KR101225564B1 - 개 ＩｇＧ의 ＦＣ 도메인의 세포 표면 발현용 벡터, 상기 벡터에 의해 형질전환된 숙주세포 및 상기 숙주세포를 이용한 개 질병 관련 바이러스에 대한 백신의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 개 면역글로불린 지(Immunoglobulin G; 이하 “IgG"라 한다)의 에프씨(Crystallized Fragment 이하 ”Fc“라 한다) 도메인의 세포 표면 발현용 벡터, 상기 벡터에 의해 형질전환된 숙주세포 및 상기 숙주세포를 이용한 개 질병 관련 바이러스에 대한 백신의 제조방법에 관한 것이다.

Description

개 ＩｇＧ의 ＦＣ 도메인의 세포 표면 발현용 벡터, 상기 벡터에 의해 형질전환된 숙주세포 및 상기 숙주세포를 이용한 개 질병 관련 바이러스에 대한 백신의 제조방법{A VECTOR FOR EXPRESSING Fc DOMAIN OF CANINE IgG ON THE CELL SURFACE, A HOST CELL TRANSFORMED WITH SAID VECTOR AND A METHOD FOR MANUFATURING VACCINE AGAINST CANINE DISEASES USING SAID HOST CELL}

본 발명은 개 면역글로불린 지(Immunoglobulin G; 이하 "IgG"라 한다)의 결정화 단편, 즉 에프씨(Crystallized Fragment 이하 "Fc"라 한다) 도메인의 세포 표면 발현용 벡터, 상기 벡터에 의해 형질전환된 숙주세포 및 상기 숙주세포를 이용한 개 질병 관련 바이러스에 대한 백신의 제조방법에 관한 것이다.

보다 구체적으로 본 발명은 개 IgG의 Fc 도메인을 코딩하는 유전자를 벡터에 삽입함으로써, 이를 세포 표면에 발현되도록 제조한 벡터, 상기 벡터로 형질전환되어 개 IgG의 Fc 도메인을 세포 표면에 발현하는 숙주세포 및 상기 숙주세포에 개 질병 관련 바이러스를 감염시켜 증식된 바이러스를 이용한 개 질병 관련 바이러스에 대한 백신의 제조방법에 관한 것이다.

IgG 는 면역 글로블린 중에서 체내에서 가장 많은 양이 생산되며 그 만큼 다양한 분야에서 중요한 역할을 하고 있다. 주로 감염면역에 관련을 하고 있으며, 중요한 역할은 체내에 침입한 세균이나 바이러스 또는 독소와 특이적으로 결합하여, 그들의 활성을 막는다. 이러한 IgG가 항원과 결합하는 기능을 옵소나이제이션(opsonization)이라 하며, 항체의존 세포매개 세포독성 (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity; ADCC, 도 1 참조) 기전에 따라 대식 세포(macrophage)와 같은 면역세포에 의해 항원이 되는 이물질을 숙주로부터 제거하는데 도움을 준다. IgG는 중쇄와 경쇄로 이루어지며, Y자 형태를 이루고, 파파인(papain)에 의해 Fab (Fragment, antigen binding) 와 Fc (Fragment, crystallizable) 부위로 각각 나누어 진다. 이들 Fab와 Fc 부위는 각각 그 기능에서 큰 차이를 보이는데, Fab는 외부 항원을 인식하는 부위이고, Fc는 Fc 수용체가 있는 세포에 결합하는 리간드가 되어 면역세포의 활성을 촉진하고 면역 반응을 일으키는 역할을 하는 부위이다(도 2).

특히 Fc 수용체가 발현되는 세포로는 단핵구/마크로파지 계열과 수지상세포(dendritic cell)와 같은 항원 제시 세포(antigen presenting cell; APC)가 알려져 있다. 일단 옵소나이제이션된 IgG이 Fc 부위를 통해 APC의 Fc 수용체에 결합을 하면, 외부 항원이 쉽게 APC에 흡수(uptake)되고, 항원제시되어 면역의 활성화를 야기시킨다(Zheng 등, 2001; You 등, 2001). Stabila 등, 1998의 논문에 의하면, 세포 표면에 발현한 인간 IgG Fc 부위가 면역세포 표면에 발현한 Fc 수용체와 결합하고 자극하여, 면역세포를 활성화시키는 것으로 나타났다. 또한 마우스 IgG의 Fc 부위를 발현시킨 세포주(cell line)에서 바이러스를 배양하여, 바이러스가 발아(budding)되어 나올때, 세포 표면의 Fc 부분을 바이러스 외피(envelope)와 함께 싸고 나옴으로써 Fc를 포함하고 있는 바이러스를 제조하였다. 이렇게 얻어진 Fc를 포함하는 바이러스는 Fc를 포함하지 않는 바이러스에 비해 면역원성이 높게 나타나는 것으로 보고된 바 있다(Takashima 등, 2005). 한편, 상기 Takashima의 경우 돼지를 타겟으로 하는 바이러스를 배양했음에도 마우스 IgG의 Fc 도메인을 사용하였다.

동물용 백신 수요는 돼지, 소, 닭에서 주로 이루어지고 있고, 개에서는 소비규모가 적어, 현재까지 개의 IgG Fc 도메인에 대한 발현 연구는 보고된 바 없다. 그러나, 최근 애완동물로서 개의 사육이 증대되고, 이에 따라 광견병 등 개의 질병에 대한 관심도 높아지고 있으며, 일반적으로 사용하는 광견병 백신이 효과적인 측면에서의 보완도 요구되고 있다.

이에 따라, 본 발명의 발명자들은 개의 IgG Fc 도메인을 발현하는 세포주를 제조하여, 공수병 바이러스를 배양함으로써 그 바이러스가 Fc를 포함하게 제작한 후, 현재 사용중인 공수병 바이러스 백신의 효과를 증가시키는 새로운 기술의 백신을 제공하고자 한다.

따라서, 본 발명의 목적은 개 IgG의 Fc 도메인의 세포 표면 발현용 벡터를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 벡터에 의해 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 숙주세포를 이용한 개 질병 관련 바이러스에 대한 백신의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 개 IgG의 Fc 도메인을 코딩하는 유전자를 포함하는 개 IgG Fc 도메인의 세포 표면 발현용 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 벡터에 의해 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 숙주세포에 개 질병 관련 바이러스를 감염시켜 증식시키는 단계 및 상기 단계에서 증식된 바이러스를 이용하여 생독 백신 또는 불활성화 백신을 제조하는 단계를 포함하는 개 질병 관련 바이러스에 대한 백신의 제조방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은 개 IgG의 Fc 도메인이 세포 표면에 발현되도록 하기 위해, 개 IgG의 Fc 도메인을 코딩하는 유전자와 마우스 IgG 단백질의 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain: 이하 "TM"이라 함)인 mRANKL 도메인을 코딩하는 유전자를 결합하고, 이를 벡터에 삽입함으로써, 개 IgG Fc 단백질이 세포 표면에 좀더 효율적이고 안정적으로 발현되도록 하였다.

구체적으로, 개(Canine)-Fc 코딩 유전자 및 mRANKL 코딩 유전자를 클로닝하기 위하여 PCR 과정을 통하여 유전자를 증폭하였고, EcoR1 자리를 이용하여 서로 연결하였다. 이를 벡터에 삽입함으로써, 재조합 단백질의 N-말단에 위치하는 마우스 IgG의 TM 도메인이 세포막에 고정되고, 재조합 단백질의 C-말단에 위치하는 개 IgG-Fc 도메인이 세포 표면에 발현되도록 하였다.

또한, 본 발명의 벡터는 형질전환체의 선발을 위해 항생제 저항성 유전자가 포함되도록 하였다.

따라서, 본 발명에 따른 벡터는 개 IgG Fc 도메인을 코딩하는 유전자 및 마우스 IgG의 TM 도메인을 코딩하는 유전자를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 따른 벡터는 상기 개 IgG의 Fc 도메인을 코딩하는 유전자 및 마우스 IgG의 TM 도메인을 코딩하는 유전자 이외에 복제원점, 프로모터, 형광 단백질 유전자 및 항생제 저항성 유전자 등을 추가로 포함할 수 있으며, 이와 같이 구성된 벡터로 형질전환된 숙주세포는 개 IgG Fc 도메인을 세포 표면에 발현하게 된다.

상기 개 IgG의 Fc 도메인을 코딩하는 유전자는 서열번호 1로 표시되는 것을 특징으로 하며, 상기 마우스 IgG의 TM 도메인(mRANKL)을 코딩하는 유전자는 서열번호 2로 표시되는 것을 특징으로 한다.

특히, 본 발명의 벡터는 형질전환체의 선발마커로서 항생제 저항성 유전자를 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 항생제 저항성 유전자로는 제네티신 (G418), 네오마이신, 하이그로마이신, 제오신 및 푸로마이신 저항성 유전자 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는 네오마이신 저항성 유전자를 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 벡터는 복제가 개시되는 특정 핵산 서열인 복제원점 (replication origin)을 포함할 수 있다. 바람직한 복제원점으로는 진핵세포 또는 원핵세포 복제원점일 수 있으며, 예를 들면, SV40(Simian virus 40), EBV(Epstein Barr virus), pUC 복제원점 등을 포함할 수 있다.

나아가, 본 발명의 벡터는 목적 유전자의 전사개시활성을 가지는 프로모터를 포함할 수 있다. 상기 프로모터는 RNA 중합효소에 대한 결합 부위를 포함하고, 암호화 영역의 상류에 위치해 있을 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 프로모터로는 CMV(Cytomegalovirus), SV40(Simian virus 40), TK(Thymidine kinase), EF-1α(Elongation factor-1 alpha), β-casein, RSV(Respiratory syncytial virus), CMV5 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 바람직한 구체예에서는, 개 IgG Fc 도메인을 코딩하는 유전자 및 마우스 IgG의 TM 도메인을 코딩하는 유전자의 프로모터로서 CMV를 사용하였다.(도 3 참조).

이외에도, 본 발명의 벡터는 목적 유전자의 전사, 번역 또는 발현의 증진을 돕거나, 이에 영향을 주는 비해독화된 핵산서열로서 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 코작(Kozak), 인핸서, 막 표적화 또는 분비를 위한 신호서열, IRES (Internal Ribosome Entry Site) 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구체예에서는, 개 IgG FC 도메인을 코딩하는 유전자 및 마우스 IgG의 TM 도메인을 코딩하는 유전자를 각각 클로닝하고, 마우스 IgG의 TM 도메인을 코딩하는 유전자와 개 IgG Fc 도메인을 코딩하는 유전자를 라이게이션한 후, 이를 pcDNA3 벡터에 클로닝하여, 테트라사이클린 유도가능하면서도 네오마이신으로 선발할 수 있는 새로운 벡터 시스템을 사용하였으며, 이 벡터를 Canine Fc/pcDNA3로 명명하였다(도 4). 상기 클로닝 및 라이게이션은 당 업계에서 사용되는 제한 효소 등을 이용하여 벡터 제조에 사용되는 통상적인 방법에 따라 수행될 수 있다.

본 발명에 따른 벡터는 당업계에 공지된 방법에 따라 숙주세포 내로 도입될 수 있다. 세포 내로 본 발명의 벡터를 도입하는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 일렉트로포레이션 (Electroporation), 인산 칼슘(CaPO₄) 침전, 염화칼슘(CaCl₂) 침전, 레트로바이러스 감염(retroviral infection), 미세주입법(Microinjection), PEG, DAEA 덱스트란, 양이온 피로좀법, 초산 리튬-DMSO법 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 벡터로 형질전환될 수 있는 숙주세포로는 포유류세포인 것이 바람직하며, 본 발명의 목적에 적합한, 즉, 개 질병과 관련되며, 외피를 가진 바이러스가 증식할 수 있는 세포로서, Vero(원숭이 신장세포), BHK(햄스터 신장세포), MDCK(개 신장세포) 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 원숭이 신장세포인 Vero 세포를 사용하였다.

본 발명의 숙주세포는 개 IgG-Fc 도메인을 상기 숙주세포의 표면에 발현하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 사용된 Vero 세포에는 Canine Fc/pcDNA3를 형질감염 하기 전에, pcDNA6/TR 벡터(Invitrogen)를 미리 형질감염시킴으로써 안정한 세포주를 만들었다. 이 pcDNA6/TR 벡터는 평상시에 억제(repression) 벡터로서 다른 유전자와 단백질의 발현을 억제하는 특징이 있는 벡터이다. 본 발명자들은 이를 이용함으로써, 추가로 숙주세포를 형질감염하여 개 Fc를 발현하고자 할 때, 유도가 이루어지기 이전에는 이들 유전자의 발현을 억제하여 최소로 발현하고 이들 플라스미드를 밖으로 내보내려는 세포의 특성을 최소한 억제하여 안정화하고자 하였다. 이 과정에서 블라스티딘(blasticidin)(2㎍/㎖)이 선발마커로서 사용되었으며, cDNA6/TR 벡터가 안정하게 발현되는 vero 세포에 canine-Fc/pcDNA3 클론을 형질감염하고, 네오마이신을 첨가한 배지를 이용하여 형질전환된 세포주, Vero-cFc를 선발하였다.

나아가, 상기에서 선발한 형질전환체의 개 IgG Fc 도메인의 발현능은 면역세포화학법 및 웨스턴 블롯(western blot)법을 이용하여 확인될 수 있다.

또한, 본 발명의 형질전환된 Vero 세포주의 세포막 및 이들 세포에서 증식된 바이러스의 외피에서 개 IgG-GFc 도메인 발현 여부는 형광항체법을 이용하여 확인할 수 있다.

이상과 같은 결과로부터, 본 발명자들은 상기 형질전환 세포주 "Vero-cFc"를 서울의대 암연구소 내 한국세포주연구재단(KCLRF; Korea Cell Line Research Foundation)에 2012년 3월 2일자로 기탁번호 KCLRF-BP-00281로 기탁하였다.

따라서, 본 발명에 따른 개 IgG의 Fc 도메인을 세포 표면에 발현하는 세포주에 바이러스의 외피가 있는 개 질병 관련 바이러스를 감염시켜 증식시키면, 바이러스가 세포 밖으로 나오는 과정에서 입자 표면에 개 IgG Fc 도메인을 함유하게 되고, 이렇게 바이러스 외피에 개 IgG Fc 도메인을 함유한 바이러스로 제조한 생독 백신 또는 불활성화 백신의 경우, 이들 백신을 개에 접종하면 개의 다양한 탐식세포(phagocyte)로 구성되는 항원 제시세포(antigen presenting cell)의 표면에 발현하고 있는 Fc 도메인에 대한 수용체를 자극하는 등 세포면역과 체액면역을 증가시킴으로써 면역 자극효과가 향상된다. 따라서, 본 발명에 따른 개 IgG Fc 도메인이 세포 표면에 발현되는 세포주는 이 세포주에서 증식가능한 외피가 있는 다양한 바이러스에 대하여 면역능이 우수한 다양한 종류의 백신을 손쉽게 생산할 수 있게 해준다.

그러므로, 본 발명은 (a) 개 IgG Fc 도메인을 세포 표면에 발현하는 세포주에 개 질병 관련 바이러스를 감염시키고, 증식시키는 단계 ; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 증식된 바이러스를 이용하여 생독 백신 또는 불활성화 백신을 제조하는 단계를 포함하는 개 질병 관련 바이러스에 대한 백신의 제조방법을 제공한다.

상기 (a) 단계에서 개 질병 관련 바이러스는 외피가 있는 바이러스가 바람직하며, 예를 들면 개 파보 바이러스(parvovirus), 개 디스템퍼(distemper) 바이러스, 개 전염성간염 바이러스, 개 코로나바이러스, 개 허피스바이러스, 개 파라인플루엔자(parainfluenza) 바이러스, 공수병(rabies) 바이러스 등이 있다. 따라서 본 발명은 이들 바이러스들에 대한 백신의 제조방법을 제공한다.

상기 (a) 단계에서 세포주에 바이러스를 감염 및 증식시키는 과정은 당업자에 의하여 공지된 방법으로 수행될 수 있으며, 이를 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 개발한 세포주가 50~80%를 형성하게 되면 특정 바이러스를 감염시킨다. 감염 소요 시간과 증식 기간은 바이러스 종류에 따라 다양할 수 있으며, 일반적으로 감염 소요 시간은 대게 3시간에서 12시간 정도이며, 증식 기간은 3일에서 1주일간이다. 해당 바이러스에 따른 감염과 증식이 종료되면, 배양 상층액을 수거한다. 상기 배양 상층액 속에는 바이러스 외피에 Fc를 함유한 바이러스가 포함되어 있다. 변이 세포를 제거하기 위하여, 벡터에 삽입된 항생제 저항 유전자에 따라 특정 항생제를 포함한 배지에 세포를 3대 간격으로 배양하여, 세포 변이 가능성을 제거한다. 이와 같은 방법으로 증식된 바이러스는 바이러스 외피에 Fc를 함유하게 된다.

상기 (b) 단계에서, 단계 (a)로부터 얻은 증식된 바이러스로부터 생독 백신 또는 불활성화 백신의 제조방법으로는, 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다. 특히, 불활성화 백신을 제조하고자 하는 경우, 포르말린 또는 제조사의 지시서에 따른 특정한 방법으로 바이러스를 처리하여 이를 불활성화시키고, 불활성화된 바이러스를 통상의 방법으로 정제하여, 바이러스 원액의 무균실험 및 바이러스 함량실험 등을 실시하고, 보존제 및 완충액 생리식염수를 가하여 희석 혼합 또는 안정제를 첨가한다. 최종 원액은 무균 실험과 보존제 함량 시험을 실시할 수 있다. 최종 백신은 원하는 바에 따라 동결건조, 액상 등의 상태로 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 발현벡터는 개 IgG Fc 도메인을 세포 표면에 발현하도록 할 수 있으며, 상기 벡터로 형질전환된 숙주세포에 바이러스를 증식시키는 경우, 바이러스 외피에 개 IgG의 Fc 도메인이 포함됨으로써 다양한 개 질병 관련 바이러스에 대하여 면역능이 우수한 백신을 용이하게 생산할 수 있도록 해준다.

도 1은 일반적인 항체의존 세포매개 세포독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity; ADCC) 기전을 나타낸다.
도 2는 Y자-형태의 IgG의 구조 및 각 쇄의 일반적인 구성을 나타낸다.
도 3은 본 발명에서 사용된 pcDNA3 벡터를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 개 Fc 및 마우스 TM 도메인인 mRANKL이 삽입된 Canine Fc/pcDNA3 벡터를 나타낸다.
도 5는 본 발명에서 Vero 세포의 안정화를 위해 사용되는 pcDNA6/TR 벡터를 나타낸다.
도 6은 본 발명에서 제조된 Vero-cfc 세포주에서 개 Fc 단백질의 발현여부를 증명하기 위하여, 태깅(tagging) 단백질에 대한 항체인 his와 myc 항체를 이용한 상기 세포주의 웨스턴 블롯 결과이다.
도 7은 본 발명에서 제조된 Vero-cfc 세포주에서 개 Fc 단백질의 세포 표면에서의 발현을 보여주는 면역세포화학법의 결과이다.
도 8은 본 발명에 따라 제공되는 바이러스 외피(envelope)에서 발현된 개 Fc 단백질을 포함하는 공수병바이러스의 모식도이다.
도 9는 Vero-cfc 안정화 세포주에 대한 공수병 바이러스의 감염 여부 및 상기 세포주 표면에서 개 Fc 단백질 발현을 나타내는 형광항체법 결과를 나타낸다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만, 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예

1. 개 IgG Fc 도메인을 코딩하는 유전자의 클로닝

NCBI Genbank(접수번호(accession number): AF354264.1)에 등록된 개 IgG 서열을 바탕으로 두 개의 프라이머 즉, 센스(sense) 프라이머 (5'-CCCGGATCCGTTGACATTGATTATTGACTA-3') 및 안티센스(anti-sense) 프라이머 (5'-CTCGAGTCAATGGTGATGGTGATG-3')를 이용하여 개 IgG Fc 유전자를 PCR로 증폭하였다. PCR 조건은 94℃에서 2분 반응 후, 94℃ 30초, 54℃ 30초, 72℃ 45초의 조건에서 25 싸이클을 반복하고, 72℃에서 5분 동안 연장반응을 실시하였다. PCR 실시 후 증폭된 유전자를 전기영동으로 확인한 결과, 약 702bp에 해당하는 밴드를 확인할 수 있었다.

2. 마우스 IgG mRANKL 를 코딩하는 유전자의 클로닝

NCBI Genbank (접수번호: NM_011613)에 등록된 마우스 IgG mRANKL 서열을 바탕으로 두 개의 프라이머 즉, 센스 프라이머 (5'-CCC AAG CTT ACC ATG CGC CGG GCC AGC CGA-3') 및 안티센스 프라이머 (5'-CCC GAA TTC ATC CAT CTG CGC TCG AAA-3')를 이용하여, 마우스 IgG mRANKL 유전자를 PCR로 증폭하였다.

PCR 조건은 94℃에서 2분 반응 후, 94℃ 30초, 54℃ 30초, 72℃ 45초의 조건에서 25 싸이클을 반복하고, 72℃에서 5분 동안 연장반응을 실시한다. PCR 실시 후 증폭된 유전자를 전기영동으로 확인한 결과, 약 228bp에 해당하는 밴드를 확인할 수 있었다

3. Canine Fc / pcDNA3 벡터의 제조

개 Fc 단백질의 표면 발현을 유도하기 위하여 마우스 IgG 단백질의 트랜스멤브레인 도메인인 mRANKL 도메인과의 융합 단백질 형태로 유전자를 클로닝하여 발현을 유도하였다. 이는 본 발명자들이 타겟으로 하는 개 Fc 단백질의 세포 표면 발현을 보다 효율적이고 안정적으로 발현하기 위한 것이다.

구체적으로, 먼저 증폭된mRANKL과 Canine Fc 유전자를 EcoRI 자리로 연결하고, 이 연결된 융합 유전자를 HindIII와 XbaI으로 처리하여, 1차적으로pcDNA4/TO/myc-His vector(Invitrogen)의 동일한 자리에 클로닝하였다. 융합된 DNA를 pcDNA4/TO/myc-His 벡터에 먼저 클로닝한 이유는 이 벡터 내에 존재하는 테트라싸이클린 유도 자리를 이용하기 위함이므로, BamHI과 XbaI 자리를 이용하여 이 벡터 내에 존재하는 pCMV 프로모터로부터 Canine Fc까지의 모든 유전자를 다시 잘라서 pcDNA3 벡터(Invitrogen)에 2차로 클로닝하였다.

결론적으로 도 3에 나타낸 바와 같은 pcDNA3 벡터에 클로닝하여, 테트라사이클린 유도가능하면서도 네오마이신으로 선발할 수 있는 새로운 벡터 시스템을 제조하였으며, 이 벡터를 Canine Fc/pcDNA3로 명명하였으며, 그 구조는 도 4에 나타낸 바와 같다.

4. 억제 벡터의 발현

Canine Fc/pcDNA3 벡터를 Vero 세포에 형질감염시켜 개 Fc를 표면발현하는 Vero 세포주를 생성시키기에 앞서, Vero 세포에 pcDNA6/TR 벡터 (도 5)를 형질감염하여 안정화 세포주를 만들었다. 상기 pcDNA6/TR 벡터의 특징은 평상시는 억제 벡터로서 다른 유전자와 단백질의 발현을 억제하는 기능을 하는 것이다. 이를 이용하여 실제 발현시키고자 하는 Canine Fc/pcDNA3로 숙주세포를 형질감염시켰을 때, 유도가 이루어지기 전에는 이들 유전자의 발현을 억제하여 최소로 발현하고, 이들 플라스미드를 밖으로 내보내려는 세포의 특성을 최소한 억제하여 안정화시킬 수 있다. pcDNA6/TR 벡터 내에는 블라스티딘이라는 선발 마커가 포함되어 있으며, 이를 이용하여 세포주를 선별하였다.

5. Vero - cfc 세포주의 생성

상기에서 설명된 것과 같이, 블라스티딘을 선발마커로 사용하여 cDNA6/TR을 안정적으로 발현하는 것으로 선발된 Vero 세포주를, 상기 제조된 Canine Fc/pcDNA3 벡터로 형질감염시켜, 개 Fc 단백질을 세포 표면에 발현하는 Vero 세포인, "Vero-cfc" 세포주를 생성하였다. 상기 단계 “3. Canine Fc/pcDNA3 벡터의 제조”에서 제조한 Canine Fc/pcDNA3 플라스미드를 cDNA6/TR을 안정적으로 발현하는 Vero 세포주에 리포펙타민(lipofectamine) 2000 형질감염 시약(Invitrogen)을 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 형질전환시켰다. 즉, 4㎍의 플라스미드 DNA를 opti-MEM (GIBCO) 무혈청배지 100㎕에 혼합하고, 10㎕의 리포펙타민 2000 시약을 동일하게 opti-MEM (GIBCO) 무혈청배지 100㎕에 혼합하여 20분간 상온에서 인큐베이션하였다. 20분 경과 후 두 혼합액을 섞어 공동형질전환 혼합물(cotransfection mixture)을 제조하고, 이를 상온에서 20분간 더 인큐베이션하였다. 한편, 6개의 웰에서, 80% 정도 단층으로 형성된 Vero 세포주에 상기에서 제조한 형질감염 혼합물을 한 방울씩 떨어뜨리면서 첨가하여 37℃ CO₂ 배양기에서 5시간 동안 배양하고, 그 후, 10% 혈청이 첨가된 alpha-MEM (GIBCO) 배지로 교체 후 48시간 동안 배양하였다. 형질감염 후 네오마이신을 첨가한 배지를 이용하여 형질전환 세포주 중에서 형질전환 Fc 발현 세포주를 선택적으로 선발하였다. 형질전환 48시간 후, 6개 웰의 세포를 100 mm 페트리디쉬로 옮긴 후 일반 세포 배양 배지 즉, 10% 혈청이 첨가된 alpha-MEM (GIBCO)에 네오마이신 (GIBCO)이 500㎍/㎖이 되게 첨가한 배지로 교환하여 배양하였다. 2~3대 계대배양하여 생존한 Vero 세포 군락 (colony)을 클로닝 실린더 (Sigma)에서 트립신 (GIBCO)으로 소화한 후 수확하여 개별적으로 배양하여 세포주를 작성하고 그 중 세포 증식능이 우수한 세포주로서 Canine Fc/pcDNA3로 형질전환된 세포주를 선발하였다.

가. 웨스턴 블롯을 이용한 개 Fc 단백질 발현 증명

상기 제조 및 선발된 Vero-cfc 세포주에서 개 Fc 발현 여부를 검증하기 위하여, 웨스턴블롯 방법을 이용하였다. 증명을 위하여 태깅(tagging) 단백질에 대한 항체인 his와 myc 항체를 이용하였다(도 6).

상기 Vero-cfc 세포주를 대상으로 먼저 SDS-page를 수행하고, 알카라인 포스포타아제 (alkaline phosphotase)가 콘쥬게이션(conjugation)되어 있는 개 IgG 항체를 사용하여 다음과 같은 방법에 따라 웨스턴 블롯 분석을 실시하였다.

Vero-cfc 세포주를 25cm² 플라스크에서 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 3일간 배양한 후 PBS로 2회 세척하고, 스크레퍼(scraper)로 긁어 세포를 수확하였다. 이를 12,000rpm에서 5분간 원심하고, 상층액을 제거한 세포에 세포 추출 용액

(50mM Tris-HCl, 150mM sodium chloride, 1% NP-40, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, pH 8.0)을 500㎕ 첨가하여 용해시켰다. 그 다음 10초씩 2회 초음파 파쇄하고, 14,000 rpm에서 10분간 원심분리한 상층액을 새로운 에펜도르프 튜브로 옮기고, 최종농도가 1mM이 되게 페닐메틸술포닐 플루오라이드 벤질술포닐 플루오라이드(PMSF)를 첨가하였다.

준비된 세포 추출물을 10%의 SDS-PAGE 겔에서 단백질 사이즈 마커와 함께 120 볼트에서 약 2시간 전기영동을 실시하고, 전개된 단백질을 폴리비닐리덴 디플로라이드(PVDF)막에 전기를 이용하여 옮기고, 블로킹 용액 즉, 5%가 되도록 무지방 건유(nonfat dried milk)가 첨가된 PBS-T(PBS 중 0.1% tween 20) 용액으로 실온에서 1시간 블로킹(blocking)을 실시하였다. 그 다음 알카라인 포스포타아제(Alkaline phosphotase)가 콘쥬게이션된 마우스 유래 항-개 IgG (H+L) AP를 1:1,000 배로 블로킹 용액에 희석한 용액에서 PVDF 막을 실온에서 1시간 반응시킨 후 PBS-T 용액으로 3회 세척하였다. 세척된 PVDF막은 예비 혼합된 BCIP/NBT 용액(Sigma)으로 발색시켰다.

그 결과, 도 6에서 나타낸 바와 같이 Fc를 발현하는 세포주에서 약 42 Kda에 해당하는 Fc 단백질 밴드를 확인할 수 있었다.

나. vero 세포에서의 개 Fc 단백질의 표면 발현의 검증

개 Fc단백질이 vero 세포에서 안정하게 발현되는 것이 상기와 같이 증명되었으나, 과연 이들 발현 단백질이 vero 세포의 표면에 발현하는지 아니면 세포 안쪽에서 봉입체의 형태로 발현되는지를 검증하기 위하여 면역세포화학을 이용하였다.

상기 면역세포화학법의 기본적인 원리는 목적 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 표적 단백질이 세포 내에 존재하는지, 그리고 어느 위치에 존재하는지를 확인하는 것이다. 이를 위해서 세포 고정 후, 항체 반응이 있기 전 계면 활성제 (detergent)를 이용하여 세포막의 투과성을 높여 항체가 막 안쪽으로 들어갈 수 있도록 하는 과정이 수행된다. 계면활성제를 처리하지 않으면 항체가 안쪽으로 들어가지 못하게 되어, 세포막 바깥쪽으로 드러나는 항원만 검출할 수 있게 된다. 즉, Canine Fc/pcDNA3 플라스미드로 형질전환된 세포를 6 개 웰 플레이트 바닥에 단층이 형성되도록 배양하고, 세포를 덮고 있는 배지를 제거한 후, 1X PBS를 이용하여 깨끗하게 세척하고, 4% PFA (Paraformaldehyde) 용액을 이용하여 세포를 고정하였다. Canine Fc 분자의 발현 위치를 확인하기 위하여 한 그룹에는 0.1X Triton X-100 용액을 처리하여 세포막의 투과성을 높였다. 그 후 1X PBS로 3회 세척하여 남아있는 Triton X-100을 완전히 제거하고, 4% BSA를 사용하여 블로킹(blocking)을 진행하였다. 1차 항체로 Dog IgG Fc 항체 (LSBio)를 1:500으로 희석하여 사용하고, 2차 항체로 HRP-콘쥬게이트된 토끼 IgG 항체 (KPL)를 1:1000으로 희석하여 사용하였다. 1X PBS로 잘 세척한 후, 형광 현미경으로 관찰하였다.

두 가지 조건, 즉 투과성(permeable) 조건 (Triton X-100 처리군) 및 비투과성(non-permeable) 조건 (Triton X-100 비처리군)을 비교한 결과, 발현이 비투과성 조건에서 강하게 나타났으며, 이는 개 Fc의 발현이 주로 세포 표면에서 발현됨을 나타낸다. (도 7)

6. 바이러스 표면에서 개 IgG Fc 를 갖는 공수병 바이러스의 제조 및 확인

본 발명에 따라 궁극적으로 제공하고자 하는 바로서, 개 Fc 유전자를 발현하는 공수병 바이러스는, 개 Fc 단백질을 표면에 발현하고 있는 vero 세포에 감염된 공수병 바이러스가 복제과정을 거치고 바이러스 표면에 개 Fc 단백질을 포함하면서 발아(budding)하는 형태로 제조되며, 이러한 바이러스의 모식도는 도 8에 나타낸 바와 같다.

본 발명에 따라 제조된 개 Fc 단백질을 안정하게 발현하는 vero 세포에 공수병 바이러스를 감염시킨 후, 이들이 과연 목표에서와 같은 형태로 개 Fc 단백질을 함유하면서 발아하는지의 여부를 본 실시예에서 증명하고자 하였다. 이를 위하여 우선적으로 본 발명자들이 개발한 Vero-cFc 안정화 세포주에 공수병 바이러스가 잘 감염하는지를 증명하기 위하여 감염시킨 결과, 도 9와 같이 명확한 CPE(세포변성효과)를 형성함으로써, 이 세포주가 공수병 바이러스에 잘 감염됨을 확인하였다. 또한 Vero-cFc 세포주를 발현하는 단백질이 Myc 단백질과 his 단백질과의 융합 단백질로 함께 발현하기 때문에 공수병 바이러스를 감염시킨 후, 새로운 야생형 vero 세포에 감염하였을 때, 공수병 바이러스를 감염시킨 후, 이를 새로이 감염시킨 세포주에서만 Myc과 his를 발현함을 증명함으로써 본 발명자들이 개발한 Vero-cFc발현 세포에 공수병 바이러스를 감염시키면 바이러스가 발아하면서 세포주 표면에 발현된 개 Fc단백질을 함께 감싸고 나옴으로써 위에서 언급한 본 발명자들이 원하는 형태의 시스템(도 8)이 개발됨을 확인하였다.

구체적으로 설명하면, 일반적인 Vero 세포주 및 Vero-cfc 세포주에서 공수병 바이러스를 각각 감염시키고, 세포변성효과가 확인된 후에 바이러스를 채독하였다. 이들 바이러스를 새로운 Vero 세포에 각각 감염시키고, 1시간 30분 후 경과 후 감염된 세포를 차가운 90% 아세톤으로 고정시켰다. 고정된 세포들은 HRP 콘쥬게이트된 항-myc 항체(abcam)와 HRP 콘쥬게이트된 항-6X His 항체(abcam)를 1:1000으로 각각 희석 후 사용하여 형광항체 반응을 실시하였다. 그 결과 도9에서 확인할 수 있듯이 Vero-Cfc 세포주에서 배양한 공수병 바이러스를 다시 Vero 세포에 감염시킨 후, myc과 His에 대한 형광항체반응을 실시한 경우 형광이 확인되었으며, 일반 Vero 세포에서 공수병 바이러스를 배양 후 동일한 실험을 반복하였을 때, 형광이 관찰되지 않았다.

상기 설명된 것과 같은 방법으로 개발된 개 Fc발현 세포주를 이용한 공수병 백신은 기존의 백신보다 효율적인 항체 형성능을 비롯한 효율성이 높아질 것으로 기대된다.

한국세포주연구재단 KCLRFBP00281BP 20120302

SEQUENCE LISTING <110> Komipharm International Co., Ltd <120> A VECTOR FOR EXPRESSING Fc DOMAIN OF CANINE IgG ON THE CELL SURFACE, A HOST CELL TRANSFORMED WITH SAID VECTOR AND A METHOD FOR MANUFATURING VACCINE AGAINST CANINE DISEASES USING SAID HOST CELL <160> 2 <170> Patent In version 3.3 <210> 1 <211> 699 <212> DNA <213> Canine IgG Fc <400> 1 ttcaatgaat gcagatgcac tgatacaccc ccatgcccag tccctgaacc tctgggaggg 60 ccttcggtcc tcatctttcc cccgaaaccc aaggacatcc tcaggattac ccgaacaccc 120 gaggtcacct gtgtggtgtt agatctgggc cgtgaggacc ctgaggtgca gatcagctgg 180 ttcgtggatg gtaaggaggt gcacacagcc aagacccagt ctcgtgagca gcagttcaac 240 ggcacctacc gtgtggtcag cgtcctcccc attgagcacc aggactggct cacagggaag 300 gagttcaagt gcagagtcaa ccacatagac ctcccgtctc ccatcgagag gaccatctct 360 aaggccagag ggagggccca taagcccagt gtgtatgtcc tgccgccatc cccaaaggag 420 ttgtcatcca gtgacacagt cagcatcacc tgcctgataa aagacttcta cccacctgac 480 attgatgtgg agtggcagag caatggacag caggagcccg agaggaagca ccgcatgacc 540 ccgccccagc tggacgagga cgggtcctac ttcctgtaca gcaagctctc tgtggacaag 600 agccgctggc agcagggaga ccccttcaca tgtgcggtga tgcatgaaac tctacagaac 660 cactacacag atctatccct ctcccattct ccgggtaaa 699 <210> 2 <211> 236 <212> DNA <213> Mouse IgG mRANKL <400> 2 agcttaccat gcgccgggcc agccgagact acggcaagta cctgcgcagc tcggaggaga 60 tgggcagcgg ccccggcgtc ccacacgagg gtccgctgca ccccgcgcct tctgcaccgg 120 ctccggcgcc gccacccgcc gcctcccgct ccatgttcct ggccctcctg gggctgggac 180 tgggccaggt ggtctgcagc atcgctctgt tcctgtactt tcgagcgcag atggat 236

Claims (7)

1. 서열번호 1로 표시되는 개 IgG의 Fc 도메인을 코딩하는 유전자와, 서열번호 2로 표시되는 마우스 IgG 단백질의 트랜스멤브레인 도메인을 코딩하는 유전자를 포함하는, 개 IgG의 Fc 도메인의 세포 표면 발현용 벡터.
2. 제 1항에 있어서, 상기 개 IgG의 Fc 도메인의 세포 표면 발현용 벡터는 도 4에 나타낸 유전자 지도를 갖는 Canine Fc/pcDNA3 벡터인 것을 특징으로 하는, 개 IgG의 Fc 도메인의 세포 표면 발현용 벡터.
3. 제1항에 따른 개 IgG의 Fc 도메인의 세포 표면 발현용 벡터로 형질전환되고, 한국세포주연구재단(KCLRF)에 기탁번호 KCLRF-BP-00281로 기탁된 숙주세포.
4. (a) 제1항 또는 제2항에 따른 개 IgG의 Fc 도메인의 세포 표면 발현용 벡터로 형질전환시킨 숙주세포에, 외피를 갖는 개 질병 관련 바이러스를 감염시켜 증식시키는 단계: 및
   (b) 상기 (a) 단계에서 증식된 바이러스를 이용하여 생독 백신 또는 불활성화 백신을 제조하는 단계를 포함하는, 개 질병 관련 바이러스에 대한 백신의 제조방법.
5. 제 4항에 있어서, 상기 숙주세포는 외피를 가진 바이러스가 증식할 수 있는 포유류 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 5항에 있어서, 상기 숙주세포는 한국세포주연구재단(KCLRF)에 기탁번호 KCLRF-BP-00281로 기탁된 숙주세포인 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 4항에 있어서, 상기 외피를 갖는 개 질병 관련 바이러스는 개 파보 바이러스, 개 디스템퍼 바이러스, 개 전염성간염 바이러스, 개 코로나바이러스, 개허피스바이러스, 개 파라인플루엔자 바이러스 및 공수병 바이러스로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.

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