FI104495B - Soluvastetta tyypin I interferonille mukauttavan proteiinin kloonaus ja ilmeneminen - Google Patents

Description

104495

Soluvastetta tyypin I interferonille mukauttavan proteiinin kloonaus ja ilmeneminen 5 Tämä keksintö koskee sellaisen geenin molekulaarista kloonausta, joka koodaa poly-peptidiä, joka mukauttaa soluvastetta tyypin I interferonille. Tällainen polypeptidi on tyypin I interferonin reseptorijärjestelmän oletettu aineosa, ja keksintö koskee geenin ilmenemistä sopivassa isännässä. Tämä keksintö koskee menetelmää polypeptidin ja sen aktiivisten analogien aikaansaamiseksi.

10

Ihmisen ja hiiren soluja voidaan indusoida tekemään kolmea interferoniluokkaa (IFN), joita nimitetään alfaksi, beetaksi ja gammaksi niiden antigeenisten ominaisuuksien ja niitä tuottavan solutyypin perusteella. Nämä IFN:t puolestaan indusoivat ihmisen soluissa lukuisia muutoksia, jotka johtavat antivirus-, antisyöpäkasvain- ja/tai antisoluti-15 lan luomiseen, ja aiheuttavat solukalvossa lukuisia muutoksia, joihin kuuluvat major histocompatibility complex (MHC) -antigeenien induktio ja/tai lisääntynyt ilmeneminen. Lindhal, P. et ai. (1973), "Enhancement by interferon of the expression of surface antigens on murine leukemia L 1210 cells," Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 70, pp. 2785-2788; ja Fellous, M. et al. (1982), "Interferon-dependent induction of mRNA for 20 the major histocompatibility antigens in human fibroblast and lymphoblastoid cells," Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 79, pp. 3082-3086. IFNiien ja niiden solupintareseptori-en vuorovaikutus aiheuttaa signaalin, joka laukaisee useimmat tai kaikki näistä muutoksista.

25 Suorat ligandisitoutumistutkimukset ja sitoutumispaikkakilpailututkimukset yhtä hyvin kuin epäsuorat immunologiset ja somaattisen solun geneettiset tutkimukset osoittavat, että kolme IFN-luokkaa ja interferonille herkät solut vaikuttavat toisiinsa sitoutumalla erityisesti toiseen solun pinnalla olevaan korkea-affiniteettireseptorityyppiin (selostettu julkaisussa Rubinstein, M. ja Orchansky, P. (1985), "The Interferon Reseptors," 30 CRC Critical Reviews in Biochemistry, 2 p. 249). Kaikki ihmisen IFN-alfat ja ihmisen IFN-β (tyypin I IFN:t) sitoutuvat kromosomin 21 koodaamaan tyypin I reseptoriin, kun taas ihmisen IFN-gamma (tyypin Π IFN) sitoutuu kromosomin 6 koodaamaan tyypin II reseptoriin, joka vaatii kromosomin 21 koodaaman geenituotteen antaakseen herkkyyden. MHC-induktioon vaadittavalla IFN-reseptorilla ja IFN-reseptorilla, joka 35 laukaisee antivirustila(AVS)-induktion, on yleiset antigeeniset determinantit ja niitä koodaa ihmisen kromosomi 21.

2 104495

Ihmisen tyypin I IFN-reseptorin molekyylipainon arvioidaan olevan 95-140 kDa kokeiden perusteella, joissa '25I-IFN:ää sitonut solukalvo ristiliitetään ja ajetaan SDS-PAGE:lla (Razziudin, A. et ai. (1984), Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 81, pp. 5504-5508 ja Thompson, M.R. et ai. (1985), J. Biol. Chem., 260, pp. 563-571). On joitakin 5 todisteita siitä, että reseptori on glykoproteiini ja alemmat arvot voivat olla lähempänä itse polypeptidin kokoa.

Ei ole tehty mitään myönnytyksiä siitä, että mikään tässä siteerattu viite kelpuutettaisiin relevantiksi tekniikan tasoksi. Kaikki tässä siteeratut julkaisut liitetään täten viit-10 teenä.

Huolimatta huomattavasta mielenkiinnosta interferonijärjestelmään, ja alfa- ja beeta-interferonigeenien kloonauksesta useita vuosia sitten, tyypin I reseptoria ei ole eristetty luonnosta ja puhdistettu, eikä sitä ole tuotettu yhdistelmä-DNA-tekniikoiden avulla. 15

Ei ole ollut mahdollista eristää IFN-a,p-reseptoreja suoran proteiinipuhdistuksen avulla johtuen niiden vähäisyydestä (muutama tuhat molekyyliä solussa) ja siitä, ettei ole solulinjoja, joissa olisi monistunut määrä reseptoreja. Jotta voitettaisiin tämä vaikeus, tämän keksinnön keksijät lähestyivät ongelmaa DNA-välitteisen geenisiirron 20 avulla. Transformoimalla hiiren solut ihmisen genomin DNA:lla ja valikoimalla so-lukloonit, jotka ovat saaneet lisääntyneen kyvyn reagoida ihmisen alfa- ja beeta-IFN:ään, eristettiin menestyksellisesti tyypin I IFN-reseptorijärjestelmän proteiiniaine-osageeni. Tämän keksinnön keksijät valitsivat käytettäväksi solupinnan H2-anti-geenien lisäyksen keinoksi ihmisen IFN:lle reagoivien solujen eristämiseksi.

25 Tämä keksintö koskee DNA-jaksoa, joka sisältää DNA-jakson, joka koodaa proteiinia, joka mukauttaa soluvastetta tyypin I interferonille ja on täten ihmisen tyypin 1 interferonin reseptorijärjestelmän oletettu aineosa. Suositussa suoritusmuodossa se koskee kuvion 1 cDNA:ta, joka sisältää koodaavan alueen 899-3253.

30 Tämä keksintö koskee myös DNA-vektoria, joka sisältää tämän keksinnön DNA:n, ja mieluummin ilmenemisvektoria, joka koostuu pääasiallisesti pSVE3-L7-plasmidista, joka sisältää kuvion 1 cDNA:n fuusioituneena Simian-virus(SV)40:n aikaisen geenin promoottoriin.

Lisäksi se koskee isäntäsoluja, mieluummin eukaryoottisia, esimerkiksi nisäkässoluja, jotka transformoidaan tämän keksinnön DNA: 11a tavalla, joka sallii isäntäsolun ilmen- 35 3 104495 tää kyseessä olevaa ihmisen tyypin I IFN-reseptoriin liittyvää polypeptidiä, ja täten ilmentyvää polypeptidiä.

Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.

5

Kuvio 1 on oletetun tyypin I interferonin reseptoriaineosan L7-cDNA-kloonin nu-kleotidijakso. Koodaava jakso tunnistetaan ja annetaan emäsjärjestyksestä ennustettu aminohappojakso.

10 Kuvio 2 on kaavamainen kuva suositusta menetelmästä, jolla kloonataan proteiineja, jotka mukauttavat soluvastetta tyypin I interferoneille. Tällaiset proteiinit ovat ihmisen tyypin I IFN-reseptorijärjestelmän oletettuja aineosia.

Kuvio 3 on L7-cDNA:n restriktiokartta esimerkkinä rakenteellisesta suhteesta kol-15 men vasta-aineiden synnyttämiseen käytetyn molekyylin ja L7-proteiinin välillä.

Kuvio 4 on pylväskaavio, joka esittää L7-cDNA-ilmenemisen monistumisen CHO-soluissa metotreksaatin (MTX) avulla ilmaistuna soluvasteena ihmisen 20 IFN:lle, (se on (2'-5')-A-syntetaasin moninkertaisuuden kasvu). CHO- pSVL7-kloonien, jotka oli valikoitu jokaisen MTX-konsentraation avulla, moninkertaisuuden lisääntyminen laskettiin vertaamalla kontrolli-CHO-DHFR-ldooneihin, jotka oli pantu alttiiksi samalle käsittelylle. (2'-5')A-syntetaasin lisääntyminen monistamattomissa klooneissa (0 MTX) oli kak-25 sinkertainen verrattuna CHO-DHFR:ään, ja ordinaatassa tätä arvoa pide tään 1 verrattaessa monistettuihin klooneihin.

Kuvio 5A on graafinen piirros (2'-5')A-syntetaasin aktiivisuudesta CHO-pSVL7-transformanteissa (300 nM MTX) verrattuna aktiivisuuteen CHO-DHFR-30 kontrolleissa soluille, jotka on indusoitu joko ihmisen IFN-β avulla (neliöt) tai hamsterin IFN:n avulla (ristit). Kuvio 5B esittää suurennetun piirroksen kuvion 5A tiedoista.

Kuvio 6 on FACS-analyysi Daudi-soluista, jotka on värjätty rodamiiniin konjugoi-35 dulla proteiini-A.lla kanin anti-L7(PSN)-vasta-aineiden läsnäollessa. Abs- kissassa on mielivaltaiset fluoresenssiyksiköt ja ordinaatassa on solujen lukumäärä. Vasemmassa kentässä on vähäistä hajontaa, mikä osoittaa, ettei solukoossa ole eroja anti-L7:n kanssa tai ilman sitä. Oikea kenttä esittää ro- 4 104495 damiini-fluoresenssiä: 60 kohdalla huippunsa saavuttavat kaksi käyrää ovat soluja, joissa ei ole kanin antiseerumia tai niissä on normaalia kanin seerumia, joka ei ole immuunia; 110 kohdalla huippunsa saavuttava käyrä on soluista, joissa on anti-L7-antiseerumia. Siirtymä osoittaa, että kaikilla 5 Daudi-soluilla on pinnallaan L7:ää.

Kuvio 7 on pylväsdiagrammi, joka esittää ihmisen IFN-a:n sitoutumista Daudi-soluihin ja eri lisäämisten vaikutusta tähän sitoutumiseen. Kylmä IFN-β kilpailee, ja samoin kilpailevat vasta-aineet soluista, joissa on kromosomi 10 21 (< kr. 21), mutta anti-L7-vasta-aineet (< L7) eivät estä.

NRS on normaali kanin seerumi ja NMS on normaali hiiren seerumi.

Sytokiniinien ja muiden proteiinihormonien reseptorit ovat solujen pinnalla olevia 15 proteiinimolekyylejä, jotka erityisesti vuorovaikuttavat ligandin kanssa (se on syto-kiniini tai hormoni), jota on solun ulkopuolisessa ympäristössä ja nämä reseptorit kuljettavat signaalin solun sisälle toteuttaakseen ligandin biologisen toiminnan. Tunnetut sytokiniinireseptorit (esimerkiksi interleukiini-2 (IL-2), interferoni-γ (IFN-γ)) koostuvat useista eri proteiiniketjuista, jotka yhdessä muodostavat reseptorijärjestelmän. 20 Näiden proteiiniketjujen tehtävä on 1) sitoa ligandia erityisesti korkealla affiniteetilla, 2) vuorovaikuttaa ligandin aktiivisen paikan kanssa, mikä usein tuottaa rakenteellisen muutoksen, ja 3) transdusoida signaali solunsisäiseen osastoon. Reseptorijärjestelmän muodostavien eri proteiinien välistä yhteistyötä pidetään vaatimuksena näille tehtäville. Esimerkiksi IL-2:n korkea-affmiteettisitominen vaatii kaksi osatekijää (Ha-25 takeyama M, et ai (1989), "Interleukin-2 receptor β chain gene: Generation of three receptor forms by cloned human a and β chain cDNAs", Science, 244, 551-556). Tyypin II interferonin reseptorijärjestelmä koostuu ainakin kahdesta osatekijästä: sito-misyksiköstä ja transdusoivasta yksiköstä (Langer J.A. ja Pestka S., 81988) "Interferon receptors", Immunology Today, 9, 393-400). On todennäköistä, että tyypin I IFN-30 reseptorijärjestelmä koostuu samalla tavalla useista proteiineista, jotka liittyvät IFN:n .. lajinomaiseen sitomiseen, vuorovaikutukseen aktiivisen IFN-paikan kanssa ja signaa lin transdusoimiseen, mikä aktivoi erityisten geenien transkription.

Vaikka alalla on tunnettua ristiliittää interferoni sen solupintareseptoriin, tätä mene-35 telmää ei voi reseptorien alhaisen lukumäärän vuoksi (tyypillisesti vähemmän kuin 5 000) käytännössä käyttää transformoitujen solujen tunnistamiseen, joissa on tyypin I • reseptori, tai kelvollisen reseptorin hankkimiseksi sen puhdistamista ja luonnehtimista 5 104495 varten. Lisäksi tämä menetelmä ei tunnistaisi L7-proteiinia, koska se ei näytä sitovan IFN.ää korkealla affiniteetilla.

Yhdessä näkökohdassa tämä keksintö koskee menetelmää, jolla tunnistetaan geeni, jo-5 ka koodaa sytokiniinin, erityisesti interferonin, reseptorin osatekijää, ja aivan erityisesti tyypin I interferonin reseptorin osatekijää, jolloin ei tarvitse yrittää ristiliittää leimattua sytokiniiniä pinnan reseptoriin, jota transformoidut solut ilmentävät ja sitten sitoutuneen leiman perusteella erottaa solut, jotka ilmentävät tällaista reseptoria, niistä soluista, jotka eivät ilmennä. Sen sijaan tämä keksintö on riippuvainen sytokiniinin 10 kyvystä aiheuttaa huomattava muutos solupinnan tunnusomaisessa piirteessä. Suositussa suoritusmuodossa tämä muutos on antigeeninen muutos. Tämä muutos voi olla yhden tai useamman antigeenin lisääntymistä tai vähenemistä. Esimerkiksi interferonille yksi tällainen muutos on MHC-antigeenien väheneminen; on suosittua osoittaa H2-antigeenin lisääntynyt ilmeneminen, mutta muita MHC-antigeeneja voidaan sa-15 maila tavalla saada selville, kuten esimerkiksi p2-mikroglobuliini tai luokan II MHC-antigeeneja.

Tällä menetelmällä on useita etuja verrattuna yllä käsiteltyyn menetelmään. Ensiksi se pystyy tunnistamaan soluliman reseptoreja eikä pelkästään solupinnan reseptoreja. 20 Toiseksi se pystyy tunnistamaan reseptorit, jotka vuorovaikuttavat vain epäsuorasti vastaavan ligandin kanssa, ei ainoastaan niitä reseptoreja, jotka sitovat ligandia suoraan. Lopuksi se varmistaa, että valikoidut kloonit ovat kelvollisia reagoimaan ligan-diin. Yksinkertainen menetelmä voi valikoida klooneja, jotka ilmentävät molekyyliä, joka sitoo interferonia, mutta ei tämän vuorovaikutuksen tuloksena laukaise mitään li-25 säsoluaktiivisuutta.

Mieluummin solupinta-antigeenin tunnistaa vasta-aine, varsinkin monoklonaalinen vasta-aine. Kuitenkin tietyissä tapauksissa erityyppinen sitomismolekyyli, kuten lek-tiini tai entsyymi, voi olla sopiva. Eräässä suoritusmuodossa sitomismolekyyli täytyy 30 leimata. Mitä tahansa koealalla tunnettua leimaa, kuten radioaktiivista leimaa, ent-syymileimaa tai fluoresenssileimaa, voidaan käyttää; fluoresenssileima on suosittu. Leima voidaan kiinnittää suoraan tai epäsuorasti, kovalenttisesti tai ei-kovalenttisesti. Vaihtoehtoisesti sitomismolekyyli voidaan kiinnittää affiniteettikromatografiatukeen ja sitten solut, joissa on reseptori, voidaan erottaa affiniteetin avulla niistä, joissa ei ole 35 reseptoria.

• Haluttujen kloonien erottaminen muista transformoiduista soluista suoritetaan mie luummin fluoresenssilla aktivoidun solulajittelun (FACS) avulla. Osoitetun pintara- 6 104495 kenteen ilmenemisen tason täytyy tietysti olla FACS:n herkkyysrajoissa, tyypillisesti yli 20 000 molekyyliä/solu.

Reseptoriaineosageeni täytyy eristää DNAista, joka ei sisällä reseptoriin kuuluvia gee-5 nejä yhtä hyvin kuin jaksoista, joilla ei ole koodaustehtävää. Seulottava DNA voi olla genomin DNA:ta tai cDNA:ta. Se voidaan saada donorin koko genomista, tai valikoidusta kromosomista. Se voidaan rikastaa tietyn kokoiseksi DNA:ksi. DNA voidaan viedä isäntäsolun sisään DNA-kappaleiden yksinkertaisen transfektion avulla, tai DNA-kappaleet voidaan kloonata sopivaan virus- tai plasmidivektoriin, jota sitten 10 käytetään isäntäsolun transformoimiseen.

Seulomiseen käytettävä isäntäsolu on mieluummin kykenemätön reagoimaan interferoniin (tai muuhun mielenkiinnon kohteena olevaan sytokiniiniin) ennen toiminnallisen reseptorigeenin transformaatiota. Kuitenkin voidaan käyttää isäntäsolua, jolla on 15 alhainen reagoimistaso, jos geneettinen muuttelu lisää osoitettavaa vastetta. Koska interferonit ovat lajinomaisia, ihmisen IFN-reseptorin aineosageenin etsinnässä on suosittua käyttää isäntäsolua, joka ei ole ihmissolu.

Kun reseptorin aineosageeni on eristetty, valmistetaan helposti reseptoriaineosan 20 luonnossa esiintymättömiä analogeja geenin paikkaspesifisen mutageneesin tai kemiallisen käsittelyn avulla (esimerkiksi proteolyyttisillä entsyymeillä). Todennäköisesti toiminnalliset analogit voidaan tunnistaa jakson tarkalla tutkimisella. Esimerkiksi mahdolliset fosforylaatio- ja transmembraanialueet ovat todennäköisemmin olennaisia aktiivisuudelle. On parempi korvata aminohappo toisella, joka on saman kokoinen ja 25 jolla on sama varaus, kuin korvata perin pohjin erilaisella aminohapolla. N-ja C-päät voidaan lyhentää, jotta määritettäisiin, mikä on tarpeellista aktiivisuutta varten.

Reseptorin aineosageeni voidaan liittää luonnostaan kuulumattomaan promoottoriin, joka voi olla konstitutiivinen tai indusoitava. Suosittu promoottori on SV40:n aikainen 30 promoottori. Geenin koodikolmikkovalinta voidaan muuttaa siten, että koodikolmikot . sopivat isännän koodikolmikkomieltymyksiin, jotta suljettaisiin pois epämieluisa se- kundaarirakennemuodostus, tai jotta helpotettaisiin geenin lisämuuttelua järjestämällä tai poistamalla restriktiopaikkoja. Geeni voidaan viedä minkä tahansa sopivan isäntäsolun sisään.

Erikoisen suositussa suoritusmuodossa pilkottu ihmisen DNA vietiin hiiren LTK-solujen sisään yhdessä herpes-viruksen TK-geenin kanssa ja transfektoidut hiiren LTK~-solut, jotka reagoivat ihmisen tyypin I IFN:iin, valikoitiin fluoresenssilla akti- 35 7 104495 voidun solulajittelun avulla (FACS). Käytettiin mieluummin epäsuoraa kuin suoraa FACS-valintaa reseptoriaineosalle, koska tyypin I IFN-reseptorit/solu -määrä on alle sen, mitä voidaan saada selville FACS-analyysin avulla. Valittiin merkitsijäksi IFN:llä indusoitu MHC-antigeenien lisääntyminen solupinnalla, jotta erotettaisiin reagoivat 5 solut.

Erityisesti seulottiin solut, jotka ilmensivät biologisesti aktiivisia reseptoriaineosia, kuten on todistettu H2:n lisääntyneellä ilmenemisellä sen jälkeen, kun HAT:lle vastustuskykyisiä soluja on käsitelty ihmisen tyypin I IFN.llä. Tämä on ensi askel, jota tukee 10 todistus siitä, että ihmisen IFN säätelee hiiren H2-ilmenemistä somaattisissa ihminen x hiiri -soluhybrideissä, jotka ilmentävät ihmisen IFN-reseptoreja. Soluja viljeltiin ja toistettiin FACS-valinta. Ihmisen DNA:n määrää hiiren soluissa vähennettiin tekemällä sekundaarinen transfektio käyttämällä alkuperäisten transfektioiden ihmisen IFN lie herkkien kloonattujen solujen DNA:ta. Sekundaaritransfektantit, jotka ilmensivät re-15 septoriaineosaa, saatiin FACS-seulonnan avulla, kuten on selvitetty yllä.

Genomin DNA-kirjastot valmistettiin sekundaaritransfektanteista eristetystä DNA:sta käyttämällä EMBL3-bakteriofaagia. Näistä faageista restriktioentsyymipilkkomisen avulla saadut ihmis-DNA-kappaleet analysoitiin Southern blot -analyysin avulla, jotta 20 saataisiin ainutlaatuisia jaksoja, jotka ilmenevät soluissa, joissa on ihmisen kromosomi 21. Yhdessä eristetyssä faagissa oli ainutlaatuinen 2,1 kb Eco Rl -restriktiokappale, joka näytti olevan ihmisen kromosomista 21 differentiaalihybridisaation perusteella, jolloin hybridisoitiin hiiren solujen genomin DNA:han vastaan ihmisen istukan DNA ja DNA:han, joka oli somaattisesta ihminen x hiiri -solulinjasta, jossa ihmisen kromo-25 somi 21 oli ainoa jäljelle jäänyt ihmisen kromosomi. Vahvistettiin, että tämä oli todella ihmisen kromosomin 21 pala sen hybridisaatiokuvion avulla pulse field -geeliana-lyysissä, jossa käytettiin DN A: ta, joka oli somaattisesta ihminen x hiiri - ja ihminen x hamsteri -soluhybrideistä, joissa oli ihmisen kromosomi 21 ja DNA:ta samoista solu-hybrideistä, joissa ei ollut ihmisen kromosomia 21. On osoitettu käyttämällä Northern 30 blot -hybridisaatiota, että tämä ainutlaatuinen kappale hybridisoituu ihmisen poly-A'-RNA:han, joka on tarpeeksi suuri koodatakseen reseptoriaineosan. Tämä pala kloonattiin pGEM 4 -plasmidivektoriin ja käytettiin seulottaessa ihmisen istukan gtll-cDNA-kirjastoa, joka oli ostettu Clonetech Laboratoriesilta (Palo Aito, Kalifornia). Eristettiin seitsemän cDNA-kloonia. Ihmisen DNA on kloonattu Stratagene Cloning 35 Systemsin (San Diego, Kalifornia) Bluescript-plasmidivektoriin.

* 104495

Esimerkki 1

Oletetun tyypin I IFN-reseptorin aineosageenin eristäminen.

Hiiren LM TK"-solut (joista puuttuu tymidylaattikinaasi-entsyymi, TK) transfektoitiin 5 ihmisen koko DNA:lla, joka oli Molt-4-T-soluleukemiasoluista, käyttämällä pAGO-plasmidia, jossa oli Herpes simplex -viruksen TK-cDNA, joka on valikoiva merkitsijä hypoksantiini-aminopteriini-tymidiini(HAT)-valintaelatusaineessa. LM TK+-solut asetettiin alttiiksi 200 U/ml ihmisen IFN-31:lle ja värjättiin monoklonaalisella anti-H2Kk 12-14 -vasta-aineella (katso Rosa, et ai. (1986), Interferon, 7, 47-87, Academic Press, 10 sisällytetään viitteenä) ja kanin FITC-(Fab')-antihiiri-IgG:llä. Käyttämällä 50 HH -sytofluorografiaa (Orthodiagnostics), 10 % fluoresoivimmista soluista lajiteltiin steriili sti, kasvatettiin uudelleen ja valikoitiin toisen kerran. Alustavat kokeet todistivat, että kahdesti lajiteltuun populaatioon rikastui soluja, jotka reagoivat ihmisen IFN-alfaan tai -beetaan (mutta eivät -gammaan), monenlaisissa kokeissa kuten (2'-5')-oligoA-15 syntetaasin induktiossa, resistenssissä Vesicular stomatitis -virukselle, ja 125I-IFN-alfan sitomisessa. Kloonit, joilla oli tällainen fenotyyppi, saatiin laimentamalla.

Polyklonaaliset ja monoklonaaliset vasta-aineet hiiri-ihminen-hybrideille, jotka sisältävät vain ihmisen kromosomin 21, joka estää sitoutumisen ihmisen IFN:ään ja rea-20 goimisen ihmisen (mutta ei hiiren) IFN:ään (katso Razziudin et ai., siteerattu yllä), estivät ihmisen IFN:n aiheuttaman H2-lisäyksen positiivisissa klooneissa, mikä osoitti, että läsnä oli ihmisen IFN-pintareseptori. Yhden tällaisen alkuperäisen transformantin DNA transfektoitiin uusiin LM ΤΚ'-soluihin ja sekundaaritransformantit saatiin käyttämällä pAGO:a valintaa varten. Sekundaaritransformantit valikoitiin uudelleen . 25 FACS :n avulla kuten yllä ja kolmen kierroksen jälkeen saatiin kloonit laimentamalla ja ihmisen IFN:ään reagoivat tunnistettiin yllä selvitettyjen kokeiden avulla. DNA valmistettiin klooniviljelmistä, joista samanaikaisesti analysoitiin ihmisen IFN:n aikaan saama (2'-5')-oligo A -syntetaasin induktio. Kloonauksen ja toistetun FACS-valinnan havaittiin olevan tarpeellisia ylläpitämään fenotyyppisen vasteen vastaavia tasoja. 30 Yksi klooni, joka nimettiin βΙΙ- 19-26:ksi, valittiin lisäanalyysiä varten.

Southern blot -analyysi ihmisen koko DNA:sta valmistetulla koettimella osoitti, että ihmis-DNA:n pitoisuus joissakin klooneissa oli tarpeeksi alhainen antamaan aihetta transformoivan DNA:n molekulaarisille kloonausyrityksille. Valmistettiin genomikir-35 jasto piI-19-26-kloonista käyttämällä EMBL-3-vektoria, ja seulottiin ihmisen ko-konais-DNA-koettimella. Puhdistettiin noin 20 EMBL-3-faagia, jotka sisälsivät ihmisen toistuvajaksoista DNA:ta. Kahdesta faagista (15-4 ja 6-40), jotka antoivat vahvimmat signaalit, eristettiin 2,1 ja 1 kb Bam HI-restriktiokappaleet, joissa ei ollut toistuva- 9 104495 jaksoista DNA:ta. Genomin DNA:n Southern blot -analyysi vahvisti, että nämä kappaleet hybridisoituvat ihmisen DNA:n kanssa, mutta eivät hiiren DNA:n kanssa. Suurin osa faageista, joilla oli piI-19-26-kirjaston ihmis-DNA:ta, hybridisoituivat 2,1 kb Bam HI-kappaleen kanssa (6-40-3-koetin-DNA) osoittaen, että tämä on ihmis-DNA:n pää-5 aineosa piI-19-26-soluissa. 6-40-3-koetin-DNA:n kromosomaalinen alkuperä määritettiin hybridisoimalla hiiri-ihminen- ja hamsteri-ihminen-hybridien DNA:han, joka oli Southern blot -filttereillä, mikä vahvisti, että 6-40-3-koetin-DNA tunnistaa 300 kb Not 1 -kappaleen, joka on peräisin kromosomista 21. 2,1 kb 6-40-3 Bam Hl -kappale ulottuu kahden Eco Rl -kappaleen yli, jotka ovat 2 ja 4 kb, jolloin insertin kokonaispi-10 tuus 6-40-faagissa on 16 kb. Transformanttikloonien DNA, joka joko reagoi ihmisen IFN.ään tai siltä puuttuu fenotyyppi, hybridisoitiin 6-40-3-koetin-DNA:han; vain reagoivat osoittivat nimenomaisesti hybridisoituvan koetin-DNA:han.

Jotta määritettäisiin, oliko 6-40-3-koetin-DNA osa transskriptioyksikköä, seuloimme 15 ihmisen istukan lambda gt 11 cDNA -kirjaston tällä koetin-DNA:lla. Seitsemän positiivista cDNA-kloonia tunnistettiin 2 x 106 faagista. Yhdellä kloonilla (L7) on 3,9 kb Eco Rl -insertti, mikä on merkkinä pitkästä transkriptioyksiköstä. Tämä vahvistettiin Northern blot -analyysien avulla, joissa sama koetin-DNA ilmaisi 4,5 kb RNA:n, ja suuremman 5,1 kb juovan. L7-cDNA-kloonin 3,9 kb Eco RI-insertti kloonattiin Blue-20 script-vektoriin (Stratagen-yhtiö) ja kompetentit E. coli TCI -bakteerit transformoitiin tällä L7-BS2-vektorilla. Nämä transformoidut bakteerit uskottiin Collection Nationale de Cultures de Microorganismes'n (C.N.C.M.) haltuun, Pariisiin, Ranskaan, 14. marraskuuta 1988, tulonumerolla C.N.C.M. 1-816, Budapestin sopimuksen mukaisesti. Viljelmiä tehdään yleisön saataville, kuten sopimus vaatii, mutta talletteesta ei voida . 25 osoittaa lisenssiä.

Kloonaus toteutettiin kahdessa orientaatiossa. T7 RNA -polymeraasitranskriptit transloituna retikulosyyttilysaateissa tuottivat 100 kd proteiinin yhdessä orientaatiossa, mutta eivät toisessa. Samat transkriptit, jotka tuottavat 100 kD proteiinin, tekevät 62 30 kD proteiinin, ja se voidaan transloida sisäisestä ATG-koodikolmikosta.

Esimerkki 2

Kloonatun oletetun tyypin I IFN-reseptorin aineosan luonnehtiminen.

35 L7-cDNA:n nukleotidijakso saatiin aikaan sekvensoimalla päällekkäin meneviä häviä-miä Bluescript-vektorin molemmista juosteista. Kuviossa 1 esitetty jakso osoittaa 3870 nukleotidin RNA:n, jolla on poly(A)-häntä. Avoin lukuraami alkaa 899-nukleotidin kohdalta ja päättyy 3253 kohdalla koodaten 785 aminohapon proteiinia. 899-3253 10 104495 koodaavan alueen sijainti vahvistettiin transloimalla häviämätransskripteja retiku-losyyttilysaateissa.

Proteiinin pituus ennustaa molekyylipainon olevan 86 000, mikä on lähellä alempia 5 arvoja, jotka on arvioitu geelielektroforeesin avulla. Retikulosyyttilysaatin L7-cDNA:n translaatiotuotteen elektroforeesin perusteella näyttää, että proteiini kulkeutuu hitaammin kuin teoreettisesti otaksuttiin ja että molekyylipaino on ilmeisesti 100 000. Tämä voidaan selittää happamien aminohappojen runsaudella jaksossa.

10 L7-proteiinin mielenkiintoinen piirre on alue, jossa on 12 seriiniä, joita reunustaa 6 glutamaattia (emäkset 1710-1760 kuviossa 1). Tämä alue voisi olla fosforyloitu. Mahdollinen transmembraanialue, jossa on 15 varauksetonta aminohappoa, on 3056-nukleotidista 3100:aan kuviossa 1. Hydrofobinen signaalipeptidi havaitaan proteiinin N-päässä. Nämä piirteet käyvät yksiin tämän proteiinin sijainnin kanssa solukalvossa 15 kuten on otaksuttu tyypin I IFN-reseptorille. Ei ole mitään merkittävää homologiaa L7-proteiinijakson ja IFN-y-reseptorin välillä tai minkään muun tunnetun geenin välillä.

Koska lopullinen todiste tunnistamisesta vaatii osoituksen hankitusta herkkyydestä 20 ihmisen IFN:lle soluissa, jotka eivät ole ihmissoluja ja jotka on transfektoitu tällä cDNA-kloonilla, SV40:n aikaiseen promoottoriin fuusioidun cDNA-geenin häipyvät ja pysyvät transfektiot analysoitiin eri solulinjoissa, jotka eivät olleet ihmissolulinjoja.

Jotta analysoitaisiin L7-cDNA:n kodaaman proteiinin biologinen aktiivisuus, suunni-. 25 teihin pSVE3-L7-ilmenemisvektori, joka sisälsi koko L7-cDNA:n fuusioituneena Si- mian-virus 40:n aikaiseen geenipromoottoriin. Häipyvää ilmenemistä varten tämä plasmidi transfektoitiin hiiren soluihin ja 24 tuntia myöhemmin soluja käsiteltiin 500 U/ml ihmisen IFN-pi:llä tai jätettiin käsittelemättä (Benech, P., et ai. (1987), Mol. Cell. Biol., 7, pp. 4498-4504). Toisen 24 tunnin jälkeen valmistettiin solu-uutteet ja 30 mitattiin (2'-5') oligo A -syntetaasi kuten on selitetty (Revel M. et ai. (1981), Meth. Enzymol., 79, p. 143). Laskettiin (2-5') oligo A -syntetaasiaktiivisuus transfektoiduis-sa soluissa, joita oli käsitelty IFN:llä, miinus aktiivisuus käsittelemättömissä soluissa. Kuten on esitetty taulukossa 1, tämä kasvu oli keskimäärin 4,5 kertaa korkeampi soluissa, jotka olivat saaneet ilmenemisvektorin, joka sisälsi L7-cDNA:n, verrattuna so-35 luihin, jotka olivat saaneet tyhjän ilmenemisvektorin. Jälkimmäisessä ei ollut merkittävää lisäystä verrattuna soluihin, jotka eivät olleet saaneet lainkaan DNA:ta (taulukko 1)· u 104495

Kiinalaisen hamsterin munasaijasolujen (CHO) pysyvät transformantit valmistettiin transfektoimalla cDNA fuusioituneena SV40:n aikaiseen promoottoriin yhdessä vektoreiden kanssa, jotka sisälsivät DHFR-geenin. Klonaaliset solupopulaatiot eristettiin transfektiosta sopivan valikoinnin jälkeen ja näistä klonaalisista linjoista seulottiin ne, 5 jotka sisälsivät cDNA:n ja reagoivat ihmisen IFN-P:aan, joka osoitetaan (2-5') A -syn-tetaasin induktion avulla. Kloonit, jotka Southern blot -analyysin perusteella sisälsivät L7-DNA:ta ja reagoivat 100 U/ml ihmisen IFN-Pj:een (2'-5')-A-syntetaasi-induktion avulla, joka oli korkeampi kuin CHO-DHFR+ -soluissa, eristettiin ja monistettiin valikoimalla asteittaisesti metotreksaatin (MTX) avulla. Klooneissa, jotka ovat vastustus-10 kykyisiä 50 nM tai paremmin 300 nM MTXille, L7-RNA-ilmeneminen tulee osoitettavaksi kokonais-RNA:n Northern blot -analyysien avulla. Vaste 100 U/ml ihmisen IFN-Piieen on 4-5 kertaa korkeampi 50 nM MTX-klooneissa kuin CHO-soluissa, jotka sisältävät vain pSVDHFR.n ja joita on samalla tavalla monistettu (taulukko 2). Kun MTX:ää käytettiin 300, 750 ja 1 000 nM, CHO-DHFR+L7-klooneissa esiintyi vasteen 15 kasvu ihmisen IFN-P:aan verrattuna korkeimpaan vasteeseen CHO-DHFR-kontrol-liklooneissa, joita oli käsitelty samalla tavalla MTX:n avulla (kuvio 4). Vasteen laajuus ihmisen IFN-P:aan kasvaa siksi geenin monistumisen myötä 8-kertaisella tekijällä. Tällaisten monistettujen kloonien vaste 100 U/ml ihmisen IFN.ään oli noin 15 % vasteesta 20 U/ml hamsterin IFNiään.

20 Tämän keksinnön tekijät ovat päätelleet, että vaikka L7-cDNA:n ilmeneminen SV40:n promoottorin valvonnan alaisuudessa johtaa solujen lisääntyneeseen vasteeseen ihmisen IFN .ään, vasteen laajuus jää alhaiseksi. Tämä saattaa johtua joko ongelmista proteiinin ilmenemisessä tai tosiasiasta, että L7-proteiini on vain osa IFN-reseptorijär-25 jestelmää. Jälkimmäinen mahdollisuus näyttää todennäköisemmältä, koska ei pystytty osoittamaan ihmisen ^I-IFN-con merkittävän korkeaa äffmiteettisitoutumista CHO-transformantteihin. Jos reseptori koostuu useammasta kuin yhdestä ketjusta, sitoutu-misaffiniteetti voi olla hyvin alhainen, kun läsnä on vain yksi proteiiniketjuista.

30 Se, että L7-proteiini on sellaisen IFN-reseptorin aineosa, joka ei ole suoraan vastuussa ihmisen IFN.n lajinomaisesta sitoutumisesta, todistetaan lisäksi sen avulla, että monis-" tetuissa CHO-pSVL7-klooneissa vaste hamsterin IFN.ään myös lisääntyy. Kuvio 5 näyttää, että alhaisella hamsterin tai ihmisen IFN:n konsentraatiolla, jotka tuottavat vähäisen (2'-5')A-syntetaasiaktiivisuuden lisääntymisen CHO-DHFR-kontrollikloonis-35 sa (abskissa), CHO-pSVL7-klooni (300 nM MTX) reagoi 5 kertaa enemmän jompaan kumpaan IFN-lajiin (suora viiva kuviossa 5 on odotettu linja, jos molemmat kloonit . reagoivat samalla tavoin). Korkeammilla IFN-konsentraatioilla, jotka tuottivat suurem paa (2'-5')A-syntetaasin induktiota, ero CHO-pSVL7:n ja CHO-DHFR-kloonin välillä 12 104495 oli vähemmän ilmeistä. Tämän keksinnön tekijät ovat päätelleet, että jos pinnalla on enemmän L7-proteiinia, solut reagoivat paremmin alhaisille IFN-konsentraatioille. Tämä tulos sopii yhteen hypoteesin kanssa, jonka mukaan L7 on yksi ketju tyypin I IFN-reseptorijärjestelmästä, joka toimii signaalin transdusoimisessa solun sisään.

5

Esimerkki 3

Vasta-aineet L7-proteiinille osoittavat proteiinin solujen pinnalla.

L7-proteiinin (kuvio 3) aminopään lähellä oleva 27 aminohappoa pitkä peptidi synteti-10 soitiin, liitettiin KLH:hon ja käytettiin lisäämään kanin antiseerumeja. Vasta-aineet puhdistettiin pylväässä, jossa oli liikkumattomaksi tehtyä peptidiä, ja käytettiin Western blot -analyyseissä. 130 kDa proteiini Daudi- ja U937-soluissa osoitetaan Triton X-100-deoksikolaattilysaateissa ja kalvovalmisteissa. Tämä on luultavasti L7:n glyko-syloitu muoto, jolla on N-glykosylaatiopaikka N-pääalueen lähellä. Kuitenkaan im-15 munosaostaminen ei ollut mahdollista peptidivasta-aineiden avulla.

L7-cDNA fuusioitiin 113-koodikolmikon kautta proteiini A -geeniin, joka oli pRIT-2-vektorissa (Pharmacia Fine Chemicals) ja ilmennettiin E. colissa. PSN- ja PN2-fuu-sioproteiini (kuvio 3), jotka oli puhdistettu immunoglobuliinipylväässä, käytettiin im-20 munisaatioon, jotta saataisiin kanin polyklonaalisia vasta-aineita L7-proteiinille. Nämä vasta-aineet immunosaostivat ihmisen Daudi-soluista, joita oli leimattu 7 tuntia 35S-metioniinilla, 80-85 kDa pääjuovia ja noin 130 kDa pikkujuovia. 80-85 kDa juovat voivat olla muotoja proteiinista, joka on menettänyt osan N-pääalueesta, joka tunnistetaan yllä kerrotun anti-peptidivasta-aineen avulla.

. 25

Kanin antiseerumin avulla, joka on L7:ää vastaan (anti-PSN ja -PN2), on mahdollista osoittaa, että L7-proteiini on ihmisen lymfoblastoidi-solujen (Daudi) pinnalla. Kuvio 6 esittää fluoresenssiaktivoidun solulajittelija -analyysin (FACS), joka todistaa, että L7 on Daudi-solujen pinnalla. Oikea kenttä esittää, että rodamiini-isotiosyanaatilla leima-30 tun proteiini A:n avulla joko yksin tai yhdessä kanin normaalin seerumin kanssa, saadaan fluoresenssihuippu 60 mielivaltaisyksikön kohdalla. Kuitenkin, kun lisätään anti-L7-seerumia, fluoresenssihuippu siirtyy korkeampien arvojen kohdalle (keskimäärin 110 kohdalle), mikä todistaa, että anti-L7-vasta-aineet sitoutuvat soluihin ja täten enemmän rodamiinilla leimattua proteiini A:ta kiinnittyy. Käyrien muoto osoittaa, että 35 kaikkien Daudi-solujen pinnalla on esillä L7-proteiinia.

. Anti-L7-vasta-aineet eivät estäneet '251-IFN-a2:n sitoutumista ihmisen lymfoblastoi- disiin Daudi-soluihin. Kuvio 7 esittää, että sitoutumista estivät kylmä IFN-β, vasta- 13 104495 aineet hiiri-ihminen-hybridisoluja vastaan, joissa oli vain kromosomi 21 (<kr. 21), mutta sitoutumista eivät estäneet anti-L7 (<L7), eikä kanin normaali seerumi (NRS) eikä hiiren normaali seerumi (NMS). Siksi L7-proteiini ei näytä suoraan liittyvän IFN-a:n sitoutumiseen näihin ihmisen soluihin. Tämä erottaisi L7-proteiinin proteiinista, 5 joka ristiliittyy IFN-a:aan ihmissoluissa (Razziudin et ai, lokus siteerattu). Ei ole jätetty lukuun ottamatta, että proteiini, joka sitoutuu IFN-a:aan, voi olla erilainen kuin proteiini, joka sitoutuu IFN-P:aan. Koska L7-proteiini tunnistettiin sen perusteella, miten se vaikutti solujen IFN-P-vasteeseen, on yritetty sitä, voitaisiinko L7 ristiliittää IFN-p.aan. Koska aktiivisen IFN-p:n käsittely radioaktiivisella jodilla ei ollut melo nestyksellinen, ristiliitettiin kylmä IFN-P Daudi-soluihin suberimidaatti-käsittelyn avulla ja L7-proteiinin (joka saatiin selville anti-peptidien avulla immublot-analyysis-sä) elektroforeettinen liikkuvuus analysoitiin, jotta määritettäisiin vähenikö se tämän käsittelyn avulla. Yhdessä kokeessa havaittiin hitaampi 150 kDa juova 130 kDa L7-proteiinin lisäksi, mutta kaksi muuta koetta epäonnistuivat todistamaan tätä ilmiötä.

15 L7-proteiinin identifiointi proteiiniksi, joka mukauttaa soluvastetta tyypin 1 interferoniin, ja tyypin I IFN-reseptorijäijestelmän aineosaksi perustuu seuraavaan: 1. L7-cDNA:n häipyvä ilmeneminen aiheuttaa sen, että hiiren solut reagoivat enemmän ihmisen IFN-p:aan.

20 2. Hamsterin CHO-solujen pysyvät transformantit, joilla on L7-cDNA, reagoivat enemmän IFN.ään. Lisäys korreloi integroituneen L7-DNA:n monistumisen kanssa. Lisääntynyt vaste nähdään ihminen-hamsteri-DNArlla ja se on ilmeisempää, kun IFN-konsentraatiot ovat alhaisia, mikä viittaa siihen, että L7 lisää solujen affiniteettia 25 IFN:ään.

3. L7-proteiini on ihmissolujen pinnalla.

4. Geeni, joka koodaa L7-proteiinia, on kromosomissa 21 alueessa (q 22), joka 30 luetaan tyypin I reseptorigeeniin/geeneihin somaattisen soluperinnöllisyystieteen pe- : rusteella.

Kuten muiden sytosiinien tapauksessa (esimerkiksi IL-2, IFN-γ), tyypin I IFN-reseptori luultavasti muodostuu useista eri proteiiniketjuista. L7-proteiini on luulta-35 vasti yksi tyypin I IFN-reseptorijäijestelmän aineosa ja liittyy solujen IFN-vasteeseen. Se ei luultavasti ole reseptorijärjestelmän ketju, joka sitoo ihmisen IFN:ää lajinomai-. sella tavalla. Se on todennäköisemmin reseptorin ketju, joka lisää IFN:n sitoutumisen tuottamaa signaalia.

14 104495 L7-proteiinin identifiointi mahdollistaa tutkia sen rakenne-toiminta-suhdetta, tuottaa muutettua L7-proteiinia päämääränä lisätä tai vähentää solujen, kudosten ja koko organismien vastetta a- tai β-tyypin interferoniin, ja tuottaa yhdistelmä-DNA-teknolo-gian avulla liukoista tai lipidiin sitoutunutta L7-proteiinia, joka voi toimia kilpailijana 5 IFN:ää vastaan. Näitä keksintöjä voidaan soveltaa patologisiin tilanteisiin, joissa toivotaan vasteen tämän tyyppisille interferoneille joko lisääntyvän tai vähenevän (esimerkiksi autoimmuunitapahtumasarjat, krooniset tai akuutit infektiot, kasvaimet ja leukemiat, jne.).

10 Esimerkiksi L7-proteiinikappaleita tai analogeja, jotka vuorovaikuttavat IFN:n kanssa, tai antidiotyyppisiä vasta-aineita, jotka on synnytetty L7-proteiinin vasta-aineita vastaan, voidaan ruiskuttaa potilaaseen, jolloin nämä molekyylit toimivat "syöttinä" mille tahansa läsnä olevalle interferonimolekyylille. Voidaan käyttää geeniterapiaa, jolloin annetaan toiminnallisia reseptorigeenejä, jotta tarjottaisiin enemmän reseptoreja ja si-15 ten lisättäisiin vastetta IFN:lle.

Pitäisi ymmärtää, että vaikka tässä selitetään yhtä erityisproteiinia ja sitä varten olevaa perinnöllistä ainesta, tämä keksintö ei rajoitu niihin. Menetelmän, jolla eristetään perinnöllistä ainesta, joka koodaa soluvastetta interferonille mukauttavaa proteiinia, on 20 osoitettu olevan tehokas koetulosten perusteella, jotka on selitetty tässä. Riittävän asiantuntemuksen tältä alalta omaavat ymmärtävät, että jos tätä menetelmää toistetaan, voidaan saada eri proteiineja, jotka myös mukauttavat soluvastetta interferonille ja nämä proteiinit todennäköisesti muodostavat tyypin I reseptorijärjestelmän muita ketjuja. Vaikka menetelmä on nimenomaisesti proteiineille, jotka aiheuttavat lisään-25 tynyttä H2-antigeenituotantoa, on täysin odotettua, että uusilla proteiineilla, jotka ovat muita kuin tässä selitetty erityisproteiini, on tällaisia ominaisuuksia ja tämän keksinnön tarkoituksena on yleisesti kattaa ne kaikki.

Lisäksi tämän keksinnön menetelmää voidaan myös toistaa käyttämällä muita interfe-30 roniaktiivisuuden merkitsijöitä, esimerkiksi interferonin aiheuttamia muita muutoksia ’ : solupinnan tunnusomaisissa piirteissä, jotta saataisiin selville interferonireseptorijär- jestelmän aineosia. Tällaiset tunnusomaiset piirteet saattavat sisältää p2-mik-roglobuliinin tai luokan II MHC-antigeenien lisääntymisen. Kun käytetään näitä tekniikoita, saadaan myös proteiineja, jotka mukauttavat soluvastetta interferonille ja täl-35 laiset puhdistetut proteiinit ja samaa koodaava perinnöllinen aines ovat myös osa tätä keksintöä.

,5 104495

On tunnettua, että mikä tahansa proteiini, joka on saatu tämän keksinnön mukaisesti, mukauttaa soluvastetta interferonille. Tämä on totta määritelmän mukaan, joka pitää tätä ominaisuutena, joka ohjaa perinnöllisen aineksen valikointia. Vaikka ajatellaan, että kaikki tällaiset proteiinit ovat osa interferonireseptorijärjestelmää, hakija ei halua 5 rajoittua tällaiseen teoriaan. On kuitenkin tunnettua, että tällaiset proteiinit eivät ainoastaan saa aikaan interferonia vaan otetaan huomioon myös se, että ne aktiivisesti reagoivat interferoniin ennemmin kuin saavat aikaan sitä.

Erityissuoritusmuotojen edellä mainittu selitys tällä tavalla täysin ilmaisee keksinnön 10 yleisen luonteen, jotta muut voivat soveltamalla käytäntöön yleisesti tiedossa olevia tietoja helposti muuttaa ja/tai soveltaa eri sovellutuksia varten tällaisia erityissuoritus-muotoja ilman, että poiketaan yleisestä käsitteestä, ja siksi tällaisten sovellutusten ja muunnosten on tarkoitus sisältyä esiintuotujen suoritusmuotojen vastineiden merkitykseen ja alaan. On ymmärrettävä, että tässä olevan fraseologian tai terminologian on 15 tarkoitus olla selityksenä eikä rajoituksena.

Claims (15)

1β 104495

1. Yhdistelmä-DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se sisältää DNA-sekvenssin, joka koodaa proteiinia, joka mukauttaa soluvastetta tyypin I interferoniin, joka sekvenssi 5 on olennaisesti homologinen kuvion 1 mukaisen koodaavan alueen 899-3253 kanssa ja omaa sen kanssa saman aktiivisuuden.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen molekyyli, tunnettu siitä, että se koodaa proteiinia, joka kykenee mukauttamaan soluvastetta tyypin I interferoniin mitattuna 2 ,5'- 10 oligosyntetaasiaktiivisuuden lisääntymisenä.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen molekyyli, tunnettu siitä, että kyseessä oleva DNA-jakso sisältää lisäksi promoottorin, jonka kanssa kyseessä oleva DNA-sekvenssi ei luonnostaan liity yhteen ja jonka avulla kyseessä olevaa proteiinia ilmennetään. 15

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen molekyyli, tunnettu siitä, että kyseessä oleva promoottori on SV 40:n aikainen promoottori.

5. Solu, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 3 mukaisella yhdistel-20 mä-DNA-molekyylillä transformoidun bakteeri- tai nisäkässolun tai sen jälkeläisen, joka sisältää kyseessä olevan DNA-molekyylin välittämän tiedon.

6. Menetelmä proteiinin valmistamiseksi, jota proteiinia koodaa kuvion 1 mukainen DNA-sekvenssin alue 899-3252, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 5 • . 25 mukaisten solujen viljelemisen sellaisissa olosuhteissa, jotka ovat riittävät kyseessä olevan DNA-molekyylin koodaaman proteiinin ilmentämiselle.

7. Yhdistelmä-vektori, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 1 mukaisen DNA-molekyylin ja että se sisältää lisäksi promoottorin, joka on sellaisessa ase- 30 massa, että kyseessä olevan proteiinin, jota koodaa kyseessä oleva DNA-molekyyli, V ilmentäminen on mahdollista.

8. Solu, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 7 mukaisella yhdistel-mävektorilla transformoidun bakteeri- tai nisäkässolun tai sen jälkeläisen, joka sisältää 35 kyseessä olevan vektorin välittämän tiedon.

9. Menetelmä proteiinin valmistamiseksi, jota proteiinia koodaa kuvion 1 mukainen DNA-sekvenssin alue 899-3252, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 8 17 104495 mukaisten solujen viljelemisen sellaisissa olosuhteissa, jotka ovat riittävät kyseessä olevan proteiinin, jota koodaa kyseessä oleva DNA-molekyyli, ilmentämiselle.

10. Ei-ihmisen bakteeri- tai nisäkässolu, tunnettu siitä, että se sisältää ihmisen gee-5 nin, joka käsittää kuvion 1 koodaavan alueen 899-3253.

11. Menetelmä proteiinin valmistamiseksi, joka proteiini on osa tyypin I interferoni-reseptorijärjestelmästä, joka mukauttaa soluvastetta tyypin I inteferoniin, tunnettu siitä, että menetelmä sisältää patenttivaatimuksen 5 mukaisten solujen viljelemisen 10 sopivassa viljelyväliaineessa sellaisissa olosuhteissa, jotka vaikuttavat osaltaan proteiinin ilmentämiseen, ja proteiinin ottamisen talteen kyseessä olevista soluista tai vilje-lyväliaineesta.

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että proteiinin il-15 mentämistä lisätään metotreksaattivalikoinnin avulla, jolloin kyseessä olevat solut ovat DHFR+-soluja.

13. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että solut ovat CHO-soluja. 20

14. Proteiini, tunnettu siitä, että sitä koodaa kuvion 1 mukaisen DNA:n koodaava alue 899-3253 ja että se on ainakin osittain puhdistetussa muodossa.

15. Menetelmä proteiinin, jota koodaa kuvion 1 mukaisen DNA:n koodaava alue • < 25 899-3253, fragmentin tai sen kanssa saman aktiivisuuden omaavan analogin valmis tamiseksi, jotka eivät esiinny luonnostaan, siten, että kyseessä olevalla fragmentilla tai analogilla on jäljellä ainakin jonkin verran proteiinin kykyä mukauttaa tyypin I interferonin soluvastetta mitattuna 2',5'-oligosyntetaasiaktiivisuuden lisääntymisenä, tunnettu siitä, että se valmistetaan yhdistelmä-DNA-tekniikan avulla ja/tai kemiallisen syn- 30 teesin avulla. « 18 104495