DE3587840T2

DE3587840T2 - Für das Polypeptid des T-Zellantigenreceptors kodierende Nukleinsäure.

Info

Publication number: DE3587840T2
Application number: DE3587840T
Authority: DE
Inventors: Tak W Mak
Original assignee: Ontario Cancer Institute
Current assignee: Ontario Cancer Institute
Priority date: 1984-01-13
Filing date: 1985-01-14
Publication date: 1994-09-15
Anticipated expiration: 2005-01-15
Also published as: JPH0698772A; EP0149548A3; JP2690289B2; JP2562268B2; ATE106940T1; DE3587840D1; JPH08109199A; HK1006854A1; JPH1057075A; EP0593092A1; EP0149548B1; JPS6128395A; EP0149548A2; JP2565486B2; US4713332A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid kodiert, das mindestens ein Teil eines T- Zell-Antigen-Rezeptors eines Säugers ist.
Ähnlich wie B-Zellen erkennen T (vom Thymus abgeleitete)-Zellen spezifische Antigene. Diese Erkennung ist wesentlich für die Aktivierung von T-Zellen, die innerhalb des Immunsystems mindestens zwei Hauptfunktionen wahrnehmen. Sie töten Zellen, die fremd erscheinen, wie Zellen, die mit Viren infiziert worden sind und virale Antigene tragen, und sie regulieren andere Immunantworten einschließlich der Antikörperbildung durch B-Zellen (H.R. Green et al., (1983), Ann. Rev. Immunol., 1, 439-461; P.C. Kung et al., (1983), Intl. J. Dermatol. 22, 67-76).
Es wird davon ausgegangen, daß die Antigenerkennung durch einen Rezeptor auf T-Zellen vermittelt wird. Eine molekulare und biochemische Charakterisierung des T-Zell-Antigen-Rezeptors sollte viele der Geheimnisse im Zusammenhang mit der T-Zell-Erkennung eines Antigens aufklären und zu einem besseren Verständnis der zahlreichen Wechselwirkungen zwischen den Immunzellen und ihren Targets und damit zu einem besseren Verständnis der Regulation von Immunantworten beitragen.
Trotz intensiver Forschungsanstrengungen hat sich die Charakterisierung des T-Zell-Antigen-Rezeptors während der letzten beiden Jahrzehnte nur langsam weiterentwickelt (J.J. Marchalonis, (1982), Immunol. Today, 3, 10-12; M. Kronenberg et al., (1983), Cell., 34, 327-329). Kürzlich haben jedoch mehrere Forschungsgruppen murine monoklonale Antikörper hergestellt, die T- Zell-Oberflächenproteine mit den vorhergesagten Eigenschaften des Antigen-Rezeptors erkennen können (J.L. Marx, (1983), Science, 221, 444-446). Diese Antikörper wurden hergestellt durch Immunisierung von Mäusen mit Zellinien klonierter T-Zellen, wobei die Antikörper lediglich mit den zur Auslösung der Antikörperbildung eingesetzten Zellen reagieren. Immunochemische Untersuchungen beim Menschen (S.C. Meuer et al., (1983), J. Exp. Med., 157, 705-719; S.C. Meuer et al., (1983), J. Exp. Med., 158, 988-993; R.D. Bigler et al., (1983), J. Exp. Med., 158, 1000-1005; A. Oreste et al., (1983), Cell., 34, 717-726; J. Kappler et al., (1983), Cell., 35, 295-302; S.C. Meuer et al., (1983), Science, 222, 1239-1242) und bei Nagetieren (K. Haskins et al., (1983), J. Exp. Med., 157, 1149-1161; P. Marrack et al., (1983), J. Exp. Med., 158, 1635-1646; B.W. McIntyre und J.P. Allison, (1983), Cell., 34, 739-746; J. Kappler et al., (1983), Cell., 34, 727-734) legen nahe, daß der putative T-Zell-Antigen- Rezeptor ein aus zwei verschiedenen Polypeptidketten mit Molekulargewichten von ungefähr 40.000 bzw. 45.000 Dalton zusammengesetztes Molekül ist. Unter nicht-reduzierenden Bedingungen ist das T-Zell-Rezeptormolekül ein über Disulfidbrücken verknüpftes Heterodimer mit einem Molekulargewicht von 85.000 bis 90.000 Dalton. Eine Peptidkartierungsanalyse im murinen System legt nahe, daß das T-Zell-Rezeptorprotein eine variable und eine konstante Region enthält. Diese Untersuchungen haben jedoch keine Informationen in Bezug auf die Protein- oder Nukleotidsequenzen erbracht.
Kürzlich sind mehrere Berichte darüber erschienen, daß Stephen Hedrick vom National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) und Mark Davis, bis vor kurzem beim NIAID und nunmehr an der Stanford Medical School, eine cDNA hergestellt haben aus T-Zell-mRNA, die für ein T-Zell-Rezeptorprotein kodieren kann (J.L. Marx, (1983), Science, 221, 1278-1279; J. Berzofsky, (1983), Immunol. Today, 4, 299-301). Diese Berichte legen nahe, daß das kodierte Protein Merkmale enthalten kann, die es mit den variablen und konstanten Regionen von Immunglobulinketten gemeinsam hat. Diese Berichte enthalten jedoch keine Informationen in Bezug auf: a) die Aminosäuresequenz des putativen T-Zell- Rezeptorproteins; b) die präzise Größe oder Nukleotidsequenz der hergestellten cDNA; c) den Ursprung der untersuchten T-Zellen (vermutlich murine Zellen); d) die durchgeführten experimentellen Vorgehensweisen; und e) Daten, die die cDNA oder das Protein betreffen. Daher würde ein Durchschnittsfachmann durch diese Berichte nicht in die Lage versetzt werden, die vermuteten Ergebnisse zu reproduzieren oder zu bestätigen. Darüber hinaus existieren keine Anregungen hinsichtlich einer möglichen Verwendung einer für das Rezeptorprotein kodierenden cDNA oder des Rezeptorproteins.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Isolierung und detaillierte molekulare Charakterisierung eines menschlichen T-Zell- Antigen-Rezeptorproteins und das dafür kodierende Gen. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren für die Isolierung und für das Screening des Rezeptorgens, der Nukleotidsequenz des Gens, der Aminosäuresequenz des von dem Gen kodierten Proteins, und Verwendungen der Nukleotidsequenz und des Proteins einschließlich der Bestimmung, ob eine unbekannte Zelle eine T-Zelle ist.
Die vorliegende Erfindung stellt eine isolierte Nukleinsäure bereit, die für ein Polypeptid kodiert, das ein Teil eines T- Zell-Antigen-Rezeptors eines Säugers ist, wobei die Nukleinsäure mindestens 936 Nukleotide umfaßt und als DNA eine mit der in Fig. 3 dargestellten Sequenz von der Position 800 bis zur Position 973 identische Sequenz von 174 Desoxyribonukleotiden umfaßt, oder als RNA eine Sequenz von 174 Ribonukleotiden umfaßt, die mit der in Fig. 3 von der Position 800 bis zur Position 973 dargestellten Sequenz von 174 Desoxyribonukleotiden korrespondiert. Die Nukleinsäure kann eine cDNA sein. Eine erfindungsgemäße Nukleinsäure oder das Komplement davon kann mit einem nachweisbaren Marker markiert sein.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner eine isolierte Nukleinsäure bereit, die für einen Teil eines T-Zell-Antigen-Rezeptors eines Säugers kodiert, wobei die Nukleinsäure mindestens 936 Nukleotide umfaßt und sich mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder dem Komplement davon hybridisieren läßt.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen cDNA bereit, umfassend das Gewinnen von mRNA aus einer T-Zelle eines Säugers, das Herstellen einer zu der mRNA komplementären cDNA, das Insertieren der cDNA in einen geeigneten Klonierungsvektor, das Einführen des Klonierungsvektors in einen geeigneten Wirt, das Kultivieren des resultierenden Wirtes unter Bedingungen, die eine Produktion von multiplen Kopien der cDNA erlauben, das Rückgewinnen der auf diese Weise hergestellten cDNA, und das Screenen der cDNA, um nachzuweisen, ob sie lediglich in T-Zellen exprimiert wird. Die Klonierungsvektoren und Expressionsvektoren, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäure umfassen, sowie Wirtszellen, die derartige Klonierungsvektoren und Expressionsvektoren umfassen, bilden ihrerseits Teile der vorliegenden Erfindung.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren bereit zur Herstellung eines Polypeptids, das zumindest ein Teil eines T- Zell-Antigen-Rezeptors eines Säugers ist, umfassend das Einführen eines Klonierungsvektors oder eines Expressionsvektors, der eine erfindungsgemäße Nukleinsäure enthält, in einen geeigneten Wirt, das Kultivieren des resultierenden Wirtes unter geeigneten Bedingungen, die eine Expression des Polypeptids erlauben, und das Rückgewinnen des auf diese Weise exprimierten Polypeptids.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Ermittlung bereit, ob eine unbekannte Zelle eine T-Zelle ist, umfassend das Gewinnen von Nukleinsäure aus der unbekannten Zelle, das Kontaktieren der unbekannten Nukleinsäure mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure, die mit einem nachweisbaren Marker markiert ist, unter Bedingungen, die eine Hybridisierung erlauben, und das Feststellen, ob hybridisierte Sequenzen vorhanden sind.
Durch die vorliegende Erfindung werden ferner bereitgestellt ein isoliertes Polypeptid, das von einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure kodiert wird, wobei das Polypeptid ein Teil eines T-Zell- Rezeptors eines Säugers ist, und ferner ein isoliertes Polypeptid, das ein Teil eines T-Zell-Antigen-Rezeptors eines Säugers ist, wobei das Polypeptid mindestens 312 Aminosäuren umfaßt und am C-Terminus eine Sequenz von 58 Aminosäuren umfaßt, die identisch ist mit der in Fig. 3 dargestellten Aminosäuresequenz von der Position 255 bis zur Position 312.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner einen isolierten Antikörper bereit, der gegen eine T-Zell-Antigen-Rezeptor-spezifische antigene Determinante eines erfindungsgemäßen Polypeptids gerichtet ist.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren bereit zur Ermittlung, ob eine unbekannte Zelle eine T-Zelle ist, umfassend das Kontaktieren der unbekannten Zelle mit einem erfindungsgemäßen Antikörper unter Bedingungen, die die Bildung eines Antigen- Antikörper-Komplexes erlauben, und das Feststellen, ob ein Komplex vorhanden ist, und sie stellt ferner ein Verfahren bereit zum Nachweis des Vorhandenseins eines T-Zell-Antigen-Rezeptors in einer Probe, umfassend das Kontaktieren der Probe mit einem erfindungsgemäßen Antikörper unter Bedingungen, die die Bildung eines Antigen-Antikörper-Komplexes erlauben, und das Feststellen, ob ein Komplex vorhanden ist.
Die vorliegende Erfindung stellt eine klonierte cDNA bereit, die für humane lymphoide T-Zellen spezifisch ist. Es wurde gefunden, daß die Information (message) in T-Lymphoblasten, Thymozyten und mit Phytohaemmaglutinin stimulierten T-Lymphozyten des Menschen und der Maus exprimiert wird. Eine Analyse der von der Nukleotidsequenz abgeleiteten Aminosäuresequenz weist darauf hin, daß deren Größe und die relativen Positionen der Cysteinreste ähnlich sind wie bei der leichten Kette von Immunglobulin-Molekülen der Maus und des Menschen. Die Nukleotidsequenz der erfindungsgemäßen cDNA enthält einen Bereich umfassender Homologie gegenüber den variablen, verknüpfenden und konstanten Regionen der Leichtketten-Proteine von sowohl menschlichen als auch murinen Immunglobulinen. Diese Merkmale weisen darauf hin, das der cDNA- Klon mit einer Information korrespondiert, die einen Teil des humanen T-Zell-Rezeptors spezifiziert.
Vielfältige bevorzugte Merkmale und Ausführungsformen der Erfindung werden nachfolgend durch nicht-beschränkende Beispiele unter Bezugnahme auf die Zeichnungen näher erläutert, von denen:
Fig. 1 eine Northern Blot-Untersuchung von T- und nicht-T- Zell-RNA hinsichtlich ihrer Hybridisierung mit dem Klan YT35 ist;
Fig. 2 das Ergebnis einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese der in vitro-Translationsprodukte der mit den Klonen YT35 und YT76 hybridisierenden mRNA darstellt;
Fig. 3 eine Darstellung der Nukleotid- und abgeleiteten Aminosäuresequenz eines Teils des T-Zell-spezifischen Klons YT35 ist, bei der T für Thymin-Nukleotid, G für Guanin- Nukleotid, A für Adenin-Nukleotid und C für Cytosin- Nukleotid stehen;
Fig. 4 ein diagonaler Dot-Matrixvergleich zwischen der abgeleiteten Aminosäuresequenz des Klons YT34 gemäß Fig. 3 und der Aminosäuresequenz der leichten Ketten der Maus und des Menschen ist; und
Fig. 5 ein direkter Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenz des Klons YT35 gemäß Fig. 3 mit derjenigen der leichten λ-Ketten der Maus und des Menschen ist.
Bei dem zum Erhalt des cDNA-Klons angewendeten Verfahren wurde die humane leukämische T-Zell-Linie MOLT-3 verwendet (K. Nagasawa und T.W. Mak, (1982), Cell Immunol., 71, 390-403). Diese Zellinie ist dafür bekannt, daß sie T-Zell-spezifische Antigene enthält. Die Boten-RNA wurde aus MOLT-3-Zellen mittels Oligo- (dT)-Cellulose-Säulenchromatographie isoliert, und es wurde eine cDNA synthetisiert unter Anwendung des Verfahrens von Land et al. (Nucleic Acid Res., 9, (1981), 2251-2266). Unter Verwendung von mRNA aus MOLT-3-Zellen wurde doppelsträngige cDNA hergestellt und in die Bgl II-Stelle des Vektors pFP502EB5 (S.P. Clark und T.W. Mak, (1982), Nucleic Acid Res., 10, 3315-3330) eingefügt. Nach der Transfektion des E. coli-Stammes HB101 wurden 10.000 unabhängige cDNA-Klone erhalten. Eine zufällige Stichprobe von 25 dieser cDNA-Klone zeigte Längen der cDNA-Inserts zwischen 0,5 und 1,7 kb an.
Um hinsichtlich einer in T-Zellen entweder exklusiv oder präferentiell exprimierten cDNA zu screenen, wurden die cDNA-Klone auf der Grundlage ihrer relativen Expressionslevels in MOLT-3- Zellen und der humanen B-Zell-Linie HSC-58 gruppiert. Vier dieser Klone, nämlich YT30, YT35, YT53 und YT76, erwiesen sich mittels Northern-Gelanalyse als spezifisch für MOLT-3-Zellen. Eine einzelne Information von 1,3 kb wurde in MOLT-3-Zellen, nicht aber in HSC-58 nachgewiesen. Um festzustellen, ob diese Information für T-Zell-Linien im allgemeinen spezifisch war, wurden Hybridisierungen mit der RNA aus den folgenden Zellinien untersucht:
a) T-Zell-Linien Jurkat und CEM(T)
b) B-Zell-Linien RPM1 1788(B) und RPM1 3638(B)
c) Zellen von einem Patienten mit chronischer lymphozyterer B-Zell-Leukämie
d) die erythroleukämische Zellinie K562 und eine, die von H. Messner, Ontario Cancer Institute, erhalten wurde,
e) normale Knochenmarkszellen
f) Blasentumor-Zellinie MGHU-1.
Aus Fig. 1a wird deutlich, daß diese Information von 1,3 kb in sämtlichen der drei untersuchten T-Zell-Linien, nicht jedoch in irgendwelchen nicht-T-Zellen oder -Zellinien exprimiert wurde (Pfeil).
Die Expression dieser Informationen in anderen T- und B-Zellen des Menschen und der Maus wurden ebenfalls mit Northern-Gelanalysen untersucht. Die Ergebnisse, die in Fig. 1b zusammengefaßt sind, bestätigen das obige Ergebnis, daß gegenüber diesen cDNA- Klonen komplementäre Sequenzen in MOLT-3-T-Zellen, nicht aber in HSC-58-B-Zellen exprimiert wurden. Zusätzlich wurden die Klone in normalen humanen Thymozyten, mit Phytohaemmaglutinin (PHA) stimulierten humanen T-Zellen des peripheren Blutes, und der T- Zell-Linie RBL-5 der Maus exprimiert (Fig. 1b).
Diese Ergebnisse zeigen, daß die cDNA-Klone YT30, YT35, YT53 und YT76 von mRNA abstammen, die T-Zell-Linien gemeinsam haben.
Um die Größe des Proteins zu bestimmen, das von der mRNA kodiert wird, welche mit den T-Zell-spezifischen cDNA-Klonen korrespondiert, wurde die in vitro Hybridselektionsmethode von Parnes et al. angewendet ((1981), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 2253- 2257). Man ließ Gesamt-RNA aus MOLT-3 mit dem Klon YT35 oder YT76 annelieren. Nach einem Tag wurde die nicht angeheftete mRNA entfernt, und die hybridisierte mRNA wurde unter niedrigen ionischen Bedingungen freigesetzt und in vitro mit einem Kaninchenreticulozyten-Lysat translatiert. Das nach diesem Hybrid-Selektionsverfahren synthetisierte Protein ist in Fig. 2 dargestellt. Das Protein mit 30.000 Dalton (Pfeil) schien von der mRNA kodiert worden zu sein, die von dem T-Zell-spezifischen cDNA-Klon ausgewählt wurde, während das größere Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 45.000 Dalton auf das in vitro-Translationssystem zurückzuführen war.
Die Nukleotidsequenz des Klons YT35 wurde bestimmt unter Anwendung des Dideoxy-Kettenabbruch-Inhibitorverfahrens von Sanger et al. ((1977), Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 5463-5467). Eine vollständige Sequenz von 1151 Nukleotiden ist in Fig. 3 dargestellt. Eine Untersuchung dieser Sequenz führt zu einem langen offenen Leserahmen mit einem TGA-Terminationstriplett an der Position 974. In dem unteren Teil der Fig. 3 sind die Positionen für die Methionin-Kodons (Balken unterhalb der Linie) und Terminations- Kodons (Balken oberhalb der Linie) der drei Kodierungsrahmen dargestellt.
Ein Protein, das von dem ersten ATG-Methionin-Kodon in diesem Leserahmen (Position 38) initiiert wird, besitzt ein abgeleitetes Molekulargewicht von 34.938 Dalton, was mit den Ergebnissen der Hybridselektion und der in vitro-Translation allgemein übereinstimmt (Fig. 2). Es existieren in diesem Protein in der Nachbarschaft der N- und C-Termini Bereiche nicht-polarer, ungeladener Aminosäuren (überstrichen in Fig. 3). Die möglichen Stellen der N-Glykosylierung sind in Fig. 3 durch Unterstreichungen gekennzeichnet.
Um nachzuweisen, ob die abgeleitete Aminosäuresequenz des T- Zell-spezifischen Klons Ähnlichkeiten mit irgendeiner der Immunglobulin- oder T-Zell-verwandten Proteinsequenzen aufweist, wurden diese Proteine einer diagonalen Dot-Matrixanalyse zugeführt (Fig. 4). Es wurde gefunden, daß es einen langen Homologiebereich gab zwischen den aus dem Klon YT35 abgeleiteten Proteinsequenzen und einer leichten λ-Kette der Maus (Fig. 4a) und den leichten λ- und κ-Ketten des Menschen. Diese Homologie ist leichter erkennbar, wenn der Hintergrund vermindert wird, indem man nach einer Homologie von mehr als 35% über 21 auf einanderfolgende Aminosäuren sucht. Die resultierenden Graphiken (Fig. 4b, c und d) zeigen, daß es zwei Bereiche mit hoher Homologie gibt, wobei sich einer nahe der C-terminalen Seite der variablen Region und ein anderer nahe der N-terminalen Seite der konstanten Region befinden. Ein direkter Vergleich dieser Sequenzen ist in Fig. 5 dargestellt. Die Cysteinreste an den Positionen 42, 111, 166 und 231 von YT35 sind unterstrichen. Identische Bereiche der Sequenzen sind mit Sternchen (*) gekennzeichnet, und vertikale Linien ( ) bezeichnen konservative Veränderungen. Lücken (-) wurden eingeführt, um die Anzahl der Paarungen zu erhöhen. Um konservative Veränderungen zu identifizieren, wurden die Aminosäuren wie folgt eingeteilt -- sauer: Asparginsäure (D) und Glutaminsäure (E); basisch: Histidin (H), Lysin (K) und Arginin (R); ungeladen polar: Asparagin (N), Glutamin (Q), Serin (S) und Threonin (T); und unpolar: Alanin (A), Cystein (C), Phenylalanin (F), Glycin (G), Isoleucin (I), Leucin (L), Methionin (M), Prolin (P), Valin (V), Tryptophan (W) und Tyrosin (Y). Die in Fig. 4 nachgewiesene höchste Homologie korrespondiert mit der Region, die die Cysteinreste an den Positionen 111 und 166 in der Sequenz von YT35 umgibt. Die Sequenzen nahe der Cysteinreste an den Positionen 42 und 231 sind ebenfalls sehr ähnlich. In Fig. 5 ist ebenfalls die Homologie hervorgehoben, die über das gesamte YT35-Protein in Fig. 4a nachgewiesen wurde. Ein Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenz des Klons YT35 mit einem humanen Protein der leichten κ-Kette zeigte eine etwas geringere, aber leicht nachweisbare Homologie als gegenüber den leichten λ-Ketten (nicht dargestellt). Eine geringer ausgeprägte Homologie wurde gegenüber den schweren Ketten von Immunglobulinen des Menschen oder der Maus gefunden, es wurde aber keine signifikante Homologie gegenüber H-2, Thy-1 der Maus oder HLA des Menschen gefunden. Die gesamte Homologie über den Bereich von 249 Aminosäuren, der mit den leichten λ-Ketten überlappt, ist zu 33% identisch mit der leichten λ-Kette der Maus und zu 38% identisch mit der konstanten Region. Unter Berücksichtigung konservativer Veränderungen steigt die Homologie auf 59% bzw. 58%. Die entsprechende Homologie gegenüber der konstanten Region einer humanen leichten λ-Kette ist ähnlich und ist zu 36% bzw. 61% unter Berücksichtigung der konservativen Veränderungen identisch. Es ist wichtig darauf hinzuweisen, daß das von dem Klon YT35 kodierte Protein den leichten Ketten des Menschen und der Maus in gleicher Weise ähnlich ist, und daß die Ähnlichkeit am größten ist, wenn die leichten Ketten des Menschen und der Maus untereinander weitgehend konserviert sind. Ferner tritt die größte Homologie gegenüber den λ- und κ-Ketten an verschiedenen Positionen auf (Fig. 4).
Die vorgenannten Ergebnisse führen zu zwei wichtigen Befunden. Zum einen ist ein humaner T-Zell-spezifischer cDNA-Klon isoliert worden, und zum anderen ist nachgewiesen worden, daß das Protein in der von der Nukleotidsequenz abgeleiteten Form den Immunglobulin-Molekülen der leichten Kette des Menschen und der Maus ähnlich ist, da es ihnen in der relativen Lokalisierung der Cysteinreste gleicht, wobei es jedoch noch wichtiger ist, daß eine umfassende Homologie gegenüber den variablen, verknüpfenden, und konstanten Regionen gefunden werden kann. Diese strukturellen Merkmale zeigen einem Durchschnittsfachmann, daß das von YT35 kodierte Protein ein Teil des Antigen-Rezeptors ist, der die spezialisierte Funktion einer T-Lymphozyte vermittelt.
Eine Nukleinsäuresequenz von mindestens etwa 936 Nukleotiden kodiert für ein Polypeptid, das zumindest ein Teil des T-Zell- Antigen-Rezeptors ist, z. B. ein T-Zell-Antigen-Rezeptor eines Primaten, vorzugsweise ein humaner T-Zell-Antigen-Rezeptor. Die Nukleinsäure kann DNA, wie z. B. cDNA oder RNA sein. Eine derartige DNA-Sequenz ist zum Teil in Fig. 3 dargestellt. Andere derartige DNA-Sequenzen enthalten an ihrem 5'-Ende eine Sequenz von mindestens etwa 174 Basen, die identisch ist mit der in Fig. 3 dargestellten Sequenz von der Position 973 bis zur Position 800. Eine derartige DNA-Sequenz ist eine Sequenz, die gegenüber der in Fig. 3 dargestellten komplementär ist. Andere derartige RNA-Sequenzen enthalten an ihren 3'-Ende eine Sequenz von mindestens etwa 174 Basen, die gegenüber der in Fig. 3 dargestellten Sequenz von der Position 973 bis zur Position 800 komplementär ist.
Die Nukleinsäuresequenzen können eingesetzt werden als Sonden, wenn sie mit einem nachweisbaren Marker, wie z. B. einem radioaktiven, fluoreszierenden oder biotinylierten Marker markiert sind. Erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen können als markierte Sonden u. a. eingesetzt werden, um festzustellen, ob eine unbekannte Zelle, wie z. B. eine Tumorzelle, eine T-Zelle ist.
Eine erfindungsgemäße cDNA-Sequenz kann wie folgt hergestellt werden. Die gesamte Boten-RNA (mRNA) wird aus einer T-Zelle, wie z. B. einer MOLT-3-Zelle oder einer Thymozyte erhalten und zur Herstellung einer gegenüber der mRNA komplementären cDNA verwendet. Die cDNA wird in einen geeigneten Klonierungsvektor eingefügt, wie z. B. pBR322 oder pFP502EBS, welcher anschließend in einen geeigneten Wirt, wie z. B. E. coli eingeführt wird. Der resultierende Wirt wird kultiviert unter geeigneten Bedingungen, die eine Bildung multipler Kopien der cDNA zulassen, und die auf diese Weise hergestellte cDNA wird gewonnen und einem Screening zugeführt, um festzustellen, ob sie lediglich in T-Zellen exprimiert wird.
Wirtszellen, die einen geeigneten Klonierungsvektor enthalten, welcher eine für den T-Zell-Antigen-Rezeptor kodierende cDNA einschließt, können hergestellt und verwendet werden, um in Übereinstimmung mit dem Durchschnittsfachmann bekannten Verfahren das Rezeptor-Polypeptid herzustellen.
Die Erfindung betrifft ferner Polypeptide, die von den Nukleinsäuresequenzen kodiert werden, einschließlich eines Polypeptids, das mindestens ein Teil eines T-Zell-Antigen-Rezeptors ist und mindestens etwa 312 Aminosäuren gemäß Fig. 3 enthält. Andere Polypeptide von mindestens etwa 312 Aminosäuren, die an ihrem C- Terminus mindestens etwa 58 Aminosäuren enthalten, die mit der in Fig. 3 dargestellten Sequenz von der Position 255 bis zur Position 312 identisch sind, sind T-Zell-Rezeptor-Antigene. Derartige Polypeptide schließen mindestens eine Sequenz ein, die über 21 aufeinanderfolgende Aminosäuren eine Homologie gegenüber den leichten ic-Ketten der Maus und des Menschen von mindestens etwa 35% aufweist, wobei eine derartige Homologie gegenüber Sequenzen in den variablen, verknüpfenden und konstanten Regionen vorhanden ist.
Antikörper gegen die Polypeptide, wie z. B. monoklonale oder aus Serum abgeleitete Antikörper, können unter Anwendung der im Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden. Derartige Antikörper können eingesetzt werden, um die Anwesenheit eines T-Zell-Rezeptor-Antigens nachzuweisen, und um festzustellen, ob eine unbekannte Zelle, wie z. B. eine Tumorzelle, eine T- Zelle ist. Zu diesem Zweck wird die zu untersuchende Probe mit dem Antikörper unter geeigneten Bedingungen behandelt, die eine Bildung eines Antigen-Antikörper-Komplexes erlauben, und es erfolgt eine Bestimmung, ob ein Komplex vorhanden ist.

Claims

1. Isolierte Nukleinsäure, die für ein Polypeptid kodiert, das ein Teil eines T-Zell-Antigen-Rezeptors eines Säugers ist, wobei die Nukleinsäure mindestens 936 Nukleotide umfaßt und als DNA eine mit der in Fig. 3 dargestellten Sequenz von der Position 800 bis zur Position 973 identische Sequenz von 174 Desoxyribonukleotiden umfaßt, oder als RNA eine Sequenz von 174 Ribonukleotiden umfaßt, die mit der in Fig. 3 von der Position 800 bis zur Position 973 dargestellten Sequenz von 174 Desoxyribonukleotiden korrespondiert.

2. Nukleinsäure nach Anspruch 1, bei der die Nukleinsäure eine cDNA ist.

3. Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, oder das Komplement davon, welche(s) mit einem nachweisbaren Marker markiert ist.

4. Isolierte Nukleinsäure, die für einen Teil eines T-Zell- Antigen-Rezeptors eines Säugers kodiert, wobei die Nukleinsäure mindestens 936 Nukleotide umfaßt und sich mit einer Nukleinsäure oder dem Komplement davon gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 hybridisieren läßt.

5. Verfahren zur Herstellung einer cDNA gemäß Anspruch 2, umfassend das Gewinnen von mRNA aus einer T-Zelle eines Säugers, das Herstellen einer zu der mRNA komplementären cDNA, das Insertieren der cDNA in einen geeigneten Klonierungsvektor, das Einführen des Klonierungsvektors in einen geeigneten Wirt, das Kultivieren des resultierenden Wirtes unter Bedingungen, die eine Produktion von multiplen Kopien der cDNA erlauben, das Rückgewinnen der auf diese Weise hergestellten cDNA und das Screenen der cDNA, um nachzuweisen, ob sie lediglich in T-Zellen exprimiert wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem die T-Zelle eine MOLT-3- Zelle oder eine Thymozyte ist.

7. Verfahren nach Anspruch 5 oder Anspruch 6, bei dem der Klonierungsvektor pBR322 oder pFP502EB5 ist.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, bei dem der Wirt E. coli ist.

9. Klonierungsvektor oder Expressionsvektor, enthaltend eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1, 2 und 4.

10. Wirtszelle, die einen Klonierungsvektor oder einen Expressionsvektor gemäß Anspruch 9 enthält.

11. Mikroorganismus, der einen Klonierungsvektor oder einen Expressionsvektor gemäß Anspruch 9 enthält.

12. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, das zumindest ein Teil eines T-Zell-Antigen-Rezeptors eines Säugers ist, umfassend das Einführen eines Klonierungsvektors oder eines Expressionsvektors gemäß Anspruch 9 in einen geeigneten Wirt, das Kultivieren des resultierenden Wertes unter geeigneten Bedingungen, die eine Expression des Polypeptids erlauben, und das Rückgewinnen des auf diese Weise exprimierten Polypeptids.

13. Verfahren zur Ermittlung, ob eine unbekannte Zelle eine T- Zelle ist, umfassend das Gewinnen von Nukleinsäure aus der unbekannten Zelle, das Kontaktieren der unbekannten Nukleinsäure mit einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 3 unter Bedingungen, die eine Hybridisierung erlauben, und das Feststellen, ob hybridisierte Sequenzen vorhanden sind.

14. Isoliertes Polypeptid, das von einer Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1, 2 und 4 kodiert wird, wobei das Polypeptid ein Teil eines T-Zell-Rezeptors eines Säugers ist.

15. Isoliertes Polypeptid, das ein Teil eines T-Zell-Antigen- Rezeptors eines Säugers ist, wobei das Polypeptid mindestens 312 Aminosäuren umfaßt und am C-Terminus eine Sequenz von 58 Aminosäuren umfaßt, die identisch ist mit der in Fig. 3 dargestellten Aminosäuresequenz von der Position 255 bis zur Position 312.

16. Isolierter Antikörper, der gegen eine T-Zell-Antigen-Rezeptor-spezifische antigene Determinante eines Polypeptids gemäß Anspruch 14 oder Anspruch 15 gerichtet ist.

17. Antikörper nach Anspruch 16, der ein monoklonaler Antikörper oder ein aus Serum abgeleiteter Antikörper ist.

18. Antikörper nach Anspruch 17, bei dem die antigene Determinante bei einem Polypeptid gemäß Anspruch 14 oder Anspruch 15 einmalig ist.

19. Verfahren zur Ermittlung, ob eine unbekannte Zelle eine T- Zelle ist, umfassend das Kontaktieren der unbekannten Zelle mit einem Antikörper gemäß Anspruch 16 unter Bedingungen, die die Bildung eines Antigen-Antikörper-Komplexes erlauben, und das Feststellen, ob ein Komplex vorhanden ist.

20. Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins eines T-Zell-Antigen-Rezeptors in einer Probe, umfassend das Kontaktieren der Probe mit einem Antikörper gemäß Anspruch 16 unter Bedingungen, die die Bildung eines Antigen-Antikörper-Komplexes erlauben, und das Feststellen, ob ein Komplex vorhanden ist.

21. Monoklonaler Antikörper, der gegen eine T-Zell-Antigen-Rezeptor-spezifische antigene Determinante eines Polypeptids gemäß Anspruch 14 oder Anspruch 15 gerichtet ist.