DE68922582T2

DE68922582T2 - Klonierung und Expression eines Proteins, das die zellulare Reaktion auf Interferon vom Typ I moduliert.

Info

Publication number: DE68922582T2
Application number: DE68922582T
Authority: DE
Inventors: Marc Fellous; Michel Revel; Lester Shulman
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 1988-11-14
Filing date: 1989-11-14
Publication date: 1995-09-07
Anticipated expiration: 2009-11-15
Also published as: JP3156724B2; WO1990005737A1; ATE122393T1; DE68922582D1; FI903577A0; US5358867A; NO903118L; ES2071675T3; AU4666189A; DK169890A; CA2002862C; NO311181B1; IL88377A; AU628895B2; ZA898680B; CA2002862A1; NO903118D0; DK169890D0; JPH03503366A; IL88377A0

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die molekulare Klonierung eines Gens, das ein Polypeptid codiert, welches die zellulare Reaktion auf Interferon vom Typ I moduliert, wobei ein derartiges Polypeptid ein putativer Bestandteil des TYP-I-Interferon- Rezeptorsystems und die Expression des Gens in einem geeigneten Wirt ist. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Polypeptid an sich, seine aktiven Analoga und Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden mit derartigen Eigenschaften.

Stand der Technik

Menschliche Zellen und mäuseartige Zellen können zur Herstellung dreier Klassen Interferon (IFN) induziert werden, die als Alpha, Beta und Gamma auf der Grundlage ihrer antigenen Eigenschaften und der Art der sie erzeugenden Zelle bezeichnet werden. Diese IFNs induzieren wiederum eine Anzahl von Veränderungen in menschlichen Zellen, die zur Ausbildung eines antiviralen, Antitumor-, und/oder antizellularen Zustands führen und eine Anzahl von Änderungen in der Zellmembran verursachen einschließlich der Induktion und/oder erhöhten Expression der wichtigsten Gewebeverträglichkeit- Komplex-Antigene (MHC). Lindhal, P. et al (1973), "Enhancement by interferon of the expression of surface antigens on murine leukemia L 1210 cells", Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 70, Seiten 2785-2788; und Fellous, M. et al (1982), "Interferon-dependent induction of mRNA for the major histocompatability antigens in human fibroblast and lymphoblastoid cells", Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 79, Seiten 3082 bis 3086. Die meisten oder alle dieser Veränderungen werden durch das Signal ausgelöst, das durch Wechselwirkung der IFNs und ihren Zelloberflächenrezeptoren erzeugt wird.
Untersuchungen zur direkten Ligandenbindung und Untersuchungen zur Bindungsortkonkurrenz sowie indirekt immunologische und genetische Untersuchungen somatischer Zellen zeigen, daß die drei IFN-Klassen mit interferonempfindlichen Zellen über eine spezifische Bindung mit einem von zwei Arten von Hochaffinitätsrezeptoren auf der Zelloberfläche wechselwirken (abgehandelt in Rubinstein, M. und Orchansky, P. (1985), "The Interferon Receptors", CRC Critical Reviews in Biochemistry, 2, Seite 249). Alle menschlichen IFN-α und menschlichen IFN-β (Typ-I-IFNs) binden sich an einen Chromosom 21-codierten Typ-I-Rezeptor, während menschliches IFN-γ (Typ-II- IFN) sich mit einem Chromosom 6-codierten Typ-II-Rezeptor bindet, der ein Chromosom 21-codiertes Genprodukt zur Verleihung der Empfindlichkeit benötigt. Der für die MHC-Induktion benötigte IFN-Rezeptor und der IFN-Rezeptor, der die Antiviralzustand-(AVS)-Induktion auslöst, haben gemeinsame antigene Bestimmungsgrößen und sind auf dem menschlichen Chromosom 21 codiert.
Das Molekulargewicht des menschlichen Typ-I-IFN-Rezeptors wurde auf 95-140 kDa geschätzt, und zwar auf der Grundlage von Experimenten bei denen Zellmembranen mit gebundenem ¹²&sup5;I-IFN vernetzt und auf SDS-PAGE betrieben werden (Razziudin, A. et al. (1984), Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 81, Seiten 5504 bis 5508 und Thompson, M.R. et al. (1985), J. Biol. Chem., 260, Seiten 563 bis 571). Es gibt einige Anhaltspunkte dafür, daß der Rezeptor ein Glykoprotein ist und die niedrigeren Werte näher bei der Größe des Polypeptides an sich liegen können.
Hiermit wird keiner der zitierten Schriften zugestanden, daß sie als stichhaltiger Stand der Technik herangezogen werden kann. Alle hier zitierten Veröffentlichungen sind hiermit durch Verweis aufgenommen.

Zusammenfassung der Erfindung

Trotz des beachtlichen Interesses an dem Interferon-System und der Klonierung der α- und β-Interferon-Gene vor einigen Jahren, wurde der Typ-I-Rezeptor weder aus der Natur isoliert und gereinigt noch mit Hilfe von Techniken auf der Grundlage rekombinanter DNA hergestellt.
Es war aufgrund ihrer Knappheit (einige tausend Molekule pro Zelle) und der Abwesenheit von Zellinien mit einer vergrößerten Anzahl von Rezeptoren nicht möglich, IFN-α-, β-Rezeptoren mittels direkter Proteinreinigung zu isolieren. Um diese Schwierigkeit zu überwinden, gingen die Erfinder dieser Erfindung das Problem über DNA-vermittelten Gentransfer an. Indem man Mauszellen mit menschlicher Genom- DNA umwandelte und Zellklone auswählte, die eine verstärkte Fähigkeit zur zellularen Reaktion auf menschliches α- und β-IFN erworben haben, wurde das Gen für einen Proteinbestandteil des Typ-I-IFN-Rezeptorsystems erfolgreich isoliert. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben sich dazu entschlossen, den Anstieg an H2-Antigenen der Zelloberfläche als ein Mittel zum Isolieren menschlicher IFN-Reaktionszellen zu verwenden.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine DNA-Sequenz mit der DNA-Sequenz, die ein Protein codiert, das die zellulare Reaktion auf Interferon vom Typ I moduliert und somit ein putativer Bestandteil des menschlichen Typ-I-Interferon-Rezeptorsystems ist. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel bezieht sie sich auf die cDNA von Fig. 1 mit dem Codierungsbereich 899-3253.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf einen DNA-Vektor, der die DNA der Erfindung enthält, und vorzugsweise auf einen Expressionsvektor, der im wesentlichen aus dem Plasmid pSVE3-L7 besteht, das die mit dem Affenvirus (SV) 40-Genfrühpromotor verbundene cDNA von Fig. 1 enthält.
Sie bezieht sich weiterhin auf vorzugsweise eukaryotische Wirtszellen, z.B. Säugetierzellen, die mit einer erfindungsgemäßen DNA derart umgewandelt wurden, daß sie es den Wirtszellen gestatten, das dem menschlichen Typ-I-IFN-Rezeptor zugeordnete Polypeptid zu exprimieren, und auf das somit exprimierte Polypeptid.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist die Nukleotidsequenz des putativen cDNA-Klons L7 des Typ-I-Interferon- Rezeptorbestandteils. Die Codierungssequenz ist identifiziert, und die vorhergesagte Translation in Aminosäuren ist gegeben.
Fig. 2 ist eine schematische Darstellung eines bevorzugten Protokolls zur Klonierung von Proteinen, welche die zellulare Reaktion auf Interferon vom Typ I modulieren, wobei derartige Proteine putative Bestandteile des menschlichen Typ-I-IFN-Rezeptorsystems sind.
Fig. 3 ist eine Restriktionskarte der L7-cDNA, welche die strukturelle Beziehung zwischen drei Molukülen, die zum Heranziehen von Antikörpern verwendet werden, und dem L7-Protein veranschaulicht.
Fig. 4 ist ein Balkendiagramm, das die Verstärkung der L7-cDNA-Expression in CHO- Zellen mittels Methotrexat (MTX) zeigt, und zwar exprimiert als die Reaktion von Zellen auf menschliches IFN (d.h. Faltungszunahme von (2'-5')-A-Synthetase). Die Faltungszunahme für CHO-pSVL7-Klone, die mit jeder MTX-Konzentration ausgewählt wurden, wurde durch Vergleich mit Steuer-CHO-DHFR-Klonen berechnet, die derselben Behandlung unterworfen wurden. Die (2'-5')-A-Synthetasezunahrne in nichtverstärkten Klonen (0 MTX) war zweimal größer als bei CHO-DHFR, und in der Ordinate wird dieser Wert als 1 zum Vergleich mit den verstärkten Klonen genommen.
Fig. 5 ist ein Diagramm, das die (2'-5')-A-Synthetaseaktivität in CHO-pSVL7- Transformanten (bei 300 nM MTX) gegenüber der Aktivität in CHO-DHFR- Steuerungen für Zellen darstellt, die entweder durch menschliches IFN-β (Quadrate) oder Hamster-IFN (Kreuze) induziert sind. Fig. 5B zeigt eine vergrößerte Darstellung der Daten von Fig. 5A.
Fig. 6 ist eine FACS-Analyse von Daudi-Zellen, die mit Rhodamin-konjugiertem Protein A in Gegenwart von Kaninchen-Anti-L7-(PSN)-Antikörpern angelärbt wurden. Die Abszisse trägt willkurliche Fluoreszenzeinheiten, und die Ordinate stellt die Anzahl der Zellen dar. Die linke Seite zeigt Lichtstreuung, woraus man sieht, daß es keine Unterschiede der Zellgröße mit oder ohne Anti-L7 gibt. Die rechte Seite zeigt Rhodamin- Fluoreszenz: die beiden Kurven mit dem Peak bei 60 sind Zellen ohne Kaninchen- Antiserum oder mit normalem (nicht-immunen) Kaninchen-Serum; die Kurve mit dem Peak bei 110 stammt von Zellen mit Anti-L7-Antiserum. Die Verschiebung zeigt, daß alle Daudi-Zellen L7 auf ihrer Oberfläche haben.
Fig. 7 ist ein Balkendiagramm, das die Bindung von menschlichem IFN-α an Daudi- Zellen und die Auswirkung unterschiedlicher Zusätze auf diese Bindung zeigt. Kaltes IFN-β hält gut mit, ebenso wie Antikörper für Zellen mit Chromosom 21 (< chr.21), doch wirken Anti-L7-Antikörper (< L7) nicht hemmend. NRS und NMS sind gewöhnliches Kaninchen- bzw. Maus-Serum.

Genaue Beschreibung der Erfindung

Rezeptoren für Zytokine oder andere Proteinhormone sind Proteinmoleküle an der Oberfläche von Zellen, die mit einem in der extrazellularen Umgebung vorhandenen Liganden (d.h dem Zytokin oder Hormon) spezifisch wechselwirken und ein Signal in die intrazellulare Kammer übertragen, um die biologsiche Wirkung des Liganden zu bewirken. Bekannte Rezeptoren für Zytokine (z.B. Interleukin-2 (IL2), Interferon-γ (IFN-γ)) bestehen aus mehreren unterschiedlichen Proteinketten, die zusammen das Rezeptorsystem bilden. Die Funktion dieser Proteinketten ist es 1) den Liganden spezifisch mit hoher Affinität zu binden, 2) mit dem aktiven Ort des Liganden, der oft eine Formänderung erzeugt, wechselzuwirken, und 3) ein Signal in die intrazellulare Kammer zu transduzieren. Ein Zusammenwirken zwischen den unterschiedlichen, das Rezeptorsystem bildenden Proteinen wird als eine notwendige Voraussetzung für diese Funktionen betrachtet. Zum Beispiel erfordert die Hochaffinitätsbindung von IL-2 zwei Komponenten (Hatakeyama M. et al (1989), "Interleukin-2 receptor β chain gene: Generation of three receptor forms by cloned human α and β chain cDNAs", Science, 244, 551-556). Das Typ-II-Interferon-Rezeptorsystem besteht aus zumindest zwei Komponenten: einer Bindungseinheit und einer Übertragungseinheit (Langer J.A. and Pestka S., (1988) "Interferon receptors", Immunology Today, 9, 393-400). Es ist wanrscheinlich, daß das Typ-I-IFN-Rezeptorsystem in ähniicher Weise aus mehreren Proteinen zusammengesetzt ist, die bei der artenspezifischen Bindung von IFN, bei der Wechselwirkung mit aktiven IFN-Orten und der Transduktion des Signals mitwirken, das die Transkription spezifischer Gene aktiviert.
Es ist im Stand der Technik zwar bekannt, ein Interferon mit seinem Zelloberflächenrezeptor zu verbinden, doch kann dieses Verfahren nicht praktisch verwendet werden, um transformierte Zellen, die den Typ-I-Rezeptor tragen, zu identifizieren oder um eine ausreichende Menge Rezeptor zu erhalten, um ihn zu reinigen und zu charakterisieren, da die Anzahl Rezeptoren pro Zelle gering ist (üblicherweise weniger als 5000). Darüber hinaus hätte dieses Verfahren das L7-Protein nicht identifiziert, da es IFN nicht mit einer hohen Affinität zu binden scheint.
Gemäß einem Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zum Identifizieren eines Gens, das einen Rezeptorbestandteil für ein Zytokin, insbesondere ein Interferon und speziell ein Typ-I-Interferon codiert, das die Notwendigkeit des Versuchs vermeidet, ein markiertes Zytokin mit einem Oberflächenrezeptor zu vernetzen, der durch die transformierten Zellen exprimiert wird, und daraufhin durch Erfassung der gebundenen Markierung Zellen, die einen solchen Rezeptor exprimieren, von denjenigen, die dies nicht tun, zu unterscheiden. Die vorliegende Erfindung beruht vielmehr auf der Fähigkeit des Zytokins, eine erfaßbare Veränderung der Zellenoberflächencharakteristik zu induzieren. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel ist diese Veränderung eine antigene Veränderung. Die Veränderung kann eine Erhöhung oder Verringerung eines oder mehrerer Antigene sein. Bei Interferon ist z.B. eine solche Veränderung eine Zunahme der MHC-Antigene; man bevorzugt, die erhöhte Expression des H2-Antigens zu erfassen, doch können andere MHC-Antigene ähnlich erfaßt werden, wie z.B. β2-Mikroglobulin oder MHC-Antigene der Klasse II.
Dieses Verfahren hat gegenüber dem oben diskutierten Verfahren mehrere Vorteile. Erstens ist es in der Lage, zytoplasmatische Rezeptoren, und nicht nur Zelloberflächenrezeptoren, zu identifizieren. Zweitens ist es in der Lage, Rezeptoren zu identifizieren, die nur indirekt mit dem entsprechenden Ligand wechselwirken, und zwar nicht nur diejenigen, die den Liganden direkt binden. Schließlich stellt es sicher, daß die ausgewählten Klone in der Lage sind, auf den Liganden zu reagieren. Das einfache Verfahren kann Klone auswählen, die ein Molekül exprimieren, das Interferon bindet, löst jedoch aufgrund dieser Wechselwirkung keine weitere zellulare Aktivität aus.
Vorzugsweise wird das Zelloberflächen-Antigen von einem Antikörper, speziell einem monoklonalen Antikörper erkannt. In gewissen Fällen kann jedoch ein Bindungsmolekul einer unterschiedlichen Klasse, wie z.B. ein Lektin oder ein Enzym, geeignet sein. In einem der Ausführungsbeispiele muß das Bindungsmolekul markiert sein. Jede bei der Erstellung von Analysen bekannte Markierung, wie z.B. eine Radiomarkierung, eine Enzymmarkierung oder Fluoreszenzmarkierung, kann verwendet werden; die Fluoreszenzmarkierung wird bevorzugt. Die Markierung kann direkt oder indirekt, kovalent oder nicht-kovalent befestigt werden. Alternativ kann das Bindungsmolekul an einem Affinitätschromatographle-Halter angebracht werden, und Zellen, die den Rezeptor tragen, können dann über ihre Affinität von denjenigen, die ihn nicht tragen, getrennt werden.
Die Trennung der gewünschten Klone von den anderen transformierten Zellen wird vorzugsweise mittels fluoreszenzaktivierter Zellauslese (FACS) erzielt. Der Wert der Expression der erfaßten Oberflächenstruktur muß natürlich innerhalb der Empfindlichkeitsgrenzen der FACS liegen, üblicherweise über 20.000 Molekule pro Zelle.
Das Gen des Rezeptorbestandteils muß von DNA getrennt werden, die Gene ohne Bezug zueinander sowie Sequenzen ohne Codierungsfiinktion enthält. Die abzuscheidende DNA kann Genom-DNA oder cDNA sein. Sie kann von dem gesamten Genom des Spenders oder von einem ausgewählten Chromosom abgeleitet werden. Sie kann mit DNA einer bestimmten Größe angereichert sein. Die DNA kann in die Wirtszelle durch einfache Transfektion von DNA-Bruchstücken eingebracht werden, oder die DNA- Bruchstücke können zu einem geeigneten viralen oder plasmiden Vektor subkloniert werden, der dann verwendet wird, um die Wirtszelle zu transformieren.
Die zur Abscheidung verwendete Wirtszelle ist vorzugsweise eine solche, die vor der Transformation mit einem fünktionellen Gen des Rezeptors nicht in der Lage ist, auf das Interferon (oder ein anderes zutreffendes Zytokin) zu reagieren. Es kann jedoch eine Wirtszelle mit einem niedrigen Reaktionswert verwendet werden, wenn die genetische Veränderung die zur erfassende Reaktion wesentlich erhöht. Da Interferone artenspezifisch sind, bevorzugt man bei der Suche nach dem menschlichen Gen des IFN- Rezeptorbestandteils die Verwendung einer nicht-menschlichen Wirtszelle.
Sobald das Gen des Rezeptorbestandteils isoliert worden ist, lassen sich nicht-natürlich auftretende Analoga des Rezeptorbestandteils durch ortspezifische Mutagenese des Gens oder durch chemische Behandlung (z.B. mit proteolytischen Enzymen) leicht gewinnen. Analoga, bei denen die Wahrscheinlichkeit besteht, daß sie fünktionell sind, können durch sorgfältige Untersuchung der Sequenz identifiziert werden. Zum Beispiel ist es wahrscheinlicher, daß potentielle Phosphorylierungs- und Transmembranbereiche für die Aktivität wesentlich sind. Es ist besser, eine Aminosäure durch eine mit ähnlicher Größe und mit ähnlicher Ladung als mit einer völlig unterschiedlichen zu ersetzen.
Die N- und C-Enden können abgeschnitten werden, um zu bestimmen, welches für die Aktivität notwendig ist.
Das Gen des Rezeptorbestandteils kann mit einem nicht-nativ zugeordneten Promotor verbunden sein, der konstitutiv oder induzierbar ist. Der bevorzugte Promotor ist der SV40-Frühpromotor. Die Codon-Auswahl des Gens kann verändert werden, damit sie mit den Codon-Präferenzen des Wirts übereinstimmt, um eine unerwünschte Sekundärstrukturbildung auszuschließen oder um weitere Änderungen des Gens zu erleichtern, indem man Schnittstellen erzeugt oder entfernt. Das Gen kann in jede beliebige Wirtszelle eingeführt werden.
In einem besonders bevorzugten Ausführungsbeispiel wurde gescherte menschliche DNA in LTK&spplus;-Mauszellen zusammen mit einem Herpes-Virus-TK-Gen eingeführt, und LTK&spplus; transfizierte Mauszellen, die auf menschliche Typ-I-IFNs reagieren, wurden mittels fluoreszenzaktivierter Zellauslese (FACS) ausgewählt. Es wurde die indirekte anstatt der direkten FACS-Auslese für Rezeptorbestandteile verwendet, weil die Anzahl der Typ-I-IFN-Rezeptoren/Zellen geringer ist als die durch FACS-Analyse erfaßbare. Die IFN-induzierte Zunahme der MHC-Antigene an der Zelloberfläche wurde für die Verwendung als Markierung zur Trennung von Reaktionszellen verwendet.
Es wurden speziell Zellen abgeschleden, welche biologisch aktive Rezeptorbestandteile exprimieren, wie durch eine erhöhte 112-Expression nach einer Behandlung von HAT- resistenten Zellen mit menschlichem Typ-I-IFN nachgewiesen wurde. Dies ist ein Ansatz, der von dem gelieferten Nachweis gestützt wird, daß menschliches IFN die Maus- H2-Expression in somatischen Mensch x Maus-Zellhybriden regelt, welche menschliche IFN-Rezeptoren exprimieren. Es wurden Zellen kultiviert und die FACS-Auslese wiederholt. Die Menge menschlicher DNA in den Mauszellen wurde verringert, indem man eine sekundäre Transfektion unter Verwendung von DNA von menschlichen IFN- empfindlichen klonierten Zellen von den primären Transfektionen durchführte. Es wurden den Rezeptorbestandteil exprimierende sekundäre Transfektanten mittels FACS- Abscheidung, wie oben beschrieben, erhalten.
Es wurden Genom-DNA-Banken aus DNA hergestellt, die von den sekundären Transfektanten unter Verwendung des Bakteriophagen EMBL3 extrahiert wurde. Menschliche DNA-Restriktionsenzym-Bruchstücke von diesen Phagen wurden mittels Südfleck- Analyse (Southern Blot analysis) analysiert, um einzigartige Sequenzen zu erhalten, die in menschliches Chromosom 21 enthaltenden Zellen exprimiert sind. Eine Phagenabtrennung enthielt ein einzigartiges 2,1 kb EcoR1-Restriktions-Bruchstück, das von menschlichem Chromosom 21 zu stammen scheint, und zwar auf der Grundlage von Differentialhybridisierung zu Genom-DNA von Mauszellen gegenüber menschlicher plazentaler DNA und DNA von einer somatischen Mensch x Maus-Zellinie, bei der menschliches Chromosom 21 das einzige beibehaltene menschliche Chromosom war. Daß dies in der Tat ein Stück des menschlichen Chromosoms 21 war, wurde durch sein Hybridisierungsmuster auf Impulsfeld-Gelflecken bestätigt, wobei DNA von somatischen Mensch x Maus- und Mensch-Hamster-Zellhybriden mit und ohne menschlichem Chromosom 21 verwendet wurde. Mittels Nordfleck-(Northern Blot)-Hybridisierung wurde gezeigt, daß dieses einzigartige Bruchstück mit menschlicher Poly-A&spplus;-RNA hybridisiert, die groß genug ist, um den Rezeptorbestandteil zu codieren. Dieses Stück wurde zu Plasmidvektor pGEM 4 subkioniert und zur Durchsicht einer von Clonetech Laboratories (Palo Alto, Calif.,) gekauften cDNA-Bank für menschliche Plazenta λgt11 verwendet. Es wurden sieben cDNA-Klone isoliert. Die menschliche DNA wurde in den Bluescript-Plasmidvektor von Stratagene Cloning Systems (San Diego, Calf.) subkloniert.

Beispiel 1: Isolierung des putativen Gens des Typ-I-IFN-Rezeptorbestandteils

Maus-LM TK&supmin;-Zellen (denen das Enyym Thymidylat-Kinase, TK fehlt) wurden mit einer gesamten menschlichen DNA von den T-Zellen-Leukämie-Molt-4-Zellen unter Verwendung eines Plasmids pAGO transfiziert, welches die Herpes-Simplex-Virus-TK&supmin;- cDNA als auswählbare Markierung in einem Hypoxanthln-Aminopterin-Thymidin- (HAT)-Auswahlmedium enthält. LM-TK&spplus;-Zellen wurden 200 U/ml menschlichem IFN- β ausgesetzt und mit monoklonalem Antikörper Anti-H2Kk12-41 (siehe Rosa, et al. (1986) Interferon, 7, 47-87, Academic Press, durch Verweis aufgenommen) und mit FITC-(Fab')-Kaninchen-Antimaus-IgG angefarbt. Unter Verwendung eins Zytofluorographen 50HH (Orthodiagnostics) wurden die am meisten fluoreszierenden 10% Zellen steril ausgelesen, woraufhin man sie erneut wachsen ließ und einer zweiten Ausleserunde unterwarf. Vorläufige Experimente ergaben, daß die zweimal ausgelesene Population mit Zellen angereichert war, die auf menschliches IFN-α oder -β (aber nicht γ) in Mehrfachversuchen reagieren, wie z.B. der Induktion der (2'-5')-Oligo-A-Synthetase, der Widerstandsfähigkeit gegenüber vesikularem Stomatitis-Virus und der '25I-IFN-α- Bindung. Klone mit diesem Phänotypen werden durch Verdünnen abgeleitet.
Polyklonale und monoklonale Antikörper für Maus-Mensch-Hybride, die nur das menschliche Chromosom 21 enthalten, welche die Bindung und die Reaktion auf menschliches (aber nicht Maus-) IFN hemmen (siehe Razziudin et al., weiter oben zitiert), blockierten die H2-Zunahme durch menschliches IFN in den positiven Klonen, was ein Indiz für das Vorhandensein des menschlichen IFN-Oberflächenrezeptors ist. DNA eines solchen primären Transformanten wurde in neue LM-TK-Zellen transfiziert, und man erhielt sekundäre Transformanten unter Verwendung der pAGO zur Auslese. Bei sekundären Transformanten wurde die FACS-Auslese wie oben erneut durchgeführt, und nach drei Zyklen wurden Klone durch Verdünnung abgeleitet und menschliche IFN-Reaktionszellen durch die oben beschriebenen Versuche identifiziert. Es wurde DNA aus Subklon-Kulturen hergestellt, die gleichzeitig auf(2'-5')-Oligo-A- Synthetase-Induktion durch menschliches IFN untersucht wurden. Die Subklonierung oder die wiederholte FACS-Auslese erwiesen sich als notwendig, um beständige Werte der Phänotyp-Reaktion aufrecht zu erhalten. Ein Klon mit dem Namen βII-19-26 wurde für die weitere Analyse ausgewählt.
Eine Südfleck-Analyse mit einer Sonde aus einer gesamten menschlichen DNA zeigte, daß der Gehalt an menschlicher DNA in einigen der Klonen niedrig genug war, um eine versuchte molekulare Klonierung der transformierenden DNA zu gewähren. Eine Genom-Bank wurde auf dem Klon βII-19-26 unter Verwendung des EMBL-3-Vektors hergestellt und mit einer gesamten menschlichen DNA als Sonde durchsucht. Es wurden ungefähr 20 EMBL-3-Phagen gereinigt, die menschliche repetitive DNA enthielten. Von den beiden das stärkste Signal abgebenden Phagen (15-4 und 6-40) wurden Bam- HI-Restriktions-Bruchstücke mit 2,1 und 1 kb isoliert, welche keine repetitive DNA enthielten. Eine Südfleck-Analyse von Genom-DNA bestätigte, daß diese Bruchstücke mit menschlicher, jedoch nicht mit Maus-DNA hybridisierten. Die Mehrheit der Phagen mit menschlicher DNA aus der βII-19-26-Bank hybridisierten mit dem BamHI- Fragment mit 2,1 kb (Sonde 6-40-3), was ein Indiz dafür ist, daß dies ein Hauptbestandteil der menschlichen DNA in den βII-19-26-Zellen ist. Der chromosonale Ursprung der 6-40-3-Sonde wurde durch Hybridisierung mit Süd-DNA-Flecken von Maus-Mensch- und Hamster-Mensch-Hybriden bestimmt, die bestätigten, daß die 6-40- 3-Sonde ein 300 kb-NotI-Bruchstück identifiziert, das von dem Chromosom 21 herrührt. Das 6-40-3-BamHI-Bruchstück mit 2,1 kb überlagert zwei EcoRI-Bruchstücke mit 2 und 4 kb, wobei die gesamte Länge der Einfügung in dem Phagen 6-40 16 kb ist. DNA aus Transformanten-Subklonen, die entweder auf menschliches IFN reagieren oder denen der Phänotyp fehlt, wurden mit 6-40-3 untersucht; nur Reaktionszellen zeigten eine spezifische Hybridisierung mit der Sonde.
Um zu bestimmen, ob die 6-40-3-Sonde Teil einer Transkriptionseinheit war, untersuchten wir eine λgt11-cDNA-Bank aus menschlicher Plazenta mit dieser Sonde. Es wurden sieben positive cDNA-Klone in den 2 x 10&sup6; Phagen identifiziert. Ein Klon (L7) hat eine EcoRI-Einfügung von 3,9 kb, was ein Indiz für eine lange Transkriptionseinheit ist. Dies wurde an Nordflecken bestätigt, bei denen dieselbe Sonde eine RNA mit 4,5 kb und ein größeres Band mit 5,1 kb erfaßte. Die EcoRI-Einfügung des cDNA-Klons L7 mit 3,9 kb wurde in einen Bluescript-Vektor (Stratagen Co.) subkloniert und E. coli TCl-fählge Bakterien wurden mit diesem L7-BS2-Vektor transformiert. Diese transformierten Bakterien wurden mit der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (C.N.C.M.), Paris, Frankreich, am 14. November 1988 unter der Zugriffsnummer C.N.C.M. 1-816 in Übereinstimmung mit dem Budapester Vertrag hinterlegt. Subkulturen werden der Öffentlichkeit zur Verfügung gestellt, wie es der Vertrag verlangt, doch kann aus der Hinterlegung keine Lizenz abgeleitet werden.
Die Subklonierung wurde in zwei Orientierungen durchgeführt. In Retikulozyt-Lysate translatierte T7-RNA-Polimerase-Transkribenten erzeugten ein Protein mit 100 kd in einer Orientierung, jedoch nicht der anderen. Ein Protein mit 62 kD wurde durch die gleichen Transkribenten hergestellt, die das Protein mit 100 kD erzeugen, und können von einem internen ATG-Codon translatiert werden.

Beispiel 2: Charakterisierung des klonierten Dutativen TYP-I-IFN- Rezeptorbestandteils

Die Nukleotid-Sequenz der L7-cDNA wurde durch Sequenzierung dicht beieinanderliegender Ausschnitte von beiden Strängen in dem Bluescript-Vektor erstellt. Die in Fig. 1 gezeigte Sequenz ist ein Indiz für eine RNA aus 3.870 Nukleotiden, denen ein Poly- A-Anhang folgt. Ein offener Ableserahmen beginnt bei Nukleotid 899 und endet bei 3.253, wodurch ein Protein aus 785 Aminosäuren codiert wird. Der Ort des Codierungsbereichs 899 bis 3.253 wurde durch Translation eines Ausschnitt-Transkribenten in Retikulozyt-Lysaten bestätigt.
Die Länge des Proteins läßt ein Moluklargewicht von 86.000 voraussagen, das nahe bei den unteren, durch Gel-Elektrophorese berechneten Werten liegt. Aus der Elektrophorese des Translationsprodukts der L7-cDNA in Retikulozyt-Lysat scheint sich zu ergeben, daß das Protein langsamer wandert als bei einem offensichtlichen Molekulargewicht von 100.000 theoretisch zu erwarten wäre. Dies läßt sich durch die große Anzahl saurer Aminosäuren in der Sequenz erklären.
Ein interessantes Merkmal des L7-Proteins ist ein Bereich aus 12 aneinanderliegenden Serinen, die von 6 Glutaminsäuren flankiert sind (Basen 1.710 bis 1.760 in Fig. 1). Dieser Bereich konnte phosphoryliert werden. Ein potentieller Transmembranbereich mit 15 ungeladenen Aminosäuren liegt von den Nukleotiden 3.056 bis 3. 100 in Fig. 1 vor. Ein hydrophobes Signalpeptid beobachtet man an dem N-Ende des Proteins. Diese Merkmale stimmen mit dem Ort dieses Proteins in der Zellmembran, wie für den Typ-I- IFN-Rezeptor erwartet, überein. Es gibt keine signifikante Homologie zwischen der L7-Protein-Sequenz und dem IFN-γ-Rezeptor oder irgendeinem anderen bekannten Gen.
Da der endgültige Beweis der Identität den Nachweis der erworbenen Empfindlichkeit gegenüber menschlichem IFN in nicht-menschlichen Zellen, die mit diesem cDNA-Klon transfiziert worden sind, erfordert, wurden Übergangs- und stabile Transfektionen des an den SV40-Frühpromotor angehefteten cDNA-Gens in verschiedenen nicht-menschlichen Zellinien analysiert.
Um die biologische Aktivität des durch die L7-cDNA codierten Proteins zu prüfen, wurde ein Expressionsvektor pSVE3-L7 konstruiert, der die gesamte an den Affenvirus 40-Genfrühpromotor fusionierte L7-cDNA enthielt. Zur Übergangsexpression wurde dieses Plasmid in Mauszellen transfiziert, und 24 Stunden später wurden die Zellen mit 500 U/ml menschlichem IFN-β1 behandelt oder unbehandelt gelassen (Benech, P., et al. (1987), Mol. Cell. Biol., 7, Seiten 4498 bis 4504). Nach weiteren 24 Stunden wurden Zellextrakte hergestellt, und (2'-5')-Oligo-A-Synthetase wurde, wie beschrieben, gemessen (Revel M. et al. (1981), Meth. Enzymol. 79, Seite 143). Die (2'-5')-Oligo-A- Synthetase-Aktivität in mit menschlichem IFN behandelten transfizierten Zellen minus derjenigen in nicht behandelten Zellen wurde berechnet. Wie in Tabelle 1 gezeigt, war diese Zunahme in den Zellen, die den die L7-cDNA enthaltenden Expressionsvektor empfangen hatten, gegenüber den Zellen, die den leeren Expressionsvektor empfangen haften, im Durchschnitt 4,5 mal höher. Die letzteren zeigten keine signifikante Zunahme gegenüber Zellen, die überhaupt keine DNA erhalten hatten (Tabelle 1).
Es wurden stabile Transformanten von chinesischen Hamster-Eierstockzellen (CHO) durch Cotransfektion der cDNA hergestellt, die an den SV40-Frühpromotor und an das DHFR-Gen enthaltende Vektoren angeheftet ist. Klonale Zellpopulationen wurden von der Transfektion nach geeignteter Auswahl abgetrennt, und diese klonalen Linien wurden auf die Anwesenheit von cDNA hin und auf eine Reaktion auf menschliches IFN-β durchsucht, wie durch Induktion von (2'-5')-A-Synthetase gezeigt. Klone, die aufgrund von Südfleck-Analyse L7-DNA enthalten und auf 100 U/ml menschliches IFN-β&sub1; aufgrund von (2'-5')-A-Synthetase-Induktion oberhalb von CHO-DHFR&spplus;-Zellen reagieren, wurden abgetrennt und einer Verstärkung durch schrittweise Auslese mit Methotrexat (MTX) unterworfen. In Klonen, die gegenüber MTX mit 50 nM oder, besser noch, 300 nM resistent sind, wird die L7-RNA-Expression durch Nordflecken von gesamter RNA erfaßbar. Die Reaktion auf 100 U/ml menschliches IFN-β&sub1; ist in den MTX-Klonen mit 50 nM 4 bis 5 mal höher als in CHO-Zellen, die nur pSVBHFR enthalten, die ähnlich verstärkt wurden (Tabelle 2). Bei MTX mit 300, 750 und 1.000 nM zeigten die CHO-DHFR+L7-Klone eine Zunahme der Reaktion auf menschliches IFN-β im Vergleich zu der stärksten Reaktion in CHO-DHFR-Steuerungsklonen, welche durch MTX ähnlich behandelt wurden (Fig. 4). Die Amplitude der Reaktion auf menschliches IFN-β nimmt daher bei Genverstärkung um einen Faktor 8 zu. Die Reaktion derart verstärkter Klone auf 100 U/ml menschliches IFN war ungefähr 15% von derjenigen auf 20 U/ml Hamster-IFN.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben daraus geschlossen, daß, obwohl die Expression der L7-cDNA unter der 5V40-Promotorsteuerung zu einer erhöhten Reaktion der Zellen auf menschliches IFN führt, die Amplitude der Reaktion gering bleibt.
Dies ergibt sich entweder aufgrund von Problemen der Expression des Proteins oder aufgrund der Tatsache, daß das L7-Protein nur ein Teil des IFN-Rezeptorsystems ist. Die letztere Möglichkeit erscheint wahrscheinlicher, da eine signifikante Bindung menschlichen ¹²&sup5;I-IFN-α mit hoher Affinität an die CHO-Transformanten nicht nachgewiesen werden konnte. Wenn der Rezeptor aus mehr als einer Kette besteht, kann die Bindungsaffinität in Gegenwart von nur einer der Proteinketten sehr gering sein.
Daß das L7-Protein ein Bestandteil des IFN-Rezeptors ist, der nicht direkt für die artenspezifische Bindung menschlichen IFN's verantwortlich ist, erkennt man weiterhin durch die Tatsache, daß in den verstärkten CHO-pSV7-Klonen die Reaktion auf Hamster-IFN auch zunahm. Fig. 5 zeigt, daß eine geringe Konzentration von Hamster- oder menschlichem IFN, die eine geringe Stimulierung der (2'-5')-A-Synthetase-Aktivität in dem Steuer-CHO-DHFR-Klon (Abszisse) erzeugen, ein CHO-pSV7-Klon (MTX mit 300 nM) eine 5 mal stärkere Reaktion mit jeder der beiden IFN-Arten ergab (die gerade Linie in Fig. 5 ist die Linie, die man erwartet, wenn beide Klone gleich reagieren). Bei höheren IFN-Konzentrationen, die eine höhere Induktion von (2'-5')-A-Synthetase erzeugen, war die Differenz zwischen dem CHO-pSVL7- und dem CHO-DHFR-Klon weniger ausgeprägt. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben daraus geschlossen, daß das Vorhandensein von mehr L7-Protein auf der Oberfläche es den Zellen ermöglicht, auf niedrige Konzentrationen von IFN besser zu reagieren. Dieses Ergebnis stimmt mit der Hypothese überein, daß L7 eine der Ketten des Typ-I-IFN-Rezeptorsystems ist, das beim Weiterleiten des Signals innerhalb der Zelle wirkt.

Beispiel 3: Antikörper für L7-Protein zeigen das Protein auf der Oberfläche von Zellen

Ein 27 Aminosäuren langes Peptid nahe bei dem Amino-Ende des L7-Proteins (Fig. 3) wurde synthetisiert, zu KLH konjugiert und zum Heranziehen von Kaninchen-Antiseren verwendet. Die Antikörper wurden an einer Säule aus festgelegten Peptiden gereinigt und in Westflecken (Western Blots) verwendet. In Daudi- und U937-Zellen wird ein Protein mit 130 kDa in Triton-X-100-Deoxycholat-Lysaten und in Membranpräparaten erfaßt. Dies ist wahrscheinlich eine glykosylierte Form von L7, die einen N- Glykosylationsort in der Nähe des N-Endbereichs hat. Eine Immunopräzipitation war jedoch mit den Peptid-Antikörpern nicht möglich.
Die L7-cDNA wurde über das Codon 113 mit dem Protein-A-Gen in dem Vektor pRIT-2 (Pharmacia Fine Chemicals) fusioniert und in E.coli. exprimiert. Die füsionierten Proteine PSN und PN2 (Fig. 3), die an einer Immonoglobulinsäule gereinigt wurden, wurden zur Immunisierung verwendet, um polyklonale Kaninchen-Antikörper für das L7-Protein zu erzeugen. Diese Antikörper immunopräzipitierten von menschlichen Daudi-Zellen, die während 7 Stunden mit 35-Methlonin, Hauptbändern mit 80-85 kDa und Unterbändern von ungefähr 140 kDa markiert wurden. Die Bänder mi 80-85 kDa können Formen des Proteins sein, die einen Teil des N-Endbereichs verloren haben, der von den obigen Anti-Peptid-Antikörpern erkannt wurde.
Mit dem Kaninchen-Antiserum gegen L7 (Anti-PSN und PN2) kann man zeigen, daß sich das L7-Protein auf der Oberfläche menschlicher Lymphoblastoid-Zellen (Daudi) befindet. Fig. 6 zeigt eine fluoreszenzaktivierte Zellauslese-Analyse (FACS), welche das Vorhandensein von L7 auf der Oberfläche von Daudi-Zellen zeigt. Die rechte Seite zeigt, daß man mit Rhodamin-Isothlozyanat-markiertem Protein A allein oder mit gewöhnlichem Kaninchenserum einen Fluoreszenzpeak bei 60 willkürlichen Einheiten erhält. Mit hinzugefügtem Anti-L7-Serum wird jedoch der Fluoreszenzpeak zu höheren Werten hin verschoben (Durchschnitt 110), woran sich zeigt, daß sich die Anti-L7- Antikörper an die Zellen binden und somit mehr Rhodamin-markiertes Protein A befestigt wird. Die Form der Kurven zeigt, daß alle Daudi-Zellen das L7-Protein an ihrer Oberfläche tragen.
Die Anti-L7-Antikörper hemmten die Bindung von ¹²&sup5;I-IFN-α&sub2; an menschliche Lymphoblastoid-Daudi-Zellen nicht. Fig. 7 zeigt, daß die Bindung durch kaltes IFN-β durch Antikörper gegen Maus-Mensch-Hybridzellen, welche nur Chromosom 21 (< chr.21) enthalten, jedoch nicht durch Anti-L7 (< L7) noch durch gewöhnliches Kaninchen-Serum (NRS) oder gewöhnliches Maus-Serum (NMS) gehemmt wurden. Das L7- Protein scheint daher mit der Bindung von IFN-α an diese menschlichen Zellen nicht verwickelt zu sein. Dies würde das L7-Protein von dem mit IFN-α auf menschlichen Zellen vernetzten Protein unterscheiden (Razziudin et al., zitierte Stelle). Es ist nicht ausgeschlossen, daß das Protein, welches IFN-α bindet, sich von demjenigen unterscheiden kann, welches IFN-β bindet. Da das L7-Protein durch seine Wirkung auf die Reaktion von Zellen auf IFN-β identifiziert wurde, wurde ein Versuch unternommen, um herauszufinden, ob L7 mit IFN-β vernetzt werden könnte. Da eine Radio- Iodination von aktivem IFN-β nicht erfolgreich war, wurde kaltes IFN-β mit Daudi- Zellen mittels Suberimidat-Behandlung verbunden, und die elektrophoretische Beweglichkeit des L7-Proteins (durch Immunoflecken mit Anti-Peptid erfaßt) wurde analysiert, um zu bestimmen, ob sie durch diese Behandlung abnahm. In einem Experiment wurde ein langsameres Band mit 150 kDa zusätzlich zu dem L7-Protein mit 130 kDa beobachtet, doch gelang es in zwei weiteren Experimenten nicht, dieses Phänomen zu zeigen.

Schlußfolgerungen:

Die Identifizierung des L7-Proteins als ein Protein, welches die zellulare Reaktion auf Interferon vom Typ I und einem Bestandteil des Typ-I-IFN-Rezeptorsystems moduliert, beruht auf dem Folgenden:
1. Die Übergangsexpression der L7-cDNA veranlaßt Mauszellen, eine stärkere Reaktion auf menschliches IFN-β zu entwickeln.
2. Stabile Transformanten von Hamster-CHO-Zellen mit der L7-cDNA zeigen eine verstärkte Reaktion auf IFN. Die Zunahme ist mit der Verstärkung der integrierten L7- DNA korreliert. Die verstärkte Reaktion zeigt sich mit menschlichem Hamster-IFN und ist bei geringen Konzentrationen von IFN stärker ausgeprägt, wodurch die Schlußfolgerung nahegelegt wird, daß L7 die Affinität der Zellen zu IFN erhöht.
3. Das L7-Protein befindet sich auf der Oberfläche menschlicher Zellen.
4. Das Gen, welches das L7-Protein codiert, ist auf dem Chromosom 21 in dem Bereich (q22), der dem/den Typ-I-Rezeptor-Gen(en) mittels somatischer Zellgenetik zugeordnet wird.
Wie in dem Fall anderen Zytosine (z.B. IL-2, IFN-y), wird der Typ-I-IFN-Rezeptor wahrscheinlich aus mehreren unterschiedlichen Proteinketten gebildet. Das L7-Protein ist wahrscheinlich eine Komponente des Typ-I-IFN-Rezeptorsystems und mit der Reaktion von Zellen auf IFN verwickelt. Es ist wahrscheinlich nicht die Kette des Rezeptorsystems, die menschliches IFN auf artspezifische Weise bindet. Es ist wahrscheinlicher, daß es eine Kette des Rezeptors ist, der das durch die Bindung von IFN erzeugte Signal erhöht.
Die Identifizierung des L7-Proteins gestattet es, daß man seine Struktur-Funktion- Beziehung studiert, um ein abgewandeltes L7-Protein mit dem Ziel zu erzeugen, die Reaktion von Zellen, Geweben oder ganzen Organismen auf Interferon des α- oder β- Typs zu erhöhen oder zu verringern, und mittels der Technolgogie der rekombinanten DNA lösliches oder Lipid-gebundenes L7-Protein zu erzeugen, das als Konkurrent gegen IFN wirken kann. Diese Erfindungen können auf pathologische Situationen angewandt werden, bei denen man wünscht, die Reaktion auf diese Arten von Interferonen entweder zu erhöhen oder zu verringern (z.B. Autoimmunverfahren, chronische und akute Infektionen, Tumore und Leukämien, etc.).
Es können z.B. L7-Protein-Bruchstücke oder Analoga, die mit IFN wechselwirken, oder anti-diotypische Antikörper, die gegen Antikörper für das L7-Protein herangezogen wurden, in einen Patienten injiziert werden, wobei sie als "Köder" für alle anwesenden Interferon-Molekule wirken. Gentherapie mit funktionellen Rezeptorgenen läßt sich anwenden, um mehr Rezeptoren bereitzustellen und dadurch die Reaktion auf das IFN zu erhöhen.
Es versteht sich, daß, obwohl hler ein einzelnes spezifisches Protein und das genetische Material dazu beschrieben wird, die vorliegende Erfindung nicht darauf beschränkt ist. Es wurde durch die hler beschriebenen experimentellen Ergebnisse gezeigt, daß das Protokoll zum Extrahleren von Genmaterialcodierung für ein Protein, das die zellulare Reaktion auf Interferon moduliert, effektiv ist. Der Durchschnittsfachmann versteht, daß, wenn dieses Protokoll wiederholt wird, unterschiedliche Proteine, die auch die zellulare Reaktion auf Interferon modulieren und bei denen es wahrscheinlich ist, daß sie andere Ketten des Typ-I-Rezeptorsystems aufweisen, erhalten werden können. Obwohl das Protokoll für Proteine spezifisch ist, die eine erhöhte H2-Antigen-Produktion verursachen, kann man mit Sicherheit damit rechnen, daß zusätzliche, von den hier beschriebenen spezifischen Proteinen unterschiedliche auch derartige Eigenschaften haben. Die vorliegende Erfindung ist dazu bestimmt, alle von ihnen generisch abzudecken.
Außerdem kann das Verfahren der vorliegenden Erfindung auch unter Verwendung anderer Markierungen für Interferon-Aktivität, wie z.B. anderen Änderungen der durch Interferon verursachten Zelloberflächen-Charakteristik, zur Erfassung der Interferon- Rezeptorsystem-Bestandteile wiederholt werden. Derartige Charakteristiken können erhöhtes β2-Microglobulin oder MHC-Antigene der Klasse II beinhalten. Wenn diese Techniken verwendet werden, erhält man auch Proteine, welche die zellulare Reaktion auf Interferon modulieren. Solche gereinigten Proteine und das genetische Material zu deren Codierung gehören auch der vorliegenden Erfindung an.
Es ist bekannt, daß jedes in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung erhaltene Protein die zellulare Reaktion auf Interferon moduliert. Dies ist definitionsgemäß wahr, da es diese Eigenschaft ist, die die Auswahl des genetischen Materials lenkt. Obwohl man glaubt, daß alle derartigen Proteine Teil des Interferon-Rezeptorsystems sind, wünscht es der Anmelder nicht, auf eine derartige Theorie begrenzt zu werden. Es ist jedoch bekannt, daß derartige Proteine nicht nur Interferon-Induktoren angesichts ihrer Aktivität bei der Reaktion auf Interferon sind, sondern auch bei dessen Erzeugung.
Die vorhergehende Beschreibung der spezifischen Ausführungsbeispiele offenbart den allgemeinen Charakter der Erfindung derart, daß andere durch Anwendung bekannten Wissens derartige spezifische Ausführungsbeispiele ohne weiteres abwandeln und/oder für verschiedene Anwendungen anpassen können, ohne von dem generischen Konzept abzuweichen. Es ist daher die Absicht, derartige Anpassungen und Abänderungen im Rahmen der Bedeutung und des Äquivalenzbereichs der offenbarten Ausführungsbeispiele mit aufzunehmen. Es versteht sich, daß die hierin verwendete Wahl der Ausdrücke und Begriffe dem Zwecke der Beschreibung und nicht der Begrenzung dient. Tabelle 1: Zusammenfassung von Übergangstransfektionen mit pSVE3-L7 Zunahme der (2'-5')-A-Synthetase durch menschliches IFN-β&sub1; Zellen pSVE3-Vektor cpm Schein-Transfektion Balb/c Mittelwert * Faltungszunahme durch pSVE3-L7 gegenüber pSVE3-Vektor allein bei der Reaktion transfizierter Zellen auf menschlisches IFN-β1 (500 U/ml). * Faltungszunahme von durch den pSVE3-Vektor übertragenen Zellen gegenüber nicht-transfizierten Zellen. Tabelle 2: (2'-5')-A-Synthetase-Induktion in CHO-Zellen, die durch pSVDHFR allein (Steuerung) oder durch pSVDHFR und pSVE3-L7-cDNA transformiert wurden; verstärkt durch 50 nM - MTX (2'-5')-A-Synthese-Aktivität CHO transformiert durch Vektor Anzahl der untersuchten Klone kein IFN cpm Induktion menschliches IFN-β, verwendet bei 100 Einheiten/ml.

Claims

1. Molekül aus rekombinanter DNA mit einer DNA-Sequenz, die ein Protein kodiert, das die zellulare Reaktion auf Interferon vom Typ I modulieren kann, wobei die Sequenz mit dem Kodierungsbereich 899-3253 von Fig. 1 im wesentlichen homolog ist.

2. Molekül nach Anspruch 1, das ein Protein kodiert, das die zellulare Reaktion auf Interferon vom Typ I modulieren kann, wie sie durch eine Zunahme der 2',5'-Oligosynthetase-Aktivität gemessen wird.

3. Molekül nach Anspruch 1, bei dem die DNA-Sequenz weiterhin einen Promotor aufweist, mit dem die DNA-Sequenz nicht nativ in Verbindung steht, wodurch das durch die DNA kodierte Protein exprimiert werden kann.

4. Molekül nach Anspruch 3, bei dem der Promotor der SV40-Frühpromotor ist.

5. Zelle mit einer transformierten Zelle, die durch ein Molekül aus rekombinanter DNA nach Anspruch 3 transformiert wurde, oder deren Abkömmling, der die durch das DNA-Molekül verliehene genetische Information enthält.

6. Verfahren zur Herstellung des durch den Bereich 899-3253 der DNA-Sequenz von Fig. 1 kodierten Proteins, mit Kulturzellen nach Anspruch 5 unter Bedingungen, die zur Expression des durch das DNA-Molekül kodierten Proteins ausreichen.

7. Rekombinanter Vektor mit einem DNA-Molekül nach Anspruch 1 und weiterhin mit einem derart positionierten Promotor, daß die Expression des durch das DNA- Molekül kodierten Proteins möglich ist.

8. Zelle mit einer transformierten Zelle, die durch einen rekombinanten Vektor nach Anspruch 7 transformiert wurde, oder deren Abkömmling, der die durch den Vektor verliehene genetische Information enthält.

9. Verfahren zur Herstellung des durch den Bereich 899-3253 der DNA-Sequenz von Fig. 1 kodierten Proteins, mit Kulturzellen nach Anspruch 8 unter Bedingungen, die zur Expression des durch das DNA-Molekül kodierten Proteins ausreichen.

10. Nicht-menschliche Zelle, die ein menschliches Gen enthält, welches den Kodierbereich 899-3253 von Fig. 1 beinhaltet.

11. Verfahren zur Herstellung eines Proteins, das eine Komponente des Typ-I- Interferon-Rezeptorsystems ist, das die zellulare Reaktion auf Interferon vom Typ I moduliert, mit Kulturzellen nach Anspruch 5 in einem geeigneten Kulturmedium unter Bedingungen, die zur Expression des Proteins führen, und zur Gewinnung des Proteins aus den Zellen oder aus dem Kulturmedium.

12. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem die Expression des Proteins durch Methotrexat-Auswahl verstärkt wird, wobei die Zellen DHFR+ sind.

13. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem die Zellen CHO-Zellen sind.

14. Protein, das durch den DNA-Kodierbereich 899-3253 von Fig. 1 kodiert wurde, in zumindest teilweise gereinigter Form.

15. Nicht-natürlich auftretendes Bruchstück oder dergleichen des Proteins, das durch den Kodierbereich 899-3253 der DNA von Fig. 1 kodiert wurde, wobei das Bruchstück oder dergleichen zumindest einen Teil der Fähigkeit des Moleküls beibehält, die zellulare Reaktion des Proteins auf Interferon vom Typ I zu modulieren, wie sie durch eine Zunahme der 2',5'-Oligosynthetase-Aktivität gemessen wird.