FR2567905A1 - Gene de synthese ou fragment d'adn, cellule hote le comprenant, procede de construction d'un gene de synthese pour une proteine cible virale, et vaccin contenant la proteine - Google Patents

Abstract

L'INVENTION CONCERNE UN GENE DE SYNTHESE OU FRAGMENT D'ADN. SELON L'INVENTION, IL CODE POUR UNE PROTEINE VIRALE DE LA PARAINFLUENZA DU BOVIN DU TYPE 3 OU UNE PARTIE DE CELLE-CI ET IL COMPREND UN GENE D'ADN A DEUX BRINS QUI EST UNE COPIE DU GENE D'ARN DU VIRUS CODANT POUR CETTE PROTEINE OU PARTIE DE CELLE-CI. L'INVENTION S'APPLIQUE NOTAMMENT A LA VACCINATION DES ANIMAUX.

Description

La présente invention se rapporte à la production de vaccins contre le

virus de parainfluenza du type 3 (PI-3)

des bovins, qui est classé comme un paramyxovirus.

Plus particulièrement, des gènes d'ADN de synthèse codant pour les protéines PI-3 peuvent être produits comme cela est révélé ici. Ces gènes peuvent être utilisés pour la production de la protéine virale choisie par 'des cellules transformées, la protéine de biosynthèse étant utile dans un vaccin, un ensemble de diagnostic ou analogue o Le gène de synthèse lui-même sera utile comme agent de diagnostic. Le virus de parainfluenza du bovin du type III, également appelé PI-3 ou virus de la fièvre d'expédition, a un impact pathologique et économique considérable en tant que facteur principal dans l'amorce d'un syndrome de troublesrespiratoiresaigûschez le bétail. Le syndrome de la fièvre d'expédition peut être amorcé par l'infection virale de PI-3, usuellement en conditions d'état tendu telles que celles associées à l'expédition ou à la gestion par lots alimentaires du bétail. On pense que l'infection virale prédispose les animaux à une infection bactérienne, par exemple par Pasteurella multocida ou Pasteurella haemolytica,

ayant pour résultat le syndrome de la fièvre d'expédition.

Les pertes économiques annuelles dues à la diminution de poids, au traitements coûteux et à la commercialité retardée sont estimées comme dépassant 75 millions de dollars. Un virus semblable infecte les moutons, conduisant à une maladierespiratoire très semblable au syndrome de la

fièvre d'expédition.

Les vaccins viraux, comprenant les vaccins vivants atténués, ont été employés depuis environ 20 ans avec un certain succès. Par exemple, des vaccins bactériens vivants produits à partir de souches chimiquement modifiées de Pasteurella multocida et Pasteurella haemolytica sont

révélés dans le brevet US NO 4 293 545 (Kucera).

Le succès de la tentative du vaccin viral pour la prévention des virus de parainfluenza a été restreint par l'efficacité limitée des vaccins courants.Cela est dû, en partie, à l'interférence d'anticorps existants ou l'inhibition par d'autres vaccins viraux. De plus, l'utilisation de vaccins viraux vivants sur des animaux d'élevage peut avoir pour résultat une infection foetale

et un avortement subséquent.

Récemment, il est devenu possible de produire un gène de synthèse en formulant une copie d'ADN bimoléculaire

à deux brins d'une molécule d'ARN messager (ARNm).

Le gène de synthèse produit de cette façon codera pour la protéine qui était le produit de translation de l'ARNm choisi. Un exemple de ce processus de manipulation génétique est révélé dans le brevet US 4 357 421 (Emtage et autres) o on l'utilise pour produire un gène de synthèse pour une protéine del'hémagglutinine de l'influenza. Les virus de l'influenza ne contiennent pas d'ADN; au contraire, ils contiennent un génome d'ARN viral (ARNv) à brin négatif segmenté qui est reproduit pendant l'infection pour produire 'ARN messager viral (ARNm) et calibre la production d'autres ARNv. Les génomes du virus de l'influenza sont du type segmenté, c'est-à-dire que chaque gène est présent en tant que morceau séparé

d'ARNv qui est transcrit séparément pour produire les ARNm.

Le procédé révélé par Emtage et autres utilise 'ARNv isolé en tant que calibre direct pour le gène de synthèse d'intérêt. Il est maintenant possible de construire un gène de synthèse ou un fragment d'ADN de synthèse qui correspond à un gène viral placé sur le génome de i'ARNv du

brin négatif -(ou moins) non segmenté du virus PI-3.

Les cellules infectées du virus sont obtenues et l'ARNm, aussi bien ARN viral que hôte, est séparé des autres composants de cellule. Les molécules d'ADN de synthèse à deux brins complémentaires des ARNm d'origine sont construites. Cette population d'ADN complémentaire (ADNc) est clonée pour préparer une génothèque d'ADNc d'o les g567905 gènes spécifiques viraux peuvent être choisis. Le gbne viral d'intérêt est identifié et isolé, par exemple, par

hybridation réciproque et translation hybride choisie.

Quand le gbne d'intérêt est identifié, il est inséré dans un vecteur approprié que l'on utilise pour transformer un hôte approprié pour l'expression du gbneo La protéine

exprimée peut être utilisée pour formuler des vaccins sub-

unitaires, des agents de diagnostic et analogues.

La présente invention a pour objet de procurer un procédé par lequel des gènes de synthèse peuvent être construits, oui correspondent aux gènes normalement trouvés sur les génomes du virus du type 3 de parainfluenza du

bovin, un paramyxovirus.

La présente invention a pour objet en proche rapport, l'identification et l'isolement du gène de synthèse cod'nt pour une protéine virale particulière comme cible, par exemple une protéine antigénique comme l'hémagglutinine. La présente invention a pour autre objet d'exprimer le gène de synthèse choisi dans des hôtes transformés afin de fabriquer économiquement la protéine cible virale pour

laquelle code le gène de synthèse.

La présente invention a pour autre objet un procédé de production de séquences d'ADN d'o des

séquences d'acidesaminés de protéine peuvent être déter-

minées afin de désigner des peptides de synthèse.

Par ailleurs, il est prévu que des sondes d'ADN de diagnostic et des agents de diagnostic de peptide

soient produits en utilisant le procédé de l'invention.

Les abréviations qui suivent ont été utilisées

dans toute la description de l'invention.

bp paires de bases BSA: albumine du sérum bovin ADNc: ADN complémentaire Ci: curie cm: centimètre dATP: désoxyadénosine triphosphate dCTP: désoxycytidine triphosphate dGTP: désoxyguanosine triphosphate dTTP: désoxythymidine triphosphate DTT: dithiothréitol ADN: acide désoxyribonucléique EDTA: acide éthylènediaminetétraacétique GuSCN: guanidine thiocyanate HA: hémagglutinine

HEPES: acide N-2-hydroxyéthylpipérazine-

N'-2-éthanesulfonique UI: unité internationale M: mole MDBK: rein de bovin de Madin-Darby (cellules) MET: méthionine J-: micro mM: millimole ARNm: ARN messager NC: protéine de nucléocapside oligo(dA): polymère formé de quelques (usuellement 2-20) molécules de désoxyadénosine oligo(dT): polymère formé de quelques molécules (usuellement 2-2D) de désoxythymidine 32: phosphore radio-actif, masse P atomique 32 Z: pourcent PI-3: virus de -parainfluenza du bovin type 3

PIPES: pipérazine-N,N'-bis [acide 2-

éthanesulfonique] poly-A: poly-désoxyadénosine poly-C: polydésoxycytidine poly-G: poly-désoxyguanosine ARN: acide ribonucléique ARNr: ARN ribosomal SDS: dodécylsulfate de sodium

SSC: 0,15 M de chlorure de sodium-

0,015 M de citrate de sodium (pH 7,0) TNE: 10 mM de tris-HCl (pH 8,0)-

mM de chlorure de sodium-

1,0 mM de EDTA (pH 8,0)

Tris-HCl: tris(hydroxyméthyl)aminométhane-

HC1 ARNt: ARN de transfert U: unité v/v: volume/volume ARNv: ARN viral p/v: poids/volume X: tout résidu d'acide aminé

Dans cette description de l'invention, les

référencesà "ARNm" et "ADNc" sont destinées à indiquer l'ensemble de la molécule d'ARN ou d'ADN respectivement ou toute partie biologiquement sensible de celle-ci. En effet, on souhaite que le procédé de l'invention soit mis en pratique soit par rapport à une molécule d'ARNm viral complète ou par rapport à une sous-portion de la molécule d'ARNm viral. Par exemple, on peut souhaiter isoler, copier et cloner uniquement la partie d'un gène viral qui code pour une sous-unité de protéine particulière ou une partie de celle-ci, ou bien un site antigénique particulier. Le virus PI-3 est classé comme un paramyxovirus sur la base des propriétés morphologiques, sérologiques et biochimiques. Les paramyxovirus sont les "virus d'ARN" et ils ne contiennent pas d'ADN. Leur information génétique est contenue uniquement dans une seule pièce continue (ou non segmentée) à un seul brin d'ARN. Les membres de la famille des paramyxovirus présentent une stratégie de

réplication basée sur un génome d'ARN à brin négatif.

Le schéma général de la réplication de 1'ARN du paramyxo-

virus comprend la transcription de l'espèce ARNm

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subgénomique à partir du gabarit à brin négatif d'un seul promoteur par un complexe de transcriptase associée à un virion. Dans les système qui ont été étudiés, chaque espèce d'ARNm est associée à des polyribosomes, est polyadénylée et code généralement un seule protéine virale. La réplication de PI-3 n'a reçu que peu d'étude, bien que plusieurs protéines de structure virale aient été identifiées. On peut par exemple voir Shibuta et autres, "Characterization of Bovine Parainfluenza Virus Type 3", Microbiol. Immunol., Volume 23, pages 617-28 (1979) et Guskey et autres, "High Yield Growth and Purification of Human Parainfluenza Type 3 Virus and Initial Analysis of Viral Structural Proteins", J. Gen. Virology,Volume 54, pages 115-23 (1981). L'art antérieur ne révèle aucune information concernant les protéines intracellulaires ou les espèces d'ARNm viral synthétisées pendant la réplication virale. Par ailleurs, la transcription et les attributions de codage pour les ARNm PI-3 ne sont pas

disponibles, à l'exception de ce qui est révélé ici.

L'invention révélée ici permet de construire un gène distinct de synthèse ou fragment d'ADN correspondant à un gène placé sur le génome d'ARNv du brin moins non segmenté du virus PI-3. Le gène de synthèse ou fragment code pour une protéine virale de PI-3 ou partie de celle-ci et comprend un gène d'ADN à deux brins qui est une copie du gène d'ARN viral codant pour cette protéine ou une partie de celle-ci. Le gène de synthèse peut être utilisé pour la production de la protéine d'intérêt, ou bien protéine "cible". Protéine "cible" sera utilisée ici pour désigner à la fois la protéine virale d'intérêt et la

protéine produite par celle exprimée du gène de synthèse.

On comprendra cependant que la protéine exprimée peut différer de manière non significative de la protéine virale ou bien peut correspondre uniquement à une partie

ou sous-unité de la protéine virale.

Comme étape préliminaire à la construction d'un

gène de synthèse, la protéine cible est identifiée.

Lorsque l'on souhaite la préparation d'un vaccin de sous-

unité ou bien d'un agent de diagnostic, la protéine cible peut être identifiée en démontrant qu'elle peut stimuler la formation d'anticorps neutralisants ou protecteurs par un animal infecté. Dans le cas du virus PI-3,

l'hémagglutinine (HA) est la protéine de structure princi-

pale contre laquelle des anticorps protecteurssont produits.

O10 La protéine HA se trouve à la surface du virus et est responsable de la fixation du virus aux cellules pour amorcer le processus infectieux. L'isolement du gène codant pour la protéine d'hémagglutinine est souhaité de façon qu'on puisse le cloner et l'utiliser pour la productionextravirale de la protéine HA. Cette protéine HA de biosynthèse est particulièrement appropriée à une utilisation dans des vaccins. Elle stimulera la production des anticorps contre PI-3 chez les animaux vaccinés sans risquer une infection virale parce que la protéine HA ellemême n'est pas infectieuse. Cependant, il est évident que d'autres protéines de structure peuvent également contribuer au déclenchement des anticorps. L'activité d'un vaccin ou d'un agent de diagnostic peut être encore améliorée par l'inclusion de versions de biosynthèse de ces autres protéines de structure. Par exemple, une protéine de fusion de structure, qui est une protéine de surface virale responsable de la fusion à la cellule à infecter et ayant des propriétés provoquant un transfert de l'ARN viral à ces cellules, peut être souhaitée pour

une inclusion dans un vaccin ou analogue.

Les cellules hâtes infectées par le virus sont obtenues par des moyens conventionnels. I1 est préférable d'utiliser les cellules du rein du bovin de Madin-Darby (MDBK) comme cellules hôtes, car elles supportent des niveaux élevés de réplication virale. Les cellules sont infectées par le virus et préparées selon des techniques

standards de culture de cellules.

L'ARN est récolté des cellules par tout moyen

pratique. Par exemple, la méthode de guanidine thyocyanate-

CsCl de Chirgwin et autres, Biochemistry, Volume 18, pages 5294-99 (1979) qui est décrite en plus de détail à l'exemple I, peut être utilisée. L'ARN total, c'est-à-dire ARNm hôte, ARNt et ARNr ainsi que ARNv viral et ARNm est

isolé ou récupéré.

L'ARNm de tous les eukaryotes infectant les virus se produit naturellement sous la forme polyadénylée

(terminé en poly-A). Il est préférable d'utiliser avanta-

geusement cela pour séparer ARNm des autres composants

de cellule et des autres ARN. Pour isoler l'ARNm poly-

adénylé, 1'ARN total récupéré est fractionné de manière

très pratique sur des colonnes d'oligo (dT) cellulose.

Cependant, d'autres méthodes peuvent être utilisées pour

séparer l'ARNm, si on le souhaite.

Des ARNm polyadénylés, il est possible de cons-

truire des molécules hybrides à deux brins d'ARN/ADN en utilisant la technique de transcription réverse. La transcriptase reverse de l'enzyme, une ADN polymérase dirigéevers ARN, synthétisera, sur chaque molécule, un

nouveau brin d'ADN complémentaire du brin existant d'ARN.

Cette transcription nécessite la présence d'un point de croissance à deux brins ou amorce o la transcription peut commencer. l'amorce peut être construite en hybridant une

molécule oligo (dT) à l'extrémité 3'-poly-A de l'ARNm.

La transcriptase réverse commence par la synthèse d'ADNc au point de croissance à deux brins, produisant la molécule

hybride d'ARN m/ADNc à deux brins.

Ensuite, le brin d'ARNm de chaque molécule à deux brins est digéré ou retiré d'une manière qui laisse le brin d'ADNc intact. Par exemple, le brin d'ARN peut être digéré par hydrolyse alcaline ou avec de la ribonucléase,

ou bien retiré des brins d'ADNc par dénaturation à la cha-

leur. Le résultat est l'ADNc à un seul brin, qui est une structure s'amorçant automatiquement avec une boucle en

épingle à cheveux à son extrémité 3'.

Les molécules d'ADNc à un seul brin sont convertiesen ADNc à deux brins en utilisant la transcriptase réverse ou une autre ADN polymérase, comme l'ADN polymérase de E. coli (E.C. 2.7.7.7) ou en utilisant un fragment de Klenow d'une ADN polymérase (formé par scission de la molécule de polymérase avec de la trypsine). Chacun de ces enzymes construira un second brin d'ADN complémentaire de la première molécule d'ADNc à un seul brin, avec la transcription commençant à l'amorce de l'extrémité en épingle à cheveux partiellement à deux brins. La molécule résultante est sensiblement l'ADNc à deux brins, avec une extrémité en épingle à cheveux à un seul brin qui

reste. En traitant les molécules avec S1 nucléase (E.C.3.1.

30.1), une nucléase spécifique à un seul brin, l'extré-

mité en épingle à cheveux à un seul brin est supprimée.

Le résultat est une population de molécules d'ADNc à deux brins qui sont complémentaires de la population d'origine

des molécules d'ARNm.

Il faut se rappeler que les molécules d'ARN utilisées comme calibres dans ce procédé comprennent à la fois des ARNm viral et hôte. Par suite, la population d'ADNc préparée par la méthode décrite ci-dessus est assez hétérogène. Les ADNc sont clonés pour produire une librairieou banque de gènes d'o le gène d'ADNC d'interêt

25.peut être identifié.

La librairie de clones d'ADNc est préparée en insérant les gènes d'ADNc dans des vecteurs appropriés

pour la transformation des hôtes appropriés. Des combinai-

sons vecteur-hôte pour ce stade du processus doivent être choisies pour la facilité de la manipulation et la consistance de l'excision. De plus, le vecteur doit contenir un seul site de reconnaissance d'endonucléase de restriction qui de préférence est approprié pour être reformé par terminaison en homopolymère de l'ADNc et du vecteur digéré. Par exemple, le vecteur plasmidique pBR'322, approprié à la transformation de E. coli, peut être digéré par l'endonucléase de restriction Pst I (E.C. 3.1.23.31)

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pour produire une molécule d'ADN linéaire. Cette molecule linéaire peut être terminée en utilisant la désoxynucléotidyl transférase terminale (E. C. 2.7.7.31) et dGTP pour donner des extrémités ou queuespoly-G sur le vecteur. Les queues poly-C peuvent être ajoutées aux molécules d'ADNc en utilisant la désoxynucléotidyl transférase terminale et dCTP. Les queues poly-G sur le vecteur sont complémentaires

des queuespoly-C sur les ADNc.

Les produits (dans ce mode de réalisation les ADNc terminés en poly-C et les vecteurs linéaires terminés en poly-G) peuvent alors être mélangés et recuits par chauffage et refroidissement lent pour former des plasmides reconstitués ayant les gènes d'ADNc insérés au site de restriction d'origine de Pst I. Lors du recuit, un brin à chaque extrémité de l'ADNc inséré aura un espace correspond au site de Pst I. Quand le plasmide recombinant est introduit dans une cellule hâte de transformation, l'hôte répare les espaces, reconstruisant le site de Pst I à chaque extrémité du gène inséré. Cette construction permet l'excision subséquente du gène d'ADNc en utilisant l'endonucléase de restriction de Pst I pour une plus

ample manipulation.

Il y a d'autres processus que l'on peut utiliser pour insérer les gènes d'ADNc dans des vecteurs. Par exemple, il est possible de joindre les fragments avec des molécules de liaison en utilisant une ADN ligase appropriée. Alternativement, une terminaison homopolymérique peut être utilisée pour créer des séquences complémentaires

poly-A et poly-T aux extrémités de chaque fragment.

Les plasmides ou vecteurs chimériques ainsi construits sont utilisés pour transformer les cellules

appropriées à la transformation par le vecteur utilisé.

E. coli est particulièrement bien adapté comme hôte de transformation mais d'autres organismes, Bacillus subtilis, par exemple, peuvent être utilisés avec un choix approprié du vecteur. A partir de la librairie de clones d'ADNc ainsi construite, les clones contenant des gènes spécifiques

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Il

du virus peuvent être identifiés et isolés.

Une banque sub-clones, ne comprenant que des clones spécifiques viraux, c'est-à-dire des cellules hôtes transformées qui comprennent le gène spécifique viral ou des fragments d'ADN, est formée en utilisant la technique d'hybridation différentielle. Des sondes d'ADNc à un seul brin sont préparées à partir de cellules de MDBK infectées par le virus et de cellules de MDBK non infectées par la méthode décrite ci-dessus, à l'exception que l'on utilise 32p dCTP afin d'obtenir ADNc radio-marqué. Les cellules de E. coli clonées de la librairie d'ADNc précédemment construite sont cultivées sur des filtres de nitrocellulose et des doubles des filtres sont préparés. Les colonies sont lysées et l'acide nucléique libéré fixé aux filtres. Les sondes radio-marquées sont hybridées à l'ADNc cloné sur les filtres. Apres avoir retiré la sonde non liée, les colonies spécifiques virales, c'est-à-dire les colonies comprenant l'ADNc correspondant à un gène viral,peuvent être identifiées en utilisant l'autoradiographie. Les colonies positives qui se lisent positivement uniquement sur les filtres hybridés en utilisant la sonde d'ADNC cellulaire plus virale, et non pas sur les doubles de filtres hybridés en utilisant la sonde d'ARNm cellulaire, sont les clones d'ADNC spécifiques du virus. Seuls les clones doivent être étudiés dans les procédés d'identification

décrits ci-dessous.

Afin de faciliter le processus de détermination, une analyse par hybridation réciproque (ou hybridation croisée de la colonie) peut être entreprise pour définir des groupes individuels de clones dans la librairie de clones d'ADNc spécifiquesdu virus qui correspondent à des gènes viraux séparés. Cette étape n'est pas requise car l'identification peut être faite par transformation et expression directe, avec ensuite identification immunologique en utilisant, par exemple, des anticorps monoclonaux. Cependant, comme il peut y avoir de plus grands nombres de clones dans la librairie, il sera plus efficace de simplifier le procédé en créant des groupes de clones qui se croisent dans le groupe et par conséquent sont considérés comme contenant des segments

du même gène viral.

Dans l'hybridation réciproque, un seul clone spécifique du virus est digéré avec Pst I pour libérer

l'insertion d'ADNc. L'insertion est alors séparée, radio-

marquée par 32p et hybridée vis-à-vis de tous les clones

dans la librairie d'ADNcde PI-3. Tous les clones s'hybri-

dant avec la sonde sont désignés par le Groupe A. Une seconde sonde est dérivée de l'un des clones n'hybridant pas et le processus est répété pour former le groupe B, etc., jusqu'à ce que des groupes multiples soient formés, et les

clones sont groupés à l'étendue possible ou souhaitée.

Dans le mode de réalisation du virus PI-3 décrit ici, les groupes A et C contenaient le plus grand nombre de clones et, en se basant sur une analogie avec les motifs d'abondance d'ARNm d'autres paramyxovirus (Rozenblatt et autres, "Cloning and Characterization of DNA Complementary to the Measles Virus mRNA Encloding Hemagglutinin and Matrix Protein ", 3. Viroloqy, volume 42, pages 790-97 (1982), ces groupes ont été présumés comme codant le gène de la protéine du nucléocapside du virus et le gène de la protéine HA respectivement comme le montre le tableau V. On peut utiliser l'analyse de la tachede Northern pour déterminer les affectations de codage de chacun des groupes de clones, en utilisant un clone prototype de chaque groupe. Par cette technique, les clones peuvent

être mis en corrélationavec les ARNm progéniteurscorrespon-

dants. Des clones prototypes individuels sont radio-marqués et utilisés comme sondes pour détecter des ARNm viraux de cellules infectées qui ont été réparties en taches sur des filtres de nitrocellulose. Les ARNm viraux peuvent recevoir des affectations de codage d'essai en se basant sur des similitudes des relations de dimension aux protéines du virion et aux ARNm d'autres virus en rapport, comme

cela est déterminé, par exemple, par électrophorèse.

Six espèces distinctes d'ARN poly-A, désignées par ARN 1-6, sont trouvées dans les cellules infectées de PI-3

mais non pas dans les cellules infectées d'un placébo.

Les cellules infectéesd'un placébo sont préparées selon les mêmes processus que les cellules infectées du virus, sans addition de l'agent viral. En utilisant les ARNm

du virus de stomatite vésiculaire, ou autres ARNm de dimen-

sion connue, comme marqueurs, les poids moléculaires des

ARNm de PI-3 peuvent être estimés.

Comme le montre le Tableau V, la capacité de codage des six espèces d'ARN poly-A de PI-3 est grossièrement en corrélation avec les dimensions des six protéines de structure virale et avec la capacité totale estiméede codage du génome viral. La sonde du Groupe A (ARNm 1) s'est hybridée en une position correspondant à l'ARNm du nueléocapside putatif et la sonde du Groupe C (ARNm 3) s'est hybridée en une position correspondant à l'ARNmde HA putatif. L'on n'a observé aucune hybridation à ARNm de

cellules hôtes non infectées (c'est-à-dire ARNm hôte).

La sélection hybride et la translation in vitro de l'ARNm viral peuvent être utilisées pour confirmer les affectations de codage et ainsi identifier définitivement des clones individuels codant la protéine cible virale, c'est-à-dire la protéine HA. Par ces processus, des ARNm poly-A de cellules infectées du virus et témoins peuvent être comparés pour leur capacité à diriger la synthèse de la protéine spécifique du virus dans un système de

translation exempt de cellule dépendant de l'ARNm.

L'ADNc plasmidique de clonesde chaque groupe

est isolé et immobilisé sur des filtres de nitrocellulose.

Les ARNm poly-A, dérivés des cellules infectées du virus ou cellules infectées du placébo (témoin) sont hybridés par l'ADNc lié au filtre. L'ARNm qui s'hybride spécifiquement à chacun des ADNc immobilisés est élué des filtres et est translaté in vitro. L'analyse des produits de translation par une technique telle qu'une électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) peut être utilisée pour confirmer

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l'identification des clones par rapport à la protéine virale codée par l'ADNc de chaque groupe de clones. Il peut être également souhaitable d'utiliser une analyse immunologique des protéines exprimées in vitro parce que les protéines qui sont glycosylées lorsqu'elles sont produites in vivo ne seront pas glycosylées in vitro et par conséquent n'émigreront pas aux mêmes positions sur le gel. Dans le mode de réalisationde PI-3, les clones du 9toupe A choisissent l'ARNm qui dirige la synthèse d'une lO protéine qui émigre avec la protéine de nucléocapside de PI-3. Les clones du Groupe C choisissent l'ARNm qui dirige la synthèse d'une protéine émigrant avec la protéine HA. Aucune protéine spécifique du virus ne doit

être détectable dans des extraits des produits de trans-

lation d'ARNm des cellules témoins infectées du placébo.

Ensuite, le clone codant la protéine cible peut être caractérisé par l'analyse de l'enzyme de restriction

et/ou la détermination de la séquence de nucléotides.

Cette étape aura un intérêt et une importance particuliers si l'on souhaite construire un gène codant uniquement une partie particulière de la protéine cible, comme la

partie contenant un site antigénique actif sur la protéine.

Alternativement, cette information peut être utilisée pour concevoir et construire une protéine de synthèse correspondant au site actif de la protéine cible, ou bien pour l'étude et la conception rationnelle des médicaments antiviraux. Ces processus de caractérisation sont

effectués par des méthodes et techniques conventionnelles.

Les tableaux I à IV montrent les résultats de la caracté-

risation du gène de HAde PI-3. Le tableau I est une représentation de la séquence d'ADN de l'ADNc de l'hémagglutinine du virus de parainfluenza du bovin (HA) cloné par le procédé de l'invention, comprenant les sites de scission de l'enzyme de restriction. Le tableau II donne la liste des sites d'enzyme de restriction du gène dans l'ADNc cloné du tableau I. Le tableau III est une translation de la séquence du gène d'ADNc de HA du tableau I, en séquence d'aminoacides correspondants et le tableau IV est la séquence prédite d'aminoacides de la protéine de HA qui se formera, lors d'une production par une analyse de calculateur de la séquence d'ADN

du gène.

Tableau I

20 30 40 50 60 70

CTGCAGGGGGGGGGGGGAGAACAATCATAATAAATTAATGTIGCAGGAMAA AAATAATT

Pstl EcoRI f 4HI EcoRdm úCe1I CHlnf 31]

90 100 110 120 130 14D

CAATAGACACCAAGATTCAGAGGAC OATAAGGCCTCAATACATCMMTATACT

Hlnf I Asul MnlI IFokl mnl 1 MIl 1 Aval I EcoRI *

160 170 180 190 200 210 A CTTCTCACAATTCAGAGTCATGTCAAAACTATATCCCACTATCACTAACACMAAATCAGATC

HInf I BgI ode! DpnI mol M11

220 230 240 250 260 270 280

AGAATI*ATCAATGATCTAACAAATAAAGAGAACATCAAGAAGTGCCAATACAGAGAATGACTCATG

EcoRI* Dpnl Hinfi Mbol ibis

290 300 310 320 330 340 350

ATAGAGGTATAGAACCCCTAAAI'M ACAITTCTGGAGTGT sACATCTGGTAACCCATCTCTA AG EcoR!*Mnl I Rsal BstE 11

Z567905

Tableau I (suite 1)

360 370 380 390 400 410 420

TAGTCCTAAGATAAGGTTAATACCAGGGCCAGGSTTTATTAGCAACATCTACrACAGTAACTGCTGTATT * e*ese Ddel Asul EcoRII ScrFI EcoRli Haelil ScrFI

430 440 450 460 470 480 490

AGAATCCCATCGTTAGCAATCAATCAMTTAATCTACGCTTACACCTCTAATCTTATCACCCAGGGCTGTC

*. * * * *e e EcoRl* Hphl EcoRII Taql Hlnfl MnIl ScrFI

500 510 520 530 540 550 560

GAGATATAGGGAAATCTTACCAAGTACTACAAATAGGGATAATTACTATAAATTCGGACCTAGTACCTGA

e s e os*e o EcoRl* Rsal Asul Rsal Escai] Ava Il EcoRI* [HlInf III

570 580 590 600 610 620 630

TTTAAATCCCAGAGTCACACATACA'T'rAATATTGATGATAATAGGAAATCTTGCTCTCTGGCACTATTG * s * e Ahal I Hinfl EcoRl* EcoRl*

640 650 660 670 680 690 700

AATACAGATGTTTATCAGTTATGCTCAACACCAAAAGTTGCTGAGAGATCCGATTATGCATCAACAGGTA

* *O À * *

Ddel Dpnl EAvaill] Mnll EcoRl* SfaNI Mbol Xholl I

710 720 - 730 740 750 760 770

TTGAGGATATTGTACTTGACATTGTCACTAATAATGGATTAATTATAACAAGAAGGTTTACAAATAATAA

Rsal TthlllI Tableau I (suite 2)

780 790 800 810 820 830 840

TATAACTmTITGATAAAccGTATGcAGCATTGTATccATcAGTAGGAcCAGGAATCTATTATAAGGcGTAAA Fnu4HI Bbvl Asul EcoRI* Avail Hlnfi EcoR! I ScrFI

850 860 870 880 890 900 910

GTTATATTTCTCGGATATGGAGGTCTAGAGCATGAAGATAACGGAGACGTAATATGTAATACAACTGGTT

Mnhil EcoPl Mboll Xba I

920 930 940 950 960 970 980

GTCCTGGCAAAACACAGAGAGACTGTAATCAGGCITTCTTATAGCCCATGGTACTCAATAGGAGAATGGT

EcoR II Nco I ScrFI

990 1000 1010 1020 1030 1040 1050

AAACTCTATTATTGTTGTTGATAAAGGCATAGATGCAACTTTAGCTTGGAGGTGTGGACTATTCCAATG

SfaNI Alul Mnil

1060 1070 1080 1090 1100 1110 1120

AGccAATTGGGGATc AGGAAGGMATTACTTTTATTAGGTGACAGAATATACATATATACTAGAT [BInIl] Mbol Hphl Dpnl Dpn I EcoRI* Mbo I MbolI Xhol Il

1130 1140 1150 1160 1170 1180 1190

CCACAGTTGGCACAGTAmTTACAGTTAGGGGTAATTGATAMTTCTGATTATAATAATATAAGAATAAA

Z567905

Tableau I (suite 3)

1200 1210 1220 1230 1240 1250 1260

TTGGACTTGGCATAATCTACTATCACGGCCAGGAAATGATGAATGTCCATGGGGTCATTCATGCCCAGAC

Cfr I Ncol EcoRI I HaelIl ScrFI

1270 1280 1290 1300 1310 1320 1330

GGATGTATAACAGGAGITTTACACTGATGCATATCcGCTAAAccCATcGGGGAGTGTTrGTATCATCAGTAA *0 Foki Ava I I I] SfaNI

1340 1350 1360 1370 1380 1390 1400

TTCTTGACTCACAAAAGTCTAGAGAAAACCCAATCATTACCTACTCAACAGCTACAAATAGAATAAATGA

* * e Hlnf I Xbal Al ul

1410 1420 1430 1440 1450 1460 1470

ATTAGCTATATATACAGAACACTTCCAGCTGCATATACAACAACAAMTTGTATCACACATTATGATAAAG

* 0 o.

Alui Bbvl Alul Fnu4HI NspBI I Pvul I

1480 1490 1500 1510 1520 1530 1540

GGTATTGTTTrCATATAGTAGAMATAAATCACAGAAGTM TACGTTTCCGATTrATTCAAC

1550 1560 1570 1580 1590 1600 1610

AGAAGTTCCAAAAAACTGCAGCTAAATTGATCATCGCATATCGGATGCCAGATGACATTAAAAGAGACCA

Al u I BbvI Foki [EcoP1] Fnu4HI Bcl SfaNI Psti Dpn I Mbo I

1-620 1630 1640 1650 1660 1670

CCATACAGACAACACAGGAGATGATGCAAGATATAAAGGAATCCCCCCCCCCCCCCCTGCAGCAA

* *. e00 SfaNI EcoRI * Fnu4HI Hinf I Pstl

Z567905

Tableau Il

SMunce Sltme pnst$ Ahal t TTTAAA 564 AIuI ACCT 1026 1382 1406 1429 1562 Asul GGNCC 93 377 547 815 AvaII GCLCC 93 547 815 [Ava Il] ATGCAT 686 1286 Bbvi GCAGC 806 1571 BbvI GCTGC 1416 BcII TGATCA 1569 E9lli AGATCT 205 [BinI] GGATC 1066 8stEl 1 GGTNACC 332 Cfrl QGGCCP 1217 Dde I CTNAG 209 357 672 Dpnl GATC 207 228 679 1069 1120 1571 [EcoP1i AGACC 1605 [EcoP1i GGTCT 862 EcoRI GAATTC- 62 EcoRl* PPATQQ 64 86 207 217 303 425 505 543

567 610 679 824 1120 1652

EcoRli CCLGG 373 379 480 817 913 1219 Fnu4HI GCNGC 69 795 1430 1560 1671 FnuODII CGCG 68 Fokl GGATG 113 1275 1597 Haelll GGCC 379 1219 Hlnfl GANTC 85 157 274 423 573 822 1337 165 [HilnfilI ATTCG 63 542 Hphl GGTGA 1106 HphI TCACC 469 Mbol GATC 205 226 677 1067 1118 1569 Mboll GAAGA 887 1089 14Mni CCTC 106 124 475 Mnl! GAGG 83 277 311 696 853 1022 NcoI CCATGG 956 1238 NspBII CJGCKG 1429 Psti CTGCAG 6 1561 1672 Pvul I CAGCTG 1429 Rs_ GTAC 325 516 555 714 [Scai] AGTACT 513 ScrFI CCNGG 375 381 482 819 915 1221 SfaNI GATGC 1003 1276 1575 1624 SfaNI GCATC 698 Taq I TCGA 490 Ttn l1111 GACNNNGTC 722 XbalI TCTAGA 865 1349 --XhoII - PGATCQ 205 677 1118 k567905

Tableau III

27 54

CTG CAG GG 6GG GGG GGG GAG A/C AAT CAT MAT MA TTA ATG TTM CAO GM ATA

Leu Gin Gly Gly Gly Gly Glu Asn Asn His Asn Lys Leu MET Leu Gin Glu lie

81 108

AGA AAA GAA TTC GCG GCA ATA GAC ACC AAG ATT CAG AGS ACC TOG GAT GAC ATT

Arg Lys Glu Phe Aie Ala lie Asp Thr Lys lie Gin Arg Thr Ser Asp Asp lie

162

GGA ACC TCA ATA CAG TCA GGA ATA AMT ACA AA CTT CTC ACA ATT CAG AGT CAT

Gly Thr Ser lie Gin Ser Gly lie Asn Thr Arg Leu Leu Thr lie Gin Ser His

189 216

GTT CAA AAC TAT ATC CCA CTA TCA CTA ACA CAA CAA ATG TCA GAT CTC AGA AAA

Val Gin Asn Tyr le Pro Leu Ser Lou Thr Gin Gin MET Ser Asp Leu Arg Lys

*243 270

miT ATC AAT GAT CTA ACA MAT AMA A GAA CAT CAA GAA TG CCA ATA CAG AGA Phe lie Asn Asp Leu Thr Asn Lys Arg Glu His Gin Glu Val Pro liel Gin Arg

297 324

ATG ACT CAT GAT AGA GGT ATA GAA CCC CTA AAT CCA S G TC TGG AGG TIGT -

MET Thr Hits Asp Arg Gly lie Glu Pro Leu Asn Pro Asp Lys Phe Trp Arg Cys

351 378

ACA TCT GGT AAC CCA TCT CTA ACA AGT AGT CCT AAG ATA AGG TTA ATA CCA GGG'

Thr Ser Gly Asn Pro Ser Leu Thr Ser Ser Pro Lys lie Arg Leu Ile Pro Gly

405 - 432

CA GGT TTA TTA GCA ACA TT ACT ACA GTA ACT GGC TGT ATT AGA ATC CCA TC

Pro Gly Leu Leu Ala Thr Ser Thr Thr Val Thr Gly Cys le Arg lle Pro Ser

459 486

lTTA GC ATC MT CAT TTA ATC TAC OCT TAC ACC TCT MT CTT ATC ACC CAG GGC Leu AlIa le Asn His Leu lle Tyr Ala Tyr Thr Ser Asn Leu Ils Thr Gin Gly

513; 540

TGT OGA GAT ATA GGG AAA TCT TAC CAA M TA CTA CAA ATA GGG ATA AT ACT ATA

Cys Arg Asp lle Gly Lys Seor Tyr Gin Val Leu Gin lie Gly lie ile Thr lle

567 594

AAT TCG GAC CTA lTA CCT GA TTA MA AAT CCC AGA GT C ACA C AT ACA TT Asn Ser Asp Leu Val Pro Asp Leu Asu Pro kArg Val Thr His Thr Phe Asn lie

621 648

GATAT-"T AGG MA TCT TGC TCT CTGG.GCA CTA TTG MAT ACA GAT GTT TAT CAG

Asp Asp Asn Arg Lys Seor Cys Ser Leu Ala Leu Leu Asn Thr Asp Val Tyr Gin

Z567905

Tableau III (suite 1)

675 -702

TTA TGC TCA ACA CCA MA GTT GCT GAG AGA TCC GAT TAT 6CA TCA ACA GGT ATT

Leu Cys Ser Thr Pro Lys Val Ala Glu Arg Ser Asp Tyr AlI Ser Thr Gly lie

729 756

GAG GAT ATT GTA CTT GAC ATT TC ACT AAT AAT GGA TTA ATT ATA ACA AGA AGG

Glu Asp lie Val Leu Asp lie Val Thr Asn Asn Gly Lou lie lie Thr Arg Arg

783 810

m ACA AAT MT AAT ATA ACT rT GAT MA COG TAT GC GCA TTG TAT CCA TCA Phe Thr Asn Asn Asn lie Thr Phe Asp Lys Pro Tyr Ala Ala Leu Tyr Pro Ser

837 864

GTA GGA CCA GGA ATC TAT TAT AAMG GGT MA GTT ATA 11T CTC GGA TAT GGA GGT

Val Gly Pro Gly lie Tyr Tyr Lys Gly Lys Val lie Phe Leu Gly Tyr Gly Gly

891 -918

CTA GAG CAT GMAA GAT MAC GGA GAC GTA ATA TGT AAT ACA ACT GGT TGT CCT GGC

Leu Glu His Glu Asp Asn Gly Asp Val lie Cys Asn Thr Thr Gly Cys Pro Gly

-945 972

MAAA ACA CAG AGA GAC TGT MAAT CAG GCT TCT TAT AGC CCA TGG TTC TCA AAT AGG

Lys Thr Gin Arg Asp Cys Asn Gin Al. Ser Tyr Ser Pro Trp Phe Ser Asn Arg

999 1026

AGA ATG GTA MAAC TCT ATT ATT GTT GTT GAT AAA GGC ATA GAT GCA ACT TTT AGC

Ar-g MET Val Asn Ser lie lie Val Val Asp Lys Gly lie Asp AlI Thr Phe Ser

1053 1080

TTG AGG GTG TGG ACT ATT CCA ATG AGC CAA MT TAT TGG GGA TCA GM GGA AGA

Leu Arg Val Trp Thr lie Pro MET Ser Gin Asn Tyr Trp Gly Ser Glu Gly Arg

1107 1134

TTA CTT TTA TTA GGT GAC AGA ATA TAC ATA TAT ACT AGA TCC ACA AGT TGG CAC

Leu Leu Leu Leu Gly Asp Arg Ile Tyr lie Tyr Thr Arg Ser Thr Ser Trp His

1161 1188

AGT AM TTA CAG TTA GGG GTA ATT GAT ATT TCT GAT TAT MT MAAT ATA AGA ATA

Ser Lys Leu Gin Leu Gly Val lie Asp lie Ser Asp Tyr Asn Asn lie Arg li.

1215 1242

AAT TGG ACT TGG CAT MT CTA CTA TCA CGG CCA GGA MT GAT GM TGT CCA TGG

Asn Trp Thr Trp ils Asn Leu Leu Ser Arg Pro Gly Asn Asp Glu Cys Pro Trp k567905 Tableau III (suite 2)

1269 1296

GGT CAT TCA TGC CCA GAC GGA TGT ATA ACA GGA 6TT TAC ACT GAT SCA TAT CCG

Gly His Ser Cys Pro Asp Gly Cys lle Thr G61y Val Tyr Thr Asp Ala Tyr Pro

1323 1350

CTA AAC CCA TCG GGG AGT GTT GTA TCA TCA GTA ATT CTT GAC TCA CAA AAG TCT

Leu Asn Pro Ser Gly Ser Val Val Ser Ser Val lie Leu Asp Ser-Gin Lys Ser

1377 1404

AGA GAA AAC CCA ATC ATT ACC TAC TCA ACA GCT ACA MT AGA ATA AAT GAA TTA

Arg Glu Asn Pro lie lie Thr Tyr Ser Thr Ale Thr Asn Arg lie Asn Glu Leu

1431 1 458

GCT ATA TAT ACA GM CAC TTC CAG CTG CAT ATA CAA CMA CAA ATT GTA TCA CAC

Ala lie Tyr Thr Glu His Phe Gin Leo Hlis Il Gin Gin Gin llo Val Ser His

1485 1512

ATT ATG ATA AAG GGT ATT GTT TTC ATA TAG TAG AAA TM ATC ACA GAA GTT TGA

lie MET lie Lys Gly lie Val Phe lie.. Lys. lie bThr Glu Val

1539 566

ATA CGT TTC MC CGA TGT TAT TCA AAA CAG AAS TTC CAA AAM ACT GCA GCT MA

lie Arg Phe Asn Arg Cys Tyr Ser Lys Gin Lys Phe Gin Lys Thr Ala Ale Lys

1593 1620

TTG ATC ATC GCA TAT CGG ATG CCA GAT GAC ATT AAA AGA GAC CAC CAT ACA GAC

Leu lie lie Ala Tyr Arg M Pro Asp Asp lie Lys Arg Asp Hls Hls Thr Asp

1647 674

MAAC ACA GGA GAT GAT GCA AGA TAT AAA GGA ATC CCC CCC CCC CCC CT GCA GCA

Asn Thr Gly Asp Asp Ala Arg Tyr Lys Gly lle Pro Pro Pro Pro Pro Aia Ala

-567905

Tableau IV

KET Leu Gin Glu lie Arg Lys Glu Phe Ais Ais lie Asp lhr Lys lls Gin Arg lhr Snr Asp Asp lie Gly lThr Ser lie Gin Ser Gly lie Asn lhr Arg Leu Leu Thr lle Gin Ser His Val Gin Asn Tyr lle Pro Leu Ser Leu lhr Gln Gin IMT Ser Asp Leu kArg Lys Phe Ilie An Asp Leu lhr Asn Lys Arg Glu His Gin Glu Vol Pro lie Gin Arg IET lhr His Asp Arg Gly Ili Glu Pro Leu Asa Pro Asp Lys Phe Trp Arg Cys Thr Ser Gly Asn Pro Seor Leu lThr Ser Ser Pro Lys li Arg Leu lie Pro Gly Pro Gly Leu Leu AlI lhr Ser Thr lhr Vol Thr Gly Cys lie Arg lie Pro Sesr Leu Ait lie Asn HMis Leu lie Tyr Ai. Tyr lThr Ser Asn Leu lie Thr Gin Gly Cys Arg Asp lie Gly Lys Ser Tyr Gin Vel Leu Gin llo Gly Ilie lie lhr lie Asn Sor Asp Leu Val Pro Asp Leu Asn Pro Arg Vol Thr Mis Thr Phe Asn 1le Asp Asp Asn kg Lys Ser Cys Ser Leu Ala Leu Leu Asn Thr Asp Yal Tyr Gin Leu Cys Ser Thr Pro Lys Val AIs Glu Arg Sr Asp Tyr AlI Ser Thr Gly lie Glu Asp lie YVal Leu Asp lie Yal 'Thr Asn Ast Gly Leu le ile Thr Arg Arg Phe Thr Ast Ast Asn le hr Phe Asp Lys Pro Tyr Ala Aià Leu Tyr Pro Ser YVal Gly Pro Gly 11 Tyr Tyr Lys Giy Lys Yal lio Phe Leu Gly Tyr Gly Gly Leu Glu Mis Glu Asp Ash Gly Asp Val fi* Cys Asn Thr Thr Gly Cys Pro Gly Lys Thr Gin kArg Asp Cys Ast Gin Ala Ser Tyr Ser Pro Trp Phe Ser Asn Ar kg Arg JET Val Asn Sor lie Ie Yal Val Asp Lys Gly lie Asp AIa Thr Phe Ser Leu Arg Val Trp Thr Ils Pro MET Sor Gin Ast Tyr Trp Gly Seor 1Glu Gly kArg Leu Leu Leu Leu Gly Asp Arg lia Tyr lie Tyr Thr Arg Ser lThr Ser Trp Mis Ser Lys Leu Gin Leu Gly ltl lit Asp 11e Ser Asp Tyr Asn Asn le kArg 1le As Trp Thr Trp His Ast Leu Leu Sev Arg Pro Gly Asu Asp Glu Cys Pro Trp Gly Mis Ser Cys Pro Asp!ly Cs lie iThr Gly Val Tyr Thr Asp Ala Tyr Pro Leu Ast Pro Ser Gly Ser Val Val Ser Ser Val lia Leu Asp--Ser Gin Lys Ser Arg Glu Ast Pro lie lie lbr Tyr Ser lhr Ais Thr Asa Arg lis Asn Glu Leu AIl lie Tyr Thr Glu Hls Fie in Lau Hlis Ile 1n. iGL 6lnY48 Gin lie Val Sea Mis lit NUET le.Laysly Ila VjL Pk IJ.9

-. el dmm -

z567905 En se référant au tableau I, la séquence d'ADN et les sites de reconnaissance et de scission de l'enzyme de restriction sont totalement détaillés. Par convention,

la séquence d'ADN est lue en direction de 5' à 3'.

L'insertion d'ADNc de HA montrée sur ce tableau est de 1675 paires de bases en longueur, comprenant les queues poly-G et poly-C utilisées pour le clonage. Sans les queues, ce clone d'ADNc représente 1633 bases dérivées de l'ARNm de HA de PI-3. Le clone représente une copie sensiblement complète d'ADNc de l'ARNm de HA. Une mise en séquence de l'extension d'amorce de l'ARNm de HA que l'on obtient des cellules infectées indique qu'il ne

manque qu'environ 10 à 15 bases à l'extrémité 5' du gène.

Dans le gène du tableau I, le premier codon initiant la translation (ATG) codant un résidu de méthionine (MET) est trouvé à la position 40 dans la séquence. Un double codon d'arrêt (TAG TAG) a été identifié à proximité de l'extrémité 3' du gène cloné (position 1486). I1 est par conséquent apparent que le tableau I représente une copie presque complète de l'ARNmde HA viral et probablement

toute la région de codage de la protéine de cet ARNm.

Tandis qu'un autre codon d'initiation peut exister plus en amont dans l'ARNm viral, et qu'ainsi il

n'est pas indiqué sur le tableau I, cela est peu probable.

2" La plupart des ARNm viraux eucaryotes sont caractérisés par la présence d'une élongation 5' ne codant pas de bases

qui contiennent les sites liant le ribosome de l'ARNm.

La séquence 5' ne codant pas putative du gène du tableau I a environ 40 bases de long. De plus, comme on l'a mentionné ci-dessus, on pense qu'environ 10 à 15 bases d'ARNm

manquent de la séquence d'ADNc.

La séquence 3' ne codant pas est caractérisée par un signal de polyadénylation canonique (AAATAA) à la

position 1492 dans la séquence d'ADN, suivant immédiate-

ment le double codon d'arrêt. Cette séquence (soulignée sur le tableau I) signale l'addition des queues poly-A

aux ARNm in vivo.

Le tableau II est une liste de tous les sites possibles d'enzyme de restriction ou d'endonucléase dans le gène d'ADNc cloné du tableau I. Les données de la liste ont été produites par analyse au calculateur de la séquence d'ADN. La première colonne indique l'abréviation de l'enzyme de restriction. La seconde colonne est le site de reconnaissance ou de scission pour l'enzyme et la troisième colonne donne l'emplacement, parnombre de bases,de chaque enzyme dans la séquence. Les numéros représentent le côté 5' du site de scission à moins que l'abréviation de l'enzyme soit entre crochets. Les crochets indiquent que seul un site de reconnaissance pour cet enzyme particulier est connu; l'enzyme peut en réalité se scinder en un site différent. Les lettres désignant le site de reconnaissance ou de scission représentent les acides aminés qui suivent: A- adénine C - cytosine G - guanine J - adénine ou cytosine K - guanine ou thymine L - adénine ou thymine M - cytosine ou guanine N - adénine, cytosine, guanine ou thymine P - adénine ou guanine Q- cytosine ou thymine T - thymine Le tableau III indique la translation de la séquence d'ADN du tableau I en séquence d'acides aminés correspondante. Par convention, la séquence d'acides aminés est lue de l'extrémité amino à l'extrémité carboxyle. Le clone d'ADNc montré sur le tableau I est caractérisé par un cadre de lecture de translation ouvert de la position 1 à la position 1485 de la séquence d'ADN o l'on trouve un double codon d'arrêt. Tous les autres cadres de lecture sont bloqués par la présence de codons multiples d'arrêt

à travers toute la séquence.

En mesurant à partir du premier résidu de méthionine à la position 40 du nucléotide (sur le tableau III), jusqu'à la fin ou aux codons d'arrêt à la position 1486, le polypeptide codé par ce gène d'ADNc contient un résidu prévisible de 482 acides aminés (montré sur le tableau IV) et a un poids moléculaire prévisible de 54.142 daltons. Cette valeur est inférieure au poids moléculaire observé de la protéine de HA séparée des virions, qui est, comme on peut s'y attendre, en l'absence de glycosylation. Le tableau IV montre la séquence prévisible d'acides aminés du polypeptide de HA (la protéine cible)avec les sites putatifs deglycosylation (Asn-X-Ser ou Asn-X-Thr) soulignés d'une ligne en trait plein. L'analyse de l'hydropathicité a révélé plusieurs

domaines hydrophiles et hydrophobes dans la protéine.

Le domaine hydrophobe est important à l'extrémité carboxylique (résidus 455 à 482) de la protéine qui est caractéristique des protéines de la membrane comme les hémagglutinines virales. Cette séquence hydrophobe terminale est indiquée en soulignant en pointillé sur

le tableau IV.

Ayant identifié le gène d'ADNc pour la protéine cible, le gène est alors inséré dans un vecteur approprié d'expression. Le critère pour le choix ou la construction d'un vecteur approprié dans ce but dépendra des conditions spécifiques du procédé (comme la purification, le rendement), de la stabilité du produit (comme la sensibilité

aux protéases, etc..) et de la toxicité ou de l'inhibi-

tion du produit. Le choix du vecteur d'expression et de l'hôte sera dans la connaissance et la compétence d'une

personne travaillant dans ce domaine.

Pour déterminer la justesse du vecteur pour l'expression du gène d'ADNc, un moyen approprié de détection de l'expression de la protéine cible doit être employé. Diverses méthodes standards de détermination d'immunité peuvent être utilisées, avec la détection de la

protéine cible soit par colorimétrie ou autoradiographie.

Des anticorps monoclonaux peuvent être préparés, soit contre la protéine cible purifiée ou le virus d'intérêt, c'est-à-dire contre chacune des protéines du virus, pour une utilisation dans l'immunodétermination. Les plasmides recombinants, formés en insérant le gène d'ADNc d'intérêt dans le vecteur d'expression choisi, sont utilisés pour transformer les hôtes, qui alors sont clonés. Il est souhaitable que la cible accumule la protéine lorsque les hôtes transformés sont mis en culture dans un milieu approprié dans des conditions appropriées. Le milieu et les conditions dépendront de l'hôte de transformation et le choix sera dans la connaissance et la compétence d'une personne travaillant dans ce domaine. Le produit d'expression de la protéine sera codé par le gène synthétique cloné, sous l'influence de la région adjacente du promoteur du plasmide. Le vecteur aura de préférence été étudié ou choisi pour comprendre un promoteur fort pour une expression maximale du gène d'intérêt. La protéine exprimée peut être identique ou sensiblement identique à la protéine virale d'intérêt, peut représenter une portion de cette protéine

ou peut être une protéine de fusion de translation.

Dans ce contexte, une "protéine de fusion de translation" est un peptide qui est le produit de l'expression de deux gènes fusionnés ou segments de ceux-ci, c'est-à-dire des produits de translation fusionnés. Une protéine de fusion de translation produite par la méthode de l'invention comprendra tout ou partie de la protéine cible virale et une séquence d'acides aminés d'un gène placé à proximité du gène d'intérêt sur le vecteur de transformation ou l'ADN hâte. On peut s'attendre à ce

que la protéine de fusion de translation soit immunologi-

quement active.

La protéine produite peut être récoltée par des moyens conventionnels. Par exemple, les cellules hôtes peuvent être centrifugées et lysées ou on peut recueillir

le liquide surnageant contenant la protéine excrétée.

La protéine peut être isolée ou purifiée du lysat ou du liquide surnageant par une chromatographie sur tamis moléculaire, une chromatographie liquide haute pression ou une chromatographie par immunoaffinité. Les anticorps monoclonaux spécifiques de la protéine cible peuvent

être utilisés dans cette dernière méthode de purification.

Le polypeptide purifié sera antigénique et peut être utilisé comme vaccin. Lorsqu'il est administré comme vaccin, dans un adjuvant approprié, l'antigène de biosynthèse élicitera la production des anticorps à la protéine cible dans l'animal ou humain traité, offrant ainsi une protection contre l'infection par le virus. Typiquement, les vaccins sont administrés par injection sous-cutanée ou intramusculaire, par voie

intraveineuse, orale ou par aérosol.

L'ADNc lui-même sera utile dans des détermina-

tions pour détecter la présence du virus correspondant dans divers environnements, comme le sang d'un animal soupçonné d'être infecté. Par exemple, l'ARNm de l'animal

peut être isolé et immobilisé sur un support solide.

L'incubation avec l'ADNc marqué chimiquement ou radio-

marqué pour le virus cible ou la protéine cible forcera la sonde d'ADNc viral marqué à se lier à i'ARNm d'essai, si l'ARNm viral est présent. L'ADNc lié peut être détecté, par exemple par colorimétrie, autoradiographie,

etc.. après avoir retiré l'ADNc non lié.

Par ailleurs, il sera possible de désigner et de construire des peptides synthétiques en se basant sur la connaissance de la séquence des nucléotides d'un gène d'ADNc construit selon la méthode de l'invention. La séquence de nucléotides du gène peut être translatée en séquence d'acides aminés correspondants de la protéine d'expression comme sur les tableaux III et IV. La protéine elle-même peut être synthétisée par voie chimique, ou bien un plus petit peptide peut être conçu et synthétisé o seront incorporés un ou plusieurs sites actifs ou

antigéniques de la protéine cible.

Les exemples qui suivent sont donnés uniquement dans des buts d'illustration et ne sont pas destinés à limiter

l'invention décrite ici.

Les solutions concentrées et les milieux de culture utilisés dans les exemples ont été préparés

comme indiqué ci-dessous.

Milieu de synthèse de l'ADNc du premier brin Tris-HCl (pH 8,3) 0,01 M Chlorure de potassium 60,00 mM Chlorure de magnésium 10,00 mM dCTP 0,50 mM dATP 0,50 mM dGTP 0,50 mM dTTP 0,50 mM DTT 10,00 G g Oligo(dT) (12-18) 500g/m Milieu de synthèse de l'ADNc du second brin HEPES (pH 6,8) 0,20 mM Chlorure de potassium 60,00 mM dCTP 0,50 mM dATP 0,50 mM dGTP 0,50 mM dTTP 0,50 mM Solution de Denhardt Ficoll (TM) (Pharmacia Fine Chemicals, Inc.) 5,0 g Polyvinylpyrrolidone 5,0 g BSA (Fraction V Pentax) 5,0 g H20 à 500 mt Filtrer à travers un filtre de Nalgene

jetable. Stocker à -20 C.

EXEMPLE I

(Isolement des ARNm de l'hôte et du virus) Préparation du virus: Des cellules de rein de bovin de Madin-Darby (MDBK) obtenues de l'American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Avenue, Rockville, Maryland 30852, ont été cultivées dans le milieu essentiel minimum (modifié) (modification de Dulbecco) ("DMEM") (Flow Laboratories, Inc) complété de % de sérum foetal de veau (K.C. Biologicals). Le virus de la parainfluenza du bovin type 3 (souche SF-4, VR-281,

obtenue de ATCC) a été purifié deux fois sur plaque.

Des virus ont été préparés en infectant des cellules de MDBK avec une solution saline du virus à une faible multiplicité d'infection (" 0,01 PFU/cellule). Les cellules infectées ont cultivées dans DMEM à 37 C pendant environ 3 à 4 jours jusqu'à ce que la cytopathologie soit presque complète et les liquides surnageants contenant le virus ont été récoltés, mis en portions et congelés à -70 C jusqu'à l'utilisation. Les produits ont été titrés par détermination sur plaque sur des cellules de MDBK sous un recouvrement semi-solide de 2,0%o (p/v) de méthylcellulose (Dow Chemical Co) dans DMEM complété de 2% de sérum foetal de veau, 50 U.I/mL de pénicilline et 50J.g/mt de streptomycine. Des plaques visibles sont apparues en trois jours, moment auquel les plaques ont

été teintées de violet cristal et les plaques comptées.

Préparation d'ARNm de PI-3 tritié: Dans des ballons T-1-50 contenant des cellules de MDBK infectées, i'ARN a été marqué métaboliquement avec 20jtLCi par mû de 3H-uridine en présence de 1,0g d'actinomycine D par mÈ à 18 heures de post-infection, la période de pointede la synthèse de l'ARNm du virus. L'actinomycine D est utilisée pour empêcher la transcription de 1'ADN hôte en ARN tout en permettant la transcription de l'ARNv en ARNm viral,

avec pour résultat que seul l'ARNm viral devient marqué.

Les ARNm de PI-3 tritié ont été utilisés comme comparaison dans l'analyse de la tache de Northern et pour

définir les dimensions des messages de PI-3.

Isolement d'ARN: Le total de ARN a été récolté des cellules de MDBK infectées en utilisant la méthode au thiocyanate de guanidine-chlorure de césium de Chirgwin et autres, Biochemistry, volume 18, pages 5294-99 (1979). Selon cette méthode)108 cellules de cinq ballons T-150 ont été lysées in situ par addition de mQ- d'un tampon de thiocyanate de guanidine (GuSCN) (5,0 M de GuSCN, 50,0 mM de Tris-HC1 (pH 7,0), 50,0 mM de EDTA, 5% (v/v) de B-mercaptoéthanol) ajusté à 2% (p/v)

avec Sarkosyl-40 (marque de fabrique) (Ciba-Geigy Corp).

Ce mélange a été chauffé à 55 C pendant 5 minutes puis

rapidement refroidi sur de la glace pendant 5 minutes.

Le lysat a été disposé en couche sur 7,0 mQ de 5,7 M de CsCl dans 50 mM de EDTA et centrifugé à 20 C pendant heures à 15.000 g dans un rotor à godet oscillant (25.000 t/mn). L'ARN total a été récupéré sous la forme d'une boulette du fond du tube de centrifugeuse. La

boulette de ARN a été soumise à un plus ample fraction-

nement sur des colonnes d'oligo (dT) cellulose pour isoler l'ARNm contenant poly-A selon la méthode de Aviv et Leder, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, volume 69, pages

1408-12 (1972).

L'ARN a été isolé des cellules de MDBK infectées du placébo de la même manière à l'exception que les cellules sont"infectées" d'une solution saline, plutôt que d'une solution saline du virus. L'ARN isolé des cellules infectées du placébo a été utilisé dans des buts de comparaison aux exemples IV et V.

EXEMPLE II

(Synthèse des molécules d'ADNc) L'ADN complémentaire d'ARNm poly-A isolé à l'exemple I a été synthétisé par incubation de 5,0j..g d'ARNm poly-A dans 100 ú du milieu de synthèse d'ADNc du premier brin à 370 C pendant 10 minutes. Ensuite, on a ajouté 12 U de transcriptase reverse du virus de myéloblastose avienne (Life Sciences, Inc) par jUg d'ARNm. Ce mélange a été incubé à 42 C pendant 45 minutes, refroidi sur de la glace pendant 5 minutes et chauffé à C pendant 3 minutes. I1 a été centrifugé à 15.000 g dans une microfugeuse pendant 2 minutes pour retirer la

protéine précipitée.

L'ADNc à deux brins a été synthétisé de l'ADNc à un seul brin dans un incubateur de 200 ki contenant 100.t du liquide surnageant de la réaction du premier brin dans lO00t du milieu de synthèse de l'ADNc du second brin. On a ajouté un volume de l'ADN polymérase de E. coli (fragment de Klenow) pour obtenir une concentration de 10 U par >Ug d'ADNc à un seul brin. Ce mélange a été incubé pendant 16 heures à 15 C. La réaction a été arrêtée en accomplissant une seule extraction au phénol-chloroforme. Les produits (molécules d'ADNc à deux brins) ont été dessalés et concentrés par deux précipitations séquentielles dans la spermine suiviesd'une précipitation dans l'éthanol. L'ADNc à deux brins dans la solution de réaction du second brin a précipité en présence de 10 mM

de spermine à 0 C (sur de la glace) pendant 30 minutes.

L'ADNc précipité a été recueilli par centrifugation à 15.000 g dans une microfugeuse pendant 5,0 minutes. La boulette a été remise en suspension dans une solution contenant 10 mM de spermine. Après une incubation de minutes à 0 C, le précipité a été recueilli par centrifugation comme précédemment. L'ADNc précipité a été remis en suspension dans 40 mM d'acétate de sodium et 10 mM d'acétate de magnésium avant précipitation avec

2,5 volumes d'éthanol à -700 C. Les ADNc produits à deux brins ont été digérés avec S1 nucléase pour

retirer l'extrémité en épingle à cheveux à un seul brin. L'ADNc a été incubé dans un volume de 50 cLQ de 0,3 M de NaCl, 0,03 M d'acétate de sodium, 0,003 M de ZnCl2 (pH 4,5) et 10 U de S1 nucléase pendant 30 minutes à 37 C. Les produits réactionnels de l'ADNc à deux brins ont été dessalés et concentrés par

précipitation dans la spermine.

EXEMPLE III

(Construction de la librairie d'ADNc) La population des ADNc préparés à partir d'ARNm de cellules infectées du virus à l'exemple II a été terminée par incubation avec 30 U de désoxynucléotidyl transférase terminale dans un tampon de réaction contenant 250 mM de cacodylate de potassium (pH 7,2), 2,0 mM de CoC12, 1,0 mM de DTT et 1,0 mM de dCTP pendant 15 minutes à 25 C pour produire des molécules d'ADNc avec des extrémités poly-C. Le vecteur plasmidique pBR322 a été digéré avec l'endonucléase de restriction de Pst I à 32 C pendant

16 heures pour produire des molécules d'ADN linéaires.

Ces molécules linéaires étaient terminées en poly-G en utilisant dGTP par le même processus utilisé pour terminer les ADNc. Les molécules du vecteur terminées en poly-G ont été mélangées aux ADNc terminés en poly-C et recuites par incubation comme suit: 70 C pendant 30 minutes, 37 C pendant 150 minutes et 22 C pendant 30 minutes, afin de former des plasmides reconstitués ayant les gènes d'ADNc insérés au site de restriction de Pst I d'origine. Cette construction permet l'excision subséquente des gènes d'ADNc par Pst I. Les plasmides chimériques créés dans cet exemple ont été utilsés pour transformer les cellules de E. coli K-12 souche AC80 (donnée par L. Bopp, General Electric) par la méthode de coprécipitation au phosphate de calcium décrite par Kushner, Proc. of the Int'l Symposium of Gen. Eng., Biomedical Press (1978). Les cellules transformées de E. coli ont constitué une

librairie de cellules contenant les insertions d'ADNc.

EXEMPLE IV

(Identification des clones spécifiques du virus) Des clones comprenant des gènes spécifi'ques du virus ont été identifiés par hybridations de colonies différentielles en utilisant des sondes d'ADNc marquées 32 P dérivées par transcription reverse d'ARNm extrait par le processus de l'exemple I des cellules de MDBK infectées du virus de PI-3 ou des cellules de MDBK infectées,du placébo. La synthèse des sondes d'ADNc à un seul brin radio-marquées a été entreprise par la méthode décrite à l'exemple II à l'exception que 3 P dCTP

a remplacé dCTP dans le mélange réactionnel.

Les cellules clonées de E. coli préparées à

l'exemple III ont été cultivées sur des filtres de nitro-

cellulose recouvrant des plaques d'agar de Luria.

On a préparé des doubles de chaque filtre. Les colonies résultantes ont été lysées en utilisant 0,5 M de NaOH, et l'acide nucléique libéré a été fixé aux filtres par

chauffage pendant 60 minutes à 80 C dans un four à vide.

Les filtres contenant les colonies lysées de E. coli ont été préhybridés par incubation dans le réactif de 5x Denhardt (c'est-à-dire à cinq fois la concentration donnée ci-dessus), 5x SSC, 100 yg/mú de sperme de saumon dénaturé, 50% de formamide et d'ADN pendant

24 heures à 42 C.

L'hybridation des sondes radio-marquées à l'ADNc cloné a été entreprisepar incubation des filtres dans un réactif de 2x Denhardt, 5x SSC, 50 jLg/m t d'ADN du sperme du saumon, 50 ' de formamide, 7,5% de sulfate de dextrane et la sonde radio-marquee spécifique soit de 1'ARNm de MDBK ou de l'ARNm de MÈBK plus PI-3. L'incubation a été pendant 24 heures à 42 C. La sonde non liée a été retirée par lavage des filtres dans 2x SSC plus 0,1% de

SDS, avec ensuite lavage dans O,lx SSC avec 0,1 % de SDS.

Des clones spécifiques du virus ont été détectés en utilisant une autoradiographie. Les colonies s'hybridant différentiellement avec des sondes contenant les séquences virales, c'est-à-dire uniquement positives, sur les filtres hybridés en utilisant les sondes d'ARNm de MDBK plus PI-3, et négatives sur les doubles de filtres hybridés en utilisant les sondes d'ARNm de MDBK ont été choisies

et redéterminées pour confirmer la spécificité virale.

EXEMPLE V

(Hybridation réciproque) Les clones d'ADNc spécifiques du virus de l'exemple IV ont été groupés par la méthode d'hybridation réciproque de Rozenblatt et autres "Cloning and Characte- rization of DNA Complementary to the Measles virus mRNA Encoding Hemagglutinin and Matrix Protein", J. Virology, volume 42, pages 790-97 (1982). L'ADN cloné a été excisé du pBR322 comme véhicule de l'un des clones d'ADNc spécifiques du virus par digestion avec l'enzyme de restriction de Pst I. L'ADN restreint a été résolu par fractionnement dans 1,5% de gel agarose, pour donner

l'ADN linéaire du plasmide pBR322 et l'ADNc d'insertion.

L'ADNc d'insertion a été électro-élué du gel et radio-

marqué avec 32P-dCTP par le processus de translation de l'entaille de Maniatis et autres, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., volume 72, pages 118488 (1975), en utilisant l'ensemble de réactif de translation par l'entaille de

Bethesda Research Laboratories.

La sonde d'ADNc radio-marqué a été utiliséecomme sonde d'hybridation contre tous les clones spécifiques du virus dans la librairie d'ADNc de PI-3 à la manière qui suit: les colonies ont été simultanément consolidées

sur une plaque principale d'agar et un filtre de nitro-

cellulose sur une seconde plaque d'agar et on a laissé croître. Les colonies sur le filtre ont été lysées avec un alcali par la méthode de Hanahan et Meselson, Gene, volume 10, pages 63-67 (1980). Après neutralisation, l'ADN a été fixé sur le filtre par cuisson. Ces taches d'ADN en colonies ont été hybridées avec la sonde 32p comme décrit par Grunstein et Hogness, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., volume 72, pages 3691-65 (1975). A la suite

de l'hybridation, les filtres ont été autoradiographiés.

Les clones s'hybridant avec la sonde marquée ont été

désignés par Groupe A de PI-3.

Une seconde sonde a été préparée de la même manière à partir du groupe non hybridant. Le processus d'hybridation a été répété jusqu'à ce que tous les clones aient été subdivisés en six classes en se basant sur l'analyse d'hybridation réciproque. Le tableau V indique le nombre de clones de chaque groupe, la dimension approximative de l'insertion d' ADNc, la dimension approximative d'ARNm correspondant, le poids moléculaire d'ARNm et l'affectation du codage expérimental,lorsqu'on

la connaît.

Tableau V

(Classification des clones d'ADNc de PI-3 basée sur les relations d'hybridation réciproque) Numéro de groupe A B C D E Sonde1 6-8 5-2 3-5 54 6-6 Nombre de clones 38 8 10 3 5

Gamme de dimension 500- 400- 500- 400- 500-

des insertions 1500bp 1300bp 1600bp 1300bp 1000lbp ARNm correspondant ARN 5 ARN 4 ARN 3 ARN 6 ? Dimension d'ARNm 1600 1900 1950 1190 ? (bases) Poids moléculaire d'ARNm 0,55 0,64 0,65 0,41 ? (x 106 daltons) Affectation de codage NC F(?) HA M P(?) 1 Dix clones spécifiques de PI-3 n'ont pu être classés

par l'analyse d'hybridation réciproque. (NC, nucléo-

capside; F, fusion; Ha, hémagglutinine; M, matrice; P, phosphoprotéine.)

EXEMPLE VI

(Analyse de la tache de Northern) Pour déterminer les ARNm correspondants de chacun des groupes de clones d'ADNc établis par hybridation réciproque, une analyse de la tachede Northern a été effectuée Les insertions d'ADNc de clones individuels dans les Groupes A-D ont été excisées et radiomarquées avec 32p par translation de l'entaille par la méthode décrite à

l'exemple V pour une utilisation comme sondes d'ADNc.

L'ARN messager des cellules de MDBK infectées du virus de PI-3 et infectées du placébo a été dénaturé en utilisant 14% de glyoxal et 50% de diméthyl sulfoxyde dans 5% de phosphate de sodium (pH 6,8) à 50 C pendant 1 heure et fractionné par électrophorèse dans 1% de gel agarose. Les

ARNm ont été transférés en taches à un filtre de nitro-

cellulose par action capillaire, en utilisant 20x SSC.

Après transfert, le filtre a été cuit pendant 2 heures à 65 C, refroidi à la température ambiante et placé dans 5x SSC pendant 15 minutes. On l'a alors scellé dans un sac contenant un tampon de préhybridation (réactif à 5x Denhardt, 5x SSC, 50 % de formamide et 100,ug/mL d'ADN de sperme de saumon dénaturé (un seul brin) et on a incubé dans un bain d'eau à 42 C pendant 4 heures. Le filtre a alors été découpé en bandes, chacune comprenant

un couloir d'ARNm de PI-3 et un couloir d'ARNm de MDBK.

Les bandes ont été placées dans des sacs individuels contenant le tampon d'hybridation (2x Denhardt, 5x SSC, % de formamide, 7,5,% de sulfate de dextrane, 50 g/mt

d'ADN du sperme de saumon dénaturé et 1,0 mM de pyro-

phosphate de sodium). Chaque bande a été hybridée avec des sondes marquées de 32p préparées, que l'on avait dénaturées par chauffage dans un bain d'eau bouillante pendant minutes avant addition au sac. L'hybridation a été effectuée par incubation dans un bain à 42 C pendant 20 heures. A la suite de l'hybridation, les filtres ont été lavés avec l, Ox SSC et 0,1% de SDS (4 lavages, minutes chacun) puis avec 0,5x SSC et 0, 1% de SDS

(4 lavages,15 minutes chacun) à la température ambiante.

Ensuite, on les a autoradiographiés. L'ARNm tritié de PI-3 préparé à l'exemple I a subi une électrophèse dans un couloir parallèleplacé sur le même filtre de nitrocellulose et visualisé parfluorographie en utilisant un jet de EN3Hance (marque de fabrique) (New England

Nuclear) pour servir de marqueur interne et de témoin.

La fluorographie a été faite par exposition au film Kodak XAR (marque de fabrique) avec écran d'intensification à-70 C pendant 24 à 48 heures jusqu'à ce que les images

soient visibles.

Des ARNm viraux individuels ont reçu des affectations de codage expérimental en se basant sur les similitudes des relations de dimension avec les protéines du virion et les ARNm d'autres paramyxovirus. Dans cet exemple, les ARNm du virus de la stomatite vésiculaire ont été utilisés comme marqueurs afin d'estimer les poids moléculaires des ARNm de PI-3 (Rose, J. et autres, "Nucleotide Sequence Complexities, Molecular Weights and Poly (A) content of Vesicular Stomatitis Virus mRNA Species", J. of Viroloqy, volume 21, pages 1105-12 (1975). Les ARN 4 et 5 de PI-3 ont émigré très précisément et étaient les mieux résolus lorsque les gels ont été transférés par taches à de la nitrocellulose plutôt que séchés avant fluorographie. Comme le montre le tableau V, la capacité de codage des six espèces d'ARN poly-A est grossièrement en corrélation avec les dimensions des six protéines de structure virale et avec la capacité estimée de codage total du génome viral. La sonde du Groupe A s'est hybridée en une position correspondant à l'ARNm du nucléocapside putatif, tandis que la sonde du Groupe C s'est hybridée en une position correspondant à l'ARNm

de HA putatif.

EXEMPLE VII

(Sélection hybride et translation) Ces affectations de codage expérimental pour les Groupes-A et C ont été confirmées par sélection hybride et translation in vitro de l'ARNm viral. L'ADN du plasmide (10 Og) a été isolé des clones de PI-3 des Groupes A et C

et purifié par centrifugation avec CsCl-bromure d'éthidium.

L'ADN a été dénaturé par chauffage dans 20 CO de Tris-HCl (pH 7,5) et 1,0 mM de EDTA pendant 10 minutes à

100 C et en refroidissant rapidement sur de la glace.

On a ajouté un volume égal de NaOH à iN et la solution d'ADN incubée à 25 C pendant 20 minutes. La solution a été neutralisée par addition de 9, 0 m E de 1,5 M de NaCI,

0,15 M de citrate de sodium et 0,25 M de Tris-HCl (pH 8,0).

L'ADN a été immobilisé sur des filtres de nitrocellulose de 2,0 cm de diamètre (pré-imbibés dans 3x SSC) par

filtration lente en utilisant un collecteur sous vide.

Les filtres ont été séchés à l'air pendant 1 heure à

C et cuits à 800 C pendant 2 heures dans un four à vide.

Après séchage, les filtres ont été coupés en bandes de 0,7 cm et placés dans un tube en corex siliconé de 30 ml. Une solution de préhybridation de 50% (p/v) de formamide désionisé, 20 mM de PIPES (pH 6,4), 0,75 M de NaCl, 1,0 mM de EDTA, 1% (p/v) de SDS, 5,0,>mg d'ADN du sperme de saumon à un brin et 5,0 _9g d'ARN de transfert de E. coli ont été ajoutés. On a incubé pendant 2 heures à 37 C. Le tampon de préhybridation a été

retiré et les bandes lavées avec le tampon de pré-

hybridation sans ARNt et ADNs.

Pour l'hybridation, les filtres coupés ont été incubés avec 50 _.g d'ARN de cellule entière isolé de cellules de MDBK infectées par un virus ou infectées d'un placébo dans un tampon d'hybridation de lO2-0 de 50% (v/v) de formamide désionisé, 20 mM de PIPES (pH 6,4), 0,75 M de NaCl, 1,0 mM de EDTA, 1% (p/v) de SDS et

1,0 mM de complexes de vanadyle pendant 5 heures à 50 C.

Les filtres ont été complètement lavés avec TNE plus

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0,5% de SDS, puis TNE seul. Les filtres ont été transférés à des tubes en corex de 15 mt et on a ajouté 300 / d'eau stérile. L'élution de l'ARNm lié a été entreprise par ébullition dans un bain d'eau pendant une minute. L'échantillon a été congelé rapidement dans

l'azote liquide puis dégelé à la température ambiante.

* Les filtres ont été jetés. L'ARN élué a été extrait avec du phénol, du chloroforme, de l'alcool isoamylique et précipité en utilisant de l'éthanol à -70 C. L'ARNm précipité dans l'éthanol a été recueilli par centrifugation

et lyophilisé.

Chaque ARNm élué de la sélection hybride a été translaté dans un système IVT d'extrait de germe de blé exempt de cellule (Bethesda Research Laboratories) en utilisant 35S-méthionine (New England Nuclear). Des produits de translation spécifiques du virus (protéine) ont été immunoprécipités en utilisant des antisérums

polyclonaux du lapin par rapport au virus purifié de PI-3.

Les complexes immunoligiques ont été séparés des mélanges réactionnels par adsorption sur le polyacrylamide de la protéine A (Immunobeads (marque de fabrique), Bio-Rad)

comme décrit par Rose, Nature, volume 279, page 260 (1979).

Les produits immunoprécipité-s ont été libérés de l'adsor-

bant de la protéine A par ébullition pendant 5 minutes

dans 25 mt de tampon (5% p/v SDS, 6% v/v de 2-mercapto-

éthanol dans l'eau)et ont subi une électrophorèse dans un système de gel de polyacrylamide-SDS à 10% (SDS-PAGE)

(Laemmli, Nature, volume 227 pages 680-85 (1970)).

Après Sélectrophorèse, les gels ont été disposés électri-

quement sur du papier de nitrocellulose (Bio-Rad), fluorographiés avec un jet de EN3hance (marque de fabrique) (New England Nuclear), et autoradiographiés pendant 24 heures à 1 semaine, jusqu'à ce que les images soient visibles, à -700 C en utilisant le film Kodak X-Omat AR

(marque de fabrique) (Kodak).

Comme témoin, l'ARNm viral a été isolé des cellules infectées du virus de PI-3 du bovin comme décrit à l'exemple I. L'ARNm isolé total a été translaté selon les processus de translation in vitro décrits précédemment dans cet exemple. Les produits de translation (aussi bien viral que hôte) ont été immunoprécipités en utilisant les antisérums du lapin polyclonaux par rapport au virus purifié de PI-3 comme décrit ci- dessus pour identifier

des protéines spécifiques du virus. Les protéines identi-

fiées de cette manière sont indiquées au tableau VI

(polypeptides témoins).

On peut voir que trois protéines virales ont été identifiées par translation in vitro de l'ARNm total avec ensuite immunoprécipitation. Deux de celles-ci, les protéines d'hémagglutinine (HA) et du nucléocapside (NC) correspondent bien aux protéines spécifiques du virus translatées par les ARNm choisis par hybridation c'est-à-dire, les ARNm choisis par hybridation de la sonde du Groupe A qui ont dirigé la synthèse d'une protéine avec un poids moléculaire de 65-70.000 daltons (correspondant à 68.000 daltons pour la protéine du nucléocapside dL virion et 65-67.000 daltons pour la protéine du groupe témoin) ces ARNm choisis par hybridation de la sonde du Groupe C qui ont

dirigé la synthèse d'une protéine ayant un poids moléculai-

re de 60.000 daltons (correspondant à 69.000 daltons pour la protéine d'hémagglutinine du virion et 60.000 daltons pour la protéine du groupe témoin). Une protéine de 31.000 daltons a été identifiée dans le groupe témoin qui correspond à la protéine de la matrice du virion de 35.000 daltons. Aucun polypeptide spécifique du virus n'a été détecté dans les extraits de germe de blé

programmés avec l'ARN de cellules infectées de placébo.

Tableau VI

(Poids moléculaire 1 des polypeptides du virus de PI-3 de bovins) Désignation Polypeptides Polypeptides Polypeptides du du virion témoins choisis par polypeptide hybridation

L 180.000 ND 2 ND

P 79.000 ND ND

HA 3 69.000 60.000 60.000

NC 4 68.000 65-67.000 65-70.000

F 55.000 ND ND

M 4 35.000 31.000 ND

Les poids moléculaires sont exprimés en daltons.

2 ND: "non détecté" 3 La différence des poids moléculaires entre les polypeptides de HA du virion et les polypeptides de HA translatés in vitro est due au manque de

glycosylation dans les produits in vitro.

4 Les protéines du nucléocapside (NC) et de la matrice (M) ne sont pas glycosylées et ainsi présentent une moindre variabilité de poids

moléculaire que déterminée par les gels SDS-PAGE.

RE V E N D I CAT I O NS

I.- Gène de synthèse ou fragment d'ADN, caractérisé en ce qu'il: (a) code pour une protéine virale de la parainfluenza du bovin du type 3 ou une partie de celle-ci et (b) comprend un gène d'ADN à deux brins qui est une copie de gène d'ARN du virus codant pour ladite protéine

ou sa partie.

2.- Gène de synthèse selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il code pour l'hémagglutinine de la

parainfluenza du bovin du type 3 ou une partie de celle-ci.

3.- Séquence d'ADN du gène de synthèse selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle commence par

un codon d'initiation, se termine par un codon de termi-

naison ou d'échelon et comprend la séquence des nucléotides

du tableau I ou une partie de celle-ci.

4.- Séquence d'ADN du gène de synthèse sela la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle code un polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés du

tableau IV ou une partie de celle-ci.

5.- Vecteur ou plasmide, caractérisé en ce qu'il

comprend le gène d'ADN à deux brins selon la revendi-

cation 1.

6.- Cellule hôte, caractérisée en ce qu'elle

comprend le gène d'ADN à deux brins de la revendication 1.

7.- Protéine virale de la parainfluenza du bovin du type 3 ou partie de celle-ci, caractérisée en ce qu'elle est produite par mise en culture de la

cellule hôte selon la revendication 6.

8.- Protéine ou partie de celle-ci selon la revendication 7, caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence d'acides aminés du tableau IV ou une partie

de celle-ci.

9.- Procédé de construction d'un gène de synthèse pour une protéine virale cible, laquelle protéine est codée à l'état naturel par un gène localisé sur le génome viral du brin moins non segmenté, du virus de la parainfluenza du bovin du type 3, caractérisé en ce qu'il consiste à: (a) isoler une population d'ARNm comprenant les gènes codant pour ladite protéine virale, (b) construire des hybrides d'ARNm/ADN à deux brins à partir de ladite population d'ARNm en utilisant la transcriptase reverse de l'enzyme et les molécules d'amorce d'oligodesoxynucléotide, (c) digérer ou retirer les brins d'ARNm desdits hybrides, (d) produire des molécules d'ADNc sensiblement complètement à deux brins à partir de l'ADNc à un seul brin restant après l'étape (c), en utilisant une ADN polymérase, et (e) retirer les parties extrêmes à un seul brin desdites molécules d'ADNc sensiblement complètement à deux brins en utilisant une nucléase spécifique d'un

seul brin.

10.- Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que les gènes de synthèse sont insérés dans des vecteurs appropriés, des hôtes appropriés sont transformés par les vecteurs recombinants et les hôtes transformés sont clones pour créer une librairie comprenant

des gènes de synthèse de ladite protéine cible virale.

11.- Gène de synthèse pour une protéine cible du virus de la parainfluenza du bovin du type 3 ou pour au moins un site antigène de ladite protéine du virus, caractérisé en ce qu'il est produit par le procédé

selon la revendication 9.

12.- Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que le gène de synthèse est utilisé pour concevoir et construire un peptide de synthèse utile comme vaccin ou agent de diagnostic en déterminant la séquence des nucléotides dudit gène de synthèse, en translatant ladite séquence des nucléotides en séquence correspondante d'acides aminés de la protéine d'expression et en synthétisant un peptide ayant ladite séquence

d'acides aminés ou une partie de celle-ci.

13.- Procédé de production d'une protéine virale ou partie de celle-ci correspondant à une protéine cible virale du virus de la parainfluenza du bovin du type 3, caractérisé en ce qu'il consiste à: (a) construire un gène de synthèse codant pour ladite protéine cible ou une partie de celleci, en (i) isolant une population d'ARNm comprenant le gène codant pour ladite protéine virale, (ii) produisant des hybrides d'ARNm/ADNc à deux brins à partir de ladite population d'ARNm en utilisant la transcriptase reverse de l'enzyme et les molécules d'amorce d'oligodésoxynucléotide, (iii) digérant ou retirant les brins d'ARNm desdits hybrides, (iv) produisant des molécules d'ADNc sensiblement complètement à deux brins à partir de l'ADNc à un seul brin restant après l'étape (c), en utilisant une ADN polymérase, (v) retirant les parties extrêmes à un seul brin desdites molécules d'ADNc sensiblement complètement à deux brins en utilisant une nucléase spécifique à un seul brin, (vi) insérant les molécules résultantes d'ADNc à deux brins dans des vecteurs et transformant les hôtes par les vecteurs recombinants, et (vii) clonant les hôtes transformés pour créer une librairie de gènes, (b) identifier et isoler ledit gène de synthèse,

(c) insérer ledite gène dans un vecteur d'expres-

sion approprié, (d) transformer un hôte approprié par le vecteur recombinant comprenant ledit gène de synthèse, (e) cloner l'hôte transformé, (f) mettre l'hôte en culture dans un milieu approprié à l'expression dudit gène de synthèse, et (g) accumuler ladite protéine virale ou une partie de celle-ci dans le milieu et/ou dans l'hâte transformé. 14.- Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que la protéine exprimée est appropriée

à une utilisation comme vaccin ou agent de diagnostic.

15.- Vaccin caractérisé en ce qu'il comprend la protéine de la revendication 14 dans un adjuvant

approprié.