SU1470739A1

SU1470739A1 - Гексапептид, обладающий гепатопротективным действием

Info

Publication number: SU1470739A1
Application number: SU843772913A
Authority: SU
Inventors: Евгений Иванович Чазов; Владимир Николаевич Смирнов; Валентин Антонович Виноградов; Владимир Маркович Полонский; Валентина Алексеевна Тищенко; Михаил Иванович Титов; Жанна Дмитриевна Беспалова; Борис Леонидович Пекелис
Original assignee: Всесоюзный кардиологический научный центр АМН СССР
Priority date: 1984-07-16
Filing date: 1984-07-16
Publication date: 1989-04-07
Also published as: EP0188629A4; WO1986000621A1; JPS61502684A; EP0188629A1; US4698419A

Abstract

Гексапептид формулы Phe-Ala-Gly-Phe-Gly-Arg , обладающий гепатопротективным действием . С (О

Description

Изобретение относитс к новому биологически активному соединению - гексапептиду:

Phe-Ala--Gly-Phe-Gly-Arg,

обладающему гепатопротективным действием , которое может найти применение в медицине.

Цель изобретени - поиск п области биологически активных соединений пептидной природы, обладающих высокой гепатопротективной активностью и не имеющих побочных свойств.

Синтез предлагаемого гексапептида провод т следующим образом.

Карбобензокси-глицил-аргинин (I). К суспензии 1,58 г (9,07 ммоль) аргинина в 25 мл диметилформамида добавл ют 3,30 г (9,98 мм) п-нитрофенилового эфира карбобензокси-глицина. Смесь размешивают при комнатной температуре в течение суток. Диметил- формамид отгон ют, остаток раствор ют в 5 мл метанола и добавл ют 300 мл эфира. Выпавший осадок отфильтровы- ,вают, промывают на фильтре эфиром, cyniaT в вакуум-зксикаторе.

Выход продукта 3,09 г (93%), Т.Ш1. 135-135,5.. .

(ot) +10,3 (с 1, ДМФА).

Ri 0,25 (н-бутанол:уксусна кис- лота:вода 3:1:1) - А.

R2 0,54 (хлороформ:метанол:32% уксусна кислота 60:45:20) - Б.

R 0,33 (этилацетат:пиридин:уксусна кислота:вода 45:20:6:11) - В.

Карбобензокси фенилаланшт-глицил- аргинин (II). Через раствор 3,09 г (8,46 ммоль) продукта (I) в 35 мл

4

-vl

о

00 со

трифторуксусной кислоты в течение 1 ч. пропускают ток сухого бромистого водорода. Растворитель упаривают, к остатку добавл ют 150 мл эфира, выпавший осадок отфильтровывают, раствор ют в воде и обрабатывают ионообменной смолой Амберлит IRA-410 (ОН -форма) до отрицательной реакции на ио ны брома. Смолу отфильтровывают , промывают на фильтре метанолом , водой, фильтрат упаривают, остатки воды удал ют азеотропной перегонкой с изопропиловым спиртом. Остаток раствор ют в 25 мл диметилфор- мамида, к раствору добавл ют 3,91 г (9,31 ммоль) п-нитрофениловог-о эфира карбобензокси-фенилаланина. Реакционную смесь выдерживают при комнатной температуре в течение суток. Ди- метилформамид отгон ют, остаток расвор ют в 5 мл метанола и продукт осаждают добавлением 300 мл эфира. Выпавший осадок отфильтровывают, пр мывают на фильтре эфиром, сушат в вакуум-эксикаторе.

Выход 3,75 г (86%) продукта, т.пл. 133-134°С.

17,2 (с 1, ДМФА).

R| 0,30 (A),R| 0,66 (Б), R3 0,43 (В).

Карбобензокси-глицил-фенилаланил глицил-аргинин (III). Продукт получают аналогично продукту (II), исход из 2,71 г (5,28 ммоль) (II) и 1,93 г (5,83 ммоль) п-нитрофенилового эфира карбобензоксиглицина.

Выход продукта 2,46 г (82%), т.пл. 142-144 С.

1

(с) -17,3 (с 1, ДМФА). R 0,57 (Б), R2 0,35 (В),

0,45 (н-бутанол:муравьина кислота: вода 15:3:1).

Карбобензокси-аланил-глицил-фенилаланил-глицил-аргинин ((IV). Про дукт получают аналогично продукту (II). Исход из 2,46 г (4,32 ммоль) продукта (III) и 1,64 г (4,75 ммол п-нитрофенилового эфира карбобензо- ксиаланина получают 2,13 г (77%) продукта (IV), т.пл. 148-149°С.

(аС) -20,8 (с 1, ДМФА).

R 0,64 (Б), R 0,38 (В), R3 0,39 (н-бутанол:пиридин:аммиак

конц.:вода 20:12:3:15) - Г.

Карбобензокси-фенилаланил-аланил глицил-фенилаланил-глицил-аргинин (V). Продукт получают аналогично продукту (II). Исход из«0,64 г

(0,99. ммоль) продукта (IV) и 0,46 г (1,1 ммоль) п-нитрофенилового эфира карбобензокси-фенилаланина, получают 0,63 г (81%) продукта V, т.пл. 150-153°С.

W 3,5 (с 1, МеОН).

R. 0,42 (А), Щ 0,70 (Б), R| 0,39 (В).

Фенилаланил-аланил-глицил-фенил- аланил-глицил-аргинин (VI), 0,63 г (0,80 ммоль) продукта (V) раствор ют в 10 мл метанола и гидрирутот в присутствии палладиевого катализатора . Катализатор отфильтровывают, промывают на фильтре .метанолом, упаривают , остаток переосаждают из 5 мл метанола эфиром (100 мл), сушат в вакуум-эксикаторе. Полученный продукт внос т в колонку (600x15) с Сефадек- сом SPC-25 и фракционируют в градиенте пиридин-ацетатного буфера 0,05 М - 1,00 М.

Выход продукта 0,34 г (65%), т.пл., 154-156°С.

R ,

(ci.)D +8,4 (с 0,5, ). R| 0,58 (Б), R2 0,32 (Г), 0,44 (н-бутанол:пиридин:уксус0

5

0

з O

5

на кислота:вода 10,5:6:1:7,5).

Данные аминокислотного анализа: фенилаланин 2,13 (2), аланин 1,00 (1), глицин 1,97 (2), аргинин 0,93 (1).

Индивидуальность синтезированного гексапептида подтверждена спектром ЯМР И методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Пептид элюируют одним пиком при 39,3% градиента на 12,8 минуте. (Колонка 250-4,6 мм, Spherisor BODS, 5/U, подвижна фаза Ai 0,05М , рН 3,0; В:С1ЦСЫ; grad. 20 В за 20 мин; давление 1500 psi, скорость 1мм/мнн} детекци при 214 мм).

Проведены биологические испытани предлагаемого гексапептида.

Изучение гепатопротективного действи гексапептида в сравнении с преднизолоном проведено на 48 мьшах- - самцах линии balb С.

Развитие острого гепатита вызывают у мышей, подвергнутых 12 ч голоданию , с помощью П-галактозамина гидрохлорида, который ввод т в/б, разведенного в 0,1 мл физиологического раствора концентрации 700 мг/кг. Контрольна группа животных получала в/б 0,1 мл физиологического раствора . Животным, получавшим D-гапактозамин , сразу же после его выделени инъецируют предлагаемый гексапептид (100 мкг/кг), преднизолон (5 мг/кг) или физиологический раствор (0,1 мл) п/к. Повторные инъекции исследуемых веществ производ т через 6 ч. Кажда из групп состо ла из 12 животных. Забой мышей производ т методом дека- пит ации, собирают кровь из шейных сосудов и в ее сыворотке определ ют концентрации аланиновой трансаминазы (АЛТ) и глютаматдегидрогеназы (ГДГ).

Статистическую обработку полученных результатов провод т с помощью t-критери Стьюдента. За достоверные- принимали различи на уровне значимости 95% (при РХО,П5). Полученные результаты представлены в табл.1. I

Как следует из таблИ, D-г.алак- тозамин вызывал достоверное повышение концентраций исследуемых ферментов (АЛТ в 1,5, а ГДГ более чем в 3 раза). Предлагаемый гексапептид практически полностью блокировал по- вьшение концентраисии АЛТ и в 2 раза по- - нижал концентрацию ГДГ. При введении преднизолона отмечена лишь недостоверна тенденци к снижению концентраций ферментов.

Предлагаемый гексапептид изучен в экспериментальной модели острого поражени печени у крыс самцов линии Вистар (78 особей), вызываемого с помощью четыреххлористого углерода. Крысам после 12 ч голодани ввод т СС концентрации 1 мл/кг, разведенный в оливковом масле, в/б. После введени СС1 крысам инъецируют гексапептид в 4 различных дозах (10,30, 100 и 300 мкг/кг). Повторно гексапептид ввод т через 6, 24 и 30 ч. Контрольна группа животных вместо

10

15

дозы. Особенно выраженно снижаетс более специфичный печеночный энзим ГДГ.

Предлагаемый гексапептид, кроме того, зависимо от дозы блокирует летальность крыс при использовании четыреххлористого углерода.

Полученные результаты представлены в табл.3.

Как следует из табл.3, если чет реххлористый углерод вызывает гибе 77% (10 из 13) животных, то при введении предлагаемого гексапептид в дозах 100 и 300 мкг/кг летальнос вовсе отсутствует.

Статистическую обработку при по жении печени, вызванном четьфеххло ристым углеродом, в отношении пока зателей энзимов провод т с помощью t -критери Стьюдента, а в отношении летальности - с помощью критер Х Пирсона.

Во всех экспериментах с примене нием предлагаемого гексапептида не отмечалось изменений со стороны кл точного состава крови, основных ге модинамических показателей. При из чении острой токсичности гексапепт 30 да LD составл ет 120 мг/кг.

Таким образом, в использованных экспериментальных модел х острого поражени печени предлатаемьм гекс пептид достоверно снижает в крови 35 концентрации ГДГ и АЛТ, повышение

которых характерно дл патологичес го процесса, развивающегос в пече Это свидетельствует о наличии у ге сапептида гепатопротективных свойс 40 Преднизолон, использованный в обыч примен емой в клинике парэнтеральн дозе, не оказывал выраженного вли ни на концентрации ферментов. Соп ставление предлагаемого гексапепти

20

25

гексапептида получает физиологический 45 с соматостатином показывает, что раствор (О,2 мл). Все группы животных гексапептид превосходит последний

состо т из 13 крыс. В крови исследованы концентрации АЛТ и ГДГ.

Полученные результаты представлены в табл.2.50

Как следует из табл.2, СС1 вызывает достоверное повышение концентрации ГДГ. Повышение АЛТ не вл етс статистически значимым в силу малого количества наблюдений. Гексапептид снижает оба показател зависимо от

по эффективности - летальность 0% по сравнению с 20% у соматостатина максимально эффективна доза в 15 меньше (100 мкг/кг - дл гексапептида , 1,5 мг/кг - дл соматостатин

Наиболее распространенньп, примен емый при лечении заболевает п чени, препарат - преднизолон npiiMe 55 н ют в дозе, в 50 раз превосход ще дозу предлагаемого гексапептида.

5

Как следует из табл.3, если четы- реххлористый углерод вызывает гибель 77% (10 из 13) животных, то при введении предлагаемого гексапептида в дозах 100 и 300 мкг/кг летальность вовсе отсутствует.

Статистическую обработку при поражении печени, вызванном четьфеххло- ристым углеродом, в отношении показателей энзимов провод т с помощью t -критери Стьюдента, а в отношении летальности - с помощью критери Х Пирсона.

Во всех экспериментах с применением предлагаемого гексапептида не отмечалось изменений со стороны клеточного состава крови, основных ге- модинамических показателей. При изучении острой токсичности гексапепти- 0 да LD составл ет 120 мг/кг.

Таким образом, в использованных экспериментальных модел х острого поражени печени предлатаемьм гексапептид достоверно снижает в крови 5 концентрации ГДГ и АЛТ, повышение

которых характерно дл патологического процесса, развивающегос в печени. Это свидетельствует о наличии у гексапептида гепатопротективных свойств. 0 Преднизолон, использованный в обычно примен емой в клинике парэнтеральной дозе, не оказывал выраженного вли ни на концентрации ферментов. Сопоставление предлагаемого гексапептида

0

5

45 с соматостатином показывает, что гексапептид превосходит последний

50

по эффективности - летальность 0% по сравнению с 20% у соматостатина, максимально эффективна доза в 15 раз меньше (100 мкг/кг - дл гексапептида , 1,5 мг/кг - дл соматостатина).

Наиболее распространенньп, примен емый при лечении заболевает пе- чени, препарат - преднизолон npiiMe- 55 н ют в дозе, в 50 раз превосход щей дозу предлагаемого гексапептида.

Таблица 1

Группа животных

113,6±5,5 32,5±:3,8

170 ,3+Ю, 121,6±16,0

-

115 ,2+14,3 104,5±10,1

115, i±5, 62,814,9

между 1 и 2 группами дос

между 2 и 3 группами дос

Таблица 2

Группа животных

АЛТ, ед

Виварный контроль

64,.6±3,3

CCl,

СС1д+ предлагаемьй

гексапептид

(10 мкг/кг)

CCl описываемый

гексапептид

(30 мкг/кг)

описываемый

гексапептид

(100 мкг/кг)

описываемый

гексапептид

(300 мкг/кг)

АЛТ, ед

ГДГ, ед

17,210,6 5619,711201,7

1962,01494,7 1487,31301,5

874,31118,3

4

603,31118 0

Claims

ГЕКСАПЕПТИД, ОБЛАДАЮЩИЙ ГЕПАТОПРОТЕКТИВНЫМ ДЕЙСТВИЕМ Гексапептид формулы

РЬе-А1а-С1у-РНе-С1у-Аг§ ,