eerste aminozuren (te j | beginnen bij het N-eindstandige uiteinde) hun 3 laatste amino- j zuren vormen zijn identiek, zodat men de hypothese heeft opge-j worpen, dat polypeptide II slechts door een glycolisering van : 10 polypeptide I zou verschillen.

j ; Het onderzoek van het virus is uitermate moeilijk, omdat j ! men over geen enkel celcultuursysteem beschikt, dat voortplanting van het virus toestaat. Deze moeilijkheid is reeds gedeeltelijk: onderscheiden, meer in het bijzonder voor wat betreft serotype j 15 ayw. Het gehele ADN (genoom) van het virus is geïdentificeerd en; gedoneerd, met name in E.coli, na voorafgaande inplanting j op de unieke plek EcoRi van een vector Agt.WES. Ab volgens de methode van FRITSCH A., POURCEL C., CHARNAY P. en TIOLLAIS P. j ) ! I (1978) C.R. Acad. de Paris, 287, 1 1+53-1 U56). j 20 Tot op heden zijn de volgordereeks van polypeptide I en

II zelf en de localisatie in het virele ADN van de reeks, die I

j I

deze peptiden codeert, niet gerealiseerd. i

De uitvinding heeft ten doel een ADN reeks te verkrijgen, j die veel kleiner is dan vireel ADN zelf, die de reeks bevat, j | 25 die de peptidereeks met immunogene eigenschappen kan coderen, die, wanneer zij in het organisme van een levende gastheer is ingebracht, de fabricage door deze laatste kan inleiden van antilicharaen, die uiteindelijk deze gastheer kunnen beschermen tegen het virus van hepatitis B, met name wanneer dit zich in 30 virulente staat bevindt.

De uitvinding vloeit niet alleen voort uit de volledige nucleotide analyse van het genoom van het deeltje van Dane, waaraan de uitvinders gewerkt hebben, maar aan het idee dat zij hebben gehad tot identificatie van het coderende geen (hierna 35 "geen S" genoemd) van genoemde polypeptiden en tot het keuren in de aldus vooropgezette volledige nucleotidestruktuur van het 8020315 i -3- genoom van het deeltje van Dane naar die nucleotidereeksen, die de bekende beginstandige en eindstandige peptidereeksen van ; deze polypeptiden kunnen coderen. j

Men herinnert zich, dat PETERSON en medewerkers hebben 5 gerapporteerd, met name in de artikelen, die hierboven zijn aangehaald, dat de beginstandige reeks (eerste N-eindstandige ; | aminozuur) van de 15 eerste aminozuren in beginsel volgens | analyse er als volgt uitziet: met glu asn ile thr ser gly phe | leu gly pro leu leü val ser en de eindstandige reeks van deze ! 10 zelfde polypeptiden (laatste C-eindstandige aminozuur) als j ! volgt is; ! | val tyr ile.

I Fig. 1 is een schematisch kaart van het genoom van het I deeltje van Dane. Deze omvat twee takken b1 en bg; de kortste j j 15 daarvan (bg) is normaliter verstoken van het gedeelte, dat door j I . i een stippellijn in de tekening wordt weergegeven. j ! Het is bekend, dat ADN slechts een enkele plek Eco^ heeft.

j ] | Pijl f^ geeft de richting aan van de nummering van de nucleotiden, waaruit de langste tak b^ is samengesteld en pijl 20 fg 'geeft de richting aan, waarin het ADN van het virus wordt j overgeschreven, met name door de cellulaire machinerie van de door het hepatitis B virus binnengedrongen cellen voor wat betreft de uitdrukking van het geen S.

De plek EcoFI kan dus worden genummerd met 0, of, zoals 25 men nu exacter heeft vastgesteld voor die van hepatitis B virussen behorend tot het serotype ayw, 3 182.

| De in een getrokken lijn weergegeven binnencirkel e geeft de schaal in % van de lengte van ADN en maakt het mogelijk de plaatsen van sommige van zijn onderdelen te preciseren.

30 De nummers 3', 51 en 5', 3' onder aan de kaart tonen de uiteinden met dezelfde nummers in de conventionele voorstel- i lingen van de ketenuiteinden van nucleïnezuur.

Volgens de uitvinding is aangetoond, dat "geen S" in vrezen het fragment van de langste tak b^ vormt, die ligt tussen 35 de posities 73,6 en 95,1 op de schematische kaart van fig. 1.

De afkortingen "Start" en "Stop" geven de begin- en eindpunten 8020315 -1+- van het overschrijven van "geen S". |

De fig. 2A, 2B en 2C zijn voorstellingen van het eind- standige gedeelte van genoemd genoom, met name gelegen tussen de positie 6o,U en 100 (in % lengte van ADN). Elk van de j 5 in de fig, 2 voorkomende letters correspondeert op conventionele' I wijze met een der vier basisnucleotiden van ADN: ; ' I A : Adenine G : Guanine T : Thymine 10 C : Cytosine j

; I

De onderste lijnen van elk paar lijnen, waaruit de fig. 2A|, j 2B en 2C zijn samengesteld komen overeen met het nucleïnezuur, j j dat overeenkomt met nucleotideketen hg. | i Op de analysemethode, die gebruikt is voor het opstel- j j 15 len van de meer gedetailleerde kaart, waarvan de fig. 2A, | | 2B en 2C getuigen, zal hieronder in het kort worden terugge- ! komen.

I i | De kenmerking van de nucleotidereeks van het "geen S", i | zoals deze in het kader van de onderhavige uitvinding is voorge-i I 20 steld en waarvan het beginstandige uiteinde p "S" en het eind- j standige uiteinde t_ "S" zijn aangegeven in de fig. 2A, 2B en 2C,; leidt tot de vaststelling, dat: ! de 11+ eerste tripletten (in de leesrichting fg) uitgaande' van het nucleotide genummerd 3 030 ten opzichte van het eind-25 standige uiteinde EcoRI, respectievelijk de “\k eerste aminozuren van de beginstandige reeks van de 15 eerste aminozuren van ge- ; noemde polypeptiden kunnen coderen, de vier laatste tripletten GTA TAC ATT TAA gelezen over de complementaire keten bg aan de overgeschreven keten b^ 30 respectievelijk overeenkomend met de drie eindstandige amino zuren van genoemde polypeptiden en met een stopcode, deze nucleotidenreeks (678 nucleotiden) geen enkele stopcode bevat, wanneer men tenminste het leesprogramma neemt, dat inhoudt, dat het eerste triplet "gelezen" over ADN door de 35 cellulaire machinerie AUG is (overeenkomend met de complemen taire keten aan ATG) en 8020315 * -5- I de volledige vertaling van de genetische informatie, | ; | te beginnen met de begincode ATG, leidt tot een theoretisch j polypeptide van 226 aminozuren met een molecuulgewicht van 25^22 dalton.

i I 5 De nucleotidestruktuur van het "geen S" evenals de polypeptideketen, die resulteert uit de vertaling van het I "geen S" zijn weergegeven in de fig. 3A, 3B en 3C.

I Deze betekenissen zijn in volledige overeenstemming met ! de analytische gegevens, die het resultaat zijn van de elek- 10 troforetische beweeglijkheid van polypeptide I over poly- | ! acrylamidegelen, die reeds zijn beschreven door eerder genoemde ; | auteurs (referenties 9-12 volgens de bibliografie aan het I einde van de beschrijving van de onderhavige octrooiaanvrage).

I ; j Het verschil, dat is waargenomen ter hoogte van het 15 15de aminozuur van de beginstandige peptidereeks van polypeptide I: leucine volgens de kaarten van de fig. 2A, 2B, 2C en 3A, 3B, 3C, die boven zijn genoemd en niet serine volgens de vaststellingen van genoemde auteurs, kan misschien worden toegeschreven aan het feit, dat deze auteurs hebben gewerkt met een andere 20 genetische variant dan die, die het onderwerp is geweest van het onderhavige onderzoek. Opgemerkt wordt, dat het verschil bovendien kan worden toegeschreven aan de substitutie van één enkel nucleotide in het betrokken triplet "TTA" in het "geen S", dat I ; | in het bijzonder wordt weergegeven in de kaarten van de fig.

25 2A, 2B, 2C en 3A, 3B, 3C in plaats van "TCA", waarbij één van de tripletten geschikt is om in serine te worden vertaald.

De uitvinding heeft dus in het bijzonder betrekking op nucleinezuurfragmenten, die kunnen worden uitgesneden uit het ADN van het deeltje van Dane, welke fragmenten in het bijzonder 30 daardoor worden gekenmerkt, dat zij het gedeelte van "geen S" bevatten, dat het proteïnegedeelte van de virusomhulling kan coderen, wat verantwoordelijk is voor de immunologische eigenschappen van hepatiet B virus.

Aldus heeft de uitvinding betrekking op een nuclei'nezuur, 35 dat ten hoogste in de orde van 1000 - 1100 nucleotiden bevat en in het bijzonder daardoor wordt gekenmerkt, dat het een immunoge- 8020315 -6-

V

ne peptidereeks kan coderen, terwijl het zelf in vivo de pro- j ductie kan opwekken van antilicharaen, die actief zijn tegen ; heptatiet B virus, welke peptidereeks in wezen de struktuur ; bevat, die wordt voorgesteld met fig. 3A, 3B, 3C of elke 5 peptidereeks met equivalente immunogene eigenschappen.

De uitvinding heeft ook betrekking op een vector gezien de uitdrukking van genoemde nucleotidereeks in een micro- \ organisme of in eucaryotescellen op voorwaarde dat de genetische1 ! : | fusie heeft plaatsgehad onder behoud van de lektuurfase van ! 10 het "geen S". ; ί ... . i | De volgens de uitvinding gebruikte nucleotidereeksen | vertonen ten opzichte van elkaar een variabiliteit, die bij hun : expressie leidt tot de vorming van verschillende determinanten volgens het subtype van hepatiet B virus (subtype d, w, y en r j 15 van groep a).

Voor een van de peptidereeksen weergegeven in fig. 3A, 3B: en 3C ziet men, dat het eerste aminozuur van genoemde reeks, | methionine, N-eindstandig is en dat het aminozuur van het j | tegenovergestelde uiteinde: isoleucine, C-eindstandig is. j | 20 De uitvinding heeft ook nog in het bijzonder betrekking op de nucleotidereeks, die wordt voorgesteld met fig. kA en ^B, die de peptidereeks codeert, die wordt weergegeven door fig. 5 ! ; of elke analoge peptidereeks met equivalente immunogene eigen schappen.

25 Het spreekt vanzelf dat onder de bovengenoemde "equiva- j lente peptidereeks" elke peptidereeks moet worden verstaan, waar- i in bepaalde gedeelten niet rigoreus identiek kunnen zijn met ! overeenkomstige gedeelten van de peptidereeks, die wordt voorge-! | steld in de fig. 3A, 3B, 3C en 5; deze variaties kunnen locale i 30 mutaties bevatten, die het algemene immunogene karakter van de proteïne niet nadelig beïnvloeden of struktuurmodificaties ver-; I tonen, die behoren bij de verschillende serotypen, waaronder de ' proteïnen van het soort in kwestie zich kunnen voordoen (met name serotypen adw, adr en ayr).

35 De uitvinding heeft in het bijzonder betrekking op de ; nucleotidereeks, die de peptidereeks bevat zoals die is weer- 8020315

V

-7- gegeven in fig. 6 of elke analoge peptidereeks met equivalente | I immunogene eigenschappen. ' I De uitvinding heeft ook in het bijzonder betrekking op | de volgende peptidereeksen: | 5 Alanine-Glutamine-Glycine-Threonine-Serine I Threonine-Alanine-Glutamine-Glycine-Threonine-Serine I Threonine-Threonine-Alanine-Glutamine-Glycine-Threonine-Serine

In het eerste hierboven weergegeven peptide is het alanine-' ! uiteinde N-eindstandig en het serine-uiteinde C-eindstandig.

i .

i 10 In het tweede en het derde hierboven weergegeven peptide is het threonine-uiteinde W-eindstandig en het serine-uiteinde | C-eindstandig.

| Bij wijze van voorbeeld kan men met name het penta- ! ! peptide bereiden uit C-eindstandig serine, waaraan men de ! 15 threonine verankert volgens de methode van Castro beschreven in Tetrahedron Letters, 1975, no. 1^, blz. 1219-1222. Daarna worden de aminozuren glycine, glutamine en alanine toegevoegd i e volgens de zogenaamde herhaalde gemengd anhydndemethode ; (rema-methode) beschreven door Beierman in Chemistry and Biology ' 20 of Peptides, Ed. J.Meienhofer, Ann. Arbour Science Publ., Ann.

Arb. Mich. 351 (1972).

De uitvinding heeft ook betrekking op de produkten die het resultaat zijn van de bevestiging van het pentapeptide aan ! een groter dragermolecuul, met name van het polypeptide- of 25 proteïnetype, de preparaten, die dit peptide in fixatieprodukten | bevatten, met name in combinatie met een farmaceutisch aanvaard- ! bare drager en vooral vaccins tegen hepatitis B. Deze farma ceutische dragers op op zichzelf klassieke wijze aangepast aan de gekozen toedieningswijze, met name langs orale, parenterale : 30 of rectale weg of door verstuiving op de slijmvliezen, met name nasaal.

Het hexapeptide en het polypeptide met 7 aminozuren kunnen synthetisch worden bereid volgens de klassieke peptidesynthese-methoden.

35 Deze peptiden moeten volgens de uitvinding de antigene- tische plek zijn van de polypeptiden van grotere omvang, waarvan 802 0 3 1 5 -8- ! "boven wordt gesproken en die verantwoordelijk zijn voor het i ; | vaccinerend vermogen van de virusomhulling (Journal of Biol. j ! Stand. 1976, U, 295-301+, RAO en VYAS "Biochemical j

Characterization of Hepatitis B Surface Antigen in Relation 5 to Serologic Activity").

De uitvinding heeft ook nog "betrekking op ADN fragmenten, j I die de produktie kunnen coderen van dergelijk pentapeptide, j hexapeptide en polypeptide met 7 aminozuren.

Het gaat: 10 bij het pentapeptide met name om polynucleotide met de formule: 5' GCT CAA GGA ACC TCT 3' 3' GGA GTT CCT TGG AGA 5' | bij het hexapeptide met name om polynucleotide met de j | 15 formule: j | 5' ACT GCT CAA GGA ACC TCT 3' j 3' TGA CGA GTT CCT TGG AGA 5' j en bij het polypeptide met 7 aminozuren om het poly- j nucleotide met de formule: j j 20 5' ACT ACT GCT CAA GGA ACC TCT 3'

3' TGA TGA CGA GTT CCT TGG AGA 5' I

of in elk van de drie gevallen om polynucleotide, dat complemen- j tair is ten opzichte van de drie respectievelijke eerder ge- j noemde polynucleotiden, of ook nog om elk polynucleotide, waarin: : 25 elk van de drie tripletten kan zijn vervangen door elk analoog | triplet, dat de produktie van hetzelfde aminozuur kan coderen.

Het aminozuur van de uitvinding kan nog daardoor worden gekenmerkt, dat het tenminste één van de twee onderling complementaire takken draagt van een ADN reeks, zoals weergegeven in 30 fig. bA en 1+B (waarin eveneens de nummers voorkomen, die overeenkomen met de posities van de eerste nucleotiden van elk van de achtereenvolgende fragmenten van 10 nucleotiden, weergegeven ten opzichte van de positie EcoRI, die niet in de figuur is weergegeven: het spreekt vanzelf, dat deze nummers geen ver-35 band houden met de karakterisering van de nucleotidereeks van het soort in kwestie). Dit ADN fragment wordt afgebakend door 8020315 -9- ; twee plekken Hindi. _ ......j

Men begrijpt, dat deze nucleotidereeks overeenkomt met de i genetische informatie, waarvan de vertaling leidt tot de in j fig. 5 weergegeven peptidereeks. j 5 De uitvinding heeft natuurlijk ook betrekking op de \ j equivalenten nucleotidereeksen met enkele tak of dubbele tak, j waarvan met name de tak, die de struktuur heeft, die voortvloeit ! j uit de opeenvolging van de onderste lijnen van fig. kA en UB, j het ADN met overeenkomstige dubbele tak, of de overeenkomstige | 10 ARN boodschappers, met name diegene, die wordt voorgesteld door de complementaire aaneenschakelingen van nucleotiden, die worden gevormd door de onderste lijnen van de lijnenparen van fig. UA en UB (richting van de pijl fp).

|

Eveneens vallen onder de uitvinding de nucleotideketens, j i 15 die zich van de voorafgaande onderscheiden door bepaalde triplet-! ten of kleine tripletreeksen voor zover deze nucleotidereeksen j geschikt blijven voor het coderen van een polypeptide, dat de I kenmerkende immunogene werking van hepatitis B virus behoudt. j In het algemeen gaat het om nucleotideketens, die in voorkomend j 20 geval, na denaturering van ADN met dubbele tak ter bereiding van j de overeenkomstige nucleïnezuren met enkele tak, geschikt blijven ; tot het zich kruisen over tenminste ongeveer 90$ van hun lengte met éên van de takken van ADN van fig. UA en UB.

Nucleïnezuren van de uitvinding, die de voorkeur ver-: 25 dienen, zijn nog diegene, die kunnen worden uitgesneden uit het ADN van hepatitis virus en die, wanneer zij een dubbele tak hebben worden gekenmerkt door de aanwezigheid van een van hun einden van een uiteinde Hindi, Hhal, Aval of EcoBI en aan hun andere einde van een uiteinde AvalII, Hindi of Hhal.

30 De posities van deze verschillende uiteinden ten opzichte van de plek EcoRI zijn schema.tisch weergegeven in de fig. 2A, 2B en 2C.

Het nucleïnezuur van de uitvinding is bedoeld voor opneming in een vector, die het kan uitdrukken in een bacterie en 35 in de eucaryotescellen, met name gezien de produktie van een proteïne of een peptide, dat in het organisme van een levende 8020315 -ΙΟΙ gastheer de produktie kan inleiden van aktieve antilichamen I . . . „ .1 I tegen het virus van hepatitis B. Het proteïne of het peptide, j dat resulteert van de vertaling van de nucleotidereeks volgens j de uitvinding kan worden gebruikt als vaccineermiddel of als | 5 middel ten dienste van de diagnose. i | Het nucleïnezuur van de uitvinding kan ook worden ge bruikt als sonde voor het vaststellen van het al of niet aanwezig zijn in bloedmonsters of proefserum van deeltjes van j

Dane, antigeen HBs of fragmenten daarvan, enz. (volgens de j 10 klassieke methode van ADN-ADN hybridisatie).

I Andere eigenschappen van de uitvinding blijken nog uit I

onderstaande korte beschrijving van de werkwijzen ter analyse, identificatie en verkrijging van de ADN fragmenten volgens de | ' i uitvinding. Daarbij wordt natuurlijk verwezen naar de tekeningen; 15 waarvan de figuren reeds in het voorafgaande in aanmerking zijn j genomen. De cijfers of getallen tussen haakjes komen overeen met de referenties van de bibliografie, die aan de onderhavige beschrijving is toegevoegd.

De uitvinding heeft ook betrekking op bijzondere vectoren; | 20 die de boven beschreven nucleotidereeksen kunnen uitdrukken, ! met name in de vorm van een proteïnehydride, waarin een proteïnefragment met de immunologische eigenschappen van HBsAg een dragermolecuul kruist, dat aan het geheel immunogene of immunoreactieve eigenschappen geeft, die de produktie kunnen ! 25 inleiden van beschermende antilichamen ten opzichte van de virus infectie in het organisme van de gastheer, waarin dit proteïne I vooraf is ingevoerd.

De uitvinding heeft in het bijzonder betrekking op een vector-faag of plasmide- - die tenminste een deel lactose-30 operon bevat, in het bijzonder de promotor en het geen Z van

deze operon, welke vector wordt gekenmerkt doordat zij gemodificeerd is door de inpassing, in fase, op een geschikte plek van geen Z, bijvoorbeeld de plek Eco^ï van een willekeurig fragment van ADN van het hoofdbrevet, met name één, die het merendeel van 35 het "geen S" bevat. Zij heeft ook betrekking op diegene van de gemodificeerde vectoren, waarin tenminste een deel van het ADN

8020315 -11- ! fragment, dat het grootste deel van dey# -galactosidase codeert, j is vervangen door een ADN fragment, dat elk ander niet immunogeeri dragermolecuul kan coderen, of waarvan de eventuele immunologische eigenschappen, indien aanwezig, niet storen met die van het i 5 peptidegedeelte met de immunologische eigenschappen van HBsAg bijvoorbeeld essentieel die, die zich uitstrekt in de leesrichtirig i vanuit zijn plek Hhal.

De uitvinding heeft ook in het bijzonder betrekking op een proteïnehydride, dat daardoor wordt gekenmerkt, dat het een 10 polypeptidereeks bevat met specifieke immunologische eigen schappen van HBsAg, dat gekruist is met een polypeptidereeks, die voor het merendeel bestaat uit -galactosidase, dat de rol : van protei'nedrager speelt.

De uitvinding strekt zich niet alleen uit over dit bij-15 zondere hydridemolecuul, waarvan de essentiële rol is het vormen; van een proteinemodel, dat is opgebouwd volgens de methode van j I . ! het genetisch vernuft en kenmerkende immunogene en immunoreactleve eigenschappen heeft van het antigeen HBsAg maar ook over elk : ander proteïnehydride, waarin hety^-galactosidasegedeelte I 20 geheel of gedeeltelijk is vervangen door een ander niet immunogeen | dragermolecuul, of waarvan de eventuele immunologische eigen- j schappen, indien aanwezig, niet storen met die van het peptide- ; ' gedeelte met de immunologische eigenschappen van HBsAg.

; Andere kenmerken van de uitvinding blijken nog in de loop | 25 van de beschrijving van de voorkeursvoorbeelden in combinatie met de tekeningen, waarvan fig. 1a en 1h schematisch de achtereenvolgende trappen weergeven van de vervaardiging van een vector van het plasmide- : type, die een fragment van HBV DNA bevat en | 30 fig. 2a tot 2c schematisch de beginstructuren weergeven van de gebruikte vector (fig. 2a) de eindstructuur weergeven van de verkregen gemodificeerde vector (fig. 2b) en die van het proteïnehydride tengevolge van de uitdrukking van deze gemodificeerde vector in E.coli (fig. 2c).

35 A. NUCLEOTIDEREÉKSEN

De produkten en gebruikte methoden.

8020315 -12- ί De gebruikte enzymen en chemische produkten.

| De gebruikte restrictie enzymen: BamHI, Hhal, Hindi, ; | HaelII, Xbal, Mbol, Hinfl, Hpall, Xhol, zijn die, gefabriceerd I door BIOLABS. Men heeft ADN-polymerase I van BOEHRINGER ge- | j 5 bruikt. De alkalische bacteriële fosfatase en de polynucleotide-j I kinase zijn geleverd door P.L.BIOCHEMICALS. De chemicaliën waren j de volgende: ! . Dimethylsulfaat (ALDRICH), j | . Hydrazine (EASTMAN KODAK), j 10 · Acrylamide en bisacrylamide (2 maal gekristalliseerd - j i SERVA), . Dideoxynucleotide trifosfaten en I deoxynucleotide trifosfaten (P.L. BIOCHEMICALS), i . Piperidine (MERCK) herdestilleerd onder vacuum.

15 Bereiding va.n ADN HBV, | | \ Het gehele genoom HBV (subtype ayw) is geclodeerd in j E.coli onder gebruikmaking van de unieke restrictieplek EcoRI | van de vector Agt.WES. AB (1^). Het gedoneerde ADN wordt hier-j | na "Eco HBV DNA" genoemd. !

20 De recombinerende bacteriofaag is in een Petrischaal I

versterkt op Agar en men heeft het gezochte ADN op bekende wijze ; geëxtraheerd. Na vertering van het ADN door het restrictie- j | enzyme EcoRI heeft men de reeks Eco HBV DNA gezuiverd door ultracentrifugering in een saccharosegradiënt volgens de methode,1 25 beschreven in de bibliografische referenties (16, 17).

Bereiding van ADN fragmenten, gemerkt 5' P

10 tot 20 picomolen van Eco HBV DNA zijn onder de door de fabrikant aanbevolen omstandigheden volledig gehydrolyseerd door j de verschillende restrictieenzymen. De ADN fragmenten zijn ge- 30 . . ...

defosforyleerd door alkalische fosfatase, die daarna geinakti- veerd is door een alkalische behandeling. Het ADN is daarna geprecipiteerd met ethanol, volgens de methode, beschreven in artikel (18). Na heroplossing in een tampon op basis van spermidine, zijn de ADN aan hun uiteinden 5' gemerkt met een 35 ATP {> 32p1 (3000 Ci/mM, bereid door NEW ENGLAND NUCLEAR) en met 8020315 -13- j polynucleotide-kinase (volgens de methode van artikel (19)· j ! De ADN fragmenten van de restrictie zi.jn door elektro- j | forese over polyacrylamidegel gescheiden en daarna geëlueerd.

| Men onderwerpt de gemerkte uiteinden aan segregatie door ; 5 elektroforese over polyacrylamidegel op op zichzelf bekende wijze na restrictie met een ander enzyme of door denaturering van de J j ADN fragmenten van het soort in kwestie. !

Bepaling van de structuur van de ADN nucleotidereeksen. \

De primaire structuur van de ADN fragmenten met dubbele ! 10 tak of enkele tap is in wezen bepaald volgens de methode, be- j ! schreven door MAXAM en GILBERT (19). Men heeft ook zijn toe- i ♦ . . · | vlucht genomen tot de methode van de eindstandige inhibitors van ; | de ketens beschreven door SANGER et al. (20) en aangepast door j | MAAT en SMITH (21) voor wat betreft de fragmenten met dubbele j. 15 tak, die aan één van hun uiteinden 5’ gemerkt zijn. i De produkten van chemische en enzymatische reactie zijn geanalyseerd door elektroforese in gelen van acrylamide-reeks van 8,16 of 25% van 1 mm dikte.

Methoden en resultaten van de analyse.

20 Na te hebben bepaald of het genoom HBV de polypeptiden i i I en II kan coderen, zijn alle fragmenten HaelII (restrictie- j plekken HaelII van het genoom HBV, weergegeven in fig. 1 met kleine pijltjes) gemerkt aan hun uiteinden 5'· Aanzienlijke gedeelten van hun primaire structuren zijn bepaald volgens de 25 methode van MAXAM en GILBERT. De nucleotidereeksen, die de beginstandige en eindstandige aminozuurreeksen van polypeptiden I en II kunnen coderen zijn gelocaliseerd in de fragmenten HaelII E en HaelII F, vooraf gelocaliseerd op de kaart van de restrictie van het genoom HBV (volgens de methode, beschreven in 30 referentie (17)). Bit zijn die nucleotidereeksen, die beschouwd worden aan de uiteinden te bestaan uit "geen S" en zelf de posities 73,6 en 95>1 innemen ten opzichte van de restrictie-plek EcoFI (fig. 1) om reeds genoemde redenen.

De nucleotidereeks tussen deze twee posities is geanaly-35 seerd onder gebruikmaking van bekende chemische methoden, met name de methode van de chemische afbraak met hydrazinedimethyl- 8 02 0 3 1 5 -.11*- « sulfaat en de methode van de beëindiging van ketens. Men heeft onder de verschillende door MAXAM en GILBERT voorgestelde I chemische reacties zijn toevlucht gezocht tot een partiële i | verontreiniging door mierenzuur en tot de splijting door I 5 piperidine, welke methoden gelijke intensiteitsbanden geven op j j de autoradiogrammen voor de fragmenten, die op een guanine en een: ' ... . .1 j adenine eindigen. Men heeft ook gebruik gemaakt van reacties met | hydrazine, gevolgd door een splitsing met piperidine, ten einde ! gelijke intensiteitsbanden te verkrijgen, voor de nucleotiden ! 10 cytosine en thymidine: de elektroforetische fractionering van de j J produkten van deze twee reacties geeft voor alle basen een vlek in de ene of de andere van de gebruikte gelkolommen. Deze proce- : dure vergemakkelijkt de lezing van het autoradiogram van de gel. i De hydrazinereactie in aanwezigheid van natriumchloride, die I 15 voor cytosine specifiek is, maakt het mogelijk dit nucleotide | te onderscheiden van thymidine en de reactie met dimethylsulfaat,: ! gevolgd door een splitsing met piperidine specifiek voor guanine j maakt het mogelijk dit laatste nucleotide te onderscheiden van adenine.

20 Ten einde zich te verzekeren van de grootst mogelijke precisiegraad, zijn er onderscheidenlijke nucleotidereeksen, die ' ! verschillende fragmenten vormen, die onderling op elkaar passen, j geproduceerd door hydrolyse van Eco HBV DNA door verschillende | restrictieenzymen: 25 Bamïïi, Hinfl, Hpall, HaelII en Hindi.

! Op deze wijze is de analyse van elke restrictieplek, die i als uitgangspunt van de eerste onderzochte fragmenten is ge nomen, bevestigd door analyse van de onderscheidenlijke fragmenten, waarin de restrictieplekken van de eerste fragmenten 30 ingesloten liggen tussen de nieuwe uiteinden van deze onderscheidenlijke fragmenten.

Het "geen S" weergegeven in fig. 3A, 3B en 3C, dat begint door begincode ATG, omvat 227 tripletten, waaronder een stopcode TAA. De drie codes, die corresponderen met de drie aminozuren aan 35 het uiteinde van de carboxyeinden van het overeenkomstige polypeptide zijn gesitueerd in hetzelfde leeskader, onmiddellijk voor 8020315 -15- I de stopcode TAA. Een van de twee andere leeskaders (die ten j

' opzichte van het voorafgaande respectievelijk zijn ontdaan van I

! 1 en 2 nucleotiden) mist ook een stoncode, maar codeert een i I e * # j | volkomen ander proteïne dan bovengenoemde polypeptiden I en II. j | 5 Het derde leeskader omvat 10 stopcodes (5 TAG, b TGA, 1 TAA). Op j i de andere ADN tak bevinden de drie leeskaders zich respectievelijk : " j afgesloten door 11, 11 en 6 stopcodes, die over de lengte van de !

; I

i ADN reeks verspreid liggen. ! ; i \ Zoals boven reeds is aangegeven, leidt de volledige ver- j 10 taling van de genetische informatie, die begint bij de begin- j j code ATG tot een theoretisch polypeptide van 226 aminozuren, | | overeenkomend met een molecuulgewicht van 25^22 dalton,

i I

I Het is interessant er de nadruk op te vestigen, dat de ! nucleotidereeks, die overeenkomt met "geen S" normaliter in de | 15 loop van de vertaling geheel moet worden gelezen.

Gedeelten van de uitvinding zijn eveneens nucleotide- * ! ketens van het boven beschreven "geen S" type, dat kleine aanvul-1 reeksen draagt, die tot een honderdtal nucleotiden kunnen bevatten of die daarentegen van verstoken kunnen zijn zonder dat 20 dit veel verandert aan de overeenkomstige genetische informatie j (22, 23).

De verschillende fragmenten van de uitvinding die boven | gedefinieerd worden, kunnen worden verkregen uitgaande van de ADN reeks, genaamd Eco HBV DNA, wanneer men zijn toevlucht neemt 25 tot de overeenkomstige restrictieenzymen en tot de bekende fractioneermethoden van ADN fragmenten, met name over polyacryl-amidegel onder gebruikmaking van hun migraties over de afstanden, die een functie zijn van hun molecuulgewicht. Ook kan men bijvoorbeeld het fragment verkrijgen, waarvan een van de uiteinden wordt 30 afgebakend door een plek EcoHI en het andere door een plek AvalII onder bewerkstelliging van een restrictie Eco HBV DNA door het enzyme AvalII waarbij het gezochte fragment bestaat uit het kleinste'verkregen fragment (een enkele plek AvalII in Eco HBV DNA).

35 Het fragment, dat wordt afgebakend door de tegenover elkaar gelegen uiteinden EcoBI en Hhal wordt verkregen door hydrolyse van 8020315 ~16~ j Eco HBV DNA, eerst met Eco^1 en daarna door partiële hydrolyse j met het restrictieenzyme Hhal. Men wint dan uit de restrictie- j ^ produkten datgene dat de plek Avalïl.

, Deze restrictiemethoden zijn natuurlijk maar als voorbeeld ! 5 gegeven want de specialist bepaalt immers zelf de orde van j behandeling met restrictieenzymen voor het vinnen van, met name ! j I uit Eco HBV DNA, de fragmenten met de nuttige restrictieuiteinden|.

! j I Voor alle nuttige doeleinden kunnen deze restrictie- ! ! bewerkingen worden uitgevoerd in een tampon Tris 10 mM ; pH 7>8 ; 10 MgClg 6 mM ; β -mercapto-ethanol 6 mM, welk milieu bovendien j bij voorkeur 50 mM NaCl bevat, wanneer men Eco^I gebruikt. j

Zoals reeds gezegd heeft de uitvinding betrekking op het j gebruik van de beschreven ADN fragmenten als sonde bij de j diagnose op de aanwezigheid in een serum van deeltjes van Dane j I 15 of deeltjes afgeleid van de voorafgaande, die dragers zijn van j j een ADN, dat een voor hepatitis B kenmerkend immunogeen proteïne j kan coderen.

Het ADN van de uitvinding kan ook worden opgenomen in een vector waarmee men, mits de opneming in fase is geschied, dit 20 ADN kan uitdrukken in een bacterie of ander microorganisme of in eucaryotescellen.

B. Vectoren, die een nucleotidereeks bevatten van het i antigeen HBs.

Constructie van een recombinerende bacteriofaag lac HBs-1' I 25 De produkten op het pijl van de verschillende trappen van deze constructie worden weergegeven in de fig. 1a en 1h. En zijn ; eveneens aangeduid met de nummers 1a tot 1h.

In de fig. 1a zijn de posities van het "geen S" en bepaalde' vlekken van restrictieenzyme aangegeven.

30 Na behandeling van DNA. + HBV met het restrictieenzyme Hhal scheidt men een ADN fragment (1b) af, dat 108h paren basen en in het bijzonder de totaliteit van het "geen S" bevat, door elektro-forese over agarosegel en elektro-eluering (fig. 1b). Men bereidt uit dit sub-fragment, dat vooraf behandeld is met het endonuclease ; 35 S1, een subfragment (1c) (fig. 1c), hetgeen leidt tot verlenging van het subfragment (1b) aan zijn uiteinden met de ADN elementen, 8020315 -17- ! genaamd "EcoRI linkers" met de formule:

; 5' GGMTTCC

i I CCTTAAGG 3' ! Het verkregen fragment wordt na vorming van de cohesieve | 5 uiteinden EcoRI, gedoneerd in het plasmide pBR322. ! | Het verkregen plasmide, hierna pBRHBs genoemd (fig. 1d), j ! bevat slechts een enkele restrictieplek Xbal, gesitueerd nabij j j de kop van het "geen S". ! | Door vertering van het recombinerende plasmide pBRHBs met

| io een mengsel van de enzymen EcoRI en xbal produceert men een ADN

fragment, dat ongeveer 9Ö0 paren basen bevat en het merendeel ; | draagt van het "geen S" (fig. 1e). Dit fragment wordt gewonnen \ en gezuiverd door elektroforese over een agarosegel. Het ver- i i kregen fragment wordt opnieuw behandeld met de endonuclease S1 i 15 en daarna opnieuw voorzien van de uiteinden EcoRI met behulp | van genoemde "EcoRI linkers" en daarna onderworpen aan een be-

j handeling met de endonuclease EcoRI ter hervorming van de over- I

| eenkomstige cohesieve uiteinden. Het fragment van fig. 1e, dat | ongeveer 980 paren basen bevat wordt dan door fusie in vitro ; : 20 ingezet in de plek EcoRI van het plasmide pBR322 ter vorming van het plasmide pXbaHBs (fig. 1f). Dit plasmide wordt op de ge- ! | bruikelijke wijze gedoneerd als het plasmide pBR322.

' Er zijn een aantal clonen verkregen.

Men extraheert en zuivert na behandeling met EcoRI 25 ADN van drie van deze clonen, pXbaHBs-1, pXbaHBs-2, pXbaHBs-3 | (fig· 1g), welke fragmenten hierna "fragmenten HBs" (fig. 1h) zullen worden genoemd.

De nucleotidereeksen van de uiteinden van genoemde fragmenten (normaliter verkregen binnen het "geen S") worden bepaald ' 30 met behulp van de procedure, beschreven door MAXAM et GILBERT (Proc. Nat. Acad. Sci. USA 7~U» 5βθ-5Sb (1977). Deze bepalingen ! hebben onthuld, dat de nucleotidereeksen van de eindstandige uiteinden, die overeenkomen met het "geen S" in de drie clonen niet identiek zijn (fig. 1g) en de verschillen zijn waarschijnlijk 35 te wijten aan heterogeniteiten, die geproduceerd zijn in de loop van de vertering door het endonuclease S1.

8 02 0 3 1 5 -18-

De twee fragmenten, die zijn voortgekomen uit pXbaHBs-1 en pXbaBHs-2 worden door fusie in vitro ingezet in het genoom van de bacteriofaag i\plac 5-1 (21), die slechts een plek EcoHI heeft;, die gesitueerd is in de nabijheid van het uiteinde van het geen 5 lac Z. Vanwege het leeskader van het geen lac Z, zoals dit kan ! | worden afgeleid uit de aminozuurreeks van β -galactosidase (23) stelt men vast - en de ervaring bevestigt dit -, dat de inzetting ; van het fragment HBs van pXbaHBs-1 op de plek EcoBÏ van het l geen lac Z van Aplac 5-1 moet leiden tot het behoud van de 10 adekwate leesfase van het "geen S". Daarentegen moet uit de inplaatsing van het fragment HBs van pXbaHBs-2 blijken, dat het : niet in de voorafgaande vector kan worden ingepast onder behoud ! van het geschikte leeskader. Het is niettemin als blanco gebruikt | bij de latere proeven.

j 15 Deze bewerkingen zijn uitgevoerd met behulp van bekende ; methoden. In het bijzonder de "fragmenten HBs" van pXbaHBs-1 j en pXbaHBs-2 zijn met een ligase ingezet in het ADN van Xplac 5-1 nadat zij vooraf waren gesplitst met EcoRI. De mengsels van de verkregen ADN fragmenten zijn daarna gebruikt voor transfectié

I 20 van de stam CÊOORecBC rk mk van E.coli. De clonen van de I

| ————— : i bacteriofaag, die lac Z waren geworden vanwege de inzetting van ' | de fragmenten HBs in de plekken EcoRI van het geen lacZ zijn versterkt en gezuiverd volgens de methode beschreven in (21).

De ADN van de verschillende bacteriofagen zijn geëxtraheerd 25 en de oriëntatie van de ingezette ADN fragmenten is bepaald door| elektrolytische analyse van hun restrictiefragmenten BamHI. Men : kan ook bepalen dat de twee fagen AlacHBs-1 en XlacHBs-2, die overeenkomen met het plasmide pXbaHBs-1 en pXbaHBs-2 een juist : georiënteerd fragment HBs bevatten.

30 De fig. 2a is een schematische kaart van de vector

Aplac 5-1 voor zijn modificatie met het fragment HBs-1 afgegeven door pXbaHBs-1.

De fig. 2c is een schematische kaart van een deel van deze I zelfde vector, die de modificatie toont, die is ingevoerd in zijn 35 geen Z door inzetting op zijn plek EcoRI van genoemd fragment HBs-1.

8020315 -19- j ....... ..... De fig. '2c geeft......een ' scEëmatÏsc'h'e "vöor¥b^ ......."~j

S I

i structuren van het polypeptidehydride, dat is verkregen als I

| resultaat van de uitdrukking van de gemodificeerde vector van

i fig. 2b. I

i 5 De uitdrukking is verkregen door transfectie van een ; I stam van de bacterie E.coli, met name van een stam HfrAlacXT^·· | Stammen van E.coli, met name een stam van E.coli j HfrAlacXT^ zijn getransformeerd met respectievelijk plac 5-1, | λ lacHBs-1 en AlacHBs-2. Na de kweek zijn de cellen gelyseerd i 10 en zijn de verkregen lysaten geanalyseerd door elektroforese | over polyacrylamidegel SDS 82^) en de proteïnen zijn bepaald door i j kleuring met coomassieblauw. Men constateert de aanwezigheid i van een sterkere band onder de uitdrukkingsprodukten van λ plac 5-1 ter hoogte van de positie, die bij een blanco 15 overeenkomt met die van β -galactosidase (molecuulgewicht 116 2k8) en een onderscheidelijke band onder de uitdrukkingsprodukten van AlacHBs-1 (niet aanwezig onder de uitdrukkings- i ~ ; produkten van AlacHBs-2) die overeenkomt met een nieuw proteïne met een molecuulgewicht in de orde van 135 000 - 20 1U1 000.

! De proteïnen, die gesynthetiseerd zijn door de getransfec- j | teerde bacteriën, zowel door AlacHBs-1 als door Aplac 5-1 | zijn gemerkt met ( S) methionine. Het aanwezig stellen van deze ! | proteïnen met een anti-HBsAg serum en de realisatie van een I 25 autoradiogram van de polyacrylamidegel SDS onthullende aanwezigheid onder de uitdrukkingsprodukten van AlacHBs-1 alleen van een band, waarmee de equivalente band onder de uitdrukkingsprodukten van de andere vectoren niet overeenkomt. Deze band verdwijnt op specifieke wijze, wanneer de immunoprecipitatie : 30 wordt gerealiseerd in aanwezigheid van niet gemerkt HBsAg. Men ziet nog dezelfde band onder de uitdrukkingsprodukten van λlacHBs-1, wanneer de immunoprecipitatie wordt gerealiseerd met een antiserum ten opzichte van β -galactosidase.

De vermoedelijke structuur van het verkregen proteïne ; 35 hybridegedeelte ter hoogte van de fusie tussen het geen lacZ

en het fragment HBs-1 blijkt uit fig. 2c, waarin het fragment 8020315 -20- ί "/3"S3·!" > dat met β -galactosidase overeenkomt (1005 aminozuren)! | en het fragment HBsAg (192 aminozuren) verschijnen, welke fragmenten worden gescheiden door een prolyne aminozuur, dat gedeeltelijk overeenkomt met"EcoRI linker", aanwezig in de 5 vector λlacHBs-1.

C. WERKWIJZE VOOR HET BEREIDEN VAN EEN IMMUNOGEEN MOLECUUL1 j ONDER GEBRUIKMAKING VAN DE VECTOR VOLGENS DE UITVINDING.

i

De uitvinding staat dientengevolge de produktie toe van I : j een proteïne met kleinere moleculaire massa dan bovengenoemde ! 10 polypeptiden I en II en met dezelfde immunogene eigenschappen.

De resultaten tonen aan, dat E.coli of elk ander geschikt microorganisme, bijvoorbeeld een bacterie of een cultuur \ i van eucaryotescellen kan worden geïnfecteerd door AlacHBs-1 i j en een proteïne kan synthetiseren met een molecuulgewicht in de j 15 orde van 13Ö000 en met tegelijkertijd de antigene determinanten ; van HBsAg en van/3-galactosidase. Dit molecuul is representatief | voor de hybride polypeptiden, die volgens de werkwijze van de uitvinding kunnen worden verkregen en waarin HBsAg is bevestigd j aan een proteïnedrager ( verkregen door gedeeltelijke of totale j

i I

20 substitutie van het-galactosidase fragment), maar deze hybri-: i den hebben niettemin de antigene eigenschappen van HBsAg. Deze j ! nieuwe moleculen kunnen worden gebruikt voor de produktie van j

aktieve vaccins tegen virale hepatitis Β. I

Zoals vanzelf spreekt en zoals bovendien uit het vooraf- j i 25 gaande blijkt, is de onderhavige uitvinding geenszins beperkt tot die toepassings- en uitvoeringsvormen, die in het bijzonder ; worden besproken; zij omvat daarentegen alle varianten. i

Thans volgt de bibliografie en in het bijzonder de | | referenties, die in het kader van de voorafgaande beschrijving ! 30 zijn aangehaald.

802 0 3 1 5 -21-

! REFERENTIES

1 - Blumberg, B. S. (1977) Science J97, 17-25 j 2 - Dane D.S., Cameron C.H., and Brigss M. (1970)

Lancet 1, 695-698 ; 5 3 - Who Technical Report series, number 602 (1976) j I it - Summers J., O'Connel A. , and Millman I. (1975) Proc.

I Nat. Acad. Sci. USA 72, k 597-¾ 601 j 5 - Hruska J.F., Clayton D.A., Rubenstein J. L. R. and i ‘ ; j Robinson W.S. (1977) J. Virol. 21_, 666-682 10 6 - Landers T.A. , C-reenberg H.B. and Robinson W.S. j | (1977) J. Virol. 23, 368-376 i i 7 - Charnay P., Pourcel C., Louise A., Fritsch A. and I Tiollais P. (1979) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 76 I 2 222-2 226 j 15 8 - Dreesman G.R. , Hollinger F.B. , Surians J.R., |

Fujioka R.B., Brunschvig J.P. and Melnick J.L. i i (1972) J. Virol. 10, it69-it76 | I 9 - Gerin J.L. (197¾) in Mecanisms of virus disease j | Ed. W.S. Robinson, C.R. Fox pp 215-2¾ Menlo Park: 20 W.A. Benjamin ! 10- Dreesman G.R. , Chairez R. , Suarez M., Hollinger F.B.

Courtney R. J. and Melnick J.L. (1975) J· Virol. 16, 508 - 515 | 11- Shih J.W. amd Gerin J.L. (1977) J .Virol. 21_, 25 1 219-I 222 12- Peterson D.L. , Roberts I.M. and Vyas G.N. (1977)

Proc. Nat. Acad. Sci. USA 7¾) 1 530-1 53¾ 13- Peterson D.L. , Chien D.Y., Vyas G.N., Nitecki D. and Bond H. (1978) in Viral Hepatitis, Ed. G. Vyas, 30 S. Cohen and R. Schmid, The Franklin Institute Press,

Philadelphia, 569-573

Fritsch A., Pourcel C., Charnay P. and Tiollais P.

(1978) C.R. Acad. Sc. Paris 287, 1 1*53-1 ¾56 15- Burrell C.J. , Mackay P., Greenaway P.J., 35 Hofschneider P.H. and Murray K. (1979) Nature 279 U3-U7 8020315 \ -22- 16 - Tiollais P., Perricaudet M., Pettersson U. and

Philipson L. (1976) Gene 1. ^9-63 i 17 - Herissé J., Courtois G., and Galibert F. (1978)

Gene k, 279-29¾ ; 5 18 - Kroeker W.D. and Laskowski M.S. R. (1977) Anal.

Biochem. 79 , 63-72 19 - Ma,xara A.M. and Gilbert W. (1977) Proc. Nat. Acad. !

Sci. USA 560-56¾ 20 - Sanger F., Nicklen S. and Coulson A.R. (1977) Proc.

10 Nat. Acad. Sci. USA ]k, 5 U63-5 i+67 21 - Maat J. and Smith A. J. W. (1978) Nucleic Acid. Res.

5, ^ 537-¾ 5^5 22 - Berget S.M., Moore C. and Sharp P.A. (1977) Proc. !

Nat. Acad. Sci. USA 7U, 3 171-3 175 15 23 - Chow L.T. , Gelinas R. E., Broker T.R. , and Roberts J.

! i j (1977), Cell 12, 1 - 8 ; 2¾ - Shiraishi H., Kohama T., Shirachi R. and Ishida N.

j (1977) J. Gen. Virol. 36, 207-210 25 - Struck D.K., Lennarz W.J., and Brew K. (1978) J.

| 20 Biol. Chem. 253, 5 786-5 79¾ 26 - Reddy V.B. , Thimmappaya B., Dhar R., Subramanian K.N.

| Zain B.S. , Pan J. , Celma C.L. and Weissman S.M.

j (1978) Science 200, 1*9^502 27 - Fiers W., Contreras R., Hargeman G., Rogiers R., Van ! | 25 de Voorde A., Van Henverswyn H., Van Herreweghe J.,

Volchaerts G, and Ysebaert M. (1978) Nature 273, 113-117 28 - Sanger F., Air G.M., Barrell B.G. , Brown N.L., Coulson A.R.

Fiddes J.C., Hutchison III C.A., Slocombe P.M. and Smith M. 30 (1977) Nature 265, 687-691 29 - Barrell B.G., Shaw D.C., Walker J.E., Northrop F.D.

Godson G.N. and Fiddes J.C. (1978) Biochem. Soc.

Trans. (5, 63-67 30 - Szmuness W., Am. J. Path. 8l· 629-6¾9 (1975) 35 31 - Sninsky J.J., Siddiqui A., Robinson W.S. and

Cohen S.N. , Nature 279, 3¾6-3¾8 (1979) §020315 -23- 32 - Valenzuela P. et al., Nature 280, 815-819 (1979) | 33 - Charnay P. et al., Nucl. Acids Res. 7, 335-3k6 (1979) ! 3^ - Galibert F., Mandart E., Fitoussi F., Tiollais P. j and Charnay P., Nature 281, 6^6-650 (1979) 5 35 - Pasek M. et al., Nature 282, 575-579 (1979) | 36 - Vyas G.N., Williams E.W., Klaus G.G. B. and Bond. H.

| J.Immunol. U08, 1 111 118 (1972) 37 - Hollinger F.B., Dreesman G.R., Sanchez Y., Cabral G.

| and Melnick J.L., in Viral Hepatitis (Ed. Vyas G.N.

10 Cohen S.N. and Schmid R.J Franklin Institute,

Philadelphia, (1978) 38 - Purcell R.H., and Gerin J.L., Am. J. Med. Sci. 270, ! 395-399 (1975)

39 - Hilleman M.R. et al., Am. J. Med. Sci. 270, il01-UoU

15 (1975) ^0 - Maupas P., Coursaget P., Goudeau A. and Drucker J.,

Lancet 1, 1 367-1 370 (1976) I

! ! In - Emtage J.S. et al. , Nature 283, I7I-I7J+ (1980) j h2 - Itakura K. et al., Science _1£8, 1 056-1 063 (1977) 20 |l3 - Goeddel D.V. et al. , Prox. Nat. Acad. Sci. USA 7β, ! 106-110 (1979) Ιώ - Pourcel C. , Marchal C., Louise A., Fritsch A. and Tiollais P., Molec. Gen. Genet. UfO, I61-I69 (1979) i*5 - Bolivar F. et al. , Gene_2, 95-113 (1977)

; 25 k6 - Fowler A. V. and Zabin I., Proc. Nat. Acad. Sci. USA

jh, 1 507-1 510 (1977) kj - Laemmli U.K., Nature 227, 68Ο-685 (1970) U8 - Burgess R.R., J. Biol. Chem. 2UU, 6 168-6 176 (1969) k9 - Bonner W.M. and Laskey R.A. , Eur, J. Biochem. J+6, . 30 83-88 (197¾) 50 - Laskey R.A, and Mills A.D., Eur. J. Biochem. 56, 335-3M ( 1975) 51 - Iwakura Y., Ito K. and Ishihama A., Molec. Gen. Genet.

133, 1-23 (197^) 35 52 - Talwai G.P. , et al. , Proc. Nat. Acad. Sci. USA 73, 218-222 (1976)

8 02 0 3 IS

Claims (23)

1, Nucleinezuur, met het kenmerk, dat het ten hoogste j ongeveer 1000 - 1100 nucleotiden bevat en een immunogene i peptidereeks kan coderen, die zelf in vivo de produktie kan 5 inleiden van actieve antilichamen tegen hepatitis B virus. j

2. Nucleinezuur volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat | het een nucleotidereeks bevat, die de peptidereeks kan coderen, ! ! die wordt voorgesteld in de fig. 3A, 3B en 3C of een analoge | peptidereeks met equivalente immunogene eigenschappen.

3. Nucleinezuur volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat het een nucleotidereeks bevat, die wordt voorgesteld in de fig. hA en i+B en een peptidereeks kan coderen, die wordt voorge- j steld in fig. 5 of een analoge peptidereeks met equivalente immunogene eigenschappen.

1. Nucleinezuur volgens conclusies 1-3, met het kenmerk, dat het een nucleotidereeks bevat, die de peptidereeks kan j coderen, die wordt voorgesteld in fig. 6 of een analoge peptide-j reeks met equivalente immunogene eigenschappen voorgesteld in ! I fig. 6.

5. Nucleinezuur volgens een der conclusies 1 - U, met het ; kenmerk, dat het een reeks bevat, die de peptidereeks: alanine (N-eindstandig) - glutamine - glycine - threonine - serine (C-eindstandig) kan coderen.

6. Nucleinezuur volgens een der conclusies 1 - U, met het : 25 kenmerk, dat het een reeks bevat, die de peptidereeks: threonine (N-eindstandig) - analine - glutamine - glycine -threonine - serine (C-eindstandig) kan coderen.

7· Nucleinezuur volgens een der conclusies 1 - k, met het kenmerk, dat het een reeks bevat, die de peptidereeks: 30 threonine (N-eindstandig) - threonine - alanine - glutamine -glycine - threonine - serine (C-eindstandig) kan coderen.

8. Nucleinezuur volgens een der conclusies 1-7, met het kenmerk, dat het tenminste een van de twee onderling complementaire takken bevat van een ADN reeks als wordt voorgesteld in 35 fig· ^A en UB of een tak, die zich met de voorafgaande kan hybridiseren. .............. 8020315 f -25-

9. Nucleïnezuur volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat het tenminste één van de twee onderling complementaire takken ! bevat van een ADN reeks als wordt voorgesteld in fig. 3A, 3B en 3. of een tak, die zich met de voorafgaande kan hybridiseren. | 5 10. Nucleïnezuur volgens een der conclusies 1 - T5 met het kenmerk, dat het een dubbele tak heeft en aan één van zijn | einden wordt afgebakend door een uiteinde Hindi, Hhal, Aval of : EcoHI en aan zijn andere einde door een uiteinde AvalII, i Hindi of Hhal.

11. Nucleïnezuur volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat het de reeks 5' GCT CAA GGA ACC TCT 3' bevat of de reeks, die complementair is met de voorafgaande, of een reeks, waarin tenminste één van genoemde tripletten door een ander triplet is | vervangen, maar die toch hetzelfde aminozuur kan coderen. | 15 12. Nucleïnezuur volgens conclusie 6, met het kenmerk, datj I het de reeks 5' ACT GCT CAA GGA ACC TCT 3’ bevat 'of de reeks, die complementair met de voorafgaande, of een reeks, waarin ten- j minste één van genoemde tripletten is vervangen door een ander triplet, maar die toch hetzelfde aminozuur kan coderen. j ! 20 13. Nucleïnezuur volgens conclusie 7, met het kenmerk, ; dat het de reeks 5’ ACT ACT GCT CAA GGA ACC TCT 3' bevat, of | de reeks, die complementair is met de voorafgaande, of een reeks, , | waarin tenminste één van genoemde tripletten is vervangen door een ander triplet, maar die toch hetzelfde aminozuur kan coderen. 25 1U. Toepassing van ADN volgens een der conclusies 1-13 ! bij de constitutie van een vector, die kan worden uitgedrukt in een microorganisme of in een eucaryotecel ter produktie van een proteïne met een peptidereeks, die door genoemd nucleïnezuur wordt gecodeerd.

15. Peptide, met het kenmerk, dat het een peptidereeks bevat, die gecodeerd wordt door het nucleïnezuur volgens een der conclusies 1-13.

16. Peptide volgens conclusie 15, gekenmerkt door de volgende reeks: alanine - glutamine - glycine - threonine - 35 serine, waarin het alanineuiteinde N-eindstandig is en het serineuiteinde C-eindstandig is. 8020315 f -26-

17. Peptide volgens conclusie 15, gekenmerkt door de ! volgende reeks: threonine - alanine - glutamine - glycine - I threonine - serine, waarin het threonineuiteinde N-eindstandig | is en het serineuiteinde C-eindstandig is.

18. Peptide volgens conclusie 15, gekenmerkt door de j volgende reeks: threonine - threonine - alanine - glutamine - i glycine - threonine - serine, waarin het threonineuiteinde N-eindstandig is en het serineuiteinde C-eindstandig is. j

19. Farmaceutisch preparaat, met name vaccin of ! 10 diagnostisch reagens voor hepatitis B, dat in verbinding met een farmaceutisch aanvaardbare drager het polypeptide volgens j een der conclusies 16, 17 en 18 bevat, hetzij afzonderlijk, het- j zij vooraf bevestigd op een dragermolecuul, met name van het polypeptide of protexnetype.

20. Vector, met name van het faag- of plasmidetype ! volgens een der conclusies 1 — 18, die tenminste een deel van het' lactose operon bevat, in het bijzonder de promotor en het geen Z ; van dit operon, welke vector daardoor wordt gekenmerkt , dat hij j ! ten behoeve van het inzetten in fase op een geschikte plek van i ! 2. het geen Z, bijvoorbeeld de plek EcoBI gemodificeerd is met j een of ander ADN fragment van het hoofdbrevet met name een j i : fragment, dat het merendeel van het geen S bevat.

21. Vector volgens conclusie 20, met het kenmerk, dat tenminste een deel van het ADN fragment, dat het merendeel van j 25 de /3-galactosidase codeert, is vervangen door een ADN fragment, ! dat elk ander niet immunogeen dragermolecuul kan coderen, of waarvan de eventuele immunologische eigenschappen, indien zij bestaan, geen storende wisselwerking vertonen met die van het peptidegedeelte met de immunologische eigenschappen van HBsAg. !

22. Vector volgens conclusie 21, met het kenmerk, dat genoemd vervangend ADN fragment zich uitstrekt in de leesrichting, te beginnen bij de plek Hhal, die eerder aanwezig was in het ADN fragment, dat het merendeel van de yS-galactosidase codeert. ,

23. Vector volgens een der conclusies 20 - 22, met het 35 kenmerk, dat de vector is afgeleid van het plasmide pBR322. 8020315 V -27- 2b, Vector volgens een der conclusies 20 - 23, met het kenmerk, dat het genoemde ingezette fragment is afgebakend door | uiteinden EcoRI dat het een van ADN afkomstig fragment bevat, | dat is voortgekomen uit hepatitis virus B, dat daarin corres-5 pondeert met het fragment, dat wordt afgebakend door de plekken j Hhal en XBal en zelf het merendeel van het geen S bevat.

25. Vector volgens een van de conclusies 20 - 2b, ; met het kenmerk, dat hij een nucleotidereeks omvat van ongeveer 1200 nucleotiden, voortgekomen uit een virus van hepatitis B ! 10 en zich in een microorganisme of een eucaryotescel vermenig vuldigt .

26. Proteïne hybride dat kan worden gecodeerd door het j ADN fragment, dat in genoemde vector is ingezet.

27. Proteïne hybride volgens conclusie 26, dat een 15 polypeptidereeks bevat met de specifieke immunologische eigen- : i schappen van HBsAg, gekruist met een polypeptidereeks, die i wordt gevormd door het merendeel van /3 -galactosidase. ί 28. Proteïne hybride volgens conclusie 27, met het kenmerk, ! dat het gehele of een deel van het -galactosidasegedeelte is 20 vervangen door een ander niet immunogeen dragermolecuul, of waarin de eventuele immunologische eigenschappen, indien zij | bestaan, geen onderlinge storende werking vertonen met die van I \ het peptidegedeelte met de immunologische eigenschappen van HBsAg.

29. Vaccinpreparaat, dat als aktief bestanddeel het ; proteïne hybride bevat volgens een der conclusies 26-28. 802 0 3 1 5