DE3524736A1

DE3524736A1 - Synthetische gene fuer den rinder-parainfluenza-virus

Info

Publication number: DE3524736A1
Application number: DE19853524736
Authority: DE
Inventors: John M. Columbus Ohio Rice
Original assignee: WR Grace and Co
Current assignee: WR Grace and Co Conn
Priority date: 1984-07-18
Filing date: 1985-07-11
Publication date: 1986-01-30
Also published as: DK326185A; GB8517994D0; US4743553A; AU4441785A; IT1187689B; FR2567905B1; IT8521609A0; ES545299A0; ES8608581A1; FR2567905A1; AU588238B2; GB2161814A; DK326185D0; NL8502063A; BE902921A

Description

Beschreibung

Die Erfindung betrifft die Herstellung von Vaccinen gegen den Rinder-Parainfluenza-Virus Typ III (PI-3), der als Paramyxovirus klassifiziert wird, und insbesondere die Herstellung synthetischer DNA-Gene, die PI-3-Proteine codieren. Diese Gene können zur Herstellung des gewählten Virenproteins durch transformierte Zellen verwendet werden, wobei das biosynthetische Protein zur Verwendung in einer Vaccine,diagnostischen Kit oder dergleichen geeignet ist.

Die synthetischen Gene selbst sind als Diagnosemittel geeignet.

Der Rinder-Parainf luenza-Virus Typ III, der auch als PI-3 oder "Shipping-Fever-Virus" bezeichnet wird, besitzt als einer der Hauptfaktoren bei der Auslösung eines akuten respiratorischen Krankheitssyndroms bei Rindern eine erhebliche pathologische und ökonomische Auswirkung. Das "Shipping-Pever-Syndrom" kann durch eine PI-3-Vireninfektion ausgelöst werden, gewöhnlich unter Streßbedingungen, wie sie mit dem Verschiffen oder dem Treiben von Rindern bei Weidekampwechsel einhergehen. Es wird angenommen, daß die Virusinfektion die Tiere für eine Bakterieninfektion, beispielsweise mit Pasteurella multocida oder Pasteurella haemolytica praedisponiert, die das "Shipping-Fever-Syndrom" hervorrufen. Aufgrund des verminderten Körpergewichts, teuren Behandlungen und verzögerter Vermarktungsfähigkeit werden jährliche wirtschaftliche Verluste geschätzt, die 75 Millionen Dollar überschreiten. Ein ähnlicher Virus infiziert Schafe und führt zu einer respiratorischen Erkrankung, die dem "Shipping-Fever-Syndrom" sehr ähnlich ist.

Virenvaccine, einschließlich abgeschwächter lebender Vaccine, werden seit etwa 20 Jahren mit einigem Erfolg verwendet. So werden beispielsweise in der US-PS 4 293 545 lebende Bakterienvaccine beschrieben, die aus chemisch modifizierten Stämmen von Pasteurella multocida und Pasteurella haemolytica hergestellt wurden.

Der Erfolg einer Vorbeugung gegen Parainfluenza-Viren mit Virenvaccinen wurde durch die begrenzte Wirksamkeit der gegenwärtig zur Verfügung stehenden Vaccine eingeschränkt. Dies ist zum Teil auf die störende Wirkung vorhandener Antikörper oder die Hemmung durch andere Virenvaccine zurückzufühen. Ferner kann die Verwendung lebender Virenvaccine bei trächtigen Tieren zur Infektion des Fötus und anschließendem Abort führen.

Es ist unlängst möglich geworden, synthetische Gene herzustellen, indem man eine bimolekulare Zwei-Strang-DNA-Kopie eines messenger-RNA (mRNA)-Moleküls formuliert. Ein Beispiel für dieses gentechnologische Verfahren wird in der US-PS 4 357 421 beschrieben, wo es verwendet wird, um ein synthetisches Gen für ein Influenza-Haemagglutinin-Protein herzustellen. Influenzaviren enthalten keine DNA, sondern sie enthalten ein Genom aus segmentierten negativen Viren-RNA (vRNA)-Strängen, das während der Infektion repliziert wird und Viren messenger-RNA (mRNA) bildet und als Matrize zur Produktion weiterer vRNA dient. Influenzaviren-Genome gehören zum segmentierten Typ, d.h., jedes Gen ist als gesondertes vRNA-Stück vorhanden, das getrennt zur Bildung von mRNA transscribiert wird. Das in der US-PS 4 357 421 beschriebene Verfahren macht von vRNA als direkte Matrize für das interessierende synthetische Gen Gebrauch.

Erfindungsgemäß ist es jetzt möglich, ein synthetisches Gen oder DNA-Fragment zu synthetisieren, das einem auf dem nicht-segmentierten, negativen (oder minus) vRNA-Stranggenom des PI-3-Virus lokalisierten Viren -Gen entspricht. Es werden mit dem Virus infizierte Zellen erhalten und die mRNA - sowohl Viren- als auch Wirts-RNA - von den übrigen Zellkomponenten abgetrennt. Es werden doppel-strängige, der ursprünglichen mRNA komplementäre synthetische DNA-Moleküle konstruiert. Diese Population von komplementärer DNA (cDNA) wird kloniert, um eine cDNA-Gen-Bibliothek herzustellen, aus welcher virenspezifische Gene ausgewählt werden können. Das interessierende Viren-Gen wird beispielsweise durch reziproke Hybridisierung und hybridselektierte Translation identifiziert und isoliert. Ist das interessierende Gen erst einmal identifiziert, so wird es in einen geeigneten Vector insertiert, der benutzt wird, um einen geeigneten Wirt zur Expression des Gens zu transformieren. Das exprimierte Protein kann zur Formulierung von Vaccinuntereinheiten, diagnostischen Mitteln und dergleichen verwendet werden.

Es ist Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, mit Hilfe dessen synthetische Gene konstruiert werden können, die mit den normalerweise in den Genomen des Rinder-Parainf luenza-Virus-Typ III, eines Paramyxovirus, gefundenen Genen korrespondieren.

Damit im Zusammenhang steht die Aufgabe der Erfindung, ein synthetisches Gen zu identifizieren und isolieren, das für ein bestimmtes Viren-Zielprotein codiert, beispielsweise für ein Protein mit antigener Wirkung wie Haemagglutinin.

Es ist ferner Aufgabe der Erfindung, das ausgewählte synthetische Gen in transformierten Wirten zu exprimieren, um das durch das synthetische Gen codierte Viren-Zielprotein auf ökonomische Weise herzustellen.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung von DNA-Sequenzen bereitzustellen, ausgehend von denen Proteinaminosäuresequenzen bestimmt werden können, um synthetische Peptide aufzubauen.
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Darüber hinaus können mit dem erfindungsgemäßen Verfahren DNA-Proben und Peptide als Diagnosemittel geschaffen werden.

In der Beschreibung der Erfindung werden die folgenden Abkürzungen gebraucht:

bp - Basenpaare

BSA - Rinderserumalbumin

cDNA - komplementäre DNA

Ci - Curie

dATP - Desoxy-adenosintriphosphat

dCTP - Desoxy-cytidintriphosphat

dGTP - Desoxy-guanosintriphosphat

dTTP - Desoxy-thymidintriphosphat

DTT - Dithiothreit

DNA - Desoxyribonucleinsäure

EDTA - Ethylendiamintetraessigsäure

GuSCN - Guanidinthiocyanat

HA - Haemagglutinin

HEPES - N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure

IU - internationale Einheit

MDBK - Madin-Darby Rinderniere (Zellen)

MET - Methionin

mRNA - messenger RNA

NC - Nukleokapsid-Protein

oligo(dA) - Polymer aus einigen (gewöhnlich 2-20) Desoxyadenosinmolekülen

oligo(dT) - Polymer aus einigen (gewöhnlich 2-20) Desoxy-

thymidinmolekülen

PI-3 - Rinder-Parainfluenzavirus Typ III
PIPES - Piperazin-N,N'-bis[2-ethansulfonsäure]
poly-A - Poly-desoxyadenosin
poly-C - Poly-desoxycytidin
poly-G - Poly-desoxyguanosin
RNA - Ribonucleinsäure
rRNA - ribosomale RNA
SDS - Natriumdocecylsulfat

SSC - 0,15 M Natriumchlorid - 0,015 Natriumeitrat

(pH 7,0)

TNE - 10 itiM Tris-HCl (pH 8,0) - 100 mM Natriumchlorid - 1,0 mM EDTA (pH 8,0)

Tris-HCl - Tris(hydroxymethyl)aminomethan.HCl
tRNA - Transfer-RNA
U - Einheit
vRNA - Viren-RNA
X - jeglicher Aminosäurerest
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Figur 1 zeigt in vier Teilen die DNA-Sequenz der Haemagglutinin-cDNA des Rinder-Parainfluenza-Virus einschließlich der Schnittstellen des Restrictionsenzyms, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kloniert wurde.

Figur 2 zeigt eine Tabelle, in der die Schnittstellen für das Restrictionsenzym in der klonierten cDNA gemäß Figur 1 angegeben sind.

Figur 3 zeigt eine übertragung der DNA-Sequenz des HA-cDNA-Gens gemäß Figur 1 in die korrespondierende Aminosäuresequenz.

Figur 4 zeigt vorhergesagte Aminosäuresequenz des HA-Proteins als Produkt der Translation des HA-cDNA-Gens gemäß Figur 1.

Die Begriffe "mRNA" und "cDNA" werden erfindungsgemäß zur Bezeichnung des gesamten RNA- oder bzw. DNA-Moleküls oder zur Bezeichnung jeglichen biologisch signifikanten Teils derselben verwendet. Das bedeutet, daß das erfindungsgemäße Verfahren entweder mit einem kompletten Viren-mRNA-Molekül oder mit einem Teil des Viren-mRNA-Moleküls durchgeführt werden kann. Beispielsweise kann es wünschenswert sein, nur den Teil des Viren-Gens zu isolieren, kopieren und klonieren, der eine bestimmte Proteinuntereinheit oder einen Teil derselben oder eine bestimmte Stelle mit Antigenwirkung codiert.

Der PI-3-Virus wird aufgrund morphologischer, serologischer und biochemischer Eigenschaften als Paramyxovirus klassifiziert. Paramyxoviren sind RNA-Viren und enthalten keine DNA. Ihre genetische Information ist lediglich in einem einzelsträngigen, kontinuierlichen (oder nicht-segmentierten) RNA-Stück enthalten. Die Mitglieder der Familie der Paramyxoviren entwickeln eine Replikationsstrategie, die auf einem Genom aus einem negativen RNA-Strang basiert. Das allgemeine Schema der Replikation von Paramyxoviren-RNA hat die Transcription subgenomischer mRNA-Spezies von der negativ-strängigen Matrize von einem einzelnen Promotor durch einen Virion-assoziierten Transcriptasekomplex zur Folge. In den untersuchten Systemen ist jede mRNA-Spezies mit Polyribosomen assoziiert, ist polyadenyliert und codiert im allgemeinen ein einzelnes Virenprotein.

Die Replikation von PI-3 ist bisher wenig untersucht worden, obgleich verschiedene Viren-Strukturproteine identifiziert worden sind? vgl. beispielsweise Shibuta et al,

"Characterization of Bovine Parainfluenza Virus Type 3", Microbiol. Immunol. 2Z_, 617-628 (1979) und Guskey et al, "High Yield Growth and Purification of Human Parainfluenza Type 3 Virus and Initial Analysis of Viral Structural Proteins", J. Gen. Virology, 5J., 115-123 (1981). Der Stand der Technik vermittelt keine Information hinsichtlich der intrazellulären Proteine oder der Viren mRNA-Spezies, die während der Vxrenreplikation synthetisiert werden. Ferner stehen über die erfindungsgemäße Beschreibung hinaus keinerlei Angaben zur Transcription und Codierung für die PI-3-mRNA zur Verfügung.

Erfindungsgemäß ist es möglich, ein bestimmtes synthetisches Gen oder DNA-Fragment zu konstruieren, das mit einem auf dem nichtsegmentierten, minus-strängigen vRNA-Genom des PI-3-Virus lokalisierten Gen korrespondiert. Das synthetische Gen oder Fragment codiert ein PI-3-Virenprotein oder einen Teil desselben und enthält ein doppel-strängiges DNA-Gen, das eine Kopie des für das Protein oder den Teil des Proteins codierenden Viren-RNA-Gens ist. Das synthetische Gen kann zur Herstellung des interessierenden Proteins, oder "Zielproteins", verwendet werden. Die Bezeichnung "Zielprotein" (targetprotein) wird erfindungsgemäß zur Bezeichnung sowohl des interessierenden Virenproteins als auch des durch Expression des synthetischen Gens gebildeten Proteins verwendet. Es ist jedoch zu beachten, daß das expremierte Protein sich in nicht-signifikanter Weise von dem Virenprotein unterscheiden kann, oder nur mit einem Teil oder einer Untereinheit des Virenproteins korrespondieren kann.

In einer Vorbereitungsstufe zur Konstruktion des synthetischen Gens wird das Zielprotein identifiziert. Wird die Herstellung einer Vaccine-üntereinheit oder eines diagnostischen Mittels angestrebt, so kann das Zielprotein identifiziert

werden, indem man nachweist, daß es die Bildung von neutralisierenden oder schützenden Antikörpern bei einem infizierten Tier stimuliert. Im Falle des PI-3-Virus ist Viren-Haemagglutinin (HA) das Hauptstrukturprotein, gegen das schützende Antikörper gebildet werden. Das HA-Protein findet sich auf der Oberfläche des Virus und ist für die Anheftung des Virus an die Zellen zur Einleitung des Infektionsprozesses verantwortlich. Die Isolierung des für das Haemagglutinin-Protein codierenden Gens wird deswegen angestrebt, um es klonieren und zur extraviralen Herstellung des HA-Proteins verwenden zu können. Das biosynthetische HA-Protein ist insbesondere zur Verwendung in Vaccinen geeignet. Es stimuliert die Bildung von Antikörpern gegen PI-3 in geimpften Tieren ohne das Risiko einer Vireninfektion, da das HA-Protein selbst nicht infektiös ist. Es existieren jedoch Hinweise darauf, daß andere Proteine ebenfalls zur Stimulierung der Antikörperbildung beitragen. Die Aktivität eines Vaccins oder eines diagnostischen Mittels kann weiter dadurch verbessert werden, daß man biosynthetische Formen dieser weiteren Strukturproteine einschließt. Beispielsweise kann es wünschenswert sein, einer Vaccine oder dergleichen ein Struktur-Fusionsprotein beizufügen, bei dem es sich um ein Oberflächenprotein des Virus handelt, das verantwortlich für die Fusion mit der zu infizierenden Zelle ist und Eigenschaften aufweist, die den Transfer der Viren-RNA in diese Zellen bewirkt.

Mit dem Virus infizierte Wirtszellen werden nach herkömmlichen Verfahren gewonnen. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Madin-Darby-Rindernierenzellen (MDBK) als Wirtszellen verwendet, da sie eine hohe Replikationsrate der Viren ermöglichen. Die Zellen werden mit dem Virus infiziert und nach Standardzellkulturverfahren aufbereitet.

Die RNA wird nach irgendeinem herkömmlichen Verfahren aus den Zellen geerntet. Beispielsweise kann das Guanidinthiocyanat- CsCl-Verfahren nach Chirgwin et al, Biochemistry, JJ., 5294-5299 (1979) verwendet werden, das in Beispiel I näher beschrieben ist. Es wird die Gesamt-RNA, d.h. die Wirts-mRNA, -tRNA und -rRNA sowie Viren-vRNA und -mRNA isoliert oder gewonnen.

Die mRNA sämtlicher eukaryontische Zellen infizierender Viren liegt selbstverständlich in polyadenylierter Form vor (mit Poly(A)-Schwänzen). Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird dies bei der Trennung der mRNA von anderen Zellbestandteilen und anderer RNA genutzt. Zur Isolierung der polyadenylierten mRNA wird die gesamte gewonnene RNA in bequemster Weise an 01igo(dT)-Cellulosesäulen fraktioniert. Wenn gewünscht können jedoch auch andere Verfahren verwendet werden, um die mRNA zu trennen.

An polyadenylierter mRNA ist es möglich, nach dem Verfahren der reversen Transcription doppel-strängige hybride RNA-DNA-Moleküle zu konstruieren. Die reverse Transcriptase, eine RNA-gesteuerte DNA-Polymerase, synthetisiert an jedem Molekül einen neuen DNA-Strang, der dem bereits existierenden RNA-Strang komplementär ist. Diese Transcription erfordert das Vorhandensein eines doppel-strängigen Ausgangspunktes oder Primers, von dem aus die Transcription beginnen kann. Der Primer kann durch Hybridisieren eines Oligo(dT)-Moleküls mit dem 3'-Poly (A)-Ende der mRNA gebildet werden. Die reverse Transcriptase beginnt die Synthese der cDNA an dem doppel-strängigen Ausgangspunkt und bildet das doppel-strängige mRNA-cDNA-Hybridmolekül.

Als nächstes wird der mRNA-Strang jedes doppel-strängigen Moleküls in solcher Weise verdaut oder entfernt, daß der

cDNA-Strang intakt bleibt. Beispielsweise kann der RNA-Strang durch alkalische Hydrolyse oder mit Ribonuclease verdaut werden oder durch Hitzedenaturierung von den cDNA-Strängen entfernt werden. Als Ergebnis wird eine einzelsträngige cDNA erhalten, die durch eine Haarnadelschlaufe an ihrem 3'-Ende eine Eigenprimer-Struktur aufweist.

Die einzelsträngigen cDNA-Moleküle werden in doppel-strängige DNA umgewandelt, indem man reverse Transcriptase oder eine andere DNA-Polymerase wie E. coli DNA-Polymerase (E.C. 2.7.7.7) oder ein Klenow-Fragment einer DNA-Polymerase (gebildet durch Spaltung des Polymerasemolekuls mit Trypsin) verwendet. Jegliches dieser Enzyme synthetisiert einen zweiten DNA-Strang komplementär zu dem ersten einzelsträngigen cDNA-Molekül, wobei die Transcription an dem teilweise doppel-strängigen Primer des Haarnadelendes beginnt. Das resultierende Molekül ist im wesentlichen doppel-strängige cDNA mit einem restlichen einsträngigen Haarnadelende. Durch Behandlung des Moleküls mit SI-Nuclease (E.C. 3.1.30.1), einer einzelstrangspezifischen Nuclease, wird das einzelsträngige Haarnadelende getrimmt. Das Ergebnis ist eine Population doppel-strängiger cDNA-Moleküle, die der ursprünglichen Population von mRNA-Molekülen komplementär sind.

Es ist zu beachten, daß die als Matrizen verwendeten RNA-Moleküle in dem erfindungsgemäßen Verfahren sowohl Viren- als auch Wirts-mRNA enthalten. Als Ergebnis ist die nach dem beschriebenen Verfahren hergestellte cDNA-Population ziemlich heterogen. Die cDNA wird kloniert, um eine Bibliothek oder Genbank zu bilden, aus der das interessierende cDNA-Gen identifiziert werden kann.

Die cDNA-Klonbibliothek wird hergestellt, indem man die cDNA-Gene in geeignete Vectoren zur Transformierung geeigneter Wirtszellen insertiert. Die Wirt-Vector-Kombinationen sollten in diesem Stadium des Verfahrens nach dem Gesichtspunkt der einfachen Handhabbarkeit und der Konsistenz der Excision ausgewählt werden. Ferner sollte der Vector eine einzelne Erkennungsstelle für die Restrictionsendonuclease enthalten, die vorzugsweise geeignet ist, sowohl bei der cDNA als auch bei dem verdauten Vector durch "Homopolymertailing" umgebildet zu werden. Beispielsweise kann der Plasmidvector pBR 322, der zum Transformieren von E. coli geeignet ist, mit Pst I Restrictionsendonuclease (E.C. 3.1.23.31) verdaut werden, um ein lineares DNA-Molekül zu liefern. Dieses lineare Molekül kann unter Verwendung von terminaler Desoxynucleotidyl-Transferase (E.C. 2.7.7.31) und dGTP mit Enden versehen werden, so daß Poly(G)-Schwänze an dem Vector erhalten werden. Die cDNA-Moleküle können mit Poly(C)-Schwänzen versehen werden, indem man terminale Desoxynucleotidyl-Transferase und dCTP verwendet. Die Poly(G)-Schwänze des Vectors sind komplementär zu den PoIy(C)-Schwänzen der cDNA.

Die Produkte - in diesem Beispiel die cDNA mit PoIy(C)-Enden und linearen Vectoren mit Poly(G)-Enden - können dann vermischt und durch Erwärmen und langsames Abkühlen reassoziiert werden, um rekonstituierte Plasmide zu bilden, die die cDNA-Gene an der ursprünglichen Pst I-Restrictionsstel-Ie insertiert aufweisen. Nach dem Reassoziieren wird ein Strang an jedem Ende der insertierten cDNA eine mit der Pst I-Stelle korrespondierende Lücke aufweisen. Nachdem das rekombinierte Plasmid in eine transformierte Wirtszelle eingeführt ist, wird der Wirt die Lücke reparieren, indem es die Pst I-Stelle an jedem Ende des integrierten Gens rekonstruiert. Diese Konstruktion erlaubt das nachfolgende Ausschneiden des cDNA-Gens durch Verwendung der Pst I-Restrictionsendonuclease zur weiteren Manipulation.

Die Integration der cDNA-Gene in Vectoren kann nach unterschiedlichen Verfahren durchgeführt werden. So ist es beispielsweise möglich, die Fragmente mit Linker-Molekülen unter Verwendung einer geeigneten DNA-Ligase zu verknüpfen. Alternativ können durch Homopolymertailing komplementäre PoIy(A)- und Poly(T)-Sequenzen an den Enden jedes Fragments angebracht werden.

Die so konstruierten chimeren Plasmide oder Vectoren werden verwendet, um zur Transformierung durch den verwendeten Vector geeignete Zellen zu transformieren. E. coli ist besonders gut als Transformationswirt geeignet, aber auch andere Organismen, wie beispielsweise Bacillus subtilis, können bei geeigneter Auswahl des Vectors verwendet werden. Aus der so konstruierten cDNA-Klonbibliothek können Klone identifiziert und isoliert werden, die die virenspezifischen Gene enthalten.

Eine Sub-Klonbank, die nur die virenspezifischen Klone enthält, d.h. transformierte Wirtszellen, die virenspezifische Gene oder DNA-Fragmente enthalten, wird nach dem Verfahren der differenzierten Hybridisierung hergestellt. Es werden einzelsträngige cDNA-Proben aus vireninfizierten und nichtinfizierten MDBK-Zellen nach dem oben beschriebenen Verfah-

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ren hergestellt, mit dem Unterschied, daß P dCTP verwendet wird, um eine radioaktiv markierte cDNA erhalten. Klonierte E. coli-Zellen aus der zuvor konstruierten cDNA-Bibliothek werden auf Nitrocellulosefiltern angezogen und es werden Kontroll-Filter zubereitet. Die Kolonien werden lysiert und die freigesetzte Nucleinsäure auf den Filtern fixiert. Die radioaktiv markierten Proben werden mit der klonierten cDNA auf den Filtern hybridisiert. Nachdem nicht-gebundenes Material entfernt wurde, können die virenspezifischen Kolonien, d.h. Kolonien, die cDNA

— A I —

korrespondierend mit einem Viren-Gen enthalten, autoradiographisch identifiziert werden. Positive Kolonien, die positive Werte nur auf denjenigen Filtern ergeben, die mit der zellulären plus der Viren-cDNA-Probe hybridisiert wurden und nicht auf den Kontroll-Filtern, die unter Verwendung der zellulären mRNA-Probe hybridisiert wurden, sind virenspezifische cDNA-Klone. Nur diese Klone sind in dem nachfolgend beschriebenen Identifizierungsverfahren zu untersuchen,

Um das Screening-Verfahren zu erleichtern, kann die reziproke Hybridisierungsanalyse (oder Koloniekreuzhybridisierung) durchgeführt werden, um die individuellen Klongruppen innerhalb der virenspezifischen cDNA-Klonbibliothek zu definieren, die mit einzelnen Virengenen korrespondieren. Diese Stufe ist nicht erforderlich, da die Identifizierung durch Transformation und direkte Expression mit nachfolgender immunologischer Identifizierung unter Verwendung von beispielsweise monoklonalen Antikörpern durchgeführt werden kann. Da jedoch eine große Anzahl von Klonen in der Bibliothek vorhanden sein kann, wird es wirkungsvoller sein, das Verfahren zu straffen, indem man Klongruppen bildet, die innerhalb der Gruppe kreuzhybridisieren und von denen daher anzunehmen ist, daß sie Segmente des gleichen Virengens enthalten.

Bei der reziproken Hybridisierung wird ein einzelner
virenspezifischer Klon mit Pst I verdaut, um den cDNA-In-

sert freizusetzen. Der Insert wird dann abgetrennt, mit

P radioaktiv markiert und mit sämtlichen Klonen in der

PI-3-cDNA-Bibliothek hybridisiert. Alle Klone, die mit der
Probe hybridisieren werden als Gruppe A bezeichnet. Eine
zweite Probe wird von einem der nichthybridisierenden
Klone entnommen und das Verfahren zur Bildung der Gruppe B
usw. wiederholt, bis mehrere Gruppen gebildet sind und die

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Klone bis zu dem möglichen oder gewünschten Ausmaß in Gruppen zusammengefaßt sind. In der vorliegend diskutierten Ausführungsform für den PI-3-Virus enthielten die Gruppen A und C die größte Anzahl von Klonen und basierend auf der Analogie zu mRNA-Häufigkeitsverteilungen anderer Paramyxoviren (vgl. Rozenblatt et al, "Cloning and Characterization of DNA Complementary to the Measles Virus mRNA Encloding Hemagglutinin and Matrix Protein", J. Virology, 42, 790-797 (1982)) wurde angenommen, daß diese Gruppen die Viren-Nukleokapsid-Proteingene bzw. die HA-Proteingene gemäß Tabelle I codieren.

Das "Northern-Blotting" kann zur Code-Zuordnung jeder der Klongruppen verwendet werden, indem man einen Prototyp-Klon aus jeder Gruppe verwendet. Nach diesem Verfahren können die Klone mit der korrespondierenden Ursprungs-mRNA korreliert werden. Individuelle Prototypklone werden radioaktiv markiert und als Proben zum Auffinden der Viren-mRNA aus den infizierten Zellen verwendet, die durch Blotting auf Nitrocellulosefilter übertragen wurden. Die Viren-mRNA kann basierend auf Übereinstimmungen hinsichtlich der Größenverhältnisse mit Virionproteinen und mit mRNA anderer verwandter Viren nach der Bestimmung durch beispielsweise Elektrophorese probeweise hinsichtlich ihres Code zugeordnet werden. Es wurden sechs deutliche PoIy(A)-RNA-Spezies, bezeichnet als RNA 1-6, in PI-3-infizierten aber nicht in scheininfizierten Zellen gefunden. Scheininfizierte Zellen werden nach den gleichen Verfahren hergestellt wie vireninfizierte Zellen jedoch ohne Zugabe von Viren.

Bei Verwendung von mRNA aus Vesicular-Stomatitis-Viren oder anderer mRNA bekannter Größe als Marker können die Molekulargewichte der PI-3 mRNAn geschätzt werden.

Wie Tabelle I zeigt korreliert die Codekapazität der sechs PI-3 Poly(A)-RNA-Spezies ungefähr mit den Größen der sechs Virenstrukturproteine und mit der geschätzten Gesamtcodekapazität des Virengenoms. Die Probe aus Gruppe A (mRNA 1) hybridisiert bei einer Position, die mit der mutmaßlichen Nukleokapsid-mRNA korrespondiert, und die Probe der Gruppe C (mRNA 3) hybridisiert bei einer Position, die mit der mutmaßlichen HA-mRNA korrespondiert. Es wurde keine Hybridisierung mit mRNA aus nichtinfizierten Wirtszellen (d.h. Wirts-mRNA) beobachtet.

Die Hybrid-Selektion und in vitro Translation von Viren mRNA kann zur Bestätigung der Code-Zuordnung und demgemäß zur definitiven Identifizierung einzelner das Viren-Zielprotein, beispielsweise das HA-Protein, codierender Klone verwendet werden. Nach diesen Verfahren kann Poly(A)-mRNA aus vireninfizierten und aus Kontrollzellen hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Steuerung virenspezifischer Proteinsynthese in einem mRNA-abhängigen zellfreien Translationssystern verglichen werden.

Es wird Plasmid cDNA aus Klonen jeder Gruppe isoliert und auf Nitrocellulosefiltern immobilisiert. Die aus Virus infizierten oder scheininfizierten (Kontrolle) gewonnene PoIy(A)-mRNA wird mit der filtergebundenen cDNA hybridisiert. Diejenige mRNA, die spezifisch mit jeder immobilisierten cDNA hybridisiert, wird von den Filtern eluiert und in vitro translatiert. Die Analyse der Translationsprodukte nach einem Verfahren wie der Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) kann verwendet werden, um die Identifizierung der Klone hinsichtlich des durch die cDNA jeder Klongruppe codierten Virenproteins zu bestätigen. Es kann ebenfalls erwünscht sein, eine immunologische Analyse der in vitro exprimierten Proteine durchzuführen, da Proteine, die bei der in vivo-Bildung glycosiliert sind, in vitro

nicht glycosiliert sind und daher auf dem Gel nicht in die gleichen Positionen wandern. In der Ausführungsform mit PI-3 selektieren die Klone der Gruppe A eine mRNA, die die Synthese eines Proteins steuert, welches mit dem PI-3-Nukleokapsidprotein wandert. Die Klone der Gruppe C selektieren eine mRNA, die die Synthese eines Proteins steuert, welches mit dem HA-Protein wandert. In Extrakten der Translationsprodukte von mRNA aus den scheininfizierten Kontrollzellen sollten keine virenspezifischen Proteine nachweisbar sein.

Als nächstes können die das Zielprotein codierenden Klone durch Restrictionsenzym-Analyse und/oder durch Bestimmung der Nucleotidsequenz charakterisiert werden. Diese Stufe ist von besonderem Interesse und Bedeutung, wenn ein Gen konstruiert werden soll, das nur einen bestimmten Teil des Zielproteins codiert, wie beispielsweise den eine aktive antigene Stelle auf dem Protein enthaltenden Teil. Alternativ kann diese Information verwendet werden, um ein synthetisches Protein zu entwerfen und zu konstruieren, das mit der aktiven Stelle auf dem Zielprotein korrespondiert oder der Untersuchung und dem rationellen Aufbau von Antivirenwirkstoffen dient. Diese Charakterisierungsverfahren werden nach herkömmlichen Methoden und Techniken durchgeführt. Die Figuren zeigen die Ergebnisse der Charakterisierung des PI-3-HA-Gens. Figur 1 zeigt die DNA-Sequenz des wie oben beschrieben klonierten Gens. Figur 2 zeigt eine Tabelle der Restrictionsenzym-Erkennungsstellen des Gens, Figur 3 zeigt eine Translation der DNA-Sequenz des HA-Gens und Figur 4 die vorausgesagte Aminosäuresequenz des HA-Proteins, ,das gebildet werden wird. Die Ergebnisse wurden durch Computeranalyse der DNA-Sequenz des Gens erhalten.

In Figur 1 sind die DNA-Sequenz und die Restrictionsenzym-Erkennungs- und Schnittstellen in allen Einzelheiten angegeben. Herkömmlicherweise wird die DNA-Sequenz in Richtung 5¹ nach 3' gelesen. Der in dieser Figur gezeigte HA-cDNA-Insert weist eine Länge von 1675 Basenpaaren einschließlich der zum Klonieren verwendeten PoIy(G)- und PoIy(C)-Schwänze auf. Ohne die Schwänze wird dieser cDNA-Klon von 1633 Basenpaaren gebildet, die aus der PI-3-HA-mRNA hergeleitet wurden. Der Klon stellt im wesentlichen eine vollständige cDNA-Kopie der HA-mRNA dar? Primer-Extensionssequenzierung der aus infizierten Zellen erhaltenen HA-mRNA zeigte, daß nur etwa 10 bis 15 Basen an dem 5'-Ende des Gens fehlen. Bei dem Gen gemäß Figur 1 wird das erste einen Methioninrest (MET) codierende Initiationscodon (ATG) für die Translation in Position 40 der Sequenz gefunden. Ein doppeltes Stopcodon (TAG TAG) wurde in der Nähe des 3'-Endes des klonierten Gens (Position 1486) identifiziert. Es ist daher offensichtlich, daß Figur 1 eine nahezu vollständige Kopie der Viren HA-mRNA und vermutlich die gesamte das Protein codierende Region dieser mRNA darstellt.

Zwar mag ein weiteres Initiationscodon weiter oberhalb in der Viren-mRNA existieren und daher nicht in der Figur 1 angegeben sein, dies ist jedoch unwahrscheinlich. Die meiste eukaryontische Viren-mRNA ist durch die Gegenwart eines 5' nicht-codierenden Basenabschnittes gekennzeichnet, der die Ribosomenbxndungsstelle der mRNA enthält. Die vermutlich nicht-codierende 5'-Sequenz des in Figur 1 gezeigten Gens weist eine Länge von etwa 40 Basen auf. Ferner fehlen vermutlich, wie oben erwähnt, etwa 10 bis 15 mRNA-Basen in der cDNA-Sequenz.

Die nicht-codierende 3'-Sequenz wird durch ein reguläres (canonical) Polyadenylxerungssignal (AAATAA) in Position 1492 in der DNA-Sequenz charakterisiert, die unmittelbar auf das Doppelstopcodon folgt. Die Sequenz (in Figur 1 unterstrichen) zeigt die Addition von Poly(A)-Schwänzen, an die mRNA in vivo an.

Figur 2 zeigt eine Tabelle sämtlicher möglichen Restrictionsenzym- oder Endonuclease-Erkennungsstellen in dem klonierten cDNA-Gen gemäß Figur 1. Die in der Tabelle wiedergegebenen Daten wurden durch Computeranalyse der DNA-Sequenz erhalten. Die erste Spalte zeigt die Restrictionsenzymabkürzungen. In der zweiten Spalte sind die Erkennungs- oder Schnittstellen für das Enzym und in der dritten Spalte die Position für jedes Enzym anhand der Basenzahl in der Sequenz angegeben. Die Zahlen geben die 5'-Seite der Schnittstelle wieder wenn nicht die Enzymabkürzung in Klammern angegeben ist. Die Klammern weisen darauf hin, daß nur eine Erkennungsstelle für dieses bestimmte Enzym bekannt ist; das Enzym mag jedoch tatsächlich an einer anderen Stelle schneiden. Die die Erkennungs- oder Schnittstellen angebenden Buchstaben stellen die folgenden Nukleotide dar:

-27- 352A7G

A - Adenin

C - Cytosin

G - Guanin

J - Adenin oder Cytosin

K- Guanin oder Thymin

L - Adenin oder Thymin

M - Cytosin oder Guanin

N - Adenin, Cytosin, Guanin oder Thymin

P - Adenin oder Guanin

ΊΟ Q - Cytosin oder Thymin

T - Thymin

Figur 3 zeigt die Translation der DNA-Sequenz gemäß Figur 1 in die korrespondierende Aminosäuresequenz. Herkömmlicherweise wird die Aminosäuresequenz vom Aminoende zum Carboxylende gelesen. Der in Figur 1 gezeigte cDNA-Klon ist charakterisiert durch einen offenen Translations-Leserahmen von Position 1 bis Position 1485 der DNA-Sequenz, wo ein doppeltes Stopcodon gefunden wurde. Alle anderen Leserahmen sind durch die Gegenwart multipler Stopcodons durch die gesamte Sequenz hindurch blockiert. Gemessen von dem ersten Methioninrest bei Nucleotidpositxon 40 (in Figur 3) bis zu den Terminations- oder Stopcodons bei Position 1486 enthält das durch dieses cDNA-Gen codierte Polypeptid vorausgesagte 482 Aminosäurereste (vgl. Figur 4) und besitzt ein vorausgesagtes Molekulargewicht von 54142 Dalton. Dieser Wert ist geringer als das beobachtete Molekulargewicht des aus dem Virion abgetrennten HA-Proteins, was in Abwesenheit der Glycosilierung den Erwartungen entsprechen würde. Figur 4 zeigt die vorhergesagte Aminosäuresequenz des HA-Polypeptids, d.h. des Zielproteins, wobei die vermutlichen Glycoslierungsstellen (Asn-X-Ser oder Asn-X-Thr) unterstrichen sind.

ORIGINAL INSPECTED

Durch hydropathische Analyse wurde gefunden, daß verschiedene hydrophile und hydrophobe Abschnitte innerhalb des Proteins vorliegen. Wichtig ist der hydrophobe Abschnitt an dem äußersten Carboxylende (Reste 455 bis 482) des Proteins, der charakteristisch für Membranproteine wie Viren-Haemagglutinine ist. Diese terminale hydrophobe Sequenz ist in Figur 4 durch unterbrochene Linien hervorgehoben.

Nach der Identifizierung des cDNA-Gens für das Zielprotein wird das Gen in einen geeigneten Expressionsvector insertiert. Die Kriterien für die Auswahl oder Konstruktion eines geeigneten Vectors zu diesem Zweck hängen von den speziellen Verfahrenserfordernissen wie Reinigung und Ausbeute, der Produktstabilität, d.h. der Anfälligkeit gegenüber Proteasen usw. und der Produkttoxizität und Hemmung ab. Die Auswahl des Expressionsvectors und des Wirts liegen im Bereich des Könnens des durchschnittlichen Fachmanns auf diesem Gebiet.

Zur Beurteilung der Eignung des Vectors für die Expression des cDNA-Gens muß ein geeignetes Verfahren zum Nachweis der Expression des Zielproteins verwendet werden. Es können verschiedene Standard Immunoassay-Verfahren verwendet werden, wobei der Nachweis des Zielproteins entweder colorimetrisch oder autoradiographisch durchgeführt werden kann. Es können monoklonale Antikörper zur Verwendung in dem Immunoassay hergestellt werden, die entweder gegen das gereinigte Zielprotein oder den interessierenden Virus, d.h. gegen jedes der Proteine des Virus gerichtet sind.

Die durch Integration des interessierenden cDNA-Gens in den ausgewählten Expressionsvector gebildeten rekombinanten Plasmide werden zum Transformieren der Wirtszellen

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verwendet, die anschließend kloniert werden. Das Zielprotein soll angereichert werden, wenn die transformierten Wirtszellen in einem geeigneten Medium unter geeigneten Bedingungen kultiviert werden. Das Medium und die Bedingungen hängen von dem Transformationswirt ab und die Auswahl liegt im Bereich des Könnens eines durchschnittlichen Fachmannes auf diesem Gebiet. Das Protein als Expressionsprodukt wird durch die klonierten synthetischen Gene unter dem Einfluß der benachbarten Promoterregion des Plasmids codiert. Der Vector wird vorzugsweise so konstruiert oder ausgewählt, daß er einen starken Promotor zur maximalen Expression des interessierenden Gens enthält. Das exprimierte Protein kann identisch oder im wesentlichen identisch mit dem interessierenden Virenprotein sein, es kann ein Teil dieses Proteins bilden oder kann ein "Translationsfusionsprotexn" sein. Erfindungsgemäß ist ein "Translationsfusionsprotein" ein Peptid, welches das Produkt der Expression zweier fusionierter Gene oder deren Segmente ist, d.h. ein fusioniertes Translationsprodukt. Ein nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestelltes Translationsfusionsprotexn enthält das gesamte oder einen Teil des Viren-Zielproteins und eine durch ein Gen codierte Aminosäuresequenz, das dem interessierenden Gen auf der DNA des Transformationsvectors oder des Wirts benachbart ist. Es ist zu erwarten, daß das Translationsfusionsprotexn immunologisch aktiv ist.

Das Proteinprodukt kann nach herkömmlichen Verfahren geerntet werden. Beispielsweise können die Wirtszellen zentrifugiert und lysiert werden oder es kann der das ausgeschiedene Protein enthaltende Überstand gesammelt werden. Das Protein kann durch Molekularsiebchromatographie, Hochdruckflüssigkeitschromatographie oder Immunaffinitätschromatographie aus dem Lysat oder Überstand isoliert oder gereinigt werden. In letzterem Reinigungsver-

fahren können monoklonale Antikörper verwendet werden, die spezifisch für das Zielprotein sind.

Das gereinigte Polypeptid wird antigenisch wirken und kann als Vaccine verwendet werden. Wird es als Vaccine in einem geeigneten Hilfsstoff verabreicht, so wird das biosynthetisch hergestellte Antigen die Produktion von Antikörpern gegen das Zielprotein in dem behandelten Tier oder Menschen hervorrufen und auf diese Weise einen Schutz gegen Virusinfektion bilden. Im typischen Fall werden Vaccine durch subkutane oder intramuskuläre Injektion, intravenös, oral oder durch.ein Aerosol verabreicht.

Die cDNA als solche ist für Nachweisverfahren zum Auffinden des korrespondierenden Virus an verschiedenen Orten geeignet, wie z.B. im Blut eines Tieres, bei dem eine Infektion vermutet wird. Beispielsweise kann die mRNA des Tieres isoliert und auf einem festen Träger immobilisiert werden. Bei der Inkubation mit chemisch oder radioaktiv markierter cDNA für den gesuchten Virus oder das gesuchte Protein wird die markierte Viren-DNA-Probe an die Test mRNA gebunden, wenn Viren-mRNA vorhanden ist. Gebundene cDNA kann beispielsweise colorimetrisch, autoradiographisch usw. nachgewiesen werden, nachdem die ungebundene cDNA entfernt wurde.

Ferner ist es möglich, basierend auf der Kenntnis der Nucleotidsequenz eines erfindungsgemäß konstruierten cDNA-Gens synthetische Peptide zu konzipieren und zu konstruieren. Die Nucleotidsequenz des Gens kann, wie in den Figuren 3 und 4 gezeigt, in die entsprechende Aminosäuresequenz des Expressionsproteins übertragen werden. Das Protein selbst kann chemisch synthetisiert werden, oder es kann ein kleineres Peptid konzipiert und synthetisiert werden, das einen oder mehrere aktive oder antigene Stellen des Zielproteins inkorporiert enthält.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen erläutert.

Die in den Beispielen verwendeten Stanunlösungen und Kulturmedien wurden wie folgt hergestellt:

Erst-Stranq cDNA-Synthesemedium

Tris-HCl (pH 8,3) 0,01 M

Kaliumchlorid 60,00 mM

Magnesiumchlorid 10,00 mM

dCTP 0,50 mM

dATP 0,50 mM

dGTP 0,5 0 mM

dTTP 0,50 mM

DTT 10,00,Ug

Oligo(dT) (12-18) 5,00,

Zweit-Stranq cDNA-Synthesemedium

HEPES (pH 6,8) 0,20 mM

Kaliumchlorid 60,00 mM

dCTP 0,50 mM

dATP 0,50 mM

dGTP 0,50 mM

dTTP 0,50 mM

Denhardt-Losunq

Ficoll (TM) (Pharmacacia Fine

Chemicals, Inc.) 5,0 g

Polyvinylpyrrolidon 5,0 g

BSA (Pentax Fraktion V) 5,0g

H₂O ad 500 ml

Es wird durch einen Einweg-Nalgenefilter filtriert und die 10

Lösung bei -20⁰C aufbewahrt.

Beispiel I (Isolierung von Wirt- und Viren mRNA)

Stammviruspräparation: Von der American Type Culture Collection (ATCC Nr. ccl-22) erhaltene Madin-Darby Rindernierenzellen (MDBK) wurden in Minimum-Essential-Medium (modifiziert, Dulbecco Modifikation, "DMEM", Flow Laboratories, Inc.) ergänzt mit 10% fötalem Kalbsserum (K.C. Biologicals) angezogen. Rinder-Parainfluenza-Virus Typ III (ATCC Stamm SF-4, VR-281) wurde zweimal plaque-gereinigt. Stammviren wurden durch Infizieren von MDBK-Zellen mit einer Virussalzlösung bei einer niedrigen Infektionsmultiplizität (<0,01 PFU/Zelle) hergestellt. Die infizierten Zellen wurden in DMEM bei 37°C etwa 3 bis 4 Tage lang bis zur nahezu vollständigen Cytophatologie angezogen und die Virus enthaltenden Überstände gesammelt, in Teilmengen aufgeteilt und bei -70⁰C bis zum Gebrauch eingefroren. Die Stammviren wurden nach dem Plaque-Verfahren auf MDBK-ZeI-len unter einer semisoliden Überschichtung von 2,0% (Gew./Vol.) Methylcellulose (Dow Chemical Co.) in DMEM angereichert mit 2% fötalem Kalbsserum, 5 IU/ml Penicillin und 50 ,ug/ml Streptomycin titriert. Sichtbare Plaques

erschienen innerhalb von 3 Tagen; zu diesem Zeitpunkt wurden die Platten mit Kristallviolett gefärbt und die Plaques gezählt.

Herstellung von tritiummarkierter PI-3-mRNA; Die RNA wurde in T-150 Flaschen, die infizierte MDBK-Zellen enthielten, metabolisch mit 20,uCi/ml H-Uridin in Gegenwart von 1,0,ug Actinomycin D/ml 18 Stunden nach Infektion, der Gipfelphase der Viren-mRNA-Synthese, markiert. Das Actinomycin D wurde verwendet, um die Transcription der Wirts-DNA in RNA zu unterbinden, während es die Transscription von vRNA in Viren-mRNA zuläßt, mit dem Ergebnis, daß nur Viren-mRNA markiert wird. Die tritiummarkierte PI-3-mRNA wurde als Vergleichswert in der "Northern-Blotting" Analyse und zur Bestimmung der Größe der PI-3-mRNA verwendet.

Isolierung von RNA; Die Gesamt-RNA wurde aus den infizierten MDBK-Zellen mit dem Guanidinthiocyanat-Cäsiumchlorid-Verfahren nach Chirgwin et al, Biochemistry, 18, 5294-5299 (1979) geerntet. Gemäß diesem Verfahren wurden

10 -Zellen aus T-150 Flaschen in situ lysiert, indem man 10 ml Guanidinthiocyanatpuffer (GuSCN) - enthaltend 5,0 M GuSCN, 50,0 mM Tris-HCl (pH 7,0), 50,0 mM EDTA, 5 Vol./Vol.% B-Mercaptoethanol mit Sarkosyl-40 (TM, Ciba-Geigy Corp.) eingestellt auf 2 Gew./Vol.% - hinzufügte. Diese Mischung wurde 5 Minuten lang auf 55°C erwärmt und dann kurz 5 Minuten lang auf Eis abgekühlt. Das Lysat wurde über 7,0 ml 5,7 M CsCl in 50 mM EDTA geschichtet und bei 20 C 5 Stunden lang bei 15 000 g in einem Schwingbecherrotor bei 25 000 UpM zentrifugiert. Die gesamte RNA wurde als Niederschlag von dem Boden der Zentrifugenröhre gewonnen. Der RNA-Niederschlag wurde einer weiteren Fraktionierung auf Oligo(dT)-Cellulosesäulen unterworfen, um PoIy(A) enthaltende mRNA nach dem Verfahren von Aviv und Leder, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 69., 1408-1412 (1972) zu isolieren.

Auf die gleiche Weise wurde RNA aus scheininfizierten MDBK-Zellen isoliert, mit dem Unterschied, daß die Zellen mit Salzlösung anstelle mit einer Viren-Salzlösung "infiziert" waren. Die aus den scheininfizierten Zellen isolierte RNA wurde zu Vergleichszwecken in den Beispielen 4 und 5 verwendet.

Beispiel II

(Synthese von cDNA-Molekülen)

Komplementäre DNA zu der gemäß Beispiel I isolierten Poly(A)-mRNA wurde synthetisiert, indem man 5,0 ,ug PoIy(A)-mRNA in 100,ul Erst-Strang cDNA-Synthesemedium bei 37 C 10 Minuten lang inkubierte. Anschließend wurden 12 U reverse Transcriptase aus Vogel-Myeloblastose-Viren (Life Sciences, Inc.) je ,ug mRNA zugegeben. Diese Mischung wurde bei 42°C 45 Minuten lang inkubiert, 5 Minuten lang auf Eis abgekühlt und anschließend 3 Minuten lang auf 100⁰C erhitzt. Es wurde 2 Minuten lang bei 15 000 g in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert, um ausgefälltes Protein zu entfernen.

Doppel-strängige cDNA wurde aus einzel-strängiger cDNA in einem 200,ul Inkubationsansatz synthetisiert, der 100,ul Erst-Strang-Reaktionsüberstand in 100 ,ul Zweit-Strang cDNA-Synthesemedium enthielt. Es wurde ein solches Volumen E.

coli DNA-Polymerase (Klenow Fragment) hinzugegeben, daß eine Konzentration von 10 U/,ug der einzel-strängigen cDNA erhalten wurde. Die Mischung wurde 16 Stunden lang bei

15°C inkubiert. Die Reaktion wurde unterbrochen, indem man eine einzelne Phenol-Chloroform-Extraktion durchführte.

Die Produkte (doppel-strängige cDNA-Moleküle) wurden entsalzen und durch zwei aufeinanderfolgende Sperminausfällungen gefolgt von einer Ethanolausfällung konzentriert. Die doppel-strängige cDNA in der Zweit-Strang-Reaktionslösung wurde in Gegenwart von 10 iriM Spermin bei 0⁰C (auf Eis) 30 Minuten lang gefällt. Die gefällte cDNA wurde durch 5 Minuten langes Zentrifugieren bei 15 000 g in einer Mikrozentrifuge gesammelt. Der Niederschlag wurde in einer 10 mM Spermin enthaltenden Lösung resuspendiert. Nach einer 30 Minuten langen Inkubation bei 0⁰C wurde der Niederschlag wie zuvor durch Zentrifugieren gesammelt. Die gefällte cDNA wurde in 400 mM Natriumacetat und 10 mM Magnesiumacetat resuspendiert bevor sie mit 2,5 Volumen Ethanol bei -70⁰C ausgefällt wurde.

Die doppel-strängigen cDNA-Produkte wurden mit Si-Nuclease verdaut, um die einzel-strängigen Haarnadelenden zu entfernen. Die cDNA wurde in einem Volumen von 50 /ul 0,03 M NaCl, 0,3 M Natriumacetat, 0,003 M ZnCl₂ (pH 4,5) und

10 U Si-Nuclease 30 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Die doppel-strängigen cDNA-Reaktionsprodukte wurden entsalzen und durch Sperminausfällung konzentriert.

Beispiel III

(Konstruktion einer cDNA-Bibliothek)

Die Population der cDNA, hergestellt aus der mRNA aus vireninfizierten Zellen gemäß Beispiel II wurde mit Schwänzen versehen, indem man diese mit 30 U terminaler Desoxynucleotidyl-Transferase in einem Reaktionspuffer, der 250 mM Kaliumcacodylat (pH 7,2), 2,0 mM CoCl₂, 1,0 mM DTT

und 1,0 inM dCTP enthielt, 15 Minuten lang bei 25°C inkubierte, um cDNA-Moleküle mit Poly(C)-Schwänzen herzustellen. Der Plasmidvector pBR322 wurde mit Psti-Restrictionsendonuclease bei 32°C 16 Stunden lang verdaut, um lineare DNA-Moleküle zu produzieren. Diese linearen Moleküle wurden unter Verwendung von dGTP nach dem gleichen Verfahren mit Poly(G)-Schwänzen versehen wie für die Anfügung von Schwänzen an die cDNA verwendet wurde. Die mit PoIy(G)-Schwänze versehenen Vectormoleküle wurden mit der Poly(ΟΙΟ Schwänze enthaltenden cDNA vermischt und durch Inkubation unter folgenden Bedingungen reassoziiert: 70⁰C 30 Minuten lang, 37°C 150 Minuten lang und 22°C 30 Minuten lang, um rekonstituierte Plasmide zu bilden, die die cDNA-Gene an der ursprünglichen Pst1-Restrictionsstelle insertiert enthielten. Diese Konstruktion erlaubte die nachfolgende Excision der cDNA-Gene durch Psti. Die in diesem Beispiel hergestellten chimeren Plasmide wurden zum Transformieren von E. coli-Zellen K-12 Stamm AC80 (zur Verfügung gestellt von L. Bopp, General Electric) durch Calciumphosphatcopräzipitation nach dem Verfahren von Kushner, proc. of the Int'l Symposium of Gen. Eng., Biomedical Press (1978) verwendet. Die transformierten E. coli-Zellen bildeten eine Zellbibliothek, die die cDNA-Inserte enthielt.

Beispiel IV

(Identifikation von virenspezifischen Klonen)

Virenspezifische Gene enthaltende Klone wurden durch differentielle Koloniehybridisierung identifiziert, indem man

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P-markierte cDNA-Proben verwendete, die durch reverse

Transcription der mRNA erhalten wurde, die nach dem Verfahren gemäß Beispiel I entweder aus PI-3-infizierten oder scheininfizierten MDBK-Zellen extrahiert war.

Die Synthese der radioaktiv markierten einzel-strängigen cDNA-Proben wurde nach dem Verfahren gemäß Beispiel II durchgeführt, mit dem Unterschied, daß ³²P-dCTP anstelle des dCTP in dem Reaktionsgemisch verwendet wurde. 5

Die gemäß Beispiel III hergestellten klonierten E. coli-Zellen wurden auf Nitrocellulosefiltern, die auf Luria Agar Platten geschichtet waren, angezogen. Für jeden Filter wurden Doppelwerte präpariert. Die gebildeten KoIonien wurden mit 0,5 M NaOH lysiert und die freigesetzte Nucleinsäure wurde durch 60 Minuten langes Erwärmen bei 80⁰C in einem Vakuumofen auf den Filtern fixiert. Die die lysierten E. coli-Kolonien enthaltenden Filter wurden durch Inkubation in 5fachem Denhardt-Reagenz, d.h. der 5fachen Konzentration wie oben angegeben, 5fachem SSC, 100/ug/ml Lachsspermien-DNA, 50% Formamid 24 Stunden lang bei 42°C praehybridisiert.

Die Hybridisierung der radioaktiv markierten Proben mit der klonierten cDNA wurde durchgeführt, indem man die Filter in 2fachem Denhardt-Reagenz, 5fachem SSC, 50,ug/ml Lachsspermien-DNA, 50% Formamid, 7,5% Dextransulfat und der entweder für MDBK-mRNA oder für MDBK- plus PI-3-mRNA spezifischen radioaktiv markierten Probe inkubierte. Die Inkubation wurde 24 Stunden lang bei 42°C durchgeführt. Ungebundenes Material wurde durch Waschen der Filter in 2facher SSC plus 0,1% SDS und nachfolgendes Waschen in 0,1 fächern SSC mit 0,1% SDS entfernt.

Die virenspezifischen Klone wurden autoradiographisch nachgewiesen. Kolonien, die differenziert mit Proben hybridi-"sierten, die Virensequenzen enthielten, d.h. die nur auf den Filtern positiv reagierten, die mit MDBK- plus PI-3-mRNA-Proben hybridisiert waren und negativ auf den mit MDBK-mRNA-Proben hybridisierten Filterkontrollen, wurden

ausgewählt und zur Bestätigung der Virenspezifität einem erneuten Screening unterworfen.

Beispiel V

(Reziproke Hybridisierung)

Die virenspezifischen cDNA-Klone gemäß Beispiel IV wurden durch reziproke Hybridisierung nach dem Verfahren von Rozenblatt et al, "Cloning and Characterization of DNA Complementary to the Maesles Virus mRNA Encoding Hemagglutinin and Matriz Protein", J. Virology 42, 790-797 (1982) in Gruppen eingeteilt. Klonierte DNA wurde aus dem pBR322 Vehikel eines der viren-spezifischen cDNA-Klone durch Verdauen mit Pst I-Restrictionsenzym ausgeschnitten. Die restringierte DNA wurde durch Fraktionieren in 1,5% Agarosegel getrennt, wobei lineare pBR322-Plasmid-DNA und Insert-cDNA erhalten wurde. Die Insert-cDNA wurde von dem Gel elektroeluiert und durch das "Nick-Translationsverfahren" nach Maniatis et al, Proc. Natl. Acad. Sei. 72, 1184-1188 (1975) mit ³²P-dCTP radioaktiv markiert, wobei "The Nick Translation Reagent Kit" von Bethesda Research Laboratories verwendet wurde.

Die radioaktiv markierte cDNA-Probe ^wurde in folgender Weise als Hybridxsierungsprobe gegenüber sämtlichen virenspezifischen Klonen der PI-3-cDNA-Bibliothek verwendet: Die Kolonien wurden gleichzeitig auf eine Master-Agarplatte und einen Nitrocellulosefilter auf einer zweiten Agarplatte aufgetragen und wachsen gelassen. Die Kolonien auf dem Filter wurden mit Alkali nach dem Verfahren von Hanahan und Meselson, Gene JjO, 63-67 (1980) lysiert. Nach der Neutralisation wurde die DNA durch Erwärmen auf dem Filter fixiert. Diese Kolonie-DNA-Blots wurden mit der

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P-Probe nach Grunstein und Hogness, Proc. Natl. Acad.

Sei. USA 72., 3961-3965 (1975) hybridisiert. Nach der Hybridisierung wurden die Filter autoradiographisch ausgewertet. Die mit der markierten Probe hybridisierten Klone wurden als PI-3-Gruppe A bezeichnet.

Eine zweite Probe wurde in der gleichen Weise aus der nicht-hybridisierenden Gruppe zubereitet. Das Hybridisierungsverfahren wurde wiederholt, bis sämtliche Klone auf Grund der reziproken Hybridisierungsanalyse in sechs Gruppen unterteilt waren. Die Anzahl der Klone in jeder Gruppe, die ungefähre Größe des cDNA-Inserte, die ungefähre Größe der korrespondierenden mRNA, das Molekulargewicht der mRNA und die vermutliche Code- Zuordnung sind, soweit bekannt, in Tabelle I wiedergegeben.

Tabelle I

Klassifizierung der PI-3-cDNA-Klone basierend auf reziproken Hybridisierungsrelationen

Gruppen Nr.:

Probe¹	6-8	5-2	3-5	5-4	6-6
Anzahl Klone	38	8	10	3	5
Größenbereich der Inserte	500- 1500bp	400- 1300bp	500- 1600bp	400- 1300bp	500- 1000bp
Korrespondie rende mRNA	RNA 5	RNA 4	RNA 3	RNA 6	?
mRNA-Größe (Basen)	1600	1900	1950	1190	?
mRNA-Molekular- gewicht (x 10⁶ Dalton) Code-Zuordnung	0,55 NC	0,64 F(?)	0,65 HA	0,41 M	p P(?)

10 PI-3 spezifische Klone konnten nicht mit der reziproken Hybridisierungsanalyse klssifiziert werden.

NC = Nukleokapsid F = Fusion

HA = Haemagglutinin M = Matrix

P = Phosphorprotein

Beispiel VI

"Northern Blotting" Analyse

Zur Bestimmung der korrespondierenden iriRNA für jede der 5

durch die reziproke Hybridisierung gebildeten cDNA-Klongruppen wurde die "Northern Blotting" Analyse durchgeführt. Die cDNA-Inserte aus den einzelnen Klonen in den

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Gruppen A-D wurden ausgeschnitten und mit P nach dem in Beispiel V beschriebenen Nick-Translationsverfahren zur Verwendung als cDNA-Proben radioaktiv markiert. Die mRNA aus PI-3 virusinfizierten und scheininfizierten MDBK-ZeI-len wurde mit 14% Glyoxal und 50% Dimethylsulf oxid in 5%igem Natriumphosphat (pH 6,8) bei 50⁰C 1 Stunde lang denaturiert und durch Elektrophorese in 1%igem Agarosegel

fraktioniert. Die mRNA wurde im Blotting-Verfahren durch Kapillarwirkung auf einen Nitrocellulosefilter unter Verwendung von 20fachem SSC transferiert.

Nach dem Transfer wurde der Filter 2 Stunden lang bei 65 C

erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und für 15 Minuten in 5faches SSC gebracht. Er wurde dann in einem Beutel versiegelt, der Praehybridisierungspuffer (5faches Denhardt-Reagenz, 5faches SSC, 50% Formamid und 100,ug/ml denaturierte einzel-strängige Lachsspermien DNA) enthielt und 4 Stunden lang in einem Wasserbad von 42°C inkubiert. Der Filter wurde anschließend in Streifen geschnitten, wobei jeder eine PI-3-mRNA Bande und eine MDBK-mRNA Bande umfaßte. Die Streifen wurden in einzelne Beutel gebracht, die Hybridisierungspuffer (2fach Denhardt, 5fach SSC, 50% Formamid, 7,5% Dextransulfat, 50,ug/ml denaturierte Lachsspermien DNA und 1,OmM Natriumpyrophosphat) enthielten.

3 2
Jeder Streifen wurde mit vorbereiteten P-markierten Proben hybridisiert, die vor der Zugabe zu dem Beutel

durch 5 Minuten langes Erhitzen in einem kochenden Wasserbad denaturiert worden waren. Die Hybridisierung wurde durch 20 Stunden lange Inkubation in einem Wasserbad von 42 C durchgeführt. Nach der Hybridisierung wurden die Filter mit 1,0facher SSC und 0,1% SDS (4 Waschvorgänge von jeweils 15 Minuten) und anschließend mit 0,5facher SSC und 0,1% SDS (4 Waschvorgänge von jeweils 15 Minuten) bei Raumtemperatur gewaschen. Als nächstes wurden sie autoradiographisch ausgewertet. Die tritiummarkierte PI-3-mRNA gemäß Beispiel I wurde auf einer parallelen Bande elektrophoretisch durch Blotting auf den gleichen Nitrocellulosefilter übertragen, und mit EN Hance-Spray (TM von New England Nuclear) fluorographisch sichtbar gemacht, um als interner Marker und Kontrolle zu dienen. Die fluorographische Auswertung wurde durchgeführt, indem man die Proben 24 bis 48 Stunden lang bei -70⁰C einem Kodak XAR (TM) Film mit Intensivierungsschirmen aussetzte, bis die Abbildungen sichtbar waren.

Der Code der einzelnen Viren-mRNAs wurden versuchsweise aufgrund der Übereinstimmungen der Größenverhältnisse mit den Virionproteinen und mit mRNA anderer Paramyxoviren zugeordnet.

In diesem Beispiel wurden mRNA von Vesicular-Stomatitis-Viren als Marker verwendet, um die Molekulargewichte der PI-3-mRNAs abzuschätzen (vgl. Rose, J. et al, "Nucleotide Sequence Complexities, Molecular Weigths and PoIy(A) Content of Vesicular Stomatitis Virus mRNA Species", J.

of Virology 2J_, 1105-1112 (1975)). Die PI-3-RNAs 4 und 5 wanderten sehr dicht beieinander und wurden am besten getrennt, wenn man die Gele durch Blotting auf Nitrocellulose transferierte anstatt sie vor der Fluorographie zu trocknen. Wie Tabelle I zeigt, korreliert die Codekapazitat der sechs PoIy(A)-RNA-Spezies in etwa mit den Größen

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der sechs Virenstrukturproteine und mit der geschätzten Gesamtcodekapazität des Virengenoms. Die Gruppe A-Probe hybridisierte bei einer Position, die mit der mutmaßlichen Nukleokapsid-mRNA korrespondierte, während die Gruppe C-Probe bei einer Position hybridisierte, die mit der mutmaßlichen HA-mRNA korrespondierte.

Beispiel VII

Hybridselektion und Translation

Die vorläufigen Code-Zuordnungen für die Gruppen A und C wurden durch Hybridselektion und in vitro Translation der Viren mRNA bestätigt. Plasmid DNA (10,ug) wurde aus PI-3-Klonen der Gruppen A und C isoliert und mit Cäsiumchlorid-Ethidiumbromid-Zentrifugation gereinigt. Die DNA wurde durch 10 Minuten langes Erhitzen in 20/Ul Tris-HCl (pH 7,5) und 1,0 mM EDTA auf 100°C und schnelles Abkühlen auf Eis denaturiert. Das gleiche Volumen 1N NaOH wurde zugegeben und die DNA-Lösung 20 Minuten lang bei 25°C inkubiert. Die Lösung wurde neutralisiert, indem 9,0 ml 1,5 M NaCl, 0,15 M Natriumeitrat und 0,25 M Tris-HCl (pH 8,0) zugegeben wurden. Die DNA wurde auf Nitrocellulosefiltern, vorbefeuchtet in 3facher SSC mit einem Durchmesser von 2,0 cm durch langsames Filtrieren unter Verwendung eines Vakuumanschlusses immobilisiert. Die Filter wurden 1 Stunde lang bei 25°C luftgetrocknet und 2 Stunden lang in einem Vakuumofen bei 80 C erhitzt.

Nach dem Trocknen wurden die Filter in 0,7 cm breite Streifen geschnitten und in ein silikonisiertes 30 ml Corex Röhrchen gebracht. Eine Praehybridisierungslösung aus 50 Gew./Vol.% entionisiertem Formamid, 20 mM PIPES (pH 6,4), 0,75 M NaCl, 1,OmM EDTA, 1 Gew./Vol.% SDS, 5,0,Ug einzel-strängiger Lachsspermien-DNA und 5,0/Ug E. coli

Transfer RNA wurde zugegeben. Die Mischung wurde 2 Stunden lang bei 37 C inkubiert. Der Praehybridisierungspuffer wurde entfernt und die Streifen mit Praehybridisierungspuffer ohne tRNA und Lachsspermien DNA gewaschen.
5

Zur Hybridisierung wurden die zerschnittenen Filter mit 50 ,ug Gesamtzellen-RNA, isoliert aus vireninfizierten oder scheininfizierten MDBK-Zellen in einem Hybridisierungspuffer aus 100 ,ul 50 Vol./Vol.% entionisiertem Formamid, 20 mM PIPES (pH 6,4), 0,75 M NaCl, 1,0 mM EDTA, 1 Gew./Vol.% SDS und 1,0 mM Vanadylkomplexen 5 Stunden lang bei 50°C inkubiert. Die Filter wurden gründlich mit TNE plus 0,5% SDS und anschließend mit TNE allein gewaschen. Die Filter wurden in 15 ml Corex Röhrchen überführt und 300 ,ul steriles Wasser zugegeben. Die Elution der gebundenen mRNA wurde durch 1 minütiges Kochen in einem Wasserbad durchgeführt. Die Probe wurde in flüssigem Stickstoff schockgefroren und auf Raumtemperatur getaut. Die Filter wurden verworfen. Die eluierte RNA wurde mit Phenol, Chloroform, Isoamylalkohol extrahiert und unter Verwendung von Ethanol bei -70⁰C gefällt. Die Ethanol gefällte mRNA wurde durch Zentrifugieren gesammelt und gefriergetrocknet.

Jede eluierte hybrid-selektierte RNA wurde in einem zellfreien Weizenkeimextrakt-IVT-System (Bethesda Research Laboratories) unter Verwendung von S-Methionin (New England Nuclear) translatiert. Viren-spezifische Translationsprodukte (Proteine) wurden mit polyklonalen Kaninchenantiseren gegen gereinigte PI-3-Viren immunopräzipitiert. Die Immunkomplexe wurden von den Reaktionsgemischen durch Adsorption an Protein-A-Polyacrylamid (Immunobeads TM, Bio-Rad) nach Rose, Nature 279, 260 (1979) getrennt. Die immunopräzipitierten Produkte wurden durch 5 Minuten langes Kochen in 25,ul Puffer (5 Gew./Vol.% SDS, 6 Vol./Vol.%

2-Mercaptoethanol in Wasser) von dem Protein-A-Adsorbens gelöst und in einem 10% SDS-Polyacrylamidgelsystem (SDS-PAGE) elektrophoretisch fraktioniert; vgl. Laemmli, Nature 227, 680-685 (1970). Im Anschluß an die Elektrophorese wurden die Gele mit Elektroblotting auf Nitrocellulosepapier (Bio-Rad) übertragen, mit EN Hance-Spray (TM New England Nuclear) fluorographisch behandelt und 24 Stunden bis 1 Woche lang bei -70⁰C unter Verwendung von Kodak Film X-Omat AR (TM) autoradiographisch analysiert, bis die Abbildungen sichtbar waren.

Zur Kontrolle wurde Viren-mRNA aus Rinder-PI-3 virusinfizierten Zellen gemäß Beispiel I isoliert. Die gesamte isolierte mRNA wurde nach dem in diesem Beispiel beschriebenen in vitro Translationsverfahren translatiert. Die Translationsprodukte (sowohl der Viren als des Wirts) wurden wie oben beschrieben mit polyklonalen Kaninchenantiseren gegen gereinigte PI-3 Viren immunopräzipitiert, um die viren-spezifischen Proteine zu identifizieren. Die so identifizierten Proteine sind in Tabelle II wiedergegeben (Kontroll-Polypeptide).

Es zeigt sich, daß durch die in vitro Translation der Gesamt-mRNA mit nachfolgender Immunopräzipitation drei Virenproteine identifiziert wurden. Zwei von diesen, nämlich die Haemagglutinin- und Nukleokapsidproteine stimmen gut mit den viren-spezifischen Proteinen überein, die durch Translation der hybrid-selektierten mRNAs gewonnen wurden. Das heißt, von der Probe der Gruppe A wurden mRNAs hybrid-selektiert, die die Synthese eines Proteins mit einem Molekulargewicht von 65-70 000 Dalton (korrespondierend mit 68 000 Dalton für das Virionnukleokapsidprotein und 65-67 000 Dalton für das Protein der Kontrollgruppe) steuerte. Die Probe der Gruppe C hybrid-selektierte solche

itiRNA, die die Synthese eines Proteins mit einem Molekulargewicht von 60 000 Dalton (korrespondierend mit 69 000 Dalton für das Virionhaemagglutininprotein und 60 000 Dalton für das Protein der Kontrollgruppe) steuerte. Es wurde ein Protein mit 31 000 Dalton in der Kontrollgruppe identifiziert, das mit dem Virionmatrixprotein von 35 000 Dalton korrespondiert. In den mit RNA aus scheininfizierten Zellen beschickten Weizenkeimextrakten wurden keine viren-spezifischen Polypeptide nachgewiesen.

Tabelle II

Molekulargewichte von Rinder PI-3-Virus Polypeptiden

Polypeptid- Bezeichnung	Virion Polypeptid	Kontroll Polypeptid	hybrid-selektiertes Polypeptid
L	180 000	nicht nachgewiesen	nicht nachgewiesen
P	79 000	nicht nachgewiesen	nicht nachgewiesen
HA²	69 000	60 000	60 000
NC³	68 000	65-67 000	65-70 000
F	55 000	nicht nachgewiesen	nicht nachgewiesen
M³	35 000	31 000	nicht nachgewiesen

Molekulargewichte ausgedrückt in Dalton

Die Differenz zwischen demM3 der Virion-HA-Polypeptide und den in vitro translatierten HA-Polypeptiden beruht auf der fehlenden Glycosilierung der in vitro Produkte

Nukleokapsid(NC)- und Matrix(M)-Proteine sind nicht glycosiliert und zeigen daher eine geringere Variabilität hinsichtlich des Molekulargewichts bei der Bestimmung mit SDS-PAGE-Gelen.

FIGUR 1 {Seite 2 von 4)

360 370 380 390 400 410 420

Ddel Asu I

EcoRII ScrFI
EcoRI(
Hael11 ScrFI

430 440 450 460 470 480 490

AGAATCCCATCGTTAGCAATCMTCATTTAATCTACGCTTACACCTCTAATCTTATCACCCAGGGCTGTC β β · · · e c

EcoRI« Hphl EcoRII Taql

HInfl MnII ScrFI

500 510 520 530 540 550 560

GAGATATAGGGAAATCTTACCAAGTACTACAAATAGGGATAATTACTATAAATTCGGACCTAGTACCTGA e c e ·ο · ·

EcoRI* Rsal Asu I Rsal

[Seal] Avail

EcoRI*

570 580 590 600 610 620 630

TTTAAATCCCAGAGTCACACATACATTTAATATTGATGATAATAGGAAATCTTGCTCTCTGGCACTATTG

Ahalll HInfl EcoRI*

EcoRI*

640 650 660 670 680 690 700

MTACAGATGTTTATCAGTTATGCTCAACACCAAMGTTGCTGAGAGATCCGATTATGCATCAACAGGTA Ddel Opnl [Aval 11] MnII

EcoRI* SfaNI Mbol Xholl

710 720 730 740 750 760 770

TTGAGGATATTGTACTTGACATTGTCACTAATMTGGATTMTTATAACAAGMGGTTTACAAATAATM β e

Rsal TthiiH

FIGUR 1 (Seite 3 von 4)

780 790 800 810 820 830 840 TATAACTTTTGATAAACCGTATGCAGCATTGTATCCATCAGTAGGACCAGGAATCTATTATAAGGGTAAA

Fnu4HI BbvI Asu! EcoRI*

Avail Hlnfl
EcoRII
ScrFI

850 860 870 880 890 900 910

GnATATTTCTCGGATATGGAGGTCTAGAGCATGAAGATAACGGAGACGTAATATGTAATACAACTGGTT • · e ·

MnII CEcoPi] MbolI

Xbal

920 930 940 950 960 970 980

GTCCTGGCAAAACACAGAGAGACTGTAATCAGGCTTCTTATAGCCCATGGTTCTCAAATAGGAGAATGGT β « β

EcoRII Ncol

ScrFI

990 1000 1010 1020 1030 1040 1050

MACTCTAnAnGnGnGATAAAGGCATAGATGCAACTTTTAGCTTGAGGGTGTGGACTATTCCAATG

SfaNI AIuI

MnI I

1060 1070 1080 t090 1100 1110 1120

AGCCAAAAnAnGGGGATCAGAAGGAAGAnACTmAnAGGTGACAGAATATACATATATACTAGAT «ce · · « ·

[BInQ Mbol I Hphl Dpnl

Dpnl ' EcoRI*

Mbol Mbol

Xhol I

1130 1140 1150 1160 1170 1180 1190 CCACAAGnGGCACAGTAAAnACAGnAGGGGTAAnGATATTTCTGAnATAATAATATAAGAATAAA

FIGUR 1 (Seite 4 von 4)

1200 1210 1220 1230 1240 1250 1260

HGGACnGGCATAATCTACTATCACGGCCAGGAAATGATGMTGTCCATGGGGTCATTCATGCCCAGAC

• · e ·

CfrI Ncol

EcoRII
Haelll
ScrFI

1270 1280 1290 1300 1310 1320 1330

GGATGTATAACAGGAGTTTACACTGATGCATATCCGCTAAACCCATCGGGGAGTGTTGTATCATCAGTAA ee ·

Fok! [AvallÜ

SfaNI

1340 1350 1360 1370 1380 1390 1400

TTCTTGACTCACAAA AGTCTAGAGAAMCCCAATCATTACCTACTCAACAGCTACAAATAGAATAAATGA e · ·

Hfnfl Xbal AIu!

1410 1420 1430 1440 1450 1460 1470

ATTAGCTATATATACAGAACACTTCCAGCTGCATATACAACMCAMTTGTATCACACATTATGATAMG e e ee

Aluf BbvI AIuI

Fnu4HI NspB11 Pvu 11

1480 1490 1500 }5)0 1520 1530 1540

GGTATTGTT^CATATAGTAGAAATAAATCACAGAAGTTTGMTAOiTTrrCMCCGATGTTATTCMMC

1550 1560 1570 1580 1590 1600 1610

AGAAGTTCCAAAMACTGCAGCTAMTTGATCATCGCATATCGGATGCCAGATGACATTAMAGAGACCA

•ee e e e e c

AIuI Bbv I Fok I CEcoPij"

Fnu4HJ BcII SfaNI Pstl Dpnl Mbo I

1620 1630 1640 1650 1660 1670

CCATACAGACAACACAGGAGATGATGCAAGATATAAAGGMTCCCCCCCCCCCCCCCTGCAGCM
e · e ee

SfaNI EcoRI* Fnu4HI

Hinfl Pstl

FIGUR 2

Sequenqe	Site	Poslf	ΧΰΏ	1406	1429	1562	1571
AhaN I	TTTAAA	564		547	815
AIuI	AGCT	1026	1382	815
Asu I	GGNCC	93	377
Avail	GGLCC	93	547				425 505 543
CAvalll]	ATGCAT	686	1286				1652
ßbvl	GCAGC	806	1571				1219
ßbvl	GCTGC	1416
Bell	TGATCA	1569
BgIII	AGATCT	205
CBInI]	GGATC	1066
BstEII	GGTNACC	332		672			822 1337 1650
Cfrl	QGGCCP	1217		679	1069	1120
Ode I	CTNAG	209	357
Dpnl	GATC	207	228
CEcoPO	AGACC	1605					1569
f_EcoPl]	GGTCT	862		207	217	303
EcoRI	GAATTC	62		679	824	1120
EcoRI*	PPATQQ	64	86	480	817	913	1022
		567	610	1430	1560	1671
EcoRII	CCLGG	373	379
Fnu4HI	GCNGC	69	795	1597
FnuDII	CGCG	68
Fokl	GGATG	113	1275	274	423	573
Haelll	GGCC	379	1219
HInf I	GANTC	85	157				1221
r_H!nf III]	ATTCG	63	542
Hphl	GGTGA	1106		677	1067	1118
Hphl	TCACC	469
Mbol	GATC	205	226	475
Mboll	GAAGA	887	1089	311	696	853
MnI I	CCTC	106	\2A
MnI]	GAGG	83	277
Ncol	CCATGG	956	1238	1672
NspBII	CJGCKG	1429
Pst I	CTGCAG	6	1561*	555	714
Pvull	CAGCTG	1429
Rsa_	GTAC	325	516	482	819	915
[Seal]	AGTACT	513		1575	1624
ScrFI	CCNGG	375	381
SfaNI	GATGC	1003	1276
SfaNI	GCATC	698
Taql	TCGA	490
Tthiiil	GACNNNGTC	722		1118
Xbal	TCTAGA	865	1349
Xholl	PGATCQ	205	677

FIGUR 3 (Seite 1 von 3)

27 54

CTG CAG GGG GGG GGG GGG GAG AAC AAT CAT AAT AAA TTA ATG TTG CAG GAA ATA Leu Gin GIy GIy GIy GIy GIu Asn As η His As η Lys Leu MET Leu Gin GIu Ue

81 108

AGA AAA GAA TTC GCG GCA ATA GAC ACC AAG ATT CAG AGG ACC TCG GAT GAC ATT Arg Lys GIu Phe AIa Ala lie Asp Thr Lys He GIn Arg Thr Ser Asp Asp lie

135 162

GGA ACC TCA ATA CAG TCA GGA ATA AAT ACA AGA CTT CTC ACA ATT CAG AGT CAT GIy Thr Ser He Gin Ser GIy lie Asn Thr Arg Leu Leu Thr lie Gin Ser His

189 216

GTT CAA AAC TAT ATC CCA CTA TCA CTA ACA CAA CAA ATG TCA GAT CTC AGA AAA VaI Gin Asn Tyr lie Pro Leu Ser Leu Thr Gin Gin MET Ser Asp Leu Arg Lys

243 ' 270

TTT ATC AAT GAT CTA ACA AAT AAA AGA GAA CAT CAA GAA GTG CCA ATA CAG AGA Phe lie Asn Asp Leu Thr Asn Lys Arg GIu His Gin GIu VaI Pro lie Gin Arg

297 324

ATG ACT CAT GAT AGA GGT ATA GAA CCC CTA AAT CCA GAC AAG TTC TGG AGG TGT MET Thr His Asp Arg GIy lie GIu Pro Leu Asn Pro Asp Lys Phe Trp Arg Cys

351 378

ACA TCT GGT AAC CCA TCT CTA ACA AGT AGT CCT AAG ATA AGG TTA ATA CCA GGG Thr Ser GIy Asn Pro Ser Leu Thr Ser Ser Pro Lys lie Arg Leu lie Pro GIy

405 432

CCA GGT TTA TTA GCA ACA TCT ACT ACA GTA ACT GGC TGT ATT AGA ATC CCA TCG Pro GIy Leu Leu Ala Thr Ser Thr Thr VaI Thr GIy Cys lie Arg He Pro Ser

459 486

TTA GCA ATC AAT CAT TTA ATC TAC GCT TAC ACC TCT AAT CTT ATC ACC CAG GGC Leu Ala lie Asn His Leu lie Tyr Ala Tyr Thr Ser Asn Leu lie Thr Gin GIy

513 540

TGT CGA GAT ATA GGG AAA TCT TAC CAA GTA CTA CAA ATA GGG ATA ATT ACT ATA Cys Arg Asp lie GIy Lys Ser Tyr Gin VaI Leu Gin lie GIy lie lie Thr lie

567 594

AAT TCG GAC CTA GTA CCT GAT TTA AAT CCC AGA GTC ACA CAT ACA TTT AAT ATT Asn Ser Asp Leu VaI Pro Asp Leu Asn Pro Arg VaI Thr His Thr Phe Asn lie

621 648

GAT GAT AAT AGG AAA TCT TGC TCT CTG GCA CTA TTG AAT ACA GAT GTT TAT CAG Asp Asp Asn Arg Lys Ser Cys Ser Leu Ala Leu Leu Asn Thr Asp VaI Tyr Gin

FIGUR 3 (Seite 2 von 3)

675 · 702

TTA TGC TCA ACA CCA AAA GTT GCT GAG AGA TCC GAT TAT GCA TCA ACA GGT ATT Leu Cys Ser Thr Pro Lys VaI Ala Glu Arg Ser Asp Tyr AIa Ser Thr GIy He

729 756

GAG GAT ATT GTA CTT GAC ATT GTC ACT AAT AAT GGA TTA ATT ATA ACA AGA AGG GIu Asp Me VaI Leu Asp lie VaI Thr Asn Asn GIy Leu Me lie Thr Arg Arg

783 810

TTT ACA AAT AAT AAT ATA ACT TTT GAT AAA CCG TAT GCA GCA TTG TAT CCA TCA Phe Thr Asn Asn Asn Me Thr Phe Asp Lys Pro Tyr Ala AIa Leu Tyr Pro Ser

837 864

GTA GGA CCA GGA ATC TAT TAT AAG GGT AAA GTT ATA TTT CTC GGA TAT GGA GGT VaI GIy Pro GIy He Tyr Tyr Lys GIy Lys VaI Ne Phe Leu GIy Tyr GIy GIy

891 918

CTA GAG CAT GAA GAT AAC GGA GAC GTA ATA TGT AAT ACA ACT GGT TGT CCT GGC Leu GIu His GIu Asp Asn GIy Asp VaI Me Cys Asn Thr Thr GIy Cys Pro GIy

945 · 972

AAA ACA CAG AGA GAC TGT AA"r CAG GCT TCT TAT AGC CCA TGG TTC TCA AAT AGG Lys Thr GIn Arg Asp Cys Asn Gin AIa Ser Tyr Ser Pro Trp Phe Ser Asn Arg

999 1026

AGA ATG GTA AAC TCT ATT ATT GTT GTT GAT AAA GGC ATA GAT GCA ACT TTT AGC Arg MET VaI Asn Ser lie lie VaI VaI Asp Lys GIy lie Asp AIa Thr Phe Ser

1053 1080

TTG AGG GTG TGG ACT ATT CCA ATG AGC CAA AAT TAT TGG GGA TCA GAA GGA AGA Leu Arg VaI Trp Thr He Pro MET Ser GIn Asn Tyr Trp GIy Ser GIu GIy Arg

1107 1134

TTA CTT TTA TTA GGT GAC AGA ATA TAC ATA TAT ACT AGA TCC ACA AGT TGG CAC Leu Leu Leu Leu GIy Asp Arg He Tyr He Tyr Thr Arg Ser Thr Ser Trp HIs

1161 . 1188

AGT AAA TTA CAG TTA GGG GTA ATT GAT ATT TCT GAT TAT AAT AAT ATA AGA ATA Ser Lys Leu GIn Leu GIy VaI lie Asp He Ser Asp Tyr Asn Asn He Arg lie

\2\5 1242

AAT TGG ACT TGG CAT AAT CTA CTA TCA CGG CCA GGA AAT GAT GAA TGT CCA TGG Asn Trp Thr Trp HIs Asn Leu Leu Ser Arg Pro GIy Asn Asp GIu Cys Pro Trp

FIGUR. 3 (Seite 3 von 3)

1269 ■ 1296

GGT CAT TCA TGC CCA GAC GGA TGT ATA ACA GGA GTT TAC ACT GAT GCA TAT CCG GIy His Ser Cys Pro Asp GIy Cys fie Thr GIy VaI Tyr Thr Asp Ala Tyr Pro

1323 1350

CTA AAC CCA TCG GGG AGT GTT GTA TCA TCA GTA ATT CTT GAC TCA CAA AAG TCT Leu Asn Pro Ser GIy Ser VaI VaI Ser Ser VaI Me Leu Asp Ser Gin Lys Ser

1377 1404

AGA GAA AAC CCA ATC Απ ACC TAC TCA ACA GCT ACA AAT AGA ATA AAT GAA TTA Arg GIu Asn Pro lie He Thr Tyr Ser Thr AIa Thr Asn Arg He Asn GIu Leu

1431 1458

GCT ATA TAT ACA GAA CAC TTC CAG CTG CAT ATA CAA CAA CAA ATT GTA TCA CAC Ala He Tyr Thr GIu HIs Phe GIn Leu His lie Gin Gin Gin lie VaI Ser HIs

1485 1512

ATT ATG ATA AAG GGT ATT GTT TTC ATA TAG TAG AAA TAA ATC ACA GAA GTT TGA He MET He Lys GIy He VaI Phe He . . Lys . He Thr GIu VaI .

1539 1566

ATA CGT TTC AAC CGA TGT TAT TCA AAA CAG AAG TTC CAA AAA ACT GCA GCT AAA lie Arg Phe Asn Arg Cys Tyr Ser Lys GIn Lys Phe GIn Lys Thr Ala AIa Lys

1593 1620

TTG ATC ATC GCA TAT CGG ATG CCA GAT GAC ATT AAA AGA GAC CAC CAT ACA GAC Leu He He AIa Tyr Arg MET Pro Asp Asp lie Lys Arg Asp His His Thr Asp

1647 1674

AAC ACA GGA GAT GAT GCA AGA TAT AAA GGA ATC CCC CCC CCC CCC CCT GCA GCA Asn Thr GIy Asp Asp Ala Arg Tyr Lys GIy He Pro Pro Pro Pro Pro Ala Ala

5k-

Leu

Gin

GIu

lie

Arg

Lys

GIu

FIGUR

Ala

4

Ue

Asp

Thr

Lys

lie

Gin

18
Arg

MET

Phe

Ala

36

Ser

Asp

tie

GIy

Thr

Ser

Gin

GIy

lie

Asn

Thr

Arg

Leu

Thr

lie

Ser

54

lie

Gin

Ser

HIs

VaI

Gin

Asn

Ne

Leu

Ser

Leu

Thr

Gin

MET

Thr

Tyr

Pro

72

Asp

Leu

Arg

Lys

Phe

lie

Asn

Leu

Asn

Lys

Arg

GIu

His

Gin

GIu

Ser

Asp

Thr

90

Pro

lte

Gin

Arg

MET

Thr

His

Arg

lie

Gfu

Pro

Leu

Asn

Pro

Asp

VaI

Asp

GIy

108

Phe

Trp

Arg

Cys

Thr

Ser

GIy

Pro

Leu

Thr

Ser

Pro

Lys

He

Lys

Asn

Ser

126

Leu

Ue

Pro

GIy

Pro

GIy

Leu

Ala

Ser

Thr

Vaf

Thr

GIy

Cys

Arg

Leu

Thr

144

Arg

Ke

Pro

Ser

Leu

Ala

lfe

HIs

lie

Tyr

Ala

Tyr

Thr

Ser

Asn

lie

Asn

Leu

162

fie

Thr

Gin

GIy

Cys

Arg

Asp

GIy

Ser

Tyr

Gin

Vat

Leu

Gin

He

Leu

Ne

Lys

180

lie

fie

Thr

lie

Asn

Ser

Asp

VaI

Asp

Leu

Asn

Pro

Arg

VaI

Thr

GIy

Leu

Pro

198

Thr

Phe

Asn

fie

Asp

Asn

Lys

Cys

Ser

Leu

Ala

Leu

Asn

His

Arg

Ser

216

Asp

VaI

Tyr

Gin

Leu

Cys

Ser

Pro

VaI

Ala

GIu

Arg

Ser

Asp

Tyr

Thr

Lys

234

Ser

Thr

GIy

lie

GIu

Asp

lie

Leu

lie

VaI

Thr

Asn

GIy

Leu

Ala

VaI

Asp

252

fie

Thr

Arg

Phe

Thr

Asn

Thr

Phe

Asp

Lys

Pro

Tyr

Ala

lie

Asn

lie

270

Leu

Tyr

Pro

Ser

VaI

GIy

Pro

lie

Tyr

Lys

GIy

Lys

VaI

lie

Phe

Ala

GIy

Tyr

288 I

GIy

Tyr

GIy

Leu

GIu

His

Asp

GIy

Asp

VaI

He

Cys

Asn

Th r,

Leu

GIu

Asn

306

GIy

Cys

Pro

GIy

Lys

Thr

Gin

Asp

Asn

Gin

Ala

Ser

Tyr

Ser

Pro

Thr

Arg

Cys

324

Phe

Ser

Asn

Arg

MtT

VaI

Ser

lie

VaI

Vat

Asp

Lys

GIy

He

Trp

Asn

lie

342

Ala

Thr

Phe

Ser

Leu

Arg

VaI

Thr

Pro

MET

Ser

Gin

Asn

Tyr

Trp

Asp

Trp

lie

360

Ser

GIu

GIy

Arg

Leu

GIy

Arg

lie

Tyr

ffe

Tyr

Thr

Arg

GIy

Leu

Asp

378

Thr

Ser

Trp

Hfs

Ser

Lys

Leu

VaI

lie

Asp

He

Ser

Asp

Tyr

Ser

Gin

GIy

396

Asn

lie

Arg

lie

Asn

Trp

Thr

His

Leu

Ser

Arg

Pro

GIy

Asn

As η

Trp

Asn

414

GIu

Cys

Pro

Trp

GIy

His

Ser

Pro

GIy

Cys

Me

Thr

GIy

Vat

Tyr

Asp

Cys

Asp

432

Asp

Ala

Tyr

Pro

Leu

Asn

Pro

GIy

VaI

Ser

Vaf

tie

Leu

Thr

Ser

450

Ser

Gin

Lys

Ser

Arg

GIu

Asn

lie

Thr

Tyr

Ser

Thr

Ala

Thr

Asn

Asp

Pro

fie

468

fie

Asn

GIu

Leu

Ala

lie

Tyr

GIu

Phe

Gin

Leu

His

lie

Gtn

Gin

Arg

Thr

His

482

lie

VaI

Ser

His

lie

MET

lie

GIy

VaI

Phe

lie

Gin

Lys

lie

λγλ, πλλ Int. Cl.⁴: C12 N 15/00

OU ΔΗ I JO _ g-g Anmeldetag: 11. Juli 1985

Offenlegungstag: 30. Januar 1986

FIGUR 1 (Seite 1 von 4)

10 20 30 40 50 60 70

CTGCAGGGGGGGGGGGGGGAGAACAATCATAATAAATTAATGTTGCAGGAAATAAGAAAAGAATTCGCGG PstI EcoRI Fnu4H!

EcoRI*

FnuDII [Mnflll]

80 90 100 110 120 130 140

CAATAGACACCAAGATTCAGAGGACCTCGGATGACATTGGAACCTCAATACAGTCAGGAATAAATACAAG • ee · β · e

Hlnfl Asul MnII Fokl MnII MnII Avail EcoRI*

150 160 170 180 190 200 210

ACTTCTCACAATTCAGAGTCATGTTCAAAACTATATCCCACTATCACTAACACAACAAATGTCAGATCTC e · β ο

Hlnfi BgIM

Ode I Dpnl EcoRI* Mbol Xholl

220 230 240 250 260 270 280

AGAAAATTTATCAATGATCTAACAAATAAAAGAGAACATCAAGAAGTGCCAATACAGAGAATGACTCATG β · e β e

EcoRI* Dpnl HJnfl

Mbol MnM

290 300 310 320 330 340 350

ATAGAGGTATAGAACCCCTAAATCCAGACAAGTTCTGGAGGTGTACATCTGGTAACCCATCTCTAACAAG

β e c ·

EcoR!« MnM Rsal BstEII

Claims

Patentansprüche

1. Synthetisches Gen oder DNA-Fragment, dadurch gekenn zeichnet, daß es

a) für ein Virenprotein des Rinder-Parainfluenza-Virus Typ III oder einen Teil desselben codiert und

b) ein doppel-strängiges DNA-Gen enthält, das eine Kopie des Viren RNA-Gens ist, welches für das Protein oder einen Teil desselben codiert.

2. Synthetisches Gen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich net, daß es für Rinder-Parainfluenza-Virus Typ III Haemagglutinin oder einen Teil desselben codiert.

DNA-Sequenz des synthetischen Gens nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß diese mit einem Initiationscodon beginnt, mit einem Terminations- oder

Stoppcodon endet und die Nucleotidsequenz gemäß Figur 1 oder einen Teil derselben enthält.

4. DNA-Sequenz des synthetischen Gens nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß diese für ein Polypeptid codiert, welches die Aminosäuresequenz gemäß Figur 4 oder einen Teil derselben enthält.

5. Synthetisches Gen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich net, daß es für Rinder-Parainfluenza-Virus Typ III Struktur-Fusionsprotein oder einen Teil desselben codiert.

6. Vector oder Plasmid enthaltend das doppel-strängige DNA-Gen gemäß Anspruch 1.

7. Vector oder Plasmid nach Anspruch 6, dadurch gekenn zeichnet, daß das enthaltene DNA-Gen für Rinder-Parainfluenza-Virus Typ III Haemagglutinin oder einen Teil desselben codiert.

8. Vector oder Plasmid nach Anspruch 6, dadurch gekenn zeichnet, daß das enthaltene DNA-Gen für Rinder-Parainfluenza- Virus Typ III Struktur-Fusionsprotein oder einen Teil desselben codiert.

9. Wirtszelle enthaltend das doppel-strängige DNA-Gen nach Anspruch 1.

10. Wirtszelle nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet,

daß das enthaltene DNA-Gen Rinder-Parainfluenza-Virus Typ III Haemagglutinin oder einen Teil desselben codiert.

11. Wirtszelle nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet,

daß das enthaltene DNA-Gen für Rinder-Parainfluenza-Virus Typ III Struktur-Fusionsprotein oder einen Teil desselben codiert.

12. Synthetisches Protein des Rinder-Parainfluenza-Virus Typ III oder ein Teil desselben erhalten durch Kultivieren der Wirtszelle nach Anspruch 9.

13. Protein oder Teil desselben nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß es die Aminosäuresequenz gemäß Figur 4 oder einen Teil derselben enthält.

14. Verfahren zur Konstruktion eines synthetischen Gens für ein Viren-Zielprotein, wobei das Protein im natürlichen Zustand durch ein auf einem nichtsegmentierten minus-strängigen Virengenom des Rinder-Parainfluenza-Virus Typ III lokalisierten Gen codiert wird, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) eine mRNA-Population isoliert, die die für das Virenprotein codierenden Gene enthält,

b) unter Verwendung der reversen Transcriptase und Oligodesoxynucleotid-Primer-Molekülen doppelsträngige mRNA/cDNA-Hybride aus der mRNA-Population konstruiert,

c) die mRNA-Stränge der Hybride verdaut oder entfernt,

d) im wesentlichen vollständig doppelsträngige cDNA-Moleküle aus der nach Stufe (c) verbleibenden einsträngigen cDNA herstellt, indem man eine DNA-Polymerase verwendet und

e) die einsträngigen Enden der im wesentlichen vollständig doppel-strängigen cDNA-Moleküle unter Verwendung einer einzelstrang-spezifischen Nuclease trimmt.

352A736

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet,

daß man die synthetischen Gene in geeignete Vectoren insertiert, geeignete Wirtszellen mit den rekombinanten Vectoren transformiert und die transformierten Wirtszellen kloniert, um eine Bibliothek zu schaffen, die die synthetischen Gene für das Viren-Zielprotein enthält.

16. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet,

daß man die in Stufe a isolierte mRNA-Population fraktioniert, um polyadenylierte mRNA zu isolieren.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man als Oligodesoxynucleotid-Primer-Moleküle in Stufe (b) Oligodesoxythymidin-Moleküle verwendet, die mit der polyadenylierten mRNA hybridisieren.

18. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet,

daß man in Stufe (c) die mRNA-Stränge mit Alkali oder einer Ribonuclease verdaut.

19. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet,

daß man in Stufe (c) die Trennung der mNRA-Stränge von den cDNA-Strängen durch Hitzedenaturieren durchführt.

20. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß man ein synthetisches Gen herstellt, das für mindestens eine antigene Stelle des Viren-Zielproteins codiert.

21. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet,

daß das Viren-Zielprotein Rinder-Parainfluenza-Virus Typ III Haemagglutinin ist.

22. Verfahren nach Anspruch21, dadurch gekennzeichnet, daß

das für das Protein codierende Gen im wesentlichen die Nucleotidsequenz gemäß Figur 1 oder einen Teil derselben enthält.

23. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet,

daß das von dem synthetischen Gen gebildete Protein im wesentlichen die Aminosäuresequenz gemäß Figur 4 oder einen Teil derselben enthält.

24. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet,

daß das Viren-Zielprotein ein Rinder-Parainfluenza-Typ III Viren-Strukturprotein ist.

25. Synthetisches Gen für ein Zielprotein des Rinder-Parainf luenza-Virus Typ III oder für mindestens eine antigene Stelle des Virenproteins erhalten nach dem Verfahren gemäß Anspruch 14.

26. Synthetisches Gen nach Anspruch 25, gekennzeichnet durch die Nucleotidsequenz gemäß Figur 1 oder einen Teil derselben.

27. Synthetisches Gen nach Anspruch 25, dadurch gekenn zeichnet, daß es für ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz gemäß Figur 4 oder einen Teil derselben enthält.

28. Vector oder Plasmid enthaltend das synthetische Gen nach Anspruch 25.

29. Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit dem Vector oder Plasmid nach Anspruch 28 transformiert ist und fähig ist, das Protein des darin enthaltenen synthetischen Gens zu exprimieren.

30. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet,

daß man das synthetische Gen verwendet, um ein synthetisches Peptid zu konzipieren und konstruieren, das als Vaccine oder diagnostisches Mittel geeignet ist, indem man die Nucleotidsequenz des synthetischen Gens bestimmt, die Translation der Nucleotidsequenz in die korrespondierende Aminosäuresequenz des Expressionsproteins bewirkt und ein Peptid synthetisiert, das die Aminosäuresequenz oder einen Teil derselben aufweist.

31. Verfahren zur Herstellung eines mit einem Viren-Zielprotein des Rinder-Parainfluenza-Virus Typ III korrespondierenden Virenproteins oder eines Teils desselben, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) ein synthetisches Gen konstruiert, welches für das Zielprotein oder einen Teil desselben codiert, indem man

(i) eine mRNA-Population isoliert, die das das Virenprotein codierende Gen enthält,
(ii) aus der mRNA-Population unter Verwendung des Enzyms reverse Transcriptase und Oligodesoxyribonucleotid-Primer-Molekülen aus der mRNA-Population doppel- strängige mRNA/cDNA-Hybride produziert,

(iii) die mRNA-Stränge der Hybride verdaut oder entfernt,

(iv) aus der einzel-strängigen nach Stufe 3 verbleibenden cDNA unter Verwendung einer DNA-Polymerase im wesentlichen vollständig doppel-strängige cDNA-Moleküle herstellt,

(v) die einzel-strängigen Enden der im wesentlichen vollständig doppel-strängigen cDNA-Moleküle unter Verwendung einer einzelstrangspezifischen Nuclease trimmt,

(vi) die resultierenden doppel-strängigen cDNA-Moleküle in Vectoren insertiert und Wirtszellen mit den rekombinanten Vectoren transformiert und (vii) die transformierten Wirtszellen kloniert, um eine Gen-Bibliothek zu schaffen,

(b) das synthetische Gen identifiziert und isoliert,

(c) das Gen in einen geeigneten Expressionsvector insertiert,

(d) einen geeigneten Wirt mit dem das synthetische Gen enthaltenden rekombinanten Vector transformiert,

(e) die transformierten Wirtszellen kloniert,

(f) die Wirtszellen in einem Medium kultiviert, das zum Exprimieren des synthetischen Gens geeignet ist und

(g) das Virenprotein oder den Teil desselben in dem Medium und/oder in den transformierten Wirtszellen anreichert.

32. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet,

daß man das in Stufe (g) angereicherte Virenprotein oder den Teil desselben isoliert und/oder reinigt.

33. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet,

daß man als Zielprotein Rinder-Parainfluenza-Virus Typ III Haemagglutinin oder ein oder mehrere antigene Stellen desselben auswählt.

34. Verfahren nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet,

daß das Protein oder eine oder mehrere antigene Stellen desselben die Aminosäuresequenz gemäß Figur 4 oder einen Teil derselben enthalten.

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35. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet,

daß man als Zielprotein Rinder-Parainfluenza-Virus Typ III Struktur-Fusionsprotein oder eine oder mehrere antigene Stellen desselben auswählt.

36. Verwendung des nach dem Verfahren gemäß Anspruch 31 exprimierten Proteins als Vaccine oder Diagnosemxttel.

37. Vaccin enthaltend das Protein nach Anspruch 36 in einem geeigneten Hilfsstoff.

38. Virenprotein des Rinder-Parainfluenza-Virus Typ III oder ein Teil desselben, erhalten nach dem Verfahren gemäß Anspruch 31.

39. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet,

daß man ein Virenprotein herstellt, welches ein Translations-Fusionsprotein ist, das das gesamte oder einen Teil des Viren-Zielproteins und eine durch ein benachbartes Gen codierte Aminosäuresequenz enthält.