FI104188B - Rekombinantti interleukiini-2-reseptori - Google Patents

Description

104188

Rekombinantti interleukiini-2-reseptori - Rekombinant-interleukin-2-reseptor > Tämän keksinnön kohteena ovat interleukiini-2:n reseptorit, tarkemmin sanoen reseptorin β-ketju, ja β-ketjua tai sen osia koodaava cDNA, β-ketjua koodaavia 5 cDNA-inserttejä sisältävät vektorit, näillä vektoreilla transformoidut isännät ja näiden isäntien viljeleminen mainitun β-ketjun tuottamiseksi.

Siitä, että sytokiinit, eräs luokka liukoisia välittäjäaineita, jotka ottavat osaa solujen välisiin "kommunikointeihin", ovat oleellisia immuunijärjestelmän sääte-10 lyssä, on kerääntynyt runsaasti todisteita. Sytokiinien on tiedetty indusoivan kohdesolujen lisääntymistä, erikoistumista ja aktivoitumista vaikuttamalla spesifiseen solupinnan reseptoriin (reseptoreihin), lnterleukiini-2 (IL-2), joka aikaisemmin on määritelty T-solun kasvufaktoriksi (1), on eräs parhaiten karakterisoiduista sytakiineista, ja sillä tiedetään olevan ohjaava osuus T-lymfosyyttien 15 (T-solujen) antigeeni-spesifisessä klonaalisessa lisääntymisessä. IL-2 näyttää myös vaikuttavan muihin immuunijärjestelmän soluihin, kuten kypsymättömiin tymosyytteihin (3), B-lymfosyytteihin (B-solut) (4), makrofaageihin (5), luonnon tappajasoluihin (NK-solut),(6) ja lymfokiinin aktivoimiin tappajasoluihin (LAK-soluihin) (7). Nämä IL-2:n monifunktionaaliset ominaisuudet ovat nyt avanneet 20 mahdollisuuksia immunoterapioiden, kuten adoptiivisen immunoterapian (8) formuloimiseen. IL-2:n on äskettäin osoitettu vaikuttavan myös hermosoluihin, kuten oligodendrosyytteihin (9), mikä viittaa tämän sytokiinin mahdolliseen osallistumiseen keskushermostojärjestelmään. Huolimatta perus-ja kliinisen immunologian yhteydessä tehdyistä laajoista IL-2-systeemin tutkimuksista, 25 informaatio on rajoittunut IL-2:n välittämän signaalitransduktion pohjana olevaan molekyylimekanismiin (-mekanismeihin).

IL-2-reseptorin (IL 2R) on tiedetty olevan ainutlaatuinen siinä suhteessa, että se esiintyy kolmessa muodossa: IL-2:aan sitoutumiskyvyltään korkea-, keski- » 30 ja matala-affiniteettisissa muodoissa vastaavien dissosiaatiovakioiden (Kd-arvot) ollessa 10‘11M, 10‘9M ja 10'8M (11, 12). IL-2Ra-ketjun (Tac-antigeeni, p55) karakterisoinnin jälkeen (13) kävi ilmeiseksi, että α-ketju muodostaa .. yksinomaan matala-affiniteettisen muodon ja että se ei ole sinänsä funktionaa- t 104188 2 linen IL-2:n sisäistämisessä ja signaalin transduktiossa, ellei se liity lymfoidi-solujen toiseen spesifiseen membraanikomponenttiin (-komponentteihin) (14,15). Lymfoidimembraanikomponentti tunnistettiin myöhemmin uudeksi reseptoriketjuksi, jolle annettiin nimeksi β-ketju (tai p70-75) (12, 16, 17). Itse 5 asiassa kokeelliset todisteet ovat viitanneet siihen, että IL-2RP-ketju sinänsä muodostaa keskiaffiniteettisen muodon (12). Lisäksi sen liittyminen IL-2Roc-ketjuun johtaa reseptorin korkea-affiniteettiseen muotoon (12, 16, 17). Eks-pressointitutkimukset, joissa on käytetty villityypin ja mutatoitua IL-2Ra-ketjun cDNA-molekyylejä, tukevat voimakkaasti käsitystä, että IL-2RP-ketjussa, mutta 10 ei IL-2Ra-ketjussa, on alue (alueita), joka käyttää signaalin transduktion solun-sisäistä reittiä (reittejä) (18). Sen vuoksi on olemassa tarve saada IL-2p-ketjua niin paljon, että voidaan selvittää sen rakenne ja toiminta. Tämä on oleellinen vaihe haluttaessa ymmärtää paremmin korkea-affiniteettisen IL-2R:n molekyyli-taustaa sekä IL-2:lle reaktiivisissa soluissa toimivan signaalitransduktion 15 mekanismia. Tätä tarkoitusta varten kuvaamme jäljempänä IL-2Rp-ketjua tai sen osia koodaavan cDNA:n, jolloin insertoimalla tämä cDNA sopivaan vektoriin ja ekspressoimalla se sopivassa isännässä voidaan rekombinanttitekniikal-la ja suuressa mitassa tuottaa IL-2R3-ketjua tai sen osia vastaavaa proteiinia.

20 Esillä oleva keksintö tuo siten esiin IL-2RP-ketjua tai sen osaa koodaavan rekombinantti-cDNA:n.

Keksinnön mukaisella cDNA:lla voi olla kaava:

• P

3 104188

ATG

GCG GCC CCT GCT CTG TCC TGG CGT CTG CCC CTC CTC ATC

CTC CTC CTG CCC CTG GCT ACC TCT TGG GCA TCT GCA GCG

GTG AAT GGC ACT TCC CAG TTC AGA TGC TTC TAC AAC TCG

5 AGA. GCC AAC ATC TCC TGT CTC TGG AGC CAA GAT GGG GCT

CTG CAG GAC ACT TCC TGC CAA GTC CAT GCC TGG CCG GAC

AGA CGG CGG TGG AAC CAA ACC TGT GAG CTG CTC CCC GTG

AGT CAA GCA TCC TGG GCC TGC AAC CTG ATC CTC GGA GCC

CCA GAT TCT CAG AAA CTG ACC ACA GTT GAC ATC GTC ACC

10 CTG AGG GTG CTG TGC CGT GAG GGG GTG CGA TGG AGG GTG

ATG GCC ATC CAG GAC TTC AAG CCC TTT GAG AAC CTT CGC

CTG ATG GCC CCC ATC TCC CTC CAA GTT GTC CAC GTG GAG

ACC CAC AGA TGG AAC ATA AGC TGG GAA ATC TCC CAA GCC

TCC CAC TAC TTT GAA AGA CAC CTG GAG TTC GAG GCC CGG

15 ACG CTG TCC CCA GGC CAC ACC TGG GAG GAG GCC CCC CTG

CTG ACT CTC AAG CAG AAG CAG GAA TGG ATC TGC CTG GAG

ACG CTC ACC CCA GAC ACC CAG TAT GAG TTT CAG GTG CGG

GTC AAG CCT CTG CAA GGC GAG TTC ACG ACC TGG AGC CCC

TGG AGC CAG CCC CTG GCC TTC AGG ACA AAG CCT GCA GCC

20 CTT GGG AAG GAC ACC ATT CCG TGG CTC GGC CAC CTC CTC

GTG GGC CTC AGC GGG GCT TTT GGC TTC ATC ATC TTA GTG

TAC TTG CTG ATC AAC TGC AGG AAC ACC GGG CCA TGG CTG

AAG AAG CTC CTG AAG TGT AAC ACC CCA GAC CCC TCG AAG

TTC TTT TCC CAG CTG AGC TCA GAG CAT GGA GGA GAC GTC

25 CAG AAG TGG CTC TCT TCG CCC TTC CCC TGA TCG TCC TTC

AGC CCT GGC GGC CTG GCA CCT GAG ATC TCG CCA CTA GAA

GTG CTG GAG AGG GAC AAG GTG ACG CAG CTG CTC CTG CAG

CAG GAC AAG GTG CCT GAG CCC GCA TCC TTA AGC AGC AAC

CAC TCG CTG ACC AGC TGC TTC ACC AAC CAG GGT TAC TTC

v 30 TTC TTC CAC CTC CCG GAT GCC TTG GAG ATA GAG GCC TGC

CAG GTG TAC TTT ACT TAC GAC CCC TAC TCA GAG GAA GAC

CCT GAT GAG GGT GTG GCC GGG GCA CCC ACA GGG TCT TCC

CCC CAA CCC CAT CAG CCT CTG TCA GGG GAG GAC GAC GCC

TAC TGC ACC TTC CCC TCC AGG GAT GAC CTG CTG CTC TTC

35 TCC CCC AGT CTC CTC GGT GGC CCC AGC CCC CCA AGC ACT

GCC CCT GGG GGC AGT GGG GCC GGT GAA GAG AGG ATG CCC

r 4 104188

CCT TCT TTG CAA GAA AGA GTC CCC AGA GAC TGG GAC CCC

CAG CCC CTG GGG CCT CCC ACC CCA GGA GTC CCA GAC CTG

GTG GAT TTT CAG CCA CCC CCT GCG CTG GTG CTG CGA GAG

GCT GGG GAG GAG GTC CCT GAC GCT GGC CCC AGG GAG GGA

5 GTC AGT TTC CCC TGG TCC AGG CCT CCT GGG CAG GGG GAG

TTC AGG GCC CTT AAT GCT CGC CTG CCC CTG AAC ACT GAT

GCC TAC TTG TCC CTC CAA GAA CTC CAG GGT CAG GAC CCA

ATC CAC TTG GTG TAG

10 joka koodaa ihmisen IL-2RP:a tai sen johdettua muunnosta tai sen osaa.

Toisella keksinnön mukaisella cDNA:lla on esimerkiksi kaava: ♦ 5 104188

g3 5fi8!<ii8SSi2gS58S§83ö5S

<00ομυ<0υυομθμυΡ<θ0υομ (-H(2oooooO(-<OQ<q<0(-o<o μο0<Ρ<ο<<υο0<ι-0μοουοο <oi-oohi-ooo^h-oki-^ooooh Ρ 0 0 μ 0 Ρ μ 0<O<<0<£0i— 0<μ 0<μυ0μουμμ0θ0ο<0Ρ0θ0μ θϋο<ο<Ηοο<|-ϋμυοΗυ<<;μο οοοοοί3θμοοΐ-<υοο<υϋμοο μμ<μμ<ο<ο<οοο0υ00<Ρ<0 ΗΟ<ϋϋϋ<θΗΟοθΟΗοΟμθΟΟ(- ομ<<ο<0<0μ<οθομ<00θο< ο<<ο<ο<0<υμμ0μυ0μ<000 <οοο0ομ000ρομρμ0οΡυ0ο Ο0<ο<ο0μ0000θ<<<<0μ<ο <μ<μ<<οΡμμυ<θ0θ0μ0<ο<

HhO0<HOqO<x0<-}0q0OCD00o Οο0<Η<Ο^θΟ><Η«<μΗ<θΗ<< 0μμ0000μ<ΗΧθ0<Ρ000ϋ0< 0O0<0i-(:,o52000H0oöH|_oCDo μμ<υ0Ρ<μ0μ<<0<ί-<<<<0μ

O0OO<<0O0<<O<Op00b00O

Η<ί0μ0<Ρ0ΟΟΗοαμμ<<Ο0οο υ<οΡυυΡμ<θ0μοΡΡ0υ0υμ< 0Ρ00θ0<0μθ0Ο°ϋΟ<<μθθ0 SSSiJgöSiSSSttSCiiisSiiSö iiSg§!5t=i2SSfitjiefi82SSStii Ο<<000Ρθ<<<ΡΡθ000<0<< O<0O0<O<i<ct9oCJOd)0(-l-O<OOn μοομ<<<00<<<μμ<0θυμοο<« Ρμμο<υμ<θ0μ0μοομ0υο0ομί ρο0οΡο<0<0θμο09θ0ουμΡ< ^,ί*ί,-^,-ϋ<:^*ί^;υο<5οι-ουο^Η 0<<<0οοοο<0μμυ<ί·οο<μμ0< oo^0-So<0H0Oi-oC)ooh ο ο 0 0 < <<9^^ο<<ϋΗ0θι-μο<θ0θμ<μ μμ0υ0Η0<0<μοΡ0<0ο<ουοο oobo0H-i-o<qobo9oH0OHi2^o υΡυ<μο<ο<ομ0υ0Ρμυοο00ο OOOOOI-OOOI-O<O0OO0O<0<O Ο0μ00υ<0ΐ— <t-oi— <001— 0ί5<0μ HH0HHOH<00pO0<H<O<00<0 0<υθ0θο<0<οομυθομ00<ο< ι-<<ομο<ροο^Ροο0μθο<0<ο

O0O000Op<0p<OH<PoO000H

Οι— ο00 0(— <ο<ρο0μθ(_)<ομμ0ΐ— 0Ρ00μμο·-μο0<ο<υ<οο<<<< <ομμ00μ00θ0ομ00μομυ0θ0 0Ηθυμ0θο0θ|_οο<00θο0μμ< 0<υο<μμυ<0υ0οϋ<μ<|_Η0<< μθ<μ<Ο0μθ<μμμ0Ο0θΡθ00Ο ΟΟ<<<Ο0<Ο<Ι_0ΟΟ<0ΟΟΟ<<Ο υουρΡ0<θΗοΡ<μ<ο<υκ·ο<<ο υμ<ο<οο00<Ρ<θ0μυυομθοθ ' |-HP0O|_OHO0HO0OOOh0O0^0 Ρ0Η<<Ρο<<θ0μ0μ<0ομμο0< ομ0θ0υμ00ομομυομμυοο0υ μ ο μ ι— οοΟι— ι— ι μ<0^ο<0<0ΐ— < ο<-<οΡ<ζΐ-<<ρ0Ρ<ί-θο0Η-οκ<μ 0<<<υ<00μΡ00<00μ0οο<οο ο 0

<<00υοο0<οι-<0<ο<0θι-ί!)μ< μ μ<μμμ<<0ουΡυ<<0<<<οθΡ< ·= <<θ0ϋ0<μμ<ο<θ0<000μοθ0 S

υϋΡΐ-9μ^υυ0θ0μ0θουμ<0ο< η υ^^Ρ^Ρ^ϋυμμ<Ρμομυ<0<<< S <00ο0Ρμ<<θ0<υοο<υ0<0<ο ° ” μ<Ρι-0ουομυ00υ00000<0ρΗ χ

^^^υ!^υϋ<ϋυ,-,-<υο<μ0<μθΡ Q

000<0ϋ<ο<οοο0ομ0υ<0θ0ο 3 6 104188 joka koodaa hiiren IL-2Rp:a tai sen johdettua muunnosta tai sen osaa.

Esillä olevassa keksinnössä erityisen mielenkiintoisia DNA-molekyylejä ovat ne, jotka koodaavat IL-2RP:n osia, esimerkiksi solunulkoista osaa tai sen osaa 5 tai solunsisäistä osaa tai sen osaa.

Erityisen mielenkiintoisia ovat ne DNA:t, jotka koodaavat IL2-Rp:n liukoisia osia, näihin mukaanlukien solunulkoisia osia ja niiden osia.

10 Esillä olevan keksinnön piiriin sisältyy siten myös cDNA, joka koodaa edellä mainittujen cDNA-molekyylien osia, esimerkiksi hlL-2R3-ketjun täydellisen sekvenssin osia, esimerkiksi solunulkoista osaa alkaen aminohapossa (tai lähellä sitä) (a,a) (kts. kuvio 1 B) 1 esimerkiksi 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ja päättyen aminohapossa (tai sen läheisyydessä) 214 esimerkiksi 200, 201, 202, 15 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, tai tämän solunulkoisen osan alaosia tai sen johdettuja muunnoksia tai reseptoriketjun solunsisäistä osaa vastaavia osia, esimerkiksi osaa alkaen aminohapossa (tai lähellä sitä) 239 esimerkiksi a.a. 230, 231, 232, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242 aminohappoon 525 asti (tai lähelle sitä), 20 esimerkiksi 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524 ja 525, tai sen alaosia tai sen johdettuja muunnoksia, sekä cDNA, joka koodaa hiiren IL-2Rp-ketjun (kts. kuvio 8) täydellisen sekvenssin osia, esimerkiksi solunulkoista osaa aika-en aminohapossa (tai lähellä sitä) 1, esimerkiksi 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ja päättyen aminohappoon 210 (tai lähelle sitä), esimerkiksi 200, 201, 202, 203, 25 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220 tai tämän solunulkoisen osan alaosia tai sen johdettuja muunnoksia, tai reseptoriketjun solunsisäistä osaa vastaavia osia, esimerkiksi osaa, joka *: alkaa aminohapossa (tai lähellä sitä) 235, esimerkiksi aminohappo 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 30 242 aminohappoon 513 asti (tai lähelle sitä), esimerkiksi 505, 506, 507, 508, 509, 510, 512 ja 513, tai sen alaosia tai sen johdettuja muunnoksia.

• · 7 104188

Huomattakoon, että tässä kuvatuille nimenomaisille IL-2RP-ketjuille tai niiden osille voi olla olemassa luonnonmukaisia alleelimuunnoksia yksittäisestä tapauksesta riippuen. Nämä variaatiot voivat käydä ilmi yhden tai useamman aminohapon erona koko sekvenssissä tai yhden tai useamman aminohapon 5 deleetioina, substituutioina, insertioina, inversioina tai lisäyksinä sekvenssissä. Lisäksi on huomattava, että tässä kuvattu IL-2R3-ketju tai sen osat voivat olla modifioituja geenitekniikan avulla, esimerkiksi pistemutatoimalla, substituoi-malla, deletoimalla tai lisäämällä yksi tai useampi aminohappo muuttamatta IL-2RP-ketjun tai sen osan oleellisia ominaisuuksia. Esillä olevan keksinnön 10 piiriin sisältyvät siten myös DNA-sekvenssit, jotka kykenevät hybridisoitumaan tässä yhteydessä kuvattujen DNA-sekvenssien kanssa, ja jotka koodaavat proteiineja, joilla on oleellisesti IL-2RP-ketjun tai sen osien, erityisesti liukoisen IL-2RP:n aktiivisuus.

15 Keksinnön eräänä tavoitteena on edelleen tuoda esiin rekombinantti-DNA-molekyyli, joka koodaa ihmisen IL-2RP:n vesiliukoista osaa (hlL2-R3), esimerkiksi aminohapposekvenssiä, joka käsittää koko hlL2-R3:n aminohapot noin 1 - noin 210. Tällainen DNA-molekyyli voi koodata esimerkiksi liukoista ihmisen interleukiini-2-reseptorin β-ketjujohdosta, jossa on 212 aminohapporyh-20 mää, joista ryhmät 1-210 vastaavat luonnon IL-2RP-ketjun aminohappoja.

Esimerkiksi eräässä jäljempänä kuvatussa suoritusmuodossa ovat liukoista hlL-2Rp-johdannaista koodaavat cDNA-molekyylin terminaaliset nukleotidit seuraavia: 25 GCC CTT G CT AGCTAG 208 Ala Leu Ala Ser [Stop] i · <

Rekombinantti-DNA-teknologian vakiomenetelmiä käyttämällä voidaan sopivi-30 en isäntäsolujen transformoimista varten rakentaa vektoreita, jotka sisältävät cDNA-sekvenssejä, jotka vastaavat edellä esitetyn IL-2RP:n tai minkä tahansa sen halutun osan tai sen johdetun muunnoksen rakennegeeniä.

• · 104188 8

Sopivia vektoreita ovat esimerkiksi plasmidivektorit, ja ne sisältävät kontrolli- ja säätelysekvenssejä, jotka on operatiivisesti kytketty IL-2R3-ketjua tai sen osaa koodaavaan cDNA-sekvenssiin.

5 Sopivat tekniikat ovat yleisesti tunnettuja ja laajalti käytettyjä, ja niitä on kuvattu esimerkkimäisesti muiden proteiinien yhteydessä eurooppalaisissa patenttijulkaisuissa, julkaisunumerot 0254249 ja 01700204.

Halutun proteiinin saaminen puhtaassa muodossa viljelmästä voidaan suorit-10 taa standarditekniikoilla, ja tällaisesta proteiinista saadaan sopiva antigeeni monoklonaalisten vasta-aineiden valmistamista varten. Siten hybridomeja, jotka kykenevät erittämään monoklonaalista vasta-ainetta, jolla on spesifinen affiniteetti IL-2Rp-ketjuun tai sen haluttuun osaan, voidaan valmistaa immuno-soimalla ei-ihmiseläin rekombinantti- IL-2R3:lla tai sen osalla, poistamalla 15 pernasolut ei-immunoglobuliinia erittävien myeloomasolujen kanssa ja valitsemalla saaduista hybridomeista solulinja, joka tuottaa sitoutumisspesifisyydel-tään halutunlaista monoklonaalista vasta-ainetta, ja haluttaessa sen jälkeen alikloonaamalla tällainen hybridoma.

20 Tekniikat, joilla valmistetaan hybridomia ja joilla näistä saadaan monoklonaali-sia vasta-aineita puhtaassa muodossa, ovat yleisesti tunnettuja, ja niitä on esimerkkimäisesti kuvattu eurooppalaisessa patenttihakemuksessa, julkaisu- « numero 0168745.

25 Keksinnön mukaiset vasta-aineet ovat hyödyllisiä esimerkiksi diagnostisissa tarkoituksissa ja myös immuunisupression tai -aktivoinnin avulla tapahtuvassa hoidossa. Edellä on jo mainittu, että tällaisia vasta-aineita voitaisiin muodostaa käyttämällä puhdistettua rekombinanttiproteiinia keksinnön mukaisesti tai transfektoimalla keksinnön mukainen cDNA, ottamalla talteen reseptoria suuria 30 määriä ekspressoivia soluja ja käyttämällä tällaisia soluja vasta-aineiden valmistamiseen.

104188 9

Edellä jo todettiin, että esillä oleva keksintö käsittää IL-2R3-ketjun liukoiset muodot ja liukoisen IL-2-reseptorin. Liukoisiin muotoihin sisältyvät ne muodot, joita koodaavat cDNA-sekvenssit, jotka koodaavat IL-2Rp:n solunulkoista osaa tai sen alaosia, kuten edellä on kuvattu. Haluttaessa voidaan tuottaa samanai-' 5 kaisesti sekä IL-2R3-ketju että a-ketju.

IL-2p-ketjun alaosille spesifisten monoklonaalisten vasta-aineiden saatavuus mahdollistaa reseptoriketjun epitooppien tunnistamisen. Tämä avaa siten tien reseptorin aktiivisuuden kontrolloimiseen käyttämällä sopivia monoklonaalisia 10 vasta-aineita tai muita peptidejä tai peptidomimeettisiä aineita tai proteiiniana-logeja.

Ihmisen IL-2RB-ketiua koodaavien cDNA-kloonien eristäminen ia analysointi 15 cDNA-kloonien eristämisessä sovellettiin ekspressointikloonausstrategiaa käyttämällä monoklonaalisia Mik-βΐ-ja Mik-32-vasta-aineita (19). Molemmat näistä on kehitetty ihmisen leukemiasolulinjan YT IL-2R3-ketjua vastaan (20).

Kummankin monoklonaalisen vasta-aineen Mik-βΐ ja Mik-32 tallentamispaikka 20 on Fermentation Research Institute, Angency of Industrial Science and

Technology, Japani. Mik-βΐ :n ja Mik-32.n tallennusnumerot ovat vastaavasti 10453 ja 10454 (1988); ne on myös kuvattu japanilaisessa patenttihakemuk-..... sessa n:o 298742 (1988).

25 Muutama cDNA-kirjastojoukko valmistettiin tavanomaisilla menetelmillä käyttämällä YT-soluista saatua poly(A)+-RNA:a. cDNAkirjastot valmistettiin käyttämällä cDM8-vektoria julkaistujen menetelmien (21) mukaisesti, mutta käyttämällä ' Ί jäljempänä esitetyn mukaisesti satunnaisprimeeriä (Amersham) tai oligo (dT)- primeeriä. Standardimenetelmällä valmistettiin 5,6x106 itsenäistä pesäkettä i 30 edustava plasmidi-DNA ja ensimmäiseen DNA- transfektioon käytettiin 1 mg DNA:a. Käytännössä DNA jaettiin 100 putkeen (jokainen putki sisälsi siten 10 pg DNA:a) ja jokainen niistä transfektoitiin 3,5x105 apinan cos-soluun ku-dosviljelymaljalla (60 mm polystyreenimalja, Corning). Transfektointi suoritettiin 104188 10 käyttämällä DEAE-dekstraanistandardimenetelmiä. Sen jälkeen transfektoidut COS-solut käsiteltiin Mik-βΐ - ja -P2-vasta-aineiden seoksella (kummallekin vasta-aineelle 400-kertaisesti laimennetut askiitit) ja huuhdeltiin normaalilla tavalla. Huuhteluun käytetty malja oli FALCON 60 mm malja, joka oli päällystet-5 ty edellä kuvatulla tavalla anti-hiiri-ILgG:lla (viite 21). Tällä ensimmäisellä huuhtelukierroksella käytettiin 100 IgG-päällystettyä maljaa. Huuhtelun jälkeen valmistettiin normaalilla menetelmällä (viite 21) Hirt-uute ja talteenotetut plas-midit vietiin E.coliin viitteessä 21 kuvatulla menetelmällä. Tällä menetelmällä saatiin 3,7x10s pesäkettä. Nämä bakteeripesäkkeet fuusioitiin COS-solujen 10 kanssa normaaleilla protoplastifuusiomenetelmillä (viite 21). Näissä fuusiokokeissa käytettiin 26 Corning-maljaa, joista jokainen sisälsi 5x10® COS-solua. Fuusion jälkeen COS-solut huuhdeltiin edellä kuvatulla tavalla ja valmistettiin Hirt-uute. Hirt-uutteesta saatiin 32.000 bakteeripesäkettä. Fuusiointi ja huuhtelu toistettiin uudelleen, jolloin seuraavasta Hirt-uutteesta saatiin 32.000 baktee-15 ripesäkettä. Sama menettely toistettiin vielä kerran, jolloin saatiin 28.000 bakteeripesäkettä (tällä välin tulisi kohdepesäkkeiden rikastua dramaattisesti). Samat menettelyt toistettiin vielä kerran ja saatiin 6.000 pesäkettä. Näistä pesäkkeistä valittiin mielivaltaisesti 30 pesäkettä ja analysoitiin cDNA-insertit. Näistä vain 7 pesäkettä sisälsi plasmideja, joista Xhol-restriktioentsyymillä 20 voitiin leikata cDNA-inserttejä. Vektoriperäiset Xhol-kohdat sijoitettiin cDNA:n kummallekin puolelle, ja kaikki muut plasmidit olivat menettäneet tällaiset katkaisukohdat DNA:n toisiintumisista johtuen; itse asiassa kaikkien niiden koko oli paljon pienempi kuin alkuperäisen vektorin. Niitä pidettiin siten epäspesifisinä tuotteina. Toisaalta kaikki nämä 7 pesäkettä olivat peräisin samasta 25 mRNA:sta, mikä vahvistettiin tavanomaisen restriktioentsyymianalyysin avulla ja DNA-blot-analyysin avulla. Näistä yksi plasmidi, jolle annettiin nimeksi pIL-2RP30, sisälsi pidemmän cDNA:n kuin muut 6 plasmidia, jotka vuorostaan ‘i osoittautuivat keskenään identtisiksi (nimeksi annettiin plL-2RP9).

30 Tässä menetelmässä eristimme sen vuoksi kaksi toisistaan riippumatonta cDNA-kloonia, plL-2Rip9:n ja ρΐί-21β30:η; kumpikin ekspressiotuote reagoi spesifisesti vasta-aineiden kanssa. Nämä kaksi kloonia sisälsivät vastaavasti 1,3 kb ja 2,3 kb cDNA-insertit ja ne ristihybridisoituivat keskenään. Myöhempi 104188 11 cDNA-molekyylien sekvenssianalyysi osoitti, että ne edustavat samaa mRNA:a. Itse asiassa RNA-blotting-analyysi osoitti, että mRNA on kooltaan noin 4 kb (kts. jäljempänä). Myöhemmin seuloimme muita YT cDNA-kirjastoja käyttämällä koettimina kloonattuja cDNA-molekyylejä ja eristimme useita 5 riippumattomia cDNA-klooneja, jotka yhdessä kattavat koko IL-2R2P-ketjun mRNA:n. Siten pll_-2Rip6 ja plL-2Ripi9 saatiin seulomalla cDNA-kirjastot koettimen pll_-2Rp9-cDNA-insertillä.

Edellä mainitut plasmidit, jotka sisältävät ihmisen IL-2RP-sekvenssejä koodaa-10 van cDNA:n, on tallennettu 2.3.1989 E.coli MC 1061/P3-kannassa Budapestin sopimuksen mukaisesti Fermentation Research Institute-kokoelmaan seuraa-villa numeroilla:

Plasmidi Järjestysnumero 15 plL-2Rp6 FERM BP-2312 plL-2Rp9 FERM BP-2313 PIL-2RP19 FERM BP-2314 plL-2Rp30 FERM BP-2315 20 Neljän kloonatun cDNA:n täydelliset nukleotidisekvenssit määritettiin (kuvio 1). Kuviossa 1 on esitetty ihmisen IL-2RP-ketjun cDNA:n rakenne. Kuvio 1a esittää * kaavallisesti kloonatuista cDNA-molekyyleistä johdettua mRNA:a. Alempana on annettu pisteviivoitettujen, vinoviivoitettujen, avoimien ja täytettyjen suora-25 kulmioiden avulla vastaavasti mRNA:n signaalisekvenssi-, solunulkoinen-, transmembraani-ja sytoplasminen alue. Kuviossa 1b on esitetty ihmisen IL-2RP-ketjun cDNA:n nukleotidi-ja aminohapposekvenssit. Sekvenssi johdet-' *· tiin seuraavana esitetystä edellä kuvattujen cDNA-kloonien täydellisestä DNA- sekvenssianalyysistä. Nukleotidit on numeroitu oikeaan marginaaliin ja amino-30 hapot vasempaan marginaaliin. Kloonit plL-2Rpi9 ja plL-2RP6 sisälsivät kumpikin G-A-mutaation vastaavasti nukleotidiryhmissä 425 ja 1531. plL-2R£6 cDNA sai siten TAG-tripletin sytoplasmiseen alueeseen. Sen uskotaan olevan käänteistranskriptiossa tapahtuneen virheen, koska kaikissa muissa klooneis- f 12 104188 sa, plL-2Rp30:ssa, p!L-2Rpi9:ssa ja plL-2Rpi6:ssa, on tässä asemassa TGG-tripletti. Ensimmäiset alleviivatut 26 aminohapporyhmää merkitsevät consensus-sekvenssin (22) ennustamaa signaalisekvenssiä. 25-transmem-braani-aminohapporyhmää on merkitty paksulla alleviivauksella. Kysteiiniryh-5 mät on neliöity. Potentiaaliset N-glykolysaatiokohdat on alleviivattu kahdesti. Mahdolliset poly-adenylaatiosignaalit on esitetty avoimella suorakulmiolla. Yhteenvetona voidaan sanoa, että RNA valmistettiin NK-maisesta ihmisen lymfoidisolulinjasta YT ja cDNA-kirjastot valmistettiin käyttämällä CDM8-vekto-ria julkaistujen menetelmien (21) mukaisesti paitsi, että käytettiin joko satun-10 naisprimeerejä (Amersham) (plL-2Rp6, 9 ja 30) tai oligo (dT) primeeriä (pIL- 2RP19). cDNA-kirjastot seulottiin anti-IL-2Rp-monoklonaalisten vasta-aineiden, Mik-P1 :n ja Mik-P2:n, coktaililla edellä kuvatulla tavalla (21). Nukleotidisek-venssit määritettiin dideoksiketjun päättämismenetelmän ja kemiallisen pilkko-mismenetelmän yhdistelmällä.

15

Kuviossa 1 on esitetty, että cDNA sisältää suuren avoimen lukukehyksen, joka koodaa 551 aminohaposta koostuvaa proteiinia. Mitään merkittävää homologiaa muiden tunnettujen proteiinien kanssa ei löydetty Portein Sequence Database-tietokannasta (National Biomedical Research Foundation, 20 Washington, D.C.) tai vielä uudempien julkaistujen sekvenssien kanssa. Vastoin kuin monet muut sytokiinireseptorit, näyttää siltä, että IL-2Ra-ja IL-2RP-ketjut eivät kuulu immunoglobuliinisuperperheeseen. Proteiinin johdetun rakenteen perusteella uskotaan 26 N-terminaalisen aminohapon esittävän signaali-sekvenssiä. IL-2Rp-ketjun valmis muoto muodostuu siten 525 aminohaposta 25 lasketun molekyylipainon ollessa 58.358. Kuviossa 1 esitetyn mukaisesti reseptorimolekyyli muodostuu ekstrasellulaarisesta alueesta, jossa on 214 aminohappoa. Tämä alue sisältää 8 kysteiiniryhmää, joista 5 ryhmää on N-terminaalisessa puoliskossa, ja niiden välissä on melko säännöllisesti 9 -12 aminohappoa. Kysteiiniryhmien välissä olevat disulfidisidokset antavat toden-30 näköisesti stabiilin konfiguraation ligandin sitoutumiselle. Itse asiassa kysteiiniryhmien runsaus näyttää olevan eräs monien reseptoreiden ligandeja sitovan alueen yleisimmistä piirteistä (23). Huomionarvoista voi olla, että aminohappojen (a.a.) ennustettu määrä IL-2RP-ketjun solun ulkoisella alueella (214 104188 13 a.a.) on lähes verrattavissa IL-2Ra-ketjun vastaavaan määrään (219 a.a.). Tällainen kokojen samankaltaisuus voi olla merkitsevää, kun otetaan huomioon heterodimeerisen reseptorikompleksin konformaatio, joka on täysin ainutkertainen tällä reseptorilla; sekä a- että β-ketjuilla on yksitellen vuorovaikutus 5 saman IL-2-molekyylin selvästi erotettavien kohtien kanssa.

25 aminohapon hydrofobinen osa, joka ulottuu aminohaposta 215 aminohappoon 239, näyttää muodostavan reseptorin membraanivälialueen (kuviot 1 ja 2).

10

Kuviossa 2 on esitetty hydropatiakäyrä-analyysi johdetuista ihmisen IL-2Ra- ja IL-2Rp-ketjun prekursorien rakenteista. Analyysi suoritettiin Kyte'n ja Doolittle'n menetelmällä (38). SG ja TM esittävät vastaavasti signaalisekvenssiä ja trans-membraanisekvenssiä.

15 13-ketjun sytoplasminen alue muodostuu 286 aminohaposta ja se on paljon suurempi kuin α-ketjun vastaava alue, joka on vain 13 aminohapon pituinen. β-ketjusta puuttuu tyrosiinikinaasin konsensussekvenssit (Gly-x-Gly-x-x-Gly) (25). Huomattakoon kuitenkin Ala-Pro-Glu (293-295)-tripletin mukanaolo; 20 tämän on ilmoitettu olevan eräiden proteiinikinaasien katalyyttisen alueen konsensuskuvion (25). Toistaiseksi on testaamatta mahdollisuus, että β-ketjun sytoplasmisella alueella on proteiinikinaasi-aktiivisuus. Tämän alueen primääri-nen rakenne paljasti vielä toisen mielenkiintoisen piirteen: melko voimakas taipumus tiettyjen tunnusomaisten aminohappojen läsnäololle. Tämä alue sisäl-25 tää runsaasti proliini-(42/286)-ja seriini-(30/286)-ryhmiä. Mielenkiintoista kylläkin "runsasproliininen" rakenne on osoitettu CD2:n T-solumembraanin antigeenin, joka liittyy T-solujen aktivoitumisreittiin, sytoplasmisessa alueessa (26).

* 'i Runsasproliininen rakenne voi antaa tälle alueelle ei-pallomaisen rakenteen, joka voi olla tärkeä kytkettäessä reseptorimolekyyli muun signaalimuuntajan 30 (-muuntajien) kanssa. Vallitsevat seriiniryhmät voivat olla pääkohde fosforylaa-tiolle, joka myös saattaa säätää reseptorin toimintaa (27). Sytoplasmisella alueella esiintyy lisäksi selvästi vinoumaa negatiivisesti varautuneiden aminohappojen suhteen. Itse asiassa tämä alue sisältää 40 tällaista aminohappoa 14 104188 (so. glutamiini- ja asparagiinihapot), kun taas positiivisesti varautuneita ryhmiä (so. lysiini ja arginiini) on vain 18 aminohappoa. Tällainen vinouma on erityisesti havaittavissa sytoplasmisen alueen keskiosassa (aminohapot 345-390). β-ketjun sytoplasminen alue voi siten olla varsin hapan. Eräät, ja mahdollisesti 5 kaikki, nämä ainutlaatuiset ominaisuudet yhdessä voivat olla syynä myötävirtaan tapahtuvan signaalitransduktion radan (ratojen) siirtymiseen edemmäksi. Reseptoriproteiini sisältää 5 potentiaalista N-kytkeytynyttä glykolysaatiokohtaa (kuvio 1B), joista 4 sijaitsee solunulkoisessa alueessa. Tällainen translaation jälkeinen modifikaatio voi olla syynä arvioidun valmiin (70-75kD) ja lasketun 10 (58kD) proteiinimolekyylin molekyylipainojen eroon, oc-ja β-ketjujen hydropa- tiakäyrä-analyysi osoitti, että kummassakin ketjussa on aivan solumembraanin vieressä hydrofiilisiä alueita (kuvio 2). Näillä alueilla voi olla oma osuutensa kahden ketjun välisessä ei-kovalenttisessa molekyylinsisäisessä liittymisessä.

15 Ihmisen IL-2R8-ketiun mRNA:n ekspressointi ΙΙ_-2Ρβ mRNA:n ekspressoitumista tutkittiin käyttämällä koettimena pIL-2Ρβ30:8ί8 saatua cDNA-inserttiä.

20 Kuvio 3a kuvaa ihmisen ΙΙ_-2Ρβ4<β^υη mRNA:n ekspressointia erilaisissa solu-tyypeissä. Seuraavista solulähteistä preparoitiin poly(A)+RNA:a (2 pg kaistaa kohti) ja niille suoritettiin RNA-blotting-analyysi käyttämällä koettimena Xhol:lla : pilkottua ihmisen IL-2Rβ-ketjun cDNA-fragmenttia, joka oli saatu plasmidista ρΙΙ_^β30, noudattamalla standardimenetelmiä (14, 18, 27). Kaista 1, YT; 25 kaista 2, Hut102(HTLV-1 :lla transformoitu ihmisen T-solulinja); kaista 3, MT-2(HTLV-1:lla transformoitu ihmisen T-solulinja), kaista 4, ARH-77 (muitip-pelimyelooma-linja); kaista 5, SKW6.4 (EBV:lla transformoitu ihmisen B-lymfo-blastoidilinja), kaista 6, U937 (histiosyyttinen leukemialinja); kaista 7, MT-1 (HTLV-1:lla transformoitu ihmisen T-solulinja), kaista 8, Jurkat (ihmisen T-leu-30 kemialinja); kaista 9, HeLa (ihmisen kohdunkaulasyöpäsolulinja).

Kuten kuviossa 3a on esitetty, RNA-blot-analyysi osoitti läsnäolevan 4kb ·: mRNA:n, jonka ekspressoituminen on rajoittunut lymfoidisoluihin, joiden aikai- 15 104188 semmin on identifioitu sisältävän IL-2RP-ketjun (so. YT, MT-2, Hut102, SKW6.4) (12, 16, 17). Toisaalta mRNA:n ekspressiota ei havaittu sellaisissa soluissa kuin Jurkat, MT-1, U937, ARH-77 ja HeLa. mRNA:n ekspressoitumis-tasot korreloituvat oleellisesti IL-2R3-ketjun ekspressoitumistasojen kanssa.

5

Kuviossa 3b on esitetty IL-2RP- ja IL-2Ra-mRNA-molekyylien ekspressoitu-minen ihmisen PBL:ssa. Jokainen kaista kuormitettiin kokonais-RNA:lla (15 pg/kaista). Kaistat 1 ja 4 ovat stimuloimattomia ihmisen periferiaveren lymfosyyttejä (PBL); kaistat 2 ja 5 ovat PBL-soluja, jotka on stimuloitu 5 pg/ml 10 fytoemaglutiinilla (PHA) 24 tunnin ajan; kaistat 3 ja 4 ovat PBL-soluja, jotka on stimuloitu 72 tuntia 5 pg/ml PHA:lla. RNA-blotattu suodatin hybridisoitiin IL-2RP-koettimen kanssa (kaistat 1-3) IL-2R3-koettimen dehybridisoinnin jälkeen sama suodatin hybridisoitiin IL-2Ra-koettimen kanssa (pSVIL2R-3:sta saatu Xbal-Bcll-fragmentti (14) (kaistat 4-6)).

15

Mielenkiintoista oli, että IL-2Rp-mRNA voitiin detektoida stimuloimattomissa PBL-soluissa ja että sen ekspressoitumistasot kasvoivat väliaikaisesti vain 2,5-kertaisiksi mitogeenilla stimuloinnin jälkeen. Aikaisemmin virtaussytometri-analyysistä saatujen tulosten perusteella (19) on todennäköistä, että mRNA:n 20 indusointikuviot ovat erilaisia erilaisten lymfosyyttipopulaatioiden kesken.

Tämä ekspressoitumiskuvio on täysin erilainen kuin IL-2Ra-ketjulla, jonka ekspressio ehdottomasti edellyttää solujen mytogeenistä stimulointia (kuvio 3b), mikä viittaa siihen, että näiden kahden geenin välillä on erilaiset geenin ekspressoitumismekanismit.

25 PBL:sta ja eri solulinjoista, mukaanlukien HTLV-1:lla transformoiduista ihmisen T-solulinjoista, saadun genomi-DNA:n southern blot-analyysi osoittaa, että * geeni on mukana yhtenä ainoana kopiona ja että se ei ole uudelleenjärjestäy- tynyt näihin soluihin.

30 16 104188 cFDNA:n koodaaman lL-2RB-ketiun lL-2:n sitomisominaisuudet

Seuraavaksi suoritimme joukon cDNA:n ekspressointitutkimuksia, joiden tarkoituksena oli tutkia, sitoutuuko cDNA-tuote IL-2:aan ja onko sillä todella ne IL-5 2R3-ketjun ominaisuudet, jotka on aikaisemmissa tutkimuksissa osoitettu ja/tai ehdotettu. Rakennettiin kaksi cDNA:n ekspressointiplasmidia, joissa koko koo-daavan alueen ylittävää cDNA:n ekspressoitumista ohjattiin joko hiiren ]ck-geenin (29) promoottorilla (pLCKRP) tai malonileukemiaviruksella LTR (30) (pMLVRP).

10

Ekspressointivektorit rakennettiin seuraavilla menetelmillä. plL-2R330 pilkottiin Hindlll:lla (katkaisukohta sijaitsee CDM8:n polylinkkerialueiden sisällä) ja molempien päiden täyttämisen jälkeen liitettiin ja ligatoitiin uudelleen BamHI-linkkeri. Saatu plasmidi pilkottiin tämän jälkeen BamHI:lla ja 1,8kb DNA-frag-15 mentti, joka sisältää β-ketjua koodaavan koko sekvenssin, vietiin pLCKRp:n rakentamiseksi BamHUla pilkottuun p1013-vektoriin, joka sisältää hiiren ]ck-promoottorin. BamHI:lla pilkottu cDNA-fragmentti vietiin pMLVR3:n rakentamiseksi myös retrovirus-vektoriin pZipSV(X) (30). pSVIL2R-3:sta (14) saatiin ihmisen IL-2Ra:n ekspressointivektori pSVIL2Rneo korvaamalla Eco-gypt-20 geeni neo-resistenttiysgeenillä.

Plasmidi pLCKRP vietiin hiiren T-lymfooma EL-4 ja ihmisen T-soluleukemia ; Jurkat-linjoihin, joilta kummaltakin tiedetään puuttuvan ihmisen IL-2:a sitovat pintamolekyylit.

25

Ekspressointiplasmidien transfektointi Jurkat- ja EL-4-soluihin electroporation-menetelmällä jo kuvatulla tavalla (39). Transfektoidut solut valittiin RPMI1640- « alustassa, joka sisälsi 10 % vasikansikiöseerumia (FCS) ja G418:a (1 mg/ml EL-4:lla ja 1,5 mg/ml Jurkat-soluilla). Sellaisten solujen saamista varten, jotka 30 ekspressoivat samanaikaisesti ihmisen IL-2Ra-ja IL-2RP-ketjujen cDNA:t, Jurkat-solusta johdettu, pSVIL2Rneo:lla transfektoitu klooni Ja-5 ko-transfek-toitiin pLCKRP:lla ja plasmidilla, joka sisälsi hygromysiini-resistenttiysgeenin pHgy. Transfektoidut solut valittiin 200 pg/ml hygromysiinillä. pMLVRP:n 17 104188 transfektointi 2 soluun suoritettiin kalsiumfosfaatti-menetelmällä jo kuvatulla tavalla (14) ja solut valittiin 700 pg/ml G418:lla. Virtaussytometristä analyysiä varten 5x105 solua käsiteltiin vasta-aineella (askiittien 1:500 laimennus) 4°C:ssa 30 minuutin ajan. Solut värjättiin pesun jälkeen fluoreseiinin kanssa 5 konjugoidulla vuohen anti-hiiri-lgG:lla.

Värjätyt solut analysoitiin FACS440-virtaussytometrillä (Beckton Dickinson). 125l-IL-2:n sitoutumismääritys ja Scatchard'in käyrä-analyysi suoritettiin jo kuvatulla tavalla (12).

10

Kuvio 4a havainnollistaa ihmisen IL-2Ra- ja/tai IL-2Rp-ketjun cDNA-molekyy-lien ekspressoitumista käyttämällä apuna ihmisen IL-2Ra-ja/tai IL-2RP-cDNA-transfektanttien solupintojen värjäytymistä. Emusolut ja eri transfektanttisolut värjättiin erikseen joko monoklonaalisella anti-ihmis-IL-2Ra-vasta-aineella 15 anti-Tac (-----) tai monoklonaalisella anti-ihmis-IL-2Rp-vasta-aineella Mik-βΐ (-). Pisteviiva (.....) on solujen, jotka on värjätty pelkästään fluoreseiinin kanssa konjugoidulla vuohen anti-hiiri-lgG:lla, fluoresenssiprofiili. Käytetyt solut olivat (1) ΕΙ_β-13 (ja EL-4.sta johdettu, ρΙΧ^βΜΙθ transfektoitu klooni), (2) ϋβ-8 (Jurkat-soluista saatu, PLCKRβ:lla transfektoitu klooni), (3) Ja-5 20 (Jurkat-soluista saatu, pSVIL2Rneo:lla transfektoitu klooni), (4) Ja-2 (Ja-5:sta saatu, ρίΟΚΡβιΙΙθ transfektoitu klooni), (5) ϋαβ-10 (Ja-5:sta saatu, ρίΟΚΡβιΙΙθ transfektoitu klooni) ja (6) Ρβ-3 (NIH3T3:sta saatu, ρΜίνΡβιΙΙθ transfektoitu linja).

25 FACS-analyysin perusteella (kuvio 4a) saatiin sekä EL-4:lla (Είβ-13) että Jurkat:lla (ϋβ-8) stabiileja transformanttiklooneja, jotka ekspressoivat cDNA-tuotteen. Lisäksi veimme saman geenin Jurkat-tansformanttiklooniin Ja-5, joka ekspressoi transfektoidun, ihmisen IL-2Ra-ketjun cDNA:n. Kahden saadun transformantin, Jαβ-2:π ja Jαβ-10:n, havaittiin ilmentävän sekä a- että β-ketjun 30 (kuvio 4a-{4), (5)). Kuten oli odotettuakin, näissä transformanteissa ekspres-soidun RNA:n RNA-blotting-analyysit osoittivat, että a-ja β-ketjulle spesifiset mRNA:t ovat peräisin transfektoiduista cDNA-molekyyleistä, mutta ei endogee-·: nisistä geeneistä (26). cDNA-tuotteen ominaisuuksien tutkimiseksi ei-lymfoidi- 104188 18 soluissa vietiin plasmidi pMLVR3 myös NIH3T3-solusta saatuun solulinjaan 2 (30), jolloin saatiin cDNA:n ekspressoiva transformantti Fp.3 (kuvio 4a-5)).

IL-2:n sitoutumistutkimukset suoritettiin 125l:lla leimatulla, ihmisen rekombi-5 nantti-IL-2:lla.

Kuvio 4b havainnollistaa a-ja β-ketjujen ekspressoitumista suorittamalla Scatchard'in käyrä-analyysi 125l-IL-2:n sitoutumiselle kloonattuja cDNA-mole-kyylejä ekspressoiviin transfektantteihin. IL-2:n sitoutumisarvojen Scatchard'in 10 käyrä, kun mukana ei ole (-o-o-) tai kun mukana on (-·-·-) Mik-βΐιη 1:100- laimennettuja askiitteja. Mik-βΐ esti täydellisesti 125l-IL-2:n sitoutumisen ΕΙ_β-13 tai ϋβ-8-klooneihin. Mitään spesifistä IL-2:n sitoutumista ei havaittu, kun tutkittiin Jurkat- tai EL-4-emosolut. IL-2:n sitoutumiskohtien lukumäärä solua kohti ja reseptorin affiniteetti määritettiin analysoimalla tietokoneen avulla IL-2:n sitou-15 tumisarvot. (1) Ε1_β-13, (2) ϋβ-8, (3) Ja-5, (4) ϋαβ-2, (5) ϋαβ-10.

Kuten voidaan havaita, EL-4:sta saadulla kloonilla (ΕΙ.β-13) ja Jurkat:sta saadulla kloonilla (ϋβ-8), jotka molemmat ekspressoivat β-ketjun cDNA:n, oli keskisuuri affiniteetti IL-2:aan, arvioitujen Kd-arvojen ollessa vastaavasti 4,0 nM ja 20 2,7 nM. Mik-βΐ-vasta-aine esti täydellisesti IL-2:n sitoutumisen näihin soluihin (kuvio 4b-(1), (2)). Jurkat:sta saaduilla ϋαβ-2-ja ϋαβ-10-klooneilla, jotka ekspressoivat sekä ihmisen IL-2Ra:n että IL-2Rβ:n cDNA:t, oli sekä suuri- että : pieniaffiniteettisia reseptoreita arvioitujen Kp-arvojen ollessa vastaavasti 22 pM ja 15 nM ϋαβ-2:Ιΐ3 ja 19 pM ja 33 nM ϋαβ-1 Oilia. Sitä vastoin vain a-ket-25 jun cDNAin ekspressoivilla Jurkatista saaduilla ϋα-5-emosoluilla oli yksinomaan alhainen affiniteetti (Kd: 19,5 nM) IL-2:n suhteen (kuvio 3b-(3)). Suuri-affiniteettisten IL-2R:n ekspressoivien ϋαβ-2-solujen ja ϋαβ-10:η lukumäärä oli verrattavissa ekspressoitujen IL-2Rβ-molekyylien määrään. Näiden solujen käsittely Mik-βΐ-vasta-aineella tuhosi lisäksi täysin suuriaffiniteettiset IL-2:n 30 sitomiskohdat solupinnalta samalla, kun matala-affiniteettisen IL-2R:n ekspres-sio säilyi (kuvio 4b-(4), (5)). Nämä havainnot osoittavat yksiselitteisesti, että CDNAin koodaama IL-2Rβ-molekyyli ottaa suoraan osaa suuriaffiniteettisen ♦: reseptorikompleksin muodostumiseen yhdessä IL-2Ra-ketjun kanssa. Päinvas- 104188 19 toin kuin edellä mainituilla T-solutransformanteilla ei Ρβ-3-soluilla ollut mitään IL-2:n sitoutumista solun pintaan samoissa sitoutumisolosuhteissa. Mielenkiintoista kyllä sama havainto tehtiin apinan COS-soluilla, jotka ekspressoivat β-ketjun mutta eivät sitoneet IL-2:a (28). Tulokset viittaavat siten siihen, että 5 funktionaalisen IL-2RP-ketjun ekspressointiin ottaa osaa joko solutyypille spesifinen prosessointimekanismi (-mekanismit) tai jokin muu solukomponentti (-komponentit) tai molemmat.

Rekonstituoidun IL-2R:n molekyylirakenteen jatkokarakterisointia varten suori-10 timme kemiallisia ristisidostuskokeita 125l-IL-2:n ja pilkkoutumattoman kemiallisen silloittajan, disukkinimidyylisberaatin (DSS) kanssa.

Kuvio 5 havainnollistaa IL-2R-positiivisten transformanttien affiniteetti-ristisi-dostustutkimusten tuloksia. Soluja-inkuboitiin 5 nM (kaistat 1-13) tai 100 pM 15 (kaistat 14-16) 125l-IL-2:n kanssa, kun mukana ei ollut (kaistat 1-4, 14-16) tai kun mukana oli 250-kertainen mooliylimäärä leimaamatonta IL-2:a (kaistat 5-7), 500-kertainen mooliylimäärä affiniteettipylväässä puhdistettua Mik-βΐ :a (kaistat 8-10) tai 500-kertainen mooliylimäärä affiniteettipylväässä puhdistettua anti-Tac:ia (kaistat 11-13). Sen jälkeen solut ristisidostettiin kemiallisesti 20 disukkinimidyylisuberaatin (DSS) kanssa jo kuvatulla tavalla (16). Tämän jälkeen solut liuennettiin ja supernatantit ajettiin 7,5 % SDS-PAGE:lla. Käytetyt solut olivat: Jurkat (kaista 1); Ja-5 (kaistat 2, 5, 8, 11, 14); ϋβ-8 (kaistat 3, 6, 9, ; 12, 15); ϋαβ-10 (kaistat 4, 7, 10, 13, 16). Markkerina (M) käytettiin 125l-ll_-2:n kanssa ristisidostettuja YT-soluja.

25

Kuviosta voidaan nähdä, että vain ΙΙ_-2Ρβ4<βί}υη ekspressoivat solut ristisidostettiin 125l-leimatun IL-2:n kanssa ja analysoitiin SDS-PAGE:lla, jolloin detektoi-tiin kaksoisvyöhyke, joka muodostui 90 kD päävyöhykkeestä ja 85 kD pienemmästä vyöhykkeestä ja jonka kulkeutumisprofiili ei ollut erotettavissa YT-solu-30 jen profiilista (kts. nuolet kuviossa 5 ja viitteet 16, 17). Leimaamattoman IL-2:n ylimäärä tai Mik-βΐ esti kaksoisvyöhykkeen muodostumisen. Kaksoisvyöhyk-keen muodostuminen voi johtua reseptori-IL-2-kompleksin hajoamisesta. Mah-·: dollista on myös se, että kummatkin proteiinituotteet ovat peräisin jälkitransla- 104188 20 tionaalisesta erottavasta modifikaatiosta (-öistä). Toinen kaksoisvyöhyke voi vaihtoehtoisesti olla reseptorikompleksin kolmas komponentti. Transfektantis-sa (ϋαβ-10) sekä YT-soluissa havaittiin myös leveä vyöhyke, joka kulkeutuu noin 150 kD kohdalla. Myös tämän vyöhykkeen muodostuminen estyi joko 5 leimaamattoman IL-2:n tai Mik-βΐιη vaikutuksesta. Se voi olla IL-2-, IL-2Rcc-ja IL-2R3-molekyylien ternäärinen kompleksi. Kuviossa 4 esitetyssä, kemiallisessa ristisidostuskoesarjassa osoitettiin, että ϋαβ-2:η pinnalla ekspressoidun reseptorikompleksin fysikokemialliset ominaisuudet eivät ole erotettavissa viljellyillä T-soluilla tai PBLIIa ekspressoidun suuriaffiniteettisen reseptorin 10 ominaisuuksista (12,16,17).

Alustavat tulokset kokeista, joissa määritettiin, johtaako a-ja β-ketjujen eks-pressio ei-lymfoidisoluissa suuriaffiniteettisen reseptorin muodostumiseen, osoittavat, että kun a-ja β-ketjun cDNA:t koekspressoituvat väliaikaisesti COS-15 soluissa, molemmat ketjut voivat ristisitoutua 125l-IL-2:n kanssa sellaisessa konsentraatiossa (400 pM), jossa samalla tavalla ekspressoitu α-ketju ei yksinään voi (28). Tulokset voivat viitata αβ-heterodimeerisen reseptorin, muodostumiseen tässä ei-lymfoidisolulinjassa.

20 IL-2:n internalisointi rekonstituoituien reseptoreiden toimesta

Keksiaffiniteettisten ja suuriaffiniteettisten IL-2-reseptoreiden on raportoitu kummankin kykenevän internalisoimaan IL-2:n (33-35). Ligandin internalisoin-tiin liittyy tavallisesti IL-2:n signaalin transduktio, mikä viittaa siihen, että tämä 25 prosessi on välttämätön.

Kuvio 6 havainnollistaa IL-2:n internalisoitumista rekonstituoitujen reseptorei-: den kautta. IL-2:n internalisoitumista tutkittiin aikaisemmin kuvatulla menetel mällä (33). Lyhyesti sanottuna solut (5x107) käsiteltiin 12Sl-IL-2:lla 200 pM 30 (ϋαβ-10) tai 5 nM (Ja-5, ϋβ-8 ja ΕΙβ-13) loppukonsentraatiossa 30 minuutin ajan 0°C:ssa. Pesun jälkeen solut suspendoitiin esilämmitettyyn viljelyalustaan (37°C) ja IL-2:n internalisoitumisen kinetiikka tutkittiin aikaisemmin kuvatulla > · » 104188 21 tavalla (33). (a) Είβ-13, (b) ϋβ-8, (c) ϋαβ-10, (d) Ja-5. (-·-·-·-), internalisoitu IL-2; (...0...0...), solupintaan sitoutunut IL-2; (-----), vapaa IL-2.

Kuten kuviossa 6 on esitetty, tutkimme, kykenevätkö rekonstituoidut reseptorit 5 Internalisoimaan IL-2:n. Itse asiassa solut, jotka ekspressoivat vain ΙΙ_-2Ρβ-ketjun tai sekä a- että β-ketjut, kykenevät internalisoimaan IL-2:n noudattamalla kinetiikkaa, joka on samanlainen kuin mitä on raportoitu natiiville reseptorille. Sitä vastoin Jurkat-solut, jotka ekspressoivat vain IL-2Ra:n, eivät kyenneet internalisoimaan IL-2:a vastaten aikaisemmin raportoituja havaintoja (33, 34). 10 Alustavat tulokset osoittavat, että IL-2 inhiboi selektiivisesti solujen, jotka ekspressoivat keskiaffiniteettisia tai suuriaffiniteettisia reseptoreita, kasvua (14, 36). Meillä on myös alustavia tuloksia siitä, että toisessa isäntäsolulinjassa ekspressoitu β-ketju stimuloi IL-2:n reaktiona tapahtuvaa solukasvua (28).

15 Hiiren IL-2R-reseptorin β-ketiun kloonaus

Hiiren IL-2-reseptorin β-ketjulle ei tiedetä olevan olemassa mitään spesifisiä vasta-aineita ja siten ei käytetty seulontamenetelmää, jota käytettiin cDNA:n eristämiseen Hu Ιί^β^β^θ varten.

20 cDNA-kirjasto valmistettiin käyttämällä konkanavaliini A:lla stimuloiduista hiiren pernasoluista saatua poly (A)+-RNA:a; cDNA kloonattiin Agt 10:ssa, joka monistettiin E.coli'ssa.

25 Sen jälkeen tämä kirjasto seulottiin käyttämällä koettimena edellä kuvattua ihmisen Ιί^β^β^η cDNA:a ei-stringenteissä olosuhteissa. Positiivisista klooneista valittiin yksi klooni, jolle annettiin nimeksi AMIL 2RP-26. Tämän kloonin cDNA-insertti sisälsi vain 540 bp sekvenssin hiiren IL-2R8-ketjun koko sekvenssistä. Sen vuoksi tämä sekvenssi eristettiin pilkkomalla λMIL-2Rβ-26 30 Pvu 2:lla ja käytettiin toisen cDNA-kirjaston seulomiseen, joka oli valmistettu standardimenetelmillä hiiren kateenkorvakasvainsolulinjasta EL-4 saatua poly(A)+:a, ja kloonattu CDM8-vektorin BstXI-kohtaan E. coli'n transfektoinnin ·: jälkeen.

104188 22 cDNA-kirjasto seulottiin erittäin stringenteissä olosuhteissa seuraavissa julkaisuissa kuvatuilla menetelmillä: eurooppalainen patenttihakemus n:o 88 119 602.9 ja Kashima et ai. (Nature Voi. 313 ss. 402-404, 1985).

5 Positiivisista klooneista valittiin hiiren IL-2RP:n rakennegeenin (kts. kuvio 8) sisältävä klooni pMIL-2RP-36. cDNA-kloonin restriktiokartta on esitetty kuviossa 7.

Plasmidi pMIL-2RB-36 on tallennettu E. coli MC 1061/P3-kannassa 23.5.1989 10 Fermentation Research Institute-kokoelmaan Budapestin sopimuksen mukaisesti numerolla FERM BP-2435.

Liukoisen ihmisen interleukiini 2:n reseptorin B-ketiun valmistaminen 15 hlL2-R3-ketjun erittynyt muoto (jäljempänä käytetään nimitystä liukoinen 13) valmistettiin transfektoimalla NIH 3T3-fibroblastit modifioidulla β-ketjun cDNA:lla ("ankkuri-minus" cDNA), jolta puuttuu koko DNA-sekvenssi, joka koodaa natiivin β-ketjun sekä intrasytoplasmista että transmembraanialuetta.

20 Ankkuri-minus cDNA:n sisältävän ekspressointivektorin, joka koodaa liukoista B, rakentaminen (BCMGNeo-sol.B) : β-ketjun cDNA (kuvio 1b) modifioitiin ankkuri-minus-muotoon liukoisen β:η tuottamista varten. Kuviossa 9 on havainnollistettu strategia, jota käytettiin 25 muodostamaan ankkuri-minus-cDNAin sisältävä ekspressointivektori. Plasmidi ρΙί-2Ρβ30, joka sisältää 2,3 kb β-ketjun cDNA:n CDM8-vektorissa, pilkottiin ensin BssH Hilla ja Sma lilla (kaikkien restriktioentsyymien nostopaikka oli New England BioLabs, Beverly, MA, USA), jolloin saatiin 1,9 kb cDNA-frag-mentti (emäkset 58-1967), joka sisälsi β-ketjun koko koodaavan sekvenssin 30 (emäkset 121-1773). BsssH ll-pään täyttämisen jälkeen insertoitiin 1,9 kb cDNA pBluescript SK-vektorin (Stratagene, San Diego, CA, USA) Sma l-res-triktiokohtaan. Tämä pBluescirpt SK-βΙ .9-plasmidi pilkottiin sen jälkeen ·: Sty lilla (restriktiokohdat; emäkset 825, 934 ja 1235) ja Sma lilla, jolloin kaikki 23 104188 intrasytoplasmiset ja transmembraanialueet deletoituivat niin, että jäljelle jäivät emäkset 121-840, jotka edustavat suurinta osaa solunulkoisesta alueesta ehjänä. Seuraavaksi fosforyloitiin 12-emäksinen synteettinen linkkeri (New England BioLabs, n:o 1060), joka sisälsi multippelit terminaatiokodonit (TAG) sekä 5 Nhe l:n tunnistamissekvenssin, ja liitettiin T4 DNA-ligaasilla Sty l/Sma l-pilkot-tiin plasmidi-DNA:an. Ylimääräinen linkkeri poistettiin pilkkomalla Nhe lilla, minkä jälkeen pBluescript SK-sol.p rakennettiin liittämällä DNA Sk-vektoriin.

Tämä pBluescript SK-sol.p pilkottiin Sai lilla ja Not lilla (restriktiokohdat sijoitet-10 tiin pBluescript SK-vektorin polylinkkerialueelle) ja ristettiin saatu liukoista P koodaava 0,8 kb cDNA-fragmentti. Tämä cDNA-fragmentti vietiin lopullisen ekspressioplasmidin BCMGN-sol.p muodostamiseksi Xho l/Not l-pilkottuun BCMGNeo-vektoriin (kts. Karasuyama et ai., J. Exp. Med. 169: 13-25, 1989), joka sisälsi sytomegalovirus (CMV)-promoottorin ja neomysiinin resitenttiys-15 geenin. BCMGNeo on sukkulavektori, joka sisältää 69 % BPV (bovine papilloma virus)-sekvenssejä, jotka varmistavat ekstrakromosomaalisen replikoitumi-sen nisäkässoluissa. Kuten on esitetty kuviossa 10, joka havainnollistaa natii-vin ja liukoisen Pm nukleotidisekvenssiä ja vastaavaa aminohapposekvenssiä, liukoisen pin cDNA koodaa 212 aminohaposta (aa) muodostuvaa proteiinia, 20 johon liittyy 26 aminohapon signaalipeptidi, kun taas natiivin P-ketjun cDNA koodaa membraaniproteiinia, joka muodostuu signaalipeptidistä (26 aa), ekstrasellulaarisesta (214 aa), transmembraanista (25 aa) ja intrasytoplasmi-: sesta (286 aa) alueesta. Kuviossa 10 on myös havainnollistettu natiivin ja liukoisen β:η nukleotidisekvenssejä ja vastaavia aminohapposekvenssejä.

25 NIH 3T3-fibroblastin transfektointi BCMGNeo-sol.Billa ia liukoista B erittävien stabiilien transformanttien kehittäminen cDNA-transfektointi suoritettiin Karasuyama'n et ai. (supra.) kuvaamalla proto-30 plastifuusio-tekniikalla. Lyhyesti sanoen BCMGNeo-sol.pin sisältämät bakteerit muunnettiin protoplasteiksi ja fuusioitiin hiiren fibroplastisolulinjan NIH 3T3:n kanssa käyttämällä polyetyleeniglykolia 2.000 (Wako Chemical Industries, ·: Osaka, Japani). Kymmenen miljoonaa protoplastifuusioitua NIH 3T3-solua 104188 24 siirrostettiin tämän jälkeen neljään 24-kaivoiseen levyyn. 25 päivän kuluttua siitä, kun oli viljelty RPMI 1640-alustassa, joka sisälsi 10 % vasikansikiösee-rumia (FCS) ja 750 pg/ml G418:a (genetisiini; Sigma, St. Louis, MO, USA), havaittiin transformanttisolujen kasvua 60 kaivossa 104 kaivosta. Kahdeksas-5 tatoista kaivosta 60:stä saatujen viljelysupernatanttien havaittiin olevan positiivisia liukoisen β suhteen, kun määritys suoritettiin jäljempänä kuvatulla ELISA-menetelmällä (sandwich enzyme-linked immunosorbent assay). Kaivoja raja-laimentamalla määritettiin viisi kloonia, joista saatiin korkein absorbanssi ELISA:ssa. Kaikkien näiden havaittiin erittävän suuria määriä liukoista β (tau-10 lukko I). NIH 3T3-solut, joka oli transfektoitu täyspitkällä β-ketjun cDNA:lla (nimeksi annettiin 3Τ3-β11), eivät sitä vastoin erittäneet lainkaan β-ketjun molekyyliä. Myöhemmissä tutkimuksissa käytimme kloonia 3Τ3-β4-14, joka eritti suurimman määrän liukoista β.

15 Taulukko 1

Liukoisen β:η määrät BCMGNeo-sol^illa transfektoitujen NIH 3T3-fibroblastien viljelysupernatantissa.

20 Viljelty supernatantti Absorbanssi 405 nm:ssa ELISA:ssa 3T3-B4-1 1,492 3T3-B4-4 1,301 3T3-B4-7 1,259 3T3-B4-14 1,579 25 3T3-B4-19 1,533 3T3-1311 0,052 vain alusta 0,072

Liukoisen b:n detektointi ELISA: Ha 30

Transfektoitujen solujen viljelysupernatanteissa seulottiin liukoisen β:η mukanaolo ELISA-menetelmällä (sandwich enzyme linked immunosorbent assay).

·: Tässä määrityksessä käytettiin kahta monoklonaalista vasta-ainetta Mik-βΐ ja 104188 25 -β3, supra, ja Tsudo et ai., Proc. natl. Acad.Sci. USA, 86: 1982-1986, 1989. Nämä vasta-aineet tunnistavat β-ketjun eri epitoopit; so. Mik-βΐ tunnistaa IL-2:n sitomiskohdan, kun taas Mik^3 tunnistaa epitoopin, joka ei osallistu IL-2:n sitomiseen. Kuten kuviossa 11, joka esittää kaaviollisesti Sandwich 5 ELISA:n, on kuvattu, päällystettiin lmmulon-l-mikrotiitterilevyt (Dynatec, Chantilly, VA, USA) yön yli 50 μΙ Mik~P3:lla 10 pg/ml konsentraatiossa Tris-puskuroidussa kyllästetyssä suolaliuoksessa (10 mM Tris-HCI, pH 7,4, 0,15 M NaCI). Ylimääräisen vasta-aineen poistamisen jälkeen sitoutumattomat kohdat blokattiin inkuboimalla 1 tunti TBS:n kanssa, joka sisälsi 1 % naudanseerumi-10 albumiinia. Pestiin TBS:lla, joka sisälsi 0,05 % Tween 20:a (T-TBS), minkä jälkeen kaivoihin lisättiin 50 μΙ transformanttien viljelysupernatantteja ja inku-boitiin 1 tunti. Pesun jälkeen lisättiin 50 μΙ biotinyloitua Mikola 1 pg/m1 konsentraatiossa sekundäärisenä vasta-aineena, jotta voitaisiin detektoida levyn primääriseen vasta-aineeseen, Mik^3:een sitoutunut liukoinen β. 45 minuutin 15 inkuboinnin ja sitä seuraavan pesun jälkeen lisättiin 50 μΙ alkalisen fosfataasin kanssa konjugoitua avidiinia (Tago, Burlingame, CA, USA). 45 minuutin inkuboinnin jälkeen levyt pestiin, lisättiin 100 μΙ p-nitrofenyylifosfaattia ja kaivojen absorbanssi mitattiin aallonpituudella 405 nm 45 minuutin kuluttua.

20 Erittyneen liukoisen B:n näennäinen molekvvlioaino

Liukoisen β:η molekyylikoon määrittämistä varten leimattiin 3T3-B4-14-solut ·» ; biosynteettisesti 35S-metioniinilla ja liukoinen β immunosaostettiin viljelysuper- natantissa Mi-βΐ mAb:lla. 8-prosenttinen SDS-polyakryyliamidigeeli panostet-25 tiin eri määrillä immunosaosteita käyttämällä saostamiseen Mik-βΐ- ja kontrollina UPC 10 mAb:a ja elektroforesoitiin. Kun geeli tutkittiin SDS-polyakryyli-amidigeelielektroforeesilla (PAGE), Mik-βΐ, mutta ei UPC 10 mAb-kontrolli, tunnisti 3T3-B4-14-solujen viljelysupematantissa yhden ainoan proteiinilajin, jonka näennäinen Mr oli 37.000, kuten on esitetty kuviossa 12. Tämä molekyy-30 lipaino vastaa hyvin typistettyä β-ketjua, jolta puuttuvat kaikki transmembraani-(25 aa)- ja sytoplasmansisäiset (286 aa)-alueet.

φ · 26 104188

Liukoisen β:η I1-2:n sitomiskvky Tämän jälkeen tutkittiin, kykeneekö 3-ketjun erittynyt muoto sitomaan IL-2;n. Tähän tarkoitukseen käytettiin "kilpailevaa" sandwich ELISA-menetelmää.

5 Tässä määrityksessä kiinnitettiin viljelysupernatantin liukoinen β kiinteään faasiin Mik-P3 mAb:lla, joka mAb ei estä IL-2:n sitoutumista, jolloin oletettu IL-2:n sitomiskohta β-ketjulla jäisi vapaaksi. Sen jälkeen lisättiin biotinyloidun Mik-βΐ:n kilpailijoiksi IL-2:n tai leimaamattoman Mik-βΐ:n sarjalaimennuksia. Kuviossa 13 on esitetty kilpailevan sandwich-ELISA:n tulokset. Käyrä -o-o-10 esittää leimaamattoman Mik-βΐ :n sarjalaimennuksia ja -o-o- IL-2:n sarjalaimennuksia. Kuten kuviossa 13 on esitetty, leimaamaton Mik-βΐ alensi absorbans-sia annoksesta riippuvalla tavalla, mikä on osoitus tämän systeemin spesifisyydestä. Myös IL-2 kilpaili tehokkaasti ja annoksesta riippuvalla tavalla biotinyloidun Mik-βΐ :n kanssa liukoiseen β:θη sitoutumisesta, mikä osoittaa, että 15 liukoinen β todella kykenee sitomaan IL-2:n.

Tämä kilpailukäyrä on varsin samanlainen kuin mitä saadaan detergentillä liuennetulle natiiville β-ketjulle YTS-soluista, jotka ekspressoivat pelkästään β-ketjun, mikä osoittaa, että liukoisen β:η affiniteetti IL-2:een on verrattavissa 20 liukoisen natiivin β-ketjun vastaavaan affiniteettiin.

IL-2f^-ketjuja koodaavien geenien saatavilla olo tekee mahdollisesti etsiä uusia tapoja, joilla IL-2-systeemin toimintaa voidaan tutkia. IL-2-systeemissä toimiva reseptorirakenne on ainutlaatuinen siinä suhteessa, että kaksi raken-25 teellisesti eri membraanimolekyyliä, IL-2Ra- ja IL-2f^-ketjut, sitovat toisistaan riippumatta molemmat IL-2:t. Tässä yhteydessä kuvattu esimerkkisarja cDNA:n ekspressiosta tukee edelleen aikaisempaa käsitystä, että a- ja β-ketjut muo- * dostavat suuriaffiniteettisen IL-2R-kompleksin liittymällä ei-kovalenttisesti molekyylien kanssa (18, 37). Tämän systeemin omituisuus on siten se, että 30 kyseessä on kolmen molekyylin vuorovaikutus yhden ligandin ja kahden eri reseptorin välillä. Esillä olevan keksinnön ansiosta on nyt mahdollista selvittää tämän ainutkertaisen sytokiinien reseptorisysteemin funktionaaliset alueet.

·: Kloonatun β-ketjun cDNA:n mutaatioanalyysi voi antaa viitteitä niiden vastaavi- 104188 27 en alueiden identifioimiseen, jotka ottavat osaa ligandin sitomiseen ja a-ket-juun liittymiseen. Tähän päivään mennessä tiedetään vain vähän siitä biokemiallisten tapahtumien sarjasta, jonka homologisten reseptoreidensa kanssa toimivat sitokiinit laukaisevat. Tämän keksinnön avulla olemme osoittaneet 5 IL-2R3-ketjussa suuren sytoplasmisen alueen, joka mitä todennäköisimmin ottaa osaa IL-2:n signaalin reitin (reittien) käyttöön. Sytoplasmisella alueella havaittu erityisen hapan kohta voi viitata kytkeytymiseen muihin sytoplasmisiin signaalimuuntajiin. Aikaisemman raportin (33), joka koskee IL-2:n läsnäoloa ydinosassa, valossa vaihtoehtoinen toinen mielenkiintoinen mahdollisuus on, 10 että IL-2R3:n sytoplasmisen komponentin happamet sekä runsasproliiniset alueet voivat ottaa osaan geneettisen ohjelmoinnin aktivoitumiseen. Ekspres-sointisysteemin, jossa cDNA:n koodaama β-ketju voi antaa kasvusignaaleja, saatavuus mahdollistaa reseptorin funktionaalisten alueiden selvittämisen edelleen. Nyt on mahdollista tutkia IL-2:n oleellista roolia immuunijärjestelmän 15 kehittymisessä ja säätelyssä.

Solupinnan reseptorin β-ketjun liukoisten vastineiden saatavuuden tulisi helpottaa β-ketjun rakenneanalyysiä, koska liukoisten molekyylien kiteyttäminen on helpompi toteuttaa kuin liukenemattomien. Liukoisia molekyylejä voidaan 20 myös käyttää varsinaisten solupinnan reseptoreiden neutraloimiseen tutkittaessa reseptorin biologisia toimintoja tai terapeuttisia tarkoituksia varten.

·« 104188 28

KIRJALLISUUSVIITEET

1. D.A. Morgan, F.W. Ruscelli, R.C. Gallo, Science 198, 1007 (1976) 2. X.A. Smith, Annu.Rev.Immunol. 2, 319 (1984); T. Taniguchi et ai., 5 Immunol. Rev. 92, 121 (1986) 3. D.H. Raulet, Nature 314, 101 (1985) 4. M. Tsudo, T. Uchiyama, H. Uchino, J.Exp.Med. 160, 612 (1984); T.A. Waldmann et ai., ibid., s. -1450 (1984); M.A. Blackman, M.A. Tigges, M E. Minis, M.E. Koshland, Cell, 47, 609 (1986) 10 5. M. Malkovsky et ai., Nature 325, 262 (1987) 6. C.S. Henney, K. Kuribayashi, D.E. Kern, S. Gillis, ibid. 291, 335 (1981) 7. M. E. Lotze, E.A. Grimm, S.A. Strausser, S.A. Rosenberg, Cancer Res. 41, 4420 (1981); E.A. Grimm, A. Mazumder, H.Z. Zhang, S.A. Rosenberg, J. Exp. Med. 155, 1823(1982 15 8. S.A. Rosenberg et al, N.Engl.J.Med. 316, 889 (1987) 9. E.N. Benveniste, J.E. Merrill, Nature 321,610 (1986) 10. S.J. LeGrue,. Lymphokine Res. 7, 1987 (1988); G.B. Millis, P. Girard, S. Grinstein, E.W. Gelfand.-Cell 55, 91 (1988); V.E. Valge, J.G.P. Wong, B.M. Datlof, A.J. Sinskey, A. Rao, ibid., s. 101 (1988); M.A. Tigges, L.S.

20 Casey, M E. Koshland, Science 243, 781 (1989) 11. R.J. Robb, W.C. Greene,'C.M. Rusk, J.Exp.Med. 160, 1126 (1984) 12. M. Tsudo, R.W. Kozak, C.K. Goldman, T.A. Waldmann, : Proc.Natl.Acad.Sci.U.S-a.. 83, 9694 (1986); K. Teshigawara, H.-M. Wang, K. Kato, K.A. Smith, J.Exp.Med. 165, 223 (1987) 25 13. W.J. Leonard et al., Nature 311, 626 (1984) T. Nikaido et al., ibid., s. 631 (1984); D. Cosman et al., ibid. 312, 768 (1984) 14. M. Hatakeyama et al., ibid. 318, 467 (1985) : 15. W.C. Greene et al., J. Exp. Med. 162, 363 (1985), S. Kondo et al., ibid.

320, 75 (1986); R.J. Robb, Proc.Natl. Acad. Sci.U.S.A. 83, 3992 (1986) 30 16. M. Sharon, R.D. Klausner, B.R. Cullen, R. Chizzonite, W.J. Leonard,

Science 234, 859 (1986) • * > 104188 29 17. R.J. Robb et ai., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,'84, 2002 (1987); M. Tsudo, R.W. Kozak, C.K. Goldman, T.A. Waldmann, ibid., s-4215 (1987); M. Dukovich et al., Nature 327, 518 (1987) 18. M. Hatakeyaäa et ai., J.Exp.Med. 166, 362 (1987); S. Kondo et al., Nature 5 327,64(1987) 19. M. Tsudo, F. Kitamura, M. Miyasaka, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. painossa 20. J. Yodoi et al-, J. Immunol. 134, 1623 (1985) 21. B. Seed, A. Aruffo, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 84, 3365 (1987)f, B. Seed, Nature'328, 840 (1987) 10 22. D. Perlman, R O. Halvorson, J.Mol.Biol. 167, 391 (1983); G. von Heijne,

Nucleic Acids Res. 14, 4683 (1986) 23. A. Ullrich et al., Nature 309, 418 (1984); A. Ullrich et al., ibid. 313, 756 (1985); U. Ebina et al., Cell 40, 747 (1985) 24. L. Collins et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 85, 7709 (1988) 15 25. K.S. Hanks, A.N. Quinn, T. Hunter, Science 241, 42 (1988) 26. A. Alcover et al., Immunol.Rev. 95,5 (1987) 27. M. Hatakeyama, S. Minamoto, T. Taniguchi, Proc.Natl.Acad-Sci.U.S.A.

83, 9650(1986) 28. M. Hatakeyama, T. Doi, T, Kono, S. Minamoto, T. Taniguchi, julkaisemat-20 tomat havainnot 29. J.D. Marth, R. Peet, E.G. Krebs, R.M. Perlmutter, Cell 43, 393 (1985) 30. R. Mann, R.C. Mulligan, D. Baltimore, ibid. 33, 153 (1983) : 31. M. Fujii et al., J.Exp.Med. 163, 550 (1986) 32. A.M. Weissman et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 83, 1463 (1986) 25 33. R.J. Robb, WC. Greene, J.Exp.Med. 165, 1201 (1987) 34. K. Sugamura et 1., ibid. 161,1243 (1985) 35. H. Saragovi, T R. Malek, J.Immunol. 141, 476 (1988) 36. J. Kyte, R.F. Daolittle, J.Mol.Biol. 157, 105 (1982) 37. H. Potter, L. Weir, P. Leder, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 81, 7161 (1984) 30 ♦ ·

Claims (27)

1. 30 104188
2. 1. Rekombinantti-DNA-molekyyli, joka koodaa IL-2-reseptorin β-ketjua tai sen osaa, joka mainittu osa kykenee sitoutumaan IL-2:een. 5
3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen rekombinantti-DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se koodaa ihmisen tai hiiren IL-2-reseptorin β-ketjun tai sen osaa, joka mainittu osa kykenee sitoutumaan IL-2:een.
4. 3. Rekombinantti-DNA-molekyyli, tunnettu rakennegeenistä, jolla on kaava: ATG GCG GCC CCT GCT CTG TCC TGG CGT CTG CCC CTC CTC ATC CTC CTC CTG CCC CTG GCT ACC TCT TGG GCA TCT GCA GCG
5. 15 GTG AAT GGC ACT TCC CAG TTC AGA TGC TTC TAC AAC TCG AGA GCC AAC ATC TCC TGT CTC TGG AGC CAA GAT GGG GCT CTG CAG GAC ACT TCC TGC CAA GTC CAT GCC TGG CCG GAC AGA CGG CGG TGG AAC CAA ACC TGT GAG CTG CTC CCC GTG AGT CAA GCA TCC TGG GCC TGC AAC CTG ATC CTC GGA GCC
6. 20 CCA GAT TCT CAG AAA CTG ACC ACA GTT GAC ATC GTC ACC CTG AGG GTG CTG TGC CGT GAG GGG GTG CGA TGG AGG GTG ATG GCC ATC CAG GAC TTC AAG CCC TTT GAG AAC CTT CGC CTG ATG GCC CCC ATC TCC CTC CAA GTT GTC CAC GTG GAG ; ACC CAC AGA TGG AAC ATA AGC TGG GAA ATC TCC CAA GCC
7. 25 TCC CAC TAC TTT GAA AGA CAC CTG GAG TTC GAG GCC CGG ACG CTG TCC CCA GGC CAC ACC TGG GAG GAG GCC CCC CTG CTG ACT CTC AAG CAG AAG CAG GAA TGG ATC TGC CTG GAG ACG CTC ACC CCA GAC ACC CAG TAT GAG TTT CAG GTG CGG GTC AAG CCT CTG CAA GGC GAG TTC ACG ACC TGG AGC CCC
8. 30 TGG AGC CAG CCC CTG GCC TTC AGG ACA AAG CCT GCA GCC CTT GGG AAG GAC ACC ATT CCG TGG CTC GGC CAC CTC CTC GTG GGC CTC AGC GGG GCT TTT GGC TTC ATC ATC TTA GTG TAC TTG CTG ATC AAC TGC AGG AAC ACC GGG CCA TGG CTG AAG AAG CTC CTG AAG TGT AAC ACC CCA GAC CCC TCG AAG
9. 35 TTC TTT TCC CAG CTG AGC TCA GAG CAT GGA GGA GAC GTC 104188 CAG AAG TGG CTC TCT TCG CCC TTC CCC TGA TCG TCC TTC AGC CCT GGC GGC CTG GCA CCT GAG ATC TCG CCA CTA GAA GTG CTG GAG AGG GAC AAG GTG ACG CAG CTG CTC CTG CAG CAG GAC AAG GTG CCT GAG CCC GCA TCC TTA AGC AGC AAC
10. 5 CAC TCG CTG ACC AGC TGC TTC ACC AAC CAG GGT TAC TTC TTC TTC CAC CTC CCG GAT GCC TTG GAG ATA GAG GCC TGC CAG GTG TAC TTT ACT TAC GAC CCC TAC TCA GAG GAA GAC CCT GAT GAG GGT GTG GCC GGG GCA CCC ACA GGG TCT TCC CCC CAA CCC CAT CAG CCT CTG TCA GGG GAG GAC GAC GCC
11. 10 TAC TGC ACC TTC CCC TCC AGG GAT GAC CTG CTG CTC TTC TCC CCC AGT CTC CTC GGT GGC CCC AGC CCC CCA AGC ACT GCC CCT GGG GGC AGT GGG GCC GGT GAA GAG AGG ATG CCC CCT TCT TTG CAA GAA AGA GTC CCC AGA GAC TGG GAC CCC CAG CCC CTG GGG CCT CCC ACC CCA GGA GTC CCA GAC CTG
12. 15 GTG GAT TTT CAG CCA CCC CCT GCG CTG GTG CTG CGA GAG GCT GGG GAG GAG GTC CCT GAC GCT GGC CCC AGG GAG GGA GTC AGT TTC CCC TGG TCC AGG CCT CCT GGG CAG GGG GAG TTC AGG GCC CTT AAT GCT CGC CTG CCC CTG AAC ACT GAT GCC TAC TTG TCC CTC CAA GAA CTC CAG GGT CAG GAC CCA
13. 20 ATC CAC TTG GTG TAG tai sen osa tai sen muunnos. . . 4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen rekombinantti-DAN-molekyyli, tunnettu 25 rakennegeenistä, jolla on kaava « m i 32 1 04 1 88 Ηθ^Ηο<ϊί0ο<Η00υθπ0ο^υ^υ <0Ooho<0oooh0hoF<o0ooh Hl-O0o00o0f-<OQ<0<0|-O<e) o<<oh<hhoFo0hF9ooo0oh HO0<F<O<<OO0<*-0HOOOOO <οπουι-ι-οθο52ΗθΗΐ-ί2ουοοι-O00H<0Fh0<0<<O<0i— Ο < I— 0<ho0hoohh0O0o<oFoo0h Ο0Ο<Ο<Η0Ο<η0ηΟΟΗΟ<<-ηΟ OOOO00OhOOF<OOO<OOH0O hh<hh<o<o<ooo0O0O<F<0 H0<0O0<0hoooOh0OhoOoh oh<<o<0<Oh<oOqh<o0Oo< ο<<ο<ο<0<οηη0ηο0η<0Ο0 <OOO0OH-0O0OOhOhOoO(j0o θ0<ο<υθμ00ϋ0ο<<<<ϋΗ<ο <h<h<<oFhho<o0O0h0<o< j-l-0O<b^OO<><O^0oC!)O000o oOo<h<Ohoo><h0<hh<0h<< 0HH0000F<HXO0<F000O0< 0oo<0hc2oO000h0q0hho0o O0OO<<0O0<<O<OF00H00O OH<oh-O|_^OOOoO<o00Ol-HO Η<θΗϋ<ΡθΟΟΗοθρμ<<Ο0οο o<oFooFh<o0hoFF0o0oh< 000000501-000^00^51-000 S8öiJg5332&M:SSii3SSfiS& O<<000FO<<<FFO000<0<< O<0O0<O<<Oq0qO0hHO<OO0 HOOH<<<00<<<H^<OOOHOo<t FHHO<OH<O0H0FOOH0OO0OH{ OO0oOo<0<0OhO0^O0OOhO< H<<h<HO<<<Hqq<50HOOOOh 0<<<0OOOO<0HHO<OO<HH0< OOU0<O<0H0OH00OOHOO00< PHOOOHO<0<HOPO<00<0000 OoHO0HhO<OoHOOql_0O(_0Oo hh<<0<Fh<oo<oOi— <^hhF00< oFo<HO<O<OH0O0FhOOO00O OOOOOHQOOHO<O0OO0O<0<O O0H00O<0H<FOH<0OH00<0H HH0HHOH<00FO0<H<O<00<0 0<OO0OO<0<OOHOOOH00<O< . H<<OHO<F0OFhOo0hOO<0<O O0O000OF<0F<OH<FOO000H OhO000H<0<OqqhOo<OHH0H 0F00HHOHHO0<O<O<OO<<<< <OHH00H00O0OH00HOHO0O0 0HOOH0OO00HOO<00OQ0HH<r 0<OO<HHo<0o0q0<H<(-H0<< HO<H<O0HO<HHH0O0OFO00O OO<<<O0<O<L_0OO<0OOO<<O OOOOH0<OHOH<H<O<OHO<<O OH<0<OO00<F<O0HOOOH0O0 : hho0Ohoh00ho0oooh0o0Ocd F0H<<HO<<00H0H<0OHHO0< OH0O0OH00OHOHOOHHOOO0O HqhOhOO0hh^H<OOo<0<0H< O<<CDF<H<<F0F<H0O0HOH<H 0<<<O<00hF00<00H0OO<OO o <<00OOCD0<Oh<O<O<0OhOh< h P>Fhh<<0ooFo<<0<<<o0F< -- <<O0O0<HH<O<O0<000HOO0 is O0HhOhOOO0O0h0OqOH<0Q< (n OHOh<F00OHH<FhOhO<0<<< x <00O0FH<<O0<OOO<O0<0<O o II H<0h0OOOHO00O0O000<0Oh X OO<OHO0<0OHH<OO<H0<H0F x 000<0O<O<OOO0OH0O<0O0O X 104188 tai sen osa tai sen degeneroitu muunnos.
14. 5. Rekombinantti-DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se muodostuu jonkin seuraavien plasmidien 5 plasmidi: talletusnumero: plL-2RP6, FERM BP-2312 plL-2RP9, FERM BP-2313 PIL-2RP19, FERM BP-2314 10 plL-2Rp30, FERMBP-2315 pMIL-2Rp36, FERM BP-2435 DNA-insertistä, joka koodaa IL-2R3:a tai sen osaa, joka mainittu osa kykenee sitoutumaan IL-2:een. 15
15. 6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen rekombinantti-DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se koodaa koko IL-2-R3-ketjun tai sen muunnoksen liukoista osaa, joka mainittu osa kykenee sitoutumaan IL-2:een.
16. 7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen rekombinantti-DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se koodaa ihmisen IL-2RP-ketjun aminohappoja noin 1 - noin 210. «
17. 8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen rekombinantti-DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että terminaaliset nukleotidit ovat seuraavat
18. 25 GCC CTT GCT AGC TAG ja että se koodaa ihmisen vesiliukoisen IL-2RP-ketjun johdosta. .e ·
19. 9. Rekombinantti-DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se erittäin stringenteissä olosuhteissa kykenee hybridisoitumaan jossakin edellä olevassa patenttivaati- 30 muksessa määritellyn rekombinantti-DNA:n kanssa ja että se koodaa patenttivaatimuksen 6 mukaista proteiinia, jolla on IL-2RP-ketjun aktiivisuus, tai sen osaa, joka mainittu osa kykenee sitoutumaan IL-2:een. • · 104188
20. 10. Jonkin patenttivaatimuksen 1 - 9 mukainen rekombinantti-DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se edelleen käsittää säätelysekvenssejä, jotka on toiminnallisesti kytketty IL-2Rp-ketjun tai sen osan, joka mainittu osa kykenee sitoutumaan IL-2:een, rakennegeeniin. 5
21. 11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen rekombinantti-DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se on plasmidi.
22. 12. Plasmidi: talletusnumero: 10 plL-2RP6, FERM BP-2312 plL-2RP9, FERM BP-2313 PIL-2RP19, FERM BP-2314 plL-2RP30, FERM BP-2315 PMIL-2RP36, FERM BP-2435 15
23. 13. Isäntäsolu, tunnettu siitä, että se on transformoitu jonkin patenttivaatimuksen 10-12 mukaisella rekombinantti-DNA-molekyylillä.
24. 14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että se on 20 bakteerisolu tai hiivasolu tai nisäkässolu. . . 15. Menetelmä proteiinin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että sopiva isäntäor- ganismi transformoidaan ekspressointivektorilla, joka sisältää sopivassa ekspressointikohdassa haluttua polypeptidiä koodaavan jonkin patenttivaati-25 muksen 1 - 9 mukaisen sekvenssin, ja eristetään haluttu proteiini saaduista transformanteista.
25. 16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetty ekspressointivektori on jonkin patenttivaatimuksen 10-12 mukainen. 30
26. 17. Menetelmä patenttivaatimuksen 13 tai 14 mukaisen isäntäorganismin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että jonkin patenttivaatimuksen 10-12 mukainen vektori transformoidaan sopivan isännän kanssa. 104188
27. 18. Menetelmä jonkin patenttivaatimuksen 10-12 mukaisen vektorin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että jonkin patenttivaatimuksen 1-9 mukainen DNA-sekvenssi insertoidaan sopivaan vektoriin. 5 • « „ 104188