DE69729996T2

DE69729996T2 - Methode zur identifizierung von attenuiertem varicella virus vom stamm oka oder von einem davon abstammenden stamm

Info

Publication number: DE69729996T2
Application number: DE69729996T
Authority: DE
Inventors: Chisato Nakamura-shi MORI; Rie Mitoyo-gun TAKAHARA; Juichiro Mitoyo-gun OSAME; Yasuyuki Kanonji-shi GOMI; Isao Takamatsu-shi FUKE
Original assignee: Research Foundation for Microbial Diseases of Osaka University BIKEN
Current assignee: Research Foundation for Microbial Diseases of Osaka University BIKEN
Priority date: 1996-05-15
Filing date: 1997-05-15
Publication date: 2005-08-25
Anticipated expiration: 2017-05-16
Also published as: CA2226714A1; CA2226714C; US6093535A; EP0839911B1; KR19990029016A; EP0839911A4; KR100279395B1; DE69729996D1; EP0839911A1; WO1997043420A1; CN1142277C; JP3871346B2; CN1193351A

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erkennung des abgeschwächten Varicella-Virus, Stamm OKA. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Erkennung des abgeschwächten Varicella-Virus, Stamm OKA, oder eines davon abgeleiteten Stamms, fähig als ein abgeschwächter Varicella-Virus Lebendimpfstoff zu wirken, und einen isolierten Virusstamm, welcher im wesentlichen derselbe Virusstamm ist, wie der als abgeschwächter Varicella-Virus erkannte Stamm OKA.
Stand der Technik
Wie allgemein bekannt werden heute verwendete Varicella-Lebendimpfstoffe hergestellt aus einem Impfstamm von Varicella-Zoster-Virus (nachfolgend häufig einfach als "Varicella-Virus" bezeichnet), welcher ein Virus ist, der von dem abgeschwächten Varicella-Virus, Stamm OKA, abstammt (siehe geprüfte Japanische Patentanmeldung Veröffentlichungsnummer 53-41202 und US-Patent Veröffentlichungsnummer 3,985,615), und die abgeschwächten Lebendimpfstoffe werden in der ganzen Welt weitverbreitet verwendet {Voraussetzungen für Varicella-Impfstoff (lebend), eingeführt 1984: WHO Technical Report Series, Nr. 725, S. 102–124, 1985}. Um die Sicherheit und die Wirksamkeit des Impfstoffs sicherzustellen, ist die Anzahl der Passagen eines zur Herstellung eines Impfstoffs verwendeten Virus unter der Kontrolle eines Impfchargensystems, das die potentielle genetische Mutation, welche wahrscheinlich während des Passagierens entstehen kann, in Betracht zieht. D. h. die Hersteller unterliegen einer Verpflichtung, Varicella-Impfstoffe nur aus dem Virus herzustellen, der aus dem genehmigten Impfvirus für Varicella-Lebendimpfstoffe stammt, wobei die Anzahl der Passagen des Virus nicht mehr als 10 beträgt, wie gezählt ab dem genehmigten Impfvirus, welcher als Passage 0 gezählt wird. In anderen Worten, die Qualitätskontrolle und Qualitätssicherung des abgeschwächten Varicella-Lebendimpfstoffs verlassen sich auf die Erfüllung des Impfchargensystems durch die Hersteller, und die Qualität des Impfstoffs ist nicht durch eine direkte genetische Analyse einer genomischen DNA eines Impfvirus oder einer genomischen DNA eines Impfstoff-Virus bestimmt worden.
Unter dem Gesichtspunkt der Epidemiologie, welche ein Aufspüren der Wirkungen eines Varicella-Impfstoffs und eine Überwachung nach Marktzulassung (post-market surveillance, PMS) umfasst, muss ferner der virologische Unterschied zwischen den frischen Wildtyp-Stämmen, isoliert aus den auf natürliche Weise infizierten Varicella-Patienten und den Impfvirusstämmen, stammend aus dem oben erwähnten Stamm OKA, bestimmt werden, und verschiedene Verfahren zur Bestimmung des virologischen Unterschieds sind probiert worden. Seit das Gen eines VZV-Genoms und die Struktur des Gens berichtet wurden (Journal of General Virology, 67, 1759–1816, 1986), wurden verschiedene Verfahren zur Bestimmung des virologischen Unterschieds, basierend auf den Unterschieden zwischen den Eigenschaften und Merkmalen der Stämme berichtet, wie z. B. der Unterschied in der DNA-Sequenz zwischen den unterschiedlichen VZV-Stämmen (Journal of Virology, 59, 660–668, 1986), dem Unterschied in der Abwesenheit oder dem Vorhandensein einer Schnittstelle des Restriktionsenzyms PstI (Japanese Journal of Experimental Medicine, 59, 233–237, 1989), dem RFLP-Unterschied (Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus) des PCR (Polymerase-Kettenreaktion)-Produkts (Journal of Virology, 66, 1016–1020, 1992), dem Unterschied in der Abwesenheit oder dem Vorhandensein einer Restriktionsschnittstelle des Restriktionsenzyms PstI, welches in Verbindung mit dem RFLP-Unterschied des PCR-Produkts genommen wird (Journal of Clinical Microbiology, 33, 658–660, 1995), und dem REFP (Restriktionsendonuklease-Fingerabdruck) des K-Fragments des Restriktionsenzyms HpaI und des R-Fragments des Restriktionsenzyms EcoRI (J. of Medical Virology, Bd. 33, Nr. 2, 128–132, 1991). Jedoch sind alle diese Verfahren nicht ausreichend und können nicht für die genaue Erkennung des Stamms OKA verwendet werden.
In anderen Worten, für die Qualitätskontrolle und Qualitätssicherung des Impfstoffs und unter dem Gesichtspunkt der Epidemiologie, welche das Aufspüren der Wirkungen des Impfstoffs und eine PMS umfasst, ist es von kritischer Wichtigkeit, den oben erwähnten abgeschwächten Varicella-Virus, Stamm OKA, oder einen davon abgeleiteten Stamm, fähig als ein abgeschwächter Varicella-Virus Lebendimpfstoff zu wirken (wobei der Stamm OKA oder ein davon abgeleiteter Stamm als ein Wirkstoff eines abgeschwächten Varicella-Lebendimpfstoffs verwendet werden kann), zu erkennen oder zu bestimmen. Jedoch ist ein verläßliches Verfahren für solch eine Erkennung oder Bestimmung nicht etabliert worden und die Entwicklung eines solchen Verfahrens wurde in dem Fachgebiet dringend erwünscht.
Zusammenfassung der Erfindung
In der vorstehenden Situation haben die gegenwärtigen Erfinder extensive und intensive Studien in Hinblick auf die Entwicklung eines neuen Verfahrens zur Erkennung, mit Genauigkeit und Geschwindigkeit, des abgeschwächten Varicella-Virus, Stamm OKA, oder eines davon abgeleiteten Stamms, fähig als ein abgeschwächter Varicella-Virus Lebendimpfstoff zu wirken, gemacht. Die gegenwärtigen Erfinder haben eine extensive genetische Analyse durchgeführt, um den Unterschied in der genomischen DNA zwischen dem abgeschwächten Varicella-Virus, Stamm OKA (oder einem davon abgeleiteten Stamm, fähig als ein abgeschwächter Varicella-Virus Lebendimpfstoff zu wirken), und anderen Varicella-Stämmen, wie z. B. einem bekannten Varicella-Stamm und einem frischen Wildtyp-Stamm, zu untersuchen. Als ein Ergebnis haben sie gefunden, daß acht spezifische Merkmale, unten beschrieben, verwendet werden können, um den abgeschwächten Varicella-Virus, Stamm OKA (oder einem davon abgeleiteten Stamm, fähig als ein abgeschwächter Varicella-Virus Lebendimpfstoff zu wirken), mit Genauigkeit und Geschwindigkeit zu erkennen. D. h. sie haben gefunden, daß eine genaue und schnelle Erkennung des Stamms OKA oder eines nützlichen davon abgeleiteten Stamms erreicht werden kann, indem bestimmt wird, ob ein Probenstamm alle acht Merkmale erfüllt oder nicht. Basierend auf dieser neuen Erkenntnis wurde die vorliegende Erfindung vervollständigt.
Deshalb ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein neues Verfahren zur Erkennung des abgeschwächten Varicella-Virus, Stamm OKA, oder eines davon abgeleiteten Stamms, fähig als ein abgeschwächter Varicella-Virus Lebendimpfstoff zu wirken, mit Genauigkeit und Geschwindigkeit bereitzustellen.
Die vorhergehende und andere Aufgaben, Eigenschaften und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden den Fachleuten aus der folgenden detaillierten Beschreibung und den angefügten Ansprüchen in Verbindung mit der begleitenden Sequenzliste und Zeichnungen ersichtlich werden.
Definition und Erklärung der in der vorliegenden Erfindung verwendeten Terminologie

(1) VZV: Eine Abkürzung für "Varicella-Zoster-Virus" (nachfolgend häufig einfach als "Varicella-Virus" bezeichnet), welcher Varicella-Herpes-Zoster verursacht. Das Erkennungsverfahren der vorliegenden Erfindung kann auf einen Virus angewandt werden, der aus einem an Varicella oder Zoster leidenden Patienten isoliert wurde.
(2) Varicella-Impfstoff: Ein Impfstoff, wirksam zur Verhinderung der Infektion mit einem VZV oder dem Ausbruch der Krankheit nach der Infektion.
(3) Abgeschwächter Stamm OKA: Ein Stamm, welcher äquivalent zu dem abgeschwächten Varicella-Virus, Stamm OKA, ist (siehe geprüfte Japanische Patentanmeldung Veröffentlichung 53-41202 und US-Patent Veröffentlichungsnummer 3,985,615). Der abgeschwächte Stamm OKA ist unter der Hinterlegungsnummer VR-795 am 14. März 1975 bei ATCC (American Type Culture Collection; 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 USA) hinterlegt.
(4) Abgeschwächter Varicella-Virus Impfstoff: Ein von dem genehmigten Impfvirus zur Herstellung des Varicella-Lebendimpfstoffs abgeleiteter Varicella-Virus, wobei die Anzahl der Passagen des Virus nicht mehr als 10 beträgt, wie ab dem genehmigten Impfvirus gezählt, welcher als Passage 0 gezählt wird (siehe WHO Technical Report Series Nr. 725, S. 107–108, 1985). Ein abgeschwächter Varicella-Virus ist nützlich als ein Wirkstoff für einen Varicella-Impfstoff.
(5) Genzahlen von VZV (Gen14 und Gen38) und Nukleotidzahlen der DNA: Diese Zahlen basieren auf einem Bericht von Davison und Scott (Journal of General Virology, 67, 1759–1816, 1986).
(6) Die Größe eines Restriktionsfragments {Einheit: Basenpaar (bp)}: Die Größe eines Restriktionsfragments mit kohäsiven Enden, welches durch den Verdau einer DNA-Sequenz eines VZV-Gens mit einem Restriktionsenzym erhalten wird, wird von den Schnittstellen des Restriktionsenzyms berechnet. Z. B., wenn die Schnittstellen des Restriktionsenzyms E zwei Stellen am 10-ten und 60-sten Nukleotid der Sequenz sind, beträgt die Größe des erhaltenen Restriktionsfragments E der DNA 60 – 10 = 50, nämlich 50 bp.
(7) HK-Fragment: eine Abkürzung für HpaI-K, gezeigt in 1 (Journal of infectious Diseases, 149, 956–963, 1984; das bedeutet das K-Fragment, das durch Verdau einer genomischen DNA eines VZV mit dem Restriktionsenzym HpaI erhalten wird).
(8) EP-Fragment: Eine Abkürzung für EcoRI-P, gezeigt in 1 (Journal of Virology, 59, 660–668; das bedeutet das P- Fragment, das durch Verdau einer genomischen DNA eines VZV mit dem Restriktionsenzym EcoRI erhalten wird).
(9) PCR-SSCP: Eine Abkürzung für "Polymerase-Kettenreaktion-Einzelstrangkonformations-Polymorphisums", welches ein Verfahren zur Analyse eines DNA-Fragments ist, welches durch PCR gemäß SSCP amplifiziert wird (Proceedings of National Academy of Science, USA, 86, 2766–2770, 1989).
(10) R2-487 Bereich: Ein Bereich eines VZV-Genoms, umfassend die repetitive Sequenz R2 des Gen14, wobei der Bereich als ein DNA-Fragment, amplifiziert durch PCR unter Verwendung der in Tabelle 1 gezeigten PCR-Primer (2) und (3), erhalten wird. Die Größe des R2-487 Bereichs des abgeschwächten Varicella-Virus Lebendimpfstoffs, Stamm OKA, beträgt 487 bp.
(11) R2-1764 Bereich: Ein Bereich eines VZV-Genoms, umfassend die repetitive Sequenz R2 von Gen14, wobei der Bereich als ein DNA-Fragment, amplifiziert durch PCR unter Verwendung der in Tabelle 1 gezeigten PCR-Primer (1) und (3), erhalten wird. Die Größe des R2-1764 Bereichs des abgeschwächten Varicella-Virus Lebendimpfstoffs, Stamm OKA, beträgt 1764 bp.
(12) Primer: Die Namen und DNA-Sequenzen {beschrieben in einer Richtung von links (5') nach rechts (3')} der bei der vorliegenden Erfindung verwendeten PCR-Primer sind in der folgenden Tabelle 1 gezeigt:

Tabelle 1 Namen der Primer und DNA-Sequenzen derselben
Wie vorstehend erwähnt haben die gegenwärtigen Erfinder den Unterschied der genomischen DNA zwischen dem abgeschwächten Varicella-Virus, Stamm OKA (oder einem davon abgeleitenden Stamm, fähig als ein abgeschwächter Varicella-Virus Lebendimpfstoff zu wirken), und anderen VZV-Stämmen, z. B. bekannten Stämmen und frischen Wildtyp-Stämmen, durch genetische Analyse untersucht. Die Gegenstände der genetischen Analyse können in nachfolgende (a) bis (e) zusammengefaßt werden (siehe auch 1):

(a) Individuelle Bestimmung der Größen des HK-Fragments und des EP-Fragments;
(b) Amplifikation des R2-1764 Bereichs durch PCR, um ein Fragment genomischer DNA eines VZV zu erhalten, und Behandlung des erhaltenen Fragments mit dem Restriktionsenzym AccIII {A Practical Guide to Molecular Cloning, Second Edition (1988)}, um dessen Spaltung in zwei Teile zu bestätigen, gefolgt von der Bestimmung der Größen der zwei Teile;
(c) Amplifikation des R2-487 Bereichs durch PCR, um ein Fragment genomischer DNA eines VZV zu erhalten, und Bestimmung der Größe des DNA-Fragments, wobei eine Analyse des R2-487 Bereichs durch PCR-SSCP und eine Bestimmung der Nukleotidsequenz des Bereichs auch ausgeführt werden;
(d) Amplifikation eines Teils von Gen38 durch PCR, um ein Fragment einer genomischen DNA eines VZV zu erhalten, und Behandlung des erhaltenen Fragments mit dem Restriktionsenzym PstI, gefolgt von der Bestimmung der Größe des Fragments vor und nach der Behandlung, um dadurch zu bestimmen, ob das Fragment mit PstI gespalten wird oder nicht, wobei die Analyse das Vorhandensein oder die Abwesenheit einer Schnittstelle des Restriktionsenzyms PstI bestätigt; und
(e) Amplifikation des gesamten kodierenden Bereichs von Gen14 des VZV durch PCR, und Bestimmung der Nukletidsequenz desselben.

Basierend auf den Ergebnissen der vorstehend erwähnten Analysen (a) bis (e) wurde die vorliegende Erfindung vervollständigt.
Kurze Beschreibung der Sequenzliste

SEQ ID NO. 1 ist die Nukleotidsequenz des R2-487 Bereichs der genomischen DNA des abgeschwächten Stamms OKA, und die Aminosäuresequenz (162 Aminosäurereste), die aus der Nukleotidsequenz gemäß dem universellen Code translatiert wurde;
SEQ ID NO. 2 ist die Nukleotidsequenz des gesamten kodierenden Bereichs von Gen14 (1683 bp), und die Aminosäuresequenz (560 Aminosäurereste), die aus der Nukleotidsequenz gemäß dem universellen Code translatiert wurde;
SEQ ID NO. 3 bis 8 sind die zur Herstellung der DNA-Fragmente der genomischen DNA des VZV verwendeten PCR-Primer, welche zur Erkennung des abgeschwächten Varicella-Virus, Stamm OKA, verwendet werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen
In den begleitenden Zeichnungen:
1 ist ein Diagramm einer genomischen DNA von VZV (etwa 125 kb), zeigend den Ort von Gen14, den Ort und die Größe der Restriktionsfragmente der genomischen DNA des abgeschwächten Stamms OKA, und die Nukleotidsequenz der bei der vorliegenden Erfindung verwendeten Primer; und
2A-1 bis 2A-3 und 2B-1 bis 2B-3 zeigen den Vergleich zwischen den Nukleotid- und Aminosäuresequenzen des abgeschwächten Stamms OKA, die von Davison und Scott offenbarten Sequenzen (Journal of General Virology, 67, 1759–1816, 1986) und die von Kinchington et al. offenbarten Sequenzen (Journal of Virology, 59, 660–668, 1986). Jede der Nukleotidsequenzen des gesamten kodierenden Bereichs von Gen14 werden in 2A-1 bis 2A-3 verglichen, und jede der Aminosäuresequenzen, die aus den Nukleotidsequenzen gemäß dem universellen Code translatiert wurden, werden in 2B-1 bis 2B-3 verglichen.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein neues Verfahren zur präzisen Erkennung des abgeschwächten Varicella-Virus, Stamm OKA, oder eines davon abgeleiteten Stamms, fähig als ein abgeschwächter Varicella-Virus Lebendimpfstoff zu wirken, bereitgestellt.
Für das einfache Verständnis der vorliegenden Erfindung werden die wesentlichen Eigenschaften und verschiedene bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung nachfolgend aufgezählt.

1. Ein Verfahren zur Erkennung des abgeschwächten Varicella-Virus, Stamm OKA, oder eines davon abgeleiteten Stamms, fähig als ein abgeschwächter Varicella-Virus Lebendimpfstoff zu wirken, welches umfaßt: das Analysieren einer genomischen DNA von einem Proben-Varicella-Virus und von DNA-Fragmenten desselben; und das Bestimmen, ob die analysierte genomische DNA des Proben-Varicella-Virus und die DNA-Fragmente desselben alle der folgenden acht Merkmale (A1) bis (A8) erfüllen:
(A1) die Größe des K-Fragments, das aus dem Verdau der genomischen DNA des Varicella-Virus mit dem Restriktionsenzym HpaI erhalten wird, ist 3231 bp;
(A2) die Größe des P-Fragments, das aus dem Verdau der genomischen DNA des Varicella-Virus mit dem Restriktionsenzym EcoRI erhalten wird, ist 1749 bp;
(A3) wenn ein DNA-Fragment, das von der genomischen DNA des Varicella-Virus durch PCR unter Verwendung des PCR-Primers (1), SEQ ID NO. 3, und des PCR-Primers (3), SEQ ID NO. 5, amplifiziert wird, mit dem Restriktionsenzym AccIII behandelt wird, wird das DNA-Fragment in zwei Teile mit Größen von 1208 bp bzw. 556 bp gespalten;
(A4) ein DNA-Fragment, das von der genomischen DNA des Varicella-Virus durch PCR unter Verwendung des PCR-Primers (2), SEQ ID NO. 4, und des PCR-Primers (3), SEQ ID NO. 5, amplifiziert wird, hat eine Größe von 487 bp;
(A5) die genomische DNA des Varicella-Virus und die genomische DNA des abgeschwächten Varicella-Virus, Stamm OKA, zeigen im wesentlichen die gleiche elektrophoretische Mobilität in Bezug auf ein durch PCR-SSCP bestimmtes DNA-Fragment, wobei der PCR-Primer (2), SEQ ID NO. 4, und der PCR-Primer (3), SEQ ID NO. 5, bei der PCR der PCR-SSCP verwendet werden;
(A6) einem DNA-Fragment, das von der genomischen DNA des Varicella-Virus durch PCR unter Verwendung des PCR-Primers (PS1), SEQ ID NO. 7, und des PCR-Primers (PS2), SEQ ID NO. 8, amplifiziert wird, fehlt eine Schnittstelle für das Restriktionsenzym PstI;
(A7) die Identität zwischen der 162 Aminosäuresequenz, kodiert von der genomischen DNA des Varicella-Virus, deren Sequenz der 162 Aminosäuresequenz der SEQ ID NO. 1 entspricht, und der 162 Aminosäuresequenz der SEQ ID NO. 1 beträgt 98 bis 100%; und
(A8) die Identität zwischen der 560 Aminosäuresequenz, kodiert von der genomischen DNA des Varicella-Virus, deren Sequenz der 560 Aminosäuresequenz der SEQ ID NO. 2 entspricht, und der 560 Aminosäuresequenz der SEQ ID NO. 2 beträgt 99 bis 100%.

Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung im Detail beschrieben.
In Bezug auf die Nukleotidsequenzen bedeuten in der vorliegenden Erfindung A Adenin, C Cytosin, G Guanin und T Thymin.
In Bezug auf die Aminosäuresequenzen bedeuten in der vorliegenden Erfindung Ala einen Alaninrest, Arg einen Argininrest, Asn einen Asparaginrest, Asp einen Asparaginsäurerest, Cys einen Cysteinrest, Gln einen Glutaminrest, Glu einen Glutaminsäurerest, Gly einen Glycinrest, His einen Histidinrest, Ile einen Isoleucinrest, Leu einen Leucinrest, Lys einen Lysinrest, Met einen Methioninrest, Phe einen Phenylalaninrest, Pro einen Prolinrest, Ser einen Serinrest, Thr einen Threoninrest, Trp einen Tryptophanrest, Tyr einen Tyrosinrest und Val einen Valinrest.
(1) Herstellung des HK-Fragments und des EP-Fragments, und Messungen der Größen derselben
Die genomische VZV-DNA wird extrahiert und gereinigt aus dem mit dem abgeschwächten Virus, Stamm OKA, infizierten Zellen, oder aus Bläschenflüssigkeit und dergleichen, erhalten von dem auf natürliche Weise infizierten Varicella-Patienten. Die extrahierte DNA wird entweder mit HpaI oder EcoRI verdaut, und die Größe von jedem der resultierenden DNA-Fragmente wird durch Agarose-Gelelektrophorese gemessen. Zur Vermehrung des VZV können WI-38 Zellen und MRC-Zellen verwendet werden. Es wird bevorzugt, daß die als eine Probe zur Amplifikation und Herstellung einer viralen genomischen DNA eines frischen Wildtyp-Stamms verwendete Bläschenflüssigkeit innerhalb von drei Tagen nach dem Ausbruch von Varicella aus einem auf natürliche Weise infizierten Patienten erhalten wird.
(2) Herstellung der PCR-Primer
Ein Paar von Polynukleotidsträngen, bestehend aus benachbarten Sequenzen von etwa 15 bis 30 Nukleotiden, wird mit einem DNA-Synthesizer hergestellt, wobei ein Polynukleotidstrang der 5'-terminalen Sequenz des gewünschten Bereichs von einem der Stränge der durch PCR zu amplifizierenden genomischen VZV-DNA entspricht, und der andere Polynukleotidstrang entspricht dem zu dem oben erwähnten Strang der genomischen VZV-DNA komplementären Strang (z. B. ein kodierender Strang und ein nicht-kodierender Strang). Die hergestellten Polynukleotidstränge werden gleichzeitig als die PCR-Primer verwendet. Der unter "Stand der Technik" erwähnte Stand der Technik in der Beschreibung kann zu Rate gezogen werden, wenn die Nukleotidsequenzen der Polynukleotide für die PCR-Primer entworfen werden.
(3) Herstellung der Fragmente, die jeweils den R2-Bereichen entsprechen, Bestimmung der Größen derselben, und die Analyse der Nukleotidsequenzen derselben
Nach der Extraktion einer genomischen VZV-DNA, direkt aus einer Bläschenflüssigkeit, auf die oben erwähnte Weise werden der R2-487 Bereich und R2-1764 Bereich der extrahierten DNA individuell durch PCR amplifiziert. Die Größe von jedem der amplifizierten DNA-Fragmente wird durch Agarose-Gelelektrophorese bestimmt. Die Nukleotidsequenz kann durch herkömmliche Verfahren analysiert werden, z. B. das Didesoxy- Verfahren und ein Verfahren unter Verwendung des Cycle Sequence Kit (hergestellt und vertrieben von TAKARA SHUZO Co. Ltd., Japan).
In Bezug auf den gesamten kodierenden Bereich von Gen14 des VZV kann die DNA im wesentlichen auf die gleiche Weise wie oben erwähnt hergestellt und analysiert werden. Die Nukleotidsequenz des gesamten kodierenden Bereichs von Gen14 des abgeschwächten Varicella-Virus, Stamm OKA, ist in SEQ ID NO. 2 gezeigt. Diese Sequenz wurde aufgeklärt und wird durch die Erfinder der vorliegenden Erfindung zum ersten Mal offenbart.
R2 ist eine repetitive Sequenz, die in dem oben erwähnten Gen14 gefunden wird, und R2 ist sowohl in dem HK-Fragment als auch dem EP-Fragment enthalten (siehe 1). Ferner kann der amplifizierte R2-1764 Bereich auch durch RFLP unter Verwendung des Restriktionsenzyms AccIII analysiert werden.
(4) Herstellung eines Fragments, das dem Spaltbereich des Restriktionsenzym PstI entspricht, und Bestimmung des Vorhandenseins oder der Abwesenheit von einer Schnittstelle des Restriktionsenzyms PstI
Nach der Extraktion der genomischen VZV-DNA, direkt aus einer Bläschenflüssigkeit, auf die oben erwähnte Weise wird der PstI-Spaltbereich (647 bp) der extrahierten DNA durch PCR amplifiziert. Das amplifizierte DNA-Fragment wird mit dem Restriktionsenzym PstI verdaut und einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, um zu bestimmen, ob der PstI-Spaltbereich, bestehend aus 647 bp, in zwei Teile mit Größen von 290 bp bzw. 357 bp gespalten wird. Die Spaltung des PstI-Spaltbereichs in zwei Teile bestätigt die Existenz einer PstI-Schnittstelle in dem PstI- Spaltbereich. Der genomischen DNA des abgeschwächten Stamms OKA fehlt eine PstI-Schnittstelle in dem PstI- Spaltbereich derselben und deshalb wird das amplifizierte DNA-Fragment nicht in zwei Teile gespalten.
(5) PCR-SSCP
Der R2-487 Bereich der genomischen VZV-DNA wird durch PCR unter Verwendung von PCR-Primern, an ihren jeweiligen 5'-Termini mit ³²P markiert, amplifiziert, wodurch markierte DNA-Fragmente erhalten werden. Jedes amplifizierte DNA-Fragment wird einer Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen, und die elektrophoretische Mobilität des Fragments wird mit der des R2-487 Bereichs des abgeschwächten Stamms OKA verglichen.
(6) Impfstoff, umfassend den abgeschwächten Stamm OKA
Der abgeschwächte Virus, Stamm OKA, oder ein davon abgeleiteter Stamm, welcher durch die vorliegende Erfindung erkannt wird, ist als Wirkstoff für den Varicella-Impfstoff geeignet, und solch ein Stamm kann als ein Varicella-Impfstoff bereitgestellt werden.
(7) gpV des abgeschwächten Varicella-Virus, Stamm OKA, der als ein Antigen für die Diagnose verwendet werden kann
Wie aus 2A und 2B ersichtlich, umfaßt der abgeschwächte Varicella-Virus, Stamm OKA, erkannt durch die vorliegende Erfindung, eine Aminosäuresequenz (gezeigt in SEQ ID NO. 2), welche spezifisch für den abgeschwächten Varicella-Virus, Stamm OKA, ist. Deshalb kann das durch Gen14 des abgeschwächten Varicella-Virus Genoms, Stamm OKA, kodierte gpV (Glycoprotein V) vorteilhaft verwendet werden, z. B. als ein Antigen für die Diagnose. Z. B. kann die Notwendigkeit einer Impfung aus einer Intrakutanreaktion unter Verwendung des Antigens der vorliegenden Erfindung bestimmt werden. Das abgeschwächte Varicella-Virus Antigen der vorliegenden Erfindung umfaßt eine benachbarte Sequenz von 3 oder mehr Aminosäuren, vorzugsweise 5 Aminosäuren, stärker bevorzugt 7 Aminosäuren, ausgewählt aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO. 2.
Beste Art zur Ausführung der Erfindung
Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf das folgende Beispiel detaillierter beschrieben, aber dieses sollte nicht als den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung limitierend aufgefaßt werden.
Beispiel 1
Stamm Kawaguchi, der ein Wildtyp VZV-Stamm ist, und die frischen Wildtyp-Stämme, die jeweils aus den Bläschenflüssigkeiten von 9 auf natürliche Weise mit Varicella infizierten Patienten isoliert wurden, (insgesamt 10 Proben) wurden wie folgt getestet. Der abgeschwächte Stamm OKA wurde als eine Kontrolle verwendet, und die Ergebnisse der Tests in Bezug auf die 10 Proben wurden mit den Ergebnissen der Tests in Bezug auf den abgeschwächten Stamm OKA verglichen.
Test (1) Bestimmung der Größe des HK-Fragments
Der abgeschwächte Stamm OKA, der Stamm Kawaguchi und die 9 Proben von Bläschenflüssigkeiten, jeweils erhalten aus auf natürliche Weise mit Varicella infizierten Patienten, wurden individuell in MRC-5 Zellen geimpft, um infizierte Zellen zu erhalten, und die infizierten Zellen wurden kultiviert. Jede der Zellkulturen (10⁶ Zellen) wurde einer Zentrifugation bei geringer Geschwindigkeit bei 400 × g bei 4°C für 5 Minuten unterzogen, um dadurch die infizierten Zellen zu sammeln, und die gesammelten Zellen wurden gefroren und aufgetaut. Jede der gesammelten Zellen wurde individuell in 5,0 ml des unten erwähnten Lysepuffers suspendiert, und mit jeweils 50 μg DNaseI und RNase A bei 37°C für 30 Minuten behandelt, gefolgt vom Kühlen in Eis für 10 Minuten. Dann wurde zu jeder der resultierenden Mischungen 2,5 ml Trichlortrifluorethan zugegeben und für 6 Minuten heftig geschüttelt, gefolgt von einer Zentrifugation bei geringer Geschwindigkeit bei 400 × g bei 4°C für 15 Minuten, um dadurch einen Überstand zu erhalten. Jeder der erhaltenen Überstände wurde individuell auf eine diskontinuierliche Dichtegradienten-Zweischichtzusammensetzung, bestehend aus zwei Schichten von 7,5 ml Lysepuffer, die jeweils 5% (V/V) bzw. 40% (V/V) Glycerol enthalten, geschichtet und das resultierende Material wurde bei 100000 × g bei 4°C für 70 Minuten ultrazentrifugiert, wodurch ein Präzipitat enthalten wird. Jedes der erhaltenen Präzipitate wurde in 0,5 ml STE-Puffer {1% (W/V) SDS (Natriumdodecylsulfat; 0,05 mM Tris-HCl Puffer (pH 7,4); und 10 mM EDTA (2 Na)} resuspendiert, und mit 500 μg Proteinase K bei 65°C für 3 Stunden behandelt. Die resultierende Mischung wurde durch dreimalige Phenolextraktion unter Verwendung von wäßrigem gesättigtem Phenol gereinigt, gefolgt von einer Ethanolpräzipitation bei –70°C. Folglich wurde die genomische DNA von jeder der 10 VZV-Virusproben, einschließlich des Stamms Kawaguchi und der genomischen DNA des abgeschwächten Stamms OKA, erhalten.
Zusammensetzung des Lysepuffers
Gelöste Bestandteile, enthalten in 50 mM Tris-HCl Puffer {pH 7,4; Tris ist "Tris-(hydroxymethyl)aminomethan"}, und die Konzentrationen derselben sind wie folgt:
3 mM Kalziumchlorid;
5 mM Magnesiumacetat;
125 mM Kaliumchlorid;
1 mM EDTA (2Na) (Dinatriumethylendiamintetraacetat);
1 mM DTT (Dithiothreitol);
0,5% (W/V) SDC (Natriumdeoxycholat) und
0,5% (W/V) Nonidet P-40 (hergestellt und vertrieben von Sigma Chemical Company, USA).
Jede der oben hergestellten genomischen DNAs wurde mit dem Restriktionsenzym HpaI verdaut, und die Größe von jedem der erhaltenen DNA-Fragmente (HK-Fragmente) wurde durch Agarose-Gelelektrophorese in einem 0,5% (W/V) Agarosegel gemessen. Als ein Ergebnis wurde gefunden, daß die Größe des HK-Fragments des abgeschwächten Stamms OKA 3231 bp beträgt, und nur 3 Proben von den 10 getesteten Proben hatten das HK- Fragment mit derselben Größe wie der des abgeschwächten Stamms OKA.
Test (2) Bestimmung der Größe des EP-Fragments
In Bezug auf die Kontrolle und jede der oben erwähnten Proben wurde ein DNA-Fragment (EP-Fragment) durch Behandlung der genomischen DNA mit dem Restriktionsenzym erhalten und die Größe des erhaltenen Fragments wurde im wesentlichen auf die gleiche Weise wie in Test (1) oben durch Elektrophorese gemessen, außer, daß anstelle von HpaI das Restriktionsenzym EcoRI verwendet wurde. Als ein Ergebnis wurde gefunden, daß die Größe des EP-Fragments des abgeschwächten Stamms OKA 1749 bp beträgt, und nur 3 Proben von den 10 getesteten Proben hatten das EP-Fragment mit derselben Größe wie der des abgeschwächten Stamms OKA.
Test (3) Bestimmung der Größe und Nukleotidsequenz des R2-487 Bereichs
Die jeweiligen Fragmente genomischer DNA des abgeschwächten Stamms OKA und Stamms Kawaguchi wurden individuell aus den Kulturmedien der mit den jeweiligen Stämmen infizierten Zellen hergestellt. Die genomische DNA von jedem der 9 frischen Wildtyp-Stämme wurde direkt aus den Bläschenflüssigkeiten der Patienten hergestellt. Präzise wurde die genomische VZV-DNA durch Behandlung der Bläschenflüssigkeit mit Guanidinthiocyanat mit einer Endkonzentration von 5,5 M solubilisiert. Die solubilisierte genomische DNA wurde einer Phenolextraktion mit Phenol unterzogen und dann einer Chloroform/Isoamylalkoholextraktion unterzogen, gefolgt von einer Reinigung durch Isopropylalkoholpräzipitation, um dadurch eine genomische DNA des frischen Wildtyp-Stamms zu erhalten.
Die R2-487 Bereiche der oben erhaltenen genomischen DNAs wurden durch PCR unter Verwendung der PCR-Primer (2) und (3) amplifiziert, um R2-487 Fragmente zu erhalten. Die Größe von jedem der erhaltenen R2-487 Bereiche wurde durch Agarose-Gelektrophorese in einem 4% (W/V) Agarosegel bestimmt. Als ein Ergebnis wurde gefunden, daß die Größe des R2-487 Bereichs des abgeschwächten Stamms OKA 487 bp beträgt, und nur 5 Proben von den 10 getesteten Proben hatten den R2-487 Bereich mit derselben Größe wie der des abgeschwächten Stamms OKA.
Ferner wurde die Nukleotidsequenz von jedem der R2-487 Bereiche durch Cycle Sequence Kit (hergestellt und vertrieben von TAKARA SHUZO Co., Ltd., Japan; Anleitung Codenummer R014) bestimmt. Die Nukleotidsequenzen der R2-487 Bereiche der Proben wurden individuell mit der Nukleotidsequenz des abgeschwächten Stamms OKA verglichen, um die DNA-Homologie zwischen den Nukleotidsequenzen zu bestimmen, und auch die Aminosäuresequenzen der R2-487 Bereiche der Proben, die durch Translation der Nukleotidsequenzen gemäß dem universellen Code erhalten wurden, wurden individuell mit der des Stamms OKA verglichen, um die Homologie zwischen den Aminosäuresequenzen zu bestimmen. Die Bestimmung wurde mit einer Computersoftware zur Genanalyse {GENETYX (ver. 9.0); hergestellt und vertrieben von Software Development Co., Ltd., Japan} durchgeführt. Die Nukleotidsequenz und Aminosäuresequenz des R2-487 Bereichs des abgeschwächten Stamms OKA sind in SEQ ID NO. 1 gezeigt.
Der Vergleich zwischen der Nukleotidsequenz des R2-487 Bereichs des abgeschwächten Stamms OKA und der Nukleotidsequenz von jeder der 10 Proben, einschließlich des Stamms Kawaguchi, zeigt, daß ein Unterschied in den Nukleotiden bezüglich 4 oder mehr Nukleotiden in dem R2-487 Bereich von jeder der Proben gefunden wurde, und daß dieser Unterschied in den Nukleotiden durch eine Veränderung in den Aminosäuren (kodiert durch 162 Codons, d. h. 162 Codons = 487 bp/3) begleitet wurde. Somit betrug die Homologie zwischen der Aminosäuresequenz des abgeschwächten Stamms OKA und der von jeder der 10 Proben weniger als 98% {d. h. 487 bp/3 = 162 Codons; [(162 Codons} – 4 unterschiedliche Codons)/162 Codons] × 100 = 97,5% < 98%}.
Test (4) Bestimmung der Größe des R2-1764 Bereichs
Die genomische DNA von jedem der Viren wurde im wesentlichen auf die gleiche Weise wie in Test (3) oben hergestellt, und jeder der R2-1764 Bereiche der genomischen DNAs wurde individuell durch PCR unter Verwendung der PCR-Primer (1) und (3) amplifiziert, um dadurch die R2-1764 Fragmente zu erhalten. Jedes der erhaltenen R2-1764 Fragmente wurde mit dem Restriktionsenzym AccIII verdaut, und die Größe von jedem der verdauten DNA-Fragmente wurde durch Agarose-Gelelektrophorese in einem 4% (W/V) Agarosegel bestimmt. Als ein Ergebnis wurde gefunden, daß das R2-1764 Fragment des abgeschwächten Stamms OKA in zwei Teile mit Größen von 1208 bp bzw. 556 bp gespalten wird, und nur 5 Proben von 10 getesteten Proben zeigten dasselbe Restriktionsmuster wie das des abgeschwächten Stamms OKA.
Test (5) Bestimmung der Abwesenheit oder des Vorhandenseins einer Schnittstelle des Restriktionsenzyms PstI
Die jeweiligen genomischen DNA-Fragmente des abgeschwächten Stamms OKA und Stamms Kawaguchi wurden individuell aus den Kulturmedien der mit den jeweiligen Stämmen infizierten Zellen hergestellt. Die genomische DNA von jedem der 9 frischen Wildtyp-Stämme wurde direkt aus den Bläschenflüssigkeiten der Patienten hergestellt. Präzise wurde die genomische VZV-DNA im wesentlichen auf die gleiche Weise erhalten, wie in Test (3) oben erwähnt.
Der PstI-Spaltbereich (647 bp) von jeder der oben hergestellten genomischen DNAs wurde individuell durch PCR unter Verwendung der PCR-Primer (PS1) und (PS2) amplifiziert. Jedes der PCR-Produkte wurde mit dem Restriktionsenzym PstI behandelt, gefolgt von Agarose-Gelelektrophorese in einem 4% (W/V) Agarosegel, um das Vorhandensein oder die Abwesenheit einer Schnittstelle des Restriktionsenzyms PstI zu bestimmen. Als ein Ergebnis wurde gefunden, daß das PstI-Spaltungsfragment (647 bp) von jedem, dem abgeschwächten Stamm OKA und Stamm Kawaguchi, nicht in zwei Teile gespalten wurde, wodurch die Abwesenheit der PstI-Schnittstelle bestätigt wurde. Das PstI-Spaltungsfragment von jeder der 9 anderen Proben wurde in zwei Teile mit Größen von 290 bp bzw. 357 bp gespalten. Durch die Spaltung des PstI-Spaltbereichs wurde das Vorhandensein einer PstI-Schnittstelle bestätigt.
Test (6) Analyse durch PCR-SSCP
Der R2-487 Bereich der Kontrolle und von jeder der 10 Proben wurde amplifiziert und im wesentlichen auf die gleiche Weise wie in Test (3) oben erwähnt hergestellt, außer, daß die PCR-Primer (2) und (3), an den jeweiligen 5' Termini derselben individuell ³²P markiert, anstelle der nicht-markierten Primer verwendet wurden. Jedes der PCR-Produkte wurde durch Erhitzen auf 95°C für 2 Minuten denaturiert und dann einer Polyacrylamid-Gelelektrophorese in einem 5% (WIV) Polyacrylamidgel unterzogen, um dadurch die elektrophoretische Mobilität von jedem der PCR-Produkte zu bestimmen. Als ein Ergebnis wurde gefunden, daß keines der aus den genomischen DNAs der Proben hergestellten PCR-Produkte im wesentlichen dieselbe elektrophoretische Mobilität wie das PCR-Produkt, hergestellt aus der genomischen DNA des abgeschwächten Stamms OKA, zeigt, und es wurde bestätigt, daß keine der 10 Virusstammproben der abgeschwächte Virus, Stamm OKA, ist.
Test (7) Analyse der Nukleotidsequenz von Gen14 von genomischer DNA des abgeschwächten Stamms OKA
Ein Fragment, das dem gesamten kodierenden Bereich von Gen14 entspricht, wurde aus der genomischen DNA des abgeschwächten Stamms OKA durch PCR unter Verwendung der PCR-Primer (1) und (4) hergestellt. Die Nukleotidsequenz der amplifizierten DNA wurde mit einem DNA-Sequencer (hergestellt und vertrieben von LI-cor, USA) analysiert. Die oben bestimmte Nukleotidsequenz des gesamten kodierenden Bereichs von Gen14 des abgeschwächten Stamms OKA ist in SEQ ID NO. 2 gezeigt.
Ferner wurde die Aminosäurehomologie zwischen der Aminosäuresequenz SEQ ID NO. 2 und jeder der im Stand der Technik offenbarten Sequenzen (Davison und Scott, Journal of General Virology, 67, 1759–1816, 1986; und Kinchington et al., Journal of Virology, 59, 660–668, 1986) im wesentlichen auf die gleiche Weise wie in Test (3) oben analysiert. Die Ergebnisse sind in 2A und 2B gezeigt. Der Vergleich zwischen den in 2B gezeigten Aminosäuresequenzen zeigt, daß Unterschiede in 8 Aminosäuren (für Davison et al.) und 9 Aminosäuren (für Kinchington) zwischen den Aminosäuresequenzen gefunden wurden, und deshalb betrug die Aminosäurehomologie zwischen der Aminosäuresequenz des abgeschwächten Stamms OKA und jeder der Sequenzen des Standes der Technik weniger als 99% {d. h. [(560 AA – 8 AA)/560 AA] × 100 = 98,6% für Davison, und [([(560 AA – 9 AA)/560 AA] × 100 = 98,4% für Kinchington}. Ferner wurde bestätigt, daß beide der zwei im Stand der Technik offenbarten VZV-Stämme eine in Test (5) oben erwähnte Schnittstelle des Restriktionsenzyms PstI hatten.
Die Ergebnisse der Tests (1) bis (7) sind in Tabelle 2 unten zusammengefaßt.
Tabelle 2
Wie aus dem Vorstehenden ersichtlich, kann der abgeschwächte Stamm OKA von anderen VZV-Stämmen unterschieden werden und mit extrem hoher Präzision erkannt werden, indem bestimmt wird, ob alle der vorstehend erwähnten 8 Merkmale erfüllt werden oder nicht.
Industrielle Anwendbarkeit
Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird eine genaue Qualitätskontrolle und Qualitätssicherung der abgeschwächten Varicella-Lebendimpfstoffe, die heute in der Produktion derselben verwendet werden, erreicht. Ferner werden genaue und vorteilhafte Verfahren, die in Forschungen auf dem Gebiet der Epidemiologie von Varicella und Zoster verwendet werden, umfassend ein Aufspüren der Wirkungen des Imfpstoffs und PMS, bereitgestellt. Deshalb stellt die vorliegende Erfindung ein genaues und sehr wirkungsvolles Maß zur Verhinderung von Varicella und Zoster bereit, welches zu der Gesundheit von Menschen beiträgt.
Sequenzliste

Claims

Verfahren zur Erkennung des abgeschwächten Varicella-Virus, Stamm OKA, oder eines davon abgeleiteten Stamms, fähig als ein abgeschwächter Varicella-Virus Lebendimpfstoff zu wirken, welches umfasst: das Analysieren einer genomischen DNA von einem Proben-Varicella-Virus und von DNA-Fragmenten desselben; und das Bestimmen, ob die analysierte genomische DNA des Proben-Varicella-Virus und die DNA-Fragmente desselben alle der folgenden acht Merkmale (A1) bis (A8) erfüllen: (A1) die Größe des K-Fragments, das aus dem Verdau der genomischen DNA des Varicella-Virus mit dem Restriktionsenzym HpaI erhalten wird, ist 3231 bp; (A2) die Größe des P-Fragments, das aus dem Verdau der genomischen DNA des Varicella-Virus mit dem Restriktionsenzym EcoRI erhalten wird, ist 1749 bp; (A3) wenn ein DNA-Fragment, das von der genomischen DNA des Varicella-Virus durch PCR unter Verwendung des PCR-Primers (1), SEQ ID NO. 3, und des PCR-Primers (3), SEQ ID NO. 5, amplifiziert wird, mit dem Restriktionsenzym AccIII behandelt wird, wird das DNA-Fragment in zwei Teile mit Größen von 1208 bp bzw. 556 bp gespalten; (A4) ein DNA-Fragment, das von der genomischen DNA des Varicella-Virus durch PCR unter Verwendung des PCR-Primers (2), SEQ ID NO. 4, und des PCR-Primers (3), SEQ ID NO. 5, amplifiziet wird, hat eine Größe von 487 bp; (A5) die genomische DNA des Varicella-Virus und die genomische DNA des abgeschwächten Varicella-Virus, Stamm OKA, zeigen im wesentlichen die gleiche elektrophoretische Mobilität in bezug auf ein durch PCR-SSCP bestimmtes DNA-Fragment, wobei der PCR-Primer (2), SEQ ID NO. 4, und der PCR-Primer (3), SEQ ID NO. 5, bei der PCR der PCR-SSCP verwendet werden; (A6) einem DNA-Fragment, das von der genomischen DNA des Varicella-Virus durch PCR unter Verwendung des PCR-Primers (PS1, SEQ ID NO. 7, und des PCR-Primers (PS2), SEQ ID NO. 8, amplifiziert wird, fehlt eine Schnittstelle für das Restriktionsenzym PstI; (A7) die Identität zwischen der 162 Aminosäuresequenz, kodiert von der genomischen DNA des Varicella-Virus, deren Sequenz der 162 Aminosäuresequenz der SEQ ID NO. 1 entspricht, und der 162 Aminosäuresequenz der SEQ ID NO. 1 beträgt 98 bis 100%; und (A8) die Identität zwischen der 560 Aminosäuresequenz, kodiert von der genomischen DNA des Varicella-Virus, deren Sequenz der 560 Aminosäuresequenz der SEQ ID NO. 2 entspricht, und der 560 Aminosäuresequenz der SEQ ID NO. 2 beträgt 99 bis 100%.