MX2010008249A - Genes de glicosilacion termofilica y termoacidofilica y enzimas a partir de alicyclobacillus acidocaldarius y metodos, organismos relacionados. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a secuencias de ácido nucleico y polipéptidos aislados y/o purificados que codifican polipéptidos a partir de Alicyclobacillus acidocaldarius; además se proporcionan métodos para glicosilas y/o post-traduccionalmente modificar proteínas usando secuencias de ácido nucleico y polipéptidos aislados y/o purificados a partir de Alicyclobacillus acidocaldanus.

Description

GENES DE GLICOSILACION TERMOFILICA Y TERMOACIDOFILICA Y ENZIMAS A PARTIR DE ALICYCLOBACILLUS ACIDOCALDARIUS Y METODOS. ORGANISMOS RELACIONADOS Í REFERENCIA CRUZADA A LAS SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica el beneficio de la fecha de presentación de la Solicitud de Patente Provisional Estadounidense Serie Número 61/031 ,984, presentada el 27 de Febrero de 2008, para "GENES DE GLICOSILACIÓN TERMOFÍLICA Y TERMOACIDOFILICA Y ENZIMAS A PARTIR DE ALICYCLOBACILLUS ACIDOCALDARIUS Y MÉTODOS, ORGANISMOS RELACIONADOS".

DERECHOS GUBERNAMENTALES El gobierno Estadounidense tiene ciertos derechos en esta invención, conforme al Contrato No. DE-AC07-99ID13727 y Contrato No. DE-AC07-05ID14517, entre el Departamento de Energía Estadounidense y Battelle Energy Alliance, LLC.

CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere en general, a biotecnología. Más específicamente, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados y/o purificados y secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos a partir de Alicyclobacillus acidocaldarius y métodos para su uso.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Se ha creído hasta hace muy poco, que las bacterias en general, no glicosílan sus proteínas. Si bien ha habido algunos casos reportados, estos fueron descartados como anomalías inusuales (Borman 2006). Ahora está siendo cada vez más aceptado, que las bacterias no glicosílan sus proteínas en quizás más formas que la que lo hacen los eucariotas, aunque esta creencia no es todavía distribuida (Scháffer et al. 2001 ). En un artículo revisado reciente, se dice que la glicosilación se ha demostrado por ayudar en la estabilidad de la proteína, modular las propiedades físicas tales como solubilidad, proteger contra la proteólisis, modificar perfiles de actividad, y objetivo para externalización (Upreti et al. 2003). En 1994, un grupo purificó una amilasa de Alicyclobacillus acidocaldarius y mostró que la amilasa fue bien unida, no glicosílada e insoluble durante el crecimiento activo (Schwerman et al., 1994). Como la fase estacionaria entra al cultivo, las células liberan vahas versiones glicosiladas solubles de la amilasa en el medio (Schwejrnan et al., 1994). No se han hecho intentos para comparar las actividades de las varias formas de las amilasas.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Modalidades de la invención se refieren a secuencias de nucleótidos aislados y/o purificados del genoma de Alicyclobacillus acidocaldarius, o un homólogo o fragmento del mismo. En una modalidad de la invención, la secuencia de nucleótido se selecciona a partir de al menos una de las SEQ ID NOs:. 2, 19, 36, 53, 70, 87, 104, 121 , 138, 155, 172, 189, 206, 223, 240, 257, 274, 291 , y 310 o un homólogo o fragmento del mismo. En otra modalidad de la invención, el homólogo se selecciona a partir del grupo que consiste de una secuencia de nucleótido que tiene al menos, 80% de identidad de secuencia con al menos una de las SEQ ID NOs:. 2, 19, 36, 53, 70, 87, 104, 121 , 138, 155, 172, 189, 206, 223, 240, 257, 274, 291 , y 310. Modalidades de la invención pueden además, referirse a una secuencia de ácido nucleico aislado y/o purificado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido seleccionado a partir del grupo que consiste de un polipéptido que tiene al menos, 90% de identidad de secuencia con al menos una de las SEQ ID NOs:. 1 , 18, 35, 52, 69, 86, 103, 120, 137, 154, 171 , 188, 205, 222, 239, 256, 273, 290, y 309. Modalidades de la invención también se refieren a polipéptidos aislados y/o purificados codificados por una secuencia de nucleótido que comprende una secuencia de nucleótido del genoma de Alicyclobacillus acidocaldarius, o un homólogo o fragmento del mismo. En una modalidad, la secuencia de nucleótido comprende una secuencia de nucleótido seleccionada a partir del grupo que consiste de una secuencia de nucleótido que tiene al menos, 80% de identidad de secuencia con al menos una de las SEQ ID NOs:. 2, 19, 36, 53, 70, 87, 104, 121 , 138, 155, 172, 189, 206, 223, 240, 257, 274, 291 , y 310. En otra modalidad de la invención, la secuencia de nucleótido comprende una secuencia de nucleótido seleccionada a partir de al menos una de las SEQ ID NOs:. 2, 19, 36, 53, 70, 87, 104, 121 , 138, 155, 172, 189, 206, 223, 240, 257, 274, 291 , y 310 o un homólogo o fragmento del mismo. En todavía otra modalidad, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácido de las SEQ ID NOs:. 1 , 18, 35, 52, 69, 86, 103, 120, 137, 154, 171 , 188, 205, 222, 239, 256, 273, 290, y 309. En aún otra modalidad, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que consiste de un polipéptido que tiene al menos, 90% de identidad de secuencia con al menos una de las SEQ ID NOs:. 1 , 18, 35, 52, 69, 86, 103, 120, 137, 154, 171 , 188, 205, 222, 239, 256, 273, 290, y 309. En modalidades de la invención, los polipéptidos pueden ser acidofílicos y/o termofílicos. En modalidades adicionales, los polipéptidos pueden ser glicosilados, pegilados, y/o de otro modo post-traduccionalmente modificados. Modalidades de métodos incluyen, glicosilar o post- traduccionalmente modificar un primer polipéptido usando un segundo polipéptido seleccionado a partir del grupo que consiste de un polipéptido que tiene al menos, 90% de identidad de secuencia con las SEQ ID NOs:. 1 , 18, 35, 52, 69, 86, 103, 120, 137, 154, 171 , 188, 205, 222, 239, 256, 273, 290, y 309. Modalidades adicionales de los métodos incluyen, métodos para modular la estabilidad de la proteína, solubilidad, degradación, perfil de actividad, y/o externalización de un primer polipéptidos, los métodos comprenden glicosilar o post-traduccionalmente modificar el primer polipéptido vía un segundo polipéptido seleccionado a partir del grupo que consiste de un polipéptido que tiene al menos, 90% de identidad de secuencia con las SEQ ID NOs:. 1 , 18, 35, 52, 69, 86, 103, 120, 137, 154, 171 , 188, 205, 222, 239, 256, 273, 290, y 309. Modalidades adicionales de los métodos incluyen, colocar una célula que produce o codifica una secuencia de nucleótido recombinante, purificado y/o aislado, que comprende una secuencia de nucleótido seleccionado a partir del grupo que consiste de una secuencia de nucleótidos que tiene al menos, 90% de identidad de secuencia con al menos una de las secuencias de las SEQ ID NOs: 2, 19, 36, 53, 70, 87, 104, 121 , 138, 155, 172, 189, 206, 223, 240, 257, 274, 291 , y 310 y/o un polipéptido recombinante, purificado y/o aislado, seleccionado a partir del grupo que consiste de un polipéptido que tiene al menos, 90% de identidad de secuencia con al menos una de las secuencias de las SEQ ID NOs:. 1 , 18, 35, 52, 69, 86, 103, 120, 137, 154, 171 , 188, 205, 222, 239, 256, 273, 290, y 309 en un ambiente que comprende temperaturas en o por arriba de aproximadamente 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, y/o 95°C y/o un pH en, por debajo de y/o por arriba de 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 , y/o 0. Estos y otros aspectos de la invención llegarán a ser aparentes para el experto en la técnica, en vista de las enseñanzas contenidas en la presente.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La FIG. 1 representa un alineamiento de secuencia entre la SEQ ID NO: 1 (RAAC00164) y ref|YP_00 223775.11, ref|YP_729290.1 |, ref|ZP_01084440.1 |, ref|ZP_01079150.11, y ref |ZP_01471594.11 (SEQ ID NOs: 3-7) respectivamente, en la cual, todas tienen la función asignada a la SEQ ID NO: 1 eri el cuadro 1. Aminoácidos conservados entre todas las secuencias están indicados por un "*" y en general, aminoácidos conservados están indicados por un La FIG. 2 representa un alineamiento de secuencia entre la SEQ ID NO: 18 (RAAC00517) y ref|ZP_00589533.1 |, ref|ZP_01386435.1 |, ref|YP_378533.1 |, ref|ZP_00513158.1 |, y ref|YP_374173.1 | (SEQ ID NOs: 20-24) respectivamente, en la cual, todas tienen la función asignada a la SEQ ID NO: 18 en el cuadro 1. Aminoácidos conservados entre todas las secuencias están indicados por un "*" y en general, aminoácidos conservados están indicados por un La FIG. 3 representa un alineamiento de secuencia entre la SEQ ID NO: 35 (RAAC00650) y ref|YP_001 127183.11, ref|ZP_02038504.1 |, ref|YP_001647987.1 |, ref|YP_0013771 14.11, y ref|NP_835081.1 | (SEQ ID NOs: 37-41) respectivamente, en la cual, todas tienen la función asignada a la SEQ ID NO: 35 en el cuadro 1 . Aminoácidos conservados entre todas las secuencias están indicados por un "*" y en general, aminoácidos conservados están indicados por un ":". La FIG. 4 representa un alineamiento de secuencia entre la SEQ ID NO: 52 (RAAC00991) y ref|ZP_02327412.1 |, ref|YP_001487207.1 |, ref|ZP_01 172765.11, ref|NP_831314.1 |, y ref|NP_844008.1 | (SEQ ID NOs: 54-58) respectivamente, en la cual, todas tienen la función asignada a la SEQ ID NO: 52 en el cuadro 1. Aminoácidos conservados entre todas las secuencias están indicados por un "*" y en general, aminoácidos conservados están indicados por un ":". Las FIGs. 5A y 5B representan un alineamiento de secuencia entre la SEQ ID NO: 69 (RAAC01 1 10) y ref|YP_001519856.1 |, ref|YP_711688.1 |, ref|ZP_0 33193 .11, ref|YP_001076955.1 |, y ref|YP_336440.1 | (SEQ ID NOs: 71-75) respectivamente, en la cual, todas tienen la función asignada a la SEQ ID NO: 69 en el cuadro 1. Aminoácidos conservados entre todas las secuencias están indicados por un "*" y en general, aminoácidos conservados están indicados por un":". Las FIGs. 6A y 6B representan un alineamiento de secuencia entre la SEQ ID NO: 86 (RAAC01166) y gb|AAR99615.1 |, gb|ABM68334.2|, ref|ZP_01372248.11, ref|YP_519555.1 |, y ref|ZP_02234077.1 | (SEQ ID NOs: 88-92) respectivamente, en la cual, todas tienen la función asignada a la SEQ ID NO: 86 en el cuadro 1. Aminoácidos conservados entre todas las secuencias están indicados por un "*" y en general, aminoácidos conservados están indicados por un La FIG. 7 representa un alineamiento de secuencia entre la SEQ ID NO: 103 (RAAC01 167) y ref|ZP_01515212.11, ref| YP_001277643.1 |, ref|ZP_02291400.1 |, ref|YP_001633727.1 |, y ref|YP_001434357.1 | (SEQ ID NOs: 105-109) respectivamente, en la cual, todas tienen la función asignada a la SEQ ID NO: 103 en el cuadro 1. Aminoácidos conservados entre todas las secuencias están indicados por un "*" y en general, aminoácidos conservados están indicados por un Las FIGs. 8A y 8B representan un alineamiento de secuencia entre la SEQ ID NO: 120 (RAAC01170) y ref |YP_001324592.11 , ref|YP_342776.1 |, ref|NP_780975.1 |, ref|YP_001636830.1 |, y ref|YP_001299026.1 | (SEQ ID NOs: 122-126) respectivamente, en la cual, todas tienen la función asignada a la SEQ ID NO: 120 en el cuadro 1. Aminoácidos conservados entre todas las secuencias están indicados por un "*" y en general, aminoácidos conservados están indicados por un ":". La FIG. 9 representa un alineamiento de secuencia entre la SEQ ID NO: 137 (RAAC01248) y ref|ZP_02170160.11, ref|ZP_01 171895.11, ref|YP_076646.1 |, ref|YP_590910.1 |, y ref|ZP_02175410.1 | (SEQ ID NOs: 139-143) respectivamente, en la cual, todas tienen la función asignada a la SEQ ID NO: 137 en el cuadro 1. Aminoácidos conservados entre todas las secuencias están indicados por un "*" y en general, aminoácidos conservados están indicados por un Las FIGs. 10A y 10B representan un alineamiento de secuencia entre la SEQ ID NO: 154 (RAAC01348) y ref|ZP_01665289.1 |, ref|ZP_01643350.11, gb|AAW77167.1 |, ref|YP_452722.1 |, y ref|ZP_02241787.11 (SEQ ID NOs: 156-160) respectivamente, en la cual, todas tienen la función asignada a la SEQ ID NO: 154 en el cuadro 1. Aminoácidos conservados entre todas las secuencias están indicados por un "*" y en general, aminoácidos conservados están indicados por un La FIG. 1 representa un alineamiento de secuencia entre la SEQ ID NO: 171 (RAAC01377) y ref|YP_147952.1 |, ref|YP_520670.1 |, ref|YP_001395809.1 |, ref|YP_001309701.11, y ref|YP_001643660.11 (SEQ ID NOs: 173-177) respectivamente, en la cual, todas tienen la función asignada a la SEQ ID NO: 171 en el cuadro 1. Aminoácidos conservados entre todas las secuencias están indicados por un "*" y en general, aminoácidos conservados están indicados por un La FIG. 12 representa un alineamiento de secuencia entre la SEQ ID NO: 188 (RAAC0161 1) y ref|YP_146214.1 |, ref|YP_001 124463.11, ref|NP_865262.1 |, ref|YP_426013.1 |, y ref|ZP_01885526.1 | (SEQ ID NOs: 190-194) respectivamente, en la cual, todas tienen la función asignada a la SEQ ID NO: 188 en el cuadro 1. Aminoácidos conservados entre todas las secuencias están indicados por un "*" y en general, aminoácidos conservados están indicados por un Las FIGs. 13A y 13B representan un alineamiento de secuencia entre la SEQ ID NO: 205 (RAAC01612) y ref|YP_146215.1 |, ref|YP_001 124464.1 |, ref|YP_074948.1 |, ref|YP_001039503.1 |, y ref|NP_621770.11 (SEQ ID NOs: 207-211) respectivamente, en la cual, todas tienen la función asignada a la SEQ ID NO: 205 en el cuadro 1. Aminoácidos conservados entre todas las secuencias están indicados por un "*" y en general, aminoácidos conservados están indicados por un ":". Las FIGs. 14A y 14B representan un alineamiento de secuencia entre la SEQ ID NO: 222 (RAAC01926) y ref|YP_001038202.11, ref|ZP_01667587.11, ref|ZP_01575301.1 |, ref|YP_00121 1020.11, y ref|YP_516465.1 ] (SEQ ID NOs: 224-228) respectivamente, en la cual, todas tienen la función asignada a la SEQ ID NO: 222 en el cuadro 1. Aminoácidos conservados entre todas las secuencias están indicados por un "*" y en general, aminoácidos conservados están indicados por un ":". La FIG. 15 representa un alineamiento de secuencia entre la SEQ ID NO: 239 (RAAC01998) y ref|NP_348940.1 |, ref|NP_721244.1 |, dbj|BAC75700.1 |, ref|ZP_00605123.1 |, y ref|YP_015329.11 (SEQ ID NOs: 241-245) respectivamente, en la cual, todas tienen la función asignada a la SEQ ID NO: 239 en el cuadro 1. Aminoácidos conservados entre todas las secuencias están indicados por un "*" y en general, aminoácidos conservados están indicados por un La FIG. 16 representa un alineamiento de secuencia entre la SEQ ID NO: 256 (RAAC0201 1) y ref|YP_754819.1 |, ref|YP_184322.11, ref|NP_577787.1 |, ref|NP_142068.1 |, y ref|NP_125751.1 | (SEQ ID NOs: 258-262) respectivamente, en la cual, todas tienen la función asignada a la SEQ ID NO: 256 en el cuadro 1. Aminoácidos conservados entre todas las secuencias están indicados por un "*" y en general, aminoácidos conservados están indicados por un Las FIGs. 17A y 17B representan un alineamiento de secuencia entre la SEQ ID NO: 273 (RAAC02381 ) y ref|NP_622177.1 |, ref|YP_848858.1 |, ref|YP_001374688.1 |, ref|NP_470039.1 |, y ref|ZP_01929325.1 | (SEQ ID NOs: 275-279) respectivamente, en la cual, todas tienen la función asignada a la SEQ ID NO: 273 en el cuadro 1. Aminoácidos conservados entre todas las secuencias están indicados por un "*" y en general, aminoácidos conservados están indicados por un La FIG. 18 representa un alineamiento de secuencia entre la SEQ ID NO: 290 (RAAC02421 ) y ref|ZP_0172181 1.1 |, ref|NP_241897.11, ref|YP_001486101.1 |, ref|ZP_01 70532.1 ], y ref|ZP_02327994.1 | (SEQ ID NOs: 292-296) respectivamente, en la cual, todas tienen la función asignada a la SEQ ID NO: 290 en el cuadro 1. Aminoácidos conservados entre todas las secuencias están indicados por un "*" y en general, aminoácidos conservados están indicados por un ":". La FIG. 19 representa un alineamiento de secuencia entre la SEQ ID NO: 309 (RAAC01 168) y ref|YP_001663880.1 |, ref|YP_00 18 332.11, ref|YP_675143.1 |, ref|YP_002352821.1 |, y ref|YP_001 1 14454.1 | (SEQ ID NOs: 31 -315) respectivamente, en la cual, todas tienen la función asignada a la SEQ ID NO: 309 en el cuadro 1. Aminoácidos conservados entre todas las secuencias están indicados por un "*" y en general, aminoácidos conservados están indicados por un DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Modalidades de la invención incluyen genes y proteínas asociadas relacionadas con la modificación post-traduccional y/o glicosilación de proteínas del termoacidófilo Alicyclobacillus acidocaldarius. Las secuencias codificantes para genes relacionados con estos procesos, se determinaron a partir de información de secuencia generada a partir del secuenciamiento del genoma de Alicyclobacillus acidocaldarius. Estos genes y proteínas pueden representar objetivos para ingeniería metabólica de Alicyclobacillus acidocaldarius u otros organismos. Ejemplos no limitantes de secuencias de nucleótidos encontradas dentro del genoma de Alicyclobacillus acidocaldarius y aminoácidos codificados por este medio, asociadas con modificación post-traduccional y/o glicosilación de proteínas, son listados en el cuadro 1. Las glicosiltransferasas y/o proteínas de modificación post-traduccional pueden ser, sin limitación, de las siguientes clases: UDP beta-glucosefosfotransferasas, Dolicol-fosfato manosiltransferasas, y Glicosiltransferasas; y otras.

Modalidades de la invención se refieren en parte, a las secuencias del gen y/o secuencias de proteína que comprenden genes y/o proteínas de Alicyclobacillus acidocaldarius. Genes y proteínas incluidos son aquellos los cuales juegan un papel en la glicosilación y/o modificación post-traduccional de proteínas. Actividades enzimáticas intracelulares pueden ser termofílicas y/o acidofílicas en naturaleza y ejemplos generales de genes similares, son descritos en la literatura. Clases de genes, secuencias, enzimas y factores incluyen, pero no se limitan a, aquellos listados en el cuadro 1.

CUADR0 1 Genes de Alicyclobacillus acidocaldarius y proteínas relacionadas con la glicosilación Secuencia de Referencia Proteína Secuencia de Gen Función RAAC00164 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:2 Glicosiltransferasa RAAC00517 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:19 Glicosiltransferasa RAAC00650 SEQ ID NO:35 SEQ ID NO:36 Glicosiltransferasa RAAC00991 SEQ ID O:52 SEQ ID NO:53 Glicosiltransferasa RAAC01110 SEQ ID NO:69 SEQ ID NO:70 Glicosiltransferasa RAAC01166 SEQ ID NO:86 SEQ ID NO:87 UDP beta-glucosefosfotransferasa RAAC011-67 SEQ ID NO:103 SEQ ID NO:104 Glicosiltransferasa RAAC01170 SEQ ID NO:120 SEQ ID NO:121 Glicosiltransferasa RAAC01248 SEQ ID NO:137 SEQ ID NO:138 Glicosiltransferasa RAAC01348 SEQ ID NO:154 SEQ ID NO:155 Glicosiltransferasa RAAC01377 SEQ ID NO:171 SEQ ID NO:172 Glicosiltransferasa RAAC01611 SEQ ID NO:188 SEQ ID O:189 Glicosiltransferasa RAAC01612 SEQ ID NO:205 SEQ ID NO:206 Glicosiltransferasa RAAC01926 SEQ ID NO:222 SEQ ID NO:223 Glicosiltransferasa RAAC01998 SEQ ID NO:239 SEQ ID NO:240 Glicosiltransferasa RAAC02011 SEQ ID NO:256 SEQ ID NO:257 Dolichol-fosfato manosiltransferasa RAAC02381 SEQ ID NO:273 SEQ ID NO:274 Glicosiltransferasa RAAC02421 SEQ ID NO:290 SEQ ID NO:291 Glicosiltransferasa RAAC01168 SEQ ID NO.309 SEQ ID NO:310 Glicosiltransferasa La presente invención se refiere a secuencias de nucleótidos que comprenden secuencias de nucleótido aislado y/o purificado del genoma de Alicyclobacillus acidocaldarius, seleccionado a partir de las SEQ ID NOs:. 2, 19, 36, 53, 70, 87, 104, 121 , 138, 155, 172, 189, 206, 223, 240, 257, 274, 291 , y 310, o uno o más de sus fragmentos. La presente invención del mismo modo se refiere a secuencias de nucleótido aislados y/o purificados, caracterizadas en que comprenden al menos una de: a) una secuencia de nucleótido de al menos una de las secuencias de la SEQ ID NOs:. 2, 19, 36, 53, 70, 87, 104, 121 , 138, 155, 172, 189, 206, 223, 240, 257, 274, 291 , y 310, o uno o más de sus fragmentos o uno de sus fragmentos; b) una secuencia de nucleótido homologa a una secuencia de nucleótido tal como se define en a); c) una secuencia de nucleótido complementaria a una secuencia de nucleótido tal como se define en a) o b), y una secuencia de nucleótido de su ARN correspondiente; d) una secuencia de nucleótido capaz de hibridizar bajo condiciones rigurosas con una secuencia tal como se define en a), b) o c); e) una secuencia de nucleótido que comprende una secuencia tal como se define en a), b), c) o d); y f) una secuencia de nucleótido modificada por una secuencia de nucleótido tal como se define en a), b), c), d) o e). Nucleótido, polinucleótido o secuencia de ácido nucleico, serán entendidos de conformidad con la presente invención por significar tanto un ADN de hebra única o de doble hebra en las formas monoméricas y diméricas (así llamadas en serie) y los productos de transcripción de dichos ADNs.

Aspectos de la invención se refieren a secuencias de nucleótido las cuales han sido posible aislar, purificar o parcialmente purificar, a partir de métodos de separación tales como por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico por exclusión, basado en el tamaño molecular, o por afinidad, o alternativamente, técnicas de fraccionamiento basadas en solubilidad en diferentes solventes, o partiendo a partir de métodos de ingeniería genética tales como amplificación, clonación y subclonación, es posible para las secuencias de la invención, ser portadas por vectores. El fragmento de secuencia de nucleótido aislado y/o purificado de conformidad con la invención, se entenderá por diseñar cualquier fragmento de nucleótido del genoma de Alicyclobacillus acidocaldarius, y puede incluir, por medio de ejemplos no limitantes, longitud de al menos 8, 12, 20 25, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 1000, o más, nucleótidos consecutivos de la secuencia a partir de la cual se origina. Fragmento específico de una secuencia de nucleótido aislado y/o purificado de conformidad con la invención, se entenderá por designar cualquier fragmento de nucleótido del genoma de Alicyclobacillus acidocaldarius, que tiene, después del alineamiento y comparación con los fragmentos correspondientes de las secuencias genómicas de Alicyclobacillus acidocaldarius, al menos un nucleótido o base de diferente naturaleza. Secuencia de nucleótido purificado y/o aislado homologa en el sentido de la presente invención, se entiende por significar una secuencia de nucleótido aislado y/o purificado que tiene al menos un porcentaje de identidad con las bases de una secuencia de nucleótido de conformidad con la invención, de al menos aproximadamente 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.6%, o 99.7%, este porcentaje siendo puramente estadístico y siendo posible distribuir las diferencias entre las dos secuencias de nucleótidos en aleatorio y sobre el total de su longitud. 1 Secuencia de nucleótido homologa específica en el sentido de la presente invención, se entiende por significar una secuencia de nucleótido homologa que tiene al menos una secuencia de nucleótido de un fragmento específico, tal como se define anteriormente. Dichas secuencias homologas "específicas" pueden comprender, por ejemplo, las secuencias correspondientes a la secuencia genómica o a las secuencias de sus fragmentos representativos de variantes del genoma de Alicyclobacillus acidocaldarius. Estas secuencias homologas específicas pueden de este modo, corresponder a variaciones ligadas a mutaciones dentro de cepas de Alicyclobacillus acidocaldarius, y especialmente corresponder a truncaciones, sustituciones, deleciones y/o adiciones de al menos un nucleótido. Dichas secuenciás homologas pueden del mismo modo corresponder a variaciones ligadas a la degeneración del código genético. ; El término "grado o porcentaje de homología de secuencia", se refiere al Agrado o porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias después del alineamiento óptimo" como se define en la presente solicitud. Dos secuencias nucleotídicas o de aminoácido se dice, son "idénticas", si la secuencia de residuos nucleotídicos o aminoácidos en las dos secuencias es la misma, cuando se alinea para correspondencia máxima como se describe posteriormente. Las comparaciones de secuencia entre dos (o más) péptidos o polinucleótidos son típicamente realizadas comparando secuencias de dos secuencias óptimamente alineadas sobre un segmento o "ventana de comparación" para identificar y comparar regiones locales de la similitud de secuencia. El alineamiento óptimo de las secuencias por comparación, puede ser conducido por el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Ad. App. Math 2: 482 (1981 ), por el algoritmo de alineamiento de homología de Neddleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), por la búsqueda por el método de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Nati. Acad. Sci. (U.S.A.) 85: 2444 (1988), por implementación computarizada de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el Paquete de Software Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wis.), o por inspección visual. "Porcentaje de identidad de secuencia" (o grado de identidad), se determina comparando dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación, en donde la porción de la secuencia de polinucleótido o péptido en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, aperturas) comparadas con la secuencia de referencia (la cual no comprende adiciones o deleciones) para alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las cuales ocurren las bases de ácido nucleico o residuo de aminoácido idénticas en ambas secuencias, para proporcionar el número de posiciones apareadas, dividiendo el número de posiciones apareadas por el número total de posiciones en la ventaja de comparación y multiplicando el resultado por 00 para proporcionar el porcentaje de identidad de secuencia. La definición de identidad de secuencia dada anteriormente, es la definición que podría ser usada por uno de habilidad en la técnica. La definición por si misma no necesita la ayuda de algún algoritmo, dichos algoritmos siendo útiles solamente para lograr los alineamientos óptimos de las secuencias, en lugar del cálculo de identidad de secuencia. A partir de la definición dada anteriormente, de ello se deduce que existe un valor bien definido y único para la identidad de secuencia entre las dos secuencias comparadas, en las cuales el valor corresponde al valor obtenido para el mejor u óptimo alineamiento. En el software BLAST N o BLAST P "secuencia BLAST 2", el cual está disponible en el sitio de red worldwideweb.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html, y es habitualmente usado por los inventores y en general por las personas expertas para comparar y determinar la identidad entre las dos secuencias, el costo de apertura el cual depende de la longitud de secuencia a ser comparada es directamente seleccionado por el software (es decir, 11.2 para la matriz de substitución BLOSUM-62 para la longitud >85). La secuencia de nucleótido complementaria de una secuencia de la invención, se entiende por significar cualquier ADN cuyos nucleótidos son complementarios a aquellos de las secuencias de la invención, y cuya orientación es invertida (secuencia antisentido). La hibridación bajo condiciones de rigurosidad con una secuencia de nucleótido de conformidad con la invención, se entiende por significar hibridación bajo condiciones de temperatura e intensidad iónica elegidas en tal forma que permiten el mantenimiento de la hibridización entre dos fragmentos de ADN complementario. Por medio de ilustración, condiciones de mayor rigurosidad de la etapa de hibridización con el objetivo de definir fragmentos de nucleótidos descritos anteriormente, son ventajosamente las siguientes. La hibridización se lleva a cabo a una temperatura preferencial de 65° C en la presencia de amortiguador SSC, 1 x SSC que corresponde a 0.15 M de NaCI y 0.05 M Na de citrato. Las etapas de lavado, por ejemplo, pueden ser las siguientes: 2 x SSC, a temperatura ambiente seguida por dos lavados con 2 x SSC, 0.5% de SDS a 65° C; 2 x 0.5 x SSC, 0.5% de SDS; a 65° C por 10 minutos cada una. Las condiciones de rigurosidad intermedia, usando por ejemplo, una temperatura de 42° C en la presencia de un amortiguador 2 x SSC, o de menos rigurosidad, por ejemplo una temperatura de 37° C en la presencia de un amortiguador 2 x SSC, respectivamente, requiere una complementariedad globalmente menos significante para la hibridización entre las dos secuencias. Las condiciones de hibridización rigurosas descritas anteriormente para un polinucleótido con un tamaño de aproximadamente 350 bases, serán adaptadas por la persona experta en la técnica para oligonucleótidos de mayor o menor tamaño, de conformidad con las enseñanzas de Sambrook et al., 1989. Entre las secuencias de nucleótido aislados y/o purificados de conformidad con la invención, están aquellas las cuales pueden ser usadas como un cebador o sonda en métodos que permiten a las secuencias homologas de conformidad con la invención, ser obtenidas, estos métodos, tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), clonación de ácido nucleico, y secuenciamiento, son bien conocidos por la persona experta en la técnica. Entre las secuencias de nucleótido aislados y/o purificados de conformidad con la invención, estas son nuevamente preferidas las cuales pueden ser usadas como una sonda o cebador en métodos que permiten la presencia de las SEQ ID NOs:. 2, 19, 36, 53, 70, 87, 104, 121 , 138, 155, 172, 189, 206, 223, 240, 257, 274, 291 , y 310, o uno de sus fragmentos, o una de sus variantes tal como se define abajo a ser diagnosticadas. Los fragmentos de secuencia de nucleótido de conformidad con la invención, se pueden obtener, por ejemplo, por amplificación especifica, tal como PCR, o después de digestión con enzimas de restricción apropiadas de secuencias de nucleótido de conformidad con la invención, estos métodos en particular son descritos en la obra de Sambrook et al., 1989. Tales fragmentos representativos pueden del mismo modo, obtenerse por síntesis química de conformidad con métodos bien conocidos por personas de habilidad en la técnica. La secuencia de nucleótido modificada se entenderá por significar cualquier secuencia de nucleótido obtenida por mutagénesis, de conformidad con técnicas bien conocidas por la persona experta en la técnica, y que contiene modificaciones con respecto a las secuencias normales de conformidad con la invención, por ejemplo, mutaciones en las secuencias promotoras y/o reguladoras de la expresión del polipéptido, especialmente conduciendo a una modificación de la velocidad de expresión del polipéptido o a la modulación del ciclo replicativo. La secuencia de nucleótido modificada del mismo modo, será entendida por significar cualquier secuencia de nucleótido que codifica para un polipéptido modificado, tal como se define posteriormente. La presente invención se refiere a una secuencia de nucleótido que comprende, secuencias de nucelótido aislado y/o purificado de Alicyclobacilius acidocaldarius, caracterizadas en que se seleccionan a partir de las secuencias de las SEQ ID NOs:. 2, 19, 36, 53, 70, 87, 104, 121 , 138, 155, 172, 189, 206, 223, 240, 257, 274, 291 , y 310, o uno de sus fragmentos. Modalidades de la invención del mismo modo, se refieren a secuencias de nucleótido aislados y/o purificados caracterizadas en que comprenden una secuencia de nucleótido seleccionadas a partir de: a) al menos una secuencia de nucleótido de las SEQ ID NOs:. 2, 19, 36, 53, 70, 87, 104, 121 , 138, 155, 172, 189, 206, 223, 240, 257, 274, 291 , y 310, o uno de sus fragmentos o uno de sus fragmentos; b) una secuencia de nucleótido de un fragmento específico de una secuencia tal como se define en a); c) una secuencia de nucleótido homologa que tiene al menos 80% de identidad con una secuencia tal como se define en a) o b); d) una secuencia de nucleótido complementaria o secuencia de ARN que corresponde a una secuencia tal como se define en a), b) o c); y e) una secuencia de nucleótido modificada por una secuencia tal como se define en a), b), c) o d). Entre las secuencias de nucleótido aislados y/o purificados de conformidad con la invención, están las secuencias de nucleótidos de las SEQ ID NOs:. 13-17, 30-34, 47-51 , 64-68, 81-85, 98-102, 1 15-1 19, 132-136, 149-153, 166-170, 183-187, 200-204, 217-221 , 234-238, 251-255, 268-272, 285-289, 302-306, 319-323, 336-340, 353-357, 370-374, 387-391 , 404-408, 421-425, 438-442, 455-459, 472-476, 489-493, 506-510, 523-527, 540-544, 557-561 , 574-578, 591-595, 608-612, 625-629, 642-646, 659-663, 676-680, 693-697, 710-714, 727-731 , 744-748, 761-765, 778-782, y 321-325, o fragmentos de las mismas, y cualesquiera otras secuencias de nucleótido aislados y/o purificados las cuales tienen una homología de al menos 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.6%, o 99.7% de identidad con al menos una de las secuencias de las SEQ ID NOs:. 2, 19, 36, 53, 70, 87, 104, 121 , 138, 155, 172, 189, 206, 223, 240, 257, 274, 291 , y 310, o fragmentos de la misma. Dichas secuencias homologas pueden comprender, por ejemplo, las secuencias correspondientes a la secuencia genómicas Alicyclobacillus acidocaidarius. En la misma manera, estas secuencias homologas específicas pueden corresponder a variaciones ligadas a mutaciones dentro de las cepas de Alicyclobacillus acidocaldarius y especialmente corresponden a truncáciones, sustituciones, deleciones y/o adiciones de al menos un nucleótido. Como será aparente para uno de habilidad ordinaria en la técnica, tales homólogos son fácilmente creados e identificados usando técnicas estándares y programas de computadora públicamente disponibles tales como BLAST. Como tal, cada homólogo referenciado anteriormente, debe ser considerado como expuesto en la presente y completamente descrito. Modalidades de la invención comprenden los polipéptidos aislados y/o purificados codificados por una secuencia de nucleótido de conformidad con la invención, o fragmentos de la misma, cuya secuencia es representada por un fragmento. Secuencias de aminoácido que corresponden a los polipéptidos aislados y/o purificados, las cuales pueden ser codificadas de conformidad con una de las tres posibles estructuras lectoras de al menos una de las secuencias de las SEQ ID NOs: 2, 19, 36, 53, 70, 87, 104, 121 , 138, 155! 172, 189, 206, 223, 240, 257, 274, 291 , y 310. Modalidades de la invención del mismo modo, se refieren a los polipéptidos aislados y/o purificados, caracterizados en que comprenden un polipéptido seleccionado a partir de al menos una de las secuencias de aminoácido de las SEQ ID NOs: 1 , 18, 35, 52, 69, 86, 103, 120, 137, 154, 171 , 188, 205, 222, 239, 256, 273, 290 y 309, o uno de sus fragmentos. Entre los polipéptidos aislados y/o purificados, de conformidad con modalidades de la invención, están los polipéptidos aislados y/o purificados de las secuencias de aminoácido de las SEQ ID NOs:. 8-12, 25-29, 42-46, 59-63, 76-80, 93-97, 110-114, 127-131 , 144-148, 161-165, 178-182, 195-199, 212-216, 229-233, 246-250, 263-267, 280-284, 297-301 , 314-318, 331-335, 348-352, 365-369, 382-386, 399-403, 416-420, 433-437, 450-454, 467-471 , 484-488, 501-505, 518-522, 535-539, 552-556, 569-573, 586-590, 603-607, 620-624, 637-641 , 654-658, 671-675, 688-692, 705-709, 722-726, 739-743, 756-760, 773-777, y 316-320, o fragmentos de la misma o cualesquiera otros polipéptidos aislados y/o purificados los cuales tienen una homología de al menos 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.6%, o 99.7% de identidad con al menos una de las secuencias de las SEQ ID NOs:. 1 , 18, 35, 52, 69, 86, 103, 120, 137, 154, 171 , 188, 205, 222, 239, 256, 273, 290 y 309, o uno de sus fragmentos. Como será aparente para uno de habilidad en la técnica, tales homólogos pueden ser fácilmente creados e identificados usando técnicas estándares y programas de computadora públicamente disponibles tales como BLAST. Como tal, cada homólogo referenciado anteriormente debe ser considerado como expuesto en la presente y completamente descrito. Modalidades de la invención también se refieren a los polipéptidos, caracterizados en que comprenden un polipéptido seleccionado a partir de: a) un fragmento específico de al menos 5 aminoácidos de un polipéptido de una secuencia de aminoácido de conformidad con la invención,; b) un polipéptido homólogo a un polipéptido tal como se define en a); c) un fragmento biológicamente activo específico de un polipéptido tal como se define en a) o b); y d) un polipéptido modificado por un polipéptido tal como se define en a), b) o c). En la presente descripción, los términos polipéptido, péptido y proteína, son intercambiables. En modalidades de la invención, los polipéptidos aislados y/o purificados de conformidad con la invención, pueden ser glicosilados, pegilados, y/o de otro modo post-traduccionalmente modificados. En modalidades adicionales, la glicosilación, pegilación, y/o otras modificaciones post-traduccionales pueden ocurrir in vivo o in vitro, y/o pueden ser realizadas usando técnicas químicas. En modalidades adicionales, cualquiera de glicosilación, pegilación y/o otras modificaciones post-traduccionales pueden ser N-ligadas u O-ligadas. En modalidades de la invención, uno cualquiera de los polipéptidos aislados y/o purificados de conformidad con la invención, puede ser enzimáticamente o funcionalmente activo a temperaturas en o arriba de aproximadamente 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, y/o 95°C y/o puede ser enzimáticamente o funcionalmente activo a un pH en, por debajo de y/o arriba de, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 y/o 0. En modalidades adicionales de la invención, la glicosilación, pegilación, y/o otra modificación post-traduccional pueden ser requeridas para los polipéptidos aislados y/o purificados de conformidad con la invención, para ser enzimáticamente o funcionalmente activos a pH en o por debajo de 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 , y/o 0, o a temperaturas en o arriba de aproximadamente 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, y/o 95°C. Aspectos de la invención se refieren a polipéptidos que son aislados u obtenidos por purificación a partir de fuentes naturales, o de otro modo obtenidos por recombinación genética, o alternativamente por síntesis química y que pueden de este modo, contener aminoácidos no naturales, como se describirá posteriormente. Un "fragmento de polipéptido" de conformidad con las modalidades de la invención, se entiende por designar un polipéptido que contiene al menos 5 aminoácidos consecutivos, preferiblemente, 10 aminoácidos consecutivos o 15 aminoácidos consecutivos. En la presente invención, un fragmento de polipéptido específico se entiende por designar el fragmento de polipéptido específico codificado por una secuencia de nucleótido de fragmento específico de conformidad con la invención. "Polipéptido homólogo" se entenderá por designar los polipéptidos que tienen, con respecto al polipéptido natural, ciertas modificaciones tales como, en particular, una deleción, adición o sustitución de al menos un amino ácido, una truncación, una prolongación, una fusión quimérica y/o una mutación. Entre los polipéptidos homólogos, son preferidos aquellos cuya secuencia de aminoácido tiene al menos 80% o 90% de homología con las secuencias de aminoácidos de polipéptidos de conformidad con la invención. "Polipéptidos homólogos específicos" se entenderán por designar los polipéptidos homólogos tal como se definen anteriormente y que tienen un fragmento específico de polipéptido de conformidad con la invención. En el caso de una sustitución, uno o más aminoácidos consecutivos o no consecutivos son reemplazados por aminoácidos "equivalentes". La expresión aminoácido "equivalente", se dirige en la presente, a designar cualquier aminoácido capaz de ser sustituido por uno de los aminoácidos de la estructura base sin, sin embargo, modificar esencialmente las actividades biológicas de los péptidos correspondientes y como tal; serán definidos por lo siguiente. Como será aparente por uno de habilidad en la técnica, tales sustituciones son fácilmente creadas e identificadas usando técnicas de biología molecular estándar y programas de computadora públicamente disponibles tales como, BLAST. Como tal, cada sustitución referenciada anteriormente debe ser considerada como expuesta en la presente y completamente descrita. Ejemplos de tales sustituciones en la secuencia de aminoácido de las SEQ ID NOs:. 1 , 18, 35, 52, 69, 86, 103, 120, 137, 154, 171 , 188, 205, 222, 239, 256, 273, 290 y 309, pueden incluir aquellos polipéptidos aislados y/o purificados de secuencias de aminoácido de las SEQ ID NOs:. 8-12, 25-29, 42-46, 59-63, 76-80, 93-97, 1 0-1 14, 127-131 , 144-148, 161-165, 178-182, 195-199, 212-216, 229-233, 246-250, 263-267, 280-284, 297-301 , 314-318, 331-335, 348-352, 365-369, 382-386, 399-403, 416-420, 433-437, 450-454, 467-471 , 484-488, 501-505, 518-522, 535-539, 552-556, 569-573, 586-590, 603-607, 620-624, 637-641 , 654-658, 671-675, 688-692, 705-709, 722-726, 739-743, 756-760, 773-777, y 316-320. Estos aminoácidos equivalentes pueden ser determinados ya sea dependiendo de su homología estructural con los aminoácidos los cuales sustituyen, o en los resultados de pruebas comparativas de actividad biológica entre los diferentes polipéptidos, los cuales son capaces de ser realizados. Por medio de ejemplo no limitante, las posibilidades de sustituciones capaces de llevarse a cabo sin resultar en una modificación extensiva de la actividad biológica de los polipéptidos modificados correspondientes, se mencionarán el reemplazo, por ejemplo, de leucina por valina o isoleucina de ácido aspártico por ácido glutámico, de glutamina por asparagina, de arginina por lisina, etc., las sustituciones inversas naturalmente son previsibles bajo las mismas condiciones. En una modalidad adicional, las sustituciones están limitadas a sustituciones en aminoácidos no conservados entre otras proteínas las cuales tienen similar actividad enzimática identificada. Por ejemplo, uno de habilidad ordinaria en la técnica puede alinear proteínas de la misma función en organismos similares y determinar cuáles aminoácidos son en general, conservados entre proteínas de tal función. Un ejemplo de un programa que puede ser usado para generar tales alineamientos es wordlwideweb.charite.de/bioinf/strap/, en conjunto con las bases de daos proporcionadas por el NCBI. Ejemplos de tales polipéptidos pueden incluir, pero no se limitan a, aquellos encontrados en las secuencias de aminoácido de las SEQ ID NOs:. 8-12, 25-29, 42-46, 59-63, 76-80, 93-97, 1 10-1 14, 127-131 , 144-148, 161-165, 178-182, 195-199, 212-216, 229-233, 246-250, 263-267, 280-284, 297-301 , 314-318, 331-335, 348-352, 365-369, 382-386, 399-403, 416-420, 433-437, 450-454, 467-471 , 484-488, 501-505, 518-522, 535-539, 552-556, 569-573, 586-590, 603-607, 620-624, 637-641 , 654-658, 671-675, 688-692, 705-709, 722-726, 739-743, 756-760, 773-777, y 316-320. De este modo, de conformidad con una modalidad de la invención, las sustituciones o mutación se pueden hacer en posiciones que son en general, conservadas entre proteínas de tal función. En una modalidad adicional, secuencias de ácido nucleico pueden ser mutadas o sustituidas de manera que el aminoácido que codifican está sin cambio (sustituciones y/o mutaciones degeneradas) y/o mutado o sustituido, de manera que cualquiera de las sustituciones o mutaciones de aminoácido resultantes se hacen en posiciones que son en general, conservadas entre proteínas de tal función. Ejemplos de tales secuencias de ácido nucleico pueden incluir, pero no- se limitan a, aquellas encontradas en las secuencias de nucleótido de las SEQ ID NOs:. 13-17, 30-34, 47-51 , 64-68, 81-85, 98-102, 115-1 19, 132-136, 149-153, 166-170, 183-187, 200-204, 217-221 , 234-238, 251-255, 268-272, 285-289, 302-306, 319-323, 336-340, 353-357, 370-374, 387-391 , 404-408, 421-425, 438-442, 455-459, 472-476, 489-493, 506-510, 523-527, 540-544, 557-561 , 574-578, 591-595, 608-612, 625-629, 642-646, 659-663, 676-680, 693-697, 710-714, 727-731 , 744-748, 761-765, 778-782, y 321-325, o fragmentos de las mismas. Los polipéptidos homólogos específicos del mismo modo, corresponden a polipéptidos codificados por las secuencias de nucleótido homologas específicas tal como se define anteriormente y de este modo, comprenden en la presente definición, los polipéptidos los cuales son mutados o corresponden a variantes las cuales pueden existir en Alicyclobacillus acidocaldarius, y las cuales especialmente corresponden a truncaciones, sustituciones, deleciones, y/o adiciones de al menos un residuo de aminoácido. "Fragmento biológicamente activo específico de un polipéptido" de conformidad con una modalidad de la invención se entenderá, en particular, por designar un fragmento de polipéptido específico, tal como se define anteriormente, que tiene al menos una de las características de polipéptidos de conformidad con la invención. En ciertas modalidades, el péptido es capaz de comportarse como al menos, uno de los tipos de proteínas resumidos en el cuadro 1. . Los fragmentos de polipéptido de conformidad con modalidades de la invención, pueden corresponder a fragmentos aislados o purificados naturalmente presentes en Alicyclobacillus acidocaldarius o corresponden a fragmentos los cuales se pueden obtener por desdoblamiento de dicho polipéptido por una enzima proteolítíca, tal como tripsina o quimiotripsina o colagenasa, o por un reactivo químico, tal como bromuro de cianógeno (CNBr). Tales fragmentos de polipéptidos pueden del mismo modo, solo ser fácilmente preparados por síntesis química, a partir de hospederos transformados por un vector de expresión de conformidad con la invención, que contiene un ácido nucleico que permite la expresión de dichos fragmentps, colocados bajo el control de elementos de expresión y/o regulación apropiados. "Polipéptido modificado" de un polipéptido de conformidad con una modalidad de la invención, se entiende por designar un polipéptido obtenido por recombinación genética o por síntesis química como se describirá posteriormente, que tiene al menos una modificación con respecto a la secuencia normal. Estas modificaciones pueden o no pueden ser capaces de portar aminoácidos en el origen de especificidad y/o actividad, o en el origen dé la conformación estructural, localización y de la capacidad de inserción de membrana del polipéptido de conformidad con la invención. De este modo, será posible crear polipéptidos de actividad equivalente, incrementada o reducida, y de especificidad equivalente, más estrecha o más amplia. Entre los polipéptidos modificados, es necesario mencionar los polipéptidos en los cuales hasta 5 o más aminoácidos pueden ser modificados, truncados en el extremo N o C-terminal, o aún suprimidos o agregados. ! Los métodos que permiten demostrar dichas modulaciones en células eucarióticas o procarióticas, son bien conocidos por la persona de habilidad ordinaria en la técnica. Del mismo modo, se entiende bien que será posible usar las secuencias de nucleótidos que codifican para los polipéptidos modificados a dichas modulaciones, por ejemplo, a través de vectores de conformidad con la invención, y descritos abajo. Los polipéptidos modificados precedentes, se pueden obtener usando química combinatorial, en la cual es posible variar sistemáticamente partes del polipéptido antes de probarlos en modelos, cultivos celulares o microorganismos por ejemplo, para seleccionar compuestos los cuales son más activos o tienen las propiedades buscadas. La síntesis química del mismo modo, tiene la ventaja de ser capaz de usar aminoácidos no naturales o enlaces no peptídicos. De este modo, para mejorar la duración de vida de los polipéptidos de conformidad con la invención, puede ser de interés usar aminoácidos no naturales, por ejemplo en forma D, o del mismo modo análogos de aminoácido, especialmente por ejemplo formas que contienen azufre. Finalmente, será posible integrar la estructura de los polipéptidos de conformidad con la invención, sus formas homologas modificadas o específicas, en estructuras químicas del tipo de polipéptido u otros. De este modo, puede ser de interés proporcionar en los extremos N- y C-terminales, moléculas no reconocidas por las proteasas. Las secuencias de nucleótidos que codifica para un polipéptido de conformidad con la invención, son del mismo modo, parte de la invención. La invención del mismo modo, se refiere a secuencias de nucleótido utilizables como una sonda o cebador, caracterizadas en que las secuencias son seleccionadas a partir de las secuencias de nucleótidos de conformidad con la invención. Es bien entendido que la presente invención, en varias modalidades, del mismo modo, se refiere a polipéptidos específicos de Alicyclobacillus acidocaldarius, codificados por secuencias de nucleótidos capaces de ser obtenidas por purificación a partir de polipéptidos naturales, por recombinación genética o por síntesis química por procedimientos bien conocidos por la persona experta en la técnica y como tal, descritos en particular abajo. De la misma manera, los anticuerpos mono o policlonales, etiquetados o no etiquetados, dirigidos contra dichos polipéptidos específicos codificados por las secuencias de nucleótidos, están también abarcados por la invención. Modalidades de la invención adicionalmente, se refieren al uso de una secuencia de nucleótido de conformidad con la invención, como un cebador o sonda para la detección y/o la amplificación de secuencias de ácido nucleico. Las secuencias de nucleótidos de conformidad con modalidades de la invención, pueden de este modo, ser usadas para amplificar secuencias de nucleótido, especialmente por la técnica de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) (Erlich, 1989; Innis et al., 1990; Rolfs et al., 1991 ; y White et al., 1997). Estos cebadores de oligodesoxirríbonucleótido u oligorribonucleótido, ventajosamente tienen una longitud de al menos 8 nucleótidos, preferiblemente, de al menos 12 nucleótidos, y aún más preferencialmente, de al menos 20 nucleótidos.

! Otras técnicas de amplificación del ácido nucleico objetivo pueden ser ventajosamente empleadas como alternativas a PCR.

Las secuencias de nucleótidos de la invención, en particular los cebadores de conformidad con la invención, pueden del mismo modo ser I empleados en otros procedimientos de amplificación de un ácido nucleico objetivo, tal como: la técnica TAS (Sistema de Amplificación a base de Transcripción), descrito por Kwoh et al. en 1989; la técnica 3SR (Replicación de Secuencia Auto-Sostenida), descrita por Guatelli et al. en 1990; la técnica NASBA (Amplificación a base de Secuencia de Ácido Nucleico), descrita por Kievitis et al. en 1991 ; la técnica SDA (Amplificación por Desplazamiento de Hebra) (Walker et al., 1992); la técnica TMA (Amplificación Mediada por Transcripción).

Los polinucleótidos de la invención, también pueden ser empleados en técnicas, de amplificación o de modificación del ácido nucleico que sirve como una sonda, tal como: la técnica LCR (Reacción en Cadena de Ligasa), descrita por Landegren et al. en 1988 y mejorada por Barany et al. en 1991 , la cual emplea una ligasa termoestable; la técnica RCR (Reacción en Cadena de Reparación), descrita por Segev en 1992; la técnica CPR (Reacción en Sonda Cíclica), descrita por Duck et al. en 1990; la técnica de amplificación con Q-beta replicasa, descrita por Miele et al. en 1983 y especialmente mejorada por Chu et al. en 1986, Lizardi et al. en 1988, después por Burg et al. así como también por Stone et al. en 1996. En el caso en donde el polinucleótido objetivo a ser detectado es posiblemente un ARN, por ejemplo un ARNm, será posible usar, previo al empleo de una reacción de amplificación con la ayuda de al menos un cebador de conformidad con la invención, o al empleo de un procedimiento de detección con la ayuda de al menos una sonda de la invención, una enzima de tipo transcriptasa inversa para obtener un cADN a partir del ARN contenido en la muestra biológica. El cADN obtenido de este modo, servirá como un objetivo para el(los) cebador(es) o la(s) sonda(s) empleada(s) en el procedimiento de amplificación o detección de conformidad con la invención. La sonda de detección será elegida en tal manera que hibridizará con la secuencia objetivo o el amplicón generado a partir de la secuencia objetivo. Por medio de la secuencia, tal sonda ventajosamente tendrá una secuencia de al menos 12 nucleótidos, en particular de al menos 20 nucleótidos, y preferiblemente, de al menos 100 nucleótidos. Modalidades de la invención también comprenden las secuencias de nucleótidos utilizable como una sonda o cebador de conformidad con la invención, caracterizadas en que son etiquetadas con un compuesto radioactivo o con un compuesto no radioactivo. Las secuencias de nucleótido no etiquetadas, pueden ser usadas directamente como sondas o cebadores, aunque las secuencias son en general, etiquetadas con un isótopo radioactivo (32P, 35S, 3H, 25l) o con una molécula no radioactiva (biotina, acetilaminofluoreno, digoxigenina, 5- bromodesoxiuridina, fluoresceína), para obtener sondas las cuales son utilizables para numerosas aplicaciones. Ejemplos de etiquetado no radioactivo de secuencias de nucleótidos se describen, por ejemplo, en la Patente Francesa No. 78.10975 o por Urdea et al. o por Sánchez-Pescador et al. en 988. En el último caso, también será posible usar uno de los métodos de etiquetado descritos en las patentes FR-2 422 956 y FR-2 518 755. La técnica de hibridización se puede llevar a cabo en varias maneras (Matthews et al., 1988). El método más general consiste en inmovilizar el extracto de ácido nucleico de las células en un soporte (tal como nitrocelulosa, nilón, poliestireno) y en incubar, bajo condiciones bien definidas, el ácido nucleico objetivo inmovilizado con la sonda. Después de la hibridización, el exceso de sonda es eliminado y las moléculas híbridas formadas son detectadas por el método apropiado (medición de la radioactividad, de la fluorescencia de la actividad enzimática ligada a la sonda). La invención, en varias modalidades, del mismo modo, comprende las secuencias de nucleótidos de conformidad con la invención, caracterizadas en que son inmovilizadas en un soporte, covalentemente o no covalentemente. De conformidad con otro modo ventajoso para emplear secuencias de nucleótido de conformidad con la invención, el último puede ser usado inmovilizado en un soporte y puede de este modo, servir para capturar, por hibridación específica, el ácido nucleico objetivo obtenido a partir de la muestra biológica a ser probada. Si es necesario, el soporte sólido se separa de la muestra y el complejo de hibridización formado entre la sonda de captura y el ácido nucleico objetivo es entonces detectado con la ayuda de una segunda sonda, una así llamada sonda de detección, etiquetada con un elemento fácilmente detectable. Otro aspecto de la presente invención es un vector para la clonación y/o expresión de una secuencia, caracterizado en que contiene una secuencia de nucleótido de conformidad con la invención. Los vectores de conformidad con la invención, caracterizados en que contienen los elementos que permiten la integración, expresión y/o la secreción de dichas secuencias de nucleótido en una célula hospedera determinada, son del mismo modo, parte de la invención. El vector puede entonces contener un promotor, señales de inicio y terminación de traducción, así como también regiones apropiadas de regulación de transcripción. Pude ser capaz de ser mantenido establemente en la célula hospedera y puede opcionalmente, tener señales particulares que especifican la secreción de la proteina traducida. Estos diferentes elementos pueden ser elegidos como una función de la célula hospedera usada. Con este fin, las secuencias de nucleótidos de conformidad con la invención, puede ser insertada en vectores de replícación autónoma dentro del hospedero elegido, o vectores integrados del hospedero elegido. Tales vectores serán preparados de conformidad con los métodos actualmente usados por la persona experta en la técnica, y será posible introducir los clones que resultan a partir de estos en un hospedero apropiado por métodos estándares, tales como, por ejemplo, transfección, lipofección, electroporación y choque térmico. Los vectores de conformidad con la invención, son, por ejemplo, vectores de origen viral o plásmido. Un ejemplo de un vector para la expresión de polipéptidos de la invención es baculovirus. Estos vectores son útiles para transformar células hospederas para clonar o expresar las secuencias de nucleótidos de la invención. La invención del mismo modo, comprende las células hospederas transformadas por un vector de conformidad con la invención. Estas células se pueden obtener por la introducción en las células hospederas, de una secuencia de nucleótido insertada en un vector tal como se define anteriormente, después cultivar las células bajo condiciones que permiten la replicación y/o expresión de la secuencia de nucleótido transfectada. La célula hospedera puede ser seleccionada a partir de sistemas procarióticos o eucarióticos, tales como, por ejemplo, células bacterianas (Olins y Lee, 1993), pero del mismo modo, células de levadura (Buckholz, 1993), así como también células vegetales tales como, Arabidopsis sp., y células animales, en particular los cultivos de células de mamífero (Edwards y Aruffo, 1993), por ejemplo, células de ovario de hámster Chino (CHO), pero del mismo modo, las células de insectos en las cuales es posible usar procedimientos empleando baculovirus, por ejemplo, células de insecto sf9 (Luckow, 1993). Modalidades de la invención del mismo modo, se refieren a organismos que comprenden una de las células transformadas de conformidad con la invención. La obtención de organismos transgénicos de conformidad con la invención, expresan uno o más de los genes de Alicyclobacillus acidocaldaríus o parte de los genes se pueden llevar a cabo en, por ejemplo, ratas, ratones, o conejos, de conformidad con métodos bien conocidos por personas expertas en la técnica, tal como por transfecciones virales o no virales. Será posible obtener los organismos transgénicos que expresan uno o más de dichos genes por transfección de copias múltiples de dichos genes bajo el control de un promotor fuerte de naturaleza ubicua, o selectivo para un tipo de tejido. Del mismo modo, será posible obtener los organismos transgénicos por recombinación homologa en cepas de células embriónicas, transferencia de estas cepas de células a embriones, selección de las quimeras afectadas al nivel de las líneas reproductivas, y crecimiento de dichas quimeras. Las células transformadas, así como también los organismos transgénicos de conformidad con la invención, son utilizable en procedimientos para la preparación de polipéptidos recombinantes. Es posible hoy día, producir polipéptidos recombinantes en cantidad relativamente grande por ingeniería genética, usando las células transformadas por vectores de expresión de conformidad con la invención, o usando organismos transgénicos de conformidad con la invención. Los procedimientos para la preparación de un polipéptido de la invencióri en forma recombinante, caracterizados en que emplean un vector y/o una célula transformada por un vector de conformidad con la invención, y/o un organismo transgénico que comprende una de las células transformadas de conformidad con la invención, están los mismos comprendidos en la presente invención. Como se usa en la presente, "transformación" y "transformado", se refiere1 a la introducción de ácidos nucleicos en una célula, sea procariótica o eucariótica. Además, "transformación" y "transformado", no necesitan relacionarse con el control de crecimiento o desregulación de crecimiento. Entre los procedimientos para la preparación de un polipéptido de la invención en forma recombinante, los procedimientos de preparación que emplean un vector, y/o una célula transformada por el vector y/o un organismo transgénico, comprenden una de las células transformadas, que contienen una secuencia de nucleótido de conformidad con la invención, que codifica para un polipéptido de Alicyclobacillus acidocaldarius. Una variante de conformidad con la invención, puede consistir en producir un polipéptido recombinante fusionado a una proteína "portadora" (proteína quimérica). La ventaja de este sistema es que permite la estabilización de y/o una reducción en la proteólisis del producto recombinante, un incremento en la solubilidad en el curso de la renaturalización in vitro y/o una simplificación de la purificación cuando el patrón de fusión tiene una afinidad para un ligando específico. Más particularmente, la invención se refiere a un procedimiento para la preparación de un polipéptido de la invención que comprende las siguientes etapas: a) cultivo de células transformadas bajo condiciones que permiten la expresión de un polipéptido recombinante de secuencia de nucleótido de conformidad con la invención; b) si se necesita, recuperar el polipéptido recombinante. Cuando el procedimiento para la preparación de un polipéptido de la invención emplea un organismo transgénico de conformidad con la invención, el polipéptido recombinante es entonces extraído a partir de dicho organismo. La invención también se refiere a un polipéptido el cual es capaz de obtenerse por un procedimiento de la invención tal como se describe previamente. La invención también comprende un procedimiento para la preparación de un polipéptido sintético, caracterizado en que usa una secuencia de aminoácidos de polipéptidos de conformidad con la invención. La invención del mismo modo, se refiere a un polipéptido sintético obtenido por un procedimiento de conformidad con la invención. Los polipéptidos de conformidad con la invención, pueden del mismo modo ser preparados por técnicas las cuales son convencionales en el campo de la síntesis de péptidos. Esta síntesis se puede llevar a cabo en solución homogénea o en fase sólida.

Por ejemplo, se puede recurrir a la técnica de síntesis en solución homogénea descrita por Houben-Weyl en 1974. Este método de síntesis consiste en condensar sucesivamente, dos por dos, los aminoácidos sucesivos en el orden requerido, o en condensar aminoácidos y fragmentos formados previamente y que ya contienen varios aminoácidos en el orden apropiado, o alternativamente, varios fragmentos previamente preparados encesta forma, entendiéndose que será necesario proteger de antemano, todas las funciones reactivas llevadas a cabo por estos aminoácidos o fragmentos, con la excepción de funciones amino de uno y carboxilos de los otros o vice-versa, lo cual debe normalmente estar involucrado en la formación de enlaces peptídicos, especialmente después de la activación de la función carboxilo, de conformidad con los métodos bien conocidos en la síntesis de péptidos. También se puede recurrir a la técnica descrita por Merrifield. Para elaborar una cadena peptídica de conformidad con el procedimiento de Merrifield, se recurre a una resina polimérica muy porosa, en la cual es inmovilizado el primer aminoácido C-terminal de la cadena. Este aminoácido es inmovilizado en una resina a través de su grupo carboxilo y su función amina es protegida. Los aminoácidos los cuales van a formar la cadena peptídica son de este modo inmovilizados, uno después del otro, en el grupo amino, el cual es desprotegido de antemano cada vez de la porción de la cadena peptídica ya formada, y el cual está unido a la resina. Cuando el total de la cadena peptídica deseada se ha formado, los grupos protectores de los diferentes aminoácidos que forman la cadena peptídica son eliminados y el péptido se separa de la resina con la ayuda de un ácido. La invención adicionalmente se refiere a polipéptidos híbridos que tienen al menos un polipéptido de conformidad con la invención, y una secuencia de un polipéptido capaz de inducir una respuesta inmune en el hombre o animales. Ventajosamente, la determinante antigénica es tal que es capaz de inducir una respuesta humoral y/o celular. Será posible para tal determinante, comprender un polipéptido de conformidad con la invención, en forma glicosilada, pegilada, y/o de otro modo post-traduccionalmente modificado, usado con el fin de obtener composiciones inmunogénicas capaces de inducir la síntesis de anticuerpos dirigidos contra epítopes múltiples. Estas moléculas híbridas pueden ser formadas, en parte, de una molécula portadora de polipéptido o de fragmentos de la misma de conformidad con la invención, asociados con una parte posiblemente inmunogénica, en particular un epítope de la toxina difteria, la toxina tetánica, un antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (patente FR 79 21811), el antígeno VP1 del virus de poliomielitis o cualquier otro antígeno o toxina viral o bacteriana. Los procedimientos para la síntesis de moléculas híbridas abarcan construir secuencias de nucleótidos híbridas que codifican para las secuencias de polipéptidos buscadas. Será posible, por ejemplo, referirse ventajosamente a la técnica para obtener genes que codifican para proteínas de fusión descritas por Minton en 1984. Tales secuencias de nucleótido híbridas que codifican para un polípéptido híbrido, así como también los polipéptidos híbridos de conformidad con la invención, caracterizados en que son polipéptidos recombinantes obtenidos por la expresión de dichas secuencias de nucleótidos híbridas, son del mismo modo, parte de la invención. La invención del mismo modo, comprende los vectores caracterizados en que contienen una de dichas secuencias de nucleótidos híbridas. Las células hospederas transformadas por dichos vectores, los organismos transgénicos que comprenden una de las células transformadas, Í así como también los procedimientos para la preparación de polipéptidos recombinantes usando dichos vectores, las células transformadas y/o los organismos transgénicos son, por supuesto del mismo modo, parte de la invención. Los polipéptidos de conformidad con la invención, los anticuerpos de conformidad con la invención, descritos abajo y las secuencias de nucleótidos de conformidad con la invención, pueden ventajosamente ser empleados en procedimientos para la detección y/o identificación de Alicyclobacillus acidocaldarius, en una muestra capaz de contenerlos. Estos procedimientos, de conformidad con la especificidad de los polipéptidos, los anticuerpos y las secuencias de nucleótidos de conformidad con la invención, los cuales serán usados, serán en particular, capaces de detectar y/o identificar Alicyclobacillus acidocaldarius. Los polipéptidos de conformidad con la invención, pueden ser empleados ventajosamente en un procedimiento para la detección y/o identificación de Alicyclobacillus acidocaldarius en una muestra capaz de contenerlos, caracterizado en que comprende las siguientes etapas: a) contactar esta muestra con un polipéptido o uno de sus fragmentos de conformidad con la invención, (bajo condiciones que permiten una reacción inmunológica entre el polipéptido y los anticuerpos posiblemente presentes en la muestra biológica); d) demostración de los complejos de antígeno-anticuerpo posiblemente formados. Cualquier procedimiento convencional puede ser empleado para llevar a cabo una detección de los complejos de antígeno-anticuerpo posiblemente formados. Por medio del ejemplo, un método preferido pone en juego procesos inmunoenzimáticos de conformidad con la técnica ELISA, por inmunofluorescencia, o procesos radioinmunológicos (RIA) o sus equivalentes. De este modo, la invención del mismo modo se refiere a los polipéptidos de conformidad con la invención, etiquetados con la ayuda de una etiqueta adecuada tal como el tipo enzimático, fluorescente o radioactivo. Tales métodos comprenden, por ejemplo, las siguientes etapas: deposición de cantidades determinadas de una composición de polipéptido de conformidad con la invención, en las cavidades de una placa microtituladora, introducción en dichas cavidades de diluciones incrementadas de suero, o de una muestra biológica distinta de aquella definida previamente, que tiene que ser analizada, incubación de la placa microtituladora, introducción en las cavidades de la placa microtituladora de anticuerpos etiquetados dirigidos contra inmunoglobulinas de cerdo, el etiquetado de estos anticuerpos tiene que llevarse a cabo con la ayuda de una enzima seleccionada a partir de aquellas las cuales son capaces de hidrolizar un sustrato modificando la absorción de la radiación del último, al menos a una longitud de onda predeterminada, por ejemplo a una detección de 550 nm, por comparación con una prueba de control, de la cantidad de sustrato hidrolizado. Los polipéptidos de conformidad con la invención, permiten preparar anticuerpos monoclonales o policlonales, los cuales son caracterizados en que específicamente reconocen los polipéptidos de conformidad con la invención. Será posible ventajosamente, preparar los anticuerpos monoclonales a partir de hibridomas de conformidad con la técnica descrita por Kohler y Milstein en 1975. Será posible preparar los anticuerpos policlonales, por ejemplo, por inmunización de un animal, en particular un ratón, con un polipéptido o un ADN, de conformidad con la invención, asociado con un adyuvante de la respuesta inmune, y después purificación de los anticuerpos específicos contenidos en el suero de los animales inmunizados sobre una columna de afinidad en la cual el polipéptido que ha servido como un antígeno, ha sido previamente inmovilizado. Los anticuerpos policlonales de conformidad con la invención, pueden también ser preparados por purificación, sobre una columna de afinidad en la cual un polipéptido de conformidad con la invención, ha sido previamente inmovilizado, de los anticuerpos contenidos en el suero de un animal inmunológicamente estimulado por Alicyclobacillus acidocaldarius, o un polipéptido o fragmento de conformidad con la invención. La invención del mismo modo, se refiere a anticuerpos mono- o policlonales o sus fragmentos, o anticuerpos quiméricos, caracterizados en que son capaces de reconocer específicamente un polipéptido de conformidad con la invención. Del mismo modo, será posible para los anticuerpos de la invención, ser etiquetados en la misma manera como se describe previamente para las sondas nucleicas de la invención, tal como un etiquetado de tipo enzimático, fluorescente o radioactivo. La invención adicionalmente se dirige a un procedimiento para la detección y/o identificación de Alicyclobacillus acidocaldarius en una muestra, caracterizada en que comprende las siguientes etapas: a) contactar la muestra con un anticuerpo mono- o policlonal de conformidad con la invención, (bajo condiciones que permiten una reacción inmunológica entre dichos anticuerpos y los polipéptidos de Alicyclobacillus acidocaldarius posiblemente presentes en la muestra biológica); b) demostración del complejo antígeno-anticuerpo posiblemente formado. La presente invención del mismo modo, se refiere a un procedimiento para la detección y/o la identificación de Alicyclobacillus acidocaldarius en una muestra, caracterizado en que emplea una secuencia de nucleótido de conformidad con la invención. Más particularmente, la invención se refiere a un procedimiento para la detección y/o la identificación de Alicyclobacillus acidocaldarius en una muestra, caracterizado en que contiene las siguientes etapas: a) si es necesario, aislamiento del ADN a partir de la muestra a ser analizada; b) amplificación especifica del ADN de la muestra con la ayuda de al menos un cebador, o un par de cebadores, de conformidad con la invención; c) demostración de los productos de amplificación. Estos pueden ser detectados, por ejemplo, por la técnica de hibridización molecular utilizando una sonda nucleica de conformidad con la invención. Esta sonda ventajosamente será etiquetada con un isótopo radioactivo o no radioactivo (sonda fría). Para los propósitos de la presente invención, "ADN de la muestra biológica" o "ADN contenido en la muestra biológica", se entenderá por significar ya sea el ADN presente en la muestra biológica considerada, o posiblemente el cADN obtenido después de la acción de una enzima de tipo transcriptasa inversa en el ARN presente en dicha muestra biológica. Una modalidad adicional de la invención comprende un método, caracterizado en que comprende las siguientes etapas: a) contactar una sonda dé nucleótido de conformidad con la invención, con una muestra biológica; el ADN contenido en la muestra biológica si se necesita, tiene que ser previamente elaborado accesible a hibridización bajo condiciones que permiten la hibridización de la sonda con el ADN de la muestra; b) demostración del híbrido formado entre la sonda de nucleótido y el ADN de la muestra biológica. La presente invención también se refiere a un procedimiento de conformidad con la invención, caracterizado en que comprende las siguientes etapas: a) contactar una sonda de nucleótido inmovilizada en un soporte de conformidad con la invención, con una muestra biológica, el ADN de la muestra si se necesita, tiene que ser previamente accesible a hibridización, bajo condiciones que permiten la hibridización de la sonda con el ADN de la muestra; b) contactar el híbrido formado entre la sonda de nucleótido inmovilizada sobre un soporte y el ADN contenido en la muestra biológica, si es necesario después de la eliminación del ADN de la muestra biológica la cual no ha sido hibridízada con la sonda, con una sonda de nucleótido etiquetada de conformidad con la invención; c) demonstración del nuevo híbrido formado en la etapa b). De conformidad con una modalidad ventajosa del procedimiento para detección y/o identificación definido previamente, este se caracteriza en que, previo a la etapa a), el ADN de la muestra biológica es primero amplificado con la ayuda de al menos un cebador de conformidad con la invención. Modalidades de métodos incluyen glicosilar o post-traduccionalmente modificar un primer polipéptido usando un segundo polipéptido seleccionado a partir del grupo que consiste de un polipéptido que tiene al menos, 90% de identidad de secuencia con las SEQ ID NOs:. 1 , 18, 35, 52, 69, 86, 103, 120, 137, 154, 171 , 188, 205, 222, 239, 256, 273, 290, y 309. Modalidades adicionales de métodos incluyen, métodos para modular la estabilidad de la proteína, solubilidad, degradación, perfil de actividad, y/o externalización de un primer polipéptido, los métodos comprenden glicosilar o post-traduccionalmente modificar el primer polipéptido vía un segundo polipéptido seleccionado a partir del grupo que consiste de un polipéptido que tiene al menos, 90% de identidad de secuencia con las SEQ ID NOs:. 1 , 18, 35, 52, 69, 86, 103, 120, 137, 154, 171 , 188, 205, 222, 239, 256, 273, 290, y 309. Modalidades adicionales de métodos incluyen, colocar una célula que produce o que codifica una secuencia de nucleótido recombinante, purificado, y/o aislado, que comprende una secuencia de nucleótido seleccionada a partir del grupo que consiste de secuencias de nucleótidos que tienen al menos, 90% de identidad de secuencia con al menos una de las secuencias de las SEQ ID NOs: 2, 19, 36, 53, 70, 87, 104, 121 , 138, 155, 172, 189, 206, 223, 240, 257, 274, 291 , y 310 y/o un polipéptido recombinante, purificado, y/o aislado seleccionado a partir del grupo que consiste de un polipéptido que tiene al menos, 90% de identidad de secuencia con al menos una de las secuencias de las SEQ ID NOs:. 1 , 18, 35, 52, 69, 86, 103, 120, 137, 154, 171 , 188, 205, 222, 239, 256, 273, 290, y 309 en un ambiente que comprende temperaturas en o arriba de aproximadamente 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, y/o 95°C y/o a pH en, abajo de, y/o arriba de 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 , y/o 0. La presente invención proporciona células que han sido genéticamente manipuladas para tener una capacidad alterada para producir proteínas expresadas. En particular, la presente invención se refiere a microorganismos Gram-positivos, tales como especies de Bacillus, que tienen expresión mejorada de una proteína de interés, en donde uno o más genes cromosomales han sido inactivados, y/o en donde uno o más genes cromosomales han sido suprimidos a partir del cromosoma de Bacillus. En algunas modalidades adicionales, una o más regiones cromosomales autóctonas han sido suprimidas a partir de un cromosoma hospedero de Bacillus de tipo nativo correspondiente. En modalidades adicionales, el Bacillus es un Alicyclobacillus sp. o Alicyclobacillus acidocaldaríus. En modalidades adicionales, métodos para glicosilar y/o post-traduccionalmente modificar un polipéptido a temperaturas en o arriba de aproximadamente 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, y/o 95 °C y/o a un pH en, abajo de, y/o arriba de 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 , y/o 0 vía una secuencia de nucleótído recombinante, purificado, y/o aislado, que comprende una secuencia de nucleótido seleccionado a partir del grupo que consiste de secuencias de nucleótidos que tienen al menos, 90% de identidad de secuencia con al menos una de las secuencias de las SEQ ID NOs: 2, 19, 36, 53, 70, 87, 104, 121 , 138, 155, 172, 189, 206, 223, 240, 257, 274, 291 , y 310 y/o un polipéptido recombinante, purificado, y/o aislado seleccionado a partir del grupo que consiste de un polipéptido que tiene al menos, 90% de identidad de secuencia con al menos una de las secuencias de las SEQ ID NOs:. 1 , 18, 35, 52, 69, 86, 103, 120, 137, 154, 171 , 188, 205, 222, 239, 256, 273, 290¡ y 309. En modalidades de la invención, uno cualquiera de los polipéptidos aislados y/o purificados de conformidad con la invención, puede ser enzimáticamente o funcionalmente activo a temperaturas en o arriba de aproximadamente 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, y/o 95°C y/o puede ser enzimáticamente o funcionalmente activo a un pH en, por debajo de y/o arriba de 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 , y/o 0. En modalidades adicionales de la invención, glicosilación, pegilación, y/o otra modificación post-traduccional pueden ser requeridas para los polipéptidos aislados y/o purificados de conformidad con la invención, para ser enzimáticamente o funcionalmente activos a pH en o por debajo de 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 , y/o 0 o a temperaturas en o arriba de aproximadamente 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, y/o 95°C. La invención se describe en detalle adicional en los siguientes ejemplos ilustrativos. Aunque los ejemplos pueden representar solamente modalidades seleccionadas de la invención, se debe entender que los siguientes ejemplos son ilustrativos y no limitantes.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 : Glicosilación usando secuencias de aminoácido y nucleótidos a partir de Alicyclobacillus acidocaldarius Proporcionadas en las SEQ ID NOs: 2, 19, 36, 53, 70, 87, 104, 121 , 138, 155, 172, 189, 206, 223, 240, 257, 274, 291 , y 310, están secuencias de nucleótidos aislados a partir de Alicyclobacillus acidocaldarius, y que codifican para los polipéptidos de las SEQ ID NOs: 1 , 18, 35, 52, 69, 86, 103, 120, 137, 154, 171 , 188, 205, 222, 239, 256, 273, 290, y 309, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos de las SEQ ID NOs: 2, 19, 36, 53, 70, 87, 104, 121 , 138, 155, 172, 189, 206, 223, 240, 257, 274, 291 , y 310, son colocadas en vectores de expresión usando técnicas estándares en el arte. Los vectores son entonces proporcionados a las células, tales como células bacterianas o células eucarióticas tales como células Sf9 o células CHO. En conjunto con la maquinaria normal presente en las células, los vectores que comprenden las SEQ ID NOs: 2, 19, 36, 53, 70, 87, 104, 121 , 138, 155, 172, 189, 206, 223, 240, 257, 274, 291 , y 310, producen los polipéptidos de las SEQ ID NOs: 1 , 18, 35, 52, 69, 86, 103, 120, 137, 154, 171 , 188, 205, 222, 239, 256, 273, 290, y 309. Los polipéptidos de las SEQ ID NOs: 1 , 18, 35, 52, 69, 86, 103, 120, 137, 154, 171 , 188, 205, 222, 239, 256, 273, 290, y 309, son entonces después aislados lo purificados. Los polipéptidos aislados y/o purificados de las SEQ ID NOs: 1 , 18, 35, 52, 69, 86, 103, 120, 137, 154, 171 , 188, 205, 222, 239, 256, 273, 290, y 309, son entonces cada uno demostrados por tener una o más de las actividades proporcionadas en el cuadro 1. Los polipéptidos aislados y/o purificados de las SEQ ID NOs: 1 , 18, 35, 52, 69, 86, 103, 120, 137, 154, 171 , 188, 205, 222, 239, 256, 273, 290, y 309, son demostrados por tener actividad en la glicosilación de otras proteínas en conjunto con otras proteínas o componentes celulares.

EJEMPLO 2: Modulación de estabilidad de proteína, solubilidad, degradación, perfil de actividad y/o externalización de un primer péptído usando secuencias de aminoácidos y/o nucleótidos a partir de Alicyclobacillus acidocaldaríus Los polipéptidos y secuencias de nucleótidos del Ejemplo 1 , son usados para modificar post-traduccionalmente uno o más de otras proteínas a través de la glicosilación u otra modificación post-traduccional. Las proteínas modificadas son demostradas por tener estabilidad de proteína alterada, solubilidad, degradación, perfil de actividad y/o externalización en comparación con proteínas no modificadas de la misma o similar secuencia de aminoácido.

EJEMPLO 3: Proteínas glicosiladas de Alicvclobacillus acidocaldarius Se obtuvo el polipéptido RAAC02676 (SEQ ID NO:307) vía el siguiente protocolo. Se cultivó Alicyclobacillus acidocaldarius en arabinoxilano de trigo y se recolectó después de tres días. El cultivo se centrifugó para remover las células y el sobrenadante resultante se filtró con un filtro de 0.22 micrones para remover algunos desechos restantes. El sobrenadante filtrado se concentró a aproximadamente 1 mL por ultrafiltración a través de una membrana de corte de peso molecular de 10,000 Da. El sobrenadante filtrado concentrado resultante, adicionalmente se purificó atrapando proteínas sobre una columna de intercambio catiónico, eluyéndolas con un gradiente de sal, recargándolas en una segunda columna de intercambio catiónico y eluyendo con un segundo gradiente de sal. Las muestras se combinaron y se corrieron en un gel de SDS-PAGE al 12%. Las bandas individuales se cortaron del gel y se sometieron a digestión tríptica en gel. Los fragmentos peptídicos entonces se eluyeron y se separaron en una columna C-18 e inyectaron en un espectrómetro de masas de trampa iónica vía electrorocío. Los espectros de masa se corrieron a través MASCOT el cual compara el espectro observado al espectro teórico generado a partir de la secuencia de proteína conocida. El MASCOT permite al usuario especificar modificaciones que podrían existir en la proteína y carecen para el espectro consistente con estas modificaciones. MASCOT identifica un número de péptidos digeridos a partir de RAAC02676 que fueron potencialmente glicosilados como se proporciona en el cuadro 2 siguiente. Como se puede ver en el cuadro 2, las Consultas 94, 96, 221 , 332, 333, 337, y 400, regresaron a glicosilaciones esperadas en RAAC02676. Todos los fragmentos en el cuadro 2 son fragmentos de las SEQ ID NO:307 (RAAC02676). Una versión glicosilada de RAAC02676 de conformidad con los sitios determinados se proporciona en la SEQ ID NO:308.

CUADRO 2 EJEMPLO 4: Teñido de glicoproteína de proteínas a partir de Alicyclobacillus acidocaldarius Se cultivó Alicyclobacillus acidocaldarius en arabinoxilano de trigo y se recolectó después de tres días. El cultivo se centrifugó para remover las células y el sobrenadante resultante se filtró con un filtro de 0.22 micrones para remover algunos desechos restantes. El sobrenadante filtrado se concentró a aproximadamente 1 ml_ por ultrafiltración a través de una membrana de corte de peso molecular 10,000 Da. Varias líneas de este material concentrado se corrieron sobre un gel de SDS-PAGE al 12% junto con un control positivo y negativo que son proteínas glicosiladas y no glicosiladas conocidas, usando protocolos estándares. El gel de cortó a la mitad verticalmente y una mitad se tiñó usando, Tinte Simply Blue Safe y la otra mitad usando un kit de detección de glicoproteína de Sígma. Los controles tanto negativo como positivo, ambos se tiñeron usando el teñido Simply Blue y solamente el control positivo se tiñó con el teñido de glicoproteína indicando que el protocolo de teñido está funcionando correctamente. Las líneas de proteína de Alicyclobacillus acidocaldarius, revelaron una banda a aproximadamente 120 kDa en el gel de teñido Simply Blue el cual es el peso esperado de una proteína extracelular de Alicyclobacillus acidocaldarius. La misma posición en el gel teñido de glicoproteína mostró bandas rosa indicado un resultado positivo para una proteina glicosilada. Mientras esta invención ha sido descrita en ciertas modalidades, la presente invención puede ser además modificada dentro del alcance y campo de esta descripción. Esta solicitud está por lo tanto, propuesta para cubrir cualquiera de las variaciones, usos, o adaptaciones de la invención usando sus principios generales. Además, esta solicitud está propuesta para cubrir tales apartados a partir de la presente descripción, como viene dentro del conocimiento o práctica habitual en la técnica a la cual esta invención pertenece y la cual cae dentro de los límites de las reivindicaciones adjuntas y sus equivalentes legales.

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Claims (10)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES t

1. Una secuencia de ácido nucleico aislado o purificado, que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene al nienos 90% de identidad de secuencia a la SEQ ID NO. 1.

2. La secuencia de ácido nucleico purificado o aislado de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el polipéptido tiene actividad enzimática en o por debajo de aproximadamente pH 8.

3. La secuencia de ácido nucleico purificado o aislado de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el polipéptido tiene actividad enzimática a una temperatura en o arriba de aproximadamente 35 grados centígrados. '

4. La secuencia de ácido nucleico purificado o aislado de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la secuencia de ácido nucleico está presente en un vector. ¡

5. Un polipéptido aislado o purificado, que comprende un polipéptido que tiene al menos 90% de identidad de secuencia a la SEQ ID NO. 1.

6. El polipéptido aislado o purificado de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque el polipéptido tiene actividad enzimática en o por debajo de aproximadamente pH 8.

7. El polipéptido aislado o purificado de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque el polipéptido tiene actividad enzimática a una temperatura en o arriba de aproximadamente 35 grados centígrados.

8. El polipéptido aislado o purificado de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque el polipéptido es glicosilado, pegilado, o de otro modo post-traduccionalmente modificado.

9. El polipéptido aislado o purificado de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque el polipéptido tiene actividad de glicosiltransferasa.

10. Un método para glicosilar o post-traduccionalmente modificar un primer polipéptido a temperaturas en o arriba de aproximadamente 35°C o a un pH en o por debajo de aproximadamente 8, el método comprende: proporcionar un polipéptido recombinante, purificado o aislado, codificado por una secuencia de nucleótido que comprende una secuencia de nucleótido que tiene al menos 90% de identidad de secuencia a la SEQ |D NO: 2; glicosilar o post-traduccionalmente modificar el primer polipéptido con el polipéptido recombinante, purificado o aislado. 1 1. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque glicosilar o post-traduccionalmente modificar el primer polipéptido ocurre en o por debajo de aproximadamente pH 8. 12. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque glicosilar o post-traduccionalmente modificar el primer pólipéptido ocurre a una temperatura en o arriba de aproximadamente 35 grados centígrados. 13. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque el pólipéptido recombinante, purificado o aislado es glicosjlado, pegilado, o de otro modo post-traduccionalmente modificado. 14. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque el pólipéptido recombinante, purificado o aislado tiene actividad de glicosiltransferasa. 15. Un método para modular la estabilidad de proteína, solubilidad, degradación, perfil de actividad, o externalización de un primer pólipéptido, el método comprende: proporcionar un pólipéptido recombinante, purificado o aislado, codificado por una secuencia de nucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 90% de identidad, de secuencia a la SEQ ID NO: 2; glicosilar o post-traduccionalmente modificar el primer pólipéptido con el pólipéptido recombinante, purificado o aislado. 16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque glicosilar o post-traduccionalmente modificar el primer pólipéptido ocurre en o por debajo de aproximadamente pH 8. ' 17. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque glicosilar o post-traduccionalmente modificar el primer pólipéptido ocurre a una temperatura en o arriba de aproximadamente 35 grados centígrados. 18. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque el polipéptido recombinante, purificado o aislado es glicosilado, pegilado, o de otro modo post-traduccionalmente modificado. 19. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque el polipéptido recombinante, purificado o aislado tiene actividad de glicosiltransferasa. 20. Una secuencia de ácido nucleico aislado o purificado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido seleccionado a partir del grupo que consiste de polipéptidos que tienen al menos 90% de identidad de secuencia a las SEQ ID NOs:. 1 , 18, 35, 52, 69, 86, 103, 120, 137, 154, 171 , 188, 205, 222, 239, 256, 273, 290, y 309. 21. Un polipéptido aislado o purificado que comprende un polipéptido seleccionado a partir del grupo que consiste de polipéptidos que tienen al menos 90% de identidad de secuencia a las SEQ ID NOs:. 1 , 18, 35, 52, 69, 86, 103, 120, 137, 154, 171 , 188, 205, 222, 239, 256, 273, 290, y 309. 22. El polipéptido aislado o purificado de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque el polipéptido tiene una actividad seleccionada a partir del grupo que consiste de actividad UDP beta-glucosefosfotransferasa, dolicol-fosfato manosiltransferasa, y glicosiltransferasa. 23. Un método para glicosilar o post-traduccionalmente modificar un primer polipéptido a temperaturas en o arriba de aproximadamente 35°C, o a un pH en o por debajo de aproximadamente 8, el método comprende: proporcionar un polipéptido recombinante, purificado o aislado, codificado por una secuencia de nucleótido que comprende, una secuencia de nucleótido seleccionada a partir del grupo que consiste de una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con al menos, una de las secuencias de las SEQ ID NOs: 2, 19, 36, 53, 70, 87, 104, 121 , 138, 155, 172, 189, 206, 223, 240, 257, 274, 291 , y 310; glicosilar o post-traduccionalmente modificar el primer polipéptido con el polipéptido recombinante, purificado o aislado. 24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque el polipéptido recombinante, purificado o aislado tiene una actividad seleccionada a partir del grupo que consiste de actividad UDP beta-glucosefosfotransferasa, dolicol-fosfato manosiltransferasa, y glicosiltransferasa. 25. Un método para modular la estabilidad de proteina, solubilidad, degradación, perfil de actividad, o externalización de un primer polipéptido, el método comprende: proporcionar un polipéptido recombinante, purificado o aislado, codificado por una secuencia de nucleótido que comprende, una secuencia de nucleótido seleccionada a partir del grupo que consiste de una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con al menos, una de las secuencias de las SEQ ID NOs: 2, 19, 36, 53, 70, 87, 104, 121 , 138, 155, 172, 189, 206, 223, 240, 257, 274, 291 , y 310; glicosilar o post-traduccionalmente modificar el primer 67 polipéptido con el polipéptido recombinante, purificado o aislado. 26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque el polipéptido recombinante, purificado o aislado tiene una actividad seleccionada a partir del grupo que consiste de actividad UDP beta-glucosefosfotransferasa, dolicol-fosfato manosiltransferasa, y glicosiltransferasa.