NL192880C

NL192880C - Nucleïnezuur dat voor het oppervlakte-antigeen van een Hepatitis B virus codeert, peptide waarvoor het codeert, vector die het nucleïnezuur bevat , hybride-eiwit waarvoor het in de vector ingevoegde nucleïnezuur codeert, en vaccin dat het hybride-eiwit bevat.

Info

Publication number: NL192880C
Application number: NL8020315A
Authority: NL
Inventors: Patrick Charnay; Pierre Tiollais; Francis Galibert
Original assignee: Inst Nat Sante Rech Med; Pasteur Institut
Priority date: 1979-08-30
Filing date: 1980-08-29
Publication date: 1998-04-02
Also published as: US4428941A; SE462530B; SE8303463L; GB2070621B; SE460727B; DE3049831T1; NL192880B; CA1163585A; JPS6362198B2; FR2480779A2; LU88365I2; WO1981000577A1; SE8303463D0; CH663796A5; SE8102726L; JPS56501128A; FR2480779B2; BE884988A; GB2070621A; NL8020315A

Description

1 192880

NucleTnezuur dat voor het oppervlakte-antigeen van een Hepatitis B virus codeert, peptide waarvoor het codeert, vector die het nucleïnezuur bevat, hybride-eiwit waarvoor het in de vector ingevoegde nucleïnezuur codeert, en vaccin dat het hybride-eiwit bevat 5 Deze uitvinding betreft een nucleïnezuur dat een sequentie bevat die codeert voor het oppervlakte-antigeen van een Hepatitis B virus.

Hepatitis B is een veel voorkomende virusziekte, vooral in tropisch Afrika, Zuid-oost Azië en het Verre Oosten.

Het etiologische agens is een virus (Hepatitis B), ook wel ”het deeltje van Dane” genoemd, bestaande uit 10 een omhulling (antigeen HBs), een capside (antigeen HBc), een endogeen polymerase en een ringvormig DNA, dat gedeeltelijk enkelstrenging is; de langere keten van dit DNA-molecule omvat ongeveer 3200 nucleotiden (J. Summers, A. O'Connel en I. Millman in Proc. Nat. Acad. Sci. USA 72 (1975) 4 597-4 601).

Het endogene DNA-polymerase kan gebruikt worden voor het in vitro herstellen van de kortere keten (T.A. Landers, H.B. Greenberg en W.S. Robinson in J. Virol 23 (1977) 368-376). Bij elektroforetische 15 analyse van de eiwitten van de omhulling vindt men twee tot zeven polypeptiden, waarvan polypeptide I en polypeptide II de voornaamste zijn (D.L. Peterson, I.M. Roberts en G.N. Vyas in Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74 (1977) 1 530-34 en D.L. Peterson, D.Y. Chien, G.N. Vyas, D. Nitecki en H. Bond in Viral Hepatitis onder redactie van G. Vyas, S. Cohen en R. Schmid, Franklin Institute Press, Philadelphia (1978) 569-573).

Polypeptide I heeft een moleculegewicht van 22.000 tot 26.000. Polypeptide II is geglycosyleerd en heeft 20 een moleculegewicht van 28.000 tot 30.000. In samenstelling lijken deze twee polypeptiden heel veel op elkaar; de eerste 15 aminozuren (te rekenen vanaf het N-einde) en de laatste drie zijn van die twee peptiden dezelfde, zodat men wel veronderstelt dat polypeptide II alleen maar een geglycosyleerd polypeptide I zou zijn.

Het onderzoeken van het virus is uitermate moeilijk doordat men over geen enkel kweekmedium beschikt 25 waarin het virus zich kan vermeerderen. De moeilijkheid is reeds ten dele onderkend, meer in het bijzonder wat het serotype ayw betreft. Het gehele DNA (genoom) van het virus is door A. Fritsch, C. Pourcel, P. Charnay en P. Tiollais (C.R. Acad. de Paris 287 (1978) 1 453-56) geïdentificeerd en gekloneerd, met name in E. coli na voorafgaande invoeging op de unieke EcoRI plek van een vector Xgt. WES. Xb.

Tot op heden waren de volgorden in polypeptide I en II zelf en de plaatsen in het virus-DNA van die 30 sequenties die voor deze peptiden coderen, nog niet bekend.

De uitvinding heeft tot doel een DNA-sequentie te verschaffen die veel kleiner is dan het virus-DNA zelf, welke voor het peptide met immunogene eigenschappen kan coderen en die, als hij in het organisme van een levende gastheer ingevoegd is, de productie in deze laatste van antilichamen kan inleiden, welke uiteindelijk deze gastheer kunnen beschermen tegen het Hepatitis B virus, met name als dat virulent is.

35 De uitvinding is niet alleen ontstaan uit de volledige nucleotide-analyse van het genoom van het deeltje van Dane waaraan de uitvinders gewerkt hebben, maar ook uit het idee dat zij hebben gehad tot identificatie van het gen (hierna ”gen S” genoemd) dat codeert voor de polypeptiden, namelijk het zoeken in de nu dus volledig bekende nucleotidestructuur van het genoom van het deeltje van Dane, naar de structuur van de nucleotidesequenties die kunnen coderen voor de bekende beginstandige en eindstandige peptidese-40 quenties van deze polypeptiden.

Gevonden zijn nu de samenstelling en plaats van het antigeen en er is een nucleïnezuur gemaakt dat de immunogene bescherming van de mens mogelijk maakt.

Deze uitvinding verschaft een nucleïnezuur volgens de aanhef, gekenmerkt doordat de sequentie codeert voor een peptide weergegeven in de figuren 3A, 3B en 3C tezamen, of voor een peptide dat een variant is 45 van het peptide weergegeven in de figuren 3A, 3B en 3C tezamen, welke variant het resultaat is van plaatseiijke mutaties of modificaties van de structuur ten gevolge van uiteenlopende serotypes zoals adw, adr en ayr, mits die varianten immunologische eigenschappen hebben overeenkomstig die van het in de figuren 3A, 3B en 3C tezamen weergegeven peptide.

50 De uitvinding wordt nader toegelicht aan de hand van de volgende tekening.

Figuur 1 is een schema van het genoom van het deeltje van Dane. Dat omvat twee strengen b1 en b2; de kortste daarvan (b2) is normaliter verstoken van het gedeelte dat in figuur 1 met een stippellijn aangegeven is.

Het is bekend dat dit DNA slechts één enkele EcoRI-plaats heeft.

55 Pijl f1 geeft de richting aan waarin de nucleotiden genummerd zijn waaruit de langste streng b1 bestaat en pijl f2 de richting waarin het DNA van het virus overgeschreven wordt, met name door het apparaat in de cellen waarin het Hepatitis B virus binnengedrongen is, althans bij het tot expressie brengen van gen S. De 192880 2

EcoRI-plaats wordt dus het nummer 0 toegekend, of, om preciezer te zijn, in Hepatitis B virus van het serotype ayw het nummer 3182.

De met een getrokken lijn getekende binnencirkel e geeft de lengte in procent van het DNA weer en maakt het mogelijk de plaatsen van sommige van zijn onderdelen te preciseren.

5 De uitvinding is dat aangetoond is dat gen S in wezen dat fragment van de langste streng b1 is dat op het schema van figuur 1 tussen plaatsen 73,6 en 95,1 ligt. De aanduidingen ’’start” en ’’stop” geven de begin- en eindpunten van het overschrijven van gen S aan.

Figuren 2A, 2B en 2C tezamen zijn voorstellingen van het eindstandige gedeelte van dit genoom, met name van wat er tussen 60,4% en 100% van dat genoom ligt. De vier in figuur 2 voorkomende letters geven 10 op gebruikelijke wijze de vier nucleotiden van het DNA aan: A = Adenine, G = Guanine, T = Thymine en C = Cytosine.

De onderste van elk paar regels van figuren 2A, 2B en 2C staat voor het nucleïnezuur van streng b2.

De karakterisering van de nucleotiden sequentie van het "gen S”, zoals deze in het kader van de onderhavige uitvinding is voorgesteld en waarvan het beginpunt £”S” en het eindpunt t”S” in figuren 2A, 2B 15 en 2C tezamen aangegeven zijn, resulteert uit de vaststelling dat: de 14 eerste tripletten (in de richting van f2) uitgaande van het nucleotide nummer 3030 ten opzichte van het eindpunt EcoRI voor de 14 eerste aminozuren van de beginsequentie van de 15 eerste aminozuren van de polypeptiden kunnen coderen.

de 4 laatste tripletten GTA TAC ATT TAA gelezen op de complementaire keten b2 naar de overgeschre-20 ven keten b1 respectieve overeenkomen met de drie eindstandige aminozuren van de polypeptiden en met een stopcodon, deze nucleotidesequentie (678 nucleotiden) geen enkel stopcodon, bevat, wanneer men ten minste uitgaat van het leeskader dat inhoudt dat het eerste triplet "gelezen” op het DNA door het cellulaire apparaat AUG is (overeenkomend met ATG in de complementaire streng), 25 de volledige vertaling van de genetische informatie te beginnen met het begincodon ATG leidt tot een theoretisch polypeptide van 226 aminozuren met een moleculegewicht van 25422.

Dit gen S en het polypeptide dat uit de vertaling van gen S resulteert zijn in de figuren 3A, 3B en 3C tezamen weergegeven.

De uitvinding heeft dus betrekking op de hierin gedefinieerde nucleïnezuurfragmenten, die kunnen 30 worden uitgesneden uit het DNA van het deeltje van Dane, welke fragmenten daardoor worden gekenmerkt, dat de sequentie ervan codeert voor een peptide, weergegeven in de figuren 3A, 3B en 3C tezamen.

De uitvinding betreft ook een peptide waarvoor het hierboven genoemde nucleïnezuur codeert, een vector die het bovengenoemde nucleïnezuur bevat, een hybride-eiwit waarvoor het in de bovengenoemde vector ingevoegde nucleïnezuur codeert en een vaccin dat als werkzaam bestanddeel het hybride-eiwit 35 bevat.

Het volgens deze uitvinding te gebruiken nucleïnezuur vertoont een zekere variabiliteit, die bij expressie leidt tot verschillende determinanten van het subtype d, w, y en r van de groep a van het Hepatitis B virus. Bij het in figuren 3A, 3B en 3C weergegeven peptide ziet men dat het eerste N-eindstandige aminozuur methionine en het aminozuur aan het andere uiteinde isoleucine is.

40 Het spreekt vanzelf dat onder de bovengenoemde "equivalent peptidesequentie” elke peptidesequent moet worden verstaan, waarin bepaalde gedeelten niet rigoureus identiek zijn aan overeenkomstige gedeelten van de peptidesequentie die wordt voorgesteld in figuren 3A, 3B en 3C tezamen deze variaties kunnen het gevolg zijn van lokale mutaties die het algemene immunogene karakter van het eiwit niet nadelig beïnvloeden of van struktuurmodificaties die behoren bij de verschillende serotypen waarin de 45 eiwitten van het soort in kwestie kunnen voorkomen (met name serotypen afd, adr, en ayr).

Eveneens vallen onder de uitvinding de nucleorideketens, die zich van de voorafgaande onderscheiden door bepaalde tripletten of kleine tripletsequenties voor zover deze nucleotidesequenties geschikt blijven voor het coderen van een polypeptide als verkrijgbaar met een nucleotide met de sequentie van figuren 3A, 3B en 3C tezamen.

50 Het nucleïnezuur van de uitvinding is bedoeld voor opname in een vector, die het tot expressie kan brengen in een bacterie en in de eucaryote cellen, met name gezien de productie van een eiwit of een peptide, dat in het organisme met een levende gastheer de productie kan inleiden van actieve antilichamen tegen het Hepatitis B virus. Het eiwit of het peptide, dat resulteert uit de translatie van de nucleotidesequentie volgens de uitvinding kan worden gebruikt als vaccineermiddel of als middel ten dienste van de 55 diagnose.

Het nucleïnezuur van de uitvinding kan ook worden gebruikt als sonde voor het vaststellen van het al of niet aanwezig zijn in bloedmonsters of proefserum van deeltjes van Dane, antigeen HBs of fragmenten 3 192880 daarvan, enz. (volgens de klassieke methode van DNA-DNA hybridisatie).

Andere eigenschappen van de uitvinding blijken nog uit onderstaande korte beschrijving van de werkwijzen ter analyse, identificatie en verkrijging van de DNA fragmenten volgens de uitvinding. Daarbij wordt natuurlijk verwezen naar de tekeningen, waarvan de figuren reeds in het voorafgaande in aanmerking 5 zijn genomen.

De uitvinding heeft ook betrekking op bijzondere vectoren, die de boven beschreven nucleotide-sequenties tot expressie kunnen brengen, in het bijzonder een vector- faag of plasmide - die ten minste een deel van het lactose-operon bevat, in het bijzonder de promotor en het gen Z van dat operon, welke vector gekenmerkt wordt doordat zij gemodificeerd is door de insertie, in fase, op een geschikte plek van gen Z, 10 bijvoorbeeld de plek EcoRI van een hiervoor gedefinieerd nucleïnezuur.

De uitvinding heeft ook betrekking op een hybride-eiwit, waarvoor het in de hiervoor beschreven vector ingevoegde nucleïnezuur codeert.

Ter toelichting van de uitvinding wordt verwezen naar de beschrijving van de voorkeursvoorbeelden in combinatie met de tekeningen, waarvan 15 figuren 1a en 1h schematisch opeenvolgende trappen weergeven van de vervaardiging van een vector van het plasmidetype, die een hiervoor gedefinieerd fragment van HBV DNA bevat en figuren 2a tot 2c schematisch de beginstructuren weergeven aan de gebruikte vector (figuur 2a) de eindstructuur weergegeven van de verkregen gemodificeerde vector (figuur 2b) en die van het hybride-eiwit ten gevolge van de expressie van deze gemodificeerde vector in E. coli (figuur 2c).

20 A. NUCLEOTIDESEQUENTIES De producten en gebruikte methoden.

De gebruikte enzymen en chemische producten.

De gebruikte restrictie enzymen: BamHI, Hhal, Hindi, Haelll, Xbal, Mbol, Hinfl, Hpall, Xhol, zijn die, 25 gefabriceerd door BIOLABS. Men heeft DNA-polymerase I van BOEHRINGER gebruikt. De alkalische bacteriële fosfatase en de polynucleotidekinase zijn geleverd door P.L. BIOCHEMICALS. De chemicaliën waren de volgende: . Dimethylsulfaat (ALDRICH), . Hydrazine (EASTMAN KODAK), 30 . Acrylamide en bisacrylamide (2 maal gekristalliseerd - SERVA), . Dideoxinucleotide trifosfaten en deoxinucleotide trifosfaten (P.L. BIOCHEMICALS), . Piperidine (MERCK) herdestilleerd onder vacuüm.

Bereiding van DNA HBV.

Het gehele genoom HBV (subtype ayw) is gedoneerd in E. coli onder gebruikmaking van de unieke 35 restrictieplek EcoRI van de vector λρί. WES. λΒ (14). Het gedoneerde DNA wordt hierna ”Eco HBV DNA” genoemd.

De recombinerende bacteriofaag is in een Petrischaal versterkt op Agar en men heeft het gezochte DNA op bekende wijze geëxtraheerd. Na vertering van het DNA voor het restrictie-enzyme EcoRI heeft men de sequentie Eco HBV DNA gezuiverd door ultracentrifugering in een sacharosegradiënt, volgens de methode, 40 beschreven in de bibliografische referenties (16, 17).

Bereiding van DNA fragmenten, gemerkt 5'32p 10 tot 20 picomolen van Eco HBV DNA zijn onder de door de fabrikant aanbevolen omstandigheden volledig gehydrolyseerd door de verschillende restrictie-enzymen. De DNA fragmenten zijn gedefosforyleerd door alkalische fosfatase, die daarna geïnactiveerd is door een alkalische behandeling. Het DNA is daarna 45 geprecipiteerd met ethanol, volgens de methode, beschreven in artikel (18). Na heroplossing in een buffer op basis van spermidine, zijn de DNA aan hun uiteinde 5' gemerkt met een {ΑΤΡ λ32Ρ} (300 Ci/mM, bereid door NEW ENGLAND NUCLEAR) en met polynucleotidekinase (volgens de methode van artikel (19)).

De DNA fragmenten van de restrictie zijn door elektroforese over polyacrylamidegel gescheiden en daarna geëlueerd. Men onderwerpt de gemerkte uiteinde aan segregatie door elektroforese over polyacryla-50 midegel op op zichzelf bekende wijze na restrictie met een ander enzym of door denaturering van de DNA fragmenten van het soort in kwestie.

Bepaling van de structuur van de DNA nucleotideseguenties.

De primaire structuur van de DNA fragmenten van dubbele streng of enkele streng is in wezen bepaald volgens de methode, beschreven door MAXAM en GILBERT (19). Men heeft ook zijn toevlucht genomen tot 55 de methode van de eindstandige inhibitors van de ketens beschreven door SANGER et al. (20) en aangepast door MAAT en SMITH (21) voor wat betreft de fragmenten met dubbele streng, die aan één van hun uiteinde 5' gemerkt zijn.

192880 4

De producten van de chemische en enzymatische reactie zijn geanalyseerd door elektroforese in gelen van acrylamide van 8,16 of 25% van 1 mm dikte.

Methoden en resultaten van de analyse.

Na te hebben bepaald of het genoom HBV de polypeptiden I en II kan coderen, zijn alle fragmenten 5 Haelll (restrictieplekken Haelll van het genoom HBV, weergegeven in figuur 1 met kleine pijltjes) gemerkt aan hun uiteinde 5'. Aanzienlijke gedeelten van hun primaire structuren zijn bepaald volgens de methode van MAXAM en GILBERT. De nucleotidesequenties, die de beginstandige en eindstandige aminozuur-sequenties van polypeptiden I en II kunnen coderen zijn gelokaliseerd in de fragmenten Haill E en Halll F, vooraf gelokaliseerd op de kaart van de restrictie van het genoom HBV (volgens de methode, beschreven in 10 referentie (17)). Dit zijn de nucleotidesequenties, die beschouwd worden aan de uiteinde te bestaan uit ”gen S” en zelf de posities 73,6 en 95,1 innemen ten opzichte van de restrictieplek EcoRI (figuur 1) om reeds genoemde redenen.

De nucleotidesequentie tussen deze twee posities is geanalyseerd onder gebruikmaking van bekende chemische methoden, met name de methode van de chemische afbraak met hydrazinedimethylsulfaat en de 15 methode van de beëindiging van ketens. Men heeft onder de verschillende door MAXAM en GILBERT voorgestelde chemische reacties zijn toevlucht gezocht tot een partiële verontreiniging door mierenzuur en tot de splijting door piperidine, welke methoden gelijke intensiteitsbanden geven op de autoradiogrammen voor de fragmenten, die op een guanine en een adenine eindigen. Men heeft ook gebruik gemaakt van reacties met hydrazine, gevolgd door een splitsing met piperidine, teneinde gelijke intensiteitsbanden te 20 verkrijgen, voor de nucleotiden cytosine en thymidine: de elektroforetische fractionering van de producten van deze twee reacties geeft voor alle basen een vlek in de ene of de andere van de gebruikte gel-kolommen. Deze procedure vergemakkelijkt de lezing van het autoradiogram van de gel. De hydrazine-reactie in aanwezigheid van natriumchloride, die voor cytosine specifiek is, maakt het mogelijk dit nuclotide te onderscheiden van thymidine en de reactie met dimethylsulfaat, gevolgd door een splitsing met piperidine 25 specifiek voor guanine maakt het mogelijk dit laatste nucleotide te onderscheiden van adenine.

Teneinde zich te verzekeren van de grootst mogelijke precisiegraad, zijn er onderscheidenlijke nucleotidesequenties, die verschillende fragmenten vormen, die onderling op elkaar passen, geproduceerd door hydrolyse van Eco HBV DNA door verschillende restrictie-enzymen:

BamHi, Hinfl, Hpall, Haell en Hindi.

30 Op deze wijze is de analyse van elke restrictieplek, die als uitgangspunt van de eerste onderzochte fragmenten is genomen, bevestigd door analyse van de onderscheidenlijke fragmenten, waarin de restrictieplekken van de eerste fragmenten ingesloten liggen tussen de nieuwe uiteinden van deze onderscheidenlijke fragmenten.

Het ”gen S" weergegeven in figuren 3A, 3B en 3C, dat begint met begincodon ATG, omvat 227 35 tripletten, waaronder een stopcodon TAA. De drie codons, die corresponderen met de drie aminozuren aan het uiteinde van de carboxieinden van het overeenkomstige polypeptide zijn gesitueerd in hetzelfde leeskader, onmiddellijk voor de stopcodon TAA. Een van de twee andere leeskaders (die ten opzichte van het voorafgaande respectieve zijn ontdaan van 1 en 2 nucleotiden) mist ook een stopcodons, maar codeert voor een volkomen ander eiwit dan bovengenoemde polypeptiden I en II. Het derde leeskader omvat 10 40 stopcodon (5 TAG, 4 TGA, 1TAA). Op de andere DNA streng bevinden de drie leeskaders zich respectieve afgesloten door 11, 11 en 6 stopcodons, die over de lengte van de DNA sequentie verspreid liggen.

Zoals boven reeds is aangegeven, leidt de volledige vertaling van de genetische informatie, die begint bij de begincode ATG tot een theoretisch polypeptide van 226 aminozuren, overeenkomend met een molecule-gewicht van 25422 dalton.

45 Het is interessant er de nadruk op te vestigen, dat de nucleotidesequentie, die overeenkomt met ”gen S” normaliter in de loop van de vertaling geheel moet worden gelezen.

Gedeelten van de uitvinding zijn eveneens nucleotide-ketens van het boven beschreven ”gen S” type, dat kleine aanvulsequenties draagt, die tot een honderdtal nucleotiden kunnen bevatten of die daarentegen van verstoken kunnen zijn zonder dat dit veel verandert aan de overeenkomstige genetische informatie (22, 50 23).

De verschillende fragmenten van de uitvinding die boven gedefinieerd worden, kunnen worden verkregen uitgaande van de DNA sequentie, genaamd Eco HBV DNA, wanneer men zijn toevlucht neemt tot de overeenkomstige restrictieenzymen en tot de bekende fractioneermethoden van DNA fragmenten, met name over polyacrylamidegel onder gebruikmaking van hun migraties over de afstanden, die een functie zijn van 55 hun moleculegewicht. Ook kan men bijvoorbeeld het fragment verkrijgen, waarvan één van de uiteinde wordt afgebakend door een plek EcoRI en het andere door een plek Avail onder bewerkstelliging van een restrictie Eco HBV DNA door het enzyme Avail waarbij het gezochte fragment bestaat uit het kleinste 5 192880 verkregen fragment (een enkele plek Avalll in Eco HBV DNA).

Het fragment, dat wordt afgebakend door de tegenover elkaar gelegen uiteinde EcoRi en Hhal wordt verkregen door hydrolyse van Eco HBV DNA, eerste met EcoRI en daarna door partiële hydrolyse met het restrictie-enzym Hhal. Men wint dan uit de restrictieproducten datgene dat de plek Avalll.

5 Deze restrictiemethoden zijn natuurlijk maar als voorbeeld gegeven want de specialist bepaalt immers zelf de orde van behandeling met restrictie-enzymen voor het winnen van, met name uit Eco HBV DNA, de fragmenten met de nuttige restrictieuiteinden.

Voor alle nuttige doeleinden kunnen deze restrictiebewerkingen worden uitgevoerd in een buffer Tris 10 mM; pH 7,8; MgCI2 6 mM; 8-mercapto-ethanol 6 mM, welke milieu bovendien bij voorkeur 50 mM NaCI 10 bevat, wanneer men EcoRi gebruikt.

Zoals reeds gezegd heeft de uitvinding betrekking op het gebruik van de beschreven DNA fragmenten als sonde bij de diagnose op de aanwezigheid in een serum van deeltjes van Dane of deeltjes afgeleid van de voorafgaande, die dragers zij van een DNA, dat een voor Hepatitis B kenmerkend immunogeen eiwit kan •coderen.

15 Het DNA van de uitvinding kan ook worden opgenomen in een vector waarmee men, mits de opneming in fase is geschied, dit DNA tot expressie kan brengen in een bacterie of ander microörganisme of in eucaryote cellen.

B. Vectoren, die een nucleotidesequentie bevatten van het antigeen HBs.

20 Constructie van een recombinerende bacteriofaag lac HBs-1

De producten op het pijl van de verschillende trappen van deze constructie worden weergegeven in de figuren 1a en 1h. En zijn eveneens aangeduid met de nummers 1a tot 1H.

In de figuur 1a zijn de posities van het ”gen S” en bepaalde vlekken van restrictie-enzyme aangegeven.

Na behandeling van DNA + HBV met het restrictieenzyme Hhal scheidt men een DNA fragment (1b) af, 25 dat in 1084 paren basen en in het bijzonder de totaliteit van het ”gen S” bevat, door elektroforese over een agarosegel en elektroeluering (figuur 1b). Men bereidt uit dit sub-fragment, dat vooraf behandeld is met het endonuclease S1, een subfragment (1c) (figuur 1c), hetgeen leidt tot verlenging van het subfragment (1b) aan zijn uiteinden met de DNA elementen, genaamd ’’EcoRi linkers” met de formule: 5' GGAATTCC 30 CCTTAAGG 3 '

Het verkregen fragment wordt na vorming van de cohesieve uiteinden EcoRi, gedoneerd in het plasmide pBR322.

Het verkregen plasmide, hierna pBRHBs genoemd (figuur 1 d), bevat slechts één enkele restrictieplek Xbal, gesitueerd nabij de kop van het ”gen S”.

35 Door vertering van het recombinerende plasmide PBRHBs met een mengsel van de enzymen EcoRi en Xbal produceert men een ADH fragment, dat ongeveer 980 paren basen bevat en het merendeel draagt van het ”gen S” (figuur 1e). Dit fragment wordt gewonnen en gezuiverd door elektroforese over een agarosegel. Het verkregen fragment wordt opnieuw behandeld met de endonuclease S1 en daarna opnieuw voorzien van de uiteinde EcoRi met behulp van genoemde "EcoRi linkers” en daarna onderworpen aan een 40 behandeling met de endonuclease EcoRi ter hervorming van de overeenkomstige cohesieve uiteinden. Het fragment van figuur 1e, dat ongeveer 980 paren basen bevat wordt dan door fusie in vitro ingezet in de plek EcoRi van het plasmide pBR322 ter vorming van het plasmide pXbaHBs (figuur 1f). Dit plasmide wordt op de gebruikelijke wijze gedoneerd als het plasmide pBr322.

Er zijn een aantal clonen verkregen.

45 Men extraheert en zuivert na behandeling met EcoRi DNA van drie van deze clonen, pXbaHBS-1, pXbaHBs-2, pXbaHBs-3 (figuur 1 g), welke fragmenten hierna "fragmenten HBs2 (figuur 1h) zullen worden genoemd.

De nucleotidesequenties van de uiteinden van genoemde fragmenten (normaliter verkregen binnen het ”gen S”) worden bepaald met behulp van de procedure, beschreven door MAXAM et GILBERT (Proc. Nat. 50 Acad. Sci. USA 74, 560-564 (1977). Deze bepalingen hebben onthuld, dat de nucleotidesequenties van de eindstandige uiteinden, die overeenkomen met het ”gen S” in de drie clonen niet identiek zijn (figuur 1g) en de verschillen zijn waarschijnlijk te wijten aan heterogeniteiten, die geproduceerd zijn in de loop van de vertering door het endonuclease S1.

De twee fragmenten, die zijn voortgekomen uit pXbaHBs-1 en pXbaBHs-2 worden door fusie in vitro 55 ingezet in het genoom van de bacteriofaag Xplac 5-1 (21), die slechts één plek EcoRi heeft, die gesitueerd is in de nabijheid van het uiteinde van het gen lac Z. Vanwege het leeskader van het gen lac Z, zoals dit kan worden afgeleid uit de aminozuursequentie van B-galactosidase (23) stelt men vast - en tie ervaring 192880 6 bevestigt dit dat de inzetting van het fragment HBs van pXbaHBs-1 op de plek EcoRI van het gen lac Z van Xplac 5-1 moet leiden tot het behoud van de adequate leesfase van het ”gen S”. Daarentegen moet uit de inplaatsing van het fragment HBs van pXbaHBs-2 blijken, dat het niet in de voorafgaande vector kan worden ingepast onder behoud van het geschikte leeskader. Het is niettemin als blanco gebruikt bij de 5 latere proeven.

Deze bewerkingen zijn uitgevoerd met behulp van bekende methoden. In het bijzonder de ’’fragmenten HBs” van pXbaHBs-1 en pXbaHBs-2 zijn met een ligase ingezet in het DNA van Xplac 5-1 nadat zij vooraf waren gesplitst met EcoRI. De mengsels van de verkregen DNA fragmenten zijn daarna gebruikt door transfectie van de stam C600RecBC rk' mk' van E. coli. De clonen van de bacteriofaag, die lac Z waren 10 geworden vanwege de inzetting van de fragmenten HBs in de plekken EcoRI van het geen Lac Z zijn versterkt en gezuiverd volgens de methode beschreven in (21).

De DNA's van de verschillende bacteriofagen zijn geëxtraheerd en de oriëntatie van de ingezette DNA fragmenten is bepaald door elektrolytische analyse van hun restrictieframenten BamHI. Men kan ook bepalen dat de twee fagen XlacHBs-1 en XlacHBs-2 , die overeenkomen met het plasmide pXbaHBs-1 en 15 pXbaHBs-2 een juist georiënteerd fragment HBs bevatten.

De figuur 2a is een schematische kaart van de vector Xplac 5-1 voor zijn modificatie met het fragment HBs-1 afgegeven door pXbaHBs-1.

De figuur 2c is een schematische kaart van een deel van deze zelfde vector, die de modificatie toont, die is ingevoerd in zijn gen Z door inzetting op zijn plek EcoRI van genoemd fragment HBs-1.

20 De figuur 2c geeft een schematische voorstelling van de structuren van het polypeptidehybride, dat is verkregen als resultaat van de expressie van de gemodificeerde vector van figuur 2b.

De expressie is verkregen door transfectie van een stam van de bacterie E. coll, met name van een stam HfrAlacX74.

Stammen van E. coli, met name een stam van E. coli HfrAlacX74 zijn getransformeerd met respectieve 25 plac 5-1, XlacHBs-1 en XlacHBs-2. Na de kweek zijn de cellen gelyseerd en zijn de verkregen lysaten geanalyseerd door elektroforese over polyacrylamidegel SDS 824) en de eiwitten zijn bepaald door kleuring met coomassieblauw. Men constateert de aanwezigheid van een sterkere band onder de expressieproduc-ten van Xplac 5-1 ter hoogte van de positie, die bij een blanco overeenkomt met die van B-galactosidase (moleculegewicht 116248) en een onderscheidelijke band onder de expressieproducten van XlacHBs-2) die 30 overeenkomt met een nieuw eiwit met een moleculegewicht in de orde van 135000 -141000.

De eiwitten, die gesynthetiseerd zijn door de getransfecteerde bacteriën, zowel door XlacHBs-1 als door Xplac 5-1 zijn gemerkt met (3¾) methionine. Het aanwezig stellen van deze eiwitten met een anti-HBsAg serum en de realisatie van een autoradiogram van de polyacrylamidegel SDS onthullende aanwezigheid onder de expressieproducten van XlacHBs-1 alleen van een band, waarmee de equivalente band onder de 35 expressieproducten van de andere vectoren niet overeenkomt. Deze band verdwijnt op specifieke wijze, wanneer de immunoprecipitatie wordt gerealiseerd in aanwezigheid van niet gemerkt HBsAg. Men ziet nog dezelfde band onder de expressieproducten van XlacHBs-1, wanneer de immunoprecipitatie wordt gerealiseerd met een antiserum ten opzichte van B-galactosidase.

De vermoedelijke structuur van het verkregen eiwit hybridegedeelte ter hoogte van de fusie tussen het 40 gen lacZ en het fragment HBs-1 blijkt uit figuur 2c, waarin het fragment ”B-gal”, dat met B-galactosidase overeenkomt (1005 aminozuren) en het fragment HBsAg (192 aminozuren) verschijnen, welke fragmenten worden gescheiden door een prolyne aminozuur, dat gedeeltelijk overeenkomt met ’’EcoRI linker", aanwezig in de vector Xlac HBs-1.

45 C. WERKWIJZE VOOR HET BEREIDEN VAN EEN IMMUNOGEEN MOLECULE ONDER GEBRUIKMAKING VAN DE VECTOR VOLGENS DE UITVINDING

De uitvinding staat dientengevolge de productie toe van een eiwit met kleinere moleculaire massa dan bovengenoemde polypeptiden I en II en met dezelfde immunogene eigenschappen.

50 De resultaten tonen aan, dat E. coli of elk ander geschikt microörganisme, bijvoorbeeld een bacterie of een cultuur van eucaryotesceilen kan worden geïnfecteerd door XlacHBs-1 en een eiwit kan synthetiseren met een moleculegewicht in de orde van 138000 en met tegelijkertijd de antigene determinanten van HBsAg en van B-galactosidase. Dit molecule is representatief voor de hybride polypeptiden, die volgens de werkwijze van de uitvinding kunnen worden verkregen en waarin HBsAg is bevestigd aan een eiwitdrager 55 (verkregen door gedeeltelijke of totale substitutie van het B-galactosidase fragment), maar deze hybriden hebben niettemin de antigene eigenschappen van HBsAg. Deze nieuwe moleculen kunnen worden gebruikt voor de productie van actieve vaccins tegen Hepatitis B virus.

7 192880

Thans volgt de bibliografie en in het bijzonder de referenties, die in het kader van de voorafgaande beschrijvingen zijn aangehaald.

REFERENTIES

5 1 Blumberg, B.S. (1977) Science 197, 17-25 2 Dance D.S., Cameron C.H., and Briggs Μ. (1970) Lancet 1, 695-698 3 Who Technical Report series, number 602 (1976) 4 Summers J„ O’Connel A., and Millman I. (1975) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 72, 4 597-4 601 5 Hruska J.F., Clayton D.A., Rubenstein J. L. R. and Robinson W.S. (1977) J. Virol. 2Λ, 666-682 10 6 Landers T.A., Greenberg H.B. and Robinson W.S. (1977) J. Virol. 23, 368-376 7 Charnay P., Pourcel C., Louise A., Fritsch A. and Tiollais P. (1979) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 76 2 222-2 226 8 Dreesman G.R., Hollinger F.B., Surians J.R., Fujioka R.B., Brunschwig J.P. and Melnick J.L.

(1972) J. Virol. 10, 469-476 15 9 Gerin J.L. (1974) in Mecanisms of virus disease Ed. W.S. Robinson, C.R. Fox pp 215-24 Menlo

Park: W.A. Benjamin 10 Dreesman G.R., Chairez R., Suarez M., Hollinger F.B. Courtney R. J. and Melnick J.L. (1975) J. Virol, 16 506-515 11 Shih J.W. amd Gerin J.L. (1977) J. Virol. 21 1 219-1 222 20 12 Peterson D.L., Roberts I.M. and Vyas G.N. (1977) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74,1 530-1 534 13 Peterson D.L., Chien D.Y., Vyas G.N., Nitecki D. and Bond H. (1978) in Viral Hepatitis, Ed. G. Vyas, S. Cohen and R. Schmid, The Franklin Institute Press, Philadelphia, 569-573 14 Fritsch A., Pourcel C., Charnay P. and Tiollais P. (1978) C.R. Acad. Sc. Paris 287, 1 453-1 456 15 Burrell C.J., Mackay P., Greenaway P.J., Hofschneider P.H. and Murray K. (1979) Nature 279 25 43-47 16 Tiollais P., Perricaudet M., Pettersson U. and Philipson L. (1976) Géne T. 49-63 17 Hérissé J., Courtois G., and Galibert F. (1978) Géne 4, 279-294 18 Kroeker W.D. and Laskowski M.S. R. (1977) Anal. Biochem. 79 63-72 19 Maxam A.M. and Gilbert W. (1977) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74, 560-564 30 20 Sanger F., Nicklen S. and Coulson A.R. (1977) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 7^ 5 463-5 467 21 Maat J. and Smith A. J. W. (1978) Nucleic Acid. Res. 5, 4 537-4 545 22 Berget S.M., Moore C. and Sharp P.A. (1977) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 7^ 3 171-3 175 23 Chow L.T. , Gelinas R.E., Broker T.R., and Roberts J. (1977), Cell 12, 1-8 24 Shiraishi H., Kohama T., Shirachi R. and Ishida N. (1977) J. Gen. Virol. 39 207-210 35 25 Struck D.K., Lennarz W.J., and Brew K. (1978) J. Biol. Chem. 253, 5 786-5 794 26 Reddy V.B., Thimmappaya B., Dhar R., Subramanian K.N. Zain B.S., Pan J., Celma C.L. and Weissman S.M. (1978) Science 200, 494-502 27 Fiers W., Contreras R., Hargeman G., Rogiers R., Van de Voorde A., Van Henverswyn H., Van Herreweghe J., Volchaerts G. and Ysebaert M. (1978) Nature 273, 113-117 40 28 Sanger F., Air G.M., Barrell B.G., Brown N.L., Coulson A.R. Fiddes J.C., Hutchison III C.A.,

Slocombe P.M. and Smith M. (1977) Nature 265, 687-691 29 Barrell B.G., Shaw D.C., Walker J.E., Northrop F.D. Godson G.N. and Fiddes J.C. (1978) Biochem Soc. Trans. 6, 63-67 30 Szmuness W„ Am. J. Path. 81. 629-649 (1975) 45 31 Sninsky J.J., Siddiqui A., Robinson W.S. and Cohen S.N., Nature 279, 346-348 (1979) 32 Valenzuela P. et al., Nature 280, 815-819 (1979) 33 Charnay P. et al., Nucl. Acids Res. "h 335-346 (1979) 34 Galibert F., Mandart E., Fitoussi F., Tiollais P. and Charnay P., Nature 281, 646-650 (1979) 35 Pasek M. et al., Nature 282, 575-579 (1979) 50 36 Vyas G.N., Williams E.W., Klaus G.G. B. and Bond. H. J. Immunol 108, 1 114-1 118 (1972) 37 Hollinger F.B., Dreesman G.R., Sanchez Y., Cabral G. and Melnick J.L., in Viral Hepatitis (Ed.

Vyas G.N. Cohen S.N. and Schmid R.) Franklin Institute, Philadelphia, (1978) 38 Purcell R.H., and Gerin J.L., Am. J. Med. Sci. 270, 395-399 (1975) 39 Hilleman M.R. et al., Am. J. Med. Sci. 270, 401-^04 (1975) 55 40 Maupas P., Coursaget P., Goudeau A. and Drucker J., Lancet 1,1 367-1 370 (1976) 41 Emtage J.S. et al., Nature 283, 171-174 (1980) 42 Itakura K. et al., Science 198,1 056-1 063 (1977)

Claims

192880 8 REFERENTIES 43 Goeddel D.V. et al., Prox. Nat. Acad. Sci. USA 76,106-110 (1979) 44 Pourcel C., Marchal C., Louise A., Fritsch A. and Tiollais P., Molec. Gen. Genet. 170, 161-169 (1979) 45 Bolivar F. et al., Gene 2, 95-113 (1977) 46 Fowler A.V. and Zabin I., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74,1 507-1 510 (1977) 47 Laemmli U.K., Nature 227, 680-685 (1970) 48 Burgess R.R., J. Biol. Chem. 244, 6 168-6 176 (1969) 49 Bonner W.M. and Laskey R.A., Eur. J. Biochem. 4*^ 83-88 (1974) 50 Laskey R.A. and Mills A.D., Eur. J. Biochem 56, 335-341 (1975) 51 Iwakura Y., Ito K. and Ishihama A., Molec. Gen. Genet. 133, 1-23 (1974) 52 Talwai G.P., et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 73, 218-222 (1976) 15

1. Nucleïnezuur dat een sequentie bevat die dit codeert voor het oppervlakte-antigeen van een Hepatitis B virus, met het kenmerk, dat de sequentie codeert voor een peptide weergegeven in de figuren 3A, 3B en 3C 20 tezamen, of voor een peptide dat een variant is van het peptide weergegeven in de figuren 3A, 3B en 3C tezamen, welke variant het resultaat is van plaatselijke mutaties of modificaties van de structuur ten gevolge van uiteenlopende serotypes zoals adw, adr en ayr, mits die varianten immunologische eigenschappen hebben overeenkomstig die van het in de figuren 3A, 3B en 3C tezamen weergegeven peptide.

2. Peptide waarvoor een nucleïnezuur volgens conclusie 1 codeert.

3. Vector, in het bijzonder van het faag- of plasmide-type, die ten minste een gedeelte van het lactoseo-peron, in het bijzonder de promotor en het Z-gen van dat operon bevat, met het kenmerk, dat hij gemodificeerd is doordat er op een geschikte plaats in het Z-gen, zoals op de EcoRI plaats, in de juiste fase een nucleïnezuur volgens conclusie 1 ingevoegd is.

4. Hybride-eiwit waarvoor het in de vector volgens conclusie 3 ingevoegde nucleïnezuur codeert.

5. Vaccin dat als werkzaam bestanddeel een hybride-eiwit volgens conclusie 4 bevat. Hierbij 9 bladen tekening