KR20080056301A - 면역 반응을 유도시키기 위한, Ｃ형 간염 바이러스폴리펩티드 및 Ｆｃ 단편을 함유하는 키메라 항원 - Google Patents

면역 반응을 유도시키기 위한, Ｃ형 간염 바이러스폴리펩티드 및 Ｆｃ 단편을 함유하는 키메라 항원 Download PDF

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안토인 나우자임
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Abstract

본원에는 C형 간염 바이러스 (HCV) 항원, 및 상기 항원에 대항하여 면역 반응을 유도시킬 수 있는 면역글로불린의 Fc 단편을 포함하는 키메라 항원이 기재되어 있다. 면역 반응은 숙주 면역계에 면역 반응 도메인 (HCV 코어, 외피 또는 비구조 단백질 단편으로부터의 HCV 항원) 및 표적 결합성 도메인 (Fc 단편)을 제시함으로써 증강된다. 표적 결합성 도메인을 통하여, 항원 제시 세포를 내재화하고 항원 제시를 위해 키메라 항원을 프로세싱함으로써, 체액성 면역 반응과 세포성 면역 반응 둘 다를 유도시킨다.
C형 간염 바이러스 (HCV), 키메라 항원, 항원 제시 세포, Fc 단편, 체액성 면역 반응, 세포성 면역 반응

Description

면역 반응을 유도시키기 위한, Ｃ형 간염 바이러스 폴리펩티드 및 Ｆｃ 단편을 함유하는 키메라 항원 {Chimeric antigen containing Hepatitis C virus polypeptide and Fc fragment for eliciting an immune response}
본 발명은 세포성 및 체액성 면역 반응을 유도시키기 위해 항원 제시 세포 (APC)를 표적화 및 활성화하기 위한 키메라 항원 (예: 융합 단백질)에 관한 것이다. 특히, 본 발명에는 하나 이상의 예비선별된 C형 간염 바이러스 (HCV) 항원(들)과 면역글로불린 단편을 함유하는 하나 이상의 키메라 항원을 함유하거나 이를 사용하는 조성물 및 방법이 기재되어 있는데, 이러한 키메라 항원은 세포성 및 체액성 면역 반응을 유도시키기 위해 프로세싱되고 항원 제시를 수행하는 APC, 특히 수지상 세포와 결합하여 이를 활성화시킬 수 있다.
전 세계적으로 1억 7천만명 이상이 만성 HCV 보균자이다 [참고: Delwaide et al. (2000) Rev. Med. Liege 55:337-340]. 현재 HCV에 이용 가능한 예방 백신은 물론 치료 백신도 없다. 감염 경로는 혈액과 기타 체액을 통해서 이루어지고 환자의 70% 이상이 이러한 바이러스의 만성 보균자가 된다. 영속적 감염으로 인해 만성 활동성 간염이 야기되고, 이는 진행성 간 질환을 유발시킬 수도 있다 [참고: Alter et al. (1999) N. Engl. J. Med. 341:556-562]. 현재 C형 간염 감염증에 대 한 유일한 치료법은 인터페론-I (IFN-I)과 리바비린 (Ribavirin)이다. 그러나, 이러한 요법은 비용이 많이 들고, 상당한 부작용이 있으며 선별된 환자 군의 대략 50%에게서만 유효하다. 만성 HCV 감염증을 없애기 위해 숙주 면역 반응을 증강시키는 치료 백신이 이러한 질병을 치료하는데 있어 두드러진 진보가 될 것이다.
면역계는 HCV 감염 결과에 있어 중요한 역할을 한다. HCV에 노출된 대부분의 개체들은 이러한 바이러스에 대한 광범위하고 강력하면서도 다중-항원 특이적인 CD4+ (조절성) 및 CD8+ (세포독성) T 세포 반응을 갖추게 된다. 이들 개체에게는 자기 한정적 (self-limited) 감염증 만이 발생한다. 그러나, HCV에 노출된 몇몇 개체에서는 약하거나 탐지 불가능하고 협소한 범위로만 집중된 면역 반응으로 인해 만성 감염증이 발생한다.
HCV는 플라비비리대 (flaviviridae) 계열의 RNA 바이러스의 한 구성원이다. HCV 게놈은 숙주에 의해 촉매된 개별적 단백질 및 바이러스성 프로테아제로 절단되어 3개의 구조 단백질 (코어, E1, E2), p7 단백질 및 6개의 비구조 단백질 (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B)을 생성시키는 단일 폴리단백질을 암호화하는 대략 9.5 Kb의 양성 센스 단일 가닥 RNA 분자이다 [참고: Hijikkata et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5547-5551]. NS3 단백질은 상기 비구조 단백질의 단백질분해적 프로세싱에 관여하는 바이러스성 세린 프로테아제이다 [참고: Bartenschlager et al. (1993) J. Virol. 67: 3835-3844].
바이러스가 숙주 면역 기구의 공격을 교묘하게 피하는 기전은 명확하게 확립되지 않았다 [참고: Shoukry et al. (2004) Ann. Rev. Microbiol. 58:391-424]. 몇 가지 HCV 단백질이 면역 회피 기전에 명백한 영향을 끼쳐 왔다. 이에는 IFN-유도된 항바이러스성 반응을 억제하는 IL-8의 생성을 유도시키고 [참고: Polyak at al. (2001) J. Virol. 75: 6095-6106] 세포성 IFN-γ-유도된 PKR 단백질 키나제를 억제함으로써, 항바이러스성 면역 반응을 억제시키는 것으로 [참고: Tan et al. (2001) Virol 284: 1-12] 제안된 NS5A; DC 분화를 억제시키는 것으로 제안된 코어 및 NS3 [참고: Dolganiuc et al. (2003) J. Immunol. 170:5615-5624]; 및 DC 성숙화를 조정함으로써 T 세포 반응을 조정하는 것으로 제안된 코어 및 E1 [참고: Sarobe et al. (2002) J. Virol. 77:10862-10871; and Grakoui et al. (2003) Science 302:659-662]; 및 최종적으로 기억 T 세포 조력인자의 결여가 포함된다 [참고: Shoji et al. (1999) Virology 254: 315-323].
발명의 요약
본 발명은 면역 반응을 유도시키는데 있어 첫 번째 단계 중의 하나인, APC를 표적화 및 활성화시키는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물에는 표적 결합성 도메인 (TBD), 예를 들어 항체 단편 부분과 연결된 면역 반응 도메인 (IRD), 예를 들어 재조합 단백질을 포함하는 신규한 부류의 분자 ("키메라 항원"으로서 후술됨)가 포함된다. 보다 구체적으로 언급하면, 키메라 항원은 바이러스성 항원, 예를 들어 C형 간염 코어, 외피 단백질 (예: E1 및 E2), 또는 비구조 단백질을 면역글로불린 단편, 예를 들어 뮤린 면역글로불린 G Fc 단편과 커플링시킨 분자이다. 몇몇 양태에서, 항체 단편은 이종형 (xenotypic) 항체 단편이다.
본 발명의 조성물 및 방법은 APC를 표적화 및 활성화하는데 유용하다. 본 발명의 조성물 및 방법은 HCV와 연관된 모든 바이러스성 항원에 대항한 세포성 및/또는 체액성 숙주 면역 반응을 유도시키는데 유용하다. 본 발명에는 HCV 감염증을 예방하기 위한 예방 백신 뿐만 아니라 만성 HCV 감염증을 치료하기 위한 치료 백신이 포함된다.
본 발명의 한 가지 이상 양태에는 HCV에 대항한 면역 반응을 개시하는데 적합한 하나 이상의 키메라 항원이 포함된다. 이들 본 발명의 양태에서는, 선택된 HCV 항원을 항체 단편에 연결시킨다. 이로써 생성되는 키메라 항원은 APC, 예를 들어 수지상 세포를 표적화 및 활성화할 수 있다.
본 발명에는 또한, 융합 단백질을 암호화하는 DNA 구조물을 클로닝하고 융합 단백질을 이종 발현 시스템에서 생성시키는 방법이 포함된다. 본 발명의 바람직한 양태에서는, 상기 클로닝 및 생성 방법으로 인해, 발현된 융합 단백질의 당화 (예: 만노실화)를 포함하지만, 그에 제한되지 않는 독특한 해독 후 변형이 도입된다.
항원의 효율적인 제시를 제공하기 위해, 본 발명자들은 신규한 바이러스성 항원-뮤린 모노클로날 항체 Fc 단편 융합 단백질을 개발하였다. 이러한 분자는 Fc 단편에 의해, APC (예: 수지상 세포)에 의한 특이적 수용체를 통하여 고 효율로 인식되고, 융합 단백질이 프로세싱되며, 바이러스성 항원으로부터의 펩티드 에피토프가 주요 조직 적합성 복합체 (MHC) 부류 I과의 복합체로서 제시된다. 이러한 프로세싱과 항원 제시로 인해, 세포독성 T-림프구에 의한 반응의 상향 조절이 일어나서, 바이러스-감염된 세포 집단이 제거된다. 또한, MHC 부류 II 분자에 의한 항원 제시와 조력인자 T 세포의 활성화로 인해, 바이러스성 감염증을 예방하고/하거나 없애주는데 도움을 줄, 바이러스성 항원에 대항한 체액성 반응이 유도될 수 있다.
상기 분자의 키메라 특성은 항원이 적당한 항원 제시 세포 (예: 수지상 세포)를 표적으로 하는데 도움을 주기 때문에, APC 수용체를 특이적으로 표적화함으로써 만성 감염성 질환 치료법에 있어 독특한 접근 방식이 된다. 이는 만성 C형 간염 감염증을 치료해 주는 치료 백신을 개발하는데 유용하다.
이들 키메라 융합 단백질을 투여하면, 숙주로부터 광범위한 면역 반응 (이에는 세포성 반응과 체액성 반응 둘 다가 포함됨)이 유도될 수 있다. 따라서, 이들은 HCV 감염증에 대해 면역 내성이 있는 대상체를 치료하기 위한 치료 백신으로서 사용할 수 있다.
보다 구체적으로 언급하면, 본 발명은 면역 반응을 유도시키기 위한 키메라 항원을 특징으로 하는데, 이러한 키메라 항원은 면역 반응 도메인과 표적 결합성 도메인을 함유하고, 면역 반응 도메인은 C형 간염 (HCV) 항원을 함유하고 표적 결합성 도메인은 항체 단편을 함유한다. 항체 단편은 이종형 항체 단편일 수 있다. 키메라 항원은 체액성 면역 반응, 세포성 면역 반응, 또는 체액성 면역 반응과 세포성 면역 반응 둘 다를 유도시킬 수 있다. 또한, 키메라 항원은 Th1 면역 반응, Th2 면역 반응, 또는 Th1 면역 반응과 Th2 면역 반응 둘 다를 유도시킬 수 있다. 면역 반응은 생체내 또는 생체외 면역 반응일 수 있다. 면역 반응 도메인은 하나 이상의 단백질을 함유할 수 있는데, 이는 예를 들어, 다음을 포함하는 하나 이상의 단백질의 하나 이상의 면역원성 부분을 함유할 수 있다: HCV 코어 (1-191) 단백질, HCV 코어 (1-177) 단백질, HCV p7 단백질, HCV E1 단백질, HCV E2 단백질, HCV E1- E2 단백질, HCV NS3 단백질, HCV NS4B 단백질, 또는 HCV NS5A 단백질. 표적 결합성 도메인은 항원 제시 세포 (APC)와 결합할 수 있다. 항체 단편은 Fc 단편일 수 있다. 키메라 항원은 6xHis 태그, 프로테아제 절단 부위, 및 면역 반응 도메인과 표적 결합성 도메인을 연결하기 위한 링커 중의 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 링커는 루이신 지퍼, 아비딘과 결합된 바이오틴, 및 공유 펩티드 연쇄 중에서 선택될 수 있다. 더우기, 키메라 항원은 당화, 예를 들어 만노스 당화될 수 있다. 항체 단편에는 면역글로불린 중쇄 단편이 포함될 수 있고, 면역글로불린 중쇄 단편은 힌지 (hinge) 영역을 함유할 수 있다. 또한, 면역글로불린 중쇄 단편은 CH1, 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인으로 이루어진 군 중에서 선택된 항체 단편의 전부 또는 일부를 함유할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 항원 제시 세포에 본원에 기재된 키메라 항원을 투여하는 것을 포함하는, 특정 항원을 항원 제시 세포에 전달하는 방법이다. 항원 제시 세포는 수지상 세포일 수 있다.
본 발명은 또한, 항원 제시 세포를 본원에 기재된 키메라 항원과 접촉시키는 것을 포함할 수 있는, 항원 제시 세포를 활성화시키는 방법을 제공한다. 이러한 접촉은 생체외 또는 생체내에서 일어날 수 있다. 이는, 예를 들어 인간에게서 일어날 수 있다. 상기 방법은 특정 대상체에게, 본 발명의 키메라 항원을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함할 수 있는데, 항원 제시 세포는 상기 대상체 내에 존재한다. 이러한 접촉으로 인해, 체액성 면역 반응, 세포성 면역 반응, 또는 체액 성 면역 반응과 세포성 면역 반응 둘 다가 발생할 수 있다. 세포성 면역 반응은 Th1 반응, Th2 반응 및 CTL 반응 중의 한 가지 이상일 수 있다. 대상체는 면역-치료 가능한 질환에 걸릴 수 있거나, 걸릴 것으로 예상될 수 있다. 면역-치료 가능한 질환은 급성 감염증 (예를 들어, 급성 바이러스성 감염증)일 수 있거나, 또는 만성 감염증 (예를 들어, 만성 바이러스성 감염증)일 수 있다. 만성 감염증은 만성 C형 간염 바이러스성 감염증일 수 있다. 면역-치료 가능한 질환은 C형 간염 바이러스성 감염증일 수 있고, 면역 반응 도메인은 HCV 코어 (1-191) 단백질, HCV 코어 (1-177) 단백질, HCV E1 단백질, HCV E2 단백질, HCV E1-E2 단백질, HCV P7 단백질, HCV NS3 단백질, HCV NS4B 단백질, 및 HCV NS5A 단백질로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 단백질의 하나 이상의 항원성 부분을 함유할 수 있다. 상기 방법을 사용하여, 대상체를 바이러스성 감염증에 대항하여 백신 접종할 수 있는데, 예를 들어 바이러스성 감염증에 대항하여 예방적으로 백신 접종할 수 있거나 또는 기존의 바이러스성 감염증에 대항하여 치료적으로 백신 접종할 수 있다.
본 발명의 또 다른 국면은 키메라 항원을 생성시키는 방법이다. 이러한 방법은 (a) 키메라 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 미생물 또는 세포를 제공하는 단계; 및 (b) 이러한 미생물 또는 세포를, 키메라 항원이 발현되도록 하는 조건 하에 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 미생물 또는 세포는 진핵 미생물 또는 세포일 수 있다. 세포는 효모 세포, 식물 세포 또는 곤충 세포일 수 있다. 또한, 키메라 항원은 당화를 포함하도록 해독 후 변형시킬 수 있는데, 예를 들어 키메라 항원은 만노스 당화를 포함하도록 해독 후 변형시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 키메라 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드인데, 이러한 폴리뉴클레오티드는 면역 반응 도메인을 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드 부분과, 항체 단편을 함유하는 표적 결합성 도메인을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드 부분을 함유한다. 항체 단편은 이종형 항체 단편일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 서열 39 및 41 내지 51에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 이루어진 군 중에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있다. 더우기, 폴리뉴클레오티드는 서열 40 및 52 내지 62에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 군 중에서 선택된 전체 아미노산 서열과 90% 이상 동일한 키메라 항원을 암호화할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 엄격한 조건 하에, 서열 39 및 41 내지 51에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 이루어진 군 중에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드와 선택적으로 혼성화할 수 있다. 본 발명은 또한, 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터, 예를 들어 폴리뉴클레오티드가 전사 조절성 요소 (TRE)와 작동적으로 연결되는 벡터를 제공한다. 또한, 본 발명은 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 미생물 또는 세포를 포괄한다.
본 발명의 또 다른 양태는 본원에 기재된 키메라 항원과, 이러한 키메라 항원을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것에 관한 지시 사항을 함유할 수 있는 제조품이다.
본 발명의 또 다른 국면은 본원에 기재된 키메라 항원과, 제약상 허용 가능한 부형제를 함유하는 제약 조성물이다.
더우기, 본 발명은 키메라 항원을 생성시키는 또 다른 방법을 제공한다. 이 러한 방법은 (a) 링커 분자와 결합된 표적 결합성 도메인을 함유하는 표적-결합성 도메인-링커 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 미생물 또는 세포를 제공하는 단계; (b) 상기 미생물 또는 세포를, 표적 결합성 도메인-링커 분자가 발현되도록 하는 조건 하에 배양하는 단계; 및 (c) 링커가 면역 반응 도메인과 결합하여 이러한 결합으로 인해 키메라 항원이 생성되도록 하는 조건 하에, 표적 결합성 도메인-링커 분자와 면역 반응 도메인을 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 미생물 또는 세포, 폴리뉴클레오티드, 표적 결합성 도메인, 링커 분자, 및 면역 반응 도메인은 본원에 기재된 것일 수 있다.
달리 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 불일치하는 경우에는, 정의를 포함한 본 명세서를 조절할 것이다. 바람직한 방법 및 물질이 다음에 기재되긴 하지만, 본원에 기재된 바와 유사하거나 등가의 방법 및 물질을 본 발명의 실시 또는 시험에 사용할 수 있다. 본원에 언급된 모든 공보, 특허원, 특허 및 기타 참고 문헌은 그 전문이 본원에 참고로 도입된다. 본원에 기재된 물질, 방법 및 실시예는 단지 예시적이며, 이로써 제한되지 않는다.
본 발명의 기타 특징 및 이점, 예를 들어, 면역-치료 가능한 질환을 치료 또는 예방하기 위한 키메라 항원은 다음의 설명, 도면 및 청구의 범위로부터 명백할 것이다.
도 1은 이량체화 형태의 키미젠™ (Chimigen™) 백신을 도식적으로 나타낸 것이다. 이는 각각 면역 반응 도메인 (IRD)과 표적 결합성 도메인 (TBD)으로 구성된 2개의 소단위체를 함유한다.
도 2A 및 B는 플라스미드 pFastBacHTa-TBD 내의 ORF (개방 판독 프레임)의 뉴클레오티드 서열 (서열 9) 및 이러한 ORF에 의해 암호화된 아미노산 서열 (서열 10)을 각각 나타낸 것이다.
도 3A 및 B는 플라스미드 pFastBacHTa-NS5A-TBD 내의 ORF의 뉴클레오티드 서열 (서열 39) 및 이러한 ORF에 의해 암호화된 아미노산 서열 (서열 40)을 각각 나타낸 것이다. 도 3A 및 도 3B에서 밑줄치고 진하게 표시한 위치에서 보존된 자발적 돌연변이 [TTC (Phe)에서 TTT (Phe)로의 돌연변이]가 있다.
뉴클레오티드 서열에서:
뉴클레오티드 1-3: 출발 코돈
뉴클레오티드 13-30: 6XHis 에피토프 태그
뉴클레오티드 91-1431: HCV NS5A
뉴클레오티드 1432-1461: 링커 펩티드
뉴클레오티드 1462-2157: TBD
뉴클레오티드 2158-2187: 말단 펩티드
뉴클레오티드 2188-2190: 정지 코돈
뉴클레오티드 1639-1641: TBD TTC-TTT 보존된 돌연변이
아미산 서열에서:
아미노산 5-10: 6xHis 에피토프 태그
아미노산 31-477: HCV NS5A
아미노산 478-487: 링커 펩티드
아미노산 488-719: TBD
아미노산 720-729: 말단 펩티드.
도 4A 및 B는 플라스미드 pFastBacHTa-gp64-NS5A-TBD 내의 ORF의 뉴클레오티드 서열 (서열 41) 및 이러한 ORF에 의해 암호화된 아미노산 서열 (서열 52)을 각각 나타낸 것이다. 도 4A 및 도 4B에서 밑줄치고 진하게 표시한 위치에서 인공적 돌연변이 [GAT (Asp)에서 TAT (Tyr)로의 돌연변이] 및 보존된 자발적 돌연변이 [TTC (Phe)에서 TTT (Phe)로의 돌연변이]가 있다.
뉴클레오티드 서열에서:
뉴클레오티드 1-3: 출발 코돈
뉴클레오티드 1-72: gp64 신호 펩티드
뉴클레오티드 97-114: 6XHis 에피토프 태그
뉴클레오티드 175-1515: HCV NS5A
뉴클레오티드 1516-1545: 링커 펩티드
뉴클레오티드 1546-2241: TBD
뉴클레오티드 2242-2271: 말단 펩티드
뉴클레오티드 2272-2274: 정지 코돈
뉴클레오티드 61-63: 신호 펩티드 GAT에서 TAT로의 인공적 돌연변이
뉴클레오티드 1725: TBD TTC에서 TTT로의 보존적 돌연변이
아미노산 서열에서:
아미노산 1-24: gp64 분비 신호
아미노산 33-38: 6xHis 에피토프 태그
아미노산 59-505: HCV NS5A
아미노산 506-515: 링커 펩티드
아미노산 516-747: TBD
아미노산 748-757: 말단 펩티드
아미노산 21: 신호 펩티드 D에서 Y로의 인공적 돌연변이.
도 5A 및 B는 플라스미드 pPSC12-NS5A-TBD 내의 ORF의 뉴클레오티드 서열 (서열 42) 및 ORF에 의해 암호화된 아미노산 서열 (서열 53)을 각각 나타낸 것이다.
도 6A 및 B는 플라스미드 pFastBacHTa-gp64-NS3-TBD 내의 ORF의 뉴클레오티드 서열 (서열 43) 및 이러한 ORF에 의해 암호화된 아미노산 서열 (서열 54)을 각각 나타낸 것이다. 도 6A에서 밑줄친 코돈으로써 나타내고 도 6B에서 아미노산으로써 나타낸 2개의 돌연변이가 있다. 도 6A의 경우 상단에서 하단으로, 그리고 도 6B의 경우에는 N-말단에서 C-말단으로 다음과 같은 돌연변이가 있다: 공학 처리시킨 CGG (Arg)에서 GCG (Ala)로의 돌연변이; 및 자발적인 CCA (Pro)에서 GGA (Gly) 로의 돌연변이.
도 7A 및 B는 플라스미드 pFastBacHTa NS3mut-TBD 내의 ORF의 뉴클레오티드 서열 (서열 44) 및 이러한 ORF에 의해 암호화된 아미노산 서열 (서열 55)을 각각 나타낸 것이다. 도 7A에서 밑줄치고 진하게 표시한 코돈으로써 나타내고 도 7B에서 아미노산으로써 나타낸 2개의 돌연변이가 있다. 도 7A의 경우 상단에서 하단으로, 그리고 도 7B의 경우에는 N-말단에서 C-말단으로 다음과 같은 돌연변이가 있다: 자발적으로 보존된 AGG (Arg)에서 CGG (Arg)로의 돌연변이; 및 공학 처리시킨 CGG (Arg)에서 GCG (Ala)로의 돌연변이.
뉴클레오티드 서열에서:
뉴클레오티드 1-3: 출발 코돈
뉴클레오티드 13-30: 6XHis 에피토프 태그
뉴클레오티드 91-1965: HCV NS3mut
뉴클레오티드 1966-1995: 링커 펩티드
뉴클레오티드 1996-2691: TBD
뉴클레오티드 2692-2721: 말단 펩티드
뉴클레오티드 2722-2724: 정지 코돈
뉴클레오티드 1462-1464: NS3mut AGG에서 CGG로의 자발적 돌연변이
뉴클레오티드 1474-1476: NS3mut CGG에서 GCG로의 공학 처리시킨 돌연변이.
아미노산 서열에서:
아미노산 5-10: 6xHis 에피토프 태그
아미노산 31-655: HCV NS3mut
아미노산 656-665: 링커 펩티드
아미노산 666-897: TBD
아미노산 898-907: 말단 펩티드
아미노산 488: NS3mut R에서 R로의 자발적 돌연변이
아미노산 492: NS3mut R에서 A로의 공학 처리시킨 돌연변이.
도 8A 및 B는 플라스미드 pFastBacHTa-gp64-NS3mut-TBD 내의 ORF의 뉴클레오티드 서열 (서열 45) 및 이러한 ORF에 의해 암호화된 아미노산 서열 (서열 56)을 각각 나타낸 것이다. 도 8A에서 강조된 코돈으로써 나타내고 도 8B에서 아미노산으로써 나타낸 3개의 돌연변이가 있다. 도 8A의 경우 상단에서 하단으로, 그리고 도 8B의 경우에는 N-말단에서 C-말단으로 다음과 같은 돌연변이가 있다: 인공적 돌연변이 [GAT (Asp)에서 TAT (Tyr)로의 돌연변이]; 자발적으로 보존된 AGG (Arg)에서 CGG (Arg)로의 돌연변이; 및 공학 처리시킨 CGG (Arg)에서 GCG (Ala)로의 돌연변이.
뉴클레오티드 서열에서:
뉴클레오티드 1-3: 출발 코돈
뉴클레오티드 1-72: gp64 신호 펩티드
뉴클레오티드 97-114: 6XHis 에피토프 태그
뉴클레오티드 175-2049: HCV NS3mut
뉴클레오티드 2050-2079: 링커 펩티드
뉴클레오티드 2080-2775: TBD
뉴클레오티드 2776-2805: 말단 펩티드
뉴클레오티드 2806-2808: 정지 코돈
뉴클레오티드 61-63: 신호 펩티드 GAT에서 TAT로의 인공적 돌연변이
뉴클레오티드 1546-1548: NS3mut AGG에서 CGG로의 보존된 돌연변이
뉴클레오티드 1558-1560: NS3mut CGG에서 GCG로의 공학 처리시킨 돌연변이.
아미노산 서열에서:
아미노산 1-24: gp64 분비 신호
아미노산 33-38: 6xHis 에피토프 태그
아미노산 59-683: HCV NS3mut
아미노산 684-693: 링커 펩티드
아미노산 694-925: TBD
아미노산 926-935: 말단 펩티드
아미노산 21: 신호 펩티드 D에서 Y로의 인공적 돌연변이
아미노산 520: NS3mut R에서 A로의 공학 처리시킨 돌연변이.
도 9A 및 B는 플라스미드 pFastBacHTa-gp64 NS3-NS4B-NS5A-TBD 내의 ORF의 뉴클레오티드 서열 (서열 46) 및 이러한 ORF에 의해 암호화된 아미노산 서열 (서열 57)을 각각 나타낸 것이다. 도 9A에서 밑줄치고 진하게 표시한 코돈으로써 나타내고 도 9B에서 아미노산으로써 나타낸 4개의 돌연변이가 있다. 도 9A의 경우 상단에서 하단으로, 그리고 도 9B의 경우에는 N-말단에서 C-말단으로 다음과 같은 돌연변이가 있다: 인공적 돌연변이 [GAT (Asp)에서 TAT (Tyr)로의 돌연변이]; 공학 처리시킨 TCG (Ser)에서 GCG (Ala)로의 돌연변이; 공학 처리시킨 CGG (Arg)에서 GCG (Ala)로의 돌연변이; 및 자발적인 CCA (Pro)에서 GGA (Gly)의 돌연변이.
도 10A 및 B는 플라스미드 pFastBacHTa-gp64-NS3-NS5A-TBD 내의 ORF의 뉴클레오티드 서열 (서열 47) 및 이러한 ORF에 의해 암호화된 아미노산 서열 (서열 58)을 각각 나타낸 것이다. 도 10A에서 밑줄친 코돈으로써 나타내고 도 10B에서 아미노산으로써 나타낸 4개의 돌연변이가 있다. 도 10A의 경우 상단에서 하단으로, 그리고 도 10B의 경우에는 N-말단에서 C-말단으로 다음과 같은 돌연변이가 있다: 인공적 돌연변이 [GAT (Asp)에서 TAT (Tyr)로의 돌연변이]; 공학 처리시킨 TCG (Ser)에서 GCG (Ala)로의 돌연변이; 공학 처리시킨 CGG (Arg)에서 GCG (Ala)로의 돌연변이; 및 자발적인 CCA (Pro)에서 GGA (Gly)의 돌연변이.
뉴클레오티드 서열에서:
뉴클레오티드 1-3: 출발 코돈
뉴클레오티드 1-72: gp64 신호 펩티드
뉴클레오티드 97-114: 6XHis 에피토프 태그
뉴클레오티드 175-2049: HCV NS3mut
뉴클레오티드 2050-2058: 링커 펩티드
뉴클레오티드 2059-3402: HCV NS5A
뉴클레오티드 3403-3426: 링커 펩티드
뉴클레오티드 3427-4122: TBD
뉴클레오티드 4123-4152: 말단 펩티드
뉴클레오티드 4153-4155: 정지 코돈
뉴클레오티드 61-63: 신호 펩티드 GAT에서 TAT로의 인공적 돌연변이
뉴클레오티드 589: NS3mut TCG에서 GCG로의 공학 처리시킨 돌연변이
뉴클레오티드 1558-1559: NS3mut CGG에서 GCG로의 공학 처리시킨 돌연변이
뉴클레오티드 2050-2052: NS3mut CCA에서 GGA로의 자발적 돌연변이.
아미노산 서열에서:
아미노산 1-24: gp64 분비 신호
아미노산 33-38: 6xHis 에피토프 태그
아미노산 59-683: HCV NS3
아미노산 684-686: 링커 펩티드
아미노산 687-1134: HCV NS5A
아미노산 1135-1374: TBD
아미노산 1375-1384: 말단 펩티드
아미노산 21: 신호 펩티드 D에서 Y로의 인공적 돌연변이
아미노산 197: NS3mut S에서 A로의 공학 처리시킨 돌연변이
아미노산 520: NS3mut R에서 A로의 공학 처리시킨 돌연변이
아미노산 684: NS3mut P에서 G로의 자발적 돌연변이.
도 11A 및 B는 플라스미드 pFastBacHTa HCV 코어 (1-177)-TBD 내의 ORF의 뉴클레오티드 서열 (서열 48) 및 이러한 ORF에 의해 암호화된 아미노산 서열 (서열 59)을 각각 나타낸 것이다.
도 12A 및 B는 플라스미드 pFastBacHTa-E1-TBD 내의 ORF의 뉴클레오티드 서열 (서열 49) 및 이러한 ORF에 의해 암호화된 아미노산 서열 (서열 60)을 각각 나 타낸 것이다.
도 13A 및 B는 플라스미드 pFastBacHTa E2-TBD 내의 ORF의 뉴클레오티드 서열 (서열 50) 및 이러한 ORF에 의해 암호화된 아미노산 서열 (서열 61)을 각각 나타낸 것이다.
도 14A 및 B는 플라스미드 pFastBacHTa-E1-E2-TBD 내의 ORF의 뉴클레오티드 서열 (서열 51) 및 이러한 ORF에 의해 암호화된 아미노산 서열 (서열 62)을 각각 나타낸 것이다.
도 15는 미성숙 DC에 대한 NS5A 키미젠™ 단백질의 3가지 상이한 농도에서의 결합을 보여주는 일련의 형광 유동 세포계수법 (FFC) 프로파일이다.
도 16은 CD32 및 CD206에 대해 특이적인 항체에 의한 미성숙 DC에 대한 NS5A 키미젠™ 단백질의 결합 억제를 보여주는 한 쌍의 막대 그래프이다.
도 17은 본 실시예에 기재된 바와 같이 생성된 성숙한 DC에 의한 표시된 세포 표면 마커의 발현을 보여주는 일련의 막대 그래프이다. 데이터는 FFC에 의해 수득하였고, "양성 세포 %" (상부 그래프) 및 "평균 형광 세기" ("MFI") (하부 그래프)로서 제시하였다.
도 18A-B는 각종 농도의 T 세포 및 NS5A 키미젠™ 단백질 또는 파상풍 톡소이드 부하된 DC의 4일 배양물 중에서의, CD69 발현성 T 세포 (도 18A), CD69 발현성 CD8+ T 세포 (도 18B), 및 CD69 발현성 CD4+ T 세포 (도 18C)의 비율을 보여주는 3가지 세트의 막대 그래프이다. 데이터는 FFC에 의해 수득하였다. 5AC1 및 5AC2: NS5A 키미젠™ 단백질의 2가지 상이한 제제.
도 19A-C는 각종 농도의 T 세포 및 NS5A 키미젠™ 단백질 또는 파상풍 톡소이드 부하된 DC의 4일 배양물 중에서의, CFSElo T 세포 (도 19A), CFSElo CD8+ T 세포 (도 19B), 및 CFSElo CD4+ T 세포 (도 19C)의 비율을 보여주는 3가지 세트의 막대 그래프이다. 데이터는 FFC에 의해 수득하였다. 5AC1 및 5AC2: NS5A 키미젠™ 단백질의 2가지 상이한 제제.
도 20A-C는 각종 농도의 T 세포 및 NS5A 키미젠™ 단백질 또는 파상풍 톡소이드 부하된 DC 또는 식물적혈구응집소 (PHA: 도 20A)의 7일 배양물 중에서의, CD69 발현성 T 세포 (도 20A), CD69 발현성 CD8+ T 세포 (도 20B), 및 CD69 발현성 CD4+ T 세포 (도 20C)의 비율을 보여주는 3가지 세트의 막대 그래프이다. 데이터는 FFC에 의해 수득하였다. 5AC1 및 5AC2: NS5A 키미젠™ 단백질의 2가지 상이한 제제.
도 21A-C는 각종 농도의 T 세포 및 NS5A 키미젠™ 단백질 또는 파상풍 톡소이드 부하된 DC 또는 PHA (도 21A)의 7일 배양물 중에서의, CFSElo T 세포 (도 21A), CFSElo CD8+ T 세포 (도 21B), 및 CFSElo CD4+ T 세포 (도 21C)의 비율을 보여주는 3가지 세트의 막대 그래프이다. 데이터는 FFC에 의해 수득하였다. 5AC1 및 5AC2: NS5A 키미젠™ 단백질의 2가지 상이한 제제.
도 22는 각종 농도의 T 세포 및 NS5A 키미젠™ 단백질 또는 파상풍 톡소이드 부하된 DC 또는 PHA의 7일 배양물 중에서의, 모세포인 T 세포의 비율을 보여주는 일련의 막대 그래프이다. 데이터는 FFC에 의해 수득하였다. 5AC1 및 5AC2: NS5A 키미젠™ 단백질의 2가지 상이한 제제.
도 23은 표시된 세포 표면 마커의 성숙되고 항원 부하된 DC에 의한 발현을 보여주는 일련의 막대 그래프이다.
도 24는 본 실시예에 기재된 바와 같이 만든 성숙되고 항원 부하된 DC로의 3회 자극 후, 모세포인 T 세포의 비율을 보여주는 한 쌍의 막대 그래프이다. 데이터는 FFC에 의해 수득하였다. 5AC: NS5A 키미젠™ 단백질.
도 25는 본 실시예에 기재된 바와 같이 만든 성숙되고 항원 부하된 DC로의 3회 자극 후, 세포내 인터페론-K (IFN-K)를 함유하는 T 세포의 비율을 보여주는 일련의 막대 그래프이다. 데이터는 FFC에 의해 수득하였다. 5AC: NS5A 키미젠™ 단백질; PMA: 포르볼 미리스트산; 둘벡코 인산염 완충 식염수 (DPBS).
도 26은 본 실시예에 기재된 바와 같이 만든 성숙되고 항원 부하된 DC로의 3회 자극 후, 세포내 IFN-K를 함유하는 CD8+ T 세포의 비율을 보여주는 한 쌍의 막대 그래프이다. 데이터는 FFC에 의해 수득하였다. 5AC: NS5A 키미젠™ 단백질.
도 27은 본 실시예에 기재된 바와 같이 만든 성숙되고 항원 부하된 DC로의 3회 자극 후, 세포내 IFN-K를 함유하는 CD4+ T 세포의 비율을 보여주는 한 쌍의 막대 그래프이다. 데이터는 FFC에 의해 수득하였다. 5AC: NS5A 키미젠™ 단백질.
도 28은 본 실시예에 기재된 바와 같이 만든 성숙되고 항원 부하된 DC로의 3회 자극 후, 세포내 종양 괴사 인자-I (TNF-I)를 함유하는 T 세포의 비율을 보여주는 한 쌍의 막대 그래프이다. 데이터는 FFC에 의해 수득하였다. 5AC: NS5A 키미젠™ 단백질; PMA: 포르볼 미리스트산; DPBS.
도 29는 본 실시예에 기재된 바와 같이 만든 성숙되고 항원 부하된 DC로의 3회 자극 후, 세포내 TNF-I를 함유하는 CD8+ T 세포 (좌측 그래프) 및 CD4+ T 세포 (우측 그래프)의 비율을 보여주는 한 쌍의 막대 그래프이다. 데이터는 FFC에 의해 수득하였다. 5AC: NS5A 키미젠™ 단백질.
도 30은 본 실시예에 기재된 바와 같이 만든 성숙되고 항원 부하된 DC로의 3회 자극 후, 과립상 단백질 GrB (좌측 그래프) 및 Pfn (우측 그래프)를 발현하는 CD8+ T 세포의 비율을 보여주는 한 쌍의 막대 그래프이다. 데이터는 FFC에 의해 수득하였다. 5AC: NS5A 키미젠™ 단백질.
도 31은 본 실시예에 기재된 바와 같이 만든 성숙되고 항원 부하된 DC로의 3회 자극 후, 모세포의 비율 및 림프구 [R1 게이트 (gate) 세포]의 총 수를 보여주는 한 쌍의 막대 그래프이다. 세포를 마지막 자극한지 6일 후에 분석하였다. 데이터는 FFC에 의해 수득하였다. 5AC: NS5A 키미젠™ 단백질.
도 32는 본 실시예에 기재된 바와 같이 만든 성숙되고 항원 부하된 DC로의 3회 자극 후, CD69 발현성 CD8+ T 세포 (좌측 그래프) 및 CD69 발현성 CD4+ T 세포 (우측 그래프)의 상대적 비율을 보여주는 한 쌍의 막대 그래프이다. 세포는 마지 막 자극한지 6일 후에 분석하였다. 데이터는 FFC에 의해 수득하였다. 5AC: NS5A 키미젠™ 단백질.
도 33은 본 실시예에 기재된 바와 같이 만든 성숙되고 항원 부하된 DC로의 3회 자극 후, EBV 펩티드/HLA-A2 사량체 (양성 대조군) 또는 대조군 사량체 (음성 사량체)와 결합한 항원 특이적 T 세포 수용체 (TCR)를 갖는 CD8+ T 세포 (좌측 그래프) 및 CD4+ T 세포 (우측 그래프)의 상대적 비율을 보여주는 한 쌍의 막대 그래프이다. 3개의 개개의 배양 웰로부터의 세포 (시험군 및 대조군에서의 3개 막대에 상응함)는 마지막 자극한지 6일 후에 분석하였다. 데이터는 FFC에 의해 수득하였다.
도 34는 본 실시예에 기재된 바와 같이 만든 성숙되고 항원 부하된 DC로의 3회 자극 (상이한 수의 T 세포 및 DC를 사용함) 후, NS5A 펩티드/HLA-A2 오량체와 결합한 TCR을 갖는 CD8+ T 세포의 상대적 비율을 보여주는 한 쌍의 막대 그래프이다. 3개의 개개의 배양 웰로부터의 세포 (시험군 및 대조군에서의 3개 막대에 상응함)는 마지막 자극한지 6일 후에 분석하였다. 데이터는 FFC에 의해 수득하였다. 5AC: NS5A 키미젠™ 단백질.
도 35는 미성숙 DC에 대한 NS3 키미젠™ 단백질의 2가지 상이한 농도에서의 결합을 보여주는 일련의 FFC 프로파일이다.
도 36은 CD32 및 CD206에 대해 특이적인 항체에 의한 미성숙 DC에 대한 NS3 키미젠™ 단백질의 결합 억제를 보여주는 한 쌍의 막대 그래프이다.
도 37은 NS3 키미젠™ 단백질 또는 파상풍 톡소이드 부하된 DC를 함유하는 4일 배양물 (상부 그래프) 및 7일 배양물 중에서의, CD69 발현성 CD8+ T 세포 (좌측 그래프), 및 CD69 발현성 CD4+ T 세포 (우측 그래프)의 비율을 보여주는 일련의 막대 그래프이다. 데이터는 FFC에 의해 수득하였다. 3C: NS3 키미젠™ 단백질.
도 38은 NS3 키미젠™ 단백질 또는 파상풍 톡소이드 부하된 DC를 함유하는 4일 배양물 (상부 그래프) 및 7일 배양물 중에서의, CFSElo CD8+ T 세포 (좌측 그래프) 및 CFSElo CD4+ T 세포 (우측 그래프)의 비율을 보여주는 일련의 막대 그래프이다. 데이터는 FFC에 의해 수득하였다. 3C: NS3 키미젠™ 단백질.
도 39는 본 실시예에서 NS5A 키미젠™ 단백질에 대해 기재된 바와 같이 만든 성숙되고 항원 부하된 DC로의 3회 자극 후, 모세포인 T 세포의 비율을 보여주는 한 쌍의 막대 그래프이다. 2개의 상이한 T 세포 및 2가지 상이한 DC 농도를 사용하여 자극을 수행하였다. 데이터는 FFC에 의해 수득하였다. 3C: NS3 키미젠™ 단백질.
도 40은 본 실시예에 기재된 바와 같이 만든 성숙되고 항원 부하된 DC로의 3회 자극 후, 세포내 IFN-K를 함유하는 T 세포의 비율을 보여주는 일련의 막대 그래프이다. 데이터는 FFC에 의해 수득하였다. 3C: NS3 키미젠™ 단백질.
도 41은 본 실시예에 기재된 바와 같이 만든 성숙되고 항원 부하된 DC로의 3회 자극 후, 세포내 IFN-K를 함유하는 CD8+ T 세포 (좌측 그래프) 및 CD4+ T 세포 (우측 그래프)의 비율을 보여주는 한 쌍의 막대 그래프이다. 데이터는 FFC에 의해 수득하였다. 3C: NS3 키미젠™ 단백질.
도 42는 본 실시예에 기재된 바와 같이 만든 성숙되고 항원 부하된 DC로의 3회 자극 후, 세포내 TNF-I를 함유하는 CD8+ T 세포 (좌측 그래프) 및 CD4+ T 세포 (우측 그래프)의 비율을 보여주는 한 쌍의 막대 그래프이다. 데이터는 FFC에 의해 수득하였다. 3C: NS3 키미젠™ 단백질.
도 43은 본 실시예에 기재된 바와 같이 만든 성숙되고 항원 부하된 DC로의 3회 자극 후, 과립상 단백질 GrB (좌측 그래프) 및 Pfn (우측 그래프)를 발현하는 CD8+ T 세포의 비율을 보여주는 한 쌍의 막대 그래프이다. 데이터는 FFC에 의해 수득하였다. 3C: NS3 키미젠™ 단백질.
도 44는 본 실시예에 기재된 바와 같이 만든 성숙되고 항원 부하된 DC로의 3회 자극 후, CD69 발현성 CD8+ T 세포 (좌측 그래프) 및 CD69 발현성 CD4+ T 세포 (우측 그래프)의 상대적 비율을 보여주는 한 쌍의 막대 그래프이다. 세포는 마지막 자극한지 6일 후에 분석하였다. 데이터는 FFC에 의해 수득하였다. 3C: NS3 키미젠™ 단백질.
도 45는 본 실시예에 기재된 바와 같이 만든 성숙되고 항원 부하된 DC로의 3회 자극 후, 모세포의 비율 (우측 그래프) 및 림프구 (R1 게이트 세포)의 총 수를 보여주는 한 쌍의 막대 그래프이다. 세포는 마지막 자극한지 6일 후에 분석하였다. 데이터는 FFC에 의해 수득하였다. 3C, AS60-1: NS3 키미젠™ 단백질.
도 46은 본 실시예에 기재된 바와 같이 만든 성숙되고 항원 부하된 DC로의 3 회 자극 (상이한 수의 T 세포 및 DC를 사용함) 후, NS3 펩티드/HLA-A2 오량체와 결합한 TCR을 갖는 CD8+ T 세포의 상대적 비율을 보여주는 한 쌍의 막대 그래프이다. 3개의 개개의 배양 웰로부터의 세포 (시험군 및 대조군에서의 3개 막대에 상응함)는 마지막 자극한지 5일 후에 분석하였다. 데이터는 FFC에 의해 수득하였다. 3C: NS3 키미젠™ 단백질.
도 47은 미성숙 DC에 대한 HCV 코어 NS3 키미젠™ 단백질의 3가지 상이한 농도에서의 결합을 보여주는 일련의 형광 유동 세포계수법 (FFC) 프로파일이다.
도 48은 CD32 및 CD206에 대해 특이적인 항체, 만노실화 소 혈청 알부민 (mBSA) 및 면역 IgG 단편에 의한 미성숙 DC에 대한 HCV 키미젠™ 코어 단백질의 결합 억제를 보여주는 한 쌍의 막대 그래프이다.
도 49는 본 실시예에 기재된 바와 같이 만든 성숙되고 항원 부하된 DC로의 3회 자극 후, 세포내 IFN-K를 함유하는 CD8+ T 세포 (좌측 그래프) 및 CD4+ T 세포 (우측 그래프)의 비율을 보여주는 한 쌍의 막대 그래프이다. 데이터는 FFC에 의해 수득하였다. HCV 코어-TBD: HCV 코어 키미젠™ 단백질.
도 50은 HCV 코어 키미젠™ 단백질 (HCV 코어-TBD) (우측 도트 플롯) 또는 TBD 단독 (TBD) (좌측 도트 플롯)이 부하된 DC로의 3회 자극 후, HCV 코어 펩티드/HLA-B7 사량체와 결합한 TCR을 갖는 CD8+ T 세포의 비율을 보여주는 한 쌍의 2차원적 FFC 도트 플롯이다.
A. 개요
본원에는 항원에 대항하여 면역 반응을 유도시키기 위한 조성물 및 방법이 기재되어 있다. 특정 양태에서는, 이러한 조성물 및 방법이 숙주에 의해 "자기" 항원으로서 인식되는 것과는 다른 항원에 대항한 면역 반응을 유도시킨다. 면역 반응은 면역 반응 도메인과, 항체 단편을 포함하는 표적 결합성 도메인을 포함하는 키메라 항원을 숙주 면역계에 제시함으로써 증강시킨다. 표적 결합성 도메인을 통하여, APC는 내재화되고, 프로세싱되며 키메라 항원을 제시하여 체액성 면역 반응 및 세포성 면역 반응을 유도시킨다.
HCV는 인간을 감염시켜 급성 및 만성 간염을 유발시킬 수 있는 플라비비리대 계열의 한 구성원이고, 간세포 암종을 유발시킬 수도 있다 [참고: Hoofnagle (2002) Hepatology 36:S21-S29]. HCV 게놈은 9.6 Kb의 캡핑되지 않은 양극성 단일 가닥 RNA 분자이고 복제는 음성-가닥 중간체를 통하여 일어난다 [참고: Lindenbach and Rice (2005) Nature 436:933-938]. HCV 게놈은 폴리단백질을 암호화하는 단일 개방 판독 프레임을 암호화하고, 이러한 폴리단백질을 프로세싱하면 코어 또는 캡시드 단백질 (C), 2개의 외피 당단백질 (E1 & E2), 소형 소수성 단백질 (p7), 및 6개 비구조 단백질 (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A & NS5B)이 생성된다. 이와 같이 폴리단백질을 개개의 단백질로 프로세싱하는 것은 숙주 및 바이러스성 프로테아제에 의해 촉매된다 [참고: Lohmann et al. (1996) J. Hepatol. 24:11-19, Penin et al. (2004) J. Hepatol. 24:11-19].
건강한 숙주 (인간 또는 동물)가 외래 항원 (예를 들어, 세균, 바이러스 및/또는 기생충으로부터 유래된 단백질)과 접촉하게 되면, 숙주는 정상적으로 면역 반응을 개시시킨다. 적응 면역 반응은 체액성, 세포성, 또는 둘 다일 수 있다 [참고: Whitton at al. (2004) Adv. Virus Res. 63: 181-238]. 세포성 반응은 해당 항원을 함유하는 세포를 직접 없앨 수 있는 특이적 T 조력 세포 및 T 림프구 (CTL)를 선별하고 팽창시키는 것을 특징으로 한다. 체액성 반응의 경우에는, 항체가 B 세포에 의해 생성되고, 항원성 자극에 반응하여 혈액 및/또는 림프 내로 분비된다. 항체는 그의 표면 상의 에피토프와 특이적으로 결합함으로써 항원 (예: 바이러스)를 중화시켜, 포식 세포 및/또는 보체-매개된 기전에 의해 파괴되도록 하여 감염된 세포를 용해시킨다 [참고: Carroll (2005) Nature Immunol. 5:981-986]. 조력 세포 (주로, CD4 T 세포)는 CTL (주로, CD8 T 세포) 및 B 세포-매개된 항체 반응 둘 다에 요구되는 조력인자 활성을 제공한다.
만성 바이러스성 감염증이 있는 개체에서는, 면역계가 침입하는 병원체에 대해 반응하지 않아 적응 면역 반응을 일으켜 이러한 감염증에서 회복된 것으로 하므로, 숙주는 상기 병원체에 대해 내성이 생긴다. HCV가 면역 감시를 피하기 위해 사용하는 기전이 완전히 밝혀지지 않았지만, 몇 가지 가능성이 제안되었다. 이러한 가능성으로는 유형 I IFN의 IRF3-매개된 유도를 NS3-4A, E2 및 NS5A 서열에 의해 봉쇄시켜, PKR (이중 가닥 RNA-활성화 단백질 키나제)를 차단시키는 것 뿐만 아니라 NK 세포 기능을 이용하여 HCV 단백질을 방해하는 것이 있다 [참고: Rehermann et al. (2005) Nature Rev. Immunol. 5:215-229]. 최근의 연구 결과, HCV 감염증을 제어하고 근절하는데 있어서 T 세포가 중추적 역할을 하는 것으로 밝혀졌다 [참고: Bowen et al. (2005) Nature 436:946-952; Wieland et al. (2005) J. Virol. 79:9369-9380]. 급성 HCV 감염증에서는, 바이러스-특이적 항체가 HCV 감염 후 7 내지 8주째에 탐지되긴 하였지만 [참고: Pawlotsky (1999) J. Hepatol. 31 (suppl):71-79], 항체의 역할은 명확하지 않은데, 이는 HCV 감염증이 침팬지에서 항-HCV 항체의 부재 하에서도 자연 치유될 수 있고 [참고: Cooper et al. (1999) Immunity 10:439-449] 인간에게서 혈청전환 없이도 자연 치유될 수 있기 때문인 것으로 [참고: Post et al. (2004) J. Infect. Dis. 189:1846-1855] 밝혀졌기 때문이다. 또한, 최근의 명백한 증거는 개체가 HCV에 대항하여 탐지 가능한 수준의 CD4+ 및 CD8+ T-세포 반응을 생성시키지 못하면 만성 감염증이 유발되었다고 제안하고 있다 [참고: Cooper et al. (1999) 상기 참고; Thimme et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:15661-15668; Thimme et al. (2002) J. Exp. Med. 194:1395-1406; Shoukry et al. (2003) J. Exp. Med. 197: 1645-1655]. 바이러스 복제 동안 생성된 이중 가닥 RNA에 대항한 면역 반응 및 유형 I IFN-반응 상의 전사적 변화와 같은 면역 기능의 상호 작용이 일어나는 것으로 제안되었지만, 바이러스 감염을 제거하는데 있어서의 이러한 효과에 관한 직접적인 명백한 증거는 전혀 관찰되지 않았다 [참고: Rehermann et al. (2005) 상기 참고]. HCV 감염증이 자연 치유된 환자에게서는 면역계가 강력한 다중-에피토프-특이적 CD4+ 및 CD8+ T 세포 반응을 생성시키는 반면 [참고: Rehermann et al. (2005) 상기 참고], 만성 HCV 감염증 환자에서는 T 세포 반응이 느리고, 일시적이거나 협소하게 집중되었다 [참고; Thimme et al. (2001) 상기 참고; Diepolder et al. (1995) Lancet 36: 1006-1007; Lechner et al. (2000) J. Exp. Med. 191:1499-1522].
만성 감염증을 유발시키는, HCV 항원에 대항한 강력한 T 세포 반응의 부재는 적당한 바이러스성 항원이 숙주 면역계에 적절히 제시되지 않았기 때문일 수도 있다. 해당 바이러스를 성공적으로 제거하는 것은 항원이 APC에 의해 프로세싱되고 제시하는 방식과, 조절성 T 조력 세포 및 세포독성 T 림프구 (CTL)의 연루로부터 비롯될 수 있다.
항원 제시 과정에 있어서의 주요 참가인자는 수지상 세포 (DC)인데, 이는 항원을 포획하여 프로세싱한다. 또한, DC는 림프구 공동-자극성 분자를 발현하고 림프계 기관으로 이동하여, 여기서 사이토킨을 분비하여 면역 반응을 개시시킨다. DC는 또한, 면역 매개인자인 B 및 T 림프구의 증식을 제어한다 [참고: Steinman et al. (1999) Hum. Immunol. 60:562-567]. CTL 반응이 생성되는 것은 바이러스 감염된 세포를 없애고 이로써 감염증이 자연 치유되도록 하는데 있어 중요하다.
접촉된 항원은 항원의 국재화에 따라서 APC에 의해 상이하게 프로세싱된다 [참고: Steinman et al. (1999) 상기 참고]. 외인성 항원은 APC의 엔도솜 내에서 프로세싱되고, 이로써 생성된 펩티드 단편은 주요 조직 적합성 복합체 (MHC) 부류 II 분자와 복합체를 형성한 세포의 표면 상에 제시된다. 이러한 복합체를 CD4+ T 세포에 제시하면 그들이 활성화된다. 그 결과, 조력 T 세포에 의해 분비된 사이토킨은 B 세포를 활성화시키는데 요구되는 가용성 인자를 제공하여 외인성 항원에 대항한 항체를 생성시킨다 (체액성 반응).
역으로 말하면, 세포내 항원은 프로테아솜에서 프로세싱되고, 이로써 생성되는 펩티드 단편은 APC의 표면 상에 MHC 부류 I 분자와의 복합체로서 제시된다. 이 복합체를 T 세포 수용체 (TCR)와 결합시킨 후, 항원이 CD8+ T 세포에 제시되면 CTL 면역 반응이 일어난다. CTL은 감염된 세포를 사멸시키고, 바이러스성 복제를 억제시키는 작용을 하는 인자, 예를 들어 사이토킨 인터페론-γ (IFN-γ)의 생성에 의해 바이러스를 제거할 수 있다.
바이러스는 만성 바이러스성 감염증 개체에게서 활동적으로 복제하기 때문에, 바이러스성 항원이 숙주 세포 내에서 생성되고, 분비된 항원은 순환계에 존재한다. 이들 항원이 존재함에도 불구하고, 상기 바이러스에 대항한 유효한 면역 반응이 없다. 유효한 면역 반응은 바이러스성 에피토프의 광범위한 어레이를 고 친화도로 인식할 수 있는 CTL의 생성과 관련이 있을 것이다. 따라서, 바이러스성 펩티드가 MHC 부류 I 분자의 그로브 내에 존재하기 위해서는, 바이러스성 항원을 함유하는 적당한 치료 백신이 반드시 적당한 세포성 구획 내에서 내재화되고 프로세싱되어야만 한다. 부류 I 제시 맥락에서 바이러스성 에피토프를 인식함으로써, CD8+ T 세포를 활성화 및 생성시킬 수 있고, CD8+ T 세포가 바이러스성 감염에 대항한 유효한 반응을 갖출 수 있는 기능적 CTL로 분화될 수 있게 해준다.
따라서, 바이러스성 항원을 함유하는 치료 백신은 이것이 프로테아솜성 경로를 통하여 프로세싱되고 MHC 부류 I을 통하여 제시되는 경우에는 유효할 것이다 [참고: Larsson et al. (2001) Trends Immunol. 22:141-148]. 이는 항원을 숙주 세포 내에서 생성시키거나, 또는 목적하는 세포성 반응이 유도되는 방식으로 항원을 프로세싱 및 제시하도록 적당한 세포성 구획에 전달함으로써 달성할 수 있었다. 항원을 세포내 전달하기 위한 몇 가지 접근 방식, 예를 들어 바이러스성 벡터 [참고: Lorenz et al. (2001) Hum. Gene Ther. 10:1095-1 103], DNA-형질감염된 세포의 사용 [참고: Donnelly at al. (1997) Annu. Rev. Immunol. 15:617-648] 및 주사된 DNA 벡터를 통한 항원의 발현 [참고: Lai et al. (1998) Crit. Rev. Immunol. 18:449-484]이 당해 분야의 문헌에 보고되었다.
그들의 APC 기능성을 통하여, 단구로부터 유래되는 DC는 일차 T 세포 반응을 자극하는 면역 조정인자로서의 상당한 잠재력을 지니고 있는 것으로 밝혀졌다 [참고: Banchereau et al. (1998) Nature 392:245-252]. DC는 항원을 포획하고, 프로세싱하며 효과적으로 제시할 수 있는 독특한 특성으로 인해, 치료 백신 개발에 매우 중요한 도구가 된다 [참고: Laupeze et al. (1999) Hum Immunol. 60:591-597]. 항원을 DC에 표적화시키는 것은 중요한 단계이고, 이러한 목적을 위해 모노클로날 항체 (mAb)의 Fc 영역에 대해 특이적인 DC 상에 몇 가지 수용체가 존재하는 것을 활용하였다 [참고: Regnault et al. (1999) J. Exp. Med. 189:371-380]. 이러한 접근 방식의 예에는 난소암 mAb-B43.13 [참고: Berlyn et al. (2001) Clin Immunol. 101: 276-283], 항-PSA mAb, 및 항-HBV 항체 항원 복합체 [참고: Wen et al. (1999) Int. Rev. Immunol. 18:251-258]가 포함된다. 종양 관련 항원이 부하된 DC를 사용하는 암 면역요법은 종양 특이적 면역 반응과 항종양 활성을 생성시키는 것으로 밝혀졌다 [참고: Campton et al. (2000) J. Invest. Dermatol. 115:57-61; Fong et al. (2000) Annu. Rev. Immunol. 18:245-273]. 종양 항원-펄스된 DC를 사용하는 생체내 임상 시험에서 가능성 있는 결과를 획득하였다 [참고: Tarte et al. (1999) Leukemia 13:653-663]. 이들 연구는 암 항원에 대항하여 면역 반응을 생성시킬 수 있는 DC 사용 효능을 명백히 입증해준다. 치료 백신은 숙주 면역계에 대해 내성이 있는 바이러스성 항원에 대항하여 숙주 면역 반응을 유도시킬 수 있어야만 한다. 이는 DC로의 항원 전달, 적당한 항원 제시, 및 만성 보균자에게서 치료 효과를 가져다 줄 수 있는 HCV-특이적 CD8+ T 세포의 프라이밍 (priming)과 관련이 있다.
본 발명의 키메라 항원 백신은 항체의 특이적 영역과 선택된 항원의 융합 단백질로서 생성된 신규한 부류의 재조합 "키메라 항원"이다. 분자를 이관능적으로 설계하는 것은 바이러스성 항원이 APC, 특히 DC를 표적으로 하도록 하여 선택된 항원에 대항하여 체액성 면역 반응과 세포성 면역 반응 둘 다를 유도시킨다. 그의 이량체화 형태의 HCV Chimigen™ 백신은 도 1에 도식적으로 나타내었다.
본 발명의 백신은 2개의 도메인, 즉 재조합 HCV 바이러스성 항원을 함유하는 면역 반응 도메인 (IRD)과, 모노클로날 항체의 Fc 단편을 함유하는 표적 결합성 도메인 (TBD)을 갖는다. 백신 설계는 그의 기능에 독특한 몇 가지 기능을 부여해준다. 키메라 설계는 특이적 수용체를 통한 그의 흡수를 촉진시켜 주고 적당한 항원 제시를 가져다 주는 항체-유사 구조물의 형성을 도와준다. 이는 프로테아솜성 경로를 통하여 프로세싱할 수 있고, 펩티드는 MHC 부류 I과의 복합체로서 제시되어 CTL 반응을 생성시킨다. 키미젠™ 백신은 MHC 부류 II에 의해 제시된 엔도솜성 경로를 통하여 프로세싱되어 체액성 반응을 생성시킬 수도 있다.
TBD는 특이적 APC 수용체, 예를 들어 Fcγ 수용체에 대한 키미젠™ 백신의 결합을 매개한다. 본 발명의 특별한 작용 기전에 의해 제한되는 것은 아니지만, 분자가 APC (예를 들어, 미성숙 DC) 상의 Fcγ 수용체와 결합하면 MHC 부류 I 경로를 통하여 항원이 프로세싱되는 것으로 여겨진다. 몇몇 양태에서, 이종형 TBD, 재조합 항원, 항원의 아미노 및 카복시 말단에 혼입된 다양한 길이의 링커 펩티드는 완전한 분자를 "외래"로 만들고 숙주 면역계가 융합 단백질 (HCV 항원 포함)에 대항한 다중-에피토프성 면역 반응을 갖출 수 있도록 해준다. 융합 단백질 키미젠™ 단백질은 비포유류 세포 (예: 효모 또는 곤충 세포)에서 생성될 수도 있으므로, 이들을 비포유류 방식으로 당화시킴으로써 포유류 (예: 인간) 숙주에서의 그들의 면역원성을 증강시킨다. 곤충 세포에 도입된 만노스/가성-만노스 당화로 인해, 흡수를 위해 APC 상의 만노스 수용체에 의한 백신의 흡수가 가능해진다.
따라서, 키미젠™ 백신은 특이적 Fcγ 수용체 I, II 및 III (CD64, CD32, CD16), 만노스 수용체 (CD206), 기타 C-유형 렉틴 수용체를 통하여 APC에 의해, 그리고 포식작용에 의해 내재화시킬 수 있다 [참고: Geijtenbeek et al. (2004) Annu. Rev. Immunol. 22:33-54]. 특이적 수용체를 통한 흡수, 엔도솜성 및 프로테아솜성 경로를 통한 프로세싱, 및 양 부류의 MHC 분자 상의 제시로 인해, 바이러스성 감염증을 예방할 수 있거나 바이러스 감염된 세포를 제거할 수 있는 광범위한 면역 반응이 발생할 수 있다. CTL 반응이 발생하는 것이 바이러스-감염된 세포를 없애는데 있어 결정적이다 [참고: Whitton et al. (2004) Adv. Virus Res. 63:181-238]. 만성 HBV 감염증을 치료하기 위한 바이렉스 (ViRexx) 최초의 키미젠™ 치료 백신인 헤파박스 (HepaVaxx) B는 임상전 연구에서 매우 가망 있는 결과를 보여주었다 [참고: George et al. (2003) A novel class of therapeutic vaccines for the treatment of chronic viral infections: evaluation in ducks chronically infected with duck hepatitis B virus (DHBV), in Hepdart 2003, Frontiers in Drug Development for Viral Hepatitis: December 14-18, Kauai, Hawaii, USA; George et al. (2003) A novel class of therapeutic vaccines for the treatment of chronic viral infections. International Meeting of the Molecular Biology of Hepatitis B Viruses. September 7-10, Centro Congressi Giovanni XXIII, Bergamo, Italy; George et al. (2004) Immunological Evaluation of a Novel Chimeric Therapeutic Vaccine for the Treatment of Chronic Hepatitis B Infections. (2004) International Meeting of the Molecular Biology of Hepatitis B Viruses. Woods Hole, MA, USA, October 24-27, 2004; George et al. (2005) BioProcessing Journal 4:39-45; George et al. (2006) A new class of therapeutic vaccines for the treatment of chronic hepatitis B infections. In "Framing the Knowledge of Viral Hepatitis" Schinazi, R. F. Editor, IHL Press USA].
B. 정의
본원에 사용된 용어는 (달리 표시하지 않는 한은) 다음 정의로써 표시된 의미를 갖는다.
"항체"는 B 림프계 세포에 의해 생성된 면역글로불린 분자를 지칭한다. 이들 분자는 항원과 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 지니는 것을 특징으로 하고, 각각은 다음 용어에서 정의된다.
"항체 반응" 또는 "체액성 반응"은 항체가 B 림프구에 의해 생성되고 항원성 자극에 반응하여 혈액 및/또는 림프 내로 분비되는 유형의 면역 반응을 지칭한다. 적절하게 기능하는 면역 반응에서는, 항체가 세포 표면 상의 항원 (예를 들어, 병원체)과 특이적으로 결합하여, 세포가 포식 세포, 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC) 효과기 인자, 및/또는 보체-매개된 기전에 의해 파괴되도록 한다. 항체는 또한 전신을 순환하여 자유 비리온과 결합할 수 잇다. 이러한 항체 결합은 비리온을 중화시킬 수 있고 비리온이 세포를 감염시키지 못하게 할 뿐만 아니라 신장 내에서의 여과 또는 포식 작용에 의해 숙주로부터 제거하기 위해 비리온을 표식시킨다.
"항원"은 적당한 세포와 접촉하여 유입됨에 따라 민감성 및/또는 면역 반응성 상태를 유도시키고, 생체내 또는 시험관 내에서 이와 같이 감작된 대상체의 면역 세포 및/또는 항체와 입증 가능한 방식으로 반응하는 모든 물질을 지칭한다. 따라서, 항원에는, 예를 들어 세포 또는 바이러스성 입자 및/또는 그들의 각각의 성분이 포함될 수 있다. 바이러스의 경우, 이들 성분에는 구체적으로 바이러스성 단백질이 포함된다.
"항원 제시 세포" ("APC")는 항원을 내재화하고, 항원을 프로세싱하며, 주요 조직 적합성 복합체 (MHC) 부류 I 또는 II 분자 맥락에서 항원성 에피토프를 림프구에 제시함으로써 주로 기능하는 항원-유도성 사건의 보조 세포를 지칭한다. APC와 항원 간의 상호 작용은 면역 유도에 있어 필수적 단계인데, 이는 이로써 림프구가 항원성 분자와 접촉하고 이를 인식하여 활성화될 수 있기 때문이다. 예시적 APC에는 대식 세포, 단구, 랑게르한스 (Langerhans) 세포, 서로 맞물려 있는 수지상 세포, 소포성 수지상 세포, 및 B 세포가 포함된다.
"B 세포"는 항원과 상호 작용하여 면역글로불린 (항체)을 생성시키는 특정 유형의 림프구를 지칭한다.
"CH1 영역", "CH2 영역", "CH3 영역"은 각각 항체의 중쇄 불변 도메인의 상이한 영역을 지칭한다.
"세포성 반응" 또는 "세포성 숙주 반응"은 바이러스에 의해 감염된 세포 또는 암 세포를 직접 또는 간접적으로 제거할 수 있는 특이적 조력 및 킬러 T 세포에 의해 매개된 특정 유형의 면역 반응을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "키메라 항원"은 면역 반응 도메인 (IRD)과 표적 결합성 도메인 (TBD)을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 면역 반응 도메인과 표적 결합성 도메인은 공유적 또는 비공유적 수단에 의해 직접 또는 간접적으로 연결될 수 있다.
"복합체" 또는 "항원-항체 복합체"는 항체와 항원 간의 반응 생성물을 지칭한다. 다가 항원과 함께 형성된 복합체는 수성 시스템에서 불용성인 경향이 있다.
"세포독성 T-림프구"는 바이러스성 항원을 생성시키는 감염체에 감염된 숙주 세포 및 외래 세포를 파괴시킬 수 있는 특수 유형의 림프구이다.
"에피토프"는 복잡한 항원 분자 상의 가장 간단한 형태의 항원 결졍기를 지칭하고, 이는 항체 또는 T 세포 수용체에 의해 인식되는 항원의 특이적 부분이다.
"단편"은 조화가 깨진 실체의 일부를 지칭한다. 본 발명의 맥락에서, 상응하는 실체의 일부로서의 상기 부분을 지칭하기 위해 사용할 수도 있다. 따라서, Fc 단편을 포함하는 융합 단백질은 본래의 단편과 동일한 펩티드 서열을 포함하는 재조합 분자를 지칭할 수 있다.
"융합 단백질"은 2개 이상의 암호화 서열을 합함으로써 만든 하이브리드 유전자의 발현에 의해 형성된 단백질을 지칭한다.
"힌지 영역"은 Fab 단편을 Fc 단편에 연결시켜 주는 항체 부분을 지칭하고; 이러한 힌지 영역을 2개의 중쇄를 함께 공유적으로 연결시켜 이량체 분자를 형성시키는 디설파이드 결합을 함유하고 있다.
용어 "동족체"는 상응하는 위치에서 동일하거나 유사한 화학적 잔기 서열을 가짐으로써, 또 다른 분자에 대한 상동성을 나타내는 분자를 지칭한다. "상동률 (%)"은 동일하거나 유사한 상동성 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 동일한 위치에서 뉴클레오티드 또는 아미노산 비율 (%)을 지칭한다. 예를 들어, 두 단백질 중의 80개 잔기 중에 75개가 동일한 경우, 두 단백질의 상동률은 93.75%이다. 상동률은 당업자에게 공지된 각종 소프트웨어 프로그램을 사용하여 결정할 수 있다.
"숙주"는 예를 들어, 키메라 항원을 투여할 수 있는 온혈 동물을 지칭한다.
본 발명의 맥락에서, "혼성화"는 올리고머성 화합물의 상보적 가닥의 짝짓기을 의미한다. 본 발명에서, 바람직한 짝짓기 기전은 올리고머성 화합물의 가닥의 상보적 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 염기 (핵산염기) 간의 왓슨-크릭 (Watson-Crick), 훅스틴 (Hoogsteen) 또는 역전 훅스틴 수소 결합일 수 있는 수소 결합을 포함한다. 예를 들어, 아데닌과 티민은 수소 결합 형성을 통하여 짝짓기하는 상보적 핵산염기이다. 혼성화는 다양한 상황 하에 일어날 수 있다. 폴리뉴클레오티드 맥락에서 사용된 용어 "혼성화", "혼성화하는"이란 통상적인 혼성화 조건, 바람직하게 예를 들어, 50% 포름아미드/6X SSC/0.1% SDS/100 ㎍/mL mDNA에서, 혼성화 온도 37℃ 이상 및 0.1 X SSC/0.1% SDS에서의 세척 온도 55℃ 하에 혼성화하는 것을 지칭한다.
"면역성" 또는 "면역 반응"은 항원에 대한 신체 반응을 지칭한다. 특별한 양태에서, 이는 신체가 감염성 질환에 대항하여 스스로를 보호하거나 저항할 수 있는 능력을 지칭한다.
"면역 반응 도메인 (IRD)"은 키메라 분자의 각종 형상의 항원성 부분을 지칭한다. IRD는 하나 이상의 항원 또는 하나 이상의 재조합 항원을 포함한다. 바람직한 바이러스성 항원에는 HCV 코어, HCV E1-E2, HCV E1, HCV E2, HCV P7, HCV NS3-세린 프로테아제, HCV NS4A, HCV NS4B, 및 HCV NS5A가 포함되지만, 그에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 "면역-치료 가능한 질환"이란 해당 대상체에게서 면역 반응을 유도시키거나 조정함으로써 예방, 억제 또는 경감시킬 수 있는 질환 또는 질병을 지칭한다.
"림프구"는 특이적 면역 반응을 매개하는, 예를 들어 혈액에서 발견된 핵화 세포의 서브세트를 지칭한다.
"모노클로날 항체" 또는 "mAb"는 특정 클론이나, 융합된 하이브리드 세포, 즉 하이브리도마 세포의 유전적 동질성 집단으로부터 생성된 항체를 지칭한다. 하이브리드 세포는 화학적 및 면역학적으로 동질성인, 즉 한 가지 유형의 항원 만을 인식하는 특이적 모노클로날 항체를 생산하는 세포주를 확립시키기 위해 클로닝한다.
본원에 사용된 바와 같은 "작동적으로 연결된"이란 발현 제어 서열이 관심있는 암호화 서열의 발현을 효과적으로 제어하도록 하기 위해 유전 구조물 내로 혼입된다는 것을 의미한다.
"펩티드 연쇄" 또는 "펩티드 결합"은 2개 이상의 아미노산 간의 공유 화학적 연쇄를 지칭한다. 이는 하나의 아미노산의 α-아미노기와 또 다른 아미노산의 α-카복실기 간의 치환된 아미드 연쇄이다.
"제약 부형제"는 아주반트, 담체, pH-조정제 및 완충제, 등장성 조정제, 습윤제, 방부제 등의 물질을 포함한다.
"제약상 허용 가능한"이란 인간 또는 기타 동물과 생리적으로 화합성인 비독성 조성물을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "폴리뉴클레오티드"는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드인, 모든 길이의 중합체성 형태의 뉴클레오티드를 지칭한다. 이러한 용어는 분자의 일차 구조 만을 지칭한다. 따라서, 이 용어에는 이중 가닥 및 단일 가닥 DNA 및 RNA가 포함된다. 이에는 또한, 공지된 유형의 변형물이 포함되는데, 예를 들면 당해 분야에 공지되어 있는 표지, 메틸화, "캡", 하나 이상의 천연 발생적 뉴클레오티드를 유사체로의 치환시킨 것, 뉴클레오티드간 변형물, 예를 들어 전하를 띠지 않는 연쇄물을 수반하는 것 (예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카바메이트 등) 및 전하를 띤 연쇄를 수반하는 것 (예를 들어 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 펜던트 부분, 예를 들어 단백질 (이에는 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩티드, 폴리-L-리신 등)을 함유하는 것, 삽입제 (예: 아크리딘, 프소랄렌 등)를 수반하는 것, 킬레이트제 (예: 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화적 금속 등)를 함유하는 것, 알킬화제를 함유하는 것, 변형된 연쇄 (예: 알파 아노머성 핵산 등)를 함유하는 것 뿐만 아니라 변형시키지 않은 형태의 폴리뉴클레오티드이다.
"폴리펩티드" 및 "단백질"은 상호 교환적으로 사용되고, 길이나 해독 후 변형에 상관없이 아미노산의 모든 펩티드-연결된 쇄를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 "예방"은 특정 질병 증상의 완전한 예방, 질병 증상 개시 지연, 또는 후속 발생된 질병 증상의 중증도 경감을 의미한다.
특정 질병의 "예방"은 이러한 질병 증상이 본질적으로 존재하지 않는 것을 의미한다.
"프로테아제 절단 부위"는 단백질 분해적 효소가 폴리펩티드 쇄 내의 아미노산 간의 펩티드 결합의 가수분해 (절단)를 촉매하는 부위를 지칭한다.
본 발명에서, "엄격한 혼성화 조건" 또는 "엄격한 조건"은 본 발명의 화합물이 그의 표적 서열과 혼성화하지만, 기타 서열과는 최소 수로만 혼성화하는 조건을 지칭한다.
용어 "대상체"는 모든 온혈 동물, 바람직하게 인간을 지칭한다.
"태그"는 이러한 태그를 함유하는 분자를 분리 또는 정제하기 위해 사용된 마커 또는 마커 서열을 지칭한다. 예시되는 태그에는 6xHis (즉, 6개 히스티딘 서열) 태그가 포함된다.
"T 세포"는 항원에 대한 항원-특이적 반응을 갖출 수 있고 체액성 및 세포성 면역 반응에 있어 일정 역할을 할 수 있는 특정 유형의 림프구를 지칭한다.
"표적 결합성 도메인 (TBD)"은 면역글로불린 중쇄 불변 영역의 전부 또는 일부를 지칭한다 [예를 들어, CH1 (전부 또는 일부)-CH2-CH3].
"치료적 유효량"은 항원에 대한 유효한 B 세포, 세포독성 T 림프구 (CTL) 및/또는 조력 T 림프구 (Th) 반응을 유도시키기에 충분하고, 특정 질병이나 장애의 증상 및/또는 합병증을 차단시키거나, 치유하거나 또는 적어도 부분적으로 정지 또는 느리게 하는데 충분한 작용제 (예를 들어, 키메라 항원, 또는 이러한 키메라 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드)의 양을 지칭한다. T 세포 서브세트는 B 세포의 활성화를 도와 항체를 분비시키는데 도움을 주거나 또는 또 다른 T 세포 서브세트에 도움을 주어 효과기 세포독성 T 림프구 (CTL)가 되도록 하는 사이토킨을 분비시킴으로써 T 조력 세포로서 기능한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료하는" 및 "치료"는 동물, 특히 인간에게서 키메라 항원에 의해 치료 가능한 질환의 모든 치료를 포괄하고, 이에는 (i) 해당 질환에 대한 소인이 있긴 하지만, 아직 이러한 질환이 있는 것으로 진단되지는 않은 대상체에게서 질환이 발생하지 못하게 예방하는 것; (ii) 질환을 억제, 예를 들어 질환 발생을 정지시키거나 느리게하는 것; 또는 (iii) 질환을 경감시키는 것, 예를 들어 질환 또는 그의 증상의 퇴행을 유발시키는 것이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은 "치료적"인 작용제는 질병 증상을 완전히 없애거나 질병 증상 중증도를 저하시켜 주는 작용제이다.
"이종형"은 숙주 이외의 종으로부터 유래되는 것을 의미한다. 예를 들어, 마우스 게놈으로부터 클로닝된 재조합적으로 발현된 항체는 재조합적으로 발현된 항체가 세균, 곤충, 인간 또는 마우스 세포에서 생성되었는지에 상관없이, 인간에 대해서 이종이지만, 마우스에 대해서는 그렇치 않을 것이다. 따라서, 본 발명의 키메라 항원 맥락에서 이종형 TBD (예를 들어, 이종형 항체 분자 또는 이종형 항체 단편)은 키메라 항원에 대한 것 이외의 종으로부터 유래된 TBD이다.
C. 키메라 항원
본 발명의 조성물에는 면역 반응 도메인 (IRD)과 표적 결합성 도메인 (TBD)을 포함하는 키메라 항원이 포함된다. 본 발명의 바람직한 양태에서, IRD 부분은 체액성 및/또는 T 세포 반응을 유도시킬 수 있고, 표적 결합성 부분은 APC, 예를 들어 수지상 세포와 결합할 수 있다. 본 발명의 키메라 항원은 또한, 다음 중의 한 가지 이상을 포함할 수 있다: 면역글로불린의 힌지 영역 (또는 그의 절편), 면역글로불린의 CH1 (또는 그의 절편), 펩티드 링커, 프로테아제 절단 부위, 및 정제 프로토콜에 사용하기 적합한 태그. 본 발명의 키메라 항원은 APC와 결합하여 이를 활성화시킬 수 있다. 일반적이긴 하지만, 반드시 그렇치 않게, IRD는 TBD의 N-말단이다.
본 발명의 몇몇 양태에서, 키메라 항원의 IRD에는 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 HCV 단백질 또는 하나 이상의 재조합 HCV 단백질을 포함하는 군 중에서 선택된 하나 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개) 단백질 (항원이 포함된다. 이들 단백질 간에는 본원에 기재된 링커와 같은 링커가 임의로 존재할 수 있다. 본 발명의 키메라 항원에서, 완전한 길이의 항원 보다는 오히려, 이들 항원의 면역원성 단편을 사용할 수 있다. 하나 이상의 항원이 키메라 항원에 존재하는 경우, 완전한 길이의 항원 단독, 면역원성 단편 단독, 또는 완전한 길이의 항원과 완전한 길이의 단백질의 혼합물을 사용할 수 있다.
본 발명의 키메라 항원은 단량체성이거나 (즉, 이들은 IRD 및 TBD를 포함하는 단일 단위를 함유한다), 또는 이들은 다량체성일 수 있다 (즉, 이들은 각각 IRD 및 TBD를 포함하는 다중 단위를 함유한다). 다량체는, 예를 들어 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체, 칠량체 또는 팔량체일 수 있다. 이러한 다량체에서는 개개의 단위가 동일하거나 상이할 수 있거나, 또는 몇몇은 동일하고 다른 것은 상이할 수 있다. 도 1은 이량체성 키메라 항원을 도시한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 키메라 항원의 IRD에는 하나 이상의 HCV 단백질, 또는 하나 이상의 재조합 HCV 단백질과 융합된 6xHis-펩티드가 포함된다.
본 발명의 몇몇 양태에서, 키메라 항원의 TBD는 항체 단편일 수 있다. 이러한 TBD는 관련 키메라 항원이 투여될 숙주 (대상체)와 동일한 종으로부터 유래될 수 있다. 또 다른 한편, 본 발명의 바람직한 양태에서 키메라 항원의 TBD는 숙주에 대해 이종형인 항체 단편이다. 예를 들어, 숙주가 인간인 경우, 예시되는 이종형 항체 단편은 비인간 동물 항체 단편, 예를 들어 마우스 항체 단편이다. 본 발명의 특정 양태에서, 이종형 항체 단편은 뮤린 Fc 단편을 포함한다. 본 발명의 가장 바람직한 양태에서, TBD는 이종형 Fc 단편 (또는 그의 절편), 힌지 영역 (또는 그의 절편), CH1 영역 (또는 그의 절편), 및 표적 결합성 도메인을 IRD에 연결시키는데 적합한 펩티드 연쇄를 포함한다.
본 발명은 또한, IRD를 TBD에 연결시켜 주는 연결성 분자의 사용을 포함한다. 예시되는 링커 분자에는 루이신 지퍼, 및 바이오틴/아비딘이 포함된다. (예를 들어, 융합 단백질에) 사용될 수 있는 기타 링커는 펩티드 서열이다. 이러한 펩티드 링커는 일반적으로, 길이가 약 2 내지 약 40개 아미노산 (예를 들어, 약 4 내지 10개 아미노산)이다. 예시되는 펩티드 링커에는 아미노산 서열 SRPQGGGS (서열 1)이 포함된다. 기타 링커는 당해 분야에 공지되어 있고, 일반적으로 이들이 연결시키는 영역들 간의 가요성을 고려하여 글리신 및/또는 알라닌이 풍부하다. 일반적으로, 본 발명의 키메라 항원에서 IRD와 TBD는 TBD의 항원 결합성 부분 (예를 들어, 항체 분자 또는 항체 분자의 단편)과 IRD 상의 적당한 항원성 에피토프 간의 물리적 항원-항체 상호 작용에 의해 연결되지 않는다.
한 양태에서, 본 발명의 키메라 항원은 2개의 부분, 즉 항원성 서열 (예를 들어, 바이러스성 항원(들))을 함유하는 IRD와, 이종형 Fc 단편을 함유하는 TBD를 갖는 융합 단백질이다. 이종형 뮤린 Fc 단편은 APC, 특히 수지상 세포 상의 특이적 수용체와 결합한다. 이로써, 키메라 항원의 결합성 영역은 항원 제시 세포를 특이적으로 표적으로 한다. 이때, APC의 내부 기구는 키메라 항원을 프로세싱하고 특이적 펩티드를 MHC 부류 I 및 부류 II 분자 상에 제시하여 T 세포와 접촉하고 이를 활성화시키며, 체액성 면역 반응과 세포성 면역 반응을 생성시켜 감염된 세포 또는 기타 적당한 바람직하지 못한 세포 (예: 암 세포)를 제거시킨다.
추가의 양태에서, 키메라 항원은 2개의 부분, 즉 변형된 바이러스성 항원(들), 항원성 단백질 단편 또는 펩티드, 또는 특이적 부위에 당화를 수반하는 이들, 및 당화될 수도 있는 이종형 뮤린 Fc 단편을 갖는 융합 단백질일 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 추가의 변형된 키메라 항원을 제공하는데, 여기서 항원 (IRD)은 바이오티닐화되고 TBD (예: Fc 단편)는, 예를 들어 융합 단백질형태로 아비딘 (예: 스트렙타비딘)과 접합된다. 이러한 아비딘-접합된 TBD는 폭넓은 종류의 IRD-TBD 접합체 생성을 촉진시킨다. 천연상, IRD는 아비딘과 접합될 수 있고 (예를 들어, 융합 단백질 형태로), TBD (예를 들어, Fc 단편)는 바이오티닐화될 수 있다는 것을 인지해야 한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 화학적 접합을 통한 IRD (항원)와 TBD (예: 항체 Fc 단편) 간의 연합을 제공한다.
본 발명의 특정 양태에는 분자 생물학 기술에 의해 항체 단편과 융합된 HCV의 재조합 항원의 용도, 바쿨로바이러스 (baculovirus) 발현 시스템에서 융합 단백질의 생성, 및 만성 HCV 감염증에 대항한 치료 백신으로서의 그의 용도가 포함된다. 본 발명은 광범위한 면역 반응, CTL을 포함한 Th1 반응 및 Th2 (항체) 반응을 생성하도록 하기 위해 HCV 항원을 생체내 APC에 전달하는 효율적 방법을 제공한다. 예비-선별된 바이러스성 항원 (예를 들어, 숙주 면역계에 의해 인식된 항원)의 면역원성은 이종형 항체 단편의 존재에 의해서 뿐만 아니라 곤충 세포 발현 시스템에 도입된 특이적 당화의 존재에 의해 증가될 수 있다. 항원-항체 단편 융합 단백질은 항체 성분의 존재로 인해, 면역계의 각종 세포 (예: APC), 예를 들어 수지상 세포, 대식 세포, 단구, B 세포 및 과립구 상에 존재하는 특이적 수용체와 결합할 것이다. 인간이나 동물에게 투여된 융합 단백질은 APC, 특히 DC에 의해 내재화될 것이고, 소형 펩티드로 가수분해될 것이며 세포 표면 상에 제시될 것이고, T 세포에 대한 MHC 부류 I 및/또는 MHC 부류 II 분자와 복합체를 형성한 것은 적당한 특이성의 항원 특이적 T 세포 수용체 (TCR)를 갖는다. 이러한 방식으로, 키메라 항원 (융합 단백질)은 광범위한 면역 반응을 유도시킬 수 있고 바이러스성 감염증을 없앨 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "표적 결합성 도메인 (TBD)"은 면역글로불린 중쇄 불변 영역의 전부 또는 일부를 지칭하는데, 이는 APC 상의 Fc 수용체와 결합할 수 있는 항체 단편이다. 본 발명에 따르면, TBD는 APC, 특히 수지상 세포 상의 Fc 수용체와 결합할 수 있는 단백질이고, 수용체-매개된 흡수에 의해 APC 내로 후속 수송된다. 본 발명에 따르면, Fc 단편이 존재하면 APC, 특히 DC 상의 Fc 수용체를 통한 키메라 항원의 흡수가 증대된다. 이러한 특이적 흡수를 통하여, 바이러스성 항원은 프로세싱되고 외래로서 제시되므로; 자연적으로 숙주에 의해 내성이 생겼거나 숙주에서 극히 약한 면역 반응을 유도시켰던 바이러스성 항원에 대한 면역 반응이 효과적으로 유도된다.
또한, 본 발명에 따르면 키메라 항원은 바람직하게, 대식 세포 만노스 수용체/C-유형 렉틴 수용체와 결합할 수 있다. CD206으로서 공지되기도 한 대식 세포 만노스 수용체 (MMR)는 APC (예: DC) 상에서 발현된다. 이러한 분자는 C-유형 렉틴 계열의 세포내 이입 수용체의 한 구성원이다. 만노실화 키메라 항원은 CD206에 의해 결합 및 내재화될 수 있다. 일반적으로, 외인성 항원은 주로 MHC 부류 II 경로를 통하여 프로세싱 및 제시되는 것으로 여겨진다. 그러나, CD206을 통한 표적화의 경우에는, MHC 부류 I 경로와 부류 II 경로 둘 다가 관여한다는 명백한 증거가 있다 [참고: Apostolopoulos et al. (2000) Eur. J. Immunol. 30:1714; Apostolopoulos et al. (2001) Curr. Mol. Med. 1:469; Ramakrishna et al. (2004) J. Immunol. 172:2845-2852]. 따라서, 특이적으로 CD206을 표적으로 하는 키메라 항원이 부하된 단구-유래된 수지상 세포는 강력한 부류 I-의존적 CD8+ CTL 반응과 부류 II-의존적 증식성 T 조력인자 반응 둘 다를 유도시킬 것이다 [참고: Ramakrishna et al. (2004) J. Immunol. 172(5):2845-52].
예시되는 TBD는 pFastBac HTa 발현 벡터에서 클로닝되고 곤충 세포 발현 시스템 (공급처: Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에서 발현된 바와 같은, 마우스 항-HBVsAg mAb (하이브리도마 2C12)로부터 유래된다. 이러한 TBD는 마우스 항-HBVsAg mAb의 N-말단에서부터 C-말단까지 힌지-CH2-CH3, 및 CH1의 일부 [아미노산 서열 VDKKI (서열 2)을 갖는다]로 이루어진다. 본 발명을 실시하기 위한 IgG1 분자의 불변 영역은 링커 펩티드, CH1-힌지의 일부, 및 영역 CH2 및 CH3을 함유할 수 있다. 단량체성 TBD의 힌지 영역 일부는 제2의 TBD 분자와 디설파이드 결합을 형성할 수 있다. 단백질은 6xHis 태그, 7개 아미노산 rTEV [재조합 토바코 에티 (tobacco etch) 바이러스] 프로테아제 절단 부위 및 HBV sAg에 대항하여 유도된 이종형 (뮤린) mAb (하이브리도마 2C12)의 표적화 결합성 도메인 (TBD)의 N-말단 융합물과의 N-말단 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 예시되는 TBD는 8개 아미노산 펩티드 링커, CH1 영역의 5개 아미노산, 힌지 서열, CH2 및 CH3 영역 서열, 및 임의로, 발현 벡터로부터 유래된 뉴클레오티드에 의해 암호화된 10개 부가의 아미노산의 C-말단 펩티드를 포함하는 아미노산 서열을 수반하는 2C12로부터의 IgG1 mAb의 불변 쇄 단편이다. 본원에 규정된 예시되는 TBD 단편은 HCV 바이러스로부터 유래된 항원과의 융합 단백질을 생성하기 위한 모 분자를 형성한다.
D. 신규 폴리뉴클레오티드
본 발명의 또 다른 국면은 본원에 기재된 키메라 항원 전부를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 면역 반응 도메인을 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드 부분과, 표적 결합성 도메인을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드 부분을 포함한다. 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드 부분은 동일하거나 상이한 뉴클레오티드 쇄 상에 위치할 수 있다.
본 발명의 키메라 항원의 상기 언급된 영역 이외에도, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 일반적으로, 키메라 항원을 생산하는 특정 세포 (예: 효모 또는 곤충 세포)로부터의 이의 분비를 촉진시켜 주는 리더 펩티드를 암호화하는 리더 서열을 함유한다. 관련 리더 서열은 일반적으로, 키메라 항원이 세포로부터 분비되기에 앞서 이러한 키메라 항원으로부터 절단된다. 리더 서열은 본원에 기재된 것 및 당해 분야에 공지된 것일 수 있으며, 예를 들어 곤충 세포에서 발현시키는데 유용한 뉴클레오티드 서열 ATGCCCTTGTACAAATTGTTAAACGTTTTGTGGTTGGTCGCCGTTTCTAACGCGATT (서열 38)에 의해 암호화된 아미노산 서열 MPLYKLLNVLWLVAVSNAI (서열 37)을 갖는 AcNPV 키티나제 신호 서열, 및 효모 세포 [예를 들어, 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) 효모 세포]에서 발현시키는데 유용한 알파-교배 인자 리더이다.
본 발명은 키메라 항원을 암호화하는 유전자, mRNA, 및/또는 암호화 서열, 바람직하게는 분리된 형태에 상응하거나 이에 대해 상보적인 폴리뉴클레오티드를 제공하고, 이에는 키메라 항원 변이체 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드; DNA, RNA, DNA/RNA 하이브리드, 및 키메라 항원을 암호화하는 유전자 또는 mRNA 서열 또는 그의 일부에 대해 상보적이거나 이들과의 상동률이 90% 이상인, 관련 분자, 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드; 및 키메라 항원을 암호화하는 유전자, mRNA, 또는 키메라 항원-암호화 폴리뉴클레오티드와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드가 포함된다.
부가적으로, 본 발명에는 본원에 구체적으로 기재된 키메라 항원을 암호화하는 유전자의 유사체가 포함된다. 유사체에는, 예를 들어 면역 반응을 유도시킬 수 있는 능력을 보유하고 있고, 서열 39 및 41 내지 51에 나타낸 서열에 의해 구체적으로 기재된 바와 같은 키메라 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드와의 상동률이 바람직하게 80% 이상, 보다 바람직하게 90%, 가장 바람직하게 95%인 돌연변이체가 포함된다. 전형적으로, 이러한 유사체는 단지 1 내지 10개 코돈 변화로써만 상이하다. 그의 예에는 바이러스성 항원 또는 항체 단편의 천연 아미노산 서열로부터의 소수 아미노산 변이를 수반한 폴리펩티드, 특히 보존적 아미노산 대체물이 포함된다. 보존적 대체는 그들의 측쇄와 관계가 있는 아미노산 계열 내에서 일어나는 것이다. 유전적으로 암호화된 아미노산은 일반적으로, 4개 계열로 분류된다: (1) 산성 = 아스파르테이트, 글루타메이트; (2) 염기성 = 리신, 아르기닌, 히스티딘; (3) 비극성 = 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판; 및 (4) 전하를 띠지 않는 극성 = 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신. 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신은 종종, 연합해서 방향족 아미노산으로서 분류된다. 예를 들어, 루이신을 이소루이신 또는 발린으로 분리 대체하거나, 아스파르테이트를 글루타메이트로 대체하거나, 트레오닌을 세린으로 대체하거나, 또는 특정 아미노산을 구조적으로 관련된 아미노산으로 유사하게 보존적 대체시키는 것은 생물학적 활성에 대해 중요한 효과를 나타내지 않을 것으로 예상하는 것이 합리적이다. 본원에 기재된 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖고 있지만, 면역 반응을 유도시킬 수 있는 키메라 항원의 능력에는 실질적으로 영향을 미치지 않는 소수 아미노산 치환을 보유하고 있는 폴리펩티드 분자가 키메라 항원의 정의 내에 포함된다. 유도체에는 기타 키메라 항원 분자와의 응집성 접합체, 및 관련이 없는 화학적 부분과의 공유적 접합체가 포함된다. 공유적 유도체는 키메라 항원 아미노산 쇄 또는 당해 분야에 공지된 수단에 의해 N- 또는 C-말단 잔기에서 발견되는 기에 작용기를 연계함으로써 제조된다.
아미노산 약어가 다음 표 1에 제공된다.
아미노산 약어
알라닌 Ala A
아르기닌 Arg R
아스파라긴 Asn N
아스파르테이트 Asp D
시스테인 Cys C
글루타메이트 Glu E
글루타민 Gln Q
글리신 Gly G
히스티딘 His H
이소루이신 Ile I
루이신 Leu L
리신 Lys K
메티오닌 Met M
페닐알라닌 Phe F
프롤린 Pro P
세린 Ser S
트레오닌 Thr T
트립토판 Trp W
티로신 Tyr Y
발린 Val V
보존적 아미노산 치환은 특정 단백질의 입체 형태나 기능을 변경시키지 않으면서도 이러한 단백질 내에서 만들어질 수 있다. 본 발명에 유용한 단백질은 15개 이하 (예를 들어, 14; 13; 12; 11; 10; 9; 8; 7; 6; 5; 4; 3; 2; 또는 1개 이하) 보존적 치환을 포함할 수 있다. 이러한 변화에는 기타 소수성 아미노산을 이소루이신 (I), 발린 (V), 및 루이신 (L)으로 대체시키고; 글루탐산 (E)을 아스파르트산 (D)으로 대체시키고, 그 반대로도 가능하며; 아스파라긴 (N)을 글루타민 (Q)으로 대체시키고, 그 반대로도 가능하며; 트레오닌 (T)을 세린 (S)으로 대체시키고, 그 반대로도 가능하다. 기타 치환은 특별한 아미노산의 환경 및 단백질의 3차원적 구조 내에서의 그의 역할에 따라서 보존적인 것으로 간주될 수도 있다. 예를 들어, 글리신 (G)과 알라닌 (A)은 알라닌 (A)와 발린 (V)의 경우 처럼, 종종 상호 교환가능할 수 있다. 비교적 소수성인 메티오닌 (M)은 종종 루이신 및 이소루이신과 상호 교환될 수 있고, 종종 발린과 상호 교환될 수 있다. 리신 (K)과 아르기닌 (R)은 아미노산 잔기의 실재적 특징이 그의 전하에 있고 이들 두 아미노산 잔기의 상이한 pK가 중요하지 않은 위치에서는 종종 상호 교환 가능하다. 또한 기타 변화들이 특별한 환경 하에서 "보존적"인 것으로 간주될 수 있다 [참고: 예를 들어, Biochemistry 4 th Ed., Lubert Stryer ed. (W. H. Freeman and Co.), pages 18-23; Henikoff et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:10915-10919; Lei et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:11882-11885].
부가의 유사한 폴리뉴클레오티드에는, 예를 들어 관련 키메라 항원의 용해도를 증가시키는 작용을 하는 모든 IRD 및/또는 모든 TBD 내에서의 하나 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 또는 20개)의 부가 또는 결실을 수반한 것이 포함된다. 이러한 부가 또는 결실은 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 키메라 항원 내의 1개 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100개 이상) 아미노산 (및 폴리뉴클레오티드 그 자체 중의 뉴클레오티드의 상응하는 수)일 수 있다.
본 발명에는 또한, 키메라 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 선택적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 바람직하게, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 엄격한 조건 하에, 서열 39 및 41 내지 51에 나타낸 서열 세트 중의 하나 이상과 혼성화할 것이다. 혼성화 반응의 엄격도는 당업자에 의해 용이하게 결정 가능하고, 일반적으로 프로브 길이, 세척 온도 및 염 농도에 따르는 실험적 계산이다. 일반적으로, 프로브가 더 길수록 적당한 어닐링을 위한 온도가 더 높아야 하는 반면, 프로브 길이가 더 짧을 수록 보다 저온이 필요하다. 혼성화는 일반적으로, 상보적 가닥이 그들의 융접 아래 환경 하에 존재하는 경우에 변성 핵산 서열을 재어닐링시킬 수 있는 능력에 좌우된다. 프로브와 혼성화 가능한 서열 간의 목적하는 상동률이 더 높을 수록, 사용될 수 있는 상대적 온도는 더 높아진다. 그 결과, 보다 높은 상대적 온도는 혼성화 조건을 보다 엄격하게 만드는 경향이 있는 반면, 보다 낮은 온도는 엄격도를 덜 하게 하는 경향이 있다. 혼성화 반응의 엄격도에 관한 부가의 상세 내역과 설명은, 예를 들어 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (⒞1995, as Supplemented April 2004, Supplement 66) at pages 2.9.1-2.10.8 and 4.9.1-4.9.13].
본원에 정의된 바와 같은 "엄격한 조건" 또는 "고도로 엄격한 조건"은 (1) 세척을 위한 고온 및 저 이온 강도, 예를 들어 50℃ 하에 0.015 M 염화나트륨/0.0015 M 나트륨 시트레이트/0.1% 나트륨 도데실 설페이트를 이용하거나; (2) 혼성화 동안, 변성제 (예: 포름아미드), 예를 들어 42℃ 하에 750 mM 염화나트륨, 75 mM 나트륨 시트레이트를 이용하여 pH 6.5에서 0.1% 소 혈청 알부민/0.1% 피콜 (Ficoll)/0.1% 폴리비닐피롤리돈/50 mM 인산나트륨 완충제를 수반한 50% (v/v) 포름아미드를 이용하거나; 또는 (3) 42℃ 하에 50% 포름아미드, 5X SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M 나트륨 시트레이트), 50 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 0.1% 피로인산나트륨, 5X 덴하르츠 (Denhardt's) 용액, 초음파 처리시킨 연어 정액 DNA (50 ㎍/mL), 0.1% SDS, 및 10% 덱스트란 설페이트를 이용하고, 42℃ 하에 0.2X SSC (염화나트륨/나트륨 시트레이트) 및 55℃ 하에 50% 포름아미드에서 세척한 후, 55℃ 하에 EDTA를 함유하는 0.1X SSC로 이루어진 고 엄격도 세척을 수행하는 조건 (이로써 제한되지는 않는다)에 의해 확인된다. "적당한 수준으로 엄격한 조건"은 문헌 [참고: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2 nd Ed., New York: Cold Spring Harbor Press, 1989]에 기재되어 있고, 이에는 상기 언급된 것 보다는 덜 엄격한 세척 용액 및 혼성화 조건 (예: 온도, 이온 강도 및 % SDS)을 사용하는 것이 포함된다. 적당한 수준으로 엄격한 조건의 한 예는 20% 포름아미드, 5X SSC (150 mM NaCl, 15 mM 삼나트륨 시트레이트), 50 mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5X 덴하르츠 용액, 10% 덱스트란 설페이트, 및 20 mg/mL 변성되고 전단된 연어 정액 DNA를 포함하는 용액 중에서 37℃ 하에 밤새 항온 배양한 다음, 약 37 내지 50℃ 하에 1X SSC 중에서 필터를 세척하는 것이다. 당업자는 프로브 길이 등의 인자들을 수용하는데 필요한 만큼 온도, 이온 강도 등을 어떻게 조정할 수 있는지를 인식할 것이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드의 양태에는 서열 40 및 52 내지 62에 나타낸 바와 같은 서열 중에서 선택된 서열을 갖는 키메라 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 포함되는데, 키메라 항원의 뉴클레오티드 서열은 T 뉴클레오티드가 U 뉴클레오티드로 치환되는 것을 제외하고는 서열 39 및 41 내지 51에 나타낸 바와 같은 서열 중에서 선택된다. 예를 들어, 키메라 항원 뉴클레오티드는 제한없이 다음을 포함한다:
(a) 서열 39 및 41 내지 51에 나타낸 바와 같은 서열 중에서 선택된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리뉴클레오티드 (여기서, T는 U일 수도 있다);
(b) 그의 서열이, 서열 39 및 41 내지 51에 나타낸 바와 같은 서열 중에서 선택된 서열과의 상동률이 80% 이상인 폴리뉴클레오티드;
(c) 그의 서열이, 본원에 기재된 플라스미드에 함유된 DNA에 의해 암호화되는 키메라 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
(d) 그의 서열이, 서열 40 및 52 내지 62에 나타낸 바와 같은 서열 중에서 선택된 서열인 키메라 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
(e) 그의 서열이, 서열 40 및 52 내지 62에 나타낸 바와 같은 서열 중에서 선택되는 전체 아미노산 서열과의 동일률이 90% 이상인 키메라 항원 관련 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
(f) (a) 내지 (e) 중의 어느 하나의 폴리뉴클레오티드에 대해 완전히 상보적인 폴리뉴클레오티드;
(g) 엄격한 조건 하에 (a) 내지 (f)의 폴리뉴클레오티드와 선택적으로 혼성화되는 폴리뉴클레오티드; 및
(h) 서열 39 및 41 내지 51에 나타낸 바와 같은 서열 중에서 선택된 서열을 포함하거나 이로 이루어지지만, IRD (예를 들어, 본원에 열거된 HCV 단백질) 및 TBD 이외의 서열 중의 전부 또는 몇몇이 결여되고, 임의로, 예를 들어 하나 이상의 대체 링커 및/또는 대체 분비 (리더) 펩티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드.
또한, 부가의 서열 (예를 들어, TBD의 C 말단에서 아미노산을 암호화하는 벡터-유래된 서열)이 본 발명의 폴리뉴클레오티드로부터 결실될 수 있다. 이러한 부가의 서열은 1 내지 15개 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14개) 아미노산을 암호화하는 것일 수 있다.
본 발명은 또한, 키메라 항원 폴리뉴클레오티드, 그의 유사체 또는 동족체를 함유하는 재조합 DNA 또는 전사된 RNA 분자, 예를 들어 파아지, 플라스미드, 파아지미드, 코스미드, YAC (효모 인공 염색체), BAC (세균 인공 염색체) 뿐만 아니라 당해 분야에 널리 공지된 각종 바이러스성 및 비바이러스성 벡터; 및 이러한 재조합 DNA 또는 RNA 분자로 형질전환 또는 형질감염시킨 세포를 제공한다. 상기 분자를 생성시키는 방법은 널리 공지되어 있다 [예를 들어, Sambrook et al., 1989, 상기 참고].
본 발명은 추가로, 적합한 원핵 또는 진핵 숙주 세포 내에, 키메라 항원 폴리뉴클레오티드, 그의 유사체 또는 동족체를 함유하는 재조합 DNA 분자를 포함하는 숙주-벡터 시스템을 제공한다. 적합한 진핵 숙주 세포의 예에는 효모 세포, 식물 세포, 또는 동물 세포, 예를 들어 포유류 세포 또는 곤충 세포 [예를 들어, 바쿨로바이러스-감염 가능한 세포, 예를 들면 Sf9, Sf21, expresSF+®, 드로소필라 (Drosophila) S2 또는 High Five™ 세포]가 포함된다. 적합한 포유류 세포의 예에는 각종 전립선 암 세포주, 예를 들어 DU145 및 TsuPrl, 기타 형질감염 가능한 또는 형질도입 가능한 전립선 암 세포주, 일차 세포 (PrEC) 뿐만 아니라 재조합 단백질의 발현을 위해 통상적으로 사용되어 온 수 많은 포유류 세포 (예: COS, CHO, 293, 293T 세포)가 포함된다. 보다 특히, 키메라 항원, 또는 그의 단편, 유사체 또는 동족체의 암호화 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 사용하여, 당해 분야에서 통상적으로 사용되고 있고 널리 공지된 수 많은 숙주-벡터 시스템을 이용하여 그의 키메라 항원을 생성시킬 수 있다.
그의 키메라 항원을 발현시키는데 적합한 광범위한 숙주-벡터 시스템이, 예를 들어 다음 문헌으로부터 이용 가능하다 [참고: 예를 들어, Sambrook et al., 1989, 상기 참고; Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, 1995, 상기 참고]. 곤충 세포 발현에 바람직한 벡터에는 전이 벡터 플라스미드 pFastBac HTa (공급처: Invitrogen)가 포함되지만, 그에 제한되지 않는다. 이러한 전이 벡터 플라스미드를 사용하여, 재조합 바쿨로바이러스를 곤충 세포에서 생성시킬 수 있고, 이들을 사용하여 몇 가지 곤충 세포주, 예를 들어 Sf9, Sf21, expresSF+®, 드로소필라 S2 또는 High Five™ 세포를 감염시켜 키메라 항원을 발현시킬 수 있다. 이의 한 예가 Bac 대 Bac 바쿨로바이러스 발현 시스템 (공급처: Invitrogen)이다. 또 다른 한편, 바람직한 효모 발현 시스템에는 삭카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae), 쉬조삭카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris), 및 피치아 아우구스트 (Pichia august)가 포함된다. 본 발명의 숙주-벡터 시스템은 키메라 항원을 생성시키는데 유용하다.
키메라 항원 또는 그의 유사체 또는 동족체는 세포 (예: 곤충 세포)를, 적당한 프로모터 (예: 곤충 세포 프로모터)를 함유하고 키메라 항원을 암호화하는 플라스미드 구조물로 안정적으로 형질감염시킴으로써 생성시킬 수도 있다. 예를 들어, 키메라 항원 또는 그의 유사체 또는 동족체를 암호화하는 재조합 플라스미드 pMIB-V5 (공급처: Invitrogen)가 Sf9 곤충 세포의 안정한 형질감염을 위해 사용될 수 있다. 키메라 항원 또는 관련 단백질이 Sf9 세포에서 발현되고, 표준 정제 방법을 사용하여 키메라 항원을 분리한다. 당해 분야에 널리 공지된 각종의 기타 발현 시스템을 이용할 수도 있다. 동일 프레임 내에서 키메라 항원 암호화 서열과 결합된 리더 서열을 암호화하는 발현 구조물이, 분비된 형태의 키메라 항원을 생성시키기 위해 사용될 수 있다.
본원에 논의된 바와 같이, 유전자 암호 상의 중복성으로 인해, 키메라 항원 유전자 서열 상의 변이가 생긴다. 특히, 특이적 숙주 종은 종종, 특이적 코돈 선호도를 지니고 있으므로, 목적하는 숙주에 대해 바람직한 것으로서 기재된 서열을 적응할 수 있는 것으로 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 선호되는 유사한 코돈 서열은 전형적으로, 보다 고 빈도 코돈으로 대체시킨 희귀한 코돈 (즉, 목적하는 숙주의 공지된 서열에서의 활용 빈도가 약 20% 미만인 코돈)을 갖는다. 특이적 종에 대한 코돈 선호도는, 예를 들어 인터넷, 예를 들어 전세계적 웹 URL www.kazusa.or.jp/codon 상에서 입수 가능한 코돈 활용 표를 이용함으로써 계산한다.
세포성 숙주에서의 단백질 발현을 증강시키는 부가의 서열 변형이 공지되어 있다. 이에는 가짜 폴리아데닐화 부위, 엑손/인트론 스플라이스 부위 신호, 트랜스포손 (transposon)-유사 반복 서열, 및/또는 유전자 발현에 해로운 기타 널리 규명된 서열을 암화하는 서열을 제거하는 것이 포함된다. 숙주 세포에서 발현된 공지된 유전자를 참고로 하여 계산한 바와 같이, 소정의 세포성 숙주에 대한 평균 수준이 되도록 서열의 GC 함량을 조정한다. 가능한 경우, 예측된 헤어핀 이차 mRNA 구조를 피하도록 서열을 변형시킨다. 기타 유용한 변형에는 다음 문헌에 기재된 바와 같이, 개방 판독 프레임 개시시 해독 개시 컨센서스 서열을 부가하는 것이 포함된다 [참고: Kozak (1989) Mol. Cell Biol. 9:5073-5080]. 당업자는 진핵성 리보솜이 5' 근접 AUG 코돈에서만 해독을 개시한다는 일반적 규칙이 아주 드문 조건 하에서만 폐기된다는 것을 이해하고 있다 [참고: 예를 들어, Kozak (1995) Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:2662-2666; Kozak (1987) Nucl. Acids Res. 15:8125-8148].
각각 다음에 열거된 플라스미드 중의 하나로 형질전환시킨 에스케리챠 콜라이 (Escherichia coli) 클론은 부다페스트 조약 하에 캐나다 국제 기탁 기관 (IDAC) [1015 Arlington Street Winnipeg, Manitoba, R3E 3R2 Canada (telephone no.: (204) 789-6030; facsimile no.: (204) 789-2018)]에 2006년 10월 11일자로 기탁되었다. 각 클론은 표시된 IDAC 승인 번호로써 용이하게 확인된다.
플라스미드 IDAC 승인 번호
pFastBacHTa-gp64 HCV NS3mutS-TBD 111006-01
pFastBacHTa-gp64 HCV NS3mut-TBD 111006-02
pFastBacHTa-gp64 NS3-NS5A-TBD 111006-03
pFastBacHTa-gp64 HCV NS5A-TBD 111006-04
pFastBacHTa HCV NS3mut-TBD 111006-05
pFastBacHTa HCV NS3-NS4B-NS5A-TBD 111006-06
IDAC에 기탁된 샘플은 본원 출원일에 앞서 바이렉스 메디칼 코포레이션 (ViRexx Medical Corporation)에 의해 유지된 바와 동일한 기탁물로부터 취한 것이다. 이 기탁물은 어느 것이 보다 길든지 간에, 30년 동안, 또는 가장 최근의 요청 후 5년 동안, 또는 특허 유효 기간 동안, IDAC 기탁 기관에 제한 없이 유지될 것이며, 이 기간 동안 기탁물이 생존하지 않을 경우에는 대체시킬 것이다.
E. 본 발명의 제약 조성물
본 발명의 한 국면은 제약상 허용 가능한 부형제와, 면역 반응 도메인 및 표적 결합성 도메인을 포함하는 키메라 항원을 포함하는 제약 조성물에 관한 것이며, 상기 표적 결합성 도메인은 항체 단편을 포함한다. 치료 적용에서는, 상기 제약 조성물을, 항원에 대한 유효한 B 세포, 세포독성 T 림프구 (CTL) 및/또는 조력 T 림프구 (Th) 반응을 유도시키기에 충분하고, 감염증을 예방하거나 감염증 증상 및/또는 합병증을 치유하거나 또는 적어도 부분적으로 정지 또는 느리게 하기에 충분한 양으로 특정 대상체에게 투여할 수 있다. 이러한 용도에 유효한 양은, 예를 들어 투여된 특별한 조성물, 투여 방식, 치료하고자 하는 질병의 병기 및 중증도, 대상체의 체중 및 일반적 건강 상태, 및 처방 전문의의 판단에 좌우된다.
(키메라 항원을 이용하여) 초기 치료적 면역시키기 위한 투여량은 일반적으로, 단위 투여량 범위 내에 존재하는데, 하한치는 약 1, 5, 50, 500, 또는 1,000 ng이고 상한치는 약 10,000; 20,000; 30,000; 또는 50,000 ㎍이다. 인간에 대한 투여량은 대상체 70 킬로그램당 전형적으로 약 500 ng 내지 약 50,000 ㎍의 범위이다. 수 일 내지 수 개월에 걸친 부스팅 섭생에 따라서 키메라 항원 약 1.0 ng 내지 약 50,000 ㎍의 부스팅 투여량을 대상체의 반응과 상태에 따라서 투여할 수 있다. 적어도 임상 증상 또는 실험실 시험이 해당 질환이 예방되었거나, 정지되었거나, 느리게 되었거나 또는 없어졌고, 그 후 일정 기간 동안 그 상태를 유지하였다는 것을 나타낼 때까지는 투여를 지속해야 한다. 투여량, 투여 경로, 및 투약 스케쥴은 당해 분야에 공지된 방법론에 따라서 조정한다.
인간 단위 용량 형태의 키메라 항원은 전형적으로, 인간 단위 용량의 허용 가능한 담체 (한 양태에서는, 수성 담체)를 포함하는 제약 조성물에 포함되고, 상기 폴리펩티드를 인간에게 투여하는데 유용한 것으로 당업자에게 공지되어 있는 용적/용량으로 투여한다 [참고: 예를 들어, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, A. Gennaro, Editor, Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, Md., 2000]. 당업자가 인지하는 바와 같이, 각종 요인들이 특별한 경우에 이상적 용량에 영향을 미칠 수 있다. 이러한 요인에는, 예를 들어 키메라 항원의 반감기, 키메라 항원의 결합 친화도, 조성물의 면역원성, 목적하는 정지 상태 농도 수준, 투여 경로, 치료 횟수, 및 본 발명의 치료 방법과 병용해서 사용된 기타 작용제의 영향력 뿐만 아니라 특별한 대상체의 건강 상태가 포함된다.
일반적으로, 키메라 항원에 대한 면역 반응을 유도시키기에 충분한 키메라 항원을 대상체에게 투여한다. TBD는 키메라 항원이 APC, 예를 들어 DC 상의 특이적 수용체를 표적으로 하도록 한다. 키메라 항원은 항원 제시 경로를 통하여 내재화 및 프로세싱하여 체액성 면역 반응 뿐만 아니라 세포성 면역 반응을 유도시킨다.
특정 양태에서, 본 발명의 조성물은 중증의 질병 상태, 즉 생명에 위협이 되거나 잠재적으로 생명에 위협이 되는 상황에 이용된다. 이러한 경우, 본 발명의 바람직한 조성물 중의 키메라 항원의 상대적 비독성 특성의 결과로서, 치료 담당의는 언급된 투여량과 비교해서 상당히 과량의 이들 키메라 항원을 투여하는 것이 가능하고 이렇게 하는 것이 바람직하다고 느낄 수 있다.
제약 조성물 중의 본 발명의 키메라 항원의 농도는 광범위할 수 있는데, 즉 약 0.1 중량% 미만, 통상적으로 약 2 중량% 이상에서부터 20 중량% 내지 50 중량% 정도로 많을 수 있으며, 선택된 특별한 투여 방식에 따라서 체액 용적, 점도 등에 의해 주로 선택될 것이다.
제약 조성물은 당해 분야에 공지된 모든 경로, 예를 들어 비경구, 수막강내, 혈관내, 정맥내, 근육내, 경피, 피내, 피하, 비내, 국소, 경구, 직장, 질내, 폐 또는 복강내 경로를 통하여 전달할 수 있다. 바람직하게, 조성물은 비경구 경로, 예를 들어 피하 또는 피내 투여에 의해 전달된다.
제약 조성물은 목적하는 키메라 항원을 의도한 투여 경로에 적합한 적당한 비히클과 혼합함으로써 제조할 수 있다. 본 발명의 제약 조성물을 만드는데 있어서, 키메라 항원은 통상적으로 부형제와 혼합하거나, 부형제에 의해 희석하거나, 또는 캡슐, 향낭, 종이 또는 기타 용기 형태일 수 있는 담체 내에 봉입한다. 제약상 허용 가능한 부형제가 희석제로서 작용하는 경우, 이는 치료제에 대한 비히클, 담체 또는 매질로서 작용하는 고형, 반고형 또는 액상 물질일 수 있다. 따라서, 조성물은 정제, 환제, 산제, 로젠지, 향낭, 교갑, 엘릭서제, 현탁제, 에멀션, 용제, 시럽, 에어로솔 (고형물로서 또는 액상 매질 중에서), 키메라 항원을 10 중량% 이하 함유하는 연고, 연질 및 경질 젤라틴 캅셀제, 좌제, 멸균성 주사 용제, 및 멸균성 패키지된 산제 형태일 수 있다.
적합한 부형제의 몇몇 예에는 덱스트로스, 슈크로스, 글리세롤, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 검, 인산칼슘, 알지네이트, 트라가칸드, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 멸균성 수, 시럽 및 메틸 셀룰로스가 포함되지만, 그에 제한되지 않는다. 제형은 부가적으로, 윤활제, 예를 들어 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 및 광유; 습윤제; 유화제 및 현탁제; 방부제, 예를 들어 메틸- 및 프로필히드록시-벤조에이트; 감미제; 및 향미제를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 당해 분야에 공지된 과정을 이용함으로써 대상체에게 투여한 후 키메라 항원의 신속, 지속 또는 지연 방출을 제공하도록 제형화할 수 있다 [참고: 예를 들어, Remington, 상기 참고, at pages 903-92 and pages 1015-1050].
정제와 같은 고형 조성물을 제조하기 위해서는, 키메라 항원을 제약 부형제와 혼합하여 본 발명의 키메라 항원의 균질한 혼합물을 함유하는 고형 예비제형 조성물을 형성시킨다. 이들 예비제형 조성물을 균질한 것으로서 지칭하는 경우, 이는 키메라 항원이 조성물 전반에 걸쳐 골고루 분산되어 이 조성물이 동등하게 유효한 단위 투여 형태 (예를 들어, 정제, 환제 및 캅셀제)로 용이하게 세분될 수 있도록 하는 것을 의미한다.
본 발명의 정제 또는 환제는 피복시키거나 달리 화합시켜 작용 연장의 이점을 부여해 주는 투여 형태를 제공할 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 환제는 내부 투여 성분과 외부 투여 성분을 포함할 수 있는데, 후자는 전자에 비해 외피 형태이다. 이들 두 성분은 위에서 붕해되는 것을 막아주고 내부 성분이 십이지장 내로 본래의 상태로 통과할 수 있게 해주거나 방출을 지연시켜 주는 작용을 하는 장내 층에 의해 격리된다. 이러한 장내 층 또는 피복재에 각종 물질을 사용할 수 있는데, 이러한 물질에는 수 많은 중합체성 산, 및 중합체성 산과 셀락, 세틸 알코올 및 셀룰로스 아세테이트와 같은 물질의 혼합물이 포함된다.
본 발명의 신규 조성물을 경구 투여를 위해 또는 주사에 의해 혼입시킬 수 있는 액상 형태에는 수성 용제, 적합하게는 향미 시럽, 수성 또는 오일 현탁제, 및 식용 오일 (예를 들어, 옥수수유, 면실유, 참깨유, 코코넛 오일 또는 땅콩유)이 부가된 향미 에멀션 뿐만 아니라 엘릭서제 및 유사한 제약 비히클이 포함된다.
비경구 투여용 조성물을 제조하는데 있어서는, 자극을 감소시키기 위해 등장성 조정하는데 엄격한 관심을 기울여야 한다. 재구성 가능한 조성물은 건조 형태로 패키징된 멸균성 고형물이다. 재구성 가능한 조성물이 바람직한데, 이는 즉시 투여할 수 있는 용제 형태 보다는 오히려 무수 고형물로서 저장되는 경우에 보다 안정적이기 때문이다. 무수 고형물은 통상적으로, 이러한 고형물이 최적의 습도 범위 하에 유지되도록 해주는 부틸 고무 마개가 있는 멸균성 용기 내에 패키징한다. 재구성 가능한 무수 고형물은 건조 충전, 분무 건조 또는 동결 건조 방법에 의해 형성시킨다. 이들 방법에 관한 기재 내용은 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: Remington, 상기 참고, at pages 681-685 and 802-803].
비경구 주사용 조성물은 일반적으로 묽고, 보다 높은 비율로 존재하는 성분은 비히클이다. 이러한 비히클은 통상적으로, 치료 활성이 전혀 없고 무독성이지만, 키메라 항원을 흡수에 적당한 형태로 체내 조직에 제시해준다. 흡수는 통상적으로, 키메라 항원이 수성 용액으로서 제시되는 경우에 가장 신속하고도 완전하게 일어날 것이다. 그러나, 비히클을 수 혼화성 액상물로 변형시키거나 수 불혼화성 액상물로 치환시키는 것은 흡수율에 영향에 미칠 수 있다. 바람직하게, 본 조성물에 가장 유용한 비히클은 등장성 식염수이다. 주사용으로 적합한 조성물을 제조하는데 있어서, 수성 비히클, 수 혼화성 비히클, 및 비수성 비히클을 사용할 수 있다.
조성물의 질을 개선시키거나 보호해 주는 부가의 물질이 본 발명의 주사용 조성물에 포함될 수 있다. 따라서, 부가 물질은 용해도에 영향을 미칠 수 있거나, 대상체에게 편안함을 제공해줄 수 있거나, 화학적 안정성을 증강시킬 수 있거나, 또는 미생물 성장으로부터 해당 제제를 보호해줄 수 있다. 따라서, 조성물은 적당한 가용화제, 항산화제로서 작용하는 물질, 및 미생물의 성장을 방지시키는 방부제로서 작용하는 물질을 포함할 수 있다. 이들 물질은 그들의 기능에 적당한 양으로 존재하지만, 조성물의 작용에 불리한 영향을 미치지 말아야 할 것이다. 적당한 항미생물제의 예에는 티메로살, 벤제토늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드, 페놀, 메틸 p-히드록시벤조에이트, 및 프로필 p-히드록시벤조에이트가 포함된다. 적당한 항산화제는 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: Remington, 상기 참고, at p. 1015-1017].
특정 양태에서는, 리포솜, 나노캡슐, 미소입자, 지질 입자, 소포 등이 본 발명의 키메라 항원을 투여하는데 사용된다. 특히, 본 발명의 조성물은 지질 입자, 리포솜, 소포, 나노구 또는 나노입자 등에 피막화된 상태로 전달되도록 제형화할 수 있다. 또 다른 한편, 본 발명의 조성물은 이러한 담체 비히클의 표면과 공유적 또는 비공유적으로 결합할 수 있다.
리포솜을 통하여 투여된 조성물은 1) 키메라 항원이 특별한 조직, 예를 들어 림프계 조직을 표적으로 하도록 하거나; 2) APC를 선택적으로 표적으로 하도록 하거나; 3) 부가의 자극성 또는 조절성 분자를 운반하거나; 또는 4) 키메라 항원 조성물의 반감기를 증가시키는 작용을 할 수도 있다. 리포솜에는 에멀션, 발포체, 미셀, 불용성 단층, 액상 결정, 인지질 분산제, 적층식 층 등이 포함된다. 이들 제제에서는, 전달하고자 하는 키메라 항원을 리포솜의 일부로서 단독으로 혼입시키거나, 또는 림프계 세포에 우세한 수용체와 결합하는 분자, 예를 들어 CD45 항원과 결합하는 모노클로날 항체와 연계하거나 또는 기타 치료 또는 면역원성 조성물과 연계해서 리포솜의 일부로서 혼입시킨다. 따라서, 본 발명의 목적하는 키메라 항원이 충전되었거나 이로 장식한 리포솜은 림프계 세포 부위를 향해 갈 수 있는데, 이때 리포솜이 키메라 항원을 전달한다. 본 발명에 따라서 사용하기 위한 리포솜은 표준 소포-형성성 지질로부터 형성되는데, 이에는 일반적으로 중성 및 음전하를 띤 인지질 및 스테롤 (예: 콜레스테롤)이 포함된다. 지질의 선택은 일반적으로, 리포솜 크기, 목적하는 투여 경로 (예를 들어, 혈류내)에 대한 리포솜의 산 불안정성 및 안정성을 고려하여 이루어진다. 리포솜을 제조하기 위한 각종 방법이 이용 가능하다 [참고: Szoka et al. (1980) Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467-508; 및 미국 특허 제4,235,871호, 제4,501,728호, 제4,837,028호, 및 제5,019,369호]. 키메라 항원을 함유하는 리포솜 현탁제는, 특히 투여 방식, 전달하고자 하는 키메라 항원, 및 치료하고자 하는 질병의 병기에 따라서 다양한 용량으로, 정맥내, 국소, 국부 등으로 투여할 수 있다.
흡입용 조성물에는 제약상 허용 가능한 수성 또는 유기 용매 또는 그의 혼합물 중의 용제 및 현탁제, 및 산제가 포함된다. 액상 또는 고형 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 적합한 제약상 허용 가능한 부형제를 함유할 수 있다. 이러한 조성물은 국소 또는 전신 효과를 위해 경구 또는 비내 호흡기 경로에 의해 투여할 수 있다. 제약상 허용 가능한 용매 중의 조성물은 불활성 기체를 사용함으로써 분무시킬 수 있다. 분무된 용액은 분무 장치로부터 직접 흡입될 수 있거나, 또는 분무 장치에 안면마스크 텐트, 또는 간헐적 양성 압력 호흡 기계를 부착시킬 수 있다. 용제, 현탁제 또는 산제 조성물은 이러한 제형을 적당한 방식으로 전달해 주는 장치로부터, 바람직하게 경구 또는 비내 투여할 수 있다.
본 발명의 방법에 이용된 또 다른 제형은 경피 전달 장치 ("패치")를 이용한다. 이러한 경피 패치를 사용하여 본 발명의 키메라 항원을 제어 량으로 연속적 또는 불연속적으로 주입할 수 있다. 제약 작용제를 전달하기 위한 경피 패치의 구조 및 사용은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 본원에 참고로 도입된 미국 특허 제5,023,252호를 참고할 수 있다. 이러한 패치는 제약 작용제를 지속적, 박동적 또는 수요에 따라 전달하도록 구축할 수 있다.
부가적으로, 키메라 항원 및 제약 부형제 이외에, 한 가지 이상의 항바이러스성 치료제 또는 화학요법제를 포함하는 것이 유리할 수 있다. 이에는 인터페론-α 2a/b, 및 항바이러스제, 예를 들어 리바비린이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다.
몇몇 양태에서는, B-림프구 또는 T 림프구를 프라이밍시키는 한 가지 이상의 성분을 본 발명의 제약 조성물에 포함시키는 것이 요망될 수 있다. 지질이 생체 내에서 CTL을 프라이밍시킬 수 있는 작용제로서 확인된 바 있다. 예를 들어, 팔미트산 잔기를 리신 잔기의 ε- 및 α-아미노기에 부착시킨 다음, 예를 들어 하나 이상의 연결성 잔기, 예를 들어 Gly, Gly-Gly-, Ser, Ser-Ser 등을 통하여 면역원성 펩티드에 연결시킬 수 있다. 이어서, 이와 같이 지질화된 펩티드를 미셀 또는 입자에 직접 투여하거나, 리포솜 내로 혼입하거나, 또는 아주반트 [예를 들어, 프로인트 (Freund) 불완전 아주반트]에 유화시킬 수 있다. 바람직한 양태에서, 특별히 유효한 면역원성 조성물은 연쇄 (예: Ser-Ser)를 통하여 면역원성 펩티드의 아미노 말단에 부착되는, Lys의 ε- 및 α-아미노기에 부착된 팔미트산을 포함한다.
CTL 반응을 지질 프라이밍시키는 또 다른 예로서, 이. 콜라이 (E. coli) 지단백질, 예를 들어 트리팔미토일-S-글리세릴시스테이닐세릴-세린 (P3CSS)을 사용하여, 적당한 펩티드에 공유적으로 부착된 경우에 바이러스 특이적 CTL을 프라이밍시킬 수 있다 [참고: 예를 들어, Deres et al. (1989) Nature 342:561]. 본 발명의 키메라 항원을, 예를 들어 P3CSS과 커플링시킬 수 있고, 이러한 지단백질을 특정 개체에게 투여하여 표적 항원에 대한 면역 반응을 특이적으로 프라이밍시켰다.
본 발명의 조성물이 아주반트의 사용을 반드시 요구하는 것은 아니지만, 아주반트를 사용할 수 있다. 각종 아주반트를 사용하여 숙주 종에 따라서 면역 반응을 증가시킬 수 있는데, 이러한 아주반트에는 프로인트 (완전 및 불완전), 미네랄 겔, 예를 들어 수산화알루미늄, 표면 활성 물질, 예를 들어 라이소레시틴, 세정제, 다가 폴리올, 폴리음이온, 펩티드, 오일 에멀션, 키홀 림펫 헤모시아닌, 디니트로페놀, 면역자극성 폴리뉴클레오티드 서열, 및 잠재적으로 유용한 인간 아주반트, 예를 들어 BCG [바실레 칼메트 게랑 (bacille Calmette-Guerin)] 및 코리네박테륨 파르붐 (corynebacterium parvum)이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다. 부가의 아주반트 또한 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
F. 키메라 항원의 사용 방법
본 발명의 또 다른 국면은 면역 반응 도메인과, 항체 단편 (예: 이종형 항체 단편)을 포함하는 표적 결합성 도메인을 포함하는 키메라 항원을 APC에게 투여하는 것을 포함하는, APC에 의해 항원 표시를 증강시키는 방법을 제공한다. 바람직한 양태에서, APC는 수지상 세포이다.
본 발명의 특정 국면은 APC를 면역 반응 도메인과, 항체 단편 (예: 이종형 항체 단편)을 포함하는 표적 결합성 도메인을 포함하는 키메라 항원과 접촉시키는 것을 포함하는, APC의 활성화 방법에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, APC는 생체 내에서 키메라 항원과 접촉시킨다. 또 다른 바람직한 양태에서, 이러한 접촉이 인간에게서 일어난다.
본 발명의 또 다른 국면은 특정 동물에게, 면역 반응 도메인과, 항체 단편 (예: 이종형 항체 단편)을 포함하는 표적 결합성 도메인을 포함하는 키메라 항원을 투여하는 것을 포함하는, 면역 반응을 유도시키는 방법을 제공한다. 이러한 면역 반응은 체액성 및/또는 세포성 면역 반응일 수 있다. 바람직한 양태에서, 세포성 면역 반응은 Th1, Th2 및/또는 CTL 반응이다.
본 발명의 또 다른 국면은 면역 반응 도메인과, 이종형 항체 단편을 포함하는 표적 결합성 도메인을 포함하는 키메라 항원을, 이를 필요로 하는 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 면역-치료 가능한 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 바람직하게, 면역-치료 가능한 질환은 만성 C형 간염 바이러스성 감염증이다. HCV를 치료하기 위해, 바람직하게 면역 반응 도메인은 HCV 코어 (1-191) 단백질, HCV 코어 (1-177) 단백질, HCV E1 단백질, HCV E2 단백질, HCV E1-E2 단백질, HCV NS2 단백질, HCV NS3 단백질, HCV NS4A 단백질, HCV NS4B 단백질, HCV NS5A 단백질, HCV NS5B 단백질, HCV p7 단백질, 및 그의 조합물로 이루어진 군 중에서 선택된 단백질을 포함한다.
본 발명의 또 다른 국면은 특정 동물에게 면역 반응 도메인과, 항체 단편을 포함하는 표적 결합성 도메인을 포함하는 키메라 항원을 투여하는 것을 포함하는, 바이러스성 감염에 대항하여 동물에게 백신 접종하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 바이러스성 감염에 대항하여 동물을 예방적 또는 치료적으로 백신 접종할 수 있다.
본 발명은 또한, APC (예를 들어, DC)와 결합하고 이를 활성화시키기 위해 본 발명의 조성물을 사용하는 방법을 포함한다. 본 발명은 또한, T 세포를 활성화시키기 위해 본 발명의 조성물을 사용하는 방법을 포함한다. 본 발명은 또한, 항원을 면역계 세포, 예를 들어 APC에 전달하는 방법을 포함한다. 본 발명은 또한, 본 발명의 하나 이상의 키메라 항원을 투여하는 것을 포함하는, 특정 동물 또는 인간에게서 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 활성화시키기 위한 조성물 및 방법을 포함한다.
클로닝 및 발현시킨 후, 키메라 항원을 대상으로 하여 면역 반응을 생성시키는데 있어서의 그의 효능에 관하여 평가한다. 평가는 키메라 항원이 생체외 또는 생체 내에서 DC에 제시되는 것을 포함한다. 이러한 DC를 대상으로 하여 키메라 항원과 결합하고 이를 내재화하는 것에 관하여 평가한다. 키메라 항원이 부하된 본래 그대로의 DC를 T 림프구에 제시하고, T 세포 반응의 마커로서의 인터페론-γ의 생성에 관하여 평가한다. 구체적으로 언급하면, 생체외 상황 하에서는 단구를 말초혈로부터 분리시키고 DC로 분화시킨다. DC는 항원과 결합하고, 이를 내재화시키며, 프로세싱하고, 항원을 본래 그대로의 자기 유래 T-림프구에 제시한다. DC에 의해 제시된 프로세싱된 항원을 인식하는 T 세포를 활성화시켜 효과기 세포, 예를 들어 조력 T 세포 또는 세포독성 T-림프구로 만든다. 이어서, 수지상 세포에 의한 T 세포의 활성화를 공지된 과정에 의해 마커 (예: 인터페론-γ 수준)를 측정함으로써 평가한다 [참고: 예를 들어, Berlyn, et al. (2001) Clin. Immunol. 101(3):276-283]. 배경에 비해 인터페론-γ를 50% 이상 생성시키는 T 세포 비율의 증가는 생체내 효능을 예측해 준다. 바람직한 양태에서, 상기 비율 증가는 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90% 또는 100% 이상이다. 생체내 상황 하에서는, 키메라 항원을 숙주에 비경구적으로 직접 도입하는데, 여기서 이용 가능한 수지상 세포 및 기타 항원 프로세싱 세포는 모든 항원과 상호 작용하고 이에 따라 이들을 프로세싱할 수 있는 능력을 지니고 있다.
G. 병용 요법
본 발명의 또 다른 국면은 키메라 항원과 항바이러스제를 포함하는, 바이러스성 감염증을 치료하기 위한 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한, 키메라 항원과 항바이러스제를 동시에 또는 순차적으로 투여하는 것을 포함하는, 바이러스성 감염증을 치료하는 방법을 제공한다.
키메라 항원을 항바이러스제 (예: 뉴클레오시드 유사체)와 병용해서 사용하는 것은 만성 C형 간염으로 인해 고통받고 있는 대상체를 치료하는데 있어 지속적 반응을 유도시키는데 고도로 효능이 있는 것으로 입증될 수 있다. 병용해서 사용된 두 작용제의 작용 기전은 C형 간염 대상체를 치료하는데 있어 상승적 효과를 가져다 줄 수 있다. 예를 들어, HCV 항바이러스제 (예: 리바비린)을 본원에 기재된 HCV 키메라 항원과 함께 병용하는 것은 항원 특이적 세포성 면역 반응 뿐만 아니라 체액성 면역 반응을 생성시키므로, 만성적으로 감염된 대상체의 HCV 감염증을 없애줄 것이다.
H. 키메라 항원의 제조 방법
본 발명의 한 국면은 (a) 키메라 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물 또는 세포주 (또는 세포), 바람직하게 진핵, 보다 바람직하게 비포유류 미생물 또는 세포주 (또는 세포)를 제공하는 단계; 및 (b) 이러한 미생물 또는 세포주 (또는 세포)를, 키메라 항원이 발현되도록 하는 조건 하에 배양하는 단계를 포함하는, 키메라 항원의 생성 방법을 제공한다. 바람직하게, 미생물 또는 세포주 (또는 세포)는 효모, 식물 세포주 (또는 세포) 또는 곤충 세포주 (또는 세포)이다. 보다 바람직하게, 세포주 (또는 세포)는 Sf9, Sf21, expresSF+®, 드로소필라 S2 및 High Five™ 세포주 또는 세포로 이루어진 군 중에서 선택된 곤충 세포주 (또는 세포)이다.
본 발명은 본 발명의 실시에 필요한 TBD와 선별된 항원(들)의 융합 단백질을 생성하는 것으로 확립된 재조합 DNA 기술을 이용한다. 융합 단백질 구조물은 목적하는 DNA 단편을 발현 벡터 내로 혼입시키는데 활용되고, 목적하는 융합 단백질을 이종 발현 시스템에서 발현시키기 위해 사용되는, 특이적 제한 효소 부위가 혼입된 DNA 수준으로 생성된다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "벡터"는 목적하는 단백질(들)을 암호화하는 DNA를 운반할 수 있는 플라스미드를 의미한다. 본 발명에 사용된 플라스미드 벡터에는 DH1OBac™ 이. 콜라이 (공급처: Invitrogen)에서 생성된 pFastBac HTa 및 상응하는 재조합 "BACMIDS" (세균성 인공 염색체)가 포함되지만, 그에 제한되지 않는다. 목적하는 단백질의 ORF를 동원하는 것이 가능하고, 본 발명에 이용된 Bac-대-Bac® 바쿨로바이러스 발현 시스템 (공급처: Invitrogen) 이외에, 상기 단백질을 기타 시스템 (세균성 또는 포유류)에서 발현시키기 위한 기타 재조합 플라스미드를 생성시키는 것이 가능하다. 용어 "발현"은 DNA 서열을 mRNA로 전사시키고, mRNA 전사체를 융합 단백질로 해독시키는 것을 의미하기 위해 사용된다.
이는 관심있는 유전자를, Sf9 곤충 세포 내로 형질감염되고 재조합 바쿨로바이러스를 생성시키는 백미드 (bacmid) 내로 전위시킴으로써 달성된다. 이들을 사용하여 Sf9 또는 High Five™ 곤충 세포를 감염시키는데, 이는 관심있는 단백질을 생성시킨다. 이로써 생성된 재조합 단백질은 N-말단 6xHis 태그를 가질 수 있는데, 이는 Ni-NTA 아가로즈 (공급처: Qiagen, Hilden, Germany)를 사용함으로써 단백질을 정제하는데 활용된다. 단백질은 또한, 그 안에 클로닝된 N-말단 rTEV 프로테아제 또는 기타 절단 부위를 가질 수 있다. Ni-정제된 단백질을 대상으로 하여, 예를 들어 N-말단 6xHis 태그를 갖기도 하는 rTEV 프로테아제 (공급처: Invitrogen)를 사용하여 분해시킨다. 프로테아제 분해 후, 혼합물을 Ni-NTA 아가로스 칼럼 상에 부하할 수 있고, 순수한 단백질을 세척 제거할 수 있는데, 이 동안에 6xHis 태그화 단편은 상기 칼럼과 결합될 것이다. 이러한 정제 방법은 표준 과정이고 당업자는 추가의 설명없이도 해당 방법론을 이해할 수 있을 것이다.
키메라 항원을 생성시키기 위해 뮤린 모노클로날 항체의 Fc 단편과 바이러스성 항원을 암호화하는 DNA 서열의 클로닝 및 발현은 두 가지 접근 방식을 통하여 달성할 수 있다. 첫 번째 접근 방식은 두 단백질을 융합 단백질로서 클로닝하는 것을 포함하는 반면, 두 번째 접근 방식은 특이적 "바이오-링커", 예를 들어 바이오틴 또는 스트렙타비딘을 상기 분자들 중의 어느 하나에 혼입시키고, 이들을 개별적으로 정제한 다음, 키메라 항원을 생성시키는 것을 포함한다.
예시 양태에서, B형 간염 바이러스 표면 항원에 대항한 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 2C12를 뮤린 면역글로불린 G에 대한 총 RNA의 공급원으로서 사용하였다. 총 RNA를 분리하고, 이를 사용하여 뮤린 Fc 단편을 클로닝하였다. 구체적으로 언급하면, 뮤린 IgG를 발현하는 하이브리도마 세포로부터의 총 RNA는 트리졸® 시약 (공급처: Invitrogen/Gibco BRL, 제품 카탈로그 번호 10551-018, 10298-016; 미국 특허 제5,346,994호에 기재된 바와 같은, 페놀 및 구아니딘 이소티오시아네이트의 단상성 용액)을 사용하여 분리한다. 올리고-dT 칼럼 (공급처: Invitrogen/Gibco BRL, 제품 카탈로그 번호 15939-010) 상에서 친화 크로마토그래피함으로써 총 RNA로부터 mRNA를 정제하였다. 역전사효소를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응에서 상보적 DNA (cDNA)를 생성시켰다. 클로닝을 촉진시켜 주는 독특한 제한 효소 인식 부위를 부가한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 설계하였다. 이러한 cDNA는 Bac-대-Bac® 바쿨로바이러스 발현 시스템 (공급처: Invitrogen/Gibco BRL, 제품 카탈로그 번호 15939-010)을 사용하여 클로닝하였다.
바쿨로바이러스 시스템을 우선적으로 사용하는데, 이는 다량의 이종 단백질이 생성되기 때문일 뿐만 아니라 단백질의 해독 후 변형, 예를 들어 인산화 및 당화가 감염된 곤충 세포 내에서 일어나기 때문이다. 이러한 발현 시스템에서는, DNA를 pFastBac™ (공급처: Invitrogen/Gibco BRL, 제품 카탈로그 번호 15939-010)로 지칭되는 벡터 내로 클로닝할 수 있다. Bac-대-Bac® 시스템에서는, 재조합체의 생성이 세균성 트랜스포손 Tn7을 이용한 부위 특이적 전위에 기초한다. 관심있는 유전자를, 클로닝 부위를 플랭킹하는 미니-Tn7 요소를 갖는 pFastBac® 내로 클로닝한다. 이 플라스미드를, LacZ 유전자 내에 Tn7의 부착 부위를 함유하는 바쿨로바이러스 셔틀 플라스미드 (백미드)를 갖는 에스케리챠 콜라이 균주 DH10Bac™ (공급처: Invitrogen/Gibco BRL, 제품 카탈로그 번호 10361-012) 내로 형질전환시킨다. 전위로 인해 LacZ 유전자가 붕괴되어, 재조합체 만이 백색 집락을 생성시키고 이에 대해 용이하게 선별되도록 한다. 이. 콜라이에서의 전위를 사용하는 경우의 이점은 단일 집락이 재조합체 만을 함유하여 플라크 정제와 스크리닝이 요구되지 않도록 하는 것이다. 재조합 백미드를 곤충 세포에서 형질감염시켜 재조합 단백질을 발현하는 바쿨로바이러스를 생성시킨다.
Bac-대-Bac® 바쿨로바이러스 발현 시스템은 공급처 (Invitrogen)로부터 시판되고 있고, 사용된 과정은 예를 들어, www.invitrogen.com로부터 입수 가능한 회사 프로토콜에 기재된 바와 같다. 관심있는 유전자를, 예를 들어 pFastBac HTa 공여자 플라스미드 내로 클로닝하고, 재조합 단백질의 생성은 Bac-대-Bac™ 바쿨로바이러스 발현 시스템 (공급처: Invitrogen)에 의거한 것이다.
그 다음 단계에서는, 관심있는 유전자를 함유하는 pFastBac HTa 공여자 플라스미드를 부위 특이적 전위에 사용하여, 클로닝된 유전자를 바쿨로바이러스 셔틀 벡터 (백미드) 내로 형질감염시킨다. 이는 이. 콜라이 균주 DH1OBac™에서 달성한다. 관심있는 유전자를 수반한 재조합 pFastBac HTa 플라스미드를 전위를 위해 DH1OBac™ 세포 내로 형질전환시켜 재조합 백미드를 생성시킨다.
재조합 백미드는 표준 과정 [Sambrook, 상기 참고]에 의해 분리하고; DNA 샘플을 형질감염에 사용하였다.
바쿨로바이러스를 생성시키기 위해서는, 백미드를 Sf9 곤충 세포 내로 형질감염시킨다. 형질감염시킨 후, 세포를 적당한 조건 하에 항온 배양하고, 바쿨로바이러스를 함유하는 배지를 수집한 다음 저장한다.
일단 바쿨로바이러스의 생성과 단백질의 발현이 확인되면, 바이러스 스톡을 증폭시켜 관심있는 유전자를 보유하고 있는 바쿨로바이러스의 농축된 스톡을 생성시킨다. 바쿨로바이러스를 2회 이상 증폭시키는 것은 당해 분야에서 표준적인 실시이고, 본원에 기재된 모든 프로토콜에 이러한 표준 실시를 첨부하였다. 증폭 제2 회전 후, 키트 제조업자 (Invitrogen)에 의해 기재된 프로토콜에 따라서 플라크 검정을 사용하여, 생성된 바쿨로바이러스의 농도를 정량화할 수 있다. 곤충 세포를 감염시키는데 가장 적당한 바이러스 농도, 및 목적하는 단백질을 생성하기 위한 최적의 시점이 일반적으로 또한 확립되었다.
관심있는 단백질을 암호화하는 DNA는 전체 바이러스성 게놈 카피를 함유하는 플라스미드로부터 독특한 제한 효소 부위를 보유하고 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 PCR함으로써 생성시키고, Fc DNA를 이용하여 융합 단백질로서 클로닝하였다. 이러한 키메라 단백질을 Ni-NTA, 렉틴, 단백질 A 또는 단백질 G 친화 크로마토그래피 또는 당업자에게 공지된 기타 표준 정제 방법에 의해 정제한다.
IRD와 TBD를 연결시키기 위한 두 번째 접근 방식은 특이적 "바이오-링커", 예를 들어 바이오틴 또는 아비딘 (예: 스트렙타비딘)을 상기 분자들 중의 어느 하나에 혼입시키고, 이들을 개별적으로 정제한 다음, 키메라 항원을 생성시키는 것을 포함한다. 관심있는 바이러스성 항원을 박테리오파아지 (bacteriophage) T7 프로모터에 의해 단백질의 발현을 제어하는 플라스미드 내로 클로닝한다. 이어서, 재조합 플라스미드를, lac 억제인자에 의해 조절된 T7 RNA 폴리머라제를 생성시킨 이. 콜라이 균주, 예를 들어 BL21 (DE3) 코돈 플러스™ RIL 세포 (공급처: Stratagene, 제품 카탈로그 번호 230245) 내로 형질전환시킨다. T7 RNA 폴리머라제는 T7 프로모터에 대해 고도로 특이적이고, 이. 콜라이 숙주의 RNA 폴리머라제 보다 훨씬 더 전진성이다 (대략 8배 더 신속하다). T7 RNA 폴리머라제의 생성이 이소프로필티오-β-D-갈락토시드 (IPTG)에 의해 유도되는 경우, T7 RNA 폴리머라제의 특이성과 전진성 (processivity)으로 인해, T7 프로모터의 제어 하에 고 수준의 유전자 전사가 발생한다. 두 단백질을 함께 커플링하기 위해서는, 바이오틴과 아비딘 (예: 스트렙타비딘) 간의 조밀한 결합성을 활용한다. 이. 콜라이에서는, BirA 효소가 특이적 인식 서열 중의 규정된 리신 잔기에 대한 바이오틴의 공유적 연쇄를 촉매한다. 뮤린 Fc 단편은 상기 언급된 바와 같이 바쿨로바이러스 시스템에서 아비딘과의 융합 단백질로서 발현된다. 이들 두 단백질을 혼합하여 바이오틴-스트렙타비딘 결합에 의해 이량체성 단백질 복합체를 형성시킬 수 있다.
본 발명의 실시는, 달리 표시하지 않는 한은 당해 분야의 기술 수준 내인 통상적인 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학 기술을 이용한다. 이러한 기술은 다음 문헌에 상세히 설명되어 있다 [Sambrook, 상기 참고; 및 Ausubel, 상기 참고].
I. 제조품 및 키트
본 발명의 또 다른 국면은 해당 조성물을 어떻게 비경구, 예를 들어 피하, 근육내, 피내, 비내 또는 혈관내 투여하는지에 관한 논의를 제공해 주는 인쇄된 라벨링 지시사항과 조합하여, 주사용으로 적합하거나 주사용으로 재구성하기에 적합한, 키메라 항원을 포함하는 조성물을 유지하기 위한 용기를 포함하는 제조품을 제공한다. 상기 조성물은 이 조성물과 실질적으로 상호 작용하지 않을 적합한 모든 용기 내에 함유될 수 있고, 이것이 비경구 용도란 것을 표시해 주는 적당한 라벨링으로 표지시킬 수 있다. 전술된 바와 같은 치료 방법에 일치하는 라벨링 지시사항을 용기에 부착시킬 수 있다. 본 발명의 조성물을 보유하고 있는 용기는 주사용으로 적합한 액상 조성물을 갖는 용기일 수 있다. 이러한 용기는 주사기 바늘에 의해 접근 가능하도록 적응시킬 수 있다. 제조품은 환자, 의사, 간호사 또는 기타 시행자가 키메라 항원을 투여할 수 있도록 적당한 바늘 및 주사용 주사기를 포함할 수 있다. 또 다른 한편, 조성물은 가용성 버젼의 키메라 항원을 함유하는 무수 또는 농축된 조성물일 수 있어, 이러한 조성물을 용해 또는 현탁시키기 위한 수성 또는 비수성 비히클과 조합되거나 이들로 희석시킬 수 있다. 또 다른 한편, 용기는 액상 현탁제를 가질 수 있거나, 또는 불용성 버젼을 현탁시킬 비히클과 조합하기 위한 불용성 버젼의 염일 수도 있다. 적당한 용기는 다음 문헌에 논의되어 있다 [참고: Remington, 상기 참고, pages 788-789, 805, 850-851 and 1005-1014].
본 발명의 키트는 전형적으로, 상기 언급된 용기와, 상업적 측면 및 사용자 측면에서 바람직한 물질, 예를 들어 완충제, 희석제, 충진제, 바늘, 주사기, 및 사용에 관한 지시사항을 수반한 패키지된 삽입물을 포함하는 1개 이상의 기타 용기를 포함할 것이다. 조성물이 특이적 요법 또는 비치료적 적용에 사용된다는 것을 표시해 주는 라벨이 용기 상에 존재할 수도 있고, 이는 또한 상기 언급된 바와 같이 생체내 또는 생체외 용도에 관한 지시사항을 표시할 수도 있다. 지시사항 및/또는 정보가 키트와 함께 포함되는 삽입물 상에 포함될 수도 있다.
다음 비제한적 실시예는 본 발명을 추가로 예시해준다.
실시예 1. 재료 및 방법
재료
이들 실시예에 기재된 키미젠™ 분자에 사용된 TBD (및 편의상, 본 실시예에서 "TBD"로서 지칭된 것)은 뮤린 HBsAg-특이적 mAb를 생산하고, 알베르타 대학 (the University of Alberta, Edmonton, Alberta, Canada)을 통하여 티렐 (Tyrrell) 실험실로부터 허가받은 하이브리도마 2C12로부터 유래되었다. HCV 항원을 암호화하는 DNA를 함유하는 플라스미드 pCV-H77C를 알베르타 대학의 티렐 실험실로부터 수득하였다.
pFastBac-HTa 클로닝 벡터, 곤충 세포주 Sf9, 셀펙틴 (Cellfectin®) 시약, 인산염 완충 식염수 (PBS), 백금 Pfx DNA 폴리머라제, 트리졸 시약, 슈퍼스크립트 (Superscript) 제1 가닥 합성 역전사효소, X-gal, 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드 (IPTG) 및 태아 소 혈청 (FBS)을 공급처 [Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)]로부터 구입하였다.
곤충 세포 성장과 발현 매질 ESF 921는 공급처 [Expression Systems (Woodland, CA, USA)]로부터 구입하였다. 제한 효소 EcoR I, Spe I, Hind III, Rsr II, Ava II 및 Not I는 공급처 [New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)]로부터 구입하였다.
엑스프레션 시스템즈 (Expression Systems) 바쿨로바이러스 역가측정 검정을 이용하여 바이러스성 스톡을 역가 측정하였다. IgG2A-PE (공급처: BD Biosciences, San Diego, CA, USA)를 1:10으로 희석시키고 이소형 대조군으로서 사용하였다. FACS 취득 및 분석을 이용하여 바쿨로바이러스 역가를 결정하였다. 벡톤 디킨슨 바이오사이언스 (Becton Dickinson Biosciences) FACSCalibur3 (4-색, 이중-레이저) 취득 세포 및 CELLQuest Pro3 소프트웨어 (공급처: BD Biosciences)를 사용하여 데이터를 분석하였다. 데이터를 입력하고 표준 곡선에 의거하여 바이러스성 역가를 결정하기 위해 엑스프레션 시스템즈에 의해 마이크로소프트 엑셀 스프레드시트 (Microsoft Excel spreadsheet)를 제공하였다. Ni-NTA 슈퍼플로우3 (Superflow3) (공급처: Qiagen, Hilden, Germany) 및 토요펄 슈퍼 (Toyopearl Super) Q3 650C (공급처: Tosoh Biosciences, Grove City, OH, USA)를 사용하여 정제를 수행하였다.
나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS PAGE) 겔을 제조하기 위한 30% 아크릴아미드 용액은 공급처 [Bio-Rad (Hercules, CA, USA)]로부터 구입하였다. PageBlue3 염색, 5x 부하 완충액, PageRuler3 예비염색시킨 단백질 래더 및 2Ox 환원제는 공급처 [Fermentas (Burlington, ON, Canada)]로부터 구입하였다.
Hybond3 ECL 니트로셀룰로스 및 ECL 웨스턴 탐지용 키트 (공급처: GE Healthcare)를 웨스턴 블롯팅을 위해 사용하였다.
트윈 (Tween) 20, 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드 (CTAB), 항-마우스 IgG (Fc 특이적) 서양고추냉이 퍼옥시다제 접합된 항체, 항-마우스 (Fab 특이적) 서양고추냉이 퍼옥시다제 접합된 이차 항체, 염소-항-토끼 서양고추냉이 퍼옥시다제 접합된 이차 항체 및 항생제 카나마이신, 앰피실린 및 젠타마이신은 공급처 [Sigma (St. Louis, MO, USA)]로부터 구입하였다.
토끼 항-NS5A, 염소 항-NS3, 및 염소 항-NS4 폴리클로날 항체 및 마우스 항-NS5A 모노클로날 항체는 공급처 [Abcam (Cambridge, MA, USA)]로부터 구입하였다. 6xHis 서양고추냉이 퍼옥시다제 접합된 모노클로날 항체는 공급처 [Clontech (Palo Alto, CA, USA)]로부터 구입하였다.
슬라이드-a-라이저3 카세트 및 마이크로 BCA3 검정용 키트는 공급처 [Pierce (Rockford, IL, USA)]로부터 구입하였다.
Pro-Q® 에머랄드 (Emerald) 300 당단백질 겔 및 블롯 염색용 키트는 공급처 Molecular Probes (Carlsbad, CA, USA)]로부터 구입하였다.
건강한 공여자로부터의 백혈구성분 채집용 샘플은 공급처 [SeraCare Life Sciences (Oceanside, CA, USA)]로부터 구입하였다. T 세포 음성 분리를 위한 다이날 다이나비드3 (Dynal Dynabeads3)은 공급처 [Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)]로부터 구입하였다. L-글루타메이트, 스트렙토마이신 설페이트 (50 ㎍/mL), 및 젠타마이신 설페이트 (10 ㎍/mL)를 함유하는 AIM V® 매질은 공급처 [Invitrogen]로부터 수득하였다. 매칭된 공여자 혈청은 피콜-하이파크 (Ficoll-Hypaque) 혈액 제제를 원심분리시킨 후 혈청 분획으로부터 수득하였다. AIM V® 매질 중의 50%인 혈청을 열 불활성화시키고, 등분한 다음, -20℃ 하에 저장하였다. 둘벡코 인산염 완충 식염수 (PBS)는 공급처 [Invitrogen]로부터 수득하였다.
다음 특이성을 지닌 접합된 모노클로날 항체 (mAbs)는 공급처 [BD Biosciences (San Diego, CA)]로부터 구입하였다: CD64-플루오레세인 이소티오시아 네이트 (FITC), CD32-R-피코에리틴 (PE), CD16-PE, CD206-PE-Cy5, CD80-PE, CD86-FITC, CD83-PE, CD40-FITC, CD11c-PE, CD14-FITC, CD19-FITC, CD3-FITC, CD3-PE, CD3-알로피코시아닌 (APC), CD8-PE-Cy5, CD4-APC, CD69-FITC, CD69-APC, HLA-ABC-FITC, HLA-DR-PE, IFN-γ-PE, TNF-α-PE, grB-FITC, pfn-FITC 및 마우스 IgG1-바이오틴. 바이오티닐화 항-6xHis는 공급처 [Qiagen (Mississauga, Ontario, Canada)]로부터 수득하였다. 염소 항-토끼 IgG-바이오틴 항체는 공급처 [Jackson ImmunoResearch Laboratories (West Grove, PA)]로부터 구입하였다. 뮤린 이소형 mAb 및 SA-PE-Cy5는 공급처 [BD Biosciences]로부터 수득하였다. 혼합 이성체 5-(및-6)-카복시플루오레세인 디아세테이트, 석신이미딜 에스테르 (5(6)-CFDA, SE; CTSE)는 공급처 [Invitrogen]로부터 수득하였다.
항원에 대한 T 세포의 특이성은 특이적 PE-접합된 사량체 (공급처: Beckman Coulter, Mississauga, Ontario, Canada) 또는 오량체 (공급처: Prolmmune, Springfield, VA)를 사용하여 측정하였다. 사용된 오량체에는 HCV NS5A 펩티드 VLSDFKTWL (서열 3)/HLA-A2 및 HCV NS3 펩티드 CINGVCWTV (서열 4)/HLA-A2가 포함되었다. 사용된 사량체에는 EBV 펩티드 GLCTLVAML (서열 5)/HLA-A2, HCV NS3 펩티드 KLVALGINAV (서열 6)/HLA-A2 및 음성 대조군 사량체 (다중 대립유전자)가 포함되었다.
다음 사이토킨은 공급처 [R&D Systems (Minneapolis, MN)]로부터 구입하였다: 인터루킨-1β (IL-1β), 인터루킨-4 (IL-4), 인터루킨-6 (IL-6), 과립구 대식 세포-집락 자극 인자 (GM-CSF), 종양 괴사 인자-I (TNF-α), 인터페론-K (IFN-γ), 및 인터페론-I (IFN-α). 사이토킨을 제조업자의 지시에 따라서 재구성하고, 등분한 다음, -70℃ 하에 저장하였다. 폴리 IC는 공급처 [Sigma]로부터 수득하였다.
웨이브 (Wave) 생물 반응기 시스템23/10EH 및 셀백 (Cellbag) lOL/O은 공급처 [Wave Biotech (Somerset, NJ., USA)]로부터 구입하였다.
방법
발현 플라스미드 구축
pFastBacHTa-TBD, 모 플라스미드 구조물
CH1-힌지-CH2-CH3 영역의 아미노산을 암호화하는 마우스 IgG1 DNA 서열을, HBV 표면 항원 (sAg)에 대항하여 mAb를 생산하는 하이브리도마 2C12로부터 분리된 mRNA로부터 생성시켰다. 트리졸 시약을 사용하여 총 mRNA를 분리하였고, 슈퍼스크립트 제1 가닥 합성을 이용하여 RT-PCR함으로써 TBD의 cDNA를 생성시켰다. PCR 프라이머는 5' 말단에 링커 펩티드-SRPQGGGS- (서열 1)를 암호화하는 링커 서열, 5' 말단에 독특한 Not I 부위 및/또는 3' 말단에 독특한 Hind III 제한 부위를 함유하였다. 이로써 생성된 cDNA는 (5' Not I)-링커 서열-CH1의 일부 (VDKKI; 서열 2)-CH2-CH3 (3' Hind III)을 함유하였다. 각각의 효소로 분해시킨 후, 동일한 제한 효소 부위를 사용하여 단편을 pFastBac-HTa 발현 벡터 플라스미드에 연결시켰다. PCR 증폭을 위해 사용된 5' 프라이머는 (센스) 5'-TGTCATTCTGCGGCCGCAAGGCGGCGGGATCCGTGGACAAGAAAATTGTGCCAGG-3' (서열 7)이고, 3' 프라이머는 (안티센스) 5'-ACGAATCAAGCTTTGCAGCCCAGGAGAGTGGGAGAG-3' (서열 8)인 데, 각각 Not I 및 Hind III 부위를 함유하였다. 이와 같이 증폭시킨 DNA를 Not I 및 Hind III로 분해시키고, 단편을 아가로스 겔에 의해 정제한 다음, 동일한 제한 효소로 분해시킨 pFastBac-HTa 발현 벡터 플라스미드에 연결시켜 발현 플라스미드 pFastBacHTa-TBD를 생성시켰다. 이 생성물을 융합 단백질 6xHis 태그-rTEV 프로테아제 절단 부위-TBD의 발현을 위해 사용하였다. 개방 판독 프레임 (ORF)의 정확도 및 DNA 서열은 표준 서열 분석 방법에 의해 검증하였다. pFastBacHTa-TBD 내의 ORF의 뉴클레오티드 서열 (서열 9) 및 이러한 ORF에 의해 암호화된 아미노산 서열 (서열 10)이 도 2에 도시되어 있다.
pFastBacHTa-gp64의 구축
분비를 위해, 아우토그라파 칼리포르니카 (Autographa californica) 핵 다각체병 바이러스 (AcNPV) gp64 단백질로부터의 신호 서열을 pFastBac-HTa 내로 클로닝하였다. 2개의 올리고뉴클레오티드를 합성하고 함께 어닐링하였다. 올리고뉴클레오티드 서열은
5'-GCATGGTCCATGGTAAGCGCTATTGTTTTATATGTGCTTTTGGCGGCGGCGGC
GCATTCTGCCTTTGCGGATCTGCAGGTACGGTCCGATGC-3 ' (서열 11) 및
5'-GCATCGGACCGTACCTGCAGATCCGCAAAGGCAGAATGCGCCGCCGCCGCCAAAAGCACATATA
AAACAATAGCGCTTACCATGGACCATGC-3' (서열 12)이다. 올리고뉴클레오티드는 5' Ava II 부위 및 3' Rsr II 부위를 함유하고 있다. Ava II 및 Rsr II로 분해시킨 후, 이 단편을, gp64 신호 서열을 6xHis 태그의 바로 상단에 위치시킨, Rsr II 분해시킨 pFastBac-HTa 내로 클로닝하여 pFastBacHTa-gp64를 생성시켰다.
pFastBacHTa HCV NS5A 키미젠™ 백신 융합 단백질 발현 벡터 플라스미드의 구축
HCV NS5A 단편을 암호화하는 DNA를, PCR 방법론을 이용하여 플라스미드 pCV-H77C 주형으로부터 생성시켰다. PCR을 위해 사용된 5' 프라이머는 제한 효소 EcoR I 부위를 함유하는 (센스) 5'- CCGGAATTCTCCGGTTCCTGGCTAAGG-3' (서열 13)이었다. 3' 말단에 대한 PCR 프라이머는 (안티센스) 5'- GGACTAGTCCGCACACGACATCTTCCGT-3' (서열 14)이고 제한 효소 Spe I 부위를 함유하였다. 증폭시킨 DNA를 각각의 효소로 분해시키고 pFastBacHTa-TBD에 연결시켜 발현 플라스미드 pFastBacHTa HCV NS5A 키미젠™ 백신 (또는 pFastBacHTa-NS5A-TBD)을 생성시켰다. pFastBacHTa-NS5A-TBD 내의 ORF의 뉴클레오티드 서열 (서열 39) 및 이러한 ORF에 의해 암호화된 아미노산 서열 (서열 40)이 도 3에 제시되었다. NS5A 단독에 대해서는, NS5A 단편을 EcoR I/Spe I 분해시킨 pFastBac-HTa에 연결시켜 pFastBacHTa-NS5A를 생성시켰다.
분비를 위한 pFastBacHTa-gp64 NS5A 키미젠™ 백신 발현 플라스미드의 구축
NS5A 키미젠™ 백신을 pFastBacHTa-gp64 내로 클로닝하기 위해서는, 플라스미드 pFastBacHTa HCV NS5A 키미젠™ 백신 (상기 언급됨)을 Rsr II 및 Hind III로 분해시키고, NS5A 키미젠™ 백신 단편을 아가로스 겔 전기영동에 의해 정제하였다. NS5A 키미젠™ 백신 단편을 Rsr II 및 Hind III 분해시킨 pFastBacHTa-gp64 플라스미드에 연결시켜 pFastBacHTa-gp64 HCV NS5A 키미젠™ 백신 (pFastBacHTa-gp64-NS5A-TBD) 발현 플라스미드 (IDAC 승인 번호 111006-04)를 수득하였다. pFastBacHTa-gp64-NS5A-TBD 내의 ORF의 뉴클레오티드 서열 (서열 41) 및 이러한 ORF에 의해 암호화된 아미노산 서열 (서열 52)이 도 4에 도시되었다.
분비를 위한 pPSC12-NS5A-TBD 키미젠™ 백신 발현 플라스미드의 구축
NS5A 키미젠™ 백신 분자의 분비를 촉진시키기 위해, 플라스미드 pPSC12 (공급처: Protein Sciences Corporation) 내로의 클로닝을 수행하였다. 이러한 플라스미드는 바쿨로바이러스 아우토그라피카 칼리포르니카 핵 다각체병 바이러스 (AcNPV)로부터의 키티나제 유전자에 대한 신호 펩티드를 갖고 있다. 관심있는 유전자를 전이 벡터 내로 클로닝하기 위해서는 4개의 PCR 프라이머가 필요하였다. 관심있는 유전자는 2개의 독특한 프라이머 [프라이머 1 GTTTCTAACGCGTCGTACTACCATCACCATCAC (서열 15) 및 2 CCGGGGTACCTTACAGCCCAGGAGAGTGGGAGAG (서열 16)]를 사용하여 증폭시켰다. 상단 폴리헤드론 프로모터와 신호 펩티드 서열을 함유하는, 폴리헤드론 상단 영역을 증폭시키기 위해서는 2개의 별개의 프라이머가 요구되었다 [프라이머 3 CTGGTAGTTCTTCGGAGTGTG (서열 17) 및 4 GGTAGTACGACGCGTTAGAAACGGCGACCAAC (서열 18)]. 최종적으로, 2개의 외부 프라이머 (프라이머 3 및 2, 상기 서열)가 결정적인 중복 연장 PCR에 사용되었다. 프라이머 4의 5' 말단과 어닐링할 수 있는 서열을 함유하는 서열 1 및 벡터 내로 클로닝하기 위한 독특한 3' Kpn I 부위를 부가한 프라이머 2를 사용하여 PCR함으로써, NS5A-TBD를 pFastBacHTa-NS5A-TBD로부터 증폭시켰다. 중복 연장 PCR 동안 프라이머 1의 5' 말단과 어닐링될 수 있게 해주는 프라이머 3 및 4를 사용하여, pPSC12의 상단 폴리헤드론 영역을 증폭시켰다. 이러한 상단 영역은 또한, 벡터 내로의 클로닝을 위해 사용되는 독특한 NgoM IV 부위를 함 유하였다. 상단 폴리헤드론 프로모터, 신호 펩티드 서열, 및 목적하는 유전자는 프라이머 2 및 3을 사용하여 중복 연장 PCR에 의해 솔기없이 융합시켰다. 완전한 길이의 융합된 생성물을 NgoM IV 및 Kpn I로 분해시키고, 이로써 생성되는 단편을 동일하게 분해시킨 pPSC12 내로 연결시켜 pPSC12-NS5A-TBD를 생성시켰다. 플라스미드 pPSC12-NS5A-TBD 내의 ORF의 뉴클레오티드 서열 (서열 42) 및 이러한 ORF에 의해 암호화된 아미노산 서열 (서열 53)이 도 5에 도시되었다.
pFastBacHTa HCV NS3 키미젠™ 백신 플라스미드의 구축
NS3을 암호화하는 DNA는 다음 프라이머를 사용하여 HCV 폴리단백질의 아미노산 1027 내지 1652 (nt 3420 내지 5294)로부터의 플라스미드 pCV-H77C 주형으로부터 PCR함으로써 생성시켰다. NS3의 최종 C-말단 6개 아미노산은 상기 구조물에 포함되지 않았는데, 이는 이들 서열이 NS3의 세린 프로테아제 활성에 대한 표적 서열이기 때문이다. 사용된 5' 말단 프라이머는 Eco RI 제한 부위를 함유하는 5'-CCGGAATTCGCGCCCATCACGGCGTA-3' (서열 19)이었고, 3' 말단 프라이머는 Spe I 제한 부위를 함유하는 5'-CCGGACTAGTCCGGCCGACATGCATGTCATGAT-3' (서열 20)였다. Eco RI 및 Spe I로 이중 분해시키면 특정 생성물이 생성되었는데, 이를 플라스미드 pFastBacHTa-TBD에 연결시켜 pFastBacHTa NS3-TBD를 생성시켰다.
pFastBacHTa HCV NS3 키미젠™ 백신 플라스미드 벡터의 돌연변이 유발
세포성 프로테아제(들)에 의해 매개되는 것으로 추정되는, 곤충 세포에서 발현된 경우의 NS3 단백질의 내부 절단은 1488에서의 아르기닌 잔기에서 일어나는 것으로 보고되었다 [참고: Shoji et al. (1999) Virology 254:315-323]. 중복 연장 (OE) PCR을 사용하여 아미노산 아르기닌에서 알라닌으로의 돌연변이를 발생시킴으로서, NS3 키미젠™ 단백질의 NS3 부분의 절단을 피하였다. 모 pFastBacHTa NS3-TBD 플라스미드로부터 2개의 NS3 DNA 단편을 생성시켰다. 5' NS3 단편은 Eco RI 제한 부위를 함유하는 프라이머 5'-CCGGAATTCGCGCCCATCACGGCGTA-3' (서열 19) 및 돌연변이 프라이머 (아르기닌에서 알라닌으로의 돌연변이를 함유함) 5'-CTGCCAGTCCTGCCCGCGCGTTGAGTCCTGGAG-3' (서열 21)를 사용하여 생성시켰다. 3' NS3 단편은 5' 프라이머 5'-GGCAGGACTGGCAGGGGGAAGCCAGGCAT-3' (서열 22) 및 Spe I 제한 부위를 함유하는 3' 프라이머 5'-CCGGACTAGTCCGGCCGACATGCATGTCATGAT-3' (서열 20)를 사용하여 생성시켰다. 5' 및 3' NS3 단편 + 2개의 외부 프라이머를 사용하여 OE PCR을 수행하였다. Eco RI 및 Spe I로 이중 분해시키면 특정 생성물이 생성되었는데, 이를 플라스미드 pFastBacHTa-TBD와 연결시켜 pFastBacHTa NS3mut-TBD (IDAC 승인 번호 111006-05)를 생성시켰다. pFastBacHTa NS3mut-TBD 내의 ORF의 뉴클레오티드 서열 (서열 44) 및 이러한 ORF에 의해 암호화된 아미노산 서열 (서열 55)이 도 7에 제시되었다. 단백질의 예상 분자량은 98.3 KDa이다. NS3mut 단독에 대해서는, NS3mut 단편을 EcoR I 및 Spe I로 분해시킴으로써 분리하고 pFastBac-HTa 내로 클로닝하여 pFastBacHTa-NS3mut를 생성시켰다.
pFastBacHTa-gp64 HCV NS3mut 키미젠™ 백신 벡터 플라스미드의 구축
pFastBacHTa HCV NS3mut-TBD 플라스미드를 Rsr II 및 Hind III 제한 효소로 분해시키고, NS3mut-TBD 단편을 Rsr II 및 Hind III 분해시킨 pFastBacHTa-gp64 내로 클로닝하여 pFastBacHTa-gp64-NS3mut-TBD (IDAC 승인 번호 111006-02)를 생성시 켰다. pFastBacHTa-gp64-NS3mut-TBD 내의 ORF의 뉴클레오티드 서열 (서열 45) 및 이러한 ORF에 의해 암호화된 아미노산 서열 (서열 56)이 도 8에 제시되었다. 단백질의 예상 분자량은 101.5 KDa이다. pFastBacHTa-gp64-NS3mut-TBD (단, 한 가지 자발적 돌연변이가 결여되고 다른 돌연변이는 갖고 있다)를 만들기 위해 사용된 것과 유사한 돌연변이된 NS3mut-TBD 단편의 클론을 또한, pFastBacHTa-gp64에 연결시켜 pFastBacHTa-gp64-NS3mut-TBD의 제2 클론을 생성시켰다. pFastBacHTa-gp64-NS3-TBD의 제2 클론 내의 ORF의 뉴클레오티드 서열 (서열 43) 및 이러한 ORF에 의해 암호화된 아미노산 서열 (서열 54)이 도 6에 제시되었다.
pFastBacHTa HCV 다중-항원 키미젠™ 융합 단백질 발현 벡터 플라스미드의 구축
HCV 다중-항원 벡터 플라스미드를 만들기 위해, NS4B-NS5A 서열을 먼저 클로닝하였다. NS4B-NS5A를 암호화하는 DNA 서열은 5' 말단에 대한 프라이머 5'-GCGCACTAGTGTCTCAGCACTTACCGTACATC-3' (서열 23) 및 3' 말단에 대한 프라이머 5'-CGGCGCGGCCGCCCGCAGCACACGACATCTTCCG-3' (서열 24)를 사용하여 플라스미드 pCV-H77C로부터 PCR함으로써 생성시켰다. 이들 프라이머를 이용하여 PCR하면, 5' 말단에 Spe I 부위 및 3' 말단에 Not I 부위의 독특한 제한 효소 부위를 수반한 생성물이 생성되었다. PCR 생성물을 Spe I 및 Not I로 분해시키고, Spe I 및 Not I 분해시킨 pFastBacHTa-gp64에 연결시켜 pFastBacHTa-gp64 NS4B-NS5A를 생성시켰다. 그 다음, TBD 부분을 구조물에 가하였다. 플라스미드 pFastBacHTa-TBD 및 pFastBacHTa-gp64 NS4B-NS5A를 Spe I 및 Hind III로 분해시켰다. Spe I/Hind III 분해시킨 TBD 단편을 분리하고, 이를 상기 분해시킨 pFastBacHTa-gp64 NS4B-NS5A에 연결시켜 pFastBacHTa-gp64 NS4B-NS5A-TBD를 생성시켰다.
NS3 활성 부위 세린 잔기의 돌연변이 유발
NS3에서는 활성 부위 세린 (ser1165)을 알라닌으로 돌연변이시켜 프로테아제 활성을 페기시켰다. 4개의 상이한 프라이머 (2개는 축소된 것이고 2개는 5' 및 3' 말단에 대해 상보적이다)를 사용하여, 주형으로서 pFastBacHTa-gp64 NS3mut-TBD를 이용하여 OE PCR함으로써 2개의 NS3 단편을 창출시켰다. 5' NS3 단편은 제한 효소 Eco RI 부위를 함유하는 5' 말단 프라이머 (센스) 5'-CCGGAATTCGCGCCCATCACGGCGTA-3' (서열 19), 및 돌연변이 프라이머 (ser에서 ala으로의 돌연변이를 함유함) (안티센스) 5'-CAACAGCGGACCCCCCGCGGAGCCTTTCAAGTAG-3' (서열 25)를 사용하여 생성시켰다. 3' NS3 단편은 5' 말단 프라이머 (센스) 5'-GTCCGCTGTTGTGCCCCGCGGGACACG-3' (서열 26) 및 제한 효소 Spe I 부위를 함유하는 3' 말단 프라이머 (안티센스) 5'-CCGGACTAGTCCGGCCGACATGCATGTCA-3' (서열 27)를 사용하여 생성시켰다. 완전한 길이의 NS3 (ser1165 → ala)는 상기 5' 및 3' 단편 및 2개의 외부 프라이머로부터 OE-PCR함으로써 생성시켰다. 이로써 생성된, Arg 1488에서 Ala로의 돌연변이 및 Ser 1165에서 Ala으로의 돌연변이를 수반한 생성물을 NS3mutS로 지칭하였다. 이 단편을 pFastBacHTa-gp64 내로 클로닝하여 pFastBacHTa-gp64 NS3mutS-TBD (IDAC 승인 번호 111006-001)를 생성시켰다.
pFastBacHTa-gp64 HCV NS3-NS4B-NS5A 다중-항원 융합 단백질 벡터 플라스미 드의 구축
융합 단백질 HCV NS3mutS-NS4B-NS5의 발현을 위해 사용될 수 있는 구조물을 제조하기 위해, NS3mutS OE-PCR 생성물을 제한 효소 Eco RI 및 Spe I로 분해시켰다. 이와 같이 분해시킨 NS3mutS를 Eco RI 및 Spe I 분해시킨 플라스미드 pFastBacHTa-gp64 NS4B-NS5A-TBD에 연결시켜 pFastBacHTa-gp64 NS3-NS4B-NS5A-TBD (IDAC 승인 번호 111006-06)를 만들었는데, 이는 pFastBacHTa-gp64 HCV 다중-항원 플라스미드이다. pFastBacHTa-gp64 NS3-NS4B-NS5A-TBD 내의 ORF의 뉴클레오티드 서열 (서열 46) 및 이러한 ORF에 의해 암호화된 아미노산 서열 (서열 57)이 도 9에 도시되었다.
pFastBacHTa-gp64 HCV NS3-NS5A 다중-항원 융합 단백질 벡터 플라스미드의 구축
HCV NS5A 및 TBD에 대한 DNA는 주형 pFastBacHTa-gp64 HCV NS3-NS4B-NS5A-TBD 키미젠™ 백신 융합 단백질 발현 벡터 플라스미드로부터 PCR함으로써 생성시켰다. PCR에 대한 5' 프라이머는 제한 효소 Spe I에 대한 인식 부위를 함유하는 (센스) 5'-GAGGGACTAGTGTCCGGTTCCTGGCTAAGGGAC-3' (서열 28)였다. 3' 말단에 대한 PCR 프라이머는 (안티센스) 5'-CCGGTCTAGATTATGATCCTCTAGTACTTCTCGAC-3' (서열 29)였다. PCR 생성물 (NS5A-TBD)을 겔 정제하고, Spe I 및 Hind III 제한 효소로 후속 분해시켰다. 플라스미드 pFasTBacHTa-gp64 NS3-NS4B-NS5A-TBD를 제한 효소 Spe I 및 Hind III로 분해시켰는데, 이로써 HCV NS4B-NS5A를 암호화하는 서열 및 TBD로 이루어진 단편이 방출되었다. 이로써 생성된 pFastBacHTa-gp64 HCV NS3 벡터 주쇄 를 겔 정제하고 NS5A-TBD 단편에 연결시켜 발현 플라스미드 pFastBacHTa-gp64 HCV NS3-NS5A 키미젠™ 백신 (pFastBacHTa-gp64-NS3-NS5A-TBD) (IDAC 승인 번호 111006-03)을 생성시켰다. pFastBacHTa-gp64-NS3-NS5A-TBD 내의 ORF의 뉴클레오티드 서열 (서열 47) 및 이러한 ORF에 의해 암호화된 아미노산 서열 (서열 58)이 도 10에 도시되었다.
pFastBacHTa HCV 코어 (1-177)-TBD 융합 단백질 플라스미드 및 pFastBacHTa HCV 코어 (1-177)의 구축
HCV 폴리단백질의 아미노산 1-177 (nt 342-872)을 암호화하는 HCV 코어 DNA 서열은 5' 프라이머 CGGAATTCATGAGCACGAATCCTAAAC (서열 30) 및 3' 프라이머 GGACTAGTCCGAAGATAGAGAAAGAGC (서열 31)를 사용하여 pCV-H77C로부터 PCR함으로써 증폭시켰다. 사용된 프라이머에 독특한 5' EcoR I 및 3' Spe I 부위를 부가하였다. PCR 생성물을 EcoR I 및 Spe I로 분해시키고, pFastBacHTa-TBD 및 pFastBac-HTa에 연결시켜 키미젠™ 백신 구조물 pFastBacHTa HCV 코어 (1-177)-TBD 및 pFastBacHTa HCV 코어 (1-177)를 각각 생성시켰다. pFastBacHTa HCV 코어 (1-177)-TBD 내의 ORF의 뉴클레오티드 서열 (서열 48) 및 이러한 ORF에 의해 암호화된 아미노산 서열 (서열 59)이 도 11에 도시되었다.
HCV 코어 (1-177)을 pFastBacHTa-gp64 및 pPSC12 내로 클로닝하여 단백질을 분비된 형태로 생성시켰다. pFastBacHTa-gp64 내로 클로닝하기 위해, HCV 코어 (1-177)-TBD 단편을 Rsr II 및 Hind III 분해에 의해 pFastBacHTa HCV 코어 (l-177)-TBD로부터 분리하고, 동일하게 분해시킨 pFastBacHTa-gp64를 클로닝하여 pFastBacHTa-gp64 HCV 코어 (1-177)-TBD를 생성시켰다.
pPSC12 내로 클로닝하기 위해, NS5A-TBD에 대해 기재된 바와 유사한 도식을 사용하였는데, 단 프라이머 2는 독특한 3' Bgl II 부위를 암호화한다 (AGTAAGATCTTTACAGCCCAGGAGAGTGGGAGAG; 서열 32). 이로써 생성된 구조물은 pPSC12-HCV 코어 (1-177)-TBD이다.
pFastBacHTa HCV E1-TBD 융합 단백질 플라스미드 및 pFastBacHTa-E1의 구축
HCV 폴리단백질의 아미노산 192 내지 369 (914-1452)를 암호화하는 DNA 서열은 독특한 5' EcoR I 부위 및 독특한 3' Spe I 부위를 부가한, 5' 프라이머 CCGGAATTCTACCAAGTGCGCAATTCCT (서열 33) 및 3' 프라이머 GCGCACTAGTCCCTTCGCCCAGTTCCCCACC (서열 34)를 사용하여 pCV-H77C로부터 증폭시켰다. 전체 E1 개방 판독 프레임은 아미노산 383에서 끝나지만, 아미노산 370과 383 사이의 영역은 E2에 대한 신호 서열이므로, 증폭되지 않았다. PCR 생성물을 EcoR I 및 Spe I로 분해시키고, 동일하게 분해시킨 pFastBacHTa-TBD에 연결시켜 HCV E1 키미젠™ 구조물 pFastBacHTa-E1-TBD을 생성시켰다. E1 단독을 발현시키기 위해, 상기 분해시킨 PCR 생성물을 EcoR I 및 Spe I 분해시킨 pFastBac-HTa 내로 클로닝하여 pFastBacHTa-E1을 생성시켰다. pFastBacHTa-E1-TBD 내의 ORF의 뉴클레오티드 서열 (서열 49) 및 이러한 ORF에 의해 암호화된 아미노산 서열 (서열 60)이 도 12에 도시되었다.
pFastBacHTa E2-TBD 융합 단백질 플라스미드 및 pFastBacHTa-E2의 구축
아미노산 384 내지 718로부터의 E2 서열 (HCV 폴리단백질의 nt 1494-2495)은 독특한 5' Spe I 부위 및 독특한 3' Not I 부위를 부가한, 5' 프라이머 GCGCACTAGTCACCCACGTCACCGGGGGAAATG (서열 35) 및 3' 프라이머 GCGCGCGGCCGCCCGTACTCCCACTTAATGGC (서열 36)를 사용하여 pCV-H77C로부터 PCR함으로써 증폭시켰다. 아미노산 719 내지 746은 p7에 대한 신호 서열이기 때문에, 구조물에 포함되지 않았다. PCR 생성물을 Spe I 및 Not I로 분해시키고, 동일하게 분해시킨 pFastBacHTa-TBD에 연결시켜 HCV E2 키미젠™ 구조물 pFastBacHTa E2-TBD를 생성시켰다. 이와 같이 분해시킨 E2를 또한 pFastBac-HTa 내로 클로닝하여 E2 단백질 단독을 발현시키기 위한 pFastBacHTa-E2를 생성시켰다. pFastBacHTa E2-TBD 내의 ORF의 뉴클레오티드 서열 (서열 50) 및 이러한 ORF에 의해 암호화된 아미노산 서열 (서열 61)이 도 13에 도시되었다.
pFastBacHTa-E1-E2-TBD 융합 단백질 플라스미드 및 pFastBacHTa-E1-E2의 구축
pFastBacHTa-E1 내의 E1 서열을 pFastBacHTa-E2 내로 아클로닝함으로써 E1 단백질과 E2 단백질의 융합물을 생성시켰다. pFastBacHTa-E1 플라스미드를 Eco RI 및 Spe I로 분해시키고, 단편을 Eco RI 및 Spe I 분해시킨 pFastBacHTa-E2 내로 클로닝하여 pFastBacHTa-E1-E2를 생성시켰다. E1-E2 키미젠™ 구조물을 만들기 위해, pFastBacHTa-E1-E2를 Eco RI 및 Not I로 분해시키고, 동일하게 분해시킨 pFastBacHTa-TBD 내로 클로닝하여 pFastBacHTa-E1-E2-TBD를 생성시켰다. pFastBacHTa-E1-E2-TBD 내의 ORF의 뉴클레오티드 서열 (서열 51) 및 이러한 ORF에 의해 암호화된 아미노산 서열 (서열 62)이 도 14에 도시되었다.
Bac-대-Bac ® 발현 시스템에서의 재조합 바쿨로바이러스의 생성
이. 콜라이의 형질전환
연결된 플라스미드를 사용하여 이. 콜라이 DH5α를 형질전환시키고, 플라스미드를 표준 프로토콜에 의해 분리하였다. 서열 및 개방 판독 프레임은 서열 분석함으로써 검증하였고 재조합 바쿨로바이러스를 생성시키는데 사용하였다.
전위
재조합체의 생성은 세균성 트랜스포손 Tn7과의 부위 특이적 전위를 이용하는 Bac-대-Bac® 클로닝 시스템 (공급처: Invitrogen)에 기초하였다. 이는 이. 콜라이 균주 DHlOBac에서 수행하였다. DH1OBac 세포는 카나마이신 내성을 부여해 주는 백미드 pMON14272, 및 트랜스포사제 (transposase)를 암호화하고 테트라사이클린에 대한 내성을 부여해 주는 조력 플라스미드 (pMON7124)를 함유한다.
관심있는 유전자를, 클로닝 부위를 플랭킹하는 미니-Tn7 요소를 갖는 pFastBac 플라스미드 내로 클로닝한다. 이 플라스미드를 이. 콜라이 균주 DHlOBac 내로 형질전환시키는데, 이는 LacZα 유전자 내에 Tn7의 부착 부위를 함유하는 바쿨로바이러스 셔틀 플라스미드 (백미드)를 갖는다. 전위로 인해 LacZα 유전자가 붕괴되어, 재조합체 만이 백색 집락을 생성시키므로 용이하게 선별된다.
이. 콜라이에서의 전위를 사용하는 이점은 단일 집락이 재조합체 만을 함유한다는 것이다. 표준 플라스미드 분리 프로토콜을 사용하여 재조합 백미드를 분리하고, 이를 곤충 세포에서의 형질감염을 위해 사용하여 재조합 단백질을 발현하는 바쿨로바이러스를 생성시킨다.
공여자 플라스미드 및 pFastBacHTa-gp64 키미젠™ 벡신 벡터를, 바쿨로바이러스 셔틀 벡터 (백미드) 내로 클로닝된 유전자의 부위 특이적 전위를 위해 사용하였다. 관심있는 유전자를 수반한 재조합 pFastBacHTa-gp64 플라스미드를 전위를 위해 DHlOBac 세포 내로 형질전환시켜 재조합 백미드를 생성시켰다. 40 ㎕ 분취량의 적격한 DHlOBac 세포를 얼음 상에서 해동시키고, pFastBacHTa-gp64에 의거한 플라스미드를 가한 다음, 전기천공에 의해 형질전환을 수행하였다. 형질전환 혼합물을 1 mL의 SOC 배지에 가하고 37℃ 하에 4시간 동안 항온 배양하였다. 형질전환시킨 세포를 LB로 일련으로 희석시켜 10-1 내지 10-2이 되도록 하였고, 100 ㎕의 각 희석액을, 카나마이신 (50 ㎍/mL), 젠타마이신 (7 ㎍/mL), 테트라사이클린 (10 ㎍/mL), X-gal (200 ㎍/mL), 및 IPTG (40 ㎍/mL)을 보충시킨 LB 한천 판 상에 도말하고, 37℃ 하에 36시간 이상 동안 항온 배양하였다.
pFastBacHTa-gp64 플라스미드에 의해 젠타마이신 내성이 부여되었고, X-gal 및 IPTG를 사용하여 백색 집락 (재조합 백미드)을 청색 집락 (비-재조합체)과 구별하였다. 백색 집락을 골라내고, 카나마이신 (50 ㎍/mL), 젠타마이신 (7 ㎍/mL) 및 테트라사이클린 (10 ㎍/mL)을 보충시킨 2 mL의 LB 내로 접종한다음, 진탕시키면서 37℃ 하에 밤새 항온 배양하였다. 멸균성 루프를 사용하여 소량의 밤새 배양물을 샘플링하고, 샘플을 카나마이신 (50 ㎍/mL), 젠타마이신 (7 ㎍/mL), 테트라사이클린 (10 ㎍/mL), X-gal (100 ㎍/mL), 및 IPTG (40 ㎍/mL)을 보충시킨 신선한 LB 한 천 판 상에 스크리킹한 다음, 37℃ 하에 36시간 이상 동안 항온 배양하여 백색 표현형을 확증하였다.
표준 프로토콜에 의해 재조합 백미드를 분리하고 [참고: Sambrook et al. In Molecular Cloning, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press], DNA 샘플을 40 ㎕의 TE (10 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA)에 용해시키고 형질감염을 위해 사용하였다.
형질감염: 재조합 바쿨로바이러스의 생성
재조합 바쿨로바이러스를 생성하기 위해, 관련 백미드를 Sf9 곤충 세포 내로 형질감염시켰다. Sf9 세포 (9 x 105)를 2 mL의 ESF 921 중의 6 웰 세포 배양 디쉬 (35 mm 웰)의 각 웰에 시딩하고, 27℃ 하에 1시간 이상 동안 부착시켜 두었다. Sf9 세포 공급업자가 제공한 프로토콜에 따라서 셀펙틴 (Cellfectin®) 시약을 사용하여 형질감염을 수행하였다. 형질감염 후, 세포를 27℃ 하에 72시간 동안 항온 배양하였다. 바쿨로바이러스를 함유하는 배지를 수집하고 4℃ 하 암실에서 저장하였다.
바쿨로바이러스성 DNA의 생성에 관해 검사함으로써 형질감염 효율을 검증하였다. 분리된 바쿨로바이러스 DNA를 대상으로 하여 PCR을 수행하여 관심있는 삽입된 유전자에 관하여 스크리닝하였다. 상기 세포에서의 이종 단백질의 발현은 프로브로서 6xHis 태그-HRP 접합된 모노클로날 항체 또는 항-마우스 IgG (Fc 특이적) 서양고추냉이 퍼옥시다제 접합된 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 및 SDS-PAG함으로써 검증하였다.
재조합 바쿨로바이러스 스톡의 증폭
일단 바쿨로바이러스의 생성과 목적하는 단백질의 발현이 확인되면, 바이러스 농축물을 증폭시켜 관심있는 유전자를 보유하고 있는 바쿨로바이러스의 농축된 스톡을 생성시킨다. 본원에 기재된 모든 프로토콜에서는, 바쿨로바이러스를 2회 이상 증폭시키는 표준 실시를 수행하였다. 증폭 제2 회전 후, 이로써 생성된 바쿨로바이러스의 농도를, 바쿨로바이러스 역가측정 검정 (공급처: Expression Systems)를 사용하여 정량화하였다. Sf9 세포를 감염시키는데 가장 적당한 바이러스 농도, 및 목적하는 단백질을 생성하기 위한 최적의 시점이 또한 확립되었다. 양 단층 뿐만 아니라 Sf9 세포의 현탁 배양물을 발현하기 위한 프로토콜이 표준 과정에 따라서 개발되었다.
바쿨로바이러스 역가측정 검정
바쿨로바이러스 역가측정 검정 (공급처: Expression Systems)을 사용하여 모든 바이러스성 스톡을 역가 측정하였다. 바이러스성 스톡을 10-1에서 10-4으로 일련으로 희석시켰다. 100 ㎕ 분취액의 각각의 희석된 샘플을 코스타르 로우 어태치먼트 (Costar Low Attachment3) 96 웰 판의 웰에 가하였다. 이어서, 100 ㎕의 Sf9 세포를 2 x lO6개/mL 농도로 각 웰에 가하고, 판을 200 내지 250 rmp 하의 궤도 진탕기 항온 배양기에서 27℃ 하에 18시간 동안 항온 배양하였다.
항온 배양 후, gp64-PE 접합된 항체를 1:200으로 희석시키고, 이소형 대조군 (IgG2A-PE)을 1:10으로 희석시켰다. 판을 1800 rpm으로 3분 동안 원심분리시켰다. 판을 역위시킴으로써 배지를 꺼내고, 50 ㎕의 gp64-PE 접합된 항체 또는 50 ㎕의 이소형 대조군을 웰에 가하였다. 이어서, 상기 판을 4℃ 암실에서 20분 동안 항온 배양하였다.
150 ㎕의 찬 PBS를 각 웰에 가하고 상기 언급된 바와 같이 판을 하향 원심분리시킴으로써, 세포를 세척하였다. 이어서, 200 ㎕의 찬 PBS를 각 웰에 가한 다음 또 다른 스핀을 적용하고, 최종적으로 200 ㎕의 PBS/0.1% BSA를 각 웰에 가하여 세포를 재현탁시키고 분석을 위해 FACS 튜브로 옮겼다. 이소형 대조군을 사용하여 형광 유동 세포계수기 상에 게이트를 설정하였다. 발현에 대해 양성인 세포 집단의 비율을 공급된 엑셀 스프레드시트 내로 삽입하고 대조군 바이러스에 기초하여 표준 곡선을 생성시킴으로써, 바이러스성 역가를 결정하였다.
단백질 발현의 최적화
키미젠™ 단백질 발현을 일정 범위의 MOI 및 시간에 걸쳐 최적화하였다. ESF 921 중의 Sf9 세포 50 mL 배양물 4개를 2 x 106개 세포/mL로 시딩하고, MOI 0.5, 1, 5 및 10로 감염시키며, 1 mL 배양물을 감염 후 각종 시점이 지난 후 수거하였다. 샘플링된 배양물을 12000 xg으로 1분 동안 원심분리시키고, 상등액과 세포를 격리시켰다. 세포와 상등액을 SDS-PAGE 분석용으로 즉시 제조하였다. 세포를 500 ㎕의 PBS에 재현탁시키고, 150 ㎕의 현탁액을 40 ㎕ 5x 부하 완충액 및 10 ㎕ 2Ox 환원제에 가하였다. 또한, 150 ㎕의 상등액을 40 ㎕ 5x 부하 완충액 및 10 ㎕ 2Ox 환원제와 혼합하였다. 샘플을 5분 동안 비등시키고, 웨스턴 블롯 분석을 위해 12% SDS-PAGE 겔 상에 부하하였다. 단백질 생성은 NS5A 키미젠™ 단백질의 경우에 36시간째 MOI 0.5에서 최상이고, NS3 키미젠™ 단백질의 경우에는 48시간째 MOI 2에서 최상이며, 다중-항원 키미젠™ 단백질의 경우에 36시간째 MOI 1.5에서 최상인 것으로 평가되었다.
세포내 키미젠™ 백신의 정제
NS5A 키미젠™ 단백질의 대규모 발현 및 세포 용해물의 제조
ESF 921 배지 중에 약 2 x 106개 세포/ml 밀도의 Sf9 세포 배양물 5 리터를 바쿨로바이러스로 MOI 0.5로 감염시켰다. 세포 생육도가 약 95%일 때 감염을 시작한 후 약 36시간에 세포를 수거하였다. 발현 시간이 더 길어지면 세포 생육도 손실이 증가하고 NS5A 키미젠™ 단백질이 집중적으로 분해되었다. 감염된 세포는 원심분리함으로써 수집하고 사용할 때까지 -80℃ 하에 저장하였다.
감염된 세포 배양액 1 L로부터의 동결된 펠릿을, 고농도의 트윈 20 (6 M GuHCl, 50 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, 1% 트윈 20, 1O mM γ-머캅토에탄올, pH 8.0)을 함유하는 200 ml 용해 완충액 중의 얼음 상에서 와동시킴으로써 신속하게 재현탁시켰다. NS5A 키미젠™ 단백질을 Ni-NTA 수지에 효율적으로 결합시키기 위해서는 고농도의 트윈 20이 필요하였다. 이와 같이 재현탁시킨 현탁액을 얼음 상에서 각 초음파 처리 펄스 간에 2분 간격으로 1분씩 3회 초음파 처리하였다. 이어서, 이와 같이 초음파 처리시킨 용해물을 실온에서 2시간 동안 교반시켰다. 교반시킨 용해 물을 원심분리시킴으로써 (10℃ 하에 15분 동안 약 27,000 x g) 제거하고, 상등액을 Ni-NTA 슈퍼플로우 (superflow) 상에서 친화 크로마토그래피하는데 사용하였다.
NS3 키미젠™ 단백질의 발현 및 세포 용해물의 제조
표준화 감염 다중도 (MOI)의 HCV NS3 키미젠™ 단백질을 암호화하는 재조합 바쿨로바이러스를 사용하여, 단백질 발현을 위해 Sf9 곤충 세포를 감염시켰다. Sf9 세포를 2 L 에를렌마이어 (Erlenmeyer) 플라스크 내에서 500 ml의 ESF 921 배지 중에 6 x 105개 세포/mL 밀도로 시딩하였다. 세포 배양물을 세포 밀도가 2-3 x 106개 세포/mL에 도달할 때까지 120 rpm으로 진탕시키면서 27.5℃ 하에 항온 배양하였다. HCV NS3 키미젠™ 단백질의 경우에는, 세포를 MOI 2로 48시간 동안 감염시켰다. 관심있는 단백질의 발현을 모니터링하기 위해 세포 용해물 상에서 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 세포를 4℃ 하에 10분 동안 3,000 rpm으로 원심분리함으로써 (1593 x g, JA10, Beckman Coulter Avanti™ J25) 수거하고, 신선한 세포 펠릿을 재조합 단백질의 정제를 위해 사용하였다. 또 다른 한편, 세포 펠릿을 적응용 배지에 재현탁시키고, 50 mL 원뿔형 튜브 (각 튜브에 대해 250 mL 세포 배양물) 내로 분배하며, 4℃ 하에 8분 동안 벡크만 (Beckman) GS-6R 원심분리기에서 2,200 rpm으로 회전시켰다. 세포 펠릿을 액체 질소에서 신속히 동결시킨 다음, -80℃ 하에 저장하였다.
동결시킨 세포 펠릿 (세포 배양 배지 2 x 50O mL에 등가임)을 1분 동안 78 W 초음파 처리함으로써 (세팅 6.5) 200 mL의 빙냉 용해 완충액 (6 M GuHCl, 15O mM NaCl, 2O mM 트리스-HCl, pH 8.00) 중의 얼음 상에 재현탁시켰다. 혼합물을 25O mL 유리 비이커에 옮기고 4회 이상 (매회 1분, 78 W) 초음파 처리하였는데, 5분 동안 간헐적으로 냉각시켰다. 혼합물을 실온으로 이동시키고 CTAB를 1% (w/v)의 최종 농도에 가하였다. pH를 검사하고 조정하여 pH 8.00으로 만들고, 용해물을 2시간 동안 항온 배양하였다. 벡크만 아반티 (Beckman Avanti) J-25 원심분리기에서 JA 25.50 회전기를 사용하여 상기 용해물을 10℃ 하에 15,000 rpm (27,000 xg)으로 30분 동안 원심분리시키고, 상등액을 대상으로하여 Ni-NTA 친화 크로마토그래피하였다.
다중-항원 키미젠™ 단백질의 대규모 발현 및 세포 용해물의 제조
ESF 921 배지 4 리터를 셀백 (Cellbag)에 옮기고 웨이브 생물 반응기 시스템 2/10 EH 상에서 27.5℃로 가온시켰다. 6 x 106개 세포/mL 농도의 Sf9 세포 배양액 1 리터를 상기 셀백에 가하였다. 이어서, 상기 셀백을 분당 0.3 L로 공기를 주사하면서 27.5℃ 하에 항온 배양하고, 130 rpm으로 진동시켰다. 세포 밀도가 2 x 106개 세포/ml에 도달하게 되면, 재조합 바쿨로바이러스를 MOI 1.5로 접종하였다. 감염시킨지 36시간 후, 상기 백을 얼음 상에서 냉각시키고 세포를 4℃ 하에 10분 동안 4500 x g으로 원심분리시킴으로써 수거하였다. 세포 펠릿을 빙냉 PBS에 현탁시킨 다음, 50 mL 원뿔형 튜브 (튜브당 300 mL 배양액으로부터의 펠릿)에 옮겼다. 세포 펠릿은 4℃ 하에 15분 동안 2800 x g 하에 원심분리시킴으로써 회수하였다. 펠릿을 액체 질소에서 즉시 동결시키고 사용할 때까지 -80℃ 냉동고에서 저장하였 다.
250 ml 배양액으로부터의 동결시킨 Sf9 세포 펠릿을 20 ml 1X PBS, 1% 트윈 20, 5O mM DTT, 5 mM EDTA, pH 8.0에 현탁시키고, 얼음 상에서 30분 동안 항온 배양하였다. NaOH를 사용하여 용해물의 pH를 pH 12.0로 조정하고 실온 하에 30분 동안 교반시켰다. HCl을 사용하여 pH를 8.0으로 저하시키고, 39191 xg 하에 30분 동안 원심분리시켰다. 상등액을 제거하고 펠릿을 20 ml 1X PBS, 1% 트윈 20, 1O mM DTT, 1 mM EDTA, pH 8.0에 현탁시켰다. pH를 상기 언급된 바와 같이 12.0로 상승시키고 8.0으로 저하시켰다. 상등액을 모으고 2O mM 트리스, 0.05% 트윈 20, O.l mM EDTA, 1O mM γ-머캅토에탄올, pH 8.0에 대항하여 투석시켜 크기 배제 및 소수성 상호 작용 크로마토그래피에 사용하였다.
Ni-NTA 친화 크로마토그래피하는 경우, 500 ml 배양액으로부터의 동결시킨 Sf9 세포 펠릿을 50 mL 빙냉 용해 완충액 (6M 구아니딘-HCl, 5O mM 탄산나트륨, 20% 에탄올, pH 10)에 현탁시켰다. 세포 용해물을 1분 동안 80 W로 초음파 처리기 3000 (공급처: Misonic Inc.)에 의해 얼음 상에서 5회 초음파 처리시켰다. 트윈 20을 상기 용해물에 가하고 (최종 농도 1%), 용해물을 실온 하에 2시간 동안 교반시켰다. 용해물 중의 불용성 미립자를 4℃ 하에 30분 동안 39,191 x g로 원심분리시키고 Ni-NTA 친화 크로마토그래피하였다.
HCV 코어 키미젠™ 단백질의 발현 및 세포 용해물의 제조
HCV 코어 키미젠™을 두 시스템에서 발현시켰다. 재조합 바이러스는 pPSC12-HCV 코어 (1-177)-TBD와 선형화 바쿨로바이러스 게놈을 Sf9 세포에서 공동- 형질감염시킴으로써 생성시키고, 플라크 정제한 다음, 증폭시켰다. 최적화 후, Sf9 배양물을 MOI 5로 감염시키고, 27.5℃ 하에 50시간 동안 항온 배양한 후 수거하였다. 재조합 바이러스는 또한, 이. 콜라이 DHlOBac 세포를 pFastBacHTa-gp64 HCV 코어 (1-177)-TBD로 형질감염시킴으로써 Bac-대-Bac® 시스템을 이용하여 생성시켰다. 재조합 백미드를 분리하고, 이를 사용하여 Sf9 세포를 형질감염시켜 재조합 바쿨로바이러스를 만들었다. Sf9 배양물을 27.5℃ 하에 49시간 동안 MOI 5로 감염시킨 후, 원심분리하여 수거하였다. 기타 키미젠™ 단백질에 대해 상기 언급된 바와 실질적으로 동일한 방식으로 용해물을 제조하고 Ni-NTA 친화 크로마토그래피하였다.
Ni-NTA 친화 크로마토그래피
세포 용해물을 10 상 용적의 용해 완충액으로 평형시킨 Ni-NTA 슈퍼플로우 칼럼 상으로 부하하였다 (2.5 L 세포 배양 펠릿당 10 ml 수지 상 용적). 이 칼럼을 A280<0.01까지 감소된 % 트윈 20 (6 M GuHCl, 50 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, 0.1% 트윈 20, 1O mM γ-머캅토에탄올, pH 8.0)을 함유하는 세척 완충액으로 세척한 다음, 15 mM 이미다졸을 함유하는 동일한 세척 완충액으로 세척하였다. 이어서, 표적 단백질을 1 상 용적 분획 중의 10 ml 상 용적의 용출 완충액 (6 M GuHCl, 50 mM NaH2PO4, 250 mM 이미다졸, 0.1% 트윈 20, 1O mM γ-머캅토에탄올, pH 8.0)으로 용출시켰다. 용출된 단백질을 함유하는 분획을 모으고 투석 완충액 3 x 4L (8 M 우레아, 2O mM 트리스, 0.1% 트윈 20, 25 mM 에틸렌디아민, 1O mM γ-머캅토에탄올, pH 8.5)에 대항하여 투석시켰다. 탈이온화 우레아를 이용하여 모든 우레아 함유 완충액을 제조하여 단백질의 카바밀화를 방지시켰다. 우레아는 앰벌라이트 (Amberlite®) MB-1 (공급처: Supelco, PA, USA) (10 g/L/hr)을 이용하여 탈이온화하고, 시아네이트 스캐빈저 에틸렌디아민을 상기 완충액에 가하였다 (25 mM 최종).
이온 교환 크로마토그래피
그 다음, Ni-NTA 친화 크로마토그래피에 의해 수득된 투석시킨 NS5A 키미젠™ 단백질 함유 샘플을, 투석 완충액에서 평형시킨 바 있는 토요펄 (Toyopearl®) 슈퍼 Q3 수지 칼럼 상으로 통과시켰다 (2.5 ml 상 용적/2.5 L 세포 배양 펠릿). 이온 교환 칼럼을 A280<0.01까지 이온 교환 세척 완충액 (8 M 우레아, 2O mM 트리스, 0.05% 트윈 20, 25 mM 에틸렌디아민, 1O mM γ-머캅토에탄올, pH 8.5)으로 세척하였다. 이어서, 단백질을 증가 농도의 염 (75 mM, 15O mM 및 50O mM NaCl)을 함유하는 10 상 용적의 세척 완충액을 이용하여 상기 칼럼으로부터 용출시켰다. 1 상 용적 분획을 수집하였다. NS5A 키미젠™ 단백질은 주로 15O mM NaCl 분획에서 용출 제거되었다. 약간 더 낮은 MW의 오염성 단백질은 75 mM NaCl에서 용출 제거되었다. 용출시킨 단백질 분획을 모으고, 4℃ 하에 최종 투석 완충액 (15O mM NaCl, 1O mM NaH2PO4, 0.05% 트윈 20, pH 8.5)에 대항하여 즉시 투석시켰는데, 투석당 2 L를 사용하고 5가지 다양한 투석 완충액을 이용하였다. 투석시킨 단백질은 단백질이 이에 부착되는 것을 방지하기 위해 예비습윤시킨 0.2 ㎛ 필터를 통하여 여과시켰다. 정제된 NS5A 키미젠™ 단백질을 4℃ 하에 저장하였다.
NS3 키미젠™ 단백질을 추가로 정제하기 위해, CM-세파로스3 고속 유동 매트릭스를 8 M 우레아 (탈이온화), 25 mM NaH2PO4, 5 mM 에틸렌디아민, 0.05% (v/v) 트윈 20, 1O mM DTT, pH 6.50로 평형시켰다. 단백질을 1 mL/min의 유속으로 동일한 완충액 중의 염화나트륨 선형 구배 (0 내지 0.6 M)를 사용하여 용출시켰다. 단백질을 함유하는 분획 (25 내지 5O mM NaCl)을 모았다.
Ni-NTA 칼럼에 의해 포획된 샘플을 함유하는 다중-항원 키미젠™ 단백질은 AKTAexplorer3 100 FPLC 시스템을 사용하여 HiTrap3 Q XL 1 ml 칼럼에 의해 추가로 정제하였다. Ni-NTA 친화 크로마토그래피로부터의 용출 완충액 중의 단백질을 아미콘 울트라 (Amicon Ultra)-15 (MWCO 30,000 Da)에 의해 농축시킨 다음, 완충액을 완충액 A (8 M 우레아, 5O mM 탄산나트륨, 25 mM 에틸렌디아민, 1% 트윈 20, pH 10)으로 교환하였다. 단백질을 HiTrap Q™ XL 칼럼 상에 부하하고, 50 ml의 완충액 A로 60 mL/hr의 유속으로 평형시켰다. 용출물의 A280이 0.01 미만으로 될 때까지 상기 칼럼을 완충액 A로 세척하였다. 단백질을 20 칼럼 용적으로 100% 완충액 A에서부터 100% 완충액 B (1 M 염화나트륨을 수반한 완충액 A)까지의 선형 구배 용출에 의해 용출시켰다. HCV 다중-항원 키미젠™ 단백질을 병류 분획물에서 용출시키고 이 분획에서 40% 내지 50% 완충액 B를 용출시켰다.
크기 배제 크로마토그래피
슈퍼덱스3 (Superdex3) 200 조제 등급을 AKTAexplorer 100 FPLC 시스템 (공 급처: GE healthcare)을 사용하여 3 MPa의 압력 하에 트리콘3 (Tricon3) 칼럼 10/300 (1 x 30 cm, 공급처: Pharmacia Biotech)에 패킹하였다. 이 칼럼을 100 ml의 6 M 구아니딘, 50 mM 탄산나트륨, pH 10으로 세척하였다. 키미젠™ 다중-항원 단백질을 함유하는 0.5 mL의 용출액을 상기 슈퍼덱스 200 칼럼 상에 부하하였다. 단백질을 30 mL/hr의 유속으로 용출시키고 0.5 mL 분획을 수집하였다. 280 nm 하에서의 흡광도에 의해 단백질 용출을 모니터링하였다.
소수성 상호 작용 크로마토그래피
페닐-650C 토요펄® (0.5 mL, 공급처: TOSOH Corp.)을 폴리-프렙 칼럼 (공급처: Bio-Rad) 내로 패킹하였다. 이 칼럼을 20 mL HIC 결합성 완충액 (0.1 M 트리스, 2 M 염화나트륨, pH 8)으로 평형시켰다. 2 M의 최종 농도의 염화나트륨을, 키미젠™ 다중-항원 단백질을 함유하는 0.5 mL 용출액에 가하고, 추출물을 3.5 mL HIC 결합성 완충액으로 희석시켰다. 20분 동안 18,000 rpm으로 원심분리시킴으로써 (39,191 x g, JA25.50 회전기에 의함, Beckman Coluter Avanti™ J-25 원심분리기) 불용성 미립자를 제거하였다. 상등액을 중력 유동에 의해 30 mL/hr의 유속으로 상기 칼럼 상에 부하하였다. 이어서, 이 칼럼을 10 mL HIC 결합성 완충액으로 세척하고, 칼럼 상에 결합된 단백질을 5 mL HIC 용출 완충액 (8 M Urea, 50 mM 에틸렌디아민, 0.5% 트윈 20, pH 10.5)으로 용출시켰다.
정제된 키미젠™ 단백질의 생화학적 평가
제작업자가 제공한 프로토콜에 따라서 미세판 과정에서 마이크로 BCA3 단백 질 검정 시약 키트를 사용하여 단백질 농도를 평가하였다.
SDS-PAGE 분석의 경우에는, 5x 단백질 부하 완충액 및 2Ox 환원제를 부가함으로써 정제된 단백질의 분취액을 변성시켰다. 변성된 단백질은 12% SDS 폴리아크릴아미드 겔 상에서 격리시키고, 이 겔을 제작업자가 제공한 조건 하에 페이지블루3 (PageBlue3)으로 염색시켰다.
웨스턴 블롯 분석하는 경우에는, 단백질을 12% SDS-PAGE에 의해 격리시키고, 48 mM 트리스 기재, 39 mM 글리신, 20% 메탄올 및 0.0375% SDS를 함유하는 완충액을 사용하여 하이본드3 (Hybond3) ECL3 니트로셀룰로스 막 상으로 전기블롯팅하였다. 이 막을 먼저, 실온 하에 1시간 동안 차단 완충액 (1% 탈지유, PBS 중의 0.1% 트윈 20)에서 항온 배양하였다. 탐지를 위한 항체는 차단 완충액에서 희석시켜 목적하는 농도로 만들었다. 막을 상기 희석시킨 항체와 함께 지속적으로 혼합하면서 실온 하에 1시간 동안 항온 배양하였다. 각 항체와 함께 항온 배양한 후, 막을 실온 하에 세척당 10분 동안 차단 완충액으로 3회 세척하였다. ECL3 웨스턴 블롯팅 탐지 키트를 이용한 화학발광 및 코닥 바이오맥스 (Kodak Biomax) XAR X-선 필름에 대한 노출에 의해 단백질 탐지를 수행하였다.
단백질의 당화를 정량적으로 탐지하기 위해, Pro-Q® 에머랄드 300 당단백질 겔 및 블롯 염색 키트 (개발업자: Molecular Probes)를 사용하였다. 이 키트를 사용하여 겔 또는 블롯 상에서 SDS-PAGE에 의해 격리된 단백질 상의 탄수화물을 탐지할 수 있다. 염색물은 대부분의 총 단백질 염색물과 화합성이고, 경우에 따라 질 량 분광법에 의한 분석과도 화합성이다. 염색물이 과요오드화물-산화된 탄수화물 기와 반응하여 밴드당 0.5 ng 정도로 아주 적은 당단백질을 탐지하는 경우에, 연녹색-형광성 신호가 생성된다. 이러한 염색은 과요오드산과 쉬프 (Schiff) 방법의 변형이고, 제조업자는 50배 더 큰 민감도 수준을 청구하고 있다. 키트에는 캔디캔 (CandyCane™) 분자량 표준물이 포함된다. 이러한 표준물은 각각 양성 및 음성 대조군으로서 제공되는 대체 당화 및 비당화 단백질로 이루어진다. 단백질 샘플을 SDS-PAGE한 후, 겔을 50% MeOH 및 5% 아세트산에서 밤새 고정시켰다. 겔을 3% 빙초산으로 20분 동안 2회 세척시킨 다음, 산화성 용액 과요오드산에서 30분 동안 글리칸 산화시켰다. 겔을 3% 빙초산으로 20분 동안 3회 세척한 다음, 암실에서 최대 120분 동안 신선한 Pro-Q3 에머랄드 300 염색용 용액에서 염색하였다. 영상화하기 전에, 암실 하에 3% 빙초산에서 20분씩 2회 더 세척하였다. 염색물의 여기/방출 최대는 280/530 nm이고, 가장 최적의 가시화는 대략 300 nm이다. 겔을 가시화하고 진제니우스 [GeneGenius (Syngene)] 트랜스일루미네이터 및 상응하는 소프트웨어를 사용하여 스캐닝하였다.
키미젠™ 백신의 면역학적 성상 확인
인간 PBMC (말초혈 단핵 세포)
PBMC는 HLA-A2 일배체형 (공급처: Biological Specialty Corporation)을 갖는 비-HCV-감염된 개체로부터의 백혈구성분 채집용 제제를 피콜-하이파크 구배 원심분리함으로써 수득하였다. PBMC를 동결용 배지 (50% 인간 AB 혈청, 40% AIM-V® 및 10% DMSO)에서 한랭 바이알당 3 x 107개 세포로 액체 질소에 저장하였다.
단구를 미성숙 DC (수지상 세포)로의 분화 및 분리
PBMC를 2.5% 매칭 혈청을 수반한 AIM-V® 배지에서 37℃ 하에 1시간 동안 100 mm 조직 배양 판 (공급처: BD Biosciences) 상에서 배양하였다. 배양한 후, 비-부착성 세포를 제거하고, 판을 AIM-V® 배지로 세척하였다. 이어서, 부착성 세포를, IL-4 및 GM-CSF (각각 1000 IU/mL)를 함유하는 2 mL의 AIM-V®/2.5% 매칭 혈청과 함께 배양하였다.
미성숙 DC에 대한 HCV 키미젠™ 단백질의 결합성
단구를 24 내지 72시간 동안 IL-4 및 GM-CSF의 존재 하에 배양함으로써 미성숙 DC를 수득하였다. 배양한 후, 세포를 수거하고, 2.5% 매칭 혈청을 함유하는 AIM-V® 배지로 1회 세척한 다음, 0.1% (w/v) BSA를 함유하는 둘벡코 인산염 완충 식염수 (공급처: Invitrogen) (PBSB)로 2회 세척하였다. 상기 세포를 사용하여 키미젠™ 단백질의 결합성과 내재화를 평가하였다. 미성숙 DC의 표현형은 CD64, CD32, CD16, CD206, HLA-ABC, HLA-DR, CD14, CD11c, CD86, CD80, CD40, CD83, CD19, CD3, 및 CD4를 포함한 각종 세포 표면 마커에 대해 표지화함으로써 평가하였다.
결합성 검정의 경우에는, 모든 단계를 4℃ 하에 수행하였는데, 세척은 항원 배양 후에 수행하였다. 세포를 각종 농도의 키미젠™ 단백질 또는 상응하는 투석 완충액 (25 ㎕ 용적의 96-웰 v-바닥 판 중의 2 x 105개 세포/웰)과 함께 PBSB 중에서 60분 동안 항온 배양하였다. 세포를 PBSB 중의 바이오티닐화 항-마우스 IgG1 또는 항-6xHis 항체와 함께 20분 동안 항온 배양한 다음, SA-PE-Cy5와 함께 20분 동안 항온 배양함으로써 단백질 결합성을 탐지하였다. 세포를 2% 파라포름알데히드 (PF)를 함유하는 PBSB에 재현탁시켰다. NS5A 키미젠™ 단백질을 사용하는 실험에서는, 토끼 항-NS5A 폴리클로날 항체, 염소 항-토끼 IgG-바이오틴, SA-PE-Cy5 조합물을 사용하여 결합성을 탐지하였다. 세포를 2% 파라포름알데히드 (PF)를 함유하는 PBSB에 재현탁시키고, 형광 세포 유동계수법 (FFC)에 의해 세포 결합성을 평가하였다.
결합 억제제를 사용한 키미젠™ 백신에 대한 DC 수용체의 성상 확인
미성숙 DC를 항-CD32 mAb (IgG2b 이소형), 항-CD206 (IgG1 이소형) 또는 이소형 대조군 마우스 IgG2b 또는 IgG1 mAb와 함께 PBSB 중에서 4℃ 하에 60분 동안 항온 배양하였다. 연속해서, 세포를 4℃ 하에 60분 동안 PBSB 중에서 키미젠™ 백신과 함께 항온 배양하였다. 세척 후, 바이오티닐화 항-마우스 IgG1 mAb 또는 바이오티닐화 항-6xHis mAb에 이어 SA-PE-Cy5를 사용하여 FFC 분석함으로써 세포에 대한 결합성을 탐지하였다.
형광 세포 유동계수법 (FFC) 분석
셀퀘스트 프로 (CellQuest Pro) 획득 및 분석 소프트웨어 (공급처: BD Biosciences)가 부착된 FACSCalibur를 사용하여 세포를 획득하였다. FSC 및 SSC 스캐터 프로파일에 의해 결정된 바와 같이 살아있는 세포 집단 상에 게이트를 설정하고 ≥20,000개 사건을 획득하였다. 특이적 양성 세포 비율을 다음과 같이 계산하였다: (% 양성 세포 시험 샘플 - % 양성 세포 대조군)/(100 - % 양성 세포 대조군) x 100. 상대적 평균 형광 세기 (MFI)는 다음과 같이 결정하였다: 시험 샘플의 MFI - 대조군 샘플의 MFI.
항원 제시 검정 (APA)
APA를 사용하여, APC에 의해 제시된 항원에 대한 T 세포의 면역 반응을 측정하였다. 본 검정은 기능성 T 세포 면역 반응과, 항원 특이적 T 세포의 증식을 유도시킬 수 있는 항원-부하된 성숙한 DC의 능력을 정량화한다. 이 과정에는 PBMC-유래된 단구를 미성숙 DC로 분화시키고, 이러한 미성숙 DC에 항원 (키미젠™ 단백질 또는 TT)을 부하하며, 미성숙 DC를 성숙한 DC로 분화시킨 다음, 성숙한 항원-부하된 DC를 자기 유래의 본래 그대로 T 세포와 함께 배양하는 것을 포함한다. 활성화 및 증식 검정의 경우에는, 배양한지 7일 후에 T 세포를 분석하였다. T 세포 기능과 특이성을 분석하기 위해, T 세포를 항원 부하된 성숙한 DC로 2회 더 자극하고, IFN-γ, TNF-α, 그랜자임 (granzyme) B (grB), 및 페르포린 (perforin) (pfn)의 생성을 평가하였다. 항원에 대한 T 세포의 특이성은 특이적 MHC 부류 I 사량체 또는 오량체를 사용하여 평가하였다.
항원 부하된 성숙한 DC의 생성
미성숙 DC를 상기 언급된 바와 같이 생성시키고, 이를 항원 또는 완충액 (대조군)과 함께 8시간 동안 항온 배양하였다. 이어서, 세포를 성숙제 폴리 IC (20 ㎍/mL), 재조합 인간 (rh) IL-1β (10 ng/mL), rhTNF-α (10 ng/mL), rhIL-6 (10 ng/mL), rhIFN-αA (1000 U/mL), 및 rhIFN-γ (1000 U/mL)와 함께 16시간 동안 배양하였다. DC의 성숙 정도는 표현형 분석에 의해 평가하였다. 세포를 CD64, CD32, CD16, CD205, CD206, CD209, HLA-ABC, HLA-DR, CD14, CD11c, CD86, CD80, CD83, CD40, CD19, CD3, CD8, 및 CD4을 포함한 각종 세포 표면 마커에 대해 표지하였다. 성숙한 항원 부하된 DC를 세척하고 T 세포와 함께 배양하였다.
인간 PBMC (말초혈 단핵 세포)-유래된 T 세포의 분리
제조업자의 과정에 따라서 다이날 (Dynal) 바이오텍 T 세포 음성 선별 키트 (공급처: Invitrogen)를 사용하여 음성 선별함으로써, T 세포를 PBMC로부터 분리하였다. 매칭 혈청을 BSA 및 FBS 대신 사용하였다. 이와 같이 분리된 세포의 표현형은 각종 세포 마커에 대한 표현형 표지화에 의해 평가하였다. T 세포 (CD3+ 세포)는 분리된 집단의 98% 이상을 차지하였다. T 세포를 CFSE (하기 참조)로 표지시키거나 DC와의 세포 배양물에 직접 가하였다.
T 세포의 CFSE 표지화
신선하게 분리된 T 세포 (1 내지 5 x 107개 세포)를 500 ㎕의 PBSB에 현탁시키고, 500 ㎕의 신선하게 제조된 CFSE의 10 ㎍/ml 작동 스톡 용액과 혼합하였다. 37℃ 하에 10분 동안 항온 배양한 후, 세포를 혈청 함유 배지 (AIM V®/10% 매칭 혈청)로 광범위하게 세척하여 혼입되지 않은 CFSE를 제거하였다. T 세포의 CFSE 표지화는 FFC에 의해 확증하였다.
인간 PBMC-유래된 T 세포의 배양
T 세포를 AIM V®/25% 매칭 혈청에서 웰당 1 내지 20 x 104개 T 세포 대 1 내지 5 x 104개 DC의 비율로 항원 부하된 성숙한 DC와 함께 항온 배양하였다. T 세포 활성화 및 증식 APA 실험의 경우에는, T 세포를 배양 4일 후 및 7일 후에 수거하였다 (하기 참고). T 세포 기능 및 특이성 APA 실험의 경우에는, T 세포를 7일 동안 배양한 다음, 항원 부하된 성숙한 DC로 재자극하고 7일 더 배양하였다. 이어서, 14일 배양한 T 세포를 두 군 [세포내 사이토킨 (ICC) 판과 사량체 판]으로 분할시키고, 항원 부하된 DC로 세 번째 자극하였다. 1 ㎍/ml의 브레펠딘 (Brefeldin) A (공급처: BD Biosciences)를 ICC IFN-γ 판의 웰에 가하고 세포를 6시간 동안 배양하였다. IFN-γ, TNF-α, grB, 및 pfn의 발현을 다음에 요약된 바와 같이 평가하였다. 다음에 요약되는 바와 같이 자극 후 5 내지 6일째에 사량체 분석을 수행하였다.
T 세포 활성화 및 증식 분석
활성화/증식 APA의 경우에는, T 세포를 항원 부하된 DC와 배양한지 4일 또는 7일 후에 수거하였다. T 세포를 대상으로 하여 CD69 (초기 활성화 마커)의 발현과 CFSE 세기 (증식 정도)에 관하여 평가하였다. 수거된 세포를 항-CD3-PE, 항-CD8-PE-Cy5, 및 항-CD69-APC로 표지시켰다. 완충액 대조군 샘플을 사용하여, 어떠한 증가도 진행되지 않은 T 세포 집단을 확인하였다. 고도의 형광으로 표지시킨 상기 집단을 FL1 채널에서 탐지하고 CFSEhi로 명명하였다. 1회 분할을 진행한 세포 집단 은 CFSEhi 집단의 MFI의 절반을 갖는다. 유사하게, 2회 분할을 진행한 집단은 CFSEhi 집단의 MFI의 대략 25% (1/4 수준)를 갖는다. CFSEhi 형광 보다 더 낮은 CFSE 형광을 나타내는 세포는 CFSElo로 명명되었다. 몇몇 세포 집단은 거의 배경 FL1 채널 형광을 갖고 있었는데, 이는 CFSE- (CFSE 음성)으로 명명되었다. 그러나, 본원에 요약된 실험 목적상, T 세포는 CFSEhi (세포 분할이 전혀 없음) 또는 CFSElo (1회 이상의 세포 분할이 있음)로 간주되었다.
CD69의 발현을 평가함으로써 T 세포 활성화를 정량화하였다. 몇몇 실험에서는, 고 FSC 및 SSC 세기 CD3+ T 세포 집단 상에서 게이트시킴으로써 T 모세포를 정량화하였다. 이로써, 세포 집단 중에서의 모세포의 상대적 수를, 집단 내의 작은 (G0) 휴지기 세포와 비교해서 보다 큰 직경을 수반한 세포 (FSChi) 및 보다 큰 세포 복합성을 지닌 세포 (SSChi)의 비율로서 표현하였다 (이들 연구에 해당됨).
세포내 IFN-γ, TNF-α, grB, 및 pfn의 탐지
IFN-γ 및 TNF-α의 생성과, 세린 프로테아제 그랜자임 B (grB) [참고: Lobe et al. (1986) Science 232:858-861] 뿐만 아니라 기공-형성성 단백질 페르포린 (pfn) [참고: Hameed et al. (1992) Am. J. Pathol. 140:1025-1030]의 발현은 표준 ICC (세포내 사이토킨) 프로토콜 (공급처: BD Biosciences)을 사용하여 정량화하였다. 간략하게 언급하면, 이는 세포를 특이적 형광단 접합된 mAb로 표지시켜 CD3 (항-CD3-APC) 및 CD8 (항-CD8-PE-Cy5)를 탐지한 다음, 고정 및 투과화하는 것으로 이루어졌다. 이어서, 세포 샘플을 2개 샘플로 분할시키는데, 이중 하나는 항-IFN-γ-PE 항체 및 항-grB-FITC 항체와 함께 항온 배양하고, 다른 하나는 항-TNF-α-PE 및 항-페르포린-FITC와 함께 항온 배양하였다. BD FACSCalibur를 사용하여 샘플당 평균 20,000 내지 100,000개 세포를 획득하였다.
사량체 및 오량체 분석
T 세포를 항-CD8-PE-Cy5, 항-CD4-APC 및 항-CD69-FITC 항체, 및 다음 PE-접합된 iTag™ 사량체 (공급처: Beckman Coulter) 또는 오량체 (공급처: Prolmmune) 중의 하나로 표지시켰다: HCV NS5A (VLSDFKTWL; 서열 3) HLA-A*0201, EBV (GLCTLVAML; 서열 5) HLA-A*0201, HCV NS3 펩티드 (CINGVCWTV; 서열 4) HLA-A*0201, HCV NS3 펩티드 (KLVALGINAV; 서열 6) HLA-A*0201, 및 음성 대조군 사량체 (다중-대립 유전자). FACSCalibur를 사용하여 대략 100,000개 세포를 획득하였다.
공초점 현미경에 의한 키미젠™ 단백질 결합성, 내재화 및 프로세싱의 분석
미성숙 DC에 의한 키미젠™ 단백질 결합성, 내재화 및 프로세싱은 공초점 현미경을 사용하여 연구하였다. 이들 연구에 사용된 미성숙 DC는 부착성 PBMC 유래된 단구를, 2.5% 공여자 매칭 혈청을 함유하는 AIM V® 배지에서 GM-CSF 및 IL-4의 존재 하에 2일 동안 분화시킴으로써 수득하였다. 2일째에, 미성숙 DC를 챔버가 있는 슬라이드에 옮기고 사용하기 전에 하루 더 항온 배양하였다. 3일째가 적당한 세포 표면 수용체를 갖는 세포와 형태를 갖는 세포 간의 절충안으로서 선택되었다.
DC 표면에 대한 키미젠™ 단백질의 결합성을 연구하기 위해, 세포를 5 Tg/mL 키미젠™ 단백질과 함께 또는 단지 음성 대조군으로서의 완충액과 함께 PBSB 중에서 4℃ 하에 1시간 동안 항온 배양하였다. 1시간 후, 세포를 PBSB로 세척하고, 이어서 바이오티닐화 항-마우스 IgG1 항체로 표지시킨 다음, 스트렙타비딘 AlexaFluor® 546로 표지시켰다. PBSB 세척을 각 단계 사이에 수행하였다. 표지화 및 세척 후, 세포를 4℃ 하에 10분 동안 4% 파라포름알데히드 (PBSB 중)로 고정시켰다. 이어서, 슬라이드에 4',6-디아미디노-2-페닐인돌, 디히드로클로라이드 (DAPI: 공급처; Invitrogen)를 수반한 플로우페이드 골드 안티페이드 (SlowFade® Gold antifade) 시약을 올려 놓고, 커버 슬립을 매니큐어액을 이용하여 슬라이드 상에 밀봉시켰다.
DC에 의한 키미젠™ 단백질 (5 Tg/mL)의 내재화는 세포를 37℃ (7% CO2) 하에 키미젠™ 단백질을 함유하는 배지에서 직접 항온 배양하거나, 또는 먼저, 표면 수용체를 4℃ 하에 PBSB에서 표지시키고, 결합된 단백질을 세척 제거한 다음, AIM-V®/2.5% 매칭 혈청 배지 중에서 37℃ (7% CO2) 하에 일정 시간이 지남에 따라 (0분, 15분, 60분 및 240분) 수용체 결합된 단백질의 흡수를 연구함으로써 연구하였다. 37℃ 하에 항온 배양한 세포를 PBSB로 세척한 다음, BD 바이오사이언스 Cytofix/Cytoperm™ 용액을 이용하여 10분 동안 고정 및 투과시켰다. 이어서, 세 포를 세척하고, BD 바이오사이언스 Perm/Wash™ 용액 중에서 바이오틴 항 마우스 IgG1로 1시간 동안 표지시킨 다음, 스트렙타비딘 Alexa Fluor® 546으로 표지시켰다. 필요에 따라, 기타 항체로의 공동-표지화를 수행하였다. 세포를 최종 세척한 후, 슬라이드에 상기 언급된 바와 같이 올려 놓았다.
키미젠™ 단백질이 세포내 이입되었는지를 확증하기 위해, 펄스-추적 실험을 수행하였다. 미성숙 DC를 얼음 상에서 30분 동안 키미젠™ 단백질 (5 Tg/mL)로 펄싱하였다. 세포를 PBSB로 세척하고, 키미젠™ 단백질을 수반하지 않은 AIM V®/2.5% 매칭 혈청 배지에서 추적한 다음, 37℃ (7% CO2) 하에 15분 동안 항온 배양하였다. 펄스-추적된 세포를 PBSB로 세척하고, 4% 파라포름알데히드로 고정시킨 다음, MHC 부류 II 항체로 표지시켜 혈장 막 만을 표지시켰다. 키미젠™ 단백질이 엔도솜에 존재하는 지를 결정하기 위해, 혈장 막-표지시킨 세포를 BD 바이오사이언스 Cytofix/Cytoperm™ 용액을 이용하여 10분 동안 고정 및 투과시켰다. BD Perm/Wash™으로 세척한 후, 상기 언급된 바와 같이 항 마우스 IgG1 바이오틴/스트렙타비딘을 이용하여 키미젠™ 단백질을 탐지하였다.
거대음작용 (macropinocytosis) 연구를 위해, FITC 덱스트란 (MW 70,000, 음이온성, 리신 가요성; 공급처: Invitrogen)을, 키미젠™ 단백질 (5 Tg/mL)을 함유하거나 함유하지 않는 AIM V®/2.5% 매칭 혈청 배지 중에서 5 mg/ml의 유동 상 마커로서 사용하였다.
수용체 매개된 세포내 이입을 연구하기 위해, Alexa Fluor® 488 트랜스페린 접합체 (공급처: Invitrogen)를, 키미젠™ 단백질 (5 Tg/mL)을 함유하는 PBSB에서 20 Tg/mL으로 사용하였다. 락타시스틴 (Lactacystin) (공급처: Sigma)을 시스테인 프로테아제 억제제와 프로테아솜 억제제 (최종 농도 5 Tg/mL) 둘 다로서 사용하였다.
생체내 동물 모델에서의 면역 반응 평가
이들 연구는 2마리의 근친계 실험용 종 (마우스 및 랫트)과 1마리의 비근친계 큰 동물 종 (새끼 돼지)을 이용한다. 특히, BALB/c 마우스 (Charles River Laboratories로부터의 6 내지 8주생), 위스타르 (Wistar) 랫트 (Charles River Laboratories로부터의 4 내지 6주생), 및 교배종 새깨 되지 (Prairie Swine Center, University of Saskatchewan로부터의 4 내지 6주생)을 사용한다. 본 연구는 키미젠™ 단백질의 보호적 효능과 면역 반응을 결정해준다.
안전성 평가
HCV 키미젠™ 단백질을 피하 (s.c.) 또는 피내 (i.d.) 투여하였다. 다음 프로토콜과 용량을 주사에 사용하였다. 동물을 0일째, 14일째, 28일째 및 42일째에 2주 마다 피하 또는 피내 투여함으로써 4회 면역시켰다. 마우스 피하 및 피내 주사의 경우에는, 마우스 1마리당 0.1 Tg, l ㎍ 또는 10 Tg의 용량을 사용하였다. 랫트를 면역시키기 위한 용량은 랫트 1마리당 0.15 Tg, 1.5 Tg 또는 15 Tg이고, 새끼 돼지의 경우에는 새끼 돼지 1마리당 0.2 Tg, 2 Tg 또는 20 Tg이다.
ELISA 기술에 의해 IgG1/IgG2a 비 뿐만 아니라 특이적 항체의 양을 분석하기 위해, 면역하기 전 (-1일째) 및 각 주사한지 7일 후에 혈액 샘플을 수집하였다.
최종 면역시킨지 2주 후에 동물을 희생시켰다. 면역시킨 후 동물을 매주마다 3회 이상 신체적 검사함으로써 HCV 키미젠™ 단백질의 안전성 프로파일을 평가하였다. 이에는 체중 및 불리한 사건 관찰이 포함된다. 전신 독성의 경우에는, 규칙적인 간격으로 수집한 혈액 샘플을 사용하여 혈청 화학 [이에는 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 (AST) 및 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT) 수준이 포함된다] 상의 변화를 모니터링하였다. 또한, 실험 말기에는 부검시 비장, 간, 신장, 심장, 폐, 근육 및 뇌로부터 수집한 조직을 10% 완충 포르말린에 고정시키고, 잠재적 병리학적 변화를 추가로 분석하기 위해 파라핀에 봉매시켰다. 연령 적합 동물을 대조군으로서 사용하였다.
키미젠™ 단백질에 대한 면역 반응
키미젠™ 단백질은 강력한 세포성 및 체액성 면역 반응을 유도시키는 것으로 예측되었다. 새끼 돼지에서 HCV 키미젠™ 단백질에 대한 숙주 면역 반응을 결정하기 위한 동물 시험을 수행하였다. 이들 연구를 위해, 코어, NS5A, NS3, 및 다중-항원 키미젠™ 단백질을 사용하였다. 제1 회전에서는, HCV 키미젠™ 단백질에 대한 면역 반응을 평가하였다. 이 단백질은 상기 언급된 바와 같이 피하 및 피내 투여되었다.
마우스 또는 랫트의 비장 세포, 및 새끼 돼지로부터의 말초혈 단핵 세포 (PBMC)를 사용하여, 다음에 기재되는 바와 같이 피하 및 피내 투여 경로 후에 HCV 키미젠™ 단백질에 대한 면역 반응의 양 및 질을 결정하였다. 이들 시험으로 인해, 키미젠™ 백신 및 상기 투여 경로가 가장 강력한 면역 반응을 유도시킨다는 것을 결정할 수 있다. HCV 키미젠™ 단백질의 표적-지시된 전달은 강력한 체액성 반응 이외에도 강력한 Th1에 의거한 면역 반응을 유도시킬 수 있었다. HCV 백신 상의 VIDO로부터의 연구 결과, DNA 백신으로의 프라이밍에 이어 단백질 부스팅하는 것이 강력한 Th1/Th2-밸런스 면역 반응을 유도시킬 수 있다는 사실이 입증되었다 [참고: Yu et al. (2004) J. Gen. Virol. 85:533-1543].
면역 반응의 평가
i) 항체 반응. HCV 항원-특이적 항체의 존재 여부를 ELISA에 의해 결정하여 총 IgG 뿐만 아니라 IgG1 및 IgG2a 항체 수준을 시험하였다. IgG 수준은 면역 반응의 양을 입증해주는 반면, IgG1과 IgG2a의 상대적 수준은 면역 반응의 질 (Th1 또는 Th2)을 입증해준다. 이들 실험은 확립된 프로토콜을 사용하여 수행하였다.
ii) 림프구 증식 검정. 마우스 또는 랫트의 비장 세포, 및 새끼 돼지로부터의 말초혈 단핵 세포 (PBMC)를 시험관 내에서 HCV 항원으로 자극하였다. [메틸-3H] 티미딘을 분할되는 세포의 DNA 내로 혼입함으로써 증식 반응을 측정하였다.
iii) 사이토킨 ELISPOT 검정. 면역 반응의 질을 추가로 확증하기 위해, 비장 세포 (마우스 및 랫트) 또는 PBMC (새끼 돼지) 중의 인터페론-γ 및 인터루킨-4 분비성 세포 수를, 본 발명자들의 확립된 프로토콜에 따라서 HCV 항원으로 자극한 후 ELISPOT 검정에서 결정하였다.
HCV 키미젠™ 단백질에 의해 유도된 보호성 항-바이러스성 면역
HCV는 극히 협소한 숙주 범위를 갖고 있다. 이는 인간과 침팬지에서만 복제한다. 백신 접종한 동물을 생 HCV로 챌린지하는 것은 실제적이지 못한데, 이는 챔팬지는 비용이 많이 들고 공급 면에서 제한되기 때문이다. 그러나, 백신 접종 후 HCV 항원을 암호화하는 재조합 백시니아 바이러스로 챌린지하는 것은 동물 모델에서 HCV 예방 백신에 의해 유도된 보호 능력을 평가하기 위한 대체 모델이다. 키미젠™ 단백질을 개별적으로 또는 조합하여 사용하여 상기 동물을 면역시켰다. 백신 접종 후 유도된 보호 면역을 평가하기 위해, 예정된 전략을 이용하여 정기적 백신 접종을 완료한지 2주 후에 관련 키미젠™ 단백질과 동일한 HCV 항원을 암호화하는 재조합 백시니아 바이러스에 의해 동물을 복강내 챌린지하였다. 챌린지 용량은 마우스의 경우에는 1 X 107개 플라크 형성 단위 (PFU)이고, 랫트의 경우에는 2 X 107개 PFU이며 새끼 돼지의 경우에는 1 X 109개 PFU일 것이다. 5일 후, 동물을 희생시키고 백시니아 바이러스 역가를 안정된 프로토콜에 따라서 플라크 검정에 의해 결정하였다.
HCV 치료 및 예방 백신에 대한 가장 적합한 후보(들)의 확인
치료 백신은 HCV 바이러스의 비구조 단백질 (예: NS5A, NS3)에 기초하는 반면, 예방 백신은 비구조 단백질 뿐만 아니라 구조 단백질 (예: E1, E2)에 기초한다. 하나 이상의 키미젠™ 백신의 조합물을 생체외 DC/T 세포 항원 제시 검정과 동물 모델 둘 다에 사용하고 면역학적 성과를 평가하였다.
치료용 및 예방용 키미젠™ 백신의 투여 경로 뿐만 아니라 면역 프로토콜은 현재 연구 중이다. 면역 반응은 항체 수준, 림프구 증식 및 사이토킨 생성을 측정함으로써 평가하였다. 예방 HCV 키미젠™ 백신 후보에 의해 유도된 보호적 항-바이러스성 면역 또한, 상기 언급된 바와 같은 챌린지 실험에서 평가하였다.
실시예 2. NS5A 키미젠™ 단백질을 이용한 결과
NS5A 키미젠™ 단백질을 정제하고 성상 확인하였다
정제된 NS5A 키미젠™ 단백질이 SDS-8% PAGE에 의해 대략 105 kDA의 밴드로서 이동하였지만, 상기 단백질의 예상 분자량은 약 81 KDa이다. 관측 분자량과 예상 분자량 간의 불일치는 부분적으로는, 고 프롤린 함량 (약 11%), 단백질의 당화 및 기타 가능한 해독 후 변형에 기인할 수 있다. 마우스 IgG1 Fc에 대항한 항체, 6xHis 태그 및 NS5A를 사용하여 상기 정제된 단백질을 탐지하였다. 정제된 단백질 상에서의 MS/MS ID (질량 분광측정법) 분석 결과 (겔로부터 절단된 밴드), NS5A, 마우스 IgG1 중쇄 및 HCV 폴리단백질에 대한 실재적 표적물이 제공되었는데, 이는 이것이 실제로 NS5A 키미젠™ 단백질이였다는 지표이다. 정제된 NS5A 키미젠™ 단백질을 8% SDS 겔 상에서 격리시키고, Pro-Q® 에머랄드 300 당단백질 겔 및 블롯 염색 키트를 사용하여 당화를 위해 염색한 다음, UV 조명하여 탐지하였다. 이러한 과정은 정제된 NS5A 키미젠™ 단백질의 당화를 나타내었다.
NS5A 키미젠™ 단백질은 미성숙 DC와 결합한다
NS5A 키미젠™ 단백질을 대상으로 하여 미성숙 DC와 결합할 수 있는 그의 능 력에 관하여 조사하였다. 세포를 4℃ 하에 1시간 동안 각종 농도의 NS5A 키미젠™ 단백질의 존재 및 부재 하에 항온 배양하였다. 결합된 백신은 바이오티닐화 항-마우스 IgG1 mAb 및 SA-PE-Cy5를 사용하여 탐지하였다. 백신을 결합시키는 세포 비율 (% 양성 세포) 및 결합된 단백질의 상대적 양 (MFI)을 유동 세포계수법에 의해 결정하였다 (도 15). NS5A 키미젠™ 단백질을 4 내지 50 ㎍/mL으로 사용하는 경우에는, 대부분의 DC가 결합에 대해 양성이었고, 결합된 단백질의 양이 용량 의존적으로 증가하였다 (도 15 및 16). 단백질의 결합성은 50 ㎍/mL와 비교해서 20 ㎍/mL에서 훨씬 더 크지 않았는데, 이는 미성숙 DC에 대한 결합이 포화 가능하였다는 지표이다. 관찰된 고 MFI의 결합성은 NS5A 키미젠™ 단백질이 미성숙 DC와 극히 효율적이면서도 고 수준으로 결합한다고 제안하고 있다. 4℃ 하에서의 결합이 포화 가능하였다는 것은 상기 프로세스가 수용체 매개된다는 것을 제안하고 있다. 4℃ 하에 5분 동안 항온 배양한 후에 탐지된 결합된 단백질의 경우에 결합이 극히 신속하게 이루어졌는데, 특정 MFI의 결합성은 1시간 항온 배양 후에 관찰된 것의 대략 절반이다 (데이터는 나타내지 않음).
NS5A 키미젠™ 단백질은 미성숙 DC 상의 특이적 수용체와 결합한다
이를 함유하는 Fc 단편을 통하여, NS5A 키미젠™ 단백질은 그의 TBD 영역을 통하여 미성숙 DC 상의 CD32 (FcγRII)와 결합하는 것으로 예측되었다. 또한, 그의 만노스 당화로 인해, NS5A 키미젠™ 단백질은 C-유형 렉틴 수용체, 예를 들어 CD206 (MMR)와 결합하는 것으로 예측되었다. 백신 후보의 결합 특이성을 결정하기 위해, 미성숙 DC를 차단성 항-CD32 및/또는 항-CD206 mAb의 존재 하에 NS5A 키미젠 ™ 단백질과 함께 항온 배양하였다.
미성숙 DC를 4℃ 하에 1시간 동안 완충액 대조군, 또는 5 ㎍/ml의 이소형 대조군 mAb, 항-CD32 mAb, 항-CD206 mAb, 또는 항-CD32와 항-CD206 둘 다와 함께 항온 배양한 다음, 4℃ 하에 1시간 동안 NS5A 키미젠™ 단백질과 함께 항온 배양하였다. 결합된 NS5A 키미젠™ 단백질을 바이오티닐화 항-6xHis mAb로 탐지한 다음, SA-PE-Cy5로 탐지하였다. 이소형 대조군 mAb (뮤린 IgG1 및 IgG2b)는 완충액 대조군과 비교해서 결합성을 억제하지 않았다. 그러나, 완충액 대조군과 비교해서 항-CD32와 항-CD206 둘 다는 결합성을 각각 대략 60% 및 40% 억제하였다.
양 mAb를 부가하면, NS5A 키미젠™ 단백질 결합성이 추가로 억제되어 80% 억제를 나타내었다. 이들 데이터는 NS5A 키미젠™ 단백질의 결합성에 있어서의 CD32와 CD206 둘 다의 역할을 나타낸다. 공초점 현미경에 의해, 4℃ 하에 NS5A 키미젠™ 단백질과 함께 항온 배양한 세포는 완충액 대조군과 비교해서 그들의 표면 상에 집중적인 표지화를 나타내었는데, 이는 NS5A 키미젠™ 단백질이 세포 표면과 결합하였다는 지표이다.
미성숙 DC에 의한 NS5A 키미젠™ 단백질의 내재화를 37℃ 하에 평가하였다. 37℃ 하에 1시간 동안 키미젠™ 단백질과 함께 항온 배양한 미성숙 DC는 종종 핵에 근접하여 작은 반점의 표지화 패턴을 나타내었는데, 이는 키미젠™ 단백질이 내재화되었고, 있다 하드라도 극히 적은 표면 표지화가 존재하였다는 것을 제안하고 있다.
DC는 포식 작용, 거대음작용, 클라트린 (clathrin)-매개된 세포내 이입 및 비-클라트린/카베올래 (caveolae) 세포내 이입을 포함하는 몇 가지 경로를 통하여 항원 흡수할 수 있다. 거대음작용은 미성숙 DC에서의 구성성 과정인 것으로 보고되었다 [참고: Trombetta and Mellman 2005]. 37℃ 하에 거대음작용에 의해 NS5A 키미젠™ 단백질을 내재화시킬 수 있는 미성숙 DC의 능력은 거대음작용 마커 FITC 덱스트란을 사용하여 평가하였다 [참고: Hewlett et al. (1994) J. Cell Biology 124:689-703]. 미성숙 DC를 상기 키미젠™ 단백질 및 FITC 덱스트란과 함께 15분 및 60분 동안 항온 배양한 후, 단백질과 FITC 덱스트란 둘 다를 함유하는 소포-유사 구조가 관찰되었는데, 이는 37℃ 하에 키미젠™ 단백질이 거대음작용에 의해 흡수될 수 있다는 것을 나타낸다. FITC 덱스트란이 대식 세포 만노스 수용체 (CD206)와 결합할 수 있으므로, 키미젠™ 단백질과 FITC 덱스트란 둘 다를 함유하는 몇몇 엔도솜이 수용체 매개된 세포내 이입에 의해 유발될 수 있다는 것을 인지해야 한다.
키미젠™ 단백질의 흡수에 있어서의 수용체 매개된 세포내 이입의 역할을 펄스-추적 실험에 의해 연구하였다. 미성숙 DC를 4℃ 하에 형광성 표지된 키미젠™ 단백질로 펄싱하고, 세척한 다음, 37℃ 하에 15분 동안 항온 배양하였다. 세포를 고정시키고, 투과시킨 다음 항체로 표지시켜 키미젠™ 단백질 뿐만 아니라 트랜스페린 수용체를 탐지하였다. 이러한 트랜스페린 수용체는 수용체 매개된 세포내 이입에 의해 흡수되어 초기 엔도솜으로부터 혈장 막으로 다시 재순환되었다. 4℃에서는 NS5A 키미젠™ 단백질이 세포 표면과 결합하였지만, 트랜스페린 수용체는 주로 세포 내에 존재하였다. 37℃로의 전환시, 엔도솜이 형성되는 것으로 관찰되었 는데, 이중 몇몇은 키미젠™ 단백질과 트랜스페린 수용체 둘 다를 함유하였다. 실험 개시시 (4℃) 다수의 기존의 세포내 트랜스페린 수용체는 키미젠™ 단백질과 공동-국재되지 않은 엔도솜을 함유하는 많은 트랜스페린에 대해 책임이 있는 것으로 추정되었다.
DC에 의한 NS5A 키미젠™ 단백질의 흡수, 및 트랜스페린 수용체에 대항한 항체로 공동-표지화시킴으로써 트랜스페린과의 그의 공동-국재화는 또한, 공초점 현미경을 사용하여 평가하였다. 트랜스페린은 트랜스페린 수용체와 결합하고 수용체 매개된 과정에 의해 내재화되는 것으로 공지되어 있다. 이러한 분석 결과, 두 분자의 공동-국재화가 밝혀졌는데, 이로써 NS5A 키미젠™ 단백질이 수용체 매개된 세포내 이입에 의해 흡수되는 것으로 나타났다.
키미젠™ 단백질과 트랜스페린 수용체 신호 간의 중복을 증가시키기 위한 시도로, 세포를 인간 트랜스페린과 접합된 Alexa Fluor 488과 함께 항온 배양하여, 세포 내의 모든 트랜스페린 수용체 보다는 오히려 최근에 세포내 이입된 트랜스페린 수용체 만을 간접적으로 탐지하였다. 미성숙 DC를 4℃ 하에 트랜스페린과 접합된 Alex Fluor 488과 키미젠™ 단백질의 혼합물로 표면 표지화시켰다. Alexa Fluor 488 트랜스페린 양성 엔도솜은 거의 관찰되지 않았지만, 존재하는 경우 이들은 NS5A 키미젠™ 단백질을 함유하였는데, 이는 이러한 키미젠™ 단백질이 수용체 매개된 세포내 이입에 의해 실제로 흡수된다는 지표이다. 이들 결과는 키미젠™ 단백질이 주로 세포내 매개된 세포내 이입에 의해 내재화된다는 것을 보여준다.
미성숙 DC에 의한 NS5A 키미젠™ 단백질의 프로세싱을 연구하였다. 특히 만 성 감염증을 치료하기 위한 백신을 설계하기 때문에, CD8+ 세포의 활성화 및 MHC 부류 I 수용체를 통한 항원 교차 제시가 요구된다. 항원 교차 제시를 위한 2가지 상이한 프로세싱 경로가 제안되었다 [참고: Lizee et al. (2005) Trends Immunol. 26(3): 141-149]. 첫 번째 경로는 포식 작용에 의해 흡수된 항원의 프로세싱을 포함하는 반면, 두 번째 경로는 세포내 이입의 기타 경로, 예를 들어 수용체 매개된 세포내 이입에 의해 흡수된 항원의 프로세싱을 포함한다. 두 번째 경로에서는, 단백질을 초기 엔도솜 내로 흡수되도록 하고, 후기 엔도솜을 표적으로 하는데, 여기서는 이들이 카텝신에 의해 파쇄된 다음 MHC 부류 I 수용체 상으로 부하되었다. 따라서, NS5A 키미젠™ 단백질이 후기 엔도솜에서 탐지될 수 있었는지를 결정하고, 또한 이러한 구조에서 MHC 부류 I 수용체와 공동-국재되었는지를 결정하기 위한 실험을 수행하였다. 4℃ 하에 NS5A 키미젠™ 단백질로 펄싱시킨 다음, 37℃ 하에 추적한 세포를 공동-표지시켜 키미젠™ 단백질과 LAMP1 (후기 엔도솜/라이소솜의 마커) 둘 다를 탐지하였다. 수 개 세포에서 4시간 및 24시간째에, NS5A 키미젠™ 단백질과 LAMP1 간에 중복이 관찰되었는데, 이는 NS5A 키미젠™ 단백질이 후기 엔도솜/라이소솜 내에 있었다는 지표이다. 또 다른 공동-표지화 실험에서는, NS5A 키미젠™ 단백질이 MHC 부류 I 분자와 유사한 구조에 존재하는 것으로 밝혀졌는데, 이로써 NS5A 키미젠™ 단백질이 MHC 부류 I 분자를 통하여 제시하기 위해 프로세싱되었다는 것을 나타낸다.
프로테아솜은 파고라이소솜 경로를 통하여 교차 제시하기 위해 항원을 붕괴시키는데 관여하는 것으로 여겨진다. 세포를 세포-투과성 프로테아솜 억제제 락타 시스틴 5 ㎍/mL 농도로 처리하였다. 락타시스테인은 최근에, 기존에 라이소솜성 프로테아제 카텝신 A를 억제하는 것으로 생각되었던 것 보다 덜 특이적인 것으로 밝혀졌다 [참고: Kozlowski et al. (2001) Tumour Biol. 22(4):211-215]. NS5A 키미젠™ 단백질의 프로세싱이 파고라이소솜 경로에서와 같이 프로테아솜과 관련이 있는 경우에는, 불완전하게 분해된 펩티드가 시토솔에 부분적으로 축적되는 것으로 예상할 수 있고 이러한 축적은 말기 엔도솜에서 프로세싱되는 것으로 예상되지 않을 것이다 [Lizee et al. (2005) 상기 참고]. 4시간 추적 후 5 ㎍//mL의 락타시스틴으로 처리시킨 펄싱된 세포 (펄스 및 추적)는 NS5A 키미젠™ 단백질을 함유하는 다수의 엔도솜을 나타내었다. 또한, 엔도솜은 대조군 세포 보다 더 많은 수의 단백질을 함유하는 것으로 여겨졌다. 세포질성 NS5A 키미젠™ 단백질의 증가는 마우스 IgG1에 대항한 모노클로날 항체를 이용해서는 탐지될 수 없었다. 이들 데이터는 파고라이소솜 경로 보다는 오히려 수용체 매개된 세포내 이입이 키미젠™ 단백질을 DC에서 내재화시키는 기전이라는 것을 다시 한번 지적하고 있다.
DC에 의한 NS5A 키미젠™ 단백질 제시로 인해 CD8+ 및 CD4+ T 세포 활성화 및 증식이 일어난다
NS5A 키미젠™ 단백질에 대한 기능성 면역 반응을 생체외 APA에 의해 평가하였다. 이러한 검정을 사용하여, T 세포를 항원 부하된 DC로 자극한 후 기능성 T 세포 면역 반응의 각종 파라미터를 측정할 수 있다. 이러한 검정은 먼저, IL-4 및 GM-CSF를 부가함으로써 PBMC-유래된 단구로부터 미성숙 DC를 생성시키는 것으로 이루어진다. 이어서, 미성숙 DC를 백신 후보, 운반체 완충액 (음성 대조군), 또는 파상풍 톡소이드 (TT) (양성 대조군)와 함께 항온 배양하였다. 이어서, DC를 사이토킨으로 처리하여 성숙화를 진행시키고, 세척한 다음, 자기 유래의 본래 그대로 T 세포와 함께 항온 배양하였다. 사이토킨 생성, 세포독성 과립 성분의 존재, 및 NS5A-특이적 T 세포의 생성을 측정하기 위해, 키미젠™ 단백질 특이적 T 세포의 팽창을 고려하여 T 세포를 2회 더 자극하였다. 초기 T 세포 활성화 마커 CD69를 측정함으로써 활성화를 평가하였고, CFSE 표지된 T 세포의 형광을 추적함으로써 증식을 측정하였다. CD69 발현과 CFSE 형광 둘 다는 항원 부하된 DC와의 4일 및 7일 배양 후에 평가하였다.
예비 분석은 배양물 중의 DC 및 T 세포 농도가 T 세포 면역 반응을 결정하는데 있어 중요한 파라미터란 사실을 나타내었다. 따라서, 6개 상이한 T 세포:DC 비를 평가하도록 APA를 설계하였다. 두 세트의 DC 농도를 사용하였는데, 고 농도의 5 x 104 DCs/웰과 저 농도의 1 x 104 DCs/웰을 사용하였다. 배양한지 48시간 후, 미성숙 DC를 완충액 (음성 대조군), 5 ㎍/mL의 NS5A 키미젠™ 단백질 (5AC)의 2개의 상이한 제제, TT (양성 대조군), 또는 PBS와 함께 항온 배양하였다. 이어서, DC를 8시간 동안 배양하고, 폴리 IC, IL-I, IL-6, TNF-α, IFN-α, 및 IFN-γ를 부가함으로써 성숙시켰다. 밤새 배양한 후 (16시간), PBS 대조군으로부터의 DC를 세척하고, 각종 성숙한 DC 마커의 발현을 알아보기 위해 조사하였다. 고 농도의 DC와 저 농도의 DC 둘 다는 고 수준의 HLA-ABC (MHC 부류 I), HLA-DR (MHC 부류 II), CD86, CD80, 및 CD83를 발현하였다 (도 17). 일반적으로, 고 농도의 DC는 약간 더 높은 수준의 DC 성숙화 마커를 발현하였다.
자기 유래의 T 세포는 음성 선별 과정에 의해 분리하였고, 세포 분할을 결정하기 위해 CFSE로 표지시켰다. 96-웰 판 중의 DC 100 ㎕/웰에, T 세포 100 ㎕/웰을 웰당 다음 농도를 위해 가하였다: 2O x 104, 5 x 104, 또는 2 x 104. 고 DC 농도 웰의 경우 (5 x 104 DC/웰), 웰당 T 세포 대 DC 비 조합은 20 x 104:5 x 104 (4:1), 5 x 104:5 x 104 (1:1), 및 2 x 104:5 x 104 (0.4:1)였다. 저 DC 농도 웰의 경우 (1 x 104 DC/웰), 웰당 T 세포 대 DC 비 조합은 20 x 104:l x 104 (20:1), 5 x 104:l x 104 (5:1), 및 2 x 104:1 x 104 (2:1)였다. T 세포를 외인성 사이토킨의 부재 하에 DC에 가하였다. 대조군으로서, 3일째 배양물 PHA 1 ㎍/mL을 PBS 처리시킨 DC 군 상으로 부하시킨 T 세포에 가하였다.
배양 4일 후, 세포 배양물의 절반 (100 ㎕)을 수거하여 활성화 및 증식에 관하여 분석하였다. 세포 배양물의 나머지 절반에는, 100 ㎕의 신선한 AIM V®/2.5% 매칭 혈청을 가하고 세포를 3일 더 배양하였다. 배양 4일 후 T 세포 상에서의 CD69 발현이 도 18A-C에 도시되었다. 도 18A는 상이한 T 세포:DC 비에 대한 CD69 발현성 CD3+ 세포의 비율을 도시한 것이다. 대다수의 PHA 처리시킨 세포는 T 세포:DC 비에 상관없이 CD69를 발현하였다. CD69는 또한, 고 DC 농도와 함께 배양한 T 세포에서는 탐지되었지만, 저 DC 농도와 함께 배양한 T 세포에서는 거의 탐지되 지 않았다. 완충액 대조군과 비교해서, 항원 자극시킨 T 세포는 보다 고 수준의 CD69를 발현하였다. NS5A 키미젠™ 단백질-부하된 DC는 4일째에 CD4+ T 세포 보다 높은 비율의 CD69 발현성 CD8+ T 세포를 유도시켰다 (도 18B 및 C). CD8+ T 세포의 CD69 발현 비율은 리콜 (recall) 항원 TT와 비교해서 키미젠™ 단백질에 대해 등가이거나 이 보다 더 컸다. 이는 NS5A 키미젠™ 단백질이 본래 그대로의 CD8+ T 세포의 강력한 활성제라는 지표이다.
배양 4일 후 1회 이상 분할을 진행한 세포 (CFSElo)의 비율이 도 19A-C에 도시되었다. PHA로 처리시킨 T 세포는 24시간 먼저 분할하기 시작하였다 (도 19A). TT-부하된 DC로 처리시킨 CD8+ 및 CD4+ T 세포는 배양 4일 후에 탐지 가능한 증식을 진행하였는데, 이는 고 DC 농도 하에서만 명백하였다 (도 19B 및 C). 4일째 키미젠™ 단백질-처리시킨 군에서는 T 세포 증식이 거의 탐지되지 않았다. 따라서, 본래 그대로의 T 세포는 CD69의 발현에 의해 명백한 바와 같이 배양 4일째에 NS5A 키미젠™ 단백질-부하된 DC에 의해 활성화되었지만, 이들 T 세포는 아직까지 분할되지 않았거나 사용된 검정에 의해 탐지 불가능한 수준으로 분할되었다.
배양 7일 후, 세포를 수거하여 활성화 및 증식에 관하여 분석하였다. 배양 7일 후 T 세포 상에서의 CD69 발현이 도 20A-C에 도시되었다. 도 2OA는 상이한 T 세포:DC 비에 대한 CD69 발현성 CD3+ 세포의 비율을 도시한 것이다. PHA로 처리시킨 T 세포의 CD69 발현은 현저하게 증가하였다. 그러나, CD69 발현성 세포의 비율은 PHA 반응으로부터 예상되는 것과 일관되게 4일째 관찰된 비율로부터 감소하였는 데; CD69의 신속한 유도에 이어 시간이 지남에 따라 발현이 저하되었다. 키미젠™ 단백질-자극된 T 세포의 경우에는, 고 DC 농도와 함께 배양한 T 세포에서는 CD69가 5% 이상 수준으로 탐지되었지만, 저 DC 농도와 함께 배양한 T 세포에서는 거의 탐지되지 않았다. 따라서, 저 DC 농도 (1 x 104 DC/웰)는 항원-특이적 T 세포 활성화를 위해 충분하지 못하였다. 완충액 대조군과 비교해서, 보다 많은 수의 키미젠™ 단백질-자극된 T 세포는 5 x 104 T 세포 및 2 x 104 T 세포:5 x 104 DC 비에 대해 CD69를 발현하였다. 7일째 리콜 TT 반응에 대해서는 CD69의 발현이 저하되었다. d4 T 세포와는 달리, NS5A 키미젠™ 단백질-부하된 DC는 7일째에 CD8+ T 세포 보다 높은 비율의 CD69 발현성 CD4+ T 세포를 유도시켰다 (도 2OB 및 C). 보다 고 DC 농도의 경우에는 (5 x 104/웰), CD8+ 및 CD4+ T 세포의 CD69 발현이 완충액 또는 리콜 항원 TT와 비교해서 키미젠™ 단백질에 대해 등가이거나 더 높았다. 따라서, NS5A 키미젠™ 단백질은 초기에는 본래 그대로의 CD8+ T 세포를 활성화시킨 다음, CD4+ T 세포를 활성화시킨다.
배양 7일 후 1회 이상 분할을 진행한 세포 (CFSElo)의 비율이 도 21A-C에 도시되었다. 그 결과는 PHA로 처리시킨 거의 모든 T 세포가 분할되었다는 것을 나타낸다 (도 21A). 키미젠™ 단백질 또는 TT가 부하된 DC는 배양 7일 후에 현저한 T 세포 증식을 가져다 주었지만, 이는 고 DC 농도 하에서 가장 명백하였다. 단지 고 DC 농도 웰 만이 항원 부하의 결과로서 현저한 CD8+ T 세포 증식을 유도시켰다 (도 21B). 그러나, 항원이 부하된 저 농도의 DC는 CD4+ T 세포 증식을 유도시키기에 충분하였다 (도 21C). 인지할 만한 수준으로 고 DC 농도에서는, 키미젠™ 단백질-부하된 DC가 TT-부하된 DC와 거의 동등한 수준으로 T 세포 증식을 유도시켰다.
T 세포 증식의 또 다른 측정치는 T 세포 집단 내의 모세포 T 세포의 상대적 비율이다. 모세포 T 세포는 보다 높은 FSC (전방 광 스캐터) 및 SSC (측면 광 스캐터)를 보유하므로 유동 세포측정법에 의해 평가된 바와 같이 림프구 게이트 내에 휴지기 림프구를 보유하고 있는 세포로서 정의된다. 배양 중인 T 모세포의 비율이 도 22에 도시되어 있다. 이들 결과는 도 21A에 도시된 바와 같이 분할을 진행하고 있는 세포의 비율과 매우 상관 관계가 있다. 따라서, 특정 집단에서의 T 모세포를 평가하는 것은 CFSE 검정에 대한 대안으로서 사용할 수 있다. 전반적으로, 이러한 발견들은 NS5A 키미젠™ 단백질이 T 세포 활성화 및 증식에 의해 측정된 바와 같이 일차 T 세포 반응을 유도시키는데 있어 매우 효율적이었다는 것을 나타낸다.
DC에 의한 NS5A 키미젠™ 단백질 제시로 인해, IFN-γ 및 TNF-α를 생산하는 CD8+ 및 CD4+ T 세포가 발생한다
NS5A 키미젠™ 백신에 대한 기능성 면역 반응은 3회 자극 생체외 APA에 의해 평가하였다. 4 x 104 DC/웰 (고 농도) 또는 2 x 104 DC/웰 (저 농도)의 미성숙 DC에 대조군 운반체 완충액, PBS, TT (양성 대조군), 또는 NS5A 키미젠™ 단백질을 부하하였다. 이어서, DC를 성숙시키고, 그들의 표현형을 평가하였다. DC 성숙화는 고 수준의 MHC 부류 I, MHC 부류 II, CD86, CD80, 및 CD83 발현을 이용하여 확 립시켰다 (도 23). 자기 유래의 T 세포를 상기 성숙시킨 항원-부하된 DC와 함께 20 x 104 T 세포/웰:4 x 104 DC/웰 또는 4 x 104 T 세포/웰:2 x 104 DC/웰의 비율로 항온 배양하였다. T 세포를 3회 자극하였고, 세 번째 자극한지 6시간 후에 Th1 사이토킨 IFN-γ 및 TNF-α의 세포내 수준을 탐지함으로써 T 세포 기능을 평가하였다. 또한, 모세포 T 세포의 수준을 평가하였다.
도 24는 고 DC 농도 및 저 DC 농도에서의 모세포 T 세포의 비율을 도시한 것이다. 2:1 T 세포:DC 비는 5:1 비와 비교해서 보다 낮은 배경 (완충액) T 세포 증식 반응을 발생시켰다. 2:1 비를 이용한 결과로서, 완충액과 항원-유도된 T 세포 증식 반응 간에는 보다 현저한 차이가 있었다.
IFN-γ 반응을 5:1 및 2:1 T 세포:DC 비에서 측정하였다. 데이터는 해당 군의 각 웰의 반응으로서 도시되고 평균의 표준 편차를 수반한 3개 웰의 평균치로서 도시되었다 (도 25). T 세포 IFN-γ 반응을 비교한 결과, 5:1 및 2:1 T 세포:DC 비 간에는 현저한 차이가 있는 것으로 나타났다. 보다 고 농도의 DC의 경우에는, 대조군 완충액에 비해 키미젠™-유도된 IFN-γ 반응의 명백한 증거가 없었다. 그러나, 보다 저 농도의 DC의 경우에는, 대조군 완충액-부하된 DC와 함께 배양한 극히 소수의 T 세포가 IFN-γ를 생성시킨 반면, 키미젠™ 단백질-부하된 DC와 함께 배양한 고 비율의 T 세포는 IFN-γ를 생성시켰다. 2.5 ㎍/mL NS5A 키미젠™ 단백질과 비교해서 5 ㎍/mL을 부하한 DC로 자극시킨 T 세포에서는 더 많은 수의 IFN-γ 생산 세포가 존재하였다. CD8+ 및 CD4+ 집단에서의 IFN-γ 발현성 T 세포의 비율 을 또한 측정하였다 (도 26 및 27). 저 DC 농도 군은 키미젠™-DC로의 자극 결과로서 IFN-γ를 발현하는 고 비율의 CD8+ T 세포를 나타내었다. IFN-γ를 발현하는 CD8+ T 세포의 비율은 TT-부하된 DC와 비교해서 키미젠™ 단백질-부하된 DC로 자극시킨 T 세포에 대해 더 높았다 (도 26). 유사하게, 대조군 완충액과 비교해서 NS5A 키미젠™ 단백질로의 자극시 IFN-γ를 발현한 CD4+ T 세포가 고 비율로 또한 존재하였다 (도 27). IFN-K를 발현하는 CD4+ T 세포의 비율은 TT-부하된 DC와 비교해서 키미젠™ 단백질-부하된 DC로 자극시킨 T 세포에 대해 거의 동등한 수준이었다 (도 27). 이들 결과는 NS5A 키미젠™ 단백질이 CD8+ T 세포 집단과 CD4+ T 세포 집단 둘 다에서 현저한 IFN-γ 반응을 유도시킨다고 나타내었고, 분자가 MHC 부류 I 경로와 부류 II 경로 둘 다에서 DC에 의해 프로세싱된다는 것을 제안하였다.
도 28은 항원 부하된 성숙한 DC로의 6시간 자극에 따른 결과로서 TNF-α를 생성시킨 T 세포의 비율을 도시한 것이다. 이들 결과는 IFN-γ 결과와 유사하였다. T 세포를 고 DC 농도 (5:1 비)로 항원 자극한 결과로서 TNF-α를 생산하는 세포 비율이 증가되긴 하였지만, 저 DC 농도 (2:1 비)를 이용한 경우에는 훨씬 더 큰 차이가 있었다. 2.5 ㎍/mL의 키미젠™ 단백질과 비교해서 5 ㎍/mL의 키미젠™ 단백질이 부하된 DC에 의해 자극된 경우에는 보다 고 비율의 T 세포가 TNF-α를 생성시켰다. TNF-α 반응은 TT와 비교해서 NS5A 키미젠™ 단백질에 대해 보다 컸다. TT-부하된 DC로 자극시키면, CD8+ T 세포와 비교해서 보다 고 비율의 TNF-α 발현성 CD4+ T 세포가 생성되었다 (도 29). 그러나, NS5A 키미젠™ 단백질-부하된 DC 는 CD8+ T 세포 집단과 CD4+ T 세포 집단 둘 다에서 유사한 정도의 TNF-α 생성을 유도시켰다 (도 29).
DC에 의한 NS5A 키미젠™ 항원 제시로 인해, 세 번째 자극한지 6시간 후 grB 및 pfn + 발현성 CD8+ T 세포, 및 CD4+ T 세포가 생성된다
세포독성 과립상 단백질 grB 및 pfn을 생성시킬 수 있는 T 세포의 능력을 또한, 생체외 항원 제시 검정에 의해 평가하였다. 미성숙 DC에 대조군 완충액, TT (양성 대조군), 또는 각종 농도의 NS5A 키미젠™ 단백질을 부하하였고, 성숙화시 자기 유래의 T 세포와 함께 항온 배양하였다. grB의 발현은 상이한 방식으로 탐지할 수 있는데, 이에는 효소적 검정 및 특이적 항체에 의한 방식이 포함된다 [참고: Ewen et al. (2003) J. Immunol. Meth. 276:89-101; Spaeny-Dekking et al (1998) J. Immunol. 160:3610; Hamann et al. (1997) J. Exp. Med. 186:1407]. GrB 및 pfn 발현은 항-grB 및 항-pfn mAb를 각각 사용하여 세포내 염색함으로써 탐지하였다. 도 30은 항원-부하된 성숙한 DC로의 3회 자극 후 grB 및 pfn을 발현하는 CD8+ T 세포의 비율을 도시한 것이다. NS5A 키미젠™ 단백질-부하된 DC는 항원이 없는 대조군과 비교해서 CD8+ T 세포에서의 grB 및 pfn 발현 증가를 유도시켰다. 이들 결과는 NS5A 키미젠™ 단백질이 CD8+ T 세포에서의 grB 및 pfn 발현을 유도시킨다는 것을 나타내고, 상기 단백질이 T 세포에 대한 유효한 제시를 위해 부류 I 경로에서 DC에 의해 프로세싱되어, 그들이 본래 그대로의 CD8+ T 세포에서 세포독성 T 림프구 (CTL)로 분화된다는 것을 제안하고 있다.
성숙한 DC에 의한 NS5A 키미젠™ 항원 제시로 인해, CD8+ 및 CD4+ T 세포가 발생하고 이들 세포의 활성화가 유지되었다
T 세포를 APA에서 항원-부하된 DC로 3회 자극하였다. 세 번째 자극 후 배양 6일 후에, T 세포를 수거하고 이를 대상으로 하여 증식 측정치로서 모세포 비율을 알아보고 활성화 마커 CD69의 발현을 알아보기 위해 FFC에 의해 연구 조사하였다. 또한 배양물로부터 회수한 T 세포의 절대적 수를 평가하기 위한 수단으로서, FSC 및 SSC 유동 세포계수 분석에 의거한 림프구 게이트 (R1 게이트)에 속하는 게이트 세포 수를 결정하였다.
완충액 대조군과 비교해서 TT 및 키미젠™ 단백질 자극시킨 세포로부터의 T 세포 회수에 있어서 현저한 차이가 있었다 (도 31). TT 자극시킨 세포는 키미젠™ 단백질 자극시킨 세포 보다 더 많은 T 세포 회수를 제공하였다. 그러나, TT 반응은 리콜 반응이므로, TT에 대해 특이적으로 반응성인 T 세포 출발 집단은 NS5A에 대해 특이적인 본래 그대로의 T 세포의 출발 집단 보다 더 많을 것으로 예상되었다. 명백하게도, 모세포 집단 평가시 모세포/증식성 세포의 비율은 TT 배양물과 비교해서 NS5A 키미젠™ 단백질 배양물에서 실제적으로 더 높았다. 완충액 대조군 배양물에서는 극히 적은 수의 모세포/증식성 세포가 존재하였다. CD69 발현에 의해 평가된 바와 같은 활성화 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 비율은 도 32에 도시되어 있다. 완충액 대조군과 비교해서 키미젠™ 단백질-부하된 DC로 자극시킨 T 세포에서는 CD4+ 및 CD8+ T 세포 둘 다가 고 비율로 존재하였다. 이들 결과는 키미젠™ 단백질로 자극시키면 현저한 T 세포 활성화 및 증식이 발생하는데, 이는 심지어 세 번째 자극한지 6일 후에도 (T 세포 배양 20일째) 명백하였다. 따라서, 키미젠™ 단백질은 CD8+ 및 CD4+ T 세포 둘 다를 활성화 및 팽창시키는데 극히 유효하다.
성숙한 DC에 의한 NS5A 키미젠™ 단백질 제시는 NS5A-특이적 CD8+ T 세포의 발생을 유도시킨다
NS5A 키미젠™ 단백질에 대한 면역 반응의 항원-특이성을 평가하기 위해, HLA-A2 맥락에서 면역우성 NS5A 에피토프에 대해 특이적인 T 세포의 비율을 정량화하였다. 이는 T 세포를 PE와 접합시킨 NS5A 펩티드/HLA-A2 오량체로 표지시킴으로써 결정하였다. 본래 그대로의 T 세포를 상이한 농도의 NS5A 키미젠™ 단백질이 부하된 DC로 3회 자극하고, APA에서 항원이 부하되지 않은 각각의 대조군 DC (완충액)와 비교하였다. 세 번째 자극한지 6일 후에 T 세포를 수거하고, NS5A-특이적 T 세포 또는 EBV-특이적 T 세포 (대조군)을 사량체 표지화 및 FFC에 의해 탐지하였다.
음성 사량체 표지화 (음성 대조군) 및 EBV 사량체 표지화 (양성 대조군) CD8+ 및 CD4+ T 세포의 비율이 도 33에 도시되어 있다. 시험된 3개 중의 1개 웰이 CD8+ T 세포 집단에서 EBV 사량체 표지화 (양성 사량체)에 대해 양성이었다. 평가된 T 세포는 완충액 대조군 처리된 웰로부터 유래되었기 때문에, EBV 사량체-표지된 T 세포의 수가 비교적 적을 것으로 예상되었다. APA를 수행한 후 NS5A 오량체로의 CD8+ T 세포 표지화 비율이 도 34에 도시되어 있다. DC에 NS5A 키미젠™ 단백질을 부하하면, NS5A 에피토프 VLSDFKTWL (서열 3)에 대한 특이성을 지닌 T 세포가 생성되었다. 이러한 특이성을 지닌 CD8+ T 세포의 현저한 팽창이 고 DC 농도의 2개 웰과 저 DC 농도의 3개 웰에서 명백하였다. 따라서, NS5A 키미젠™ 단백질은 상기 NS5A 면역우성 에피토프에 대해 특이적인 T 세포의 생성을 유도시킬 수 있고, 기타 NS5A 에피토프에 대한 특이성을 지닌 T 세포가 존재하는 것으로 예상되었다.
실시예 3. NS3 키미젠™ 단백질을 이용한 결과
NS3 키미젠™ 단백질을 정제하고 성상 확인하였다
Sf9 세포에서 발현된 NS3 키미젠™ 단백질을 Ni-NTA 친화 크로마토그래피에 이어 양이온 교환 크로마토그래피함으로써 정제하였다. 정제된 샘플은 10% SDS-PAGE 겔을 사용하여 분석하였다. 전기영동 후, 겔을 웨스턴 블롯팅하기 위해 니트로셀룰로스에 옮겼다. SDS-PAGE 겔을 페이지블루로 염색시키고, NS3 키미젠™ 단백질의 상이한 성분에 대해 특이적인 항체를 사용하여 웨스턴 블롯을 전개하였다. 이와 같이 정제된 단백질은 대략 110 KDa 및 120 KDa에서 이중선으로서 나타났다. 양 종은 N-말단 (항-6xHis), TBD (항-Fc) 및 NS3 (폴리클로날 항-NS3)에 대항한 항체에 의해 탐지하였는데, 이는 정제된 단백질이 본래의 것이었다는 사실을 나타낸다.
정제된 NS3 키미젠™ 단백질의 당화를 정량적으로 평가하는 것은 Pro-Q® 에머랄드 300 당단백질 겔 및 블롯 염색 키트를 사용하여 수행하였다. 정제된 단백질을 8% SDS 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동한 후, 제조업자의 프로토콜을 사용하여 겔을 염색하고 UV로 조사하여 스캐닝하였다. 정제된 단백질은 이중선이기 때문에, 분자량 상의 차이는 상이한 당화 수준에 기인하는 것으로 예상된다.
NS3 키미젠™ 단백질은 미성숙 DC와 결합한다
NS3 키미젠™ 단백질을 대상으로 하여 미성숙 DC와 결합할 수 있는 그의 능력에 관하여 조사하였다. 세포를 4℃ 하에 1시간 동안 각종 농도의 NS3 키미젠™ 단백질의 존재 및 부재 하에 항온 배양하였다. 결합된 단백질은 바이오티닐화 항-마우스 IgG1 mAb 및 SA-PE-Cy5를 사용하여 탐지하였다. 키미젠™ 단백질을 결합시키는 세포 비율 (% 양성 세포) 및 결합된 단백질의 상대적 양 (MFI)을 FFC에 의해 결정하였다. NS3 키미젠™ 단백질을 4 내지 55 ㎍/mL으로 사용하는 경우에는, 대부분의 DC가 결합에 대해 양성이었고, 결합된 단백질의 양이 용량 의존적으로 증가하였다 (도 35 및 36). 단백질의 결합성은 55 ㎍/mL와 비교해서 22 ㎍/mL에서 훨씬 더 크지 않았는데, 이는 미성숙 DC에 대한 결합이 포화 가능하였다는 지표이다. 관찰된 고 MFI의 결합성은 NS3 키미젠™ 단백질이 미성숙 DC와 극히 효율적이면서도 고 수준으로 결합한다는 것을 나타낸다. 4℃ 하에서의 결합이 포화 가능하였다는 것은 이것이 수용체 매개된다는 지표이다. 4℃ 하에 5분 동안 항온 배양한 후에 탐지된 결합된 단백질의 경우에 결합이 극히 신속하게 이루어졌는데, 특정 MFI의 결합성은 60분 항온 배양 후에 관찰된 것의 대략 절반이다 (데이터는 나타내지 않음).
NS3 키미젠™ 단백질은 미성숙 DC 상의 특이적 수용체와 결합한다
Fc 단편의 존재를 통하여, NS3 키미젠™ 단백질은 그의 TBD 영역을 통하여 미성숙 DC 상의 CD32 (FcγRII)와 결합하는 것으로 예측되었다. 또한, 그의 만노스 당화로 인해, NS3 키미젠™ 단백질은 C-유형 렉틴 수용체, 예를 들어 CD206 (MMR)와 결합하는 것으로 예측되었다. 상기 단백질의 결합 특이성을 결정하기 위 해, 미성숙 DC를 차단성 항-CD32 및/또는 항-CD206 mAb의 존재 하에 NS3 키미젠™ 단백질과 함께 항온 배양하였다.
미성숙 DC를 4℃ 하에 1시간 동안 완충액 대조군, 또는 5 ㎍/ml의 이소형 대조군 mAb, 항-CD32 mAb, 항-CD206 mAb, 또는 항-CD32와 항-CD206 둘 다와 함께 항온 배양한 다음, 4℃ 하에 1시간 동안 NS3 키미젠™ 단백질과 함께 항온 배양하였다. 결합된 NS3 키미젠™ 단백질을 바이오티닐화 항-6xHis mAb로 탐지한 다음, SA-PE-Cy5로 탐지하였다. 이소형 대조군 mAb (뮤린 IgG1 및 IgG2b)는 완충액 대조군과 비교해서 결합성을 억제하지 않았다. 그러나, 완충액 대조군과 비교해서 항-CD32와 항-CD206 둘 다는 결합을 각각 대략 70% 및 60% 억제하였다 (도 36). 양 차단성 mAb를 부가하면, NS3 키미젠™ 단백질 결합성이 추가로 억제되어 90% 억제를 나타내었다 (도 36). 따라서, 이들 데이터는 미성숙 DC에 대한 NS3 키미젠™ 단백질의 결합성에 있어서의 CD32와 CD206 둘 다의 역할을 나타낸다.
NS3 키미젠™ 단백질의 결합성은 공초점 현미경에 의해 가시화하였다. 미성숙 DC를 4℃ 하에 NS3 키미젠™ 단백질과 함께 항온 배양하였다. 완충액 대조군과 비교한 세포 표면 상에서의 강력한 표지화는 키미젠™ 단백질이 세포 표면, 가능하게는 수용체와 결합하였다는 지표이다.
내재화를 연구 조사하기 위해, 미성숙 DC를 37℃ 하에 1시간 동안 키미젠™ 단백질과 함께 항온 배양하였다. 세포는 존재하는 경우일지라도 표면 표지화를 거의 나타내지 않았지만 (혈청 막 윤곽), 대신 종종 핵에 근접하여 작은 반점의 표지화 패턴을 나타내었는데, 이는 키미젠™ 단백질이 내재화되었다는 지표이다.
DC에 의한 NS3 키미젠™ 단백질 제시로 인해 CD8+ 및 CD4+ T 세포 활성화 및 증식이 일어난다
NS3 키미젠™ 단백질에 대한 기능성 면역 반응을 생체외 항원 제시 검정 (APA)에 의해 평가하였다. 이러한 검정을 사용하여, T 세포를 항원 부하된 DC로 자극한 후 기능성 T 세포 면역 반응의 각종 파라미터를 측정할 수 있다. 이러한 검정은 먼저, IL-4 및 GM-CSF를 부가함으로써 PBMC-유래된 단구로부터 미성숙 DC를 생성시키는 것으로 이루어진다. 이어서, 미성숙 DC를 백신 후보, 운반체 완충액 (음성 대조군), 또는 TT (양성 대조군)와 함께 항온 배양하였다. 이어서, DC를 사이토킨으로 처리하여 성숙화를 진행시키고, 세척한 다음, 자기 유래의 본래 그대로 T 세포와 함께 항온 배양하였다. 사이토킨 생성, 세포독성 과립 성분의 존재, 및 NS3-특이적 T 세포의 생성을 측정하기 위해, 키미젠™ 단백질 특이적 T 세포의 팽창을 고려하여 T 세포를 2회 더 자극하였다. 그러나, 단일 자극이 본래 그대로의 T 세포 집단으로부터의 팽창을 개시시키는 것으로 예상되었다. 초기 T 세포 활성화 마커 CD69를 측정함으로써 활성화를 평가하였고, CFSE 표지된 T 세포의 형광을 추적함으로써 증식을 측정하였다. CD69 발현과 CFSE 형광 둘 다는 항원 부하된 DC와의 4일 및 7일 배양 후에 평가하였다.
예비 분석은 배양물 중의 DC 및 T 세포 농도가 T 세포 면역 반응을 결정하는데 있어 중요한 파라미터란 사실을 나타내었다. 따라서, 6개 상이한 T 세포:DC 농도를 평가하도록 APA를 설계하였다. 두 세트의 DC 농도를 사용하였는데, 고 농도 의 5 x 104 DCs/웰과 저 농도의 1 x 104 DCs/웰을 사용하였다. 배양한지 48시간 후, 미성숙 DC를 완충액 (음성 대조군), 5 ㎍/mL의 NS3 키미젠™ 단백질 (3C), TT (양성 대조군), 또는 PBS와 함께 항온 배양하였다. 이어서, DC를 8시간 동안 배양하고, 폴리 IC, IL-I, IL-6, TNF-α, IFN-α, 및 IFN-γ를 부가함으로써 성숙시켰다. 밤새 배양한 후 (16시간), PBS 대조군으로부터의 DC를 세척하고, 각종 성숙한 DC 마커의 발현을 알아보기 위해 조사하였다. 고 농도의 DC와 저 농도의 DC 둘 다는 고 수준의 HLA-ABC (MHC 부류 I), HLA-DR (MHC 부류 II), CD86, CD80, 및 CD83를 발현하였다.
자기 유래의 T 세포는 음성 선별 과정에 의해 분리하였고, 세포 분할을 결정하기 위해 CFSE로 표지시켰다. 96-웰 판 중의 DC 100 ㎕/웰에, T 세포 100 ㎕/웰을 웰당 다음 농도를 위해 가하였다: 2O x 104, 5 x 104, 또는 2 x 104. 고 DC 농도 웰의 경우 (5 x 104 DC/웰), 웰당 T 세포 대 DC 비 조합은 20 x 104:5 x 104 (4:1), 5 x 104:5 x 104 (1:1), 및 2 x 104:5 x 104 (0.4:1)였다. 저 DC 농도 웰의 경우 (1 x 104 DC/웰), 웰당 T 세포 대 DC 비 조합은 20 x 104:l x 104 (20:1), 5 x 104:l x 104 (5:1), 및 2 x 104:1 x 104 (2:1)였다. T 세포를 외인성 사이토킨의 부재 하에 DC에 가하였다. 대조군으로서, 3일째 배양물 PHA 1 ㎍/mL을 PBS 처리시킨 DC 군 상으로 부하시킨 T 세포에 가하였다.
배양 4일 후, 세포 배양물의 절반 (100 ㎕)을 수거하여 활성화 및 증식에 관하여 분석하였다. 세포 배양물의 나머지 절반에는, 100 ㎕의 신선한 AIM V®/2.5% 매칭 혈청을 가하고 세포를 3일 더 배양하였다. 배양 4일 및 7일 후 5 x 104 T 세포/웰:5 x 104 DC/웰 비 (1:1)에서 T 세포 상에서의 CD69 발현이 도 37에 도시되었다. 대다수의 PHA 처리시킨 세포는 T 세포:DC 비에 상관없이 CD69를 발현하였다. CD69는 고 DC 농도와 함께 배양한 T 세포에서는 탐지되었지만, 저 DC 농도와 함께 배양한 T 세포에서는 거의 탐지되지 않았다 (데이터는 나타내지 않음). 완충액 대조군과 비교해서, 항원 자극시킨 T 세포는 보다 고 수준의 CD69를 발현하였다. NS3 키미젠™ 단백질-부하된 DC는 4일째에 CD4+ T 세포 보다 높은 비율의 CD69 발현성 CD8+ T 세포를 유도시켰다. 배양 4일 후 1회 이상 분할을 진행한 세포 (CFSElo)의 비율이 도 38에 도시되었다. 이러한 결과는 PHA로 처리시킨 T 세포가 24시간 먼저 분할하기 시작하였다는 지표이다. TT-부하된 DC로 처리시킨 CD8+ 및 CD4+ T 세포는 배양 4일 후에 탐지 가능한 증식을 진행하였는데, 이는 고 DC 농도 하에서만 명백하였다 (데이터는 나타내지 않음). 4일째 백신 후보-처리시킨 군에서는 T 세포 증식이 거의 탐지되지 않았다. 따라서, 본래 그대로의 T 세포는 CD69의 발현에 의해 명백한 바와 같이 배양 4일째에 NS3 키미젠™ 단백질-부하된 DC에 의해 활성화되었지만, 이들 T 세포는 아직까지 분할되지 않았다.
배양 7일 후, 세포를 수거하여 활성화 및 증식에 관하여 분석하였다. 배양 7일 후 T 세포 상에서의 CD69 발현이 도 37에 도시되었다. 키미젠™ 단백질-자극된 T 세포의 경우에는, 고 DC 농도와 함께 배양한 T 세포에서는 CD69가 5% 이상 수준으로 탐지되었지만, 저 DC 농도와 함께 배양한 T 세포에서는 거의 탐지되지 않았다 (데이터는 나타내지 않음). 따라서, 저 DC 농도 (1 x 104 DC/웰)는 항원-특이적 T 세포 활성화를 위해 충분하지 못하였다. 7일째 리콜 TT 반응에 대해서는 CD69의 발현이 저하되었다. d4 T 세포와는 달리, NS3 키미젠™ 단백질-부하된 DC는 7일째에 CD8+ T 세포 보다 높은 비율의 CD69 발현성 CD4+ T 세포를 유도시켰다. 7일째 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 CD69 발현 비율은 리콜 항원 TT와 비교해서 키미젠™ 단백질에 대해 더 높았다. 따라서, 키미젠™ 단백질은 초기에는 본래 그대로의 CD8+ T 세포를 활성화시킨 다음, CD4+ T 세포를 활성화시킨다. 배양 7일 후 1회 이상 분할을 진행한 세포 (CFSElo)의 비율이 도 38에 도시되었다. 키미젠™ 단백질 또는 TT가 부하된 DC는 배양 7일 후에 현저한 CD8+ 및 CD4+ T 세포 증식을 가져다 주었고, 이는 고 DC 농도 하에서 가장 명백하였다 (결과는 나타내지 않음).
DC에 의한 NS3 키미젠™ 단백질 제시로 인해, IFN-γ 및 TNF-α를 생산하는 CD8+ 및 CD4+ T 세포가 발생한다
NS3 키미젠™ 백신에 대한 기능성 면역 반응은 3회 자극 생체외 APA에 의해 평가하였다. 4 x 104 DC/웰 (고 농도) 또는 2 x 104 DC/웰 (저 농도)의 미성숙 DC에 대조군 운반체 완충액, PBS, TT (양성 대조군), 또는 NS3 키미젠™ 단백질을 부하하였다. 이어서, DC를 성숙시키고, 그들의 표현형을 평가하였다. DC가 고 수준 의 MHC 부류 I, MHC 부류 II, CD86, CD80, 및 CD83을 발현하였기 때문에 성숙한 것으로서 평가하였다. 자기 유래의 T 세포를 상기 성숙시킨 항원-부하된 DC와 함께 20 x 104 T 세포/웰:4 x 104 DC/웰 또는 4 x 104 T 세포/웰:2 x 104 DC/웰의 비율로 항온 배양하였다. T 세포를 3회 자극하였고, 세 번째 자극한지 6시간 후에 Th1 사이토킨 IFN-γ 및 TNF-α의 세포내 수준을 탐지함으로써 T 세포 기능을 평가하였다. 또한, 모세포 T 세포의 수준을 평가하였다.
T 세포 집단 중의 모세포 T 세포의 비율 측정치가 T 세포 증식 정도의 평가 기준으로서 사용할 수 있다. 모세포 T 세포는 보다 높은 FSC 및 SSC 광 스캐터를 보유하므로 유동 세포측정법에 의해 평가된 바와 같이 림프구 게이트 내에 휴지기 림프구를 보유하고 있는 세포로서 정의된다. 배양 14일 후 배양 중인 T 모세포의 비율이 도 39에 도시되어 있다. NS3 키미젠™ 단백질은 T 세포 증식 (모세포 생성)을 유도시키는 데에 있어 효율적이었는데, 2:1 T 세포:DC 비는 5:1 비와 비교해서 보다 낮은 배경 (완충액) T 세포 증식 반응을 발생시켰다. 2:1 T 세포:DC 비를 이용한 결과로서, 완충액과 비교해서 NS3 키미젠™ 단백질로의 자극시 T 세포 증식 간에는 현저한 차이가 있었다.
IFN-γ 반응을 5:1 및 2:1 T 세포:DC 비에서 측정하였다. 데이터는 해당 군의 각 웰의 반응으로서 도시되고 평균의 표준 편차를 수반한 3개 웰의 평균치로서 도시되었다 (도 40). T 세포 IFN-γ 반응을 비교한 결과, 5:1 및 2:1 T 세포:DC 비 간에는 현저한 차이가 있는 것으로 나타났다. 보다 고 농도의 DC의 경우에는, 대조군 완충액에 비해 백신 후보-유도된 IFN-γ 반응의 명백한 증거가 없었다. 그러나, 보다 저 농도의 DC의 경우에는, 대조군 완충액-부하된 DC와 함께 배양한 극히 소수의 T 세포가 IFN-γ를 생성시킨 반면, 백신 후보-부하된 DC와 함께 배양한 고 비율의 T 세포는 IFN-γ를 생성시켰다. 5 Tg/mL NS3 키미젠™ 단백질과 비교해서 2.5 ㎍/mL을 부하한 DC로 자극시킨 T 세포에서는 IFN-γ 생산 세포의 감소가 전혀 없었다. CD8+ 및 CD4+ 집단에서의 IFN-γ 발현성 T 세포의 비율을 정량화하고 도 41에 도시하였다. IFN-γ를 발현하는 CD8+ T 세포의 비율은 TT-부하된 DC와 비교해서 백신 후보-부하된 DC 2.5 ㎍/mL로 자극시킨 T 세포에 대해 거의 동등한 수준이었다. 마찬가지로, 대조군 완충액과 비교해서 NS3 키미젠™ 단백질로의 자극시 IFN-γ를 발현한 CD4+ T 세포가 고 비율로 또한 존재하였다. IFN-γ를 발현하는 CD4+ T 세포의 비율은 TT-부하된 DC와 비교해서 백신 후보-부하된 DC로 자극시킨 T 세포에 대해 거의 동등한 수준이었다. 이들 결과는 NS3 키미젠™ 단백질이 CD8+ T 세포 집단과 CD4+ T 세포 집단 둘 다에서 현저한 IFN-γ 반응을 유도시킨다고 나타내었고, 분자가 MHC 부류 I 경로와 부류 II 경로 둘 다에서 DC에 의해 프로세싱된다는 것을 제안하였다.
도 42는 항원 부하된 성숙한 DC로의 6시간 자극에 따른 결과로서 TNF-α를 생성시킨 T 세포의 비율을 도시한 것이다. 이들 결과는 IFN-γ 결과와 유사하였다. TNF-α 반응은 TT와 비교해서 NS3 키미젠™ 단백질에 대해 대략 등가이거나 더 컸다. TT 또는 NS3 키미젠™ 단백질-부하된 DC로 자극시키면, CD8+ T 세포와 비교해서 보다 고 비율의 TNF-α 발현성 CD4+ T 세포가 생성되었다.
DC에 의한 NS3 키미젠™ 단백질 제시로 인해 grB 및 pfn 발현성 CD8+ T 세포가 생성된다
세포독성 과립상 단백질 grB 및 pfn을 생성시킬 수 있는 T 세포의 능력을 또한, 생체외 APA에 의해 평가하였다. 미성숙 DC에 대조군 완충액, TT (양성 대조군), 또는 각종 농도의 NS3 키미젠™ 단백질을 부하하였고, 성숙시 자기 유래의 T 세포와 함께 항온 배양하였다. GrB 및 pfn 발현은 항-grB 및 항-pfn mAb를 각각 사용하여 세포내 염색함으로써 탐지하였다. 도 43은 항원-부하된 성숙한 DC로의 3회 자극 후 grB 및 pfn을 발현하는 CD8+ T 세포의 비율을 도시한 것이다. NS3 키미젠™ 단백질-부하된 DC는 완충액 대조군-처리시킨 DC와 비교해서 CD8+ T 세포에서의 grB 및 pfn 발현 증가를 유도시켰다. 이들 결과는 NS3 키미젠™ 백신이 CD8+ T 세포에서의 grB 및 pfn 발현을 유도시켰다는 것을 나타낸다. 이러한 발견은 상기 백신 후보가 T 세포에 대한 유효한 제시를 위해 MHC 부류 I 경로에서 DC에 의해 프로세싱되어, 그들이 본래 그대로의 CD8+ T 세포에서 세포독성 T 림프구 (CTL)로 분화된다는 것을 나타낸다.
성숙한 DC에 의한 NS3 키미젠™ 단백질 제시로 인해, CD8+ 및 CD4+ T 세포가 발생하고 이들 세포의 활성화가 유지되었다
T 세포를 APA에서 항원-부하된 DC로 3회 자극하였다. 세 번째 자극 후 배양 6일 후에, T 세포를 수거하고 이를 대상으로 하여 증식 측정치로서 모세포 비율을 알아보고 활성화 마커 CD69의 발현을 알아보기 위해 유동 세포계수법에 의해 연구 조사하였다. 또한 배양물로부터 회수한 T 세포의 절대적 수를 평가하기 위한 수단 으로서, FSC 및 SSC FFC 분석에 의거한 림프구 게이트 (R1 게이트)에 속하는 게이트 세포 수를 결정하였다.
CD69 발현에 의해 평가된 바와 같은 활성화된 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 비율이 도 44에 도시되어 있다. 완충액 대조군과 비교해서 키미젠™ 단백질-부하된 DC로 자극시킨 T 세포에서 CD69를 발현하는 CD4+ 및 CD8+ T 세포 둘 다의 비율이 증가하였다. 완충액 대조군과 비교해서 TT 및 키미젠™ 단백질 자극시킨 세포로부터의 T 세포 회수에 있어서 현저한 차이가 있었다 (도 45). TT 자극시킨 세포는 백신 후보 자극시킨 세포 보다는 더 많은 T 세포 회수를 제공하였다. 그러나, TT 반응은 리콜 반응이므로, TT에 대해 특이적으로 반응성인 T 세포 출발 집단은 NS3에 대해 특이적인 본래 그대로의 T 세포의 출발 집단 보다 더 많을 것으로 예상되었다. 배양물에 존재하는 T 모세포 조사시 명백하게도, 모세포/증식성 세포의 비율은 TT 배양물과 비교해서 NS3 키미젠™ 단백질 함유 배양물에서 더 높았다. 완충액 대조군 배양물에서는 극히 적은 수의 모세포/증식성 세포가 존재하였다. 따라서, 키미젠™ 단백질로 자극시키면 현저한 T 세포 활성화 및 증식이 발생하는데, 이는 심지어 세 번째 자극한지 6일 후에도 (T 세포 배양 20일째) 명백하였다. 따라서, NS3 키미젠™ 단백질은 CD8+ 및 CD4+ T 세포 둘 다를 활성화 및 팽창시키는데 극히 유효하다.
성숙한 DC에 의한 NS3 키미젠™ 단백질 제시는 NS3-특이적 CD8+ T 세포의 발생을 유도시킨다
NS3 키미젠™ 단백질에 대한 면역 반응의 특이성을 평가하기 위해, HLA-A2 맥락에서 2개의 면역우성 NS3 에피토프에 대해 특이적인 T 세포의 비율을 정량화하였다. 이는 T 세포를 PE와 접합시킨 NS3 펩티드/HLA-A2 오량체로 표지시킴으로써 결정하였다. 본래 그대로의 T 세포를 상이한 농도의 NS3 키미젠™ 단백질이 부하된 DC로 3회 자극하고, APA에서 항원이 부하되지 않은 각각의 대조군 DC (완충액)와 비교하였다. 세 번째 자극한지 6일 후에 T 세포를 수거하고, NS3-특이적 T 세포 또는 EBV-특이적 T 세포 (대조군)을 사량체 표지화에 의해 탐지하고 유동 세포계수법에 의해 분석하였다. 시험된 완충액 대조군 3개 중의 1개 웰이 CD8+ T 세포 집단에서 EBV 사량체 표지화 (양성 사량체)에 대해 양성이었고, 음성 사량체 표지화에 대해 양성인 웰은 전혀 없었다 (데이터는 나타내지 않음). 평가된 T 세포는 완충액 대조군 처리된 웰로부터 유래되었기 때문에, EBV 사량체-표지된 T 세포의 수가 비교적 적을 것으로 예상되었다. APA를 수행한 후 NS3 오량체로의 CD8+ T 세포 표지화 비율이 도 46에 도시되어 있다. DC에 NS3 키미젠™ 단백질을 부하하면, NS3 에피토프에 대한 특이성을 지닌 T 세포가 생성되었다. 이러한 특이성을 지닌 CD8+ T 세포의 현저한 팽창이 저 DC 농도 군의 6개 웰 중의 4개에서 명백하였다. 따라서, NS3 키미젠™ 단백질은 NS3 면역우성 에피토프에 대해 특이적인 T 세포의 생성을 유도시킬 수 있고, 기타 NS3 에피토프에 대한 특이성을 지닌 T 세포가 또한 존재하는 것으로 예상할 수 있다.
실시예 4. NS3-NS4B-NS5A 다중-항원 키미젠™ 단백질을 이용한 결과
HCV NS3-NS4B-NS5A 키미젠™ 단백질의 발현
Sf9 세포에서 시간 경과에 따른 HCV 다중-항원 키미젠™ 단백질의 발현을 SDS-PAGE에 이어 웨스턴 블롯팅함으로써 분석하였다. HCV 다중-항원 키미젠™ 단백질의 발현과 분해 두 요인을 고려함으로써, 단백질 발현을 위한 가장 우수한 조건을 감염 후 36시간 동안 MOI 1.5로서 결정하였다.
Sf9 세포 펠릿의 청정한 용해물로부터 HCV NS3-NS4B-NS5A 키미젠™ 단백질의 정제
Ni-NTA 친화 크로마토그래피
정제 제1 단계로서, HCV NS3-NS4B-NS5A 키미젠™ 단백질을 Ni-NTA 슈퍼플로우 칼럼 상에 포획시켰다. Ni-NTA 슈퍼플로우 칼럼 상에 결합된 단백질을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. 웨스턴 블롯은 키미젠™ 단백질의 우성 밴드를 나타내었지만, 니트로셀룰로스 막을 은 염색한 결과, 비-면역반응성 단백질의 부가 밴드가 나타났다.
HiTRap Q-XL 이온 교환 크로마토그래피
Ni-NTA 슈퍼플로우 칼럼에 의해 포획된 단백질을 HiTrap Q XL 1 mL 칼럼 크로마토그래피함으로써 추가로 격리시켰다. 단백질을 관류 분획에서 용출시키고, 이 분획을 0.4 내지 0.5 M NaCl의 염 농도에서 용출시켰다. 칼럼 상에 결합된 HCV NS3-NS4B-NS5A 다중-항원 키미젠™ 단백질은 상기 관류 분획 중의 단백질 보다 덜 오염성이었다. 6개 이상의 비-면역 반응성 단백질 밴드가 은 염색에 의해 관찰되었다.
슈퍼덱스 200 크로마토그래피
용해물 중의 단백질을 슈퍼덱스 200 칼럼에 의해 분획화하였다. HCV NS3- NS4B-NS5A-다중-항원 키미젠™ 단백질을 제1 피크에서 용출시켰다. 분획의 웨스턴 블롯과 은 염색을 수행하였다. 단백질은 은 염색시 우성 밴드로서 나타났지만, 수 많은 오염물질 밴드가 또한 가시적이었다. 웨스턴 블롯 결과는 정제 동안 단백질의 응집을 제안하고 있다.
페닐-650C 토요펄 상에서의 소수성 상호 작용 크로마토그래피
HCV NS3-NS4B-NS5A 다중-항원 키미젠™ 단백질을 함유하는 세포 용해물을 페닐-650C 토요펄® 상에 부하하고, 흡수되지 않은 분획과 흡수된 분획 둘 다에서 용출시켰다. 분획의 웨스턴 블롯과 은 염색을 수행하였다. 양 분획에서는, 니트로셀룰로스 막의 웨스턴 블롯 및 은 염색시 HCV 다중-항원 키미젠™ 단백질이 우성 밴드로서 관찰되었다.
실시예 5. HCV 코어 키미젠™ 단백질을 이용한 결과
HCV 코어 키미젠™ 단백질을 정제하고 성상 확인하였다
HCV 코어 키미젠™ 단백질을 변성 조건 하에 Ni 킬레이트화 크로마토그래피 (Ni-NTA 슈퍼플로우)한 다음, 양이온 교환 크로마토그래피 (CM 세파로스)함으로써 정제하였다. 정제된 샘플을 12% SDS-PAGE 겔 상에서 분석하였다. 주요 밴드는 융합 단백질 (약 55 KDa)였고, 28 KDa에서 인지된 제2 밴드는 거의 분해 산물인 것으로 예상된다. 12% SDS-PAGE 겔 상에서 격리시킨 후, 정제된 단백질을 니트로셀룰로스 막에 전기 블롯팅하였다. 웨스턴 블롯팅은 항-6xHis-HRP 접합된 항체, 항-Fc 특이적-HRP 접합된 항체, 및 이차 항체로서 항-Fab 특이적-HRP 접합된 항체를 수반 한 항-HCV 코어 항체를 이용하여 수행하였다. 결합된 항체는 화학발광에 의해 탐지하였다. 항체가 블롯에 결합한다는 것은 정제된 HCV 코어-TBD가 본래의 N-말단, 코어 및 TBD 부분을 갖고 있다는 지표이다. 또한, 보다 저 분자량 밴드가 3개 항체 모두에 의해 탐지되었는데, 이는 완전한 길이의 HCV 코어 키미젠™ 분자로부터 유래된 단백질이고 분해 결과물인 것으로 예상되었다는 지표이다.
HCV 코어 키미젠™ 단백질은 미성숙 DC와 결합한다
HCV 코어 키미젠™ 단백질을 대상으로 하여 미성숙 DC와 결합할 수 있는 그의 능력에 관하여 조사하였다. 세포를 4℃ 하에 1시간 동안 각종 농도의 HCV 코어 키미젠™ 단백질의 존재 및 부재 하에 항온 배양하고, FFC 또는 공초점 현미경에 의해 결합을 탐지하였다. FFC 분석을 위해, 결합된 HCV 코어 키미젠™ 단백질을 바이오티닐화 항-마우스 IgG1 mAb 및 SA-PE-Cy5로 탐지하였다.
HCV 코어 키미젠™ 단백질을 결합시키는 세포 비율 (% 양성 세포) 및 결합된 단백질의 상대적 양 (MFI)을 FFC에 의해 결정하였다. HCV 코어 키미젠™ 단백질을 5 내지 40 ㎍/mL으로 사용하는 경우에는, 대략 100%의 세포가 결합에 대해 양성이었고, 결합된 HCV 코어 키미젠™ 단백질의 양이 용량 의존적으로 증가하였다 (도 47). 관찰된 고 MFI의 결합성은 HCV 코어 키미젠™ 단백질이 미성숙 DC와 극히 효율적이면서도 고 수준으로 결합한다고 것을 나타낸다.
HCV 코어 키미젠™ 단백질의 결합성은 또한 공초점 현미경을 사용하여 연구하였다. 결합성은 FITC 접합된 염소 항-마우스 IgG를 이용하여 탐지하였다. 블루 형광성 염료 DAPI를 사용하여 핵을 영상화하였다. 공초점 영상 및 상응하는 광 영 상은 상기 단백질이 4℃ 하에 1시간 펄싱한 후 미성숙 DC의 막과 결합한다는 것을 보여주었다.
HCV 코어 키미젠™ 단백질은 미성숙 DC 상의 특이적 수용체와 결합한다
Fc 단편의 존재를 통하여, HCV 코어 키미젠™ 단백질은 그의 TBD 영역을 통하여 미성숙 DC 상의 CD32 (FcγRII)와 결합할 수 있는 것으로 예측되었다. 또한, 그의 만노스 당화로 인해, HCV 코어 키미젠™ 단백질은 C-유형 렉틴 수용체, 예를 들어 CD206 (MMR)와 결합하는 것으로 예측되었다. HCV 코어 키미젠™ 단백질의 결합 특이성을 결정하기 위해, 미성숙 DC를 CD32 또는 CD206에 대해 특이적인 차단성 mAb의 존재 하에 HCV 코어 키미젠™ 단백질과 함께 항온 배양하였다. 결합성은 또한, 경쟁성 리간드, Fcγ 수용체에 대한 뮤린 IgG Fc 단편, 및 C-유형 렉틴 수용체에 대한 만노실화 BSA (mBSA)의 존재 하에 조사하였다.
미성숙 DC를 4℃ 하에 1시간 동안 PBS (완충액 대조군), 뮤린 IgG Fc 단편 (500 ㎍/ml), CD32 mAb (200 ㎍/ml), 만노실화 BSA (500 ㎍/ml), 또는 항-CD206 (500 ㎍/ml)와 함께 항온 배양한 다음, 4℃ 하에 1시간 동안 HCV 코어 키미젠™ 단백질 (30 ㎍/ml)과 함께 항온 배양하였다. 결합된 단백질을 바이오티닐화 항-마우스 IgG1 mAb 또는 바이오티닐화 항-HCV 코어 mAb로 탐지한 다음, SA-PE-Cy5로 탐지하였다. 결합된 HCV 코어 키미젠™ 단백질의 상대적 양 (MFI)은 FFC에 의해 결정하였다. 결합성 및 억제 연구로부터의 결과는 HCV 코어 키미젠™ 단백질이 Fcγ 수용체, 예를 들어 CD32 및 C-유형 렉틴 수용체, 예를 들어 CD206과 결합하였다고 나타내었다 (도 48).
DC에 의한 HCV 코어 키미젠™ 단백질 제시로 인해 CD8+ 및 CD4+ T 세포 중에서의 세포내 IFN-γ 수준이 증가하였다
HCV 코어 키미젠™ 단백질에 대한 기능성 면역 반응을 생체외 항원 제시 검정에 의해 평가하였다. 미성숙 DC에 PBS (완충액 대조군), 파상풍 톡소이드 (양성 대조군), 또는 각종 농도의 HCV 코어 키미젠™ 단백질을 부하하였다. DC의 성숙화시, 이들을 자기 유래의 T 세포와 함께 항온 배양하였다. Th1 사이토킨 IFN-γ의 세포내 수준을 탐지함으로서 T 세포 기능을 평가하였다. 세포의 CD3 및 CD8 표현형을 또한 FFC에 의해 결정하였다. 도 49A 및 B는 항원 부하된 성숙한 DC로의 세 번째 자극한지 12시간 후 IFN-γ를 발현하는 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 비율을 각각 도시한 것이다. 유효한 항원 제시를 위한 양성 대조군으로서 파상풍 톡소이드를 사용하였다. HCV 코어 키미젠™ 단백질-부하된 DC는 항원이 없는 대조군과 비교해서 CD8+ T 세포에서의 IFN-γ 발현의 현저한 증가를 유도시켰다. HCV 코어 키미젠™ 단백질-부하된 DC로의 자극시 CD4+ T 세포 집단에서의 IFN-γ의 발현이 증가되었다. 이들 결과는 HCV 코어 키미젠™ 단백질이 CD8+ 및 CD4+ T 세포 집단 둘 다에서 IFN-γ 반응을 유도시킨다고 나타내고, 상기 분자가 MHC 부류 I 및 부류 II 경로 둘 다에서 DC에 의해 프로세싱된다는 것을 제안하고 있다.
성숙한 DC에 의한 HCV 코어 키미젠™ 단백질 제시는 HCV 코어-특이적 CD8+ T 세포의 발생을 유도시킨다
HCV 코어에 대한 면역 반응의 특이성을 평가하기 위해, HLA-B7 맥락에서 면역우성 HCV 코어 에피토프에 대해 특이적인 T 세포의 비율을 정량화하였다. 이는 T 세포를 PE와 접합시킨 HCV 코어 펩티드/HLA-B7 사량체로 표지시킴으로써 달성하였다. 또한, T 세포를 CD4 및 CD8 특이적 mAb로 표지시켰다.
HCV 코어 본래 그대로의 T 세포를 상이한 농도의 HCV 코어 키미젠™ 단백질이 부하된 DC로 3회 자극하고, 항원이 부하되지 않은 대조군 DC, 파상풍 톡소이드 또는 TBD가 부하된 각각의 대조군 DC와 비교하였다. 세 번째 자극한지 5일 후에 T 세포를 수거하고, HCV 코어-특이적 T 세포를 2차원적 FFC에 의해 탐지하였다. 도 50에서의 2개의 2차원적 FFC 도트 플롯은 HCV 코어 키미젠™ 단백질이 부하된 DC와 함께 배양한 T 세포에서는 코어 사량체 양성 T 세포가 소량 증가한 것으로 나타났다.
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SEQUENCE LISTING <110> ViRexx Medical Corp. <120> CHIMERIC HEPATITIS C VIRUS ANTIGENS FOR ELICITING AN IMMUNE RESPONSE <130> 17506-014WO1 <140> PCT/CA2006/001685 <141> 2006-10-13 <150> US 60/726,701 <151> 2005-10-13 <160> 62 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> exemplary peptide linker <400> 1 Ser Arg Pro Gln Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Val Asp Lys Lys Ile 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polymer <400> 3 Val Leu Ser Asp Phe Lys Thr Trp Leu 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polymer <400> 4 Cys Ile Asn Gly Val Cys Trp Thr Val 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polymer <400> 5 Gly Leu Cys Thr Leu Val Ala Met Leu 1 5 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polymer <400> 6 Lys Leu Val Ala Leu Gly Ile Asn Ala Val 1 5 10 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ttc ccc cca aag ccc aag 240 Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys 65 70 75 80 gat gtg ctc acc att act ctg act cct aag gtc acg tgt gtt gtg gta 288 Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val 85 90 95 gac atc agc aag gat gat ccc gag gtc cag ttc agc tgg ttt gta gat 336 Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp 100 105 110 gat gtg gag gtg cac aca gct cag acg caa ccc cgg gag gag cag ttc 384 Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe 115 120 125 aac agc act ttc cgc tca gtc agt gaa ctt ccc atc atg cac cag gac 432 Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp 130 135 140 tgg ctc aat ggc aag gag ttc aaa tgc agg gtc aac agt gca gct ttc 480 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe 145 150 155 160 cct gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa acc aaa ggc aga ccg aag 528 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys 165 170 175 gct cca cag gtg tac acc att cca cct ccc aag gag cag atg gcc aag 576 Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys 180 185 190 gat aaa gtc agt ctg acc tgc atg ata aca gac ttc ttc cct gaa gac 624 Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp 195 200 205 att act gtg gag tgg cag tgg aat ggg cag cca gcg gag aac tac aag 672 Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys 210 215 220 aac act cag ccc atc atg gac aca gat ggc tct tac ttc gtc tac agc 720 Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser 225 230 235 240 aag ctc aat gtg cag aag agc aac tgg gag gca gga aat act ttc acc 768 Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr 245 250 255 tgc tct gtg tta cat gag ggc ctg cac aac cac cat act gag aag agc 816 Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser 260 265 270 ctc tcc cac tct cct ggg ctg caa agc ttg tcg aga agt act aga gga 864 Leu Ser His Ser Pro Gly Leu Gln Ser Leu Ser Arg Ser Thr Arg Gly 275 280 285 tca taa 870 Ser 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Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp 195 200 205 Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys 210 215 220 Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser 225 230 235 240 Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr 245 250 255 Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser 260 265 270 Leu Ser His Ser Pro Gly Leu Gln Ser Leu Ser Arg Ser Thr Arg Gly 275 280 285 Ser <210> 11 <211> 92 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 11 gcatggtcca tggtaagcgc tattgtttta tatgtgcttt tggcggcggc ggcgcattct 60 gcctttgcgg atctgcaggt acggtccgat gc 92 <210> 12 <211> 92 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 12 gcatcggacc gtacctgcag atccgcaaag gcagaatgcg ccgccgccgc caaaagcaca 60 tataaaacaa tagcgcttac catggaccat gc 92 <210> 13 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 13 ccggaattct ccggttcctg gctaagg 27 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DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 30 cggaattcat gagcacgaat cctaaac 27 <210> 31 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 31 ggactagtcc gaagatagag aaagagc 27 <210> 32 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 32 agtaagatct ttacagccca ggagagtggg agag 34 <210> 33 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 33 ccggaattct accaagtgcg caattcct 28 <210> 34 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 34 gcgcactagt cccttcgccc agttccccac c 31 <210> 35 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 35 gcgcactagt cacccacgtc accgggggaa atg 33 <210> 36 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 36 gcgcgcggcc gcccgtactc ccacttaatg gc 32 <210> 37 <211> 19 <212> PRT <213> Autographa californica <400> 37 Met Pro Leu Tyr Lys Leu Leu Asn Val Leu Trp Leu Val Ala Val Ser 1 5 10 15 Asn Ala Ile <210> 38 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gag atc act gga cat 288 Gly Ile Met His Thr Arg Cys His Cys Gly Ala Glu Ile Thr Gly His 85 90 95 gtc aaa aac ggg acg atg agg atc gtc ggt cct agg acc tgc agg aac 336 Val Lys Asn Gly Thr Met Arg Ile Val Gly Pro Arg Thr Cys Arg Asn 100 105 110 atg tgg agt ggg acg ttc ccc att aac gcc tac acc acg ggc ccc tgt 384 Met Trp Ser Gly Thr Phe Pro Ile Asn Ala Tyr Thr Thr Gly Pro Cys 115 120 125 act ccc ctt cct gcg ccg aac tat aag ttc gcg ctg tgg agg gtg tct 432 Thr Pro Leu Pro Ala Pro Asn Tyr Lys Phe Ala Leu Trp Arg Val Ser 130 135 140 gca gag gaa tac gtg gag ata agg cgg gtg ggg gac ttc cac tac gta 480 Ala Glu Glu Tyr Val Glu Ile Arg Arg Val Gly Asp Phe His Tyr Val 145 150 155 160 tcg ggt atg act act gac aat ctt aaa tgc ccg tgc cag atc cca tcg 528 Ser Gly Met Thr Thr Asp Asn Leu Lys Cys Pro Cys Gln Ile Pro Ser 165 170 175 ccc gaa ttt ttc aca gaa ttg gac ggg gtg cgc cta cac agg ttt gcg 576 Pro Glu Phe Phe Thr Glu Leu Asp Gly Val Arg Leu His Arg Phe Ala 180 185 190 ccc cct tgc aag ccc ttg ctg cgg gag gag gta tca ttc aga gta gga 624 Pro Pro Cys Lys Pro Leu Leu Arg Glu Glu Val Ser Phe Arg Val Gly 195 200 205 ctc cac gag tac ccg gtg ggg tcg caa tta cct tgc gag ccc gaa ccg 672 Leu His Glu Tyr Pro Val Gly Ser Gln Leu Pro Cys Glu Pro Glu Pro 210 215 220 gac gta gcc gtg ttg acg tcc atg ctc act gat ccc tcc cat ata aca 720 Asp Val Ala Val Leu Thr Ser Met Leu Thr Asp Pro Ser His Ile Thr 225 230 235 240 gca gag gcg gcc ggg aga agg ttg gcg aga ggg tca ccc cct tct atg 768 Ala Glu Ala Ala Gly Arg Arg Leu Ala Arg Gly Ser Pro Pro Ser Met 245 250 255 gcc agc tcc tcg gct agc cag ctg tcc gct cca tct ctc aag gca act 816 Ala Ser Ser Ser Ala Ser Gln Leu Ser Ala Pro Ser Leu Lys Ala Thr 260 265 270 tgc acc gcc aac cat gac tcc cct gac gcc gag ctc ata gag gct aac 864 Cys Thr Ala Asn His Asp Ser Pro Asp Ala Glu Leu Ile Glu Ala Asn 275 280 285 ctc ctg tgg agg cag gag atg ggc ggc aac atc acc agg gtt gag tca 912 Leu Leu Trp Arg Gln Glu Met Gly Gly Asn Ile Thr Arg Val Glu Ser 290 295 300 gag aac aaa gtg gtg att ctg gac tcc ttc gat ccg ctt gtg gca gag 960 Glu Asn Lys Val Val Ile Leu Asp Ser Phe Asp Pro Leu Val Ala Glu 305 310 315 320 gag gat gag cgg gag gtc tcc gta cct gca gaa att ctg cgg aag tct 1008 Glu Asp Glu Arg Glu Val Ser Val Pro Ala Glu Ile Leu Arg Lys Ser 325 330 335 cgg aga ttc gcc cgg gcc ctg ccc gtc tgg gcg cgg ccg gac tac aac 1056 Arg Arg Phe Ala Arg Ala Leu Pro Val Trp Ala Arg Pro Asp Tyr Asn 340 345 350 ccc ccg cta gta gag acg tgg aaa aag cct gac tac gaa cca cct gtg 1104 Pro Pro Leu Val Glu Thr Trp Lys Lys Pro Asp Tyr Glu Pro Pro Val 355 360 365 gtc cat ggc tgc ccg cta cca cct cca cgg tcc cct cct gtg cct ccg 1152 Val His Gly Cys Pro Leu Pro Pro Pro Arg Ser Pro Pro Val Pro Pro 370 375 380 cct cgg aaa aag cgt acg gtg gtc ctc acc gaa tca acc cta tct act 1200 Pro Arg Lys Lys Arg Thr Val Val Leu Thr Glu Ser Thr Leu Ser Thr 385 390 395 400 gcc ttg gcc gag ctt gcc acc aaa agt ttt ggc agc tcc tca act tcc 1248 Ala Leu Ala Glu Leu Ala Thr Lys Ser Phe Gly Ser Ser Ser Thr Ser 405 410 415 ggc att acg ggc gac aat acg aca aca tcc tct gag ccc gcc cct tct 1296 Gly Ile Thr Gly Asp Asn Thr Thr Thr Ser Ser Glu Pro Ala Pro Ser 420 425 430 ggc tgc ccc ccc gac tcc gac gtt gag tcc tat tct tcc atg ccc ccc 1344 Gly Cys Pro Pro Asp Ser Asp Val Glu Ser Tyr Ser Ser Met Pro Pro 435 440 445 ctg gag ggg gag cct ggg gat ccg gat ctc agc gac ggg tca tgg tcg 1392 Leu Glu Gly Glu Pro Gly Asp Pro Asp Leu Ser Asp Gly Ser Trp Ser 450 455 460 acg gtc agt agt ggg gcc gac acg gaa gat gtc gtg tgc gga cta gtg 1440 Thr Val Ser Ser Gly Ala Asp Thr Glu Asp Val Val Cys Gly Leu Val 465 470 475 480 cgg ccg caa ggc ggc gga tcc gtg gac aag aaa att gtg ccc agg gat 1488 Arg Pro Gln Gly Gly Gly Ser Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp 485 490 495 tgt ggt tgt aag cct tgc ata tgt aca gtc cca gaa gta tca tct gtc 1536 Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val 500 505 510 ttc atc ttc ccc cca aag ccc aag gat gtg ctc acc att act ctg act 1584 Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr 515 520 525 cct aag gtc acg tgt gtt gtg gta gac atc agc aag gat gat ccc gag 1632 Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu 530 535 540 gtc cag ttt agc tgg ttt gta gat gat gtg gag gtg cac aca gct cag 1680 Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln 545 550 555 560 acg caa ccc cgg gag gag cag ttc aac agc act ttc cgc tca gtc agt 1728 Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser 565 570 575 gaa ctt ccc atc atg cac cag gac tgg ctc aat ggc aag gag ttc aaa 1776 Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys 580 585 590 tgc agg gtc aac agt gca gct ttc cct gcc ccc atc gag aaa acc atc 1824 Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 595 600 605 tcc aaa acc aaa ggc aga ccg aag gct cca cag gtg tac acc att cca 1872 Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro 610 615 620 cct ccc aag gag cag atg gcc aag gat aaa gtc agt ctg acc tgc atg 1920 Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp 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gcc atg gat ccg gaa ttc tcc ggt tcc tgg cta agg 192 Tyr Phe Gln Gly Ala Met Asp Pro Glu Phe Ser Gly Ser Trp Leu Arg 50 55 60 gac atc tgg gac tgg ata tgc gag gtg ctg agc gac ttt aag acc tgg 240 Asp Ile Trp Asp Trp Ile Cys Glu Val Leu Ser Asp Phe Lys Thr Trp 65 70 75 80 ctg aaa gcc aag ctc atg cca caa ctg cct ggg att ccc ttt gtg tcc 288 Leu Lys Ala Lys Leu Met Pro Gln Leu Pro Gly Ile Pro Phe Val Ser 85 90 95 tgc cag cgc ggg tat agg ggg gtc tgg cga gga gac ggc att atg cac 336 Cys Gln Arg Gly Tyr Arg Gly Val Trp Arg Gly Asp Gly Ile Met His 100 105 110 act cgc tgc cac tgt gga gct gag atc act gga cat gtc aaa aac ggg 384 Thr Arg Cys His Cys Gly Ala Glu Ile Thr Gly His Val Lys Asn Gly 115 120 125 acg atg agg atc gtc ggt cct agg acc tgc agg aac atg tgg agt ggg 432 Thr Met Arg Ile Val Gly Pro Arg Thr Cys Arg Asn Met Trp Ser Gly 130 135 140 acg ttc ccc att aac gcc tac acc acg ggc ccc tgt act ccc ctt cct 480 Thr Phe Pro Ile Asn Ala Tyr Thr Thr Gly Pro Cys Thr Pro Leu Pro 145 150 155 160 gcg ccg 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Leu Val 370 375 380 gag acg tgg aaa aag cct gac tac gaa cca cct gtg gtc cat ggc tgc 1200 Glu Thr Trp Lys Lys Pro Asp Tyr Glu Pro Pro Val Val His Gly Cys 385 390 395 400 ccg cta cca cct cca cgg tcc cct cct gtg cct ccg cct cgg aaa aag 1248 Pro Leu Pro Pro Pro Arg Ser Pro Pro Val Pro Pro Pro Arg Lys Lys 405 410 415 cgt acg gtg gtc ctc acc gaa tca acc cta tct act gcc ttg gcc gag 1296 Arg Thr Val Val Leu Thr Glu Ser Thr Leu Ser Thr Ala Leu Ala Glu 420 425 430 ctt gcc acc aaa agt ttt ggc agc tcc tca act tcc ggc att acg ggc 1344 Leu Ala Thr Lys Ser Phe Gly Ser Ser Ser Thr Ser Gly Ile Thr Gly 435 440 445 gac aat acg aca aca tcc tct gag ccc gcc cct tct ggc tgc ccc ccc 1392 Asp Asn Thr Thr Thr Ser Ser Glu Pro Ala Pro Ser Gly Cys Pro Pro 450 455 460 gac tcc gac gtt gag tcc tat tct tcc atg ccc ccc ctg gag ggg gag 1440 Asp Ser Asp Val Glu Ser Tyr Ser Ser Met Pro Pro Leu Glu Gly Glu 465 470 475 480 cct ggg gat ccg gat ctc agc gac ggg tca tgg tcg acg gtc agt agt 1488 Pro Gly Asp Pro Asp Leu Ser Asp Gly Ser Trp Ser Thr Val Ser Ser 485 490 495 ggg gcc gac acg gaa gat gtc gtg tgc gga cta gtg cgg ccg caa ggc 1536 Gly Ala Asp Thr Glu Asp Val Val Cys Gly Leu Val Arg Pro Gln Gly 500 505 510 ggc gga tcc gtg gac aag aaa att gtg ccc agg gat tgt ggt tgt aag 1584 Gly Gly Ser Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys 515 520 525 cct tgc ata tgt aca gtc cca gaa gta tca tct gtc ttc atc ttc ccc 1632 Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro 530 535 540 cca aag ccc aag gat gtg ctc acc att act ctg act cct aag gtc acg 1680 Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr 545 550 555 560 tgt gtt gtg gta gac atc agc aag gat gat ccc gag gtc cag ttt agc 1728 Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser 565 570 575 tgg ttt gta gat gat gtg gag gtg cac aca gct cag acg caa ccc cgg 1776 Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg 580 585 590 gag gag cag ttc aac agc act ttc cgc tca gtc agt gaa ctt ccc atc 1824 Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile 595 600 605 atg cac cag gac tgg ctc aat ggc aag gag ttc aaa tgc agg gtc aac 1872 Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn 610 615 620 agt gca gct ttc cct gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa acc aaa 1920 Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys 625 630 635 640 ggc aga ccg aag gct cca cag gtg tac acc att cca cct ccc aag gag 1968 Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu 645 650 655 cag atg gcc aag gat aaa gtc agt ctg acc tgc atg ata aca gac ttc 2016 Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe 660 665 670 ttc cct gaa gac att act gtg gag tgg cag tgg aat ggg cag cca gcg 2064 Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala 675 680 685 gag aac tac aag aac act cag ccc atc atg gac aca gat ggc tct tac 2112 Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr 690 695 700 ttc gtc tac agc aag ctc aat gtg cag aag agc aac tgg gag gca gga 2160 Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly 705 710 715 720 aat act ttc acc tgc tct gtg tta cat gag ggc ctg cac aac cac cat 2208 Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His 725 730 735 act gag aag agc ctc tcc cac tct cct ggg ctg caa agc ttg tcg aga 2256 Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Leu Gln Ser Leu Ser Arg 740 745 750 agt act aga gga tca taa 2274 Ser Thr Arg Gly Ser 755 <210> 42 <211> 2211 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <221> CDS <222> (1)...(2208) <400> 42 atg ccc ttg tac aaa ttg tta aac gtt ttg tgg ttg gtc gcc gtt tct 48 Met Pro Leu Tyr Lys Leu Leu Asn Val Leu Trp Leu Val Ala Val Ser 1 5 10 15 aac gcg tcg tac tac cat cac cat cac cat cac gat tac gat atc cca 96 Asn Ala Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro 20 25 30 acg acc gaa aac ctg tat ttt cag ggc gcc atg gat ccg gaa ttc tcc 144 Thr Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Met Asp Pro Glu Phe Ser 35 40 45 ggt tcc tgg cta agg gac atc tgg gac tgg ata tgc gag gtg ctg agc 192 Gly Ser Trp Leu Arg Asp Ile Trp Asp Trp Ile Cys Glu Val Leu Ser 50 55 60 gac ttt aag acc tgg ctg aaa gcc aag ctc atg cca caa ctg cct ggg 240 Asp Phe Lys Thr Trp Leu Lys Ala Lys Leu Met Pro Gln Leu Pro Gly 65 70 75 80 att ccc ttt gtg tcc tgc cag cgc ggg tat agg ggg gtc tgg cga gga 288 Ile Pro Phe Val Ser Cys Gln Arg Gly Tyr Arg Gly Val Trp Arg Gly 85 90 95 gac ggc att atg cac act cgc tgc cac tgt gga gct gag atc act gga 336 Asp Gly Ile Met His Thr Arg Cys His Cys Gly Ala Glu Ile Thr Gly 100 105 110 cat gtc aaa aac ggg acg atg agg atc gtc ggt cct agg acc tgc agg 384 His Val Lys Asn Gly Thr Met Arg Ile Val Gly Pro Arg Thr Cys Arg 115 120 125 aac atg tgg agt ggg acg ttc ccc att aac gcc tac acc acg ggc ccc 432 Asn Met Trp Ser Gly Thr Phe Pro Ile Asn Ala Tyr Thr Thr Gly Pro 130 135 140 tgt act ccc ctt cct gcg ccg aac tat aag ttc gcg ctg tgg agg gtg 480 Cys Thr Pro Leu Pro Ala Pro Asn Tyr Lys Phe Ala Leu Trp Arg Val 145 150 155 160 tct gca gag gaa tac gtg gag ata agg cgg gtg ggg gac ttc cac tac 528 Ser Ala Glu Glu Tyr Val Glu Ile Arg Arg Val Gly Asp Phe His Tyr 165 170 175 gta tcg ggt atg act act gac aat ctt aaa tgc ccg tgc cag atc cca 576 Val Ser Gly Met Thr Thr Asp Asn Leu Lys Cys Pro Cys Gln Ile Pro 180 185 190 tcg ccc gaa ttt ttc aca gaa ttg gac ggg gtg cgc cta cac agg ttt 624 Ser Pro Glu Phe Phe Thr Glu Leu Asp Gly Val Arg Leu His Arg Phe 195 200 205 gcg ccc cct tgc aag ccc ttg ctg cgg gag gag gta tca ttc aga gta 672 Ala Pro Pro Cys Lys Pro Leu Leu Arg Glu Glu Val Ser Phe Arg Val 210 215 220 gga ctc cac gag tac ccg gtg ggg tcg caa tta cct tgc gag ccc gaa 720 Gly Leu His Glu Tyr Pro Val Gly Ser Gln Leu Pro Cys Glu Pro Glu 225 230 235 240 ccg gac gta gcc gtg ttg acg tcc atg ctc act gat ccc tcc cat ata 768 Pro Asp Val Ala Val Leu Thr Ser Met Leu Thr Asp Pro Ser His Ile 245 250 255 aca gca gag gcg gcc ggg aga agg ttg gcg aga ggg tca ccc cct tct 816 Thr Ala Glu Ala Ala Gly Arg Arg Leu Ala Arg Gly Ser Pro Pro Ser 260 265 270 atg gcc agc tcc tcg gct agc cag ctg tcc gct cca tct ctc aag gca 864 Met Ala Ser Ser Ser Ala Ser Gln Leu Ser Ala Pro Ser Leu Lys Ala 275 280 285 act tgc acc gcc aac cat gac tcc cct gac gcc gag ctc ata gag gct 912 Thr Cys Thr Ala Asn His Asp Ser Pro Asp Ala Glu Leu Ile Glu Ala 290 295 300 aac ctc ctg tgg agg cag gag atg ggc ggc aac atc acc agg gtt gag 960 Asn Leu Leu Trp Arg Gln Glu Met Gly Gly Asn Ile Thr Arg Val Glu 305 310 315 320 tca gag aac aaa gtg gtg att ctg gac tcc ttc gat ccg ctt gtg gca 1008 Ser Glu Asn Lys Val Val Ile Leu Asp Ser Phe Asp Pro Leu Val Ala 325 330 335 gag gag gat gag cgg gag gtc tcc gta cct gca gaa att ctg cgg aag 1056 Glu Glu Asp Glu Arg Glu Val Ser Val Pro Ala Glu Ile Leu Arg Lys 340 345 350 tct cgg aga ttc gcc cgg gcc ctg ccc gtc tgg gcg cgg ccg gac tac 1104 Ser Arg Arg Phe Ala Arg Ala Leu Pro Val Trp Ala Arg Pro Asp Tyr 355 360 365 aac ccc ccg cta gta gag acg tgg aaa aag cct gac tac gaa cca cct 1152 Asn Pro Pro Leu Val Glu Thr Trp Lys Lys Pro Asp Tyr Glu Pro Pro 370 375 380 gtg gtc cat ggc tgc ccg cta cca cct cca cgg tcc cct cct gtg cct 1200 Val Val His Gly Cys Pro Leu Pro Pro Pro Arg Ser Pro Pro Val Pro 385 390 395 400 ccg cct cgg aaa aag cgt acg gtg gtc ctc acc gaa tca acc cta tct 1248 Pro Pro Arg Lys Lys Arg Thr Val Val Leu Thr Glu Ser Thr Leu Ser 405 410 415 act gcc ttg gcc gag ctt gcc acc aaa agt ttt ggc agc tcc tca act 1296 Thr Ala Leu Ala Glu Leu Ala Thr Lys Ser Phe Gly Ser Ser Ser Thr 420 425 430 tcc ggc att acg ggc gac aat acg aca aca tcc tct gag ccc gcc cct 1344 Ser Gly Ile Thr Gly Asp Asn Thr Thr Thr Ser Ser Glu Pro Ala Pro 435 440 445 tct ggc tgc ccc ccc gac tcc gac gtt gag tcc tat tct tcc atg ccc 1392 Ser Gly Cys Pro Pro Asp Ser Asp Val Glu Ser Tyr Ser Ser Met Pro 450 455 460 ccc ctg gag ggg gag cct ggg gat ccg gat ctc agc gac ggg tca tgg 1440 Pro Leu Glu Gly Glu Pro Gly Asp Pro Asp Leu Ser Asp Gly Ser Trp 465 470 475 480 tcg acg gtc agt agt ggg gcc gac acg gaa gat gtc gtg tgc gga cta 1488 Ser Thr Val Ser Ser Gly Ala Asp Thr Glu Asp Val Val Cys Gly Leu 485 490 495 gtg cgg ccg caa ggc ggc gga tcc gtg gac aag aaa att gtg ccc agg 1536 Val Arg Pro Gln Gly Gly Gly Ser Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg 500 505 510 gat tgt ggt tgt aag cct tgc ata tgt aca gtc cca gaa gta tca tct 1584 Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser 515 520 525 gtc ttc atc ttc ccc cca aag ccc aag gat gtg ctc acc att act ctg 1632 Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu 530 535 540 act cct aag gtc acg tgt gtt gtg gta gac atc agc aag gat gat ccc 1680 Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro 545 550 555 560 gag gtc cag ttc agc tgg ttt gta gat gat gtg gag gtg cac aca gct 1728 Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala 565 570 575 cag acg caa ccc cgg gag gag cag ttc aac agc act ttc cgc tca gtc 1776 Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val 580 585 590 agt gaa ctt ccc atc atg cac cag gac tgg ctc aat ggc aag gag ttc 1824 Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe 595 600 605 aaa tgc agg gtc aac agt gca gct ttc cct gcc ccc atc gag aaa acc 1872 Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 610 615 620 atc tcc aaa acc aaa ggc aga ccg aag gct cca cag gtg tac acc att 1920 Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile 625 630 635 640 cca cct ccc aag gag cag atg gcc aag gat aaa gtc agt ctg acc tgc 1968 Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys 645 650 655 atg ata aca gac ttc ttc cct gaa gac att act gtg gag tgg cag tgg 2016 Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp 660 665 670 aat ggg cag cca gcg gag aac tac aag aac act cag ccc atc atg gac 2064 Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp 675 680 685 aca gat ggc tct tac ttc gtc tac agc aag ctc aat gtg cag aag agc 2112 Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser 690 695 700 aac tgg gag gca gga aat act ttc acc tgc tct gtg tta cat gag ggc 2160 Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly 705 710 715 720 ctg cac aac cac cat act gag aag agc ctc tcc cac tct cct ggg ctg 2208 Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Leu 725 730 735 taa 2211 <210> 43 <211> 2808 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <221> CDS <222> (1)...(2805) <400> 43 atg gta agc gct att gtt tta tat gtg ctt ttg gcg gcg gcg gcg cat 48 Met Val Ser Ala Ile Val Leu Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala Ala His 1 5 10 15 tct gcc ttt gcg tat ctg cag gta cgg tcc gaa acc atg tcg tac tac 96 Ser Ala Phe Ala Tyr Leu Gln Val Arg Ser Glu Thr Met Ser Tyr Tyr 20 25 30 cat cac cat cac cat cac gat tac gat atc cca acg acc gaa aac ctg 144 His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr Thr Glu Asn Leu 35 40 45 tat ttt cag ggc gcc atg gat ccg gaa ttc gcg ccc atc acg gcg tac 192 Tyr Phe Gln Gly Ala Met Asp Pro Glu Phe Ala Pro Ile Thr Ala Tyr 50 55 60 gcc cag cag acg aga ggc ctc cta ggg tgt ata atc acc agc ctg act 240 Ala Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly Cys Ile Ile Thr Ser Leu Thr 65 70 75 80 ggc cgg gac aaa aac caa gtg gag ggt gag gtc cag atc gtg tca act 288 Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Glu Gly Glu Val Gln Ile Val Ser Thr 85 90 95 gct acc caa acc ttc ctg gca acg tgc atc aat ggg gta tgc tgg act 336 Ala Thr Gln Thr Phe Leu Ala Thr Cys Ile Asn Gly Val Cys Trp Thr 100 105 110 gtc tac cac ggg gcc gga acg agg acc atc gca tca ccc aag ggt cct 384 Val Tyr His Gly Ala Gly Thr Arg Thr Ile Ala Ser Pro Lys Gly Pro 115 120 125 gtc atc cag atg tat acc aat gtg gac caa gac ctt gtg ggc tgg ccc 432 Val Ile Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp Gln Asp Leu Val Gly Trp Pro 130 135 140 gct cct caa ggt tcc cgc tca ttg aca ccc tgt acc tgc ggc tcc tcg 480 Ala Pro Gln Gly Ser Arg Ser Leu Thr Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser 145 150 155 160 gac ctt tac ctg gtc acg agg cac gcc gat gtc att ccc gtg cgc cgg 528 Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His Ala Asp Val Ile Pro Val Arg Arg 165 170 175 cga ggt gat agc agg ggt agc ctg ctt tcg ccc cgg ccc att tcc tac 576 Arg Gly Asp Ser Arg Gly Ser Leu Leu Ser Pro Arg Pro Ile Ser Tyr 180 185 190 ttg aaa ggc tcc tcg ggg ggt ccg ctg ttg tgc ccc gcg gga cac gcc 624 Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu Leu Cys Pro Ala Gly His Ala 195 200 205 gtg ggc cta ttc agg gcc gcg gtg tgc acc cgt gga gtg gct aaa gcg 672 Val Gly Leu Phe Arg Ala Ala Val Cys Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala 210 215 220 gtg gac ttt atc cct gtg gag aac cta ggg aca acc atg aga tcc ccg 720 Val Asp Phe Ile Pro Val Glu Asn Leu Gly Thr Thr Met Arg Ser Pro 225 230 235 240 gtg ttc acg gac aac tcc tct cca cca gca gtg ccc cag agc ttc cag 768 Val Phe Thr Asp Asn Ser Ser Pro Pro Ala Val Pro Gln Ser Phe Gln 245 250 255 gtg gcc cac ctg cat gct ccc acc ggc agc ggt aag agc acc aag gtc 816 Val Ala His Leu His Ala Pro Thr Gly Ser Gly Lys Ser Thr Lys Val 260 265 270 ccg gct gcg tac gca gcc cag ggc tac aag gtg ttg gtg ctc aac ccc 864 Pro Ala Ala Tyr Ala Ala Gln Gly Tyr Lys Val Leu Val Leu Asn Pro 275 280 285 tct gtt gct gca acg ctg ggc ttt ggt gct tac atg tcc aag gcc cat 912 Ser Val Ala Ala Thr Leu Gly Phe Gly Ala Tyr Met Ser Lys Ala His 290 295 300 ggg gtt gat cct aat atc agg acc ggg gtg aga aca att acc act ggc 960 Gly Val Asp Pro Asn Ile Arg Thr Gly Val Arg Thr Ile Thr Thr Gly 305 310 315 320 agc ccc atc acg tac tcc acc tac ggc aag ttc ctt gcc gac ggc ggg 1008 Ser Pro Ile Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly Lys Phe Leu Ala Asp Gly Gly 325 330 335 tgc tca gga ggt gct tat gac ata ata att tgt gac gag tgc cac tcc 1056 Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp Ile Ile Ile Cys Asp Glu Cys His Ser 340 345 350 acg gat gcc aca tcc atc ttg ggc atc ggc act gtc ctt gac caa gca 1104 Thr Asp Ala Thr Ser Ile Leu Gly Ile Gly Thr Val Leu Asp Gln Ala 355 360 365 gag act gcg ggg gcg aga ctg gtt gtg ctc gcc act gct acc cct ccg 1152 Glu Thr Ala Gly Ala Arg Leu Val Val Leu Ala Thr Ala Thr Pro Pro 370 375 380 ggc tcc gtc act gtg tcc cat cct aac atc gag gag gtt gct ctg tcc 1200 Gly Ser Val Thr Val Ser His Pro Asn Ile Glu Glu Val Ala Leu Ser 385 390 395 400 acc acc gga gag atc ccc ttt tac ggc aag gct atc ccc ctc gag gtg 1248 Thr Thr Gly Glu Ile Pro Phe Tyr Gly Lys Ala Ile Pro Leu Glu Val 405 410 415 atc aag ggg gga aga cat ctc atc ttc tgc cac tca aag aag aag tgc 1296 Ile Lys Gly Gly Arg His Leu Ile Phe Cys His Ser Lys Lys Lys Cys 420 425 430 gac gag ctc gcc gcg aag ctg gtc gca ttg ggc atc aat gcc gtg gcc 1344 Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Val Ala Leu Gly Ile Asn Ala Val Ala 435 440 445 tac tac cgc ggt ctt gac gtg tct gtc atc ccg acc agc ggc gat gtt 1392 Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val Ile Pro Thr Ser Gly Asp Val 450 455 460 gtc gtc gtg tcg acc gat gct ctc atg act ggc ttt acc ggc gac ttc 1440 Val Val Val Ser Thr Asp Ala Leu Met Thr Gly Phe Thr Gly Asp Phe 465 470 475 480 gac tct gtg ata gac tgc aac acg tgt gtc act cag aca gtc gat ttc 1488 Asp Ser Val Ile Asp Cys Asn Thr Cys Val Thr Gln Thr Val Asp Phe 485 490 495 agc ctt gac cct acc ttt acc att gag aca acc acg ctc ccc cag gat 1536 Ser Leu Asp Pro Thr Phe Thr Ile Glu Thr Thr Thr Leu Pro Gln Asp 500 505 510 gct gtc tcc 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cac cat cac cat cac gat tac gat atc cca acg 48 Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr 1 5 10 15 acc gaa aac ctg tat ttt cag ggc gcc atg gat ccg gaa ttc gcg ccc 96 Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Met Asp Pro Glu Phe Ala Pro 20 25 30 atc acg gcg tac gcc cag cag acg aga ggc ctc cta ggg tgt ata atc 144 Ile Thr Ala Tyr Ala Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly Cys Ile Ile 35 40 45 acc agc ctg act ggc cgg gac aaa aac caa gtg gag ggt gag gtc cag 192 Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Glu Gly Glu Val Gln 50 55 60 atc gtg tca act gct acc caa acc ttc ctg gca acg tgc atc aat ggg 240 Ile Val Ser Thr Ala Thr Gln Thr Phe Leu Ala Thr Cys Ile Asn Gly 65 70 75 80 gta tgc tgg act gtc tac cac ggg gcc gga acg agg acc atc gca tca 288 Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Thr Arg Thr Ile Ala Ser 85 90 95 ccc aag ggt cct gtc atc cag atg tat acc aat gtg gac caa gac ctt 336 Pro Lys Gly Pro Val Ile Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp Gln Asp Leu 100 105 110 gtg ggc tgg ccc gct cct caa 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gtg gcc cac ctg cat gct ccc acc ggc agc ggt aag 720 Gln Ser Phe Gln Val Ala His Leu His Ala Pro Thr Gly Ser Gly Lys 225 230 235 240 agc acc aag gtc ccg gct gcg tac gca gcc cag ggc tac aag gtg ttg 768 Ser Thr Lys Val Pro Ala Ala Tyr Ala Ala Gln Gly Tyr Lys Val Leu 245 250 255 gtg ctc aac ccc tct gtt gct gca acg ctg ggc ttt ggt gct tac atg 816 Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala Thr Leu Gly Phe Gly Ala Tyr Met 260 265 270 tcc aag gcc cat ggg gtt gat cct aat atc agg acc ggg gtg aga aca 864 Ser Lys Ala His Gly Val Asp Pro Asn Ile Arg Thr Gly Val Arg Thr 275 280 285 att acc act ggc agc ccc atc acg tac tcc acc tac ggc aag ttc ctt 912 Ile Thr Thr Gly Ser Pro Ile Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly Lys Phe Leu 290 295 300 gcc gac ggc ggg tgc tca gga ggt gct tat gac ata ata att tgt gac 960 Ala Asp Gly Gly Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp Ile Ile Ile Cys Asp 305 310 315 320 gag tgc cac tcc acg gat gcc aca tcc atc ttg ggc atc ggc act gtc 1008 Glu Cys His Ser Thr Asp Ala Thr Ser Ile Leu Gly Ile Gly Thr Val 325 330 335 ctt gac caa gca gag act gcg ggg gcg aga ctg gtt gtg ctc gcc act 1056 Leu Asp Gln Ala Glu Thr Ala Gly Ala Arg Leu Val Val Leu Ala Thr 340 345 350 gct acc cct ccg ggc tcc gtc act gtg tcc cat cct aac atc gag gag 1104 Ala Thr Pro Pro Gly Ser Val Thr Val Ser His Pro Asn Ile Glu Glu 355 360 365 gtt gct ctg tcc acc acc gga gag atc ccc ttt tac ggc aag gct atc 1152 Val Ala Leu Ser Thr Thr Gly Glu Ile Pro Phe Tyr Gly Lys Ala Ile 370 375 380 ccc ctc gag gtg atc aag ggg gga aga cat ctc atc ttc tgc cac tca 1200 Pro Leu Glu Val Ile Lys Gly Gly Arg His Leu Ile Phe Cys His Ser 385 390 395 400 aag aag aag tgc gac gag ctc gcc gcg aag ctg gtc gca ttg ggc atc 1248 Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Val Ala Leu Gly Ile 405 410 415 aat gcc gtg gcc tac tac cgc ggt ctt gac gtg tct gtc atc ccg acc 1296 Asn Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val Ile Pro Thr 420 425 430 agc ggc gat gtt gtc gtc gtg tcg acc gat gct ctc atg act ggc ttt 1344 Ser Gly Asp Val Val Val Val Ser Thr Asp Ala Leu Met Thr Gly Phe 435 440 445 acc ggc gac ttc gac tct gtg ata gac tgc aac acg tgt gtc act cag 1392 Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Ile Asp Cys Asn Thr Cys Val Thr Gln 450 455 460 aca gtc gat ttc agc ctt gac cct acc ttt acc att gag aca acc acg 1440 Thr Val Asp Phe Ser Leu Asp Pro Thr Phe Thr Ile Glu Thr Thr Thr 465 470 475 480 ctc ccc cag gat gct gtc tcc cgg act caa cgc gcg ggc agg act ggc 1488 Leu Pro Gln Asp Ala Val Ser Arg Thr Gln Arg Ala Gly Arg Thr Gly 485 490 495 agg ggg aag cca ggc atc tat aga ttt gtg gca ccg ggg gag cgc ccc 1536 Arg Gly Lys Pro Gly Ile Tyr Arg Phe Val Ala Pro Gly Glu Arg Pro 500 505 510 tcc ggc atg ttc gac tcg tcc gtc ctc tgt gag tgc tat gac gcg ggc 1584 Ser Gly Met Phe Asp Ser Ser Val Leu Cys Glu Cys Tyr Asp Ala Gly 515 520 525 tgt gct tgg tat gag ctc acg ccc gcc gag act aca gtt agg cta cga 1632 Cys Ala Trp Tyr Glu Leu Thr Pro Ala Glu Thr Thr Val Arg Leu Arg 530 535 540 gcg tac atg aac acc ccg ggg ctt ccc gtg tgc cag gac cat ctt gaa 1680 Ala Tyr Met Asn Thr Pro Gly Leu Pro 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agg act ggc agg ggg aag cca 1584 Ala Val Ser Arg Thr Gln Arg Ala Gly Arg Thr Gly Arg Gly Lys Pro 515 520 525 ggc atc tat aga ttt gtg gca ccg ggg gag cgc ccc tcc ggc atg ttc 1632 Gly Ile Tyr Arg Phe Val Ala Pro Gly Glu Arg Pro Ser Gly Met Phe 530 535 540 gac tcg tcc gtc ctc tgt gag tgc tat gac gcg ggc tgt gct tgg tat 1680 Asp Ser Ser Val Leu Cys Glu Cys Tyr Asp Ala Gly Cys Ala Trp Tyr 545 550 555 560 gag ctc acg ccc gcc gag act aca gtt agg cta cga gcg tac atg aac 1728 Glu Leu Thr Pro Ala Glu Thr Thr Val Arg Leu Arg Ala Tyr Met Asn 565 570 575 acc ccg ggg ctt ccc gtg tgc cag gac cat ctt gaa ttt tgg gag ggc 1776 Thr Pro Gly Leu Pro Val Cys Gln Asp His Leu Glu Phe Trp Glu Gly 580 585 590 gtc ttt acg ggc ctc act cat ata gat gcc cac ttt tta tcc cag aca 1824 Val Phe Thr Gly Leu Thr His Ile Asp Ala His Phe Leu Ser Gln Thr 595 600 605 aag cag agt ggg gag aac ttt cct tac ctg gta gcg tac caa gcc acc 1872 Lys Gln Ser Gly Glu Asn Phe Pro Tyr Leu Val Ala Tyr Gln Ala Thr 610 615 620 gtg tgc gct agg 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gcg gcg gcg gcg cat 48 Met Val Ser Ala Ile Val Leu Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala Ala His 1 5 10 15 tct gcc ttt gcg tat ctg cag gta cgg tcc gaa acc atg tcg tac tac 96 Ser Ala Phe Ala Tyr Leu Gln Val Arg Ser Glu Thr Met Ser Tyr Tyr 20 25 30 cat cac cat cac cat cac gat tac gat atc cca acg acc gaa aac ctg 144 His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr Thr Glu Asn Leu 35 40 45 tat ttt cag ggc gcc atg gat ccg gaa ttc gcg ccc atc acg gcg tac 192 Tyr Phe Gln Gly Ala Met Asp Pro Glu Phe Ala Pro Ile Thr Ala Tyr 50 55 60 gcc cag cag acg aga ggc ctc cta ggg tgt ata atc acc agc ctg act 240 Ala Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly Cys Ile Ile Thr Ser Leu Thr 65 70 75 80 ggc cgg gac aaa aac caa gtg gag ggt gag gtc cag atc gtg tca act 288 Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Glu Gly Glu Val Gln Ile Val Ser Thr 85 90 95 gct acc caa acc ttc ctg gca acg tgc atc aat ggg gta tgc tgg act 336 Ala Thr Gln Thr Phe Leu Ala Thr Cys Ile Asn Gly Val Cys Trp Thr 100 105 110 gtc tac cac ggg gcc gga acg agg acc atc gca tca ccc aag ggt cct 384 Val Tyr His Gly Ala Gly Thr Arg Thr Ile Ala Ser Pro Lys Gly Pro 115 120 125 gtc atc cag atg tat acc aat gtg gac caa gac ctt gtg ggc tgg ccc 432 Val Ile Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp Gln Asp Leu Val Gly Trp Pro 130 135 140 gct cct caa ggt tcc cgc tca ttg aca ccc tgt acc tgc ggc tcc tcg 480 Ala Pro Gln Gly Ser Arg Ser Leu Thr Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser 145 150 155 160 gac ctt tac ctg gtc acg agg cac gcc gat gtc att ccc gtg cgc cgg 528 Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His Ala Asp Val Ile Pro Val Arg Arg 165 170 175 cga ggt gat agc agg ggt agc ctg ctt tcg ccc cgg ccc att tcc tac 576 Arg Gly Asp Ser Arg Gly Ser Leu Leu Ser Pro Arg Pro Ile Ser Tyr 180 185 190 ttg aaa ggc tcc gcg ggg ggt ccg ctg ttg tgc ccc gcg gga cac gcc 624 Leu Lys Gly Ser Ala Gly Gly Pro Leu Leu Cys Pro Ala Gly His Ala 195 200 205 gtg ggc cta ttc agg gcc gcg gtg tgc acc cgt gga gtg gct aaa gcg 672 Val Gly Leu Phe Arg Ala Ala Val Cys Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala 210 215 220 gtg gac ttt atc cct gtg gag aac cta ggg aca acc atg aga tcc ccg 720 Val Asp Phe Ile Pro Val Glu Asn Leu Gly Thr Thr Met Arg Ser Pro 225 230 235 240 gtg ttc acg gac aac tcc tct cca cca gca gtg ccc cag agc ttc cag 768 Val Phe Thr Asp Asn Ser Ser Pro Pro Ala Val Pro Gln Ser Phe Gln 245 250 255 gtg gcc cac ctg cat gct ccc acc ggc agc ggt aag agc acc aag gtc 816 Val Ala His Leu His Ala Pro Thr Gly Ser Gly Lys Ser Thr Lys Val 260 265 270 ccg gct gcg tac gca gcc cag ggc tac aag gtg ttg gtg ctc aac ccc 864 Pro Ala Ala Tyr Ala Ala Gln Gly Tyr Lys Val Leu Val Leu Asn Pro 275 280 285 tct gtt gct gca acg ctg ggc ttt ggt gct tac atg tcc aag gcc cat 912 Ser Val Ala Ala Thr Leu Gly Phe Gly Ala Tyr Met Ser Lys Ala His 290 295 300 ggg gtt gat cct aat atc agg acc ggg gtg aga aca att acc act ggc 960 Gly Val Asp Pro Asn Ile Arg Thr Gly Val Arg Thr Ile Thr Thr Gly 305 310 315 320 agc ccc atc acg tac tcc acc tac ggc aag ttc ctt gcc gac ggc ggg 1008 Ser Pro Ile Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly Lys Phe Leu Ala Asp Gly Gly 325 330 335 tgc tca gga ggt gct tat gac ata ata att tgt gac gag tgc cac tcc 1056 Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp Ile Ile Ile Cys Asp Glu Cys His Ser 340 345 350 acg gat gcc aca tcc atc ttg ggc atc ggc act gtc ctt gac caa gca 1104 Thr Asp Ala Thr Ser Ile Leu Gly Ile Gly Thr Val Leu Asp Gln Ala 355 360 365 gag act gcg ggg gcg aga ctg gtt gtg ctc gcc act gct acc cct ccg 1152 Glu Thr Ala Gly Ala Arg Leu Val Val Leu Ala Thr Ala Thr Pro Pro 370 375 380 ggc tcc gtc act gtg tcc cat cct aac atc gag gag gtt gct ctg tcc 1200 Gly Ser Val Thr Val Ser His Pro Asn Ile Glu Glu Val Ala Leu Ser 385 390 395 400 acc acc gga gag atc ccc ttt tac ggc aag gct atc ccc ctc gag gtg 1248 Thr Thr Gly Glu Ile Pro Phe Tyr Gly Lys Ala Ile Pro Leu Glu Val 405 410 415 atc aag ggg gga aga cat ctc atc ttc tgc cac tca aag aag aag tgc 1296 Ile Lys Gly Gly Arg His Leu Ile Phe Cys His Ser Lys Lys Lys Cys 420 425 430 gac gag ctc gcc gcg aag ctg gtc gca ttg ggc atc aat gcc gtg gcc 1344 Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Val Ala Leu Gly Ile Asn Ala Val Ala 435 440 445 tac tac cgc ggt ctt gac gtg tct gtc atc ccg acc agc ggc gat gtt 1392 Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val Ile Pro Thr Ser Gly Asp Val 450 455 460 gtc gtc gtg tcg acc gat gct ctc atg act ggc ttt acc ggc gac ttc 1440 Val Val Val Ser Thr Asp Ala Leu Met Thr Gly Phe Thr Gly Asp Phe 465 470 475 480 gac tct gtg ata gac tgc aac acg tgt gtc act cag aca gtc gat ttc 1488 Asp Ser Val Ile Asp Cys Asn Thr Cys Val Thr Gln Thr Val Asp Phe 485 490 495 agc ctt gac cct acc ttt acc att gag aca acc acg ctc ccc cag gat 1536 Ser Leu Asp Pro Thr Phe Thr Ile Glu Thr Thr Thr Leu Pro Gln Asp 500 505 510 gct gtc tcc agg act caa cgc gcg ggc agg act ggc agg ggg aag cca 1584 Ala Val Ser Arg Thr Gln Arg Ala Gly Arg Thr Gly Arg Gly Lys Pro 515 520 525 ggc atc tat aga ttt gtg gca ccg ggg gag cgc ccc tcc ggc atg ttc 1632 Gly Ile Tyr Arg Phe Val Ala Pro Gly Glu Arg Pro Ser Gly Met Phe 530 535 540 gac tcg tcc gtc ctc tgt gag tgc tat gac gcg ggc tgt gct tgg tat 1680 Asp Ser Ser Val Leu Cys Glu Cys Tyr Asp Ala Gly Cys Ala Trp 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atc ttc ccc cca aag ccc aag gat gtg ctc acc 4320 Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr 1425 1430 1435 1440 att act ctg act cct aag gtc acg tgt gtt gtg gta gac atc agc aag 4368 Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys 1445 1450 1455 gat gat ccc gag gtc cag ttc agc tgg ttt gta gat gat gtg gag gtg 4416 Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val 1460 1465 1470 cac aca gct cag acg caa ccc cgg gag gag cag ttc aac agc act ttc 4464 His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe 1475 1480 1485 cgc tca gtc agt gaa ctt ccc atc atg cac cag gac tgg ctc aat ggc 4512 Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 1490 1495 1500 aag gag ttc aaa tgc agg gtc aac agt gca gct ttc cct gcc ccc atc 4560 Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile 1505 1510 1515 1520 gag aaa acc atc tcc aaa acc aaa ggc aga ccg aag gct cca cag gtg 4608 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala 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Pro Ala Gly His Ala 195 200 205 gtg ggc cta ttc agg gcc gcg gtg tgc acc cgt gga gtg gct aaa gcg 672 Val Gly Leu Phe Arg Ala Ala Val Cys Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala 210 215 220 gtg gac ttt atc cct gtg gag aac cta ggg aca acc atg aga tcc ccg 720 Val Asp Phe Ile Pro Val Glu Asn Leu Gly Thr Thr Met Arg Ser Pro 225 230 235 240 gtg ttc acg gac aac tcc tct cca cca gca gtg ccc cag agc ttc cag 768 Val Phe Thr Asp Asn Ser Ser Pro Pro Ala Val Pro Gln Ser Phe Gln 245 250 255 gtg gcc cac ctg cat gct ccc acc ggc agc ggt aag agc acc aag gtc 816 Val Ala His Leu His Ala Pro Thr Gly Ser Gly Lys Ser Thr Lys Val 260 265 270 ccg gct gcg tac gca gcc cag ggc tac aag gtg ttg gtg ctc aac ccc 864 Pro Ala Ala Tyr Ala Ala Gln Gly Tyr Lys Val Leu Val Leu Asn Pro 275 280 285 tct gtt gct gca acg ctg ggc ttt ggt gct tac atg tcc aag gcc cat 912 Ser Val Ala Ala Thr Leu Gly Phe Gly Ala Tyr Met Ser Lys Ala His 290 295 300 ggg gtt gat cct aat atc agg acc ggg gtg aga aca att acc act ggc 960 Gly Val Asp Pro Asn Ile Arg Thr Gly Val Arg Thr Ile Thr Thr Gly 305 310 315 320 agc ccc atc acg tac tcc acc tac ggc aag ttc ctt gcc gac ggc ggg 1008 Ser Pro Ile Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly Lys Phe Leu Ala Asp Gly Gly 325 330 335 tgc tca gga ggt gct tat gac ata ata att tgt gac gag tgc cac tcc 1056 Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp Ile Ile Ile Cys Asp Glu Cys His Ser 340 345 350 acg gat gcc aca tcc atc ttg ggc atc ggc act gtc ctt gac caa gca 1104 Thr Asp Ala Thr Ser Ile Leu Gly Ile Gly Thr Val Leu Asp Gln Ala 355 360 365 gag act gcg ggg gcg aga ctg gtt gtg ctc gcc act gct acc cct ccg 1152 Glu Thr Ala Gly Ala Arg Leu Val Val Leu Ala Thr Ala Thr Pro Pro 370 375 380 ggc tcc gtc act gtg tcc cat cct aac atc gag gag gtt gct ctg tcc 1200 Gly Ser Val Thr Val Ser His Pro Asn Ile Glu Glu Val Ala Leu Ser 385 390 395 400 acc acc gga gag atc ccc ttt tac ggc aag gct atc ccc ctc gag gtg 1248 Thr Thr Gly Glu Ile Pro Phe Tyr Gly Lys Ala Ile Pro Leu Glu Val 405 410 415 atc aag ggg gga aga cat ctc atc ttc tgc cac tca aag aag aag tgc 1296 Ile Lys Gly Gly Arg His Leu Ile Phe Cys His Ser Lys Lys Lys Cys 420 425 430 gac gag ctc gcc gcg aag ctg gtc gca ttg ggc atc aat gcc gtg gcc 1344 Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Val Ala Leu Gly Ile Asn Ala Val Ala 435 440 445 tac tac cgc ggt ctt gac gtg tct gtc atc ccg acc agc ggc gat gtt 1392 Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val Ile Pro Thr Ser Gly Asp Val 450 455 460 gtc gtc gtg tcg acc gat gct ctc atg act ggc ttt acc ggc gac ttc 1440 Val Val Val Ser Thr Asp Ala Leu Met Thr Gly Phe Thr Gly Asp Phe 465 470 475 480 gac tct gtg ata gac tgc aac acg tgt gtc act cag aca gtc gat ttc 1488 Asp Ser Val Ile Asp Cys Asn Thr Cys Val Thr Gln Thr Val Asp Phe 485 490 495 agc ctt gac cct acc ttt acc att gag aca acc acg ctc ccc cag gat 1536 Ser Leu Asp Pro Thr Phe Thr Ile Glu Thr Thr Thr Leu Pro Gln Asp 500 505 510 gct gtc tcc agg act caa cgc gcg ggc agg act ggc agg ggg aag cca 1584 Ala Val Ser Arg Thr Gln Arg Ala Gly Arg Thr Gly Arg Gly Lys Pro 515 520 525 ggc atc tat aga ttt gtg gca ccg ggg gag cgc ccc tcc ggc 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acc ctc cat ggg cca aca ccc ctg 1968 Lys Cys Leu Ile Arg Leu Lys Pro Thr Leu His Gly Pro Thr Pro Leu 645 650 655 cta tac aga ctg ggc gct gtt cag aat gaa gtc acc ctg acg cac cca 2016 Leu Tyr Arg Leu Gly Ala Val Gln Asn Glu Val Thr Leu Thr His Pro 660 665 670 atc acc aaa tac atc atg aca tgc atg tcg gcc gga cta gtg tcc ggt 2064 Ile Thr Lys Tyr Ile Met Thr Cys Met Ser Ala Gly Leu Val Ser Gly 675 680 685 tcc tgg cta agg gac atc tgg gac tgg ata tgc gag gtg ctg agc gac 2112 Ser Trp Leu Arg Asp Ile Trp Asp Trp Ile Cys Glu Val Leu Ser Asp 690 695 700 ttt aag acc tgg ctg aaa gcc aag ctc atg cca caa ctg cct ggg att 2160 Phe Lys Thr Trp Leu Lys Ala Lys Leu Met Pro Gln Leu Pro Gly Ile 705 710 715 720 ccc ttt gtg tcc tgc cag cgc ggg tat agg ggg gtc tgg cga gga gac 2208 Pro Phe Val Ser Cys Gln Arg Gly Tyr Arg Gly Val Trp Arg Gly Asp 725 730 735 ggc att atg cac act cgc tgc cac tgt gga gct gag atc act gga cat 2256 Gly Ile Met His Thr Arg Cys His Cys Gly Ala Glu Ile Thr Gly His 740 745 750 gtc aaa aac ggg acg atg agg atc gtc ggt cct agg acc tgc agg aac 2304 Val Lys Asn Gly Thr Met Arg Ile Val Gly Pro Arg Thr Cys Arg Asn 755 760 765 atg tgg agt ggg acg ttc ccc att aac gcc tac acc acg ggc ccc tgt 2352 Met Trp Ser Gly Thr Phe Pro Ile Asn Ala Tyr Thr Thr Gly Pro Cys 770 775 780 act ccc ctt cct gcg ccg aac tat aag ttc gcg ctg tgg agg gtg tct 2400 Thr Pro Leu Pro Ala Pro Asn Tyr Lys Phe Ala Leu Trp Arg Val Ser 785 790 795 800 gca gag gaa tac gtg gag ata agg cgg gtg ggg gac ttc cac tac gta 2448 Ala Glu Glu Tyr Val Glu Ile Arg Arg Val Gly Asp Phe His Tyr Val 805 810 815 tcg ggt atg act act gac aat ctt aaa tgc ccg tgc cag atc cca tcg 2496 Ser Gly Met Thr Thr Asp Asn Leu Lys Cys Pro Cys Gln Ile Pro Ser 820 825 830 ccc gaa ttt ttc aca gaa ttg gac ggg gtg cgc cta cac agg ttt gcg 2544 Pro Glu Phe Phe Thr Glu Leu Asp Gly Val Arg Leu His Arg Phe Ala 835 840 845 ccc cct tgc aag ccc ttg ctg cgg gag gag gta tca ttc aga gta gga 2592 Pro Pro Cys Lys Pro Leu Leu Arg Glu Glu Val Ser Phe Arg Val Gly 850 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Thr Gly Asp Asn Thr Thr Thr Ser Ser Glu Pro Ala Pro Ser 1075 1080 1085 ggc tgc ccc ccc gac tcc gac gtt gag tcc tat tct tcc atg ccc ccc 3312 Gly Cys Pro Pro Asp Ser Asp Val Glu Ser Tyr Ser Ser Met Pro Pro 1090 1095 1100 ctg gag ggg gag cct ggg gat ccg gat ctc agc gac ggg tca tgg tcg 3360 Leu Glu Gly Glu Pro Gly Asp Pro Asp Leu Ser Asp Gly Ser Trp Ser 1105 1110 1115 1120 acg gtc agt agt ggg gcc gac acg gaa gat gtc gtg tgc tgc ggg cgg 3408 Thr Val Ser Ser Gly Ala Asp Thr Glu Asp Val Val Cys Cys Gly Arg 1125 1130 1135 ccg caa ggc ggc gga tcc gtg gac aag aaa att gtg ccc agg gat tgt 3456 Pro Gln Gly Gly Gly Ser Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys 1140 1145 1150 ggt tgt aag cct tgc ata tgt aca gtc cca gaa gta tca tct gtc ttc 3504 Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe 1155 1160 1165 atc ttc ccc cca aag ccc aag gat gtg ctc acc att act ctg act cct 3552 Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro 1170 1175 1180 aag gtc acg tgt gtt gtg gta gac atc agc aag gat gat ccc gag gtc 3600 Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val 1185 1190 1195 1200 cag ttc agc tgg ttt gta gat gat gtg gag gtg cac aca gct cag acg 3648 Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr 1205 1210 1215 caa ccc cgg gag gag cag ttc aac agc act ttc cgc tca gtc agt gaa 3696 Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu 1220 1225 1230 ctt ccc atc atg cac cag gac tgg ctc aat ggc aag gag ttc aaa tgc 3744 Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys 1235 1240 1245 agg gtc aac agt gca gct ttc cct gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc 3792 Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 1250 1255 1260 aaa acc aaa ggc aga ccg aag gct cca cag gtg tac acc att cca cct 3840 Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro 1265 1270 1275 1280 ccc aag gag cag atg gcc aag gat aaa gtc agt ctg acc tgc atg ata 3888 Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile 1285 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gat tac gat atc cca acg 48 Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr 1 5 10 15 acc gaa aac ctg tat ttt cag ggc gcc atg gat ccg gaa ttc atg agc 96 Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Met Asp Pro Glu Phe Met Ser 20 25 30 acg aat cct aaa cct caa aga aaa acc aaa cgt aac acc aac cgt cgc 144 Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn Arg Arg 35 40 45 cca cag gac gtc aag ttc ccg ggt ggc ggt cag atc gtt ggt gga gtt 192 Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly Gly Val 50 55 60 tac ttg ttg ccg cgc agg ggc cct aga ttg ggt gtg cgc gcg acg agg 240 Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala Thr Arg 65 70 75 80 aag act tcc gag cgg tcg caa cct cga ggt aga cgt cag cct atc ccc 288 Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro Ile Pro 85 90 95 aag gca cgt cgg ccc gag ggc agg acc tgg gct cag ccc ggg tac cct 336 Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Thr Trp Ala Gln Pro Gly Tyr Pro 100 105 110 tgg ccc ctc tat ggc aat gag ggt tgc ggg tgg gcg 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tgt aca gtc cca gaa gta tca 720 Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser 225 230 235 240 tct gtc ttc atc ttc ccc cca aag ccc aag gat gtg ctc acc att act 768 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr 245 250 255 ctg act cct aag gtc acg tgt gtt gtg gta gac atc agc aag gat gat 816 Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp 260 265 270 ccc gag gtc cag ttc agc tgg ttt gta gat gat gtg gag gtg cac aca 864 Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr 275 280 285 gct cag acg caa ccc cgg gag gag cag ttc aac agc act ttc cgc tca 912 Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser 290 295 300 gtc agt gaa ctt ccc atc atg cac cag gac tgg ctc aat ggc aag gag 960 Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 ttc aaa tgc agg gtc aac agt gca gct ttc cct gcc ccc atc gag aaa 1008 Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 acc atc tcc aaa acc 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aac tgg gcg 624 Gly Val Leu Ala Gly Ile Ala Tyr Phe Ser Met Val Gly Asn Trp Ala 195 200 205 aag gtc ctg gta gtg ctg ctg cta ttt gcc ggc gtc gac gcg gaa gga 672 Lys Val Leu Val Val Leu Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Ala Glu Gly 210 215 220 cta gtg cgg ccg caa ggc ggc gga tcc gtg gac aag aaa att gtg ccc 720 Leu Val Arg Pro Gln Gly Gly Gly Ser Val Asp Lys Lys Ile Val Pro 225 230 235 240 agg gat tgt ggt tgt aag cct tgc ata tgt aca gtc cca gaa gta tca 768 Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser 245 250 255 tct gtc ttc atc ttc ccc cca aag ccc aag gat gtg ctc acc att act 816 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr 260 265 270 ctg act cct aag gtc acg tgt gtt gtg gta gac atc agc aag gat gat 864 Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp 275 280 285 ccc gag gtc cag ttc agc tgg ttt gta gat gat gtg gag gtg cac aca 912 Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr 290 295 300 gct cag acg caa ccc cgg gag gag cag ttc aac agc act ttc cgc tca 960 Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser 305 310 315 320 gtc agt gaa ctt ccc atc atg cac cag gac tgg ctc aat ggc aag gag 1008 Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 325 330 335 ttc aaa tgc agg gtc aac agt gca gct ttc cct gcc ccc atc gag aaa 1056 Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys 340 345 350 acc atc tcc aaa acc aaa ggc aga ccg aag gct cca cag gtg tac acc 1104 Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr 355 360 365 att cca cct ccc aag gag cag atg gcc aag gat aaa gtc agt ctg acc 1152 Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr 370 375 380 tgc atg ata aca gac ttc ttc cct gaa gac att act gtg gag tgg cag 1200 Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln 385 390 395 400 tgg aat ggg cag cca gcg gag aac tac aag aac act cag ccc atc atg 1248 Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met 405 410 415 gac aca gat ggc tct tac ttc gtc tac agc aag ctc aat gtg cag aag 1296 Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys 420 425 430 agc aac tgg gag gca gga aat act ttc acc tgc tct gtg tta cat gag 1344 Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu 435 440 445 ggc ctg cac aac cac cat act gag aag agc ctc tcc cac tct cct ggg 1392 Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly 450 455 460 ctg caa agc ttg tcg aga agt act aga gga tca taa 1428 Leu Gln Ser Leu Ser Arg Ser Thr Arg Gly Ser 465 470 475 <210> 50 <211> 1938 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <221> CDS <222> (1)...(1935) <400> 50 atg tcg tac tac cat cac cat cac cat cac gat tac gat atc cca acg 48 Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr 1 5 10 15 acc gaa aac ctg tat ttt cag ggc gcc atg gat ccg gaa ttc acc cac 96 Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Met Asp Pro Glu Phe Thr His 20 25 30 gtc acc ggg gga aat gcc ggc cgc acc acg gct ggg ctt gtt ggt ctc 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480 Ala Lys Ser Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro Ser Pro Val 145 150 155 160 gtg gtg gga acg acc gac agg tcg ggc gcg cct acc tac agc tgg ggt 528 Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Ser Gly Ala Pro Thr Tyr Ser Trp Gly 165 170 175 gca aat gat acg gat gtc ttc gtc ctt aac aac acc agg cca ccg ctg 576 Ala Asn Asp Thr Asp Val Phe Val Leu Asn Asn Thr Arg Pro Pro Leu 180 185 190 ggc aat tgg ttc ggt tgt acc tgg atg aac tca act gga ttc acc aaa 624 Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn Ser Thr Gly Phe Thr Lys 195 200 205 gtg tgc gga gcg ccc cct tgt gtc atc gga ggg gtg ggc aac aac acc 672 Val Cys Gly Ala Pro Pro Cys Val Ile Gly Gly Val Gly Asn Asn Thr 210 215 220 ttg ctc tgc ccc act gat tgc ttc cgc aaa cat ccg gaa gcc aca tac 720 Leu Leu Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys His Pro Glu Ala Thr Tyr 225 230 235 240 tct cgg tgc ggc tcc ggt ccc tgg att aca ccc agg tgc atg gtc gac 768 Ser Arg Cys Gly Ser Gly Pro Trp Ile Thr Pro Arg Cys Met Val Asp 245 250 255 tac ccg tat agg ctt tgg cac tat cct tgt acc atc aat tac acc ata 816 Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys Thr Ile Asn Tyr Thr Ile 260 265 270 ttc aaa gtc agg atg tac gtg gga ggg gtc gag cac agg ctg gaa gcg 864 Phe Lys Val Arg Met Tyr Val Gly Gly Val Glu His Arg Leu Glu Ala 275 280 285 gcc tgc aac tgg acg cgg ggc gaa cgc tgt gat ctg gaa gac agg gac 912 Ala Cys Asn Trp Thr Arg Gly Glu Arg Cys Asp Leu Glu Asp Arg Asp 290 295 300 agg tcc gag ctc agc ccg ttg ctg ctg tcc acc aca cag tgg cag gtc 960 Arg Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu Ser Thr Thr Gln Trp Gln Val 305 310 315 320 ctt ccg tgt tct ttc acg acc ctg cca gcc ttg tcc acc ggc ctc atc 1008 Leu Pro Cys Ser Phe Thr Thr Leu Pro Ala Leu Ser Thr Gly Leu Ile 325 330 335 cac ctc cac cag aac att gtg gac gtg cag tac ttg tac ggg gta ggg 1056 His Leu His Gln Asn Ile Val Asp Val Gln Tyr Leu Tyr Gly Val Gly 340 345 350 tca agc atc gcg tcc tgg gcc att aag tgg gag tac gtc gtt ctc ctg 1104 Ser Ser Ile Ala Ser Trp Ala Ile Lys Trp Glu Tyr Val Val Leu Leu 355 360 365 ttc ctt ctg ctt gca gac gcg cgc 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cag ttc aac agc act ttc cgc tca gtc agt gaa ctt ccc atc 1488 Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile 485 490 495 atg cac cag gac tgg ctc aat ggc aag gag ttc aaa tgc agg gtc aac 1536 Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn 500 505 510 agt gca gct ttc cct gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa acc aaa 1584 Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys 515 520 525 ggc aga ccg aag gct cca cag gtg tac acc att cca cct ccc aag gag 1632 Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu 530 535 540 cag atg gcc aag gat aaa gtc agt ctg acc tgc atg ata aca gac ttc 1680 Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe 545 550 555 560 ttc cct gaa gac att act gtg gag tgg cag tgg aat ggg cag cca gcg 1728 Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala 565 570 575 gag aac tac aag aac act cag ccc atc atg gac aca gat ggc tct tac 1776 Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr 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Gly His Ile Thr Gly His Arg Met Ala Trp Asp 145 150 155 160 atg atg atg aac tgg tcc cct acg gca gcg ttg gtg gta gct cag ctg 528 Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Ala Ala Leu Val Val Ala Gln Leu 165 170 175 ctc cgg atc cca caa gcc atc atg gac atg atc gct ggt gct cac tgg 576 Leu Arg Ile Pro Gln Ala Ile Met Asp Met Ile Ala Gly Ala His Trp 180 185 190 gga gtc ctg gcg ggc ata gcg tat ttc tcc atg gtg ggg aac tgg gcg 624 Gly Val Leu Ala Gly Ile Ala Tyr Phe Ser Met Val Gly Asn Trp Ala 195 200 205 aag gtc ctg gta gtg ctg ctg cta ttt gcc ggc gtc gac gcg gaa acc 672 Lys Val Leu Val Val Leu Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Ala Glu Thr 210 215 220 cac gtc acc ggg gga aat gcc ggc cgc acc acg gct ggg ctt gtt ggt 720 His Val Thr Gly Gly Asn Ala Gly Arg Thr Thr Ala Gly Leu Val Gly 225 230 235 240 ctc ctt aca cca ggc gcc aag cag aac atc caa ctg atc aac acc aac 768 Leu Leu Thr Pro Gly Ala Lys Gln Asn Ile Gln Leu Ile Asn Thr Asn 245 250 255 ggc agt tgg cac atc aat agc acg gcc ttg aat tgc aat gaa agc ctt 816 Gly 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tcc gtg gac aag aaa att gtg ccc agg gat tgt ggt tgt 1824 Gly Gly Gly Ser Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys 595 600 605 aag cct tgc ata tgt aca gtc cca gaa gta tca tct gtc ttc atc ttc 1872 Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe 610 615 620 ccc cca aag ccc aag gat gtg ctc acc att act ctg act cct aag gtc 1920 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val 625 630 635 640 acg tgt gtt gtg gta gac atc agc aag gat gat ccc gag gtc cag ttc 1968 Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe 645 650 655 agc tgg ttt gta gat gat gtg gag gtg cac aca gct cag acg caa ccc 2016 Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro 660 665 670 cgg gag gag cag ttc aac agc act ttc cgc tca gtc agt gaa ctt ccc 2064 Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro 675 680 685 atc atg cac cag gac tgg ctc aat ggc aag gag ttc aaa tgc agg gtc 2112 Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val 690 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Ala Lys Gln Asn Ile Gln Leu Ile Asn Thr Asn Gly 50 55 60 Ser Trp His Ile Asn Ser Thr Ala Leu Asn Cys Asn Glu Ser Leu Asn 65 70 75 80 Thr Gly Trp Leu Ala Gly Leu Phe Tyr Gln His Lys Phe Asn Ser Ser 85 90 95 Gly Cys Pro Glu Arg Leu Ala Ser Cys Arg Arg Leu Thr Asp Phe Ala 100 105 110 Gln Gly Trp Gly Pro Ile Ser Tyr Ala Asn Gly Ser Gly Leu Asp Glu 115 120 125 Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Pro Pro Arg Pro Cys Gly Ile Val Pro 130 135 140 Ala Lys Ser Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro Ser Pro Val 145 150 155 160 Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Ser Gly Ala Pro Thr Tyr Ser Trp Gly 165 170 175 Ala Asn Asp Thr Asp Val Phe Val Leu Asn Asn Thr Arg Pro Pro Leu 180 185 190 Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn Ser Thr Gly Phe Thr Lys 195 200 205 Val Cys Gly Ala Pro Pro Cys Val Ile Gly Gly Val Gly Asn Asn Thr 210 215 220 Leu Leu Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys His Pro Glu Ala Thr Tyr 225 230 235 240 Ser Arg Cys Gly Ser Gly Pro Trp Ile Thr Pro Arg Cys Met Val Asp 245 250 255 Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys Thr Ile Asn Tyr Thr Ile 260 265 270 Phe Lys Val Arg Met Tyr Val Gly Gly Val Glu His Arg Leu Glu Ala 275 280 285 Ala Cys Asn Trp Thr Arg Gly Glu Arg Cys Asp Leu Glu Asp Arg Asp 290 295 300 Arg Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu Ser Thr Thr Gln Trp Gln Val 305 310 315 320 Leu Pro Cys Ser Phe Thr Thr Leu Pro Ala Leu Ser Thr Gly Leu Ile 325 330 335 His Leu His Gln Asn Ile Val Asp Val Gln Tyr Leu Tyr Gly Val Gly 340 345 350 Ser Ser Ile Ala Ser Trp Ala Ile Lys Trp Glu Tyr Val Val Leu Leu 355 360 365 Phe Leu Leu Leu Ala Asp Ala Arg Val Cys Ser Cys Leu Trp Met Met 370 375 380 Leu Leu Ile Ser Gln Ala Glu Ala Ala Gly Leu Val Arg Pro Gln Gly 385 390 395 400 Gly Gly Ser Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys 405 410 415 Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro 420 425 430 Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr 435 440 445 Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser 450 455 460 Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg 465 470 475 480 Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile 485 490 495 Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn 500 505 510 Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys 515 520 525 Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu 530 535 540 Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe 545 550 555 560 Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala 565 570 575 Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr 580 585 590 Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly 595 600 605 Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His 610 615 620 Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Leu Gln Ser Leu Ser Arg 625 630 635 640 Ser Thr Arg Gly Ser 645 <210> 62 <211> 838 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 62 Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr 1 5 10 15 Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Met Asp Pro Glu Phe Tyr Gln 20 25 30 Val Arg Asn Ser Ser Gly Leu Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Pro Asn 35 40 45 Ser Ser Ile Val Tyr Glu Ala Ala Asp Ala Ile Leu His Thr Pro Gly 50 55 60 Cys Val Pro Cys Val Arg Glu Gly Asn Ala Ser Arg Cys Trp Val Ala 65 70 75 80 Val Thr Pro Thr Val Ala Thr Arg Asp Gly Lys Leu Pro Thr Thr Gln 85 90 95 Leu Arg Arg His Ile Asp Leu Leu Val Gly Ser Ala Thr Leu Cys Ser 100 105 110 Ala Leu Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe Leu Val Gly Gln 115 120 125 Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Arg His Trp Thr Thr Gln Asp Cys Asn 130 135 140 Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His Ile Thr Gly His Arg Met Ala Trp Asp 145 150 155 160 Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Ala Ala Leu Val Val Ala Gln Leu 165 170 175 Leu Arg Ile Pro Gln Ala Ile Met Asp Met Ile Ala Gly Ala His Trp 180 185 190 Gly Val Leu Ala Gly Ile Ala Tyr Phe Ser Met Val Gly Asn Trp Ala 195 200 205 Lys Val Leu Val Val Leu Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Ala Glu Thr 210 215 220 His Val Thr Gly Gly Asn Ala Gly Arg Thr Thr Ala Gly Leu Val Gly 225 230 235 240 Leu Leu Thr Pro Gly Ala Lys Gln Asn Ile Gln Leu Ile Asn Thr Asn 245 250 255 Gly Ser Trp His Ile Asn Ser Thr Ala Leu Asn Cys Asn Glu Ser Leu 260 265 270 Asn Thr Gly Trp Leu Ala Gly Leu Phe Tyr Gln His Lys Phe Asn Ser 275 280 285 Ser Gly Cys Pro Glu Arg Leu Ala Ser Cys Arg Arg Leu Thr Asp Phe 290 295 300 Ala Gln Gly Trp Gly Pro Ile Ser Tyr Ala Asn Gly Ser Gly Leu Asp 305 310 315 320 Glu Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Pro Pro Arg Pro Cys Gly Ile Val 325 330 335 Pro Ala Lys Ser Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro Ser Pro 340 345 350 Val Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Ser Gly Ala Pro Thr Tyr Ser Trp 355 360 365 Gly Ala Asn Asp Thr Asp Val Phe Val Leu Asn Asn Thr Arg Pro Pro 370 375 380 Leu Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn Ser Thr Gly Phe Thr 385 390 395 400 Lys Val Cys Gly Ala Pro Pro Cys Val Ile Gly Gly Val Gly Asn Asn 405 410 415 Thr Leu Leu Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys His Pro Glu Ala Thr 420 425 430 Tyr Ser Arg Cys Gly Ser Gly Pro Trp Ile Thr Pro Arg Cys Met Val 435 440 445 Asp Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys Thr Ile Asn Tyr Thr 450 455 460 Ile Phe Lys Val Arg Met Tyr Val Gly Gly Val Glu His Arg Leu Glu 465 470 475 480 Ala Ala Cys Asn Trp Thr Arg Gly Glu Arg Cys Asp Leu Glu Asp Arg 485 490 495 Asp Arg Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu Ser Thr Thr Gln Trp Gln 500 505 510 Val Leu Pro Cys Ser Phe Thr Thr Leu Pro Ala Leu Ser Thr Gly Leu 515 520 525 Ile His Leu His Gln Asn Ile Val Asp Val Gln Tyr Leu Tyr Gly Val 530 535 540 Gly Ser Ser Ile Ala Ser Trp Ala Ile Lys Trp Glu Tyr Val Val Leu 545 550 555 560 Leu Phe Leu Leu Leu Ala Asp Ala Arg Val Cys Ser Cys Leu Trp Met 565 570 575 Met Leu Leu Ile Ser Gln Ala Glu Ala Ala Gly Leu Val Arg Pro Gln 580 585 590 Gly Gly Gly Ser Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys 595 600 605 Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe 610 615 620 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val 625 630 635 640 Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe 645 650 655 Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro 660 665 670 Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro 675 680 685 Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val 690 695 700 Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr 705 710 715 720 Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys 725 730 735 Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp 740 745 750 Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro 755 760 765 Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser 770 775 780 Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala 785 790 795 800 Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His 805 810 815 His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Leu Gln Ser Leu Ser 820 825 830 Arg Ser Thr Arg Gly Ser 835

Claims (49)

  1. 면역 반응 도메인 및 표적 결합성 도메인을 포함하며, 여기서 면역 반응 도메인은 C형 간염 (HCV) 항원을 포함하고 표적 결합성 도메인은 항체 단편을 포함하는 것인, 면역 반응을 유도시키기 위한 키메라 항원.
  2. 제1항에 있어서, 항체 단편이 이종형 (xenotypic) 항체 단편인 키메라 항원.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 체액성 면역 반응, 세포성 면역 반응, 또는 체액성 면역 반응과 세포성 면역 반응 둘 다를 유도시키는 키메라 항원.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, Th1 면역 반응, Th2 면역 반응, 또는 Th1 면역 반응과 Th2 면역 반응 둘 다를 유도시키는 키메라 항원.
  5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 면역 반응이 생체내 면역 반응인 키메라 항원.
  6. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 면역 반응 도메인이 하나 이상의 단백질을 포함하는 것인 키메라 항원.
  7. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 면역 반응 도메인이 HCV 코어 (1-191) 단백질, HCV 코어 (1-177) 단백질, HCV p7 단백질, HCV E1 단백질, HCV E2 단백질, HCV E1-E2 단백질, HCV NS3 단백질, HCV NS4B 단백질, 및 HCV NS5A 단백질로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 단백질의 하나 이상의 면역원성 부분을 포함하는 것인 키메라 항원.
  8. 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 표적 결합성 도메인이 항원 제시 세포 (APC)와 결합할 수 있는 것인 키메라 항원.
  9. 제2항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 항체 단편이 Fc 단편인 키메라 항원.
  10. 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 6xHis 태그, 프로테아제 절단 부위, 및 면역 반응 도메인과 표적 결합성 도메인을 연결하기 위한 링커 중의 하나 이상을 추가로 포함하는 키메라 항원.
  11. 제10항에 있어서, 링커가 루이신 지퍼, 아비딘과 결합된 바이오틴, 및 공유 펩티드 연쇄로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 키메라 항원.
  12. 제1항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, 당화된 키메라 항원.
  13. 제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, 만노스 당화된 키메라 항원.
  14. 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, 항체 단편이 면역글로불린 중쇄 단편을 포함하는 것인 키메라 항원.
  15. 제14항에 있어서, 면역글로불린 중쇄 단편이 힌지 (hinge) 영역을 포함하는 것인 키메라 항원.
  16. 제14항에 있어서, 면역글로불린 중쇄 단편이 CH1, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인으로 이루어진 군 중에서 선택된 항체 단편의 전부 또는 일부를 포함하는 것인 키메라 항원.
  17. 항원 제시 세포에 제1항 내지 제16항 중의 어느 한 항의 키메라 항원을 투여하는 것을 포함하는, 항원을 상기 항원 제시 세포에 전달하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 항원 제시 세포가 수지상 세포인 방법.
  19. 항원 제시 세포를 제1항 내지 제16항 중의 어느 한 항의 키메라 항원과 접촉 시키는 것을 포함하는, 항원 제시 세포를 활성화시키는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 접촉이 생체 외에서 일어나는 방법.
  21. 제19항에 있어서, 접촉이 생체 내에서 일어나는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 접촉이 인간에게서 일어나는 방법.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 특정 대상체에게 제1항의 키메라 항원을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 항원 제시 세포가 상기 대상체 내에 존재하는 것인 방법.
  24. 제20항 내지 제23항 중의 어느 한 항에 있어서, 접촉으로 인해, 체액성 면역 반응, 세포성 면역 반응, 또는 체액성 면역 반응과 세포성 면역 반응 둘 다가 발생하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 세포성 면역 반응이 Th1 반응, Th2 반응 및 CTL 반응 중의 하나 이상인 방법.
  26. 제23항 내지 제25항 중의 어느 한 항에 있어서, 대상체에게서 면역-치료 가 능한 질환이 발생하였거나, 또는 발생할 것으로 예상되는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 면역-치료 가능한 질환이 급성 감염증인 방법.
  28. 제26항에 있어서, 면역-치료 가능한 질환이 만성 감염증인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 만성 감염증이 만성 C형 간염 바이러스성 감염증인 방법.
  30. 제26항 내지 제29항 중의 어느 한 항에 있어서, 면역-치료 가능한 질환이 C형 간염 바이러스성 감염증이고, 면역 반응 도메인이 HCV 코어 (1-191) 단백질, HCV 코어 (1-177) 단백질, HCV E1 단백질, HCV E2 단백질, HCV E1-E2 단백질, HCV P7 단백질, HCV NS3 단백질, HCV NS4B 단백질, 및 HCV NS5A 단백질로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 단백질의 하나 이상의 면역원성 부분을 포함하는 것인 방법.
  31. 제23항 내지 제30항 중의 어느 한 항에 있어서, 대상체가 바이러스성 감염증에 대항하여 백신 접종된 것인 방법.
  32. 제23항 내지 제31항 중의 어느 한 항에 있어서, 대상체가 바이러스성 감염증에 대항하여 예방적으로 백신 접종된 것인 방법.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 대상체가 기존의 바이러스성 감염증에 대항하여 치료적으로 백신 접종된 것인 방법.
  34. (a) 키메라 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물 또는 세포를 제공하는 단계; 및
    (b) 이러한 미생물 또는 세포를, 키메라 항원이 발현되도록 하는 조건 하에 배양하는 단계
    를 포함하는, 키메라 항원의 생성 방법.
  35. 제34항에 있어서, 미생물 또는 세포가 진핵 미생물 또는 세포인 방법.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 세포가 효모 세포, 식물 세포 또는 곤충 세포인 방법.
  37. 제34항 내지 제36항 중의 어느 한 항에 있어서, 키메라 항원이 당화를 포함하도록 해독 후 변형된 것인 방법.
  38. 제34항 내지 제37항 중의 어느 한 항에 있어서, 키메라 항원이 만노스 당화를 포함하도록 해독 후 변형된 것인 방법.
  39. 면역 반응 도메인을 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드 부분 및
    항체 단편을 포함하는 표적 결합성 도메인을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드 부분
    을 포함하는, 키메라 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  40. 제39항에 있어서, 항체 단편이 이종형 항체 단편인 폴리뉴클레오티드.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 서열 39 및 41 내지 51에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 이루어진 군 중에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  42. 제39항 내지 제41항 중의 어느 한 항에 있어서, 서열 40 및 52 내지 62에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 군 중에서 선택된 전체 아미노산 서열과 90% 이상 동일한 키메라 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  43. 제39항 내지 제42항 중의 어느 한 항에 있어서, 서열 39 및 41 내지 51에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 이루어진 군 중에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건 하에 선택적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오티드.
  44. 제39항 내지 제43항 중의 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  45. 제44항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 전사 조절성 요소 (TRE)와 작동적으로 연결되는 것인 벡터.
  46. 제39항 내지 제43항 중의 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물 또는 세포.
  47. 제1항 내지 제16항 중의 어느 한 항의 키메라 항원과, 이를 필요로 하는 대상체에게 상기 키메라 항원을 투여하는 것에 관한 지시 사항을 포함하는 제조품.
  48. 제1항 내지 제16항 중의 어느 한 항의 키메라 항원과 제약상 허용 가능한 부형제를 포함하는 제약 조성물.
  49. (a) 링커 분자와 결합된 표적 결합성 도메인을 포함하는 표적-결합성 도메인-링커 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물 또는 세포를 제공하는 단계;
    (b) 상기 미생물 또는 세포를, 표적 결합성 도메인-링커 분자가 발현되도록 하는 조건 하에 배양하는 단계; 및
    (c) 링커가 면역 반응 도메인과 결합하여 이러한 결합으로 인해 키메라 항원 이 생성되도록 하는 조건 하에, 표적 결합성 도메인-링커 분자와 면역 반응 도메인을 접촉시키는 단계
    를 포함하는, 키메라 항원의 생성 방법.
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