DK170649B1

DK170649B1 - Corticotropinderivater og fysiologisk acceptable salte deraf, deres fremstilling og lægemidler, der indeholder dem

Info

Publication number: DK170649B1
Application number: DK482185A
Authority: DK
Inventors: Rolf Geiger; Hermann Gerhards; Hansjoerg Kruse
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1984-10-22
Filing date: 1985-10-21
Publication date: 1995-11-20
Also published as: PT81345A; IE852596L; DK482185A; US4623715A; ES548052A0; EP0179332A2; DK482185D0; CS408391A3; EP0179332B1; PT81345B; JPS61100596A; ES8703488A1; AU579593B2; GR852541B; ATE84544T1; JPH075632B2; DE3586979D1; IE59724B1; US4696913A; EP0179332A3

Description

DK 170649 B1

Opfindelsen angår hidtil ukendte CNS-aktive peptider (corticotropinderivater) og fysiologisk acceptable salte deraf med virkning på det cholinerge system, deres fremstilling og lægemidler, der indeholder dem.

5 I US patentskrift nr. 3.842.064 angives det, jf. tabellen i spalte 5-6, at CNS-virkningen af det naturlige ACTH(4-10)-fragment (peptid 1) ved erstatning af L-arginin med D-arginin eller D-lysin (peptiderne 2 og 3) forøges med en faktor på 3-10, og at virkningen ved C-10 terminal forlængelse af den ACTH (4-10)-analoge (peptid 2) ud over D-Lys med L-Phe-OH, tryptamid eller L-Phe-Gly-OH (peptiderne 5-7) forøges med en faktor på 300-500.

Disse stigninger skal ses i forhold til det naturlige ACTH(4-10)-fragment, hvis biologiske virkning er forholds-15 vis svag.

I US patentskrift nr. 3.853.838 er der omtalt ACTH(4-7)-analoge, der i stilling 7 indeholder D-Phe (spalte 1, linie 23) og udløser helt andre virkninger end de i det følgende beskrevne corticotropinderivater ifølge den 20 foreliggende opfindelse. Den biologiske aktivitet af de i US skriftet beskrevne corticotropinderivater er således fuldstændig modsat virkningen af corticotropinderivaterne ifølge den foreliggende opfindelse, idet de i det nævnte US skrift beskrevne peptider fører til en fremskyndelse 25 af ekstinktionen i stedet for som i tilfælde af corticotropinderivaterne ifølge opfindelsen til en hæmning af ekstinktionen af et ved konditionering fastlagt hukommelsesspor, jf. spalte 1, linie 8-14 i US skriftet.

Allerede simple dipeptid-derivater som f.eks.

30 Z-Lys-Phe-OMe (IV) (Z = benzyloxycarbonyl) fremkalder efter en intracerebro- ventrikulær (i.c.v.) indgivelse på 10 /xg en trang hos 35 rotter til at pudse sig og bevæge sig. Samtidig påvirkes 2 * DK 170649 B1 cholinerge mekanismer i centralnervesystemet (CNS). I rottens striatum er indholdet af cholin efter subkutan indgivelse af 10 μg formindsket, medens indholdet af ace-tylcholin er forøget.

5 Virkningerne forstærkes, når carboxylgruppen bærer en basisk substitueret gruppe, idet lysin kan foreligge i D-formen. Således har f.eks. forbindelsen Z-D-Lys-Phe-NH-(CH2)8-NH2*2 HCl (V), 10 der er et eksempel på en forbindelse ifølge opfindelsen, jf. det følgende, allerede med 1 μg i.c.v. eller subkutant de samme virkninger.

De beskrevne effekter er karakteristiske for ACTH

15 og MSH.

Såfremt Z-gruppen i forbindelsen (V) erstattes med phenylalanin, og dennes a-aminogruppe substitueres med partialsekvenser af ACTH/MSH, men også med andre acyl-, aminosyre- og peptidrester, kan der iagttages en yder-20 ligere forøgelse af effekten i det cholinerge system under svækkelse af trangen til at pudse sig og bevæge sig.

Ved de kraftigere virksomme forbindelser iagttages der ikke blot forøgede, men også formindskede acetylcholinspejle. Begge effekter refererer til en for-25 øget syntesehastighed eller en forøget omsætning.

En fremskyndelse af acetylcholinomsætningen i forskellige hjerneområder efter intracerebroventrikulær (i.c.v.)-indgivelse af alfa-MSH, ACTH og længerekædede ACTH-brudstykker (ATCH 1-24) er allerede tidligere be-30 skrevet af to arbejdsgrupper (jfr. P. Wood et al.: Life Sciences 22 (1978), 673-678; JPET 209 (1979), 97-103; L.J. Botticelli and R.J. Wurtmann: Brain Research 210 (1981), 479-484; J. Neuroscience 2 (1982), 1316-1321).

Neurotrop virkning har også ACTH-lignende korte 35 peptider, som er kendt fra Ann. N.Y. Acad. Sci. 297 (1977), 267-274.

3 DK 170649 B1

Ved de ovennævnte, fra litteraturen kendte forsøg til forstærkning af virkningen har det også vist sig, at arten af de N-terminale substituenter er mindre vigtig end substitutionen i sig selv, især når det ved substitu-5 enterne drejer sig om peptider. Phenylalaninerne kan også modificeres uden at miste virkningen. Endvidere har det vist sig, at den C-terminale basiske substituent i sammenligning med en ikke-substitueret forbindelse stadig forøger virkningen ca. 100 gange.

10 Den foreliggende opfindelse angår således cor- ticotropinderivater, der er ejendommelige ved, at de har den almene formel R4-D-Lys-Phe-NH-(CH2)n-NH2 (I) 15 i hvilken R4 betyder over Na bundet benzyloxycarbonyl (Z) eller Ri - A2 - A 3 - Phe, hvori R^· betyder glutaroyl, H--Met(O), Η-Met(02), Η-Tyr eller pyroglutamyl, 20 A2 betyder Glu eller Ala, A3 betyder His eller Ala, og n er et helt tal fra 4 til 10, eller er fysiologisk tålelige salte deraf, idet dog forbindelsen H-Met(O)-Glu-His-Phe-D-Lys-Phe-NH-25 (CH2)8~NH2 er undtaget.

Opfindelsen angår både forbindelser med R- og S-konfigureret sulfinylgruppe i gruppen H-Met(O)-.

I den C-terminale gruppe -NH-(CH2)n~NH2 betyder n fortrinsvis 6-10, især 8.

30 Der skal nedenfor angives nogle delsekvenser af foretrukne penta- og hexapeptid-derivater: -Glu-His-Phe-D-Lys-Phe--Ala-Ala-Phe-D-Lys-Phe-35 -Glu-Ala-Phe-D-Lys-Phe- 4 * DK 170649 B1

De følgende forbindelser med formlen I er særligt foretrukne: H-Met (0) -Glu-His-Phe-D-Lys-Phe-NH- (CH2) g-NH2 med S- eller R-konfigureret sulfinylgruppe, 5 Η-Met(02)-Glu-His-Phe-D-Lys-Phe-NH(CH2)g-NH2, Η-Met(02)-Ala-Ala-Phe-D-Lys-Phe-NH(CH2)g-NH2 og H00C-(CH2)3~CO-Glu-Ala-Phe-D-Lys-Phe-NH-(CH2)g-NH2.

Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til fremstilling af forbindelser med formlen I, hvilken fremit) gangsmåde er ejendommelig ved, at et fragment med N-terminal, fri aminogruppe kondenseres med et fragment med C--terminal, fri carboxylgruppe, idet der i disse fragmenter beskyttet foreligger primære og sekundære aminogrupper med surt fraspaltelige beskyttelsesgrupper af urethantypen 15 (f.eks. Boc) og carboxylgrupper med surt fraspaltelige beskyttelsesgrupper af estertypen (f.eks. Bu*-), som ikke deltager i reaktionen, og at de i de således fremkomne forbindelser til beskyttelse af amino- eller carboxylgrup-per indførte beskyttelsesgrupper fraspaltes surt, hvorefter 20 forbindelserne eventuelt omdannes til deres fysiologisk acceptable salte.

Bekyttelsesgrupper af urethantypen er beskrevet i Schroder, Lubke, The Peptides, bd. I, New York, London 1965, side 22 ff., og beskyttelsesgrupper af estertypen 25 er beskrevet sammesteds, side 52 ff.

Fremgangsmåden gennemføres med fordel på den måde, a) at en forbindelse med formlen Ila kondenseres med en forbindelse med formlen Illa, r4-o-Lys-OH H-Phe-NH-(CH2)n-NH2 30 (Ila) (Illa) b) at en forbindelse med formlen Ilb kondenseres med en forbindelse med formlen Hib, R4-0H H-D-Lys-Phe-NH-(CH2)n-NH2· eller (Ilb) (Hib) · 35 c) at en forbindelse med formlen Ile kondenseres med en forbindelse med formlen Ille, ' 5 DK 170649 B1 R1-0H H-A2-A3-Phe-D-Lys-Phe-NH-(CH2)nNH2 (Ile) (Ille) idet grupperne R1 og R4 samt A2 og A3 har de ovenfor angivne betydninger, men idet frie primære og sekundære 5 aminogrupper, med undtagelse af de N-terniinale grupper af forbindelserne med formlerne Illa, Hib og Ille, er beskyttet med surt fraspaltelige beskyttelsesgrupper af urethantypen, og frie carboxylgrupper, med undtagelse af de c-terminale grupper af forbindelserne med formlerne 10 Ila, Ilb og Ile, er beskyttet med surt fraspaltelige beskyttelsesgrupper af estertypen, hvorefter de i de ifølge a)-c) opnåede forbindelser til beskyttelse af amino- eller carboxylgrupper indførte beskyttelsesgrupper fraspaltes surt, og de fremkomne forbindelser eventuelt omdannes til 15 deres fysiologisk acceptabel salte. Omsætningen af forbindelserne med formlen Ilb med forbindelser med formlen Hib er foretrukket.

Udgangsforbindelserne med formlerne Ila, Ilb og Ile og Illa, Hib og Ille er kendte forbindelser eller 20 kan opnås på i og for sig kendt måde, f.eks. ved fragmentkondensation .

Ved syntesen af de her omhandlede peptider kommer som Na-beskyttelsesgrupper fortrinsvis benzyloxy-carbonyl- eller 9-fluorenylmethoxycarbonylgruppen i 25 betragtning og som carboxylbeskyttelsesgruppe tert.-butylgruppen.

Kondensationen ifølge den her omhandlede fremgangsmåde sker ifølge de almene metoder inden for peptidkemien, ved sulfonylforbindelser via sulfochloridet, men 30 ellers fortrinsvis ifølge metoden for de blandede anhydri-der, via aktivestere, azider eller ifølge carbodiimid-metode, især under tilsætning af reaktionsfremskyndende og racemiseringshindrende stoffer, f.eks. 1-hydroxybenzo-triazol, N-hydroxysuccinimid, 3-hydroxy-4-oxo-3,4-dihydro-35 6 - DK 170649 B1 -1,2,3-benzotriazin og N-hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarb-oximid, samt endvidere under anvendelse af aktiverede derivater af 1-hydroxybenzotriazolen eller anhydrider af phosphor-, phosphon- og phosphinsyrer.

5 Opløsningsmidler er dimethylformamid, dimethyl- acetamid, hexamethylphosphorsyretriamid, N-methylpyrro-lidon eller dimethylsulfoxid. Såfremt komponenternes opløselighed gør det muligt, kan der også anvendes opløsningsmidler som methylenchlorid eller chloroform. De 10 nævnte metoder er f.eks. beskrevet i Meienhofer-Gross: "The Peptides", Academic Press, Vol. I, (1979).

Virkningen af de her omhandlede forbindelser på det cholinerge system bestemmes efter en i J. Neurochem.

20 (1973), side 1-8 beskreven metode.

15 Den følgende tabel angiver nogle karakteristiske eksempler, som bl.a. viser den forøgede virkning af de basisk substituerede peptider ifølge opfindelsen i forhold til ACTH og kortere, usubstituerede peptider.

Med hensyn til de benyttede forsøgsmetoder skal 20 der i øvrigt henvises til Life Science 48., 155-161 (1991) [passiv undgåelse]. Physiol. Reviews §2, nr. 8, 976-1059 (1982) [gaben og strækning] og Peptides 9, 1081-1087 (1988) [Acetylcholin-omsætning].

7 DK 170649 B1 i : -I g-lgl ooooo-oo o o « s « r-i ! z* Z: * - mmwtiC.'i ^ T-T-T- o ε w <f _i$ Ό 0 vk tu ^ u r-t I t>0H g ad >, o g o c h

4J,2UtI 0) U I I

CO <d C S <3 ______ ' ““ " “I — o n ^ ‘ o-o °- °. o o o °- c.fi-^u'o ooo o

o u kJ q> to ! I

w o c i kJ W Sk VI * &P|

e)tH

rk « O T-itd \ as i boa g ω ό g c n a.

o © -rk O ^ g < C tw __________ , , · o — ol o © >o O o o o o I -) Bfl- O o ooooocooo

Sk CSBO °. W O O O CO - rtO

0 k a η EH O OOr — tkk O ir- —

tu ch > as jj <t i ' I

Jki <rk 10 CU -—r I

Sk g W i—i Cg >v-k to o) bOH kJ O Λ ·Ιβ ·Η © wj: a bOr-k c ...___________

u.; , CO o T- col—IfO — COI — — JO

Sk *g - §«o* g 2-5° © °o- tu is ^ o r- ° ° σ <u as α> tu to ° ° C to tO kJ *

•rk rt |> rt JJ Q HD

c tu -rk tu o sa x

X u Μ·ιί k2S

Sk kJ tn bOw bo

•rk 4) te Π I

> ι-i α '-'I

Ί) , I---— !------------ x ! 1 i t -Η X Φ bO i cn « kJ a. i o Sk k-i ! rk · kJ 0 © j + 0 E » kH i + « · iiiiii+t m k c Sk f> ! s d il Ulig ' i

H , C £> C kJ O I

ns te -rt kk · I

b CO O c Φ ή I________ cm z 00 CM I ζί S' sii^i χ£ 2 ζώΙΧώΝ Z*

“ -S- m c\Ti- £Ml:E eo CO

m X .. &X CD X ? Ro?

S H C^OjCOto II

1-1 9 Φ Γϊ V *V X cm OO

JJ < -r- »iii «II VV m

1 "g «1^20 IX

•h ? 9 dz »n ^ ^ S

i if 54£ifi is § 8 5¾ Us· if $19¾¾ 3

C I— A ®-JQ<SJ»J,iA W G

C Bi tS H

σ < J= ««foiQlp-f W S

i -Μ A cl "tf I A ; I On ^ a Ή

1 rk 2 L -ik£LCDOiS®wIl-A U

c kc w 'dtX^JUJ. _ r-t φ Q-X St -2 59 ?alsl ro >1 i λ . Jx itiiilzi ; E *> L|= MA<STO^ro=5 -i ® o «‘i'iX * 9 sr = o. 9 a s < ti « v9 2- 1 nS-X^ £ ,i g kJ*r»i>i^ ,r( n r ^ s i j ^ ϊϊ O —

2 «Ε,Ιί ? «.®0|ί·Λ is *U S

_&______1S8±± g ,I.X I JC X Kl_ αχ < • -= 5 = > >i> ^ [ i I I . > >1>1 Ixxxlxx lx!xl I-..

8 « DK 170649 B1

De her omhandlede forbindelser forårsager hos mus en signifikant, dosisafhængig svækkelse af den ved elektrochok eller scopolamin fremkaldte amnesi ("one-trial passive avoidance test").

5 Hos mennesker virker de omhandlede peptider for bedrende på sindsstemningen, antidepressivt og anxiolytisk.

De forøger opmærksomheden over for omgivelserne, forbedrer indlærings- og hukommelsesydelsen, virker gunstige på resocialiseringsprocesser og kan anvendes ved alle syg-10 domme, post-traumatiske og degenerative hjerneskader, som er forbundet med forringet funktion af det centrale acetyl-cholinstofskifte, f.eks. en mild grad af dementia og tillige tidlige former af Alzheimer's sygdom etc. Endvidere formindsker de nævnte peptider hyperemotionaliteten.

15 Opfindelsen angår også et lægemiddel, der er ejendommeligt ved, at det indeholder en virksom mængde af en forbindelse ifølge opfindelsen og et fysiologisk tåleligt bærestof.

Opfindelsen angår fremdeles et peptid ifølge 20 opfindelsen til anvendelse som lægemiddel, især som middel til forbedring af indlærings- og hukommelsespræstationen ved behandling af posttraumatiske og degenerative hjerneskader eller til formindskelse af hyperemotionalitet.

Som lægemidler anvendes de omhandlede forbindel-25 ser, når de ikke foreligger som zwitterioner, i form af deres salte med fysiologisk uskadelige syrer, f.eks. eddikesyre, malonsyre, citronsyre og æblesyre, men også som hydrochlorid eller sulfat. Hos en voksen med normal vægt anvendes den intranasale indgivelse fortrinsvis i 30 en dosering fra 0,1 pg til 1 mg pr. dosis, men særligt foretrukket er 1 til 500, især 5 til 200 pg pr. dosis.

De her omhandlede lægemidler kan f.eks. indgives indtil 6 gange, fortrinsvis indtil 3 gange pr. dag. I mange tilfælde er det tilstrækkeligt med én dosis om dagen.

35 De omhandlede forbindelser kan også indgives subkutant med 0,001 til 10 pg/kg, fortrinsvis 0,01 til 5 pg/kg, især 0,05 til 2 pg/kg. Afhængigt af konstitutionen kan 9 DK 170649 B1 de mere eller mindre resorberes peroralt. Spillerummet for doseringerne ved peroral indgivelse er forholdsvis stort og ligger mellem 0,1 og 50 mg om dagen, fordelt på flere indgivelser. For de kraftigst virkende 5 forbindelser ligger den foretrukne enkeltdosis på 0,1 til 10 mg.

De omhandlede forbindelser kan indgives oralt eller parenteralt i et tilsvarende farmaceutisk præparat. Til en oral anvendelsesform blandes de aktive for-10 bindeiser med de dertil gængse tilsætningsstoffer, f.eks. bærestoffer, stabilisatorer eller indifferente fortyndingsmidler, og forarbejdes ved sædvanlige metoder til egnede indgivelsesformer, f.eks. tabletter, dragées, stikkapsler, vandige alkoholiske eller olieagtige sus-15 pensioner eller vandige alkoholiske opløsninger. Som indifferente bærere kan der f.eks. anvendes gummi arabi-cum, magnesiumcarbonat, kaliumphosphat, mælkesukker, glucose eller stivelse, især majsstivelse. Herved kan fremstillingen ske både som tør- og fugtighedsgranulat. Som 20 olieagtige bærestoffer eller opløsningsmidler kommer f.eks. vegetabilske og animalske olier i betragtning, f.eks. solsikkeolie eller levertran.

Til subkutan eller intravenøs indgivelse anvendes de aktive forbindelser eller deres fysiologisk accep-25 table salte, eventuelt med de dertil gængse stoffer såsom opløsningshjælpestoffer, emulgatorer eller yderligere hjælpestoffer i opløsning, suspension eller emulsion. Som opløsningsmidler til de hidtil ukendte aktive forbindelser og de tilsvarende fysiologisk acceptable salte kommer 30 f.eks. vand, fysiologiske kogsaltopløsninger eller alkoholer, f.eks. ethanol, propandiol eller glycerol, samt illige sukkeropløsninger, f.eks. glucose- eller mannitol-opløsninger, eller en blanding af de forskellige nævnte opløsningsmidler i betragtning.

35 Eksempler I de følgende fremstillingseksempler anvendes de i peptidkemien benyttede forkortelser. Yderligere, hyppigt anvendte forkortelser er følgende: DK 170649 B1 10 o DMF dimethylformamid NEM N-ethylmorpholin DCC dicyclohexylcarbodiimid DCH dicyclohexylurinstof 5 DCA dicyclohexylamin HOBt 1-hydroxybenzotriazol HOObt 3-hydroxy-4-oxo-3,4-dihydro-l,2,3-benzotriazin Z benzyloxycarbonyl

Boc tert.butyloxycarbonyl 10 Bu^" ter t. bu tyl

Me methyl

Et ethyl

Tic 1,2,3,4-tetrahydroisoquinolin-3-carboxylsyre (L-form) 15 HONp 4-nitrophenol HOTcp 2,4,5-trichlorphenol HONSu N-hydroxysuccinimid DC tyndtlagschromatograf i/tyndtlagschromatogram i løbemidlerne: 20 A: methylethylketon:pyridin:vand:eddikesyre (70:15:15:2) B: n-butanol:eddikesyre:vand (6:2:2) C: n-butanol:pyridin:eddikesyre:vand (4:1:1:5); deraf den øverste fase 25 D: heptan:tert.butanol:pyridin (3:1:1)

Eksempel 1 Z-D-Lys-Phe-NH-(CH2)g-NH2 · 2 HCl 30 a) Boc-NH-(CH2)g-NH-Boc 65 g 1,8-diaminooctan opløses i 800 ml dioxan og 400 ml vand. Der tilsættes 69 ml triethylamin og derefter 35 under vibroblanding portionsvis under 20°C 216 g di-tert.-butyl-dicarbonat. Herved udfældes allerede reaktionspro- DK 170649 B1 11 o duktet. Der efterrøres i 2 timer, og fældningen fraskilles ved filtrering, vaskes med lidt vand og tørres.

Filtratet inddampes i vakuum, idet der flere gange fraskilles en fældning ved sugning, som behandles som oven-5 for. Fældningerne samles, digereres med vand og tørres.

Udbytte: 118 g med smp. 103-104°C.

C18H36N2°4 (344'3): 10

Beregnet: C=62,75%, H=10,53%, N=6,97%;

Fundet: C=63,0 %, H=10,7 %, N=7,2 %.

b) Boc-NH-(CH2)g-NH2 · HCl 15 68 g af den ifølge a) fremstillede forbindelse suspenderes i 1 liter tør ether, som indeholder 2 N HCl.

Der omrøres i 3 timer ved stuetemperatur og afkøles til ca. 0°C, hvorefter fældningen fraskilles ved filtrering 20 og vaskes med tør ether.

Udbytte: 38 g med smp. 150-152°C (sønderd.).

C13H29C1N2°2 (208'8): 25

Beregnet: C=55,65%, H=10,4%, N=10,0%, Cl=12,6%;

Fundet: C=55,6 %, H=10,5%, N=10,2%, Cl=12,5%.

c) Z-D-Lys(Boc)-Phe-OMe 30 43,2 g Z-D-Lys(Boc)-OH, fremstillet analogt med L-forbindelsen, opløses i 400 ml dimethylformamid. Der tilsættes 24,5 g H-Phe-OMe·HCl, 15,33 g HOBt, 14,53 ml NEM og under omrøring 25 g DCC, og blandingen får lov at 35 henstå natten over ved stuetemperatur. Efter fraskillelse af urinstoffet ved filtrering afdestilleres opløsnings- 0 DK 170649 B1 12 midlet i vakuum, og den olieagtige remanens omkrystalliseres fra 200 ml 80%'s ethanol.

Udbytte: 57,9 g (94% af det teoretiske).

5

Til analyse fældes en prøve fra DMF med en blanding af ether og petroleumsether (1:1), og der krystalliseres endnu en gang fra 80%'s ethanol.

10 C29H39N3°7 (541'6):

Beregnet: C=64,31%, H=7,26%, N=7,76%;

Fundet: C=64,3 %, H=7,3 %, N=7,5 %.

15 [a]p°: + 5.5° (c = 0,5 i 90%’s eddikesyre)

d) Z-D-Lys(Boc)-Phe-OH

56,0 g af methylesteren opløses i varmen i en 20 blanding af 500 ml dioxan, 200 ml methanol og 60 ml vand og forsæbes ved pH=12,5 med 1 N NaOH inden for 150 minutter. Der indstilles under omrøring på pH=7 med 2 N HCl, de organiske opløsningsmidler afdestilleres uanset fældningen i vid udstrækning i vakuum, der tilsættes 800 ml 25 iskold eddikeester, og under isafkøling og kraftig omrøring tilsættes der forsigtigt 35 ml 2 N HCl. Lagene adskilles, og eddikeesteropløsningen vaskes med lidt vand, tørres over natriumsulfat og inddampes i vakuum. Den foreløbige olieagtige remanens krystalliserer efter 30 nogen tid, og krystallerne vaskes med petroleumsether og tørres i vakuum.

Udbytte: 50,2 g (93%) med smp. 85-87°C.

35 0 DK 170649 B1 13 C28H37N3°7 (527'6)i

Beregnet: 0=63,74%, H=7,09%, N=7,96%;

Fundet: 0=63,3 %, H=7,3 %, N=8,4 %.

5 [a]2*^: + 10,7° (c = 1 i 90%’s eddikesyre).

e) Z-D-Lys(Boc)-Phe-NH-(CH2)g-NH-Boc 10 48,5 g af det ifølge d) fremstillede dipeptid og 25,8 g af det ifølge b) fremstillede Boc-diamin-hydro-chlorid opløses i 1 liter DMF. Der tilsættes efter hinanden 14,8 g HOObt, 15 ml NEM og under afkøling 22,5 g DCC, der omrøres i 1 time, og der henstilles natten over ved 15 stuetemperatur. Der fraskilles fra urinstoffet ved filtrering, opløsningsmidlet afdestilleres i vakuum, og remanensen omkrystalliseres fra 300 ml 80%'s ethanol. Fældningen er vanskelig at fraskille ved filtrering og udvindes med fordel ved centrifugering.

20

Udbytte: 60,2 g (86,9%).

C41H62N5°8 (753'°): 25 Beregnet: 0=65,40%, H=8,30%, N=9,3%;

Fundet: 0=65,6 %, H=8,5 %, N=9,3%.

[a]2^: + 2,0° (c = 1 i 90%'s eddikesyre).

30 f) Z-D-Lys-Phe-NH-(CH2)g-NH2 · 2HC1 753 mg af den ifølge e) opnåede forbindelse henstilles i 30 minutter i 7,5 ml koncentreret HCl/vand/ myresyre (0,6:0,6:9,6). Opløsningsmidlet afdestilleres 35 i vakuum og efterdestilleres med toluen. Remanensen størkner ved henstand under ether, fraskilles ved filtrering, vaskes med ether og tørres i vakuum over KOH.

DK 170649 B1 14

Udbytte: 650 mg.

Forbindelsen er ensartet i DC på silicagel i 5 løbemiddel A.

Elementæranalyse inden for fejlgrænsen.

Eksempel 2 10 Z-D-Lys-Phe-D-Lys-Phe-Gly-NH-iC^J^-N^ * 3HC1 a) Z-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-OMe

Til 5,3 g Z-D-Lys(Boc)-Phe-OH (eksempel ld) 15 sættes der i 60 ml DMF efter hinanden under omrøring 1,26 g G-Gly-OMe * HCl, 1,6 g HOObt, 1,3 ml NEM og 2,2 g DCC. Efter henstand natten over fraskilles der fra urinstoffet ved filtrering, og filtratet inddampes i vakuum. Remanensen optages i 200 ml eddikeester, opløs-20 ningen vaskes i kulden med 10%’s citronsyreopløsning, mættet natriumhydrogencarbonatopløsning og vand og inddampes i vakuum til ca. 40 ml, hvorefter der tilsættes en blanding af ether og petroleumsether i forholdet 1:1. Fældningen fraskilles ved filtrering, vaskes med en blan-25 ding af ether og petroleumsether i forholdet 1:1 og tørres .

b) H-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-OMe, TosOH

30 4,21 g af den ifølge a) opnåede forbindelse hydrogeneres i 70 ml MeOH under titrering katalytisk med 1 N methanolisk TosOH ved pH=4,5 på Pd. Efter fraskil-lelse af katalysatoren ved filtrering afdestilleres opløsningsmidlet i vakuum, og remanensen rives flere gange 35 med diisopropylether og tørres.

Udbytte: 3,82 g? ensartet i DC (A,C).

0 DK 170649 B1 15 c) Z-D-Lys(Boc)-Phe-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-OMe

Til 5,3 g Z-D-Lys(Boc)-Phe-OH og 6,4 g H-D-Lys-(Boc)-Phe-Gly-OMe, TosOH sættes der i 100 ml DMF under 5 omrøring 1,6 g HOObt, 1,3 g NEM og 2,2 g DCC. Efter henstand natten over og fraskillelse af urinstoffet ved filtrering afdestilleres opløsningsmidlet i vakuum.

Remanensen optages i en blanding af 300 ml eddikeester og n-butanol (2:1)og vaskes som ovenfor med citronsyre-10 opløsning, natriumhydrogencarbonatopløsning og vand og tørres over natriumsulfat, hvorefter opløsningsmidlet afdestilleres i vakuum. Remanensen omkrystalliseres fra 60 ml isopropanol.

15 Udbytte: 7,0 g; ensartet i DC (A).

d) Z-D-Lys(Boc)-Phe-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-QH

5,4 g af methylesteren opløses varm i 50 ml 20 dioxan + 50 ml methanol + 20 ml vand og forsæbes med 1 N NaOH ved pH=13. Der indstilles på pH=6 i kulden med 2 N HC1, størstedelen af opløsningsmidlet afdestilleres, der tilsættes 100 ml eddikeester og 20 ml n-butanol, der syrnes i kulden med 1 N HC1 til pH=2 og vaskes med 25 vand. Den organiske fase tørres over natriumsulfat og inddampes i vakuum. Den olieagtige remanens bliver fast ved rivning med ether.

Udbytte: 5,1 g; næsten ensartet i DC (A) .

30 e) Z-D-Lys(Boc)-Phe-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-NH-(CH2)4-NH-Boc

Til 1,9 g af den ifølge d) opnåede forbindelse sættes der i 30 ml DMF 0,44 g Boc-NH-(CH9).-NH,*HC1, fremstillet ifølge Liebig's Ann. Chem. 750 (1971), 165, og under omrøring yderligere 0,27 g HOBt, 0,3 ml NEM og 0,45 g DCC. Efter henstand natten over, fraskillelse af urinstoffet ved filtrering og afdestillation af 0 DK 170649 B1 16 DMF i vakuum optages remanensen i en blanding af 60 ml eddikeester og n-butanol (1:1) og vaskes som ovenfor med citronsyreopløsning/ hydrogencarbonatopløsning og vand, hvorefter den tørres og befries for opløsningsmidlet i 5 vakuum. Remanensen omkrystalliseres fra isopropanol.

Udbytte: 1,55 g; ensartet i DC (A, C) .

f) Z-D-Lys-Phe-D-Lys-Phe-Gly-NH-(CH2)4-NH2 · 3HC1 10 582 mg opløses analogt med eksempel lf i 5,4 ml af en blanding af HC1 og HCCOH og oparbejdes som beskrevet.

15 Udbytte: 440 g; ensartet i DC (B,C) .

Eksempel 3 20 H-Phe-D-Lys-Phe-NH-(CH2)8-NH2 · 3HC1 a) Z-Phe-D-Lys (Boc) -Phe-NH- (CH2) g-NH-Boc 10,8 g H-D-Lys(Boc)-Phe-NH-(CH2)g-NH-Boc · TosOH, 25 fremstillet ud fra Z-forbindelsen analogt med eksempel 2b ved katalytisk hydrogenering i methanol ved pH=4,5 under titrering med 1 N TosOH, opløses i 100 ml DMF, og der tilsættes under omrøring efter hinanden 4,1 g Z-Phe-OH, 1,8 g HOBt, 2 ml NEM og 3,0 g DCC. Efter henstand natten 30 over fraskilles der fra urinstoffet ved filtrering, og DMF af destilleres i vakuum. Remanensen omkrystalliseres fra 50 ml 80%'s ethanol.

Udbytte: 8,2 g? ensartet i DC (A) .

35 C50H71N6°9 (900'2):

Beregnet: C=66,72%, H=7,95%, N=9,34%?

Fundet: C=66,7 %, H=7,9 %, N=9,l S.

DK 170649 Bl 17 o [α]^: + 3,0° (c = 1 i 90%'s eddikesyre).

b) H-Phe-D-Lys(Boc)-Phe-NH~(CH2)8-NH2 · HC1 5 1,0 g af den ifølge a) opnåede forbindelse hydrogeneres katalytisk analogt med eksempel 2b, idet pH-værdien dog opretholdes med 1 N HC1 i methanol.

Efter analog oparbejdning fås der 0,92 g, som er ensartet i DC (D).

10 c) H-Phe-D-Lys-Phe-NH-(CH2)8-NH2 · 3HC1

Fraspaltning af Boc-beskyttelsesgrupperne fra den ifølge b) opnåede forbindelse som i eksempel lf.

15

Udbytte: 0,86 g; næsten ensartet i DC (A,B).

Aminosyreanalyse: Phe:Lys (2,0:1,04).

Eksempel 4 20 Z-Glu-His-Phe-D-Lys-Phe-NH-(CH2)8-NH2 · 2 HC1

a) H-Phe-D-Lys(Bos)-Phe-NH-(CH2)g-NH-Boc · TosOH

25 7,5 g af den ifølge eksempel 3a fremstillede Z-forbindelse hydrogeneres katalytisk analogt med eksempel 2b i methanol og oparbejdes.

Udbytte: 7,3 g; ensartet i DC (D).

30 b) Z-Glu(OBut)-His-Phe-D-Lys(Boc)-Phe-NH-(CH2)g-NH-Boc 5,16 g af den ifølge a) opnåede forbindelse i 70 ml DMF omsættes med 2,76 g Z-Glu (OBu^) -:His-0H, 35 0,9 g HOObt, 0,7 ml NEM og 1,22 g DCC og oparbejdes ana logt med eksempel 4a. Den efter afdestillation af eddike- 18 DK 170649 B1

O

esteren tilbageblivende remanens rives flere gange med en blanding af ether og petroleumsether (1:1) og tørres.

Udbytte: 5,0 g. Ifølge DC (A,C) kun forurenet med meget 5 lidt DCH.

c) Z-Glu-His-Phe-D-Lys-Phe-NH-(CH2)8-NH2 · 2 HC1

Af 0,5 g af den ifølge b) opnåede forbindelse 10 fraspaltes der analogt med eksempel lf Boc- og Bu^grup-per og oparbejdes som beskrevet deri. Derefter opløses der endnu en gang i lidt vand, der omrøres med lidt svagt basisk ionbytter indtil pH=4,5, der filtreres, og der inddampes til tørhed i vakuum. Remanensen rives med ether 15 og tørres.

Udbytte: 0,3 g; næsten ensartet i DC (A,B). Aminosyre-analyse korrekt.

20 Eksempel 5

H-Met(0)-Glu-His-Phe-D-Lys-Phe-NH-(CH2)8“NH2 * 3 CH3COOH

a) Boc-Met-Glu(OBut)-His-Phe-D-Lys(Boc)-Phe-NH-(CH2)g)-25 -NH-BOC

Ud fra 3,75 g af den ifølge eksempel 4b opnåede forbindelse fremstilles der analogt med eksempel 2b 4.2 g H-Glu(OBut)-His-Phe-D-Lys(Boc)-Phe-NH-(CH2)g-NH-30 -Boc*TosOH. Heraf omsættes 2,56 g i 60 ml DMF med 1.2 g Boc-Met-ONP, 27 mg HOBt og 0,4 ml NEM natten over ved stuetemperatur, opløsningsmidlet afdestilleres i vakuum, og remanensen omfældes efter digerering med NaHCOg og vand fra en blanding af eddikeester og ether, 35 digereres med ether og tørres.

Udbytte: 2,2 g; ensartet i DC (C).

0 DK 170649 B1 19 b) Boc-Met (0) -Glu (OBu11) -His-Phe-D-Lys (Boc) -Phe-NH- (CH2) g--NH-Boc 1/8 g af den ifølge a) opnåede forbindelse oxideres 5 i 36 ml eddikesyre med 2 ml 3%'s Η2<02. Efter 30 minutters forløb inddampes der i vakuum, og remanensen digereres med vand og ether.

c) H-Met(0)-Glu-His-Phe-D-Lys-Phe-NH-(CH2)g-NH2 · 3CH3COOH

10 ...... ...——— -—-

Det ifølge b) opnåede råprodukt befries analogt med eksempel lf for beskyttelsesgrupperne med 25 ml af en blanding af HC1 og HC00H. Der inddampes til tørhed i vakuum, remanensen opløses i 30 ml 50%‘s methanol, be-15 handles med ionbytter Amberlite (R) IRA 93 i acetatformen, indtil pH-værdien er faldet til ca. 4,2, og filtreres, hvorefter opløsningen tørres i vakuum.

Udbytte: 1,36 g.

20

Med rensning for øje opløses der i 60 ml 1%’s eddikesyre og chromatograferes i samme opløsnings- (R) middel over en søjle 200 x 2,5 cm Sephadex' ' LH-20.

I fraktionerne 5 og 6 foreligger der 480 mg chromatogra-25 fisk ensartet peptid med korrekt aminosyreanalyse.

[a]^: + 4,9° (c = 0,5 i 90%'s eddikesyre).

I fraktion 7 foreligger der 290 mg af en blan-30 ding med det stereoisomere Met(O)-derivat.

Eksempel 6 pGlu-Glu-His-Phe-D-Lys-Phe-NH-(CH2)g-NH2 · 2 CHgCOOH 35 a) pGlu-Glu(OBut)-His-Phe-D-Lys(Boc)-Phe-NH-(CH2)g-NH-Boc 1,6 g H-Glu(OBut)-His-Phe-D-Lys-Phe-NH-(CH2)g--NH-Boc * TosOH (eksempel 5a) og 370 mg pGlu-OTcp 0 DK 170649 B1 20 bringes til reaktion natten over i 20 ml DMF i nærværelse af 0,17 ml NEM og 17 mg HOBt. Opløsningsmidlet afdestilleres i vakuum, og remanensen digereres med ether.

5

Udbytte: 1,6 g. ' ^ b) Det under a) opnåede råprodukt befries analogt med eksempel lf for beskyttelsesgrupperne og renses 10 chromatografisk analogt med eksempel 5c. Der fås 465 mg af den i DC (C) ensartede titelforbindelse. Aminosyre-analyse korrekt.

Eksempel 7 15

Z-Tyr-Glu-His-Phe-D-Lys-Phe-NH-(CH2)g-NH2 · 2 CHgCOOH

1,28 g af det i eksempel 5a beskrevne delbeskyttede pentapeptid omsættes i 20 ml DMF med 610 mg 20 Z-Tyr(Bu )-0NSu i nærværelse af 13,5 mg HOBt og 0,13 ml NEM. Efter henstand natten over afdestilleres opløsningsmidlet i vakuum. Remanensen behandles efter rivning med ether analogt med eksempel lf med en blanding af HC1 og HCOOH. Efter afdestillation af opløsningsmidlet 25 chromatograferes der analogt med eksempel 5c.

Udbyttet af chromatografisk ensartet peptid er 360 mg. Aminosyreanalyse korrekt.

Eksempel 8 30

H-Tyr-Glu-His-Phe-D-Lys-Phe-NH-(CH2)8-NH2 · 3 CHgCOOH

Der gås frem som i eksempel 7, idet der dog t * anvendes 565 mg Boc-Tyr(Bu )-ONSu, og der fås 280 mg 35 af titelforbindelsen.

Ensartet i DC (C). Aminosyreanalyse korrekt.

0 DK 170649 B1 21

Eksempel 9 H-Met(02)-Glu-His-Phe-D-Lys-Phe-NH-(CH2)8-NH2 · 3HC1 5 a) Boc-Met(02)-Glu(OBu^)-His-Phe-D-Lys(Boc)-Phe-NH--(CH2)g-NH-Boc — '

Til 370 mg Boc-Met (C>2)-OH og 1,4 g H-GlufOBu^--His-Phe-D-Lys(Boc)-Phe-NH-(CH2)g-NH-Boc *TosOH sættes 10 der i 25 ml DMF 0,14 ml NEM og 150 mg HOBt. Der tilsættes 242 mg DCC og efter 30 minutters forløb endnu en gang 0,07 ml NEM, og der oparbejdes efter henstand natten over. Råproduktet opløses i fugtig eddikeester og vaskes efter hinanden med 10%'s KHS0^/K2S0^-opløsning, 15 mættet natriumhydrogencarbonatopløsning og vand, og eddikeesteropløsningen tørres kort over natriumsulfat, inddampes til et lille rumfang og dryppes under kraftig omrøring i ether.

20 Udbytte af uopløseligt råprodukt: 1,1 g.

b) H-Met(02)-Glu-His-Phe-D-Lys-Phe-NH-(CH2)g-NH2 · 3CH3COOH

650 mgaf den ifølge a) opnåede forbindelse 25 befries analogt med eksempel 5 . for beskyttelsesgrupperne og oparbejdes.

Udbytte: 520 mg.

30 350 mg opløses i 2 ml 1 N eddikesyre og chroma- tograferes på Sephadex^ LH 20 (2,5 x 100 cm). De i DC ensartede hovedfraktioner forenes og lyofiliseres.

Udbytte: 230 mg; ensartet i DC (C). Aminosyreanalyse 35 korrekt.

0 DK 170649 B1 22

Eksempel 10' Z-Glu-Ala-Phe-D-Lys-Phe-NH-(CH2)8-NH2 ♦ 2 HC1 5 a) Z-Ala-Phe-D-Lys(Boc)-Phe-NH-(CH2)g-NH-Boc

Til 20,85 g delbeskyttet tripeptid (eksempel 3b) og 4,95 g Z-Ala-OH sættes der i 300 ml DMF under omrøring 12,7 g HOBt, 2,84 g NEM og 4,88 g DCC. Efter henstand 10 natten over fraskilles der fra DCH ved filtrering, og opløsningsmidlet afdestilléres i vakuum. Der fældes to gange fra en blanding af ethanol og vand og tørres i vakuum.

15 Udbytte: 18,5 g.

[a]^®: -11° (c = 1, i 90%'s eddikesyre).

C53H77N7O10 (972,3): 20

Beregnet: C=65,47%, H=7,98%, N=10,09%;

Fundet: C=65,6 %, H=8,0 %, N=10,3 %.

b) H-Ala-Phe-D-Lys(Boc)-Phe-NH-(CH2)g-NH-Boc · TosOH 25 16 g af den ifølge a) fremstillede Z-forbindelse hydrogeneres katalytisk i en blanding af methanol og DMF under tilsætning af 1 N TosOH ved pH=6 på Pd. Der fraskilles fra katalysatoren ved filtrering, der klares 30 med aktive kul, opløsningsmidlet afdestilleres, og remanensen rives med eddikeester.

Udbytte efter tørring: 12,4 g.

35 0 DK 170649 B1 23 ^55^84^8^12 (1081,35):

Beregnet: C=61,09%, H=7,83%, N=10,36%, S=2,9%;

Fundet: C=60,9 %, H=7,8 %, N=10,2 %, S=3,2%.

5 c) Z-Glu- (OBut) -Ala-Phe-D-Lys (Boc)-Phe-NH- (CH2) g-NH-Boc

Til 5,0 g af den ifølge b) opnåede forbindelse sættes der i 50 ml DMF 2,03 g Z-Glu (OBut)-OH og derefter 10 under omrøring 675 mg HOBt, 0,71 ml NEM og 1,13 g DCC.

Efter henstand natten over fraskilles DCH ved filtrering, opløsningsmidlet afdestilleres, og remanensen optages i en blanding af n-butanol og eddikeester (1:1), vaskes med natriumhydrogencarbonatopløsning og vand og tørres 15 over Na2SO^. Den efter afdestillation af opløsningsmidlet tilbageblivende remanens digereres med ether og tørres.

Udbytte: 5,24 gjensartet i DC (D).

20 d) Z-Glu-Ala-Phe-D-Lys-Phe-NH-(CH2)g-NH2 · 2 HC1 300 mg af den ifølge c) opnåede forbindelse behandles som i eksempel If til fraspaltning af beskyttelsesgrupperne. Remanensen rives med ether efter opar-25 bejdning og tørres.

Udbytte: 160 mg.

Ensartet i DC (D) . U3^°: -15° (c = 1, i MeOH) .

Aminosyreanalyse korrekt.

30

Eksempel 11 Η-Met(02)-Glu-Ala-Phe-D-Lys-Phe-NH-(CH2)g-NH2 · 3HC1 35 a) Boc-Met(02)-Glu(OBut)-Ala-Phe-D-Lys(Boc)-Phe-NH--(CH2)8-NH-Boc

Til 1,2 g af den ifølge eksempel 12a fremstillede 0 DK 170649 B1 24 H-Glu(ΟΒιΛ -Ala-Phe-D-Lys(Boc)-Phe-NH-(CHj)g-NH-Boc · TosOH sættes der i DMF 344 mg Boc-Met(02)-OH, 137 mg HOBt, 013 ml NEM og 225 mg DCC, og dette får efter omrøring til at begynde med lov til at henstå i 15 timer. Der fraskilles 5 ved filtrering, opløsningsmidlet afdestilleres i vakuum, og remanensen rives med vand og ether.

Udbytte: 1,2 g. Forbindelsen indeholder stadig lidt DCH, men er ellers ensartet i DC (A,D).

10 b) H-Met(02)-Glu-Ala-Phe-D-Lys-Phe-NH-(CH2)8-NH2 · 3HC1

Den ifølge a) fremstillede forbindelse behandles analogt med eksempel lf med en blanding af myresyre og HCl 15 og oparbejdes. Derefter opløses der endnu en gang i vand, og der filtreres og tørres i vakuum. Remanensen rives i eddikeester og tørres.

Udbytte af 1,0 g: 0,78 g. Ensartet i DC (A,B,C).

20 [a}^°: - 12,5° (c = 1, methanol).

Aminosyreanalyse korrekt.

25 Eksempel 12

Glutaroyl-Glu-Ala-Phe-D-Lys-Phe-NH-(CH0)0-NH0 · 2 HCl ____ ______ Å o 2 a) Glutaroyl-Glu(OBut)-Ala-Phe-D-Lys(Boc)-Phe-NH-(CH2)-30 -NH-BOC “ ---~~ 1,2 g H-Glu(OBufc)-Ala-Phe-D-Lys(Boc)-Phe-NH--(CH2)q-NH-Boc - TosOH, fremstillet ved katalytisk hydrogenering af den ifølge eksempel 10c fremkomne Z-forbin- 35 delse, opløses i 10 ml pyridin. Der tilsættes 140 mg glu- 0 DK 170649 B1 25 tarsyre-anhydrid, og blandingen får lov til at reagere i 15 timer ved stuetemperatur. Den efter inddampning i vakuum tilbageblivende remanens rives med eddikeester, og det faste produkt fraskilles ved filtrering, vaskes med 5 ether og tørres.

Udbytte: 1,08 g; ensartet i DC (A,B,C). b) Glutaroyl-Glu-Ala-Phe-D-Lys-Phe-NH-(CH2)g-NH2 · 2HC1 10 0,9 g af den ifølge a) opnåede forbindelse behandles analogt med eksempel lf med en blanding af myresyre og HC1.

15 Udbytte: 0,6 g.

[a]^°: - 19,6° (c = 1, methanol).

Aminosyre- og elementæranalyse korrekt.

20

Ved opløsning i vand, behandling med svagt basiske ionbyttere indtil pH=5-6 og inddampning af den filtrerede opløsning opnås titelforbindelsen.

25 Eksempel 13 Z-Ala-Ala-Phe-D-Lys-Phe-NH-(CH2)8-NH2 · 2 HC1 a) Z-Ala-Ala-Phe-D-Lys(Boc)-Phe-NH-(CH2)g-NH-Boc 30 20,85 g delbeskyttet tripeptid (eksempel 3b) omsættes i 200 ml DMF med 6,53 g Z-Ala-Ala-OH, 12,66 g HOBt, 2,84 ml NEM og 4,9 g DCC og oparbejdes analogt med eksempel 4a.

35 0 DK 170649 B1 26

Udbytte: 16,7 g; ensartet i DC (C,D).

[a]p°: - 12,0° (c = 1, i 90%'s eddikesyre).

5 C56H82N8°U (10*3,3) :

Beregnet: C=64,47%, H=7,92%, N=10,74%;

Fundet: C=64,2 %, H=8,0 %, N=10,6 %.

10 b) Z-Ala-Ala-*Phe-D-Lys-Phe-NH-(CH2) 8“NH2 · 2 HC1 500 mg af den ifølge a) opnåede forbindelse befries analogt med eksempel If for beskyttelsesgrupperne. Forbindelsen er allerede uden chromatografisk 15 rensning ensartet i DC (D).

[a]^: - 15,2° (c = 1, i 90%’s eddikesyre).

20 C46H68C12N8°7 (916'ο)ϊ

Beregnet: C=60,32%, H=7,98%, N=12,23%, Cl=7,74%;

Fundet: C=60,l %, H=7,9 %, N=12,l %, Cl=7,9 %.

Aminosyreanalyse korrekt.

25

Eksempel 14 H-Gly-Ala-Ala-Phe-D-Lys-Phe-NH-(CH2)g-NH2 · 3 HCl 30 a) H-Ala-Ala-Phe-D-Lys(Boc)-Phe-NH-(CH2)g-NH-Boc · TosOH 1 35 g af den ifølge eksempel 13a opnåede forbindelse hydrogeneres katalytisk og oparbejdes ifølge eksempel 10 b· 0 DK 170649 B1 27

Udbytte: 12,9 g.

C55H84N8°12S (1081,35): 5 Beregnet: 061,09%, H=7,83%, N=10,36%, S=2,96%;

Fundet: C=60,9 %, H=7,8 %, N=10,2 %, S=3,2 %.

b) Boc-Gly-Ala-Ala-Phe-D-Lys(Boc)-Phe-NH-(CH2)g-NH-Boc 10 973 mg af den ifølge a) opnåede forbindelse omsæt tes i 10 ml DMF med 260 mg Boc-Gly-ONSu, og titelforbindelsen isoleres efter afdestillation af opløsningsmidlet i vakuum ved rivning med eddikeester.

15 Udbytte: 850 mg; ensartet i DC (D).

C55H87N9°12 (1066'37);

Beregnet: C=61,95%, H=8,22%, N=ll,82%; 20 Fundet: C=61,8 %, H=8,3 %, N=ll,6 %.

c) H-Gly-Ala-Ala“Phe-D-Lys-Phe-NH-(CH2)8-NH^ 3HC1 800 mg af den ifølge b) opnåede forbindelse 25 befries analogt med eksempel lf for beskyttelsesgrupperne.

Udbytte: 610 mg; ensartet i DC (B,D).

[a]^: - 24,0° (c = 1, i methanol) 30 C40H66C13N9°6 (875,34):

Beregnet: C=54,88%, H=7,60%, N=14,4%, Cl=12,5%;

Fundet: C=55,0 %, H=7,5 %, N=14,2%, Cl=12,8%.

Aminosyreanalyse korrekt.

35 H-Tyr-Ala-Ala-Phe-D-Lys-Phe-NH-(CH2)8-NH2 · 3 HCl

Eksempel 15 DK 170649 B1 28 o

A

5 0,97 g af den ifølge eksempel 10a opnåede for bindelse omsættes i 10 ml DMF med 435 mg Boc-Tyr(Bu^)--ONSu under tilsætning af 0,13 ml NEM. Oparbejdning ifølge eksempel 6a. Produktet (0,8 g) befries derefter analogt med eksempel lf for beskyttelsesgrupperne.

10

Udbytte: 0,65 g.

[aj^: - 15,0° (c = 1, methanol), 15 Ensartet i DC (A,B,C).

Aminosyreanalyse korrekt.

Eksempel 16 20 Glutaroyl-Ala-Ala-Phe-D-Lys-Phe-NH-(CH2)g-NH2 · 2 HCl

Det ifølge eksempel 14 a opnåede delbeskyttede peptid omsættes analogt med eksempel 12 a med glutarsyre--anhydrid, beskyttelsesgrupperne fraspaltes, og der opar-25 bejdes som beskrevet.

[a]^°: - 19,6° (c = 1, methanol).

Aminosyreanalyse korrekt. Ved opløsning i vand og behand-30 ling med svagt basisk ionbytter indtil en pH-værdi på 5-6 fås mono-hydrochloridet, som isoleres ved inddampning af opløsningen og rivning af remanensen med ether.

a 35 H-Met(02)-Ala-Ala-Phe-D-Lys-Phe-NH-(CH2)8-NH2 · 3 HC1 0

Eksempel 17 DK 170649 B1 29 5 Analogt med eksempel 9 fås titelforbindelsen ud fra det ifølge eksempel 14a fremstillede peptid og ved fraspaltning af beskyttelsesgrupperne.

[a]^°: - 15,3° (c = 1, methanol).

10

Aminosyreanalyse korrekt. Ensartet i DC (A,B,C).

Eksempel 18 15 Z-D-Lys-Phe-NH-(CH2)9-NH2 · 2 HC1 a) Z-D-Lys(Boc)-Phe-NH-(CH2)g-NH-Boc 27 g NH2-(CH2)9-NH-Boc, HC1, fremstillet analogt 20 med eksempel la-b, omsættes analogt med eksempel le med 48 g Z-D-Lys-Phe-OH og oparbejdes.

Udbytte: 61,9 g.

25 [a]D: + 1/9° (c = 1, i methanol) C42H64N5°8 <767'°>:

Beregnet: C=65,77%, H=8,41%, N=9,13%; 30 Fundet: C=65,2 %, H=8,5 %, N=9,0 %.

b) Z-D-Lys-Phe-NH-(CH2)9-NH2 · 2HC1

Ved fraspaltning af beskyttelsesgrupperne fra 35 den ifølge a) fremstillede forbindelse analogt med eksempel lf opnås titelforbindelsen i chromatografisk ensartet form (AfB). Elementæranalyse korrekt.

Eksempel 19

H-Met(02)-Giu-His-Phe-D-Lys-Phe-NH-(CH2)9-NH2 · 3CH3COOH

0 DK 170649 B1 30 5 Fra det ifølge eksempel 18a opnåede peptidderi vat fraspaltes 1-gruppen analogt med eksempel 3a, hvorefter der omsættes med Z-Phe-OH som beskrevet deri. Derpå fraspaltes Z-gruppen analogt med eksempel 3b, og der gås yderligere frem som angivet i eksempel 4b og 9a. Herved 10 fås den beskyttede titelforbindelse, fra hvilken beskyttelsesgrupperne fraspaltes ifølge eksempel lf. Oparbejdning og rensning ifølge eksempel 5c. Aminosyreana-lyse korrekt.

15 Eksempel 20

H-Met(02)-Glu-His-Phe-D-Lys-Phe-NH-(CH2)1q-NH2 · 3CH3COOH

Der gås frem som angivet i eksempel 18a og 19, 20 idet der dog i første trin anvendes NH2~(CH2)^q-NH--Boc · HC1.

Titelforbindelsen er efter rensning analogt med eksempel 5c chromatografisk ensartet og viser en korrekt aminosyreanalyse.

25

Eksempel 21

H-Met(02)-Glu-His-Phe-D-Lys-Phe-NH-(CH2)6-NH2 · 3CH3COOH

30 Der gås frem analogt med eksempel 20, idet der dog som basisk gruppe anvendes NH2~(CH2)g-NH-Boc · HC1.

35

Claims

31 DK 170649 B1 PATENTKRAV.

1. Corticotropinderivater, kendetegnet ved, at de har den almene formel 5 R4-D-Lys-Phe-NH-(CH2)n-NH2 (X) i hvilken R4 betyder over Na bundet benzyloxycarbonyl (Z) eller 10 R1 - A2 - A3 - Phe, hvori R1 betyder glutaroyl, H-Met(O), H-Met(02), Η-Tyr eller pyroglutamyl, A2 betyder Glu eller Ala,, A3 betyder His eller Ala, og 15. er et helt tal fra 4 til 10, eller er fysiologisk tålelige salte deraf, idet dog forbindelsen Η-Met(O)-Glu-His-Phe-D-Lys-Phe-NH-(CH2)8“NH2 er undtaget.

2. Peptid ifølge krav 1, kendetegnet 20 ved, at n er et helt tal fra 6 til 10.

3. Peptid ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at R1 betyder H-Met(O), og at sulfinylgruppen foreligger i R- eller S-konfigurationen.

4. Peptid ifølge krav 1 eller 2, kendeteg-25 net ved, at R1 betyder H-Met(02).

5. Peptid ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at R1 betyder H02C-(CH2)3-CO-.

6. Peptid ifølge ethvert af kravene 1-6, kendetegnet ved, at n er tallet 8.

7. Peptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det har formlen H-Met(02)-Glu-His-Phe-D-Lys-Phe-NH-(CH2)g~NH2 eller er et fysiologisk tåleligt salt deraf.

8. Peptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det har formlen Η-Met(02)-Ala-Ala-Phe-D-Lys-Phe-

35 NH-(CH2)s"NH2 eller er et fysiologisk tåleligt salt deraf.

9. Peptid ifølge krav 1, kendetegnet 32 DK 170649 B1 ved, at det har formlen HOOC-(CH2)3-CO-Glu-Ala-Phe-D-Lys-Phe-NH-(CH2)8-NH2 eller er et fysiologisk tåleligt salt deraf.

10. Peptid ifølge krav 1, kendetegnet 5 ved, at det har formlen Η-Met(O)-Glu-His-Phe-D-Lys-Phe-NH-(CH2)6-NH2 ©Her er et fysiologisk tåleligt salt deraf.

11. Peptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det har formlen Η-Met(02)-Glu-Ala-Phe-D-Lys-Phe-NH-{CH2)8_NH2 eller er et fysiologisk tåleligt salt deraf.

12. Peptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det har formlen H-Tyr-Glu-His-Phe-D-Lys-Phe-NH-(CH2)8"NH2 eller er et fysiologisk tåleligt salt deraf.

13. Peptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det har formlen pyro-Glu-Glu-His-Phe-D-Lys-Phe-NH- 15 (CH2)g-NH2 eller er et fysiologisk tåleligt salt deraf.

14. Lægemiddel, kendetegnet ved, at det indeholder en virksom mængde af en forbindelse ifølge ethvert af kravene 1-13 og et fysiologisk tåleligt bærestof.

15. Peptid ifølge ethvert af kravene 1-13 til anvendelse som lægemiddel.

16. Peptid ifølge ethvert af kravene 1-13 til anvendelse som middel til forbedring af indlærings- og hukommelsespræstationen ved behandling af posttraumatiske 25 og degenerative hjerneskader eller til formindskelse af hyperemotionalitet.

17. Fremgangsmåde til fremstilling af et cor-ticotropinderivat ifølge ethvert af kravene 1-13, kendetegnet ved, at et fragment med N-terminal, fri 30 aminogruppe kondenseres med et fragment med C-terminal, fri carboxylgruppe, idet der i disse fragmenter beskyttet foreligger primære og sekundære aminogrupper med surt fraspaltelige beskyttelsesgrupper af urethantypen og carb-oxylgrupper med surt fraspaltelige beskyttelsesgrupper af 5 35 estertypen, som ikke deltager i reaktionen, og at de i de således fremkomne forbindelser til beskyttelse af amino- - 33 DK 170649 B1 eller carboxylgrupper indførte beskyttelsesgrupper fraspaltes surt, hvorefter forbindelserne eventuelt omdannes til deres fysiologisk acceptable salte.