NO306624B1 - Rekombinant DNA-molekyl som koder for <beta>-kjeden til en IL-2 reseptor - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører rekombinant DNA-molekyl som koder for fé-kjeden til IL-2 reseptor, plasmider og vertsceller som er transformert med og kan uttrykke det rekombinante DNA-molekyl, hybridoma som er i stand til å utskille et monoklonalt antistoff med spesifikk aktivitet mot et protein oppnådd ved ekspresjon av et rekombinant DNA-molekyl, monoklonalt antistoff samt fremgangsmåte for fremstilling av S-kjeden til en IL-2 reseptor.

Betydelig kunnskap er blitt samlet om at cytokinene, en klasse løselige mediatorer som inngår i celle-til-celle-"kommunikasjoner", er essensielle i reguleringen av immunsystemet. Det er kjent at cytokiner induserer formering, differensiering og aktivering av målceller via interaksjon med spesifikke celleoverflatereseptor(er). Interleukin-2 (IL-2), tidligere definert som T-celle vekstfaktor (1), er én av de best karakteriserte cytokiner, som er kjent å spille en avgjørende rolle i den antigen-spesifikke klonale formering av T-lymfocytter (T-celler) (2). IL-2 virker også trolig på andre celler i immunsystemet slik som umodne tymocytter (3), B-lymfocytter (B-celler) (4), makrofager (5), naturlige dreperceller (NK-celler) (6), og lymfokin-aktiverte dreperceller (LAK-celler) (7). Disse multifunksjonelle egenskaper til IL-2 har nå åpnet muligheter vedrørende formulering av immunterapier slik som adoptiv immunterapi (8). Mer nylig, har IL-2 også blitt vist å virke på nerveceller slik som oligodendrocytter (9), hvilket antyder en mulig medvirkning av dette cytokin i sentralnervesystemet. Til tross for utstrakte studier på IL-2-systemet i forbindelse med grunnleggende og klinisk immunologi, er informasjonen blitt begrenset til de(n) molekylære mekanisme(r) som ligger bak den IL-2-formidlede signaloverføring (10). IL-2-reseptoren (IL 2R) er kjent å være unik idet den er tilstede i tre former: høy-, mellom- og lav-affinitetsformer med hensyn til dens bindingsegenskap vis-å-vis IL-2, og respektive dissosiasjonskonstanter (Kds) på 10_<11>M, 10"<9>M og10"<8>M (11, 12). Etter at IL-2Ra-kjeden erkarakterisert(Tac antigen, p55), (13), ble det vist at a-kjeden utgjør utelukkende lav-affinitetsformen og at den ikke er funksjonell per se i IL-2-internalisering og signaloverføring, med mindre den er assosiert med en annen spesifikk membrankomponent(er) av lymfoide celler (14, 15). Deretter ble den lymfoide membrankomponent fastslått å være en ny reseptorkjede, betegnet S-kjede (eller p70-75) (12, 16, 17). Eksperimentelle data har faktisk antydet at IL-2RS-kjeden per se utgjør mellom-affinitetsformen (12). I tillegg vil dens assosiasjon med IL-2Ro;-kjeden resultere i høy-af f initetsf ormen til reseptoren (12, 16, 17). Ekspresjonsstudier som benytter villtypé og mutert IL-2Ra-kjede cDNA-er støtter sterkt forslaget at IL-2RJS-kjeden, men ikke IL-2Ra-kjeden har område(r) ansvarlig for aktivering av de(n) intracellulære signalformidlingsvei(er) (18). Det foreligger derfor et behov for å oppnå IL-2J5-kjede i mengder som muliggjør å belyse dets struktur og funksjon, dette er et essensielt trinn i å oppnå videre innsikt i den molekylære basis til høy-affinitet IL-2R så vel som i mekanismen for signaloverføring som er operativ i IL-2 responsive celler. For dette formål beskriver vi nedenfor cDNA som koder for IL-2RS-kjeden eller deler av denne hvorved innskudd av nevnte cDNA i en passende vektor og ekspresjon av denne i en passende vert vil tillate rekombinant og storskalaproduksjon av protein som korresponderer til IL-2RS-kjeden eller deler av denne.

Ifølge ett aspekt av den foreliggende oppfinnelsen gir vi derfor et rekombinant DNA-molekyl som koder for S-kjeden til en IL-2 reseptor kjennetegnet ved at det har et srukturelt gen med formelen: eller en del derav som koder for et fragment av S-kjeden av en IL-2 reseptor som er i stand til å binde IL-2 eller en degenerert variant derav, eller har formelen:

hvori XXX = GGC eller TGC,

eller en del derav som koder for et fragment av 5-kjeden av en IL-2 reseptor som er i stand til å binde IL-2 eller en degenerert variant derav.

DNA-typer av spesiell interesse i den foreliggende oppfinnelsen inkluderer de som koder for deler av IL2-RS, f.eks. for den ekstracellulære del eller en del av denne eller den intracellulære del eller en del av denne.

Av spesiell interesse er de DNA-er som koder for løselige deler av IL2-RS, disse inkluderer de ekstracellulære deler og deler av disse.

Den foreliggende oppfinnelse inkluderer således også innenfor dens ramme cDNA som koder for deler av de ovenfor nevnte cDNA-er, f.eks. deler av den komplette sekvens til hlL-2RS-kjeden, f.eks. den ekstracellulære del som begynner ved, eller omkring aminosyre (a,a) (se fig. 1 B) 1 f.eks. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 og ender ved eller omkring a.a. 214 f.eks. 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, eller subdeler av denne ekstracellulære del eller degenerative varianter av denne, eller deler som korresponderer til den intracellulære del av reseptorkjeden f.eks. delen som begynner ved eller omkring a.a. 239, f.eks. a.a. 230, 231, 232, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, opp til eller omkring avslutningsvis a.a. 525, f.eks. 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524 og 525 eller under-deler av dette, eller degenerative varianter av denne, så vel som cDNA som koder for deler av den komplette sekvensen til muse IL-2RS-kjeden (se fig. 8) f.eks. den ekstracellulære del som begynner ved eller omkring aminosyre 1 f.eks. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 og ender ved eller omkring aminosyre 210 f.eks. 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220 eller sub-deler av denne ekstracellulære del eller degenerative varianter av denne, eller deler som korresponderer til den intracellulære del av reseptorkjeden f.eks. den delen som begynner ved eller omkring aminosyre 235 f.eks. aminosyre 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, opp til eller omkring avslutningsvis aminosyre 513, f.eks. 505, 506, 507, 508, 509, 510, 512 og 513 eller sub-deler av denne eller degenerative varianter av denne.

Det vil bli forstått at for de spesielle IL-2R£-kjeder eller deler av disse beskrevet herved, kan naturlige allele variasjoner eksistere, som kan opptre fra et individ til et annet. Disse variasjoner kan bli vist ved én eller flere aminosyreforskjeller i den totale sekvensen eller ved delesjoner, substitusjoner, insersjoner, inversjoner eller addisjoner av én eller flere aminosyrer i sekvensen. I tillegg vil det bli forstått at IL-2R£-kjeden eller deler av denne beskrevet herved kan bli modifisert via teknikker i genetisk ingeniørkunst f.eks. punktmutasjon, for substitusjon, delesjon eller addisjon av én eller flere aminosyrer uten å forandre de essensielle egenskaper til IL-2RE-kjeden eller deler av denne. Den foreliggende oppfinnelse inkluderer også innenfor dens ramme DNA-sekvenser som er i stand til å hybridisere med DNA-sekvensene beskrevet herved og kode for proteiner som har i vesentlig grad aktiviteten til en IL-2RS-kjede eller deler av denne, spesielt den løselige IL-2RS.

I ett videre aspekt av oppfinnelsen beskriver vi et rekombinant DNA-molekyl som koder for en vannløselig del av den humane IL2-RS (hIL2-Ri5) f. eks. en aminosyresekvens som omfatter aminosyrene fra omkring 1 til omkring 210 av det hele hIL2-RS. Et slikt DNA-molekyl kan kode f.eks. for en løselig human interleukin 2 reseptor S-kjedederivat som har 212 aminosyrerester i hvilket restene 1 til 210 korresponderer til aminosyrene i den native IL-2R S-kjeden.

F.eks. i én utførelsesform beskrevet nedenfor er de terminale nukleotider til et rekombinant DNA-molekyl som koder for et derivat av vannløselig hIL-2Rfé-kjede som følger:

GCC CTT GCT AGC TAG

208 Ala Leu Ala Ser [stopp]

Ved bruk av standardteknikker innen rekombinant DNA-teknologi kan vektorer for å transformere passende vertsceller bli konstruert slik at de inneholder DNA-sekvenser som korresponderer til det strukturelle gen for IL-2RJS som beskrevet ovenfor eller enhver ønsket del av denne som er i stand til å binde IL-2, eller degenerativ variant av denne.

Egnede vektorer er f.eks. plasmidvektorer og disse vil inkludere kontroll- og regulatoriske sekvenser som er operativt bundet til cDNA-sekvensen som koder for IL-2RS-kjeden eller en del av denne som koder for et fragment av S-kjeden av en IL-2 reseptor som er i stand til å binde IL-2.

Passende teknikker er vel kjent og vidt praktisert og er ved hjelp av eksempel beskrevet i forbindelse med andre proteiner, i europeiske patentsøknader, publikasjon nr. 0254249 og 0170204.

Det ønskede proteinet kan oppnås i ren form fra kulturen ved hjelp av standardteknikker og slikt protein utgjør et passende antigen for å lage monoklonale antistoffer. Således kan hybridomer som er i stand til å utskille et monoklonalt antistoff som har en spesifikk affinintet for IL-2RS-kjeden eller en ønsket del av denne bli laget ved å immunisere et ikke-humant dyr med rekombinant IL-2RJ3 eller en del av denne oppnådd ved ekspresjon av et rekombinant DNA-molekyl ifølge kravene 1-9, fusjon av miltceller med ikke-immunglobulin utskillende myelomceller, og seleksjon fra de resulterende hybridomer en cellelinje som produserer et monoklonalt antistoff som har den ønskede bindingsspesifisitet og hvis ønskelig, etterfulgt av subkloning av nevnte hybridom.

Teknikkene for å lage hybridomer og oppnå monoklonale antistoffer i ren form fra disse er vel kjent og beskrevet i form av eksempel i europeisk patentsøknad, publikasjon nr. 0168745.

Oppfinnelsen omfatter også monoklonale antistoffer som har en spesifikk aktivitet til et protein oppnådd ved ekspresjon av et rekombinant DNA-molekyl ifølge ethvert av kravene 1-9, som vil være brukbare f.eks. til diagnostiske formål og også for terapi gjennom immunsuppresjon eller aktivering. Som nevnt ovenfor, kunne slike antistoffer bli laget ved bruk av renset rekombinant protein ifølge oppfinnelsen eller ved å transfektere cDNA beskrevet i oppfinnelsen, og oppnå celler som uttrykker store mengder av reseptoren og bruker slike celler til å oppnå antistoffene. Tilgjengeligheten av monoklonale antistoffer til spesifikke sub-deler av IL-2S-kjeden gjør det mulig å identifisere epitoper av reseptorkjeden og således åpne veien for å kontrollere aktiviteten til reseptoren ved bruk av passende monoklonale antistoffer eller andre peptider eller peptidomimetiske eller proteinanaloge substanser.

Et ytterligere aspekt ved foreliggende oppfinnelse er en fremgangsmåte for fremstilling av S-kjeden til en IL-2 reseptor eller deler eller varianter derav kjennetegnet ved transformering av en egnet vertsorganisme med en ekspresjonsvektor inneholdende en kodende sekvens som krevet i ethvert av kravene 1-7.

Isolering og analyse av cDNA- klonene som koder for human IL-2RS- kiede

For å isolere cDNA-klonene, ble en ekspresjonsklonings-strategi benyttet ved bruk av de monoklonale antistoffene, Mik-Sl og Mik-S2 (19), begge er blitt utviklet mot IL-2RS-kjeden funnet på den humane leukemi-cellelinje YT (20).

De monoklonale antistoffene Mik-Sl og Mik-S2 er begge deponert ved Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan. Deponeringsnumrene for Mik-Sl og Mik-S2 er hhv. 10453 og 10454 (1988), de er også beskrevet i japansk patentsøknad nr. 298742 (1988).

Noen få typer cDNA-bibliotek ble laget ved bruk av poly (A)+-RNA fra YT-celler ifølge standardprosedyrer. cDNA-bibliotekene ble laget med cDM8-vektor ifølge publiserte prosedyrer (21), bortsett fra bruk av tilfeldig primer (Amersham) eller oligo (dT) primer som nevnt nedenfor. Plasmidet DNA som representerte 5,6xl0<6>uavhengige kolonier ble laget ved standardprosedyre og ett mg av DNA ble benyttet for den første DNA-transfeksjon. Egentlig ble DNA-et delt i 100 rør (derfor inneholdt hvert rør 10/xg DNA) og de ble hver transfektert inn i 3,5xl0<5>ape COS-celler i en vevskulturskål (60 mm polystyrenskål, Corning). Transfeksjonen ble gjort ved bruk av standard DEAE-dekstranmetoder. De transfekterte COS-cellene ble så behandlet med blandingen avMik-Sl og -S2 antistoffer (400 ganger fortynnet ascites for hvert antistoff) og gjort gjenstand for standard utsåingsprosedyre. Skålen som ble benyttet for utsåing var FALCON 6 0 mm skål, dekket med anti-mus IgG som beskrevet tidligere (ref. 21). I denne første runde med utsåing, ble 100 IgG-dekkede skåler benyttet. Etter utsåing, ble Hirt-ekstrakt preparert ved standardprosedyren (ref. 21) og de gjenvunne plasmider ble introdusert i E. coli ved metoden som er beskrevet i ref. 21. Ved denne metoden ble 3.7xl0<6>kolonier oppnådd. Disse bakteriekoloniene ble fusjonert med COS-celler ved standard protoplastfusjonsmetoder (ref. 21). I disse fusjonseksperimentene, ble 26 Corning-skåler som hver inneholdt 5xl0<5>COS-celler brukt. Etter fusjon, ble COS-cellene sådd ut som beskrevet ovenfor og Hirt-ekstraktet laget. 32,000 bakterielle kolonier ble oppnådd fra Hirt-ekstraktet. Fusjonen, utsåingsmetodene ble gjentatt og 32,000 bakteriekolonier ble oppnådd fra det etterfølgende Hirt-ekstrakt. De samme metodene ble gjentatt igjen, 28,000 bakteriekolonier ble oppnådd (i mellomtiden, skulle det være en dramatisk anrikning av de ønskede klonene). De samme metodene ble gjentatt igjen og 6,00 0 kolonier ble oppnådd.

Fra disse koloniene ble 30 kolonier plukket tilfeldig og cDNA-innskuddene analysert. Av disse inneholdt bare 7 kolonier plasmider fra hvilket cDNA-innskuddene kunne bli spaltet ut ved restriksjonsenzym Xhol. Vektorkarakteristiske Xhol-seter ble lokalisert på begge sider av cDNA-et og alle andre plasmider hadde mistet slike klyvningsseter p.g.a. DNA-rearrangementene; alle var faktisk meget mindre i størrelse enn den opprinnelige vektor. Disse ble således betraktet å være ikke-spesifikke produkter. På den annen side ble alle de 7 kolonier oppnådd fra samme mRNA, som bekrefetet ved den konvensjonelle restriksjonsenzymklyvningsanalyse og DNA-blotanalyse. Av disse, inneholdt ett plasmid betegnet pIL-2RS3 0 lengre cDNA enn de andre 6 plasmidene som viste seg å være identiske med hverandre (betegnet IL-2RS9).

Med denne metode isolerte vi derfor to uavhengige cDNA-kloner, pIL-2RS9 og pIL-2RS3 0; begge ekspresjonsproduktene reagerte spesifikt med antistoffene. De to klonene inneholdt cDNA-innskudd på hhv. 1,3Kb og 2,3Kb, og krysshybridiserte med hverandre. Etterfølgende sekvensanalyse av cDNA-ene viste at de representerte det samme mRNA. RNA-blottinganalyse viste faktisk at mRNA-et er omtrent 4Kb i størrelse (se nedenfor). Vi undersøkte deretter andre YT cDNA-bibliotek ved å bruke de klonede cDNA-er som prober, og flere uavhengige cDNA-kloner som sammen dekket hele mRNA-et for IL-2RS-kjeden ble isolert. Således ble pIL-2R£6 og pIL-2R£l9 oppnådd ved å undersøke cDNA-bibliotekene med pIL-2RE9-cDNA-innskuddet som probe.

De ovenfor nevnte plasmidene som inneholdt cDNA som koder for human IL-2RS-sekvensener er blitt deponert i bakterietype E. coli MC 1061/P3 2. mars 1989 i Fermentation Research Institute ifølge Budapest Treaty under de følgende tall:

De komplette nukleotidsekvensene til fire av de klonede cDNA-ene ble bestemt (fig. 1). Fig. 1 viser strukturen til det humane IL-2RS-kjede cDNA. Fig. la er en skjematisk beskrivelse av mRNA slik det er dedusert fra de klonede cDNA-ene. Prikket, streket, åpne og lukkede rektangler viser hhv. signalsekvensen, den ekstracellulære, den transmembrane og den cytoplasmatiske region til mRNA-et beskrevet nedenfor. Fig. lb viser nukleotid- og aminosyresekvensene til det humane IL-2RS-kjede cDNA. Sekvensen ble dedusert etter komplett DNA-sekvensanalyse av de ovenfor beskrevne cDNA-klonene. Nukleotidene er nummerert på høyre side og aminosyrene er nummerert på venstre side. Klonene pIL-2RSl9 og pIL-2R£6 inneholdt hver G-A mutasjon på hhv. nukleotidrestene 425 og 1531. Således har pIL-2R£6 cDNA fått en TAG-triplett i den cytoplasmatiske region. Det er antatt å være en feil i den reverse transkripsjon, siden alle andre kloner, pIL-2RS30, pIL-2R£l9 og pIL-2R£l6 har en TGG-triplett i den posisjon. De første understrekede 26 aminosyrerester representerer signalsekvensen som forutsagt ved konsensussekvensen (22). De 25 transmembranaminosyrerestene er markert med en tykk under-strekning. Cysteinrestene er rammet inn. De potensielle N-glykosyleringssetene er understreket dobbelt. De mulige poly-adenyleringssignalene er vist ved åpen rektangel. Som oppsum-mering var RNA preparert fra den NK-lignende humane lymfoide cellelinje, YT og cDNA-bibliotek laget med CDM8-vektor ifølge publiserte metoder (21) , bortsett fra bruk av enten random primers (Amersham) (for pIL-2RS6, 9 og 30) eller oligo (dT) primer (for pIL-2RSl9). Undersøkelse av cDNA-bibliotekene ved en blanding av anti-IL-2Rfé monoklonale antistoffer, Mik-Sl og Mik-S2 ble utført som beskrevet tidligere (21). Nukleotidsekvensene ble bestemt ved en kombinasjon av dideoksykjede-terminering og kjemiske spaltningsmetoder.

Som vist i fig. 1 inneholder cDNA-et en stor åpen leseramme som koder for et protein som består av 551 aminosyrer. Ikke noe signifikant homologi ble funnet til andre kjente proteiner i proteinsekvensdatabasen (National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C.) eller med sekvenser som er publisert mer nylig. Til forskjell fra mange andre cytokine reseptorer, synes det som om IL-2Ro;- og IL-2RS-kjeder ikke tilhører til immunglobulinsuperfamilien. Fra den deduserte struktur til proteinet, er den N-terminale 26 aminosyre betraktet å representere signalsekvensen. Den modne form til IL-2RS-kjeden består således av 525 aminosyrer med en beregnet molekylvekt på 58358. Som vist i fig. 1 består reseptormolekylet av en ekstracellulær region som består av 214 aminosyrer.. Denne region inneholder 8 cysteinrester der 5 rester er funnet i den N-terminale halvpart og de er separert relativt periodisk med 9-12-aminosyrer. Det er sannsynlig at disulfidbroer mellom cysteinrestene fører til en stabil konfigurasjon for ligandbinding. En rikdom på cysteinrester ser faktisk ut til å være ett av fellestrekkene i den ligandbindende domene til mange reseptorer (23). Det kan være verdt å legge merke til at det antatte antall aminosyrer (a.a.) innen den ekstracellulære region til IL-2RS-kjeden (214 a.a.) er nesten sammenlignbar i antall til IL-2Ra-kjeden (219 a.a.). Slik størrelseslikhet kan være av betydning når det gjelder å vurdere konformasjonen til det heterodimeriske reseptorkompleks hvilket er ganske unikt for denne reseptor; siden både a- og S-kjeder reagerer individuelt med distinkte seter til det samme IL-2-molekylet (24).

En hydrofob strekning på 25 aminosyrer som går fra 215 til 23 9 aminosyrerester synes å utgjøre den membranomfattende region til reseptoren (fig. 1 og 2).

Fig. 2 er en hydrofobisitetsplottanalyse av den deduserte humane IL-2Rof- og IL-2RS-kjedeforløperstrukturer. Analysen ble utført ifølge Kyte og Doolittle (38). SG og TM representerer hhv. signalsekvens og transmembransekvens.

Den cytoplasmatiske region til S-kjeden består av 286 a.a. og den er meget større enn den for a-kjeden, som er bare 13 a.a. lang. Konsensussekvensene til tyrosinkinase (Gly-x-Gly-x-x-Gly) (25) er fraværende i S-kjeden. Tilstedeværelsen av en triplett, Ala-Pro-Glu (293-295) kan imidlertid bemerkes; dette er blitt antatt å være konsensusmotivet for et katalytisk domene til visse proteinkinaser (25). Muligheten for at den cytoplasmatiske regionen til S-kjeden har en proteinkinaseaktivitet gjenstår å bli testet. Den primære strukturen til denne regionen viste en ytterligere interessant egenskap; en ganske sterk forfordeling av visse karakteristiske aminosyrer. Denne regionen er rik på prolin (42/286) og serin (30/286) rester. Det er interessant at "den prolinrike" struktur er også blitt vist innen den cytoplasmatiske region til CD2, et T-cellemembranantigen som er involvert i aktiveringsmåten til T-celler (26). Den prolinrike struktur kan medføre en ikke-globobulær konformasjon inn i denne regionen som kan være viktig for å koble reseptormolekylet med andre signalformidler(e). De mange serinrester kan være hovedmålet for fosforylering, som også kunne modulere reseptorfunksjonen (27). I tillegg er den cytoplasmatiske region spesielt forfordelt med hensyn til negativt ladede aminosyrer. Denne region inneholder faktisk 40 slike aminosyrer (f.eks. glutamin- og asparaginsyrer), mens bare 18 aminosyrer utgjør de positivt ladede rester (f.eks. lysin og arginin). Slik en forfordeling er særlig

■bemerkelsesverdig i den midtre del (a.a. 345-390) i den cytoplasmatiske regionen. Således kan den cytoplasmatiske

regionen til S-kjeden være ganske sur. Vurdert sammen kan noen hvis ikke alle av disse unike egenskaper være ansvarlig når det gjelder å formidle videre

nedstrømssignaltransduksjonsveien(e). Reseptorproteinet inneholder 5 potensielle seter for N-bundetglykosylering (fig. IB), av disse er 4 lokalisert i den ekstracellulære region. Slik posttranslasjonell modifikasjon kan forklare forskjellen mellom M.W. til det estimerte mature (70-75kD) og de kalkulerte (58kD) proteinmolekylene. Hydrofobisitetsplottanalyse av a- og fi-kjedene avslørte nærværet av hydrofile regioner like inntil cellemembranen i begge kjedene (fig. 2). Disse regionene kan spille en rolle i den ikke-kovalente intramolekylære assosiasjon mellom de to kjedene.

Ekspresjon av human IL- 2RS- kiede mRNA

Ekspresjon av IL-2RS mRNA ble undersøkt ved bruk av cDNA-innskudd fra pIL-2RS30 som probe.

Fig. 3a illustrerer ekspresjon av human IL-2RS kjede mRNA i forskjellige celletyper. Poly(A)<+>RNA (2/xg per spor) fra de følgende cellekilder ble laget og behandlet med tanke på RNA-blottanalyse ved bruk av Xhol-prøvet human IL-2RS-kjede cDNA-fragment som stammer fra pIL-2R£3 0 som probe ifølge standard metoder (14, 18, 27). Spor 1, YT; spor 2, Hutl02(HTLV-1 transformert human T-cellelinje); spor 3, MT-2 (HTLV-1 transformert human T-cellelinje); spor 4, ARH-77 (multippel myelomlinje); spor 5, SKW6.4 (EBV-transformert human B lymfoblastoid linje); spor 6, U937 (histiocytt leukemi-linje); spor 7, MT-1 (HTLV-1 transformert human T-cellelinje); spor 8, Jurkat (human T leukemi-linje); spor 9, HeLa (human cervikal karsinoma cellelinje).

Som vist i figur 3a, viste RNA blottanalysen nærværet av en 4kb mRNA, hvis ekspresjon er begrenset til lymfoide celler som tidligere er blitt vist å ha IL-2RS-kjede (f.eks. YT, MT-2, Hutl02, SKW6.4) (12, 16, 17). På den annen side ble mRNA-ekspresjonen ikke oppdaget i celler slik som Jurkat, MT-1, U937, ARH-77 og HeLa-celler. mRNA-ekspresjonsmengdene er i hovedsak korrelert til IL-2RS-kjedeekspresjonsmengdene.

Fig. 3b illustrerer ekspresjonen av IL-2RS og IL-2Ra mRNA i human PBLs. Total RNA (15/xg per spor) ble applisert i hvert spor. Sporene 1 og 4 representerer ikke-stimulerte humane perifere blodlymfocytter (PBLs); spor 2 og 5, PBLs stimulert med 5 tig/ml fytohemagglutinin (PHA) i 24 timer; spor 3 og 6, PBLs stimuerlt med 5 /xg/ml PHA i 72 timer. Det RNA-blottede filter ble hybridisert med IL-2RS-probe (spor 1-3). Etter fjerning av IL-2R£-proben, ble det samme filteret hybridisert med IL-2Ra-proben (XbalBclI-fragment fra pSVIL2R-3 (14) (spor 4-6).

Det er interessant å merke at IL-2R& mRNA ble oppdaget i de ikke-stimulerte PBLs og dens ekspresjonsnivåer øket midlertidig bare 2,5 ganger etter mitogenstimulering. Ut fra tidligere resultater oppnådd fra flow cytometrisk analyse (19), er det sannsynlig at mRNA-induksjonsmønsterne varierer mellom de forskjellige lymfocyttpopulasjonene. Dette ekspresjonsmønster er ganske forskjellig fra det til IL-2Ra-kjeden hvis ekspresjon krever absolutt mitogenstimulering av cellene (fig. 3b), hvilket antyder at det eksiterer forskjellige mekanismer for genekspresjon av de to genene.

Southern blottanalyse av genomisk DNA fra PBL og forskjellige cellelinjer inkludert HTLV-1-transformerte humane T-cellelinjer indikerte at genet er tilstede i en enkelt kopi og er ikke rearrangert i disse cellene.

IL- 2 bindingsegenskaper til den cDNA- kodede IL- 2RS- kiede

Vi utførte deretter en serie av cDNA-ekspresjonsstudier for å undersøke hvorvidt cDNA-produktet binder IL-2 og virkelig har de egenskaper som IL-2RiS-kjeden er blitt vist og/eller antydet å ha i tidligere studier. De to cDNA-ekspresjonsplasmidene ble konstruert der ekspresjon av cDNA som omfatter den hele kodende region ble dirigert ved hjelp av enten muse lck-qen (29) promotoren (pLCKRlS) eller Moloney leukemivirus LTR (3 0) (pMLVRS).

Ekspresjonsvektorer ble konstruert ved hjelp av de følgende metoder. pIL-2RS30 ble fordøyet med Hindlll (kly-vingssete er lokalisert innen polylinkerregionene til CDM8) og etter fyll-inn av begge endene, ble en BamHI-linker bundet til og religert. Det resulterende plasmid ble så fordøyet med BamHI og det 1.8kb DNA-fragment som inneholder hele den kodende sekvens for S-kjeden ble introdusert i BamHI-klyvet pl013 vektor som inneholdt muse lek-promotoren for å konstruere pLCKRS. Det BamHI-fordøyde cDNA-fragment ble også innsatt i en retrovirusvektor, pZipSV(X) (30) for å konstruere pMLVRS. Den humane IL-2LRa!ekspresjonsvektoren, pSVIL2Rneo, ble laget fra pSVIL2R-3 (14) ved å erstatte Eco-gyptgenet med neo-resistensgenet.

Plasmidet pLCKRS ble innsatt i muse T-lymfom EL-4 og humane T-celle-leukemi Jurkat-1injer, begge er kjent å være fri for overflatemolekyler som binder human IL-2.

Transfeksjon av ekspresjonsplasmidene i Jurkat og EL-4-celler ble utført ved hjelp av elektroporering som beskrevet tidligere (39). Transfekterte celler ble selektert i RPMI1640 medium som inneholdt 10% føtalt kalveserum (FCS) og G418

(1 mg/ml for EL-4 og 1,5 mg/ml for Jurkat). For å oppnå celler som uttrykker cDNA-er til human IL-2Ra- og IL-2RS-kjeder samtidig, ble en Jurkat-derivert klone Ja-5, transfektert med pSVIL2Rneo, kotransfektert med pLCKRS og et plasmid som inneholdt hygromycin-resistensgenet, pHgy. De transfekterte cellene ble selektert med 200/ig/ml hygromycin. Transfeksjon av pMLVRS i 2 celler ble utført ved kalsium-fosfatmetoden som beskrevet tidligere (14) og cellene ble selektert ved 700/xg/ml av G418. For flow cytometrisk analyse, ble 5 x IO<5>celler behandlet med antistoff (1:500 fortynning av ascites) ved 4°C i 30 min.. Etter vask, ble cellene farget med fluorescein-konjugert geit anti-muse IgG.

De fargede cellene ble analysert på en FACS440 flow cytometer (Beckton Dickinson) . Bruk av<125>I-IL-2 bindingsassay og Scatchard plottanalyse ble utført som beskrevet tidligere (12) .

Fig. 4a illustrerer ekspresjon av human IL-2Ro; og/eller IL-2RS-kjede cDNA-er ved hjelp av

celleoverflatefargingsmønstre til human IL-2Ra og/eller IL-2RS cDNA-transfektanter. Parenterale celler og forskjellige transfektante celler ble separat farget med enten en monoklonal anti-human IL-2Ra antistoff, anti-Tac( ), eller monoklonalt antihuman IL-2RS-antistoff, Mik-Sl ( ).

Prikket linje ( ) er en fluorescensprofil til cellene som er farget med fluorescein-konjugert geit-anti-muse IgG alene. Celler som er benyttet var (1) ELS-13 og EL-4-derivert klon transfektert med pLCKRS), (2) JS-8 (en Jurkat-derivert klon transfektert med pLCKRS), (3) Ja-5 (en Jurkat-derivert klon transfektert med pSVIL2Rneo), (4) Ja-2 (et Ja-5-derivert klon transfektert med pLCKRS), (5) JaS-10 (en Ja-5-derivert klon transfektert med pLCKRS), og (6) FS-3 (en NIH3T3-derviert linje transfektert med pMLVRS).

Stabile transformante kloner som uttrykker cDNA-produktet ble oppnådd for både EL-4 (ELS-13) og Jurkat (JS-8) celler som bedømt ved FACS-analyse (fig. 4a). I tillegg introduserte vi også det samme genet i Jurkat-transformant-klonen, Ja-5, som uttrykker det transfekterte, humane IL-2Ra-kjede cDNA. To av de resulterende transformanter, JaS-2 og JaS-10 ble funnet å uttrykke både a- og S-kjeder (fig. 4a-(4), (5)). Som ventet viste RNA blottinganalyse av mRNA-et som var uttrykt i disse transformanter at a- og S-kjede-spesifikke mRNA-ene ble dannet fra de transfekterte cDNA-ene, men ikke fra de endogene gener (26). Videre for å undersøke egenskapen til cDNA-produktet i ikke-lymfoide celler, ble plasmid pMLVRS innsatt i en NIH3T3-cellederivert cellelinje 2 (30), og det ble oppnådd at den resulterende transformant uttrykte dette cDNA, FS-3, (fig. 4a-(5)). IL-2-bindingsstudier ble utført med<125>I-merket, rekombinant human IL-2.

Fig. 4b illustrerer ekspresjon av ot- og S-kjeder ved hjelp av Scatchard plottanalyse av125I-IL-2-binding til transfektantene som uttrykker de klonede cDNA-er. Scatchardplott av IL-2-bindingsdata i fravær (-o-o-) eller nærvær (-•-•-) av 1:100-fortynnet ascites av Mik-S-1. Bidning av<125>I-IL-2 til ELS-13 eller JS-8 ble fullstendig forhindret av Mik-Sl. Ikke noe spesifikk IL-2-binding ble observert når parental Jurkat eller EL-4-celler ble undersøkt. Tallet av IL-2-bindingsseter per celle og reseptoraffiniteten ble bestemt ved dataassistert analyse av IL-2-bindingsresultater.

(1) ELS-13, (2) JS-8, (3) Ja-5, (4) JaS-2, (5) JaS-10.

Det kan sees at den EL-4-deriverte klonen (ELS-13) og den

Jurkat-deriverte klonen (JS-8), som begge uttrykker S-kjede cDNA viste mellomaffinintet til IL-2 med estimerte Kd-verdier på hhv. 4,OnM og 2,7nM. IL-2-binding av disse cellene ble fullstendig fjernet ved Mik-Sl-antistoff (fig. 4b-(1), (2)). De Jurkat-deriverte JaS-2 og JaS-10 kloner som uttrykte både den humane IL-2Ra og I1-2RS cDNA viste både høy og lav affini-tetreseptorer med estimert Kd-verdier på 22pM og 15nM for JaS-2 og hhv. 19pM og 33nM for JaS-10. I kontrast viste de parentale Jurkat-deriverte Ja-5-celler som uttrykte a-kjede cDNA alene en ren lavaffinintet (Kd: 19,5nM) til IL-2 (fig. 4b-(3)). Antallet av høyaffinintet IL-2R uttrykt av JaS-2-celler og JaS-10 var sammenlignbart med uttrykte IL-2RS-molekyler. I tillegg fjernet behandling av disse celler med Mik-Sl-antistoff fullstendig høyaffinintet IL-2-bindingsseter fra celleoverflaten, mens ekspresjon av lav-affinintet IL-2R ble beholdt (fig. 4b-(4), (5)). Disse observasjonene viste entydig at cDNA som kodet for IL-2RS-molekylet er direkte involvert i dannelsen av høyaffinintetsreseptorkomplekset i assosiasjon med IL-2Ra-kjeden. I kontrast til de tidligere beskrevne T-celletransformanter, viste FS-3-cellene ingen IL-2-binding på celleoverflaten under samme bindingsbetingelser. Det er interessant at samme observasjon ble gjort med ape COS-celler som uttrykker S-kjeden, men som ikke binder IL-2 (28). Således antyder resultatene at enten er en celle-typespesifikk prosesseringsmekanisme(r) eller ytterligere cellulær(e) komponent(er), eller begge involvert i ekspresjon av den funksjonelle IL-2RS-kjeden.

For å karakterisere videre den molekylære struktur til rekonstituert IL-2R, utførte vi kjemisk kryssbindingseksperimenter med1<25>I-IL-2 og ikke-spaltbar kjemisk kryssbinder, dissuccinimidylsuberat (DSS).

Fig. 5 illustrerer resultatene av affinitetskryss-bindingsstudier med IL-2R-positive transformanter. Cellene ble inkubert med 5nM (spor 1-13) eller 100 pM (spor 14-16)<125>I-IL-2 i fravær (spor 1-4, 14-16) eller nærvær av en 250 ganger molar overskudd av ikke-merket IL-2 (spor 5-7), 500-ganger molar overskudd av affinintetskolonne-renset Mik-Sl (spor 8-10) eller 500-ganger molar overskudd av affinitet søylerenset antiTac (spor 11-13). Så ble cellene kjemisk kryssbundet med dissuccinimidylsuberat (DSS) som beskrevet tidligere (16). Cellene ble så løst opp og supernatantene ble analysert på 7,5% SDS-PAGE. Cellene som ble benyttet var: Jurkat (spor 1); Ja-5 (spor 2, 5, 8, 11, 14); JS-8 (spor 3, 6, 9,12, 15); JaS-10 (spor 4, 7, 10, 13, 16). YT-celler som var kryssbundet med12<5>I-IL-2 ble benyttet som en markør (M) .

Det kan sees at celler som uttrykte bare IL-2RS-kjede ble kryssbundet med1<25>I-merket IL-2 og analysert ved SDS-PAGE viste et dobbeltbånd som bestod av 90kD hovedbånd og 85dD mindre bånd og at dets migrasjonsmønster var lik den fra YT-celler (se piler i fig. 5 og ref. 16, 17). Opptreden av dubletten blir hemmet ved et overskudd av umerket IL-2 eller ved Mik-Sl. Dublettdannelsen kan skyldes degradering av reseptor-IL-2-komplekset. Det er også mulig at begge protein-produktene stammer fra en forskjellig posttranslasjonell modifikasjon(er). Alternativt, kan én av dublettene representere en tredje komponent av reseptorkomplekset. Et bredt bånd som migrerer rundt posisjon 150kD ble også oppdaget i transfektanten (JaS-10) så vel som YT-celler. Opptredenen av dette bånd blir også hemmet av enten umerket IL-2 eller Mik-Sl. Det kan representere det ternære kompleks av IL-2, IL-2Ra og IL-2RS-molekyler. I en serie av kjemiske kryssbindingseksperimenter vist i fig. 4, ble det demonstrert at de fysisk-kjemiske egenskapene til reseptorkomplekset uttrykt på overflaten til JaS-2 er ikke mulig å skille fra egenskapene til høyaffinitetsreseptor uttrykt på dyrkede T-celler eller PBLs (12, 16, 17).

Preliminære resultater fra eksperimenter for å avgjøre hvorvidt ekspresjon av a- og S-kjedene i ikke-lymfoide celler resulterer i dannelse av høy-affinitetsreseptor indikerer at når a- og S-kjede cDNA-ene blir midlertidig ko-uttrykt i COS-celler, kan begge kjeder kryssbinde med<125>I-IL-2 ved konsen-trasjonen (400 pM) i hvilken den samtidig uttrykte a-kjeden ikke kan alene (28). Resultatene kan antyde dannelsen av aS heterodimerreseptor i denne ikke-lymfoide cellelinjen.

IL- 2- internaliserinq med rekonstituerte reseptorer

Det er blitt rapportert at mellom- og høy-affinintets IL-2-reseptorer kan begge internalisere IL-2 (33-35) . Ligand-internalisering er vanligvis ledsaget av IL-2-signalformidling, hvilket antyder at denne prosess er essensiell.

Fig. 6 illustrerer IL-2-internalisering via de rekonstituerte reseptorene. IL-2-internalisering ble undersøkt ifølge en metode beskrevet tidligere (33). Kort fortalt ble celler (5xl0<7>) behandlet med<125>I-IL-2 i en endelig konsentrasjon på 200pM (JaS-10) eller 5nM (Ja-5, JS-8 og ELS-13) ved 0°C i 3 0 min.. Etter vask, ble cellene suspendert med forvarmet kulturmedium (37°C) og kinetikken til IL-2-internalisering ble undersøkt som beskrevet tidligere (33).

(a) ELS-13, (b) JS-8, (c) JaS-10, (d) Ja-5.

(-•-•-•-), internalisert IL-2; (...o...o...), celle-overflate-bundet IL-2; (-■-■-■-■-), fritt IL-2.

Som vist i fig. 6 undersøkte vi hvorvidt de rekonstituerte reseptorene kan internalisere IL-2. Cellene som uttrykker IL-2RS-kjedet alene, eller både a- og S-kjeder er faktisk i stand til å internalisere IL2 ifølge et kinetisk mønster som er likt det rapportert for den opprinnelige reseptoren. I kontrast, internaliserte ikke Jurkat-cellene som uttrykte bare IL-2Ra, IL-2, i likhet med tidligere rapporterte observasjoner (33, 34). Preliminære resultater indikerer at veksten til cellene som uttrykker mellom- eller høy-affinintetsreseptorer blir selektivt hemmet av IL-2 (14, 36). Vi har også preliminære resultater som viser at S-kjeden uttrykt i en annen vertscellelinje fungerer når det gjelder å stimulere celleveksten som respons på IL-2 (28).

Kloning av muse- IL- 2R- reseptor S- kiede

Ingen spesifikke antistoffer til muse-IL-2-reseptor-S-kjede er vist å eksistere, derfor ble den screeningmetode som ble benyttet for isolering av cDNA for Hu IL-2RS-kjede ikke benyttet.

Et cDNA-bibliotek ble laget ved bruk av poly (A)<+->RNA fra Concanavalin A-stimulerte musemiltceller; cDNA ble klonet i

Xgt 10 som ble oppformet i E. coli.

Screening av dette bibliotek ble så utført ved bruk av den ovenfor beskrevne humane IL-2RS-kjede cDNA som probe under ikke-stringente betingelser. Fra de positive klonene ble en klone betegnet XMIL 2RS-26 selektert. cDNA-innskuddet i denne klonen inneholdt bare en 540 bp-sekvens av den hele murine II-2RS-kjedesekvens. Denne sekvens ble derfor isolert ved fordøyelse av XMIL-2RS-26 ved bruk av Pvu 2 og benyttet for å undersøke et annet cDNA-bibliotek som var laget ved bruk av poly (A)<+>fra mus-thymoncellelinjen EL-4 ifølge standard metoder og klonet inn i BstXI-setet til CDM8-vektoren fulgt av transfeksjon av E. coli.

Undersøkelse av cDNA-biblioteket ble utført under høyt stringente betingelser ifølge metoden beskrevet i europeisk patentsøknad nr. 88 119 602.9 og Kashima et al. (Nature Vo. 313 s. 402-404, 1985) .

Fra de positive klonene ble klon pMIL-2RS-36 som inneholdt det strukturelle gen for murin IL-2RS (se fig. 8) selektert. Restriksjonskartet til cDNA-klonen er vist i fig. 7 ..

Plasmid pMIL-2RS-36 er blitt deponert i E.coli bakterielinje MC 1061/P3 23. mai 1989 ved Fermentation Research Institute ifølge Budapest Treaty under registreringsnr. FERM BP-2435.

Fremstilling av løselig human interleukin 2 reseptor- S- kjede

En utskilt form av hIL2-RS-kjede (betegnet heretter løselig S) ble produsert ved å transfektere NIH 3T3 fibroblaster med det modifiserte S-kjede cDNA ("anker minus" cDNA) som manglet hele den cDNA-sekvens som kodet for både intracytoplasmatiske- og transmembrandomener i den native S-kjede.

Konstruksjon av ekspresjonsvektor som inneholder ankerdelen minus cDNA som koder for den løselige S ( BCMGNeo- sol. S)

S-kjede cDNA (fig. lb) ble modifisert til å bestå av anker minus delen for produksjon av den løselige S. En strategi for å lage ekspresjonsvektoren som inneholdt anker minus cDNA er illustrert i fig. 9. Først ble plasmid pIL-2RS3 0 som inneholdt 2.3-kb S-kjede cDNA i CDM8-vektoren fordøyet med BssH II og Sma I (alle restriksjonsenzymer ble kjøpt fra New England BioLabs, Beverly, MA, USA), og et 1.9-kb cDNA-fragment (base 58-1967) som inkluderte den hele kodende sekvens (base 121-1773) av S-kjeden ble så oppnådd. Etter fyll-inn ved BssH II enden, ble 1.9-kb cDNA innsatt i et Sma I restriksjonssete i pBluescript SK vektor (Stratagene, San Diego, CA, U.S.A.). Dette pBluescript SK-Sl.9-plasmid ble så fordøyet med sty I (restriksjonsseter; base 825, 934 og 1235) og Sma I slik at alle de intracytoplasmatiske og transmembranregioner ble fjernet, og etterlot basene 121-840 som rerpesenterer mesteparten av den ekstracellulære intakte region. Deretter ble en 12-base syntetisk linker (New England BioLabs, #1060) som inneholdt multiple termineringskodoner (TAG) så vel som gjenkjennelsessekvensen for Nhe I fosforylert og ligert til Sty I/Sma I-fordøyet plasmid DNA med T4 DNA-ligase. Etter fordøyelse med Nhe I for å fjerne overskudd linker, ble DNA ligert til SK-vektoren for å konstruere pBluescript SK-sol.S.

Dette SK-sol.S ble fordøyet med Sal I og Not I (restrik-sjonssetene ble lokalisert innen polylinkerregionen til pBluescript SK-vektoren), og det resulterende 0.8-kb cDNA-fragment som kodet for den løselige S ble isolert. Dette cDNA-fragment ble innsatt i Xho I/Not I-fordøyet BCMGNeo-vektor (se Karasuyama et al., J. Exp. Med. 169: 13-25, 1989) som inneholdt cytomegalovirus (CMV) promotor og neoycin-resistensgenet for å gi det endelige ekspresjonsplasmid BCMGNeo-sol.S. BCMGNeo er en "shuttle" (multippel vertscelle) vektor som inneholder 69% bovinpapillomavirus (BPV) sekvenser hvilket sikrer ekstrakromosomal replikasjon i pattedyrceller. Som illustrert i fig. 10, som illustrerer nukleotidsekvensen og den korresponderende aminosyresekvens for det native og løselige S, koder den løselige S cDNA for et maturt protein som består av 212 aminosyrer (aa) ledsaget av et signalpeptid på 26 aa, mens det native S-kjede cDNA koder for et membranprotein som består av et signalpeptid (26 aa), ekstracellulær (214 aa), transmembran (25 aa), og intracytoplasmatisk (286 aa) domener. Nukleotidet og de korresponderende aminosyresekvenser for det native og det løselige S er også illustrert i fig. 10.

Transfeksjon av NIH 3T3 fibroblast med BCMGNeo- sol. S og etablering av stabile transformanter som utskiller det løselige S

cDNA-transfeksjon ble utført ved

protoplastfusjonsteknikken som beskrevet av Karasuyama et al.

(supra.). I korthet, ble bakterier som inneholdt BCMGNeo-sol. S overført til protoplaster og fusjonert med en murin fibroblast cellelinje, NIH3T3 ved bruk av polyetylenglykol 2.000 (Wako Chemical Industries, Osaka, Japan). 10 millioner protoplast-fusjonerte NIH 3T3-celler ble så sådd ut i fire 24-brønnplater. 25 dager etter kulturen i RPMI 1640 medium som inneholdt 10% føtalt kalveserum (FCS) og 750/xg/ml av G418 (Geneticin; Sigma, St. Louis, MO, USA), ble

transformantcellevekst observert i 60 brønner av 104. Etter undersøkelse ved hjelp av "sandwich" enzym-bundet immunosorbentassay (ELISA) som beskrevet nedenfor, ble kultursupernatantene fra 18 brønner av 60 funnet å være positive for den løselige S. Fem kloner ble etablert ved begrenset fortynning fra en brønn som ga den høyeste absorbans i ELISA, og de ble alle funnet å utskille store mengder løselig S (tabell I). I kontrast NIH 3T3-celler transfektert med full-lengde iS-kjede cDNA (betegnet 3T3-S11) skilte ikke ut S-kjede-molekyl i nevneverdig mengde. I etterfølgende undersøkelser benyttet vi klonen betegnet 3T3-B4-14 som utskilte den høyeste mengden av løselig S.

ELISA for å oppdage den løselige S

Kultursupernatanter til transfekterte celler ble undersøkt for nærværet av den løselige S ved en "sandwich" enzym-bundet immunosorbentassay (ELISA). I denne assay ble det benyttet to monoklonale antistoffer Mik-Sl og -S3, supra. og Tsudo et al., Proe. Nati. Acad.Sci. USA, 86: 1982-1986, 1989, som gjenkjenner de distinkte epitopene på S-kjeden; f.eks. Mik-Sl gjenkjenner IL2-bindingssetet, mens Mik-S3 gjenkjenner epitopen som ikke er involvert i IL2-bindingen. Som illustrert i fig. 11, som er en skjematisk presentasjon av Sandwich ELISA Immulon-I mikrotiterplater (Dynatec, Chantilly, VA, USA) ble dekket over natten med 50/il Mik-S3 ved 10//g/ml i Tris-bufret saltvann (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,15 M NaCl). Etter avhelling overskudd antistoff, ble ubundne seter blokkert ved inkubasjon med TBS som inneholdt 1% bovint serumalbumin i 1 time. Etter å vaske med TBS som inneholdt 0,05% Tween 20 (T-TBS) , ble 50/xl av kultursupernatantene til transformantene tilsatt brønnene og inkubert 1 time. Etter vask ble 50/xl biotinylert Mik-Sl i 1//g/ml tilsatt som sekundært antistoff for å oppdage den løselige S bundet til det primære antistoff, Mik-S3 på platen. Etter 45 min. inkubasjon og etterfølgende vask, ble 50/il av alkalisk fosfatase-konjugert avidin (Tago, Burlingame, CA, USA) tilsatt. Etter en 45 min. inkubasjon, ble platene vasket,

100/xl av p-nitrof enylf osf at tilsatt, og absorbansen i brønnene bestemt ved 405 nm etter 45 min..

Synlig molekylvekt på utskilt løselig S

For å definere molekylvekten på løselig S, ble 3T3-B4-14-celler biosyntetisk merket med<35>S-metionin, og løselig S-immunopresipitert med Mik-Sl mAb fra kultursupernatanten. Forskjellige mengder av immunopresipitater ved bruk av Mik-Sl og som kontroll UPC 10 mAb for presipitasjon, ble påsatt og elektroforesert på en 8% SDS-polyakrylamidgel. Som vist i fig. 12, ble Mik-Sl, men ikke kontroll UPC 10 mAb, identifisert som et enkelt proteinbånd med en omtrent Mr på 37.000 i kultursupernatanten til 3T3-B4-14-celler etter undersøkelse ved hjelp av SDS-polyakrylamidgelelektroforese (PAGE)). Denne molekylstørrelsen er i god forståelse med den som er forutsagt for den trunkerte S-kjede som mangler alle transmembrane (25 aa) og intracytoplasmatiske (286 aa) regioner.

IL- 2- bindingsfunksion til den løselige S

Det ble så undersøkt hvorvidt den utskilte form av S-kjeden er i stand til å binde IL-2. Til dette formål, ble en "konkurranse" sandwich ELISA benyttet. I denne metoden blir den løselige S i kultursupernatanten bundet på en solid fase ved Mik-S3 mAb, en ikke-inhibitorisk mAb for IL-2-binding, slik at det antatte IL-2-bindingssetet på S-kjeden ville få bli ublokkert. Så ble seriefortynninger av IL-2 eller umerket Mik-Sl tilsatt som konkurrenter for biotinylert Mik-Sl. Fig. 13 viser resultatene til den kompetitive "sandwich" ELISA i hvilken kurven er for seriefortynninger med umerket Mik-Sl og -o-o- for seriefortynninger med IL-2. Som vist i fig. 13 reduserer umerket Mik-Sl absorbansen doseavhengig, hvilket viser spesifisiteten til dette system. På samme måte konkurrerte IL-2 effektivt og doseavhengig med biotinylert Mik-Sl for bindingen til den løselige S, hvilket indikerte at den løselige S er virkelig i stand til å binde IL-2.

Denne konkurransekurve er ganske lik den som ble funnet for detergent-solubilisert nativ S-kjede fra YTS-celler som uttrykker S-kjeden alene, hvilket indikerer at affiniteten til den løselige S til IL-2 er sammenlignbar med den løselige native S-kjede.

Tilgjengeligheten på genene som koder for IL-2RS-kjeder gjør det mulig å utforske nye veier for funksjonelle studier i IL-2-systemet. Reseptorstrukturen som fungerer i IL-2-systemet er unik idet to strukturelt distinkte membranmolekyler, IL-2Ra-og IL-2RS-kjedene, begge binder IL-2 uavhengig. Seriene med cDNA-ekspresjonseksempler beskrevet heri underbygger videre den tidligere antagelse at a- og S-kjedene utgjør det høy-affinitet IL-2R-kompleks via en ikke-kovalent assosiasjon av molekylene (18, 37). Således er det spesielle i dette systemet involveringen av tre intermolekylære interaksjoner mellom én ligand og to distinkte reseptorer. Ved hjelp av den foreliggende oppfinnelse vil det nå være mulig å belyse de fuksjonelle domener i dette unike cytokinreseptorsystem. Mutasjonsanalyser av det klonede S-kjede cDNA kan gi løsninger med hensyn til identifikasjonen av de respektive domener som er involvert i ligandbinding og assosiasjon med a-kjeden. Pr. i dag er lite kjent om den kaskade av biokjemiske begivenheter som utløses av cytokiner gjennom reaksjon med deres homologe reseptorer. Ved den foreliggende opfinnelsen har vi demonstrert nærværet i IL-2RS-kjeden av en stor cytoplasmatisk region som mest sannsynlig er innblandet i formidling av IL-2-signalvei(er). Den spesielle sure kjerne funnet i den cytoplasmatiske region kan antyde kobling til andre cytoplasmatiske signaloverførere. Alternativt i relasjon til den tidligere rapport vedrørende nærværet av IL-2 i nukleus (kjernelegeme) (33), representerer de sure så vel som de prolinrike regioner av den IL-2RS cytoplasmatiske komponent en interessant mulighet for å spille en rolle i aktivering av den genetiske programmering. Tilgjengeligheten av ekspresjonssystemet der den cDNA-kodende S-kjede kan produsere vekstsignaler vil tillate videre oppklaring av de funksjonelle domener i reseptoren. Det er nå mulig å studere den essensielle rolle som IL-2 har i utviklingen og reguleringen av immunsystemet.

Tilgjengeligheten av løselige deler av celleoverflate-reseptor S-kjeden skulle forenkle strukturell analyse av S-kjeden siden krystallisering er lettere å gjøre av løselige molekyler enn av uløselige. De løselige molekylene kan også bli benyttet til å nøytralisere de aktuelle celleoverflate-reseptorer for å studere de biologiske funksjonene til reseptorene eller for terapeutiske formål.

REFERANSER OG NOTER

1. D.A. Morgan, F.W. Ruscelli, R.C. Gallo, Science 198,

1007 (1976) 2. K.A. Smith, Annu.Rev.Immunol. 2, 319 (1984); T. Taniguchi et al., Immunol.Rev. 92, 121 (1986)

3. D.H. Raulet, Nature 314, 101 (1985)

4. M. Tsudo, T. Uchiyama, H. Uchino, J. Exp. Med. 160, 612

(1984)); T.A. Waldmann et al., ibid., s. 1450 (1984);

M.A. Blackman, M.A. Tigges, M.E. Minis, M.E. Koshland, Cell, 47, 609 (1986)

5. M. Malkovsky et al., Nature 325, 262 (1987)

6. C.S. Henney, K. Kuribayashi, D.E. Kern, S. Gillis, ibid. 291, 335 (1981) 7. M.E. Lotze, E.A. Grimm, S.A. Strausser, S.A. Rosenberg, Cancer Res. 41, 4420 (1981); E.A. Grimm, A. Mazumder, H.Z. Zhang, S.A. Rosenberg, J. Exp. Med. 155, 1823 (1982) 8. S.A. Rosenberg et al., N. Engl. J. Med. 316, 889 (1987)

9. E.N. Benveniste, J.E. Merrill, Nature 321, 610 (1986)

10. S. J. LeGrue, Lymphokine Res. 7, 1987 (1988); G.B. Millis, P. Girard, S. Grinstein, E.W. Gelfand, Cell 55, 91 (1988); V.E. Valge, J.G.P. Wong, B.M. Datlof, A.J.

Sinskey, A. Rao, ibid., s. 101 (1988); M.A. Tigges. L.S. Casey, M.E. Koshland, Science 243, 781 (1989)

11. R.J. Robb, W.C. Greene, CM. Rusk, J.Exp.Med. 160, 1126

(1984) 12. M. Tsudo, R.W. Kozak, C.K. Goldman, T.A. Waldmann, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 83, 9694 (1986); K. Teshigawara,

H.-M. Wang, K. Kato, K.A. Smith, J.Exp.Med. 165,. 223

(1987) 13. W. J. Leonard et al., Nature 311, 626 (1984) T. Nikaido et al., ibid., s. 631 (1984); D. Cosman et al., ibid. 312, 768 (1984)

14. M. Hatakeyama et al., ibid. 318, 467 (1985)

15. W.C. Greene et al., J. Exp. Med. 162, 363 (1985), S. Kondo et al., ibid. 320, 75 (1986); R.J. Robb, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 83, 3992 (1986) 16. M. Sharon, R.D. Klausner, B.R. Cullen, R. Chizzonite, W.J. Leonard, Science 234, 859 (1986) 17. R. J. Robb et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A., 84, 2002 (1987); M.Tsudo, R.W. Kozak, C.K. Goldman, T.A. Waldmann, ibid., s 4215 (1987); M. Dukovich et al., Nature 327, 518 (1987) 18. M. Hatakeyama et al., J. Exp. Med. 166, 362 (1987); S. Kondo et al., Nature 327, 64 (1987) 19. M. Tsudo, F. Kitamura, M. Miyasaka, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A.i trykning.

20. J. Yodoi et al., J. Immunol. 134, 1623 (1985)

21. B. Seed, A. Aruffo, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 84, 3365 (1987); B. Seed, Nature 328, 840 (1987) 22. D. Perlman, H.O. Halvorson, J.Moi.Biol. 167, 391 (1983);

G. von Heijne, Nucleic Acids Res. 14, 4683 (1986)

23. A. Ullrich et al., Nature 309, 418 (1984); A. Ullrich et al., ibid. 313, 756 (1985); U. Ebina et al., Cell 40, 747

(1985)

24. L. Collins et al., Proe.Nati.Acad.Sei. U.S.A. 85, 7709

(1988) 25. K.S. Hanks, A.M. Quinn, T. Hunter, Science 241, 42 (1988)

26. A. Alcover et al., Immunol. Rev. 95,5 (1987)

27. M. Hatakeyama, S. Minamoto, T. Taniguchi,

Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 83, 9650 (1986)

28. M. Hatakeyama, T. Doi, T. Kono, S. Minamoto, T. Taniguchi, upubliserte observasjoner 29. J.D. Marth, R. Peet, E.G. Krebs, R.M. Perlmutter, Cell 43, 393 (1985) 30. R. Mann, R.C. Mulligan, D. Baltimore, ibid. 33, 153

(1983)

31. M. Fujii et al., J. Exp. Med. 163, 550 (1986)

32. A.M. Weissman et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 83, 1463 (1986)

33. R. J. Robb, W.C. Greene, J.Exp.Med. 165, 1201 (1987)

34. K. Sugamura et al., ibid. 161, 1243 (1985)

35. H. Saragovi, T.R. Malek, J. Immunol. 141, 476 (1988)

36. J. Kyte, R.F. Doolittle, J.Moi.Biol. 157, 105 (1982)

37. H. Potter, L. Weir, P. Leder, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 81, 7161 (1984)

Claims (15)

1. Rekombinant DNA-molekyl som koder for S-kjeden til en IL-2 reseptor,karakterisert vedat det har et strukturelt gen med formelen:

eller en del derav som koder for et fragment av iS-kjeden av en IL-2 reseptor som er i stand til å binde IL-2 eller en degenerert variant derav, eller har formelen:

hvori XXX = GGC eller TGC, eller en del derav som koder for et fragment av jS-kjeden av en IL-2 reseptor som er i stand til å binde IL-2 eller en degenerert variant derav.

2. Rekombinant DNA-molekyl ifølge krav 1,karakterisert vedat det består av DNA-innskuddet til en av plasmidene deponert under tilgjengelighetsnumrene FERM BP-2312, FERM BP-2313, FERM BP-2314, FERM BP-2315 eller FERM BP-2435 henholdsvis, eller en del av nevnte DNA-innskudd som koder for et fragment av jS-kjeden av en IL-2 reseptor som er i stand til å binde IL-2.

3. Rekombinant DNA-molekyl,karakterisert vedat det koder for en løselig del av den fullstendige IL-2Rfé-kjeden eller variant derav som definert i hvert av kravene 1 eller 2.

4. Rekombinant DNA-molekyl ifølge krav 3,karakterisert vedat det koder for aminosyrene 1 til 210 i IL2-RS-menneskekjeden.

5. Rekombinant DNA-molekyl ifølge krav 4,karakterisert vedat de terminale nukleotider er GCC CTT GCT AGC TAG, og som koder for et derivat av den vann-løselige IL-2RS-menneskekjede.

6. Rekombinant DNA-molekyl,karakterisert vedat det er istand til å hybridisere til det rekombinante DNA som definert i kravene 1-5, og koder for et protein med aktiviteten til en IL-2RS-kjede eller en løselig del derav, som definert i krav 3.

7. Rekombinant DNA-molekyl ifølge hvert av kravene 1-6,karakterisert vedat det videre omfatter reguleringssekvensene operativt knyttet til det strukturelle gen for IL-2RJ5-kjeden eller delen derav som koder for et fragment av jS-kjeden av en IL-2 reseptor som er i stand til å binde IL-2.

8. Rekombinant DNA-molekyl som definert i krav 7,karakterisert vedat det er et plasmid.

9. Plasmider,karakterisert vedat de er deponert under tilgjengelighetsnumrene henholdsvis FERM BP-2312, FERM BP-2313, FERM BP-2314, FERM BP-2315, eller FERM BP2435.

10.Vertscelle,karakterisert vedat den er transformert med og kan uttrykke et rekombinant DNA-molekyl som definert i kravene 7-9.

11. Vertscelle ifølge krav 10,karakterisert vedat den er en bakteriecelle eller en pattedyr-celle .

12. Hybridoma, subklon eller variant derav,karakterisert vedat det er istand til å utskille et monoklonalt antistoff med spesifikk aktivitet mot et protein oppnådd ved ekspresjon av et rekombinant DNA-molekyl, ifølge hvert av kravene 1-9.

13. Monoklonalt antistoff,karakterisert vedat det har en spesifikk aktivitet til et protein oppnådd ved ekspresjon av et rekombinant DNA-molekyl, ifølge hvert av kravene 1-9 .

14. Fremgangsmåte for fremstilling av S-kjeden til en IL-2 reseptor eller deler eller varianter derav som nevnt i krav 3-5,karakterisert vedtransformering av en egnet vertsorganisme med en ekspresjonsvektor inneholdende en kodende sekvens som krevet i hvert av kravene 1-7 for det ønskede poly-peptid ved et egnet sete for ekspresjon og isolering av det ønskede protein fra de resulterende transformanter.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert vedat det anvendes en ekspresjonsvektor ifølge kravene 8 eller 9.