JP3339855B2 - 組換えタンパク質レセプター - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はインターロイキン２のレセプター、特に該レ
セプターのβ鎖、そのβ鎖をコードするcDNA又はその一
部分、そのβ鎖をコードするcDNA挿入物を含むベクタ
ー、そのベクターでトランスホームした宿主及びその宿
主の培養による該β鎖の生産に関する。

〔従来の技術〕

細胞−細胞コミュニケーションに関する一種の可溶性
介在物であるサイトカインが免疫系の調節に必須である
という証拠が多く蓄積されてきている。サイトカインは
特異的細胞表面レセプターとの相互作用を介して標的細
胞の増殖、分化及び活性化を誘導することが知られてい
る。以前はＴ細胞増殖因子（１）として定義されていた
インターロイキン２（IL−２）は最もよく特徴を明らか
にされたサイトカインの１つであり、Ｔリンパ球（Ｔ細
胞）（２）の抗原特異的クローン増殖において重要な役
割を果していることが知られている。またIL−２は未成
熟胸腺リンパ球（３）、Ｂリンパ球（Ｂ細胞）（４）、
マクロファージ（５）、ナチュラルキラー細胞（NK細
胞）（６）、及びリンホカイン活性化キラー細胞（LAK
細胞）（７）などの免疫系の他の細胞にも作用するよう
である。これらのIL−２の多機能性は適応性免疫治療
（８）などの免疫治療法の確立の可能性を切り開いた。
最近、IL−２はオリゴデシドロサイト（９）などの神経
細胞にも作用することが示され、このことは中枢神経系
におけるサイトカインの関与の可能性も示唆している。
基礎及び臨床免疫学におけるIL−２系の勢力的研究にも
かかわらずIL−２が仲介するシグナルトランスダクショ
ン（10）を支配する分子的メカニズムに関する情報には
制限がある。

IL−２レセプター（IL−2R）はIL−２に対する結合能
に関し、高、中、低アフィニティー型で各々解離定数
（Kd）が10^-11M、10^-9M及び10^-8Mの三つの型で存在する
という意味で独特な存在であることが知られている（1
1,12）。IL−2Rα鎖（T_ac抗原、p55）（13）の特性化に
より、α鎖は低アフィニティ型のみを構成し、リンパ球
の他の特異的膜成分と会合しない限り、IL−２取込み及
びシグナルトランスダクションにはそのまま機能するこ
とはないことが明らかになった（14,15）。つづいて、
このリンパ球膜成分はβ鎖（又はp70−75）と命名され
る新しいレセプター鎖であることが同定された（12,16,
17）。事実、実験的にIL−2Rβ鎖それ自体は、中アフィ
ニティー型を構成することが示された（12）。さらに、
IL−2Rα鎖との会合はそのレセプターの高アフィニティ
型を与える（12,16,17）。野生型及び突然変異IL−2Rα
鎖cDNAを用いた発現実験は、IL−2Rα鎖ではなくIL−2R
β鎖が細胞内シグナルインダクション経路を推進するド
メインを有していることを強く示している（18）。それ
ゆえ、その構造及び機能を解明するのに十分な量のIL−
2Rβ鎖を得る必要があり、このことは高アフィニティー
IL−2Rの分子的基礎同様、IL−２応答性細胞において機
能するシグナルトランスダクションのメカニズムに関す
る洞察を得る基本的ステップである。最後に、IL−2Rβ
鎖又はその一部分をコードするcDNAを以下に示す。適当
なベクターへの該cDNAの挿入及び適当な宿主におけるそ
の発現はそのIL−2Rβ鎖又はその一部分による組換え的
及び大規模なタンパク質の生産を可能とする。

〔発明の内容〕

それゆえ、本発明の１つの特徴に従がい、IL−2Rβ鎖
又はその一部分をコードする組換えcDNAが提供される。

本発明のcDNAは以下の式で表わされ、これはヒトIL−
2Rβ、又はその変異体又はその一部分をコードしてい
る； 本発明の別のcDNAは、例えば以下の式で表わされ、こ
れは、マウスのIL−2Rβ、又はその変異体又はその一部
分をコードしている； 本発明において特に興味あるDNAには、IL−2Rβの一
部分、例えばその細胞外部分、又はその細胞内部分など
をコードするものが含まれる。

IL−2Rβの細胞外部分を含む可能性部分をコードする
DNAは特に興味深い。

また、本発明は先に述べたcDNAの一部分、例えば、hI
L−2Rβ鎖の完全配列の一部分、例えば、アミノ酸（a,
a）（第1B図参照）１番又はその付近例えば1,2,3,4,5,
6,7,8,9,10で始まり、アミノ酸214番又はその付近、例
えば200,201,202,203,204,205,206,207,208,209,210,21
1,212,213,214,215,216,217,218,219,220で終わる細胞
外部分、又は、本細胞外部分又はその変異体の一部分、
及び該レセプター鎖の細胞内部分に対応する部分、例え
ばアミノ酸239番又はその付近、例えば、アミノ酸230,2
31,232,233,234,235,236,237,238,239,240,241,242で始
まり、アミノ酸525番又はその付近、例えば516,517,51
8,519,520,521,522,523,524及び525で終わる部分、又は
その一部分又はその変異体、及び同様に、マウスIL−2R
β鎖の完全配列の一部分（第８図参照）、例えばアミノ
酸１番又はその付近、例えば、1,2,3,4,5,6,7,8,9,10番
で始まり、アミノ酸210番又はその付近、例えば200,20
1,202,203,204,205,206,207,208,209,210,211,212,213,
214,215,216,217,218,219,220で終わる細胞外部分又は
該細胞外部分、又はその変異体の一部分、及び該レセプ
ター鎖の細胞内部分に対応する部分、例えばアミノ酸23
5番又はその付近、例えば225,226,227,228,229,230,23
1,232,233,234,235,236,237,238,239,240,241,242で始
まり、アミノ酸513番又はその付近、例えば、505,506,5
07,508,509,510,511,512,513で終わる部分又はその一部
分又はその変異体をコードするcDNAを含む。

ここで述べている特定のIL−2Rβ鎖又はその一部分に
関し、個人個人で起こる自然対立遺伝子変異が存在する
ことは理解されよう。これらの変異は全配列における１
個以上のアミノ酸の変化、又はその配列における１個以
上のアミノ酸の欠失、置換、挿入、転換又は付加で示さ
れる。さらに、ここで述べるIL−2Rβ鎖又はその一部分
は、これらの基本的特性を変化させることなく１個以上
のアミノ酸の置換、欠失又は付加を起こすために遺伝子
工学技術、例えば点突然変異などにより修正し得ること
も理解されよう。従って本発明はここで述べたDNA配列
とハイブリダイズし得、かつ実質的にIL−2Rβ鎖又はそ
の一部分、特に可溶性IL−2Rβの特性を有するタンパク
質をコードするDNA配列も含む。

さらに本発明の別の特徴により、ヒトIL−2Rβ（hIL
−2Rβ）の水溶性部分、例えば全hIL−2Rβのアミノ酸
約１番から約210番までを含むアミノ酸配列をコードす
る組換えDNA分子が提供される。このようなDNA分子は、
例えば本来のIL−2Rβ鎖のアミノ酸１番から210番に対
応する212個のアミノ酸残基を有する可溶性ヒトインタ
ーロイキン２レセプターβ鎖誘導体をコードしている。

例えば以下に述べる１つの態様において、可溶性hIL
−2Rβ誘導体をコードするcDNA分子の末端ヌクレオチド
配列は以下のようである。

組換えDNA技術の標準的手法を用い、適当な宿主細胞
をトランスホームするベクターとして先に示したIL−2R
β又はその望ましい部分又はその変異体の構造遺伝子に
対応するcDNA配列を含むベクターを構築し得る。

適当なベクターとしては例えばプラスミドベクターが
あり、かつこれにはIL−2Rβ鎖又はその一部分をコード
するcDNA配列に機能的に結合する制御及び調節配列が含
まれている。

適当な手法はよく知られており、かつ広く実践されて
いる。他のタンパク質に関して、ヨーロッパ特許出願、
出願番号第0254249号及び第0170204号に例が述べられて
いる。

培養物から純粋な形で目的タンパク質を得るために標
準的手法を使用し、これらのタンパク質はモノクローナ
ル抗体を調製するための適当な抗原を提供する。IL−2R
β鎖又はその望ましい部分に特異的アフィニティを有す
るモノクローナル抗体を分泌し得るハイブリドーマは、
非ヒト動物の組換えIL−2Rβ又はその一部分による免疫
化、非免疫グロブリン分泌ミエローマ細胞を含む脾細胞
の収穫及び該ハイブリドーマからの望ましい結合特異性
を有するモノクローナル抗体を生産する細胞系列の選択
及び望ましい場合の該ハイブリドーマのひきつづくサブ
クローニングにより調製する。

ハイブリドーマの調製法及びそれから純粋な形でのモ
ノクローナル抗体の入手技術はよく知られており、ヨー
ロッパ特許出願、出願番号第0168745号に例が述べられ
ている。

本発明に従がう抗体は例えば診断及び免疫抑制や活性
化による治療に有用である。先に述べたように、このよ
うな抗体は本発明の精製した組換えタンパク質を用いる
か、又は本発明のcDNAをトランスフェクションし、多量
のレセプターを発現する細胞を入手し、これらの細胞を
用いて抗体を得ることにより作ることができる。

先に述べたように、本発明は、IL−2Rβ鎖及び可溶性
IL−２レセプターの可溶型に関している。可溶型には先
に述べたIL−2Rβの細胞外部分又はその一部分をコード
する部分的なcDNA配列によりコードされるものを含んで
いる。望ましい場合には、IL−2Rβ及びα鎖の両方を同
時に生産し得る。

IL−２β鎖の特異的部分に対するモノクローナル抗体
を使用するとレセプター鎖のエピトープを同定でき、従
って適当なモノクローナル抗体又は他のペプチド又はペ
プチド様又はタンパク質アナログ物質を用いたレセプタ
ーの活性の制御への道が開かれる。

（ヒトIL−2Rβ鎖をコードするcDNAクローンの単離及び
解析） cDNAクローンの単離においては、両方ともヒト白血病
細胞系列YT（20）上に存在するIL−2Rβに対して生産さ
れたモノクローナル抗体Mik−β１及びMik−β２（19）
を用いた発現クローニンイグ法を適用した。

モノクローナル抗体Mik−β１及びMik−β２は両方と
も日本の工業技術院と発酵研究所（Fermentation Resea
rch Institute,Agency of Indnstrial Science and Tec
hnology）に保管されている。Mik−β１及びMik−β２
の登録番号は各々10453及び10454（1988）である。また
それらは日本特許出願番号第298742号（1988）に述べら
れている。

いくつかのcDNAライブラリーを標準操作によりYT細胞
由来のポリ（Ａ）⁻−RNAを用いて調製した。cDNAライ
ブラリーは以下に述べられているランダムプライマー
（アマーシャム製）又はオリゴ（dT）プライマーを用い
た以外、報告されている操作により、cDM8ベクターを用
いて調製した。5.6×10⁶個の独立したコロニーを示すプ
ラスミドDNAが標準的手法で調製された。１ミリグラム
のDNAを第１回目のDNAトランスフェクションに用いた。
実際にはこのDNAを100本のチューブに分け（従って各チ
ューブは10μｇのDNAを含む）、それらを各々組織培養
皿（コーニング製、60mmポリスチレン皿）中の3.5×10⁵
個のモンキーCOS細胞にトランスフェクションした。ト
ランスフェクションは標準的なDEAEデキストラン法を用
いて行った。その後、トランスフェクトした細胞をMik
−β１及びβ２抗体（各抗体について400倍希釈した腹
水）の混合物で処理し、標準的パニング操作を行った。
パニングに用いたディッシュは先に述べた抗マウスIgG
でコートしたファルコン（FALCON）の60mmディッシュで
ある（参考文献21）。この第１回目のパニングにおいて
は100個IgGコートディッシュを用いた。パニング後、ハ
ート（Hirt）抽出物は標準法を用いて調製し（参考文献
21）、回収したプラスミドを参考文献21で述べている方
法を用いて大腸菌中に導入した。この操作により3.7×1
0⁶個のコロニーが得られた。これらの細菌コロニーを標
準的プロトプラスト融合操作を用い（参考文献21）、CO
Sと融合させた。これらの融合実験では各々５×10⁵個の
COS細胞を含む26枚のコーニングディッシュを用いた。
融合後、このCOS細胞について先に述べたパニングを行
ない、ついでハート抽出物を調製した。そのハート抽出
物から32,000個の細菌コロニーが得られた。この融合・
パニング操作を再度繰り返し、このハート抽出物から32
000個の細菌コロニーを得た。同様の操作を再度繰り返
し、28000個の細菌コロニーを得た（その間、目的クロ
ーンの劇的増加があるはずである）。同様の操作を再度
繰り返し、6000個のコロニーを得た。これらのコロニー
から30個のコロニーをランダムにピックアップし、その
cDNA挿入物を分析した。これらの中のわずか７個のコロ
ニーが制限酵素Xho IでcDNA挿入物を切り出すことがで
きるプラスミドを含んでいた。ベクター由来のXho I部
位はcDNAの両側に位置し、かつその他の全てのプラスミ
ドはDNA再配列によりそれらの切断部位を失っていた。
事実それらの全ては本来のベクターに比べサイズがたい
へん小さくなっていた。従って、それらは非特異的産物
であると考えた。一方それら７個のコロニー全ては従来
の制限酵素切断分析及びDNAブロット法による同じmRNA
に由来することが確認された。それらのうちのpIL−2R
β30と命名された１個のプラスミドは、互いに同一であ
ることが分った他の６個のプラスミド（pIL−2Rβ９と
命名されている）よりも長いcDNAを含んでいた。

それゆえ、この操作において我々は２個の独立するcD
NAクローン、pIL−2Rβ９及びpIL−2Rβ30を単離した。
すなわち、各々の発現産物はその抗体と特異的に反応す
る。その２個のクローンは各々1.3kb及び2.3kbのcDNA挿
入物を含んでおり、かつ互いにクロスハイブリダイズす
る。ひきつづくcDNAの配列分析では、それらが同じmRNA
を示していることが明らかになった。事実、RNAブロッ
ティング分析は、そのmRNAの大きさがおよそ4kbである
ことを示した（以下参照）。つづいて、我々はプローブ
としてクローン化cDNAを用いて別のYTcDNAライブラリー
をスクリーニングし、IL−2Rβ鎖の全mRNAを共にカバー
するいくつかの独立したcDNAクローンを単離した。この
ようにして、そのプローブ中のpIL−2Rβ9cDNA挿入物を
用いてこのcDNAライブラリーをスクリーニングすること
によりpIL−2Rβ６及びpIL−2Rβ19を得た。

ヒトIL−2Rβ配列をコードするcDNAを含む上述のプラ
スミドは、以下の受理番号で1989年３月２日、発酵研究
所（Fermentation Research Institute）にブダペスト
協定に従がい大腸菌MC1061/P3株中という形で保管され
た。

プラスミド 受入番号 pIL−2Rβ６ FERM BP−2312 pIL−2Rβ９ FERM BP−2313 pIL−2Rβ19 FERM BP−2314 pIL−2Rβ30 FERM BP−2315 クローン化した４個のcDNAの完全なヌクレオチド配列
は決定された（第１図）。

第１図はヒトIL−2Rβ鎖cDNAの構造を示している。第
1a図はクローン化したcDNAに由来するmRNAを図で示した
ものである。点付、斜線、白及び黒の長方形は各々mRNA
のシグナル配列、細胞外、膜内及び細胞質内の領域を表
わしている。第1b図はヒトIL−2Rβ鎖cDNAのヌクレオチ
ド及びアミノ酸の配列を示している。この配列は上述の
cDNAクローンの完全なDNA配列分析から誘導したもので
ある。ヌクレオチドは右余白に番号付けし、アミノ酸は
左余白に番号付けした。クローンpIL−2Rβ19及びpIL−
2Rβ６は各々ヌクレオチド残基425及び1531番にＧ−Ａ
突然変異を含んでいた。従って、pIL−2Rβ6cDNAは細胞
質領域にTAGトリプレットを有している。その他の全て
のクローン、pIL−2Rβ30、pIL−2Rβ19及びpIL−2Rβ1
6はその部位にTGGトリプレットを有していることから、
これは逆転写時の誤まりに由来するものと考える。最初
の下線部の26個のアミノ酸残基はコンセンサス配列から
推定されるシグナル配列を表わしている（22）。25個の
膜内アミノ酸残基を太い下線で印されている。システイ
ン残基は箱で囲んである。潜在的なＮ−グリコシル化部
位は二重下線で示した。推定されるポリアデニル化部位
は白ぬきの長方形で示した。まとめると、RNAはNY様ヒ
トリンパ球細胞系列YTから調製し、またcDNAは、ランダ
ムプライマー（アマーシャム製）（pIL−2Rβ6,9及び3
0）又はオリゴ（dT）プライマー（pIL−2Rβ19）を用い
ること以外報告されている操作（21）に従がいcDM8ベク
ターを用いて調製した。抗IL−2Rβモノクローナル抗体
Mik−β１及びMik−β２の混合物によるcDNAライブラリ
ーのスクリーニングは先に示された方法（21）に従って
行った。ヌクレオチド配列はダイデオキシチェーンター
ミネーション法及び化学的分解法を組合せて決定した。

第１図に示されているように、cDNAは551個のアミノ
酸を含むタンパク質をコードする大きいオープンリーデ
ィングフレームを含んでいる。タンパク質配列データベ
ース（ナショナルバイオメディカルリサーチファンデー
ション，ワシントン,D,C,）又は最近報告された配列中
の他の既知タンパク質との間に有意なホモロジーは見ら
れなかった。他の多くのサイトカインレセプターと異な
り、IL−2Rα及びIL−2Rβ鎖は免疫グロブリンスーパー
ファミリーに属していないようだ。このタンパク質から
誘導される構造から、Ｎ末端の26個のアミノ酸はシグナ
ル配列を示していると考える。従ってIL−2Rβ鎖の成熟
型はM,W,58,358と計算される525個のアミノ酸を含んで
いる。第１図に示されるように、このレセプター分子は
214個のアミノ酸を含む細胞外領域を有している。この
領域は８個のシステイン残基を含み、その中の５残基は
Ｎ末端側半分の中に存在し、かつそれらは９〜12個のア
ミノ酸により周期的に分断されている。システイン残基
間のジスルフィド結合はリガンド結合に適した安定な構
造を与えているようである。事実、システイン残基が豊
富に存在することは多くのレセプターのリガンド結合ド
メインの共通した特徴の１つであるように思える（2
3）。IL−2Rβ鎖の細胞外領域内に存在するアミノ酸
（a,a）の推定数（214 a,a,）はIL−2Rα鎖中の数（219
a,a,）とほぼ等しいことは注目に値する。このような
サイズの類似性は本レセプターに独特なヘテロ二量体レ
セプター複合体の構造を考える上で重要である。という
のはα及びβ鎖は独立に同じIL−２分子の異なる部位と
相互作用を起こすからである。

215から239番までの範囲の25個のアミノ酸からなる疎
水領域は本レセプターの膜内領域を構成しているようで
ある（第１図及び第２図）。

第２図は推定されるヒトIL−2Rα及びIL−2Rβ鎖前駆
体構造のハイドロパシープロット分析である。この分析
はカイト（Kyte）及びドゥーリトル（Doolittle）の方
法（38）に従って行った。SG及びTMは各々シグナル配列
及び膜内配列を表わしている。

β鎖の細胞質領域は286個のアミノ酸からなり、わず
か13a,a長のα鎖よりもはるかに大きい。チロシンキナ
ーゼのコンセンサス配列（Gly−Ｘ−Gly−Ｘ−Ｘ−Gl
y）（25）はこのβ鎖には存在しない。しかしトリプレ
ットAla−Pro−Gluの存在（293〜295）は注目される。
すなわちこれはいくつかのタンパク質キナーゼの触媒ド
メインのコンセンサスモチーフであると考えられてきた
（25）。このβ鎖の細胞質領域がタンパク質キナーゼ活
性を持つという可能性は未にテトスされていない。この
領域の一次構造は別の興味ある特徴も明らかにした。つ
まり特定のアミノ酸に関する強い選択性である。この領
域にはプロリン（42/286）及びセリン（30/286）が豊富
である。おもしろいことにこの“プロリンリッチ”構造
はＴ細胞の活性化経路に関するＴ細胞膜抗原CD2の細胞
質領域中にも存在することが示されている（26）。この
プロリンリッチ構造はレセプター分子と他のシグナルイ
ンジューサーとが結合するのに重要であるこの領域に非
球状構造を与える。多数のセリン残基はリン酸化の主要
な標的であり、このことがレセプター機能を調節してい
る（27）。さらにこの細胞質領域は主として負電荷アミ
ノ酸に富んでいる。事実、この領域はそのようなアミノ
酸（すなわちグルタミン酸及びアスパラギン酸）を40個
含んでおり、一方、正電荷残基（すなわちリジン及びア
ルギニン）はわずか18個しか含んでいない。このような
選択性は細胞質の中間領域（a,a,345−390）に特に顕著
である。従って、β鎖の細胞質領域は極めて酸性であ
る。全部でないにしろこれら独特の特性のいくつかを合
せると下流のシグナルインダクション経路をさらに進め
る役割を担い得るのかもしれない。レセプタータンパク
質は潜在的Ｎ−グリコシル化部位を５個含んでいる（第
1B図）。そのうちの４個は細胞外領域に存在する。この
ような翻訳後の修飾が実験上の成熟タンパク質分子（70
−75KD）と計算上のタンパク質分子（58KD）の分子量の
差を説明している。α及びβ鎖のハイドロパシープロッ
ト分析は両鎖中の細胞膜に隣接する疎水領域の存在を明
確にした（第２図）。これらの領域は両鎖間の非共有結
合的分子内会合に１役を担っている。

（ヒトIL−2Rβ鎖mRNAの発現） プローブとしてpIL−2Rβ30に由来するcDNA挿入物を
用いてIL−2RβmRNAの発現を試験した。

第3a図は種々の細胞におけるヒトIL−2Rβ鎖mRNAの発
現を説明している。以下の細胞源由来のポリ（Ａ）⁺RNA
（レーン当り２μｇ）を調製し、標準操作に従がいプロ
ーブとしてpIL−2Rβ30由来のヒトIL−2Rβ鎖cDNAのXho
I消化断片を用いてRNAブロッティング分析を行った（1
4,18,27）。レーン1,YT;レーン2,Hut102（HTLV−１でト
ランスホームしたヒトＴ細胞系列）；レーン3,MT−２
（HTLV−１でトランスホームしたヒトＴ細胞系列）；レ
ーン4,ARH−77（多重ミエローマ系列）；レーン5,SKW6.
4（EBVでトランスホームしたヒトＢリンパ芽球細胞系
列）；レーン6,U937（組織球白血病細胞系列）；レーン
7,MT−１（HTLV−１でトランスホームしたヒトＴ細胞系
列）；レーン8,ジャーカット（Jurkat）（ヒトＴ白血病
細胞系列）；レーン9,HeLa（ヒト子宮がん細胞系列）。

第3a図で示されているように、RNAブロット分析は4kb
mRNAの存在を明らかにし、かつその発現は先にIL−2Rβ
鎖を有することが同定されているリンパ球（すなわちY
T,MT−2,Hut102,SKW6.4）に限られていた（12,16,1
7）。一方、このmRNAの発現はJurkat,MT−1,U937,ARH−
77及びHeLa Cellなどの細胞では検出されなかった。基
本的にmRNA発現レベルはIL−2Rβ鎖発現レベルと相関関
係がある。

第3b図はヒトPBLにおけるIL−2Rβ及びIL−2RαmRNA
の発現を示している。全RNA（レーン当り15μｇ）を各
レーンにロードした。レーン１及び４は非感作ヒト末端
血液リンパ球（PBL）を示している；レーン２及び5,5μ
g/mフィトヘマグルチニン（PHA）で24時間感作したPB
L;レーン３及び6,5μg/mPHAで72時間感作したPBL。RN
AブロットフィルターをIL−2Rβプローブでハイブリダ
イズした（レーン１−３）。IL−2Rβプローブのデハイ
ブリダイゼーション後同フィルターをIL−2Rαプローブ
（pSVIL2R−３由来のXba I−BCl I断片）でハイブリダ
イズした（14）（レーン４−６）。

興味あることに、IL−2RβmRNAは非感作PBLで検出さ
れ、その発現レベルはマイトゲン感作後わずか25倍まで
徐々に増加した。フローサイトメトリー分析のデータ
（19）に基づき、mRNA誘導パターンはリンパ球集団の種
類により異なるようだ。この発現パターンはその発現が
細胞のマイトゲン感作を厳格に要求するIL−2Rα鎖の発
現とは全く異なり（第3b図）、このことは両遺伝子間の
遺伝子発現の相違なるメカニズムの存在を指差してい
る。

PBL及びHTLV−１でトランスホームしたヒトＴ細胞系
列を含む種々の細胞系列に由来するゲノムDNAのサウザ
ンブロット分析はこの遺伝子が単一コピーとして存在
し、かつこれらの細胞中で転位していないことを示して
いる。

（cDNAにコードされているIL−2Rβ鎖のIL−２結合性） 次に我々はcDNA産物がIL−２と結合し、かつ実際に先
の研究で証明され、及び、又は指差されているIL−2Rβ
鎖の性質を有しているかどうかを試すため一連のcDNA発
現実験を行った。全コード領域を含むcDNAの発現がマウ
スlck遺伝子（29）プロモーター（pLCKRβ）又はモロニ
ー白血病ウイルスLTR（30）（pMLVRβ）により進行する
２個の発現プラスミドを構築した。

発現ベクターは次に示す手順に従って構築した。pIL
−2Rβ30をHind IIIで消化し（その切断部位はcDM8のポ
リリンカー領域内に存在する）、両端を充填した後BamH
Iリンカーを結合し再びライゲーションした。このプラ
スミドをさらにBamH Iで消化しβ鎖の全コード配列を含
む1.8kbのDNA断片をマウスlckプロモーターを含むp1013
ベクターのBamH I消化物に導入してpLCKRβを構築し
た。またBamH Iで消化したcDNA断片をレトロウイルスベ
クターpZipSV（λ）（30）に導入しpMLVRβを構築し
た。ヒトIL−2Rα発現ベクターpSVIL2RneoはEco−gypt
遺伝子をneo耐性遺伝子と置換えることによりpSVIL2R−
３（14）から構築した。

ヒトIL−２を結合する表面分子を欠くことが知られて
いるマウスＴリンパ腫細胞EL−２及びヒトＴ細胞白血病
ジャーカット系列にプラスミドpLCKRβを導入した。

ジャーカット及びEL−４細胞への発現プラスミドのト
ランスフェクションは先に報告されているエレクトロポ
レーションにより行った（39）。トランスフェクトした
細胞は10％ウシ胎児血清（FCS）及びG418（EL−４に対
しては1mg/m、ジャーカットに対しては1.5mg/m）を
含むRPMIR例えば1640培地中で選択した。ヒトIL−2Rα
及びIL−2Rβ鎖のcDNAを同時に発現する細胞を得るため
pSVIL2Rneoでトランスフェクトしたジャーカット由来ク
ローンＪα−５をpLCKRβ及びヒグロマイシン耐性遺伝
子pHgyを含むプラスミドでコトランスフェクトした。こ
のトランスフェクトした細胞は200μg/mヒグロマイシ
ンで選択した。これら２つの細胞へのpMLVRβのトラン
スフェクションは先に報告されているリン酸カルシウム
法（14）で行ない、その細胞の選択は700μg/m G418
で行った。フローサイトメトリー分析のため５×10⁵個
の細胞を４℃、30分間抗体（腹水1:500希釈物）で処理
した。洗浄後この細胞をフルオレセイン結合ヤギ抗マウ
スIgGで染色した。

染色細胞はFACS 440フローサイトメーター（ベックマ
ンディッキッンソン製）で分析した。¹²⁵I−IL−２結合
検定及びスキャッチャードプロット分析は先に報告され
ている方法で行った（12）。

第4a図はヒトIL−2Rα及び、又はIL−2RβcDNAトラン
スフェクタントの細胞表面染色パターンによりヒトIL−
2Rα及び、又はIL−2Rβ鎖cDNAの発現を示している。親
細胞及び種々のトランスフェクタント細胞を別々にモノ
クローナル抗体ヒトIL−2Rα抗体、抗T_ac 又はモノクローナル抗ヒトIL−2Rβ抗体、Mik−β１ で染色した。点線 はフルオレセイン結合ヤキ抗マウスIgGのみで染色した
細胞の蛍光プロフィールである。使用した細胞は（１）
EJβ−13（及びpLCKRβでトランスフェクトしたEL−４
由来クローン）、（２）Ｊβ−８（pLCKRβでトランス
フェクトしたジャーカット由来クローン）、（３）Ｊα
−５（pSVIL2Rneoでトランスフェクトしたジャーカット
由来クローン）、（４）Ｊα−２（pLCKRβでトランス
フェクトしたＪα−５由来クローン）、（５）Ｊαβ−
10（pLCKRβでトランスフェクトしたＪα−５由来クロ
ーン）、及び（６）Ｆβ−３（pMLVRβでトランスフェ
クトしたNIH3T3由来細胞系列）である。

cDNA産物を発現する安定なトランスホーマントクロー
ンはFACS分析により判断されるようにEL−４（ELβ−1
3）及びジャーカット（Ｊβ−８）に関して得られた
（第4a図）。さらに我々はトランスフェクトしたヒトIL
−2Rα鎖cDNAを発現するジャーカットトランスホーマン
トクローンＪα−５に同遺伝子を導入した。生成した２
つのトランスホーマントＪαβ−２及びＪαβ−10はα
及びβ鎖を両方発現することが分った（第4a図（４），
（５））。期待されるように、これらトランスホーマン
トで発現されるmRNAのRNAブロッティング分析はα及び
β鎖特異的mRNAは内在性遺伝子由来ではなくトランスフ
ェクトしたcDNAに由来することが明らかになった（2
6）。さらに非リンパ球におけるcDNA産物の正当性を試
すためプラスミドpMLVRβをNIH3T3細胞由来細胞系列２
（30）に導入し、cDNAを発現するトランスホーマントＦ
β−３が得られた（第4a図（５））。

IL−２結合実験は¹²⁵Iラベル化組換えヒトIL−２を用
いて行った。

第4b図はクローン化したcDNAを発現するトランスフェ
クタントへの¹²⁵I−IL−２結合のスキャッチャードプロ
ット分析によるα及びβ鎖の発現を示している。Mik−
β１の1:100の希釈腹水の非存在下 又は存在下 のIL−２結合データのスキャッチャードプロット。ELβ
−13又はＪβ−８への¹²⁵I−IL−２の結合はMik−β１
により完全に阻害された。親細胞ジャーカット又はEL−
４を試験した時、特異的IL−２結合は観測されなかっ
た。細胞当りのIL−２結合部位数及びレセプターアフィ
ニティーはIL−２結合データのコンピュータ分析により
決定した。（１）ELβ−13、（２）Ｊβ−８、（３）Ｊ
α−５、（４）Ｊαβ−２、（５）Ｊαβ−10。

EL−４由来クローン（ELβ−13）及びジャーカット由
来クローン（Ｊβ−８）に見られるように、β鎖cDNAを
発現する両クローンは各々Kbの見積値4.0nM及び2.7nMと
いうIL−２に対する中程度のアフィニティーを示した。
これらの細胞に対するIL−２結合はMik−β１抗体によ
り完全に阻害された（第4b図（１），（２））。IL−2R
α及びIL−2RβcDNA両方を発現するジャーカット由来Ｊ
αβ−２及びＪαβ−10クローンは各々のKb見積値Ｊα
β−２については22pM及び15nM及びＪαβ−10について
19pM及び33nMの高アフィニティー及び低アフィニティー
両レセプターを示した。一方、α鎖cDNAのみを発現する
ジャーカット由来Ｊα−５親細胞はIL−２に対する低ア
フィニティーのみ（Kd:19.5nM）を示した（第4b図
（３））。高アフィニティーIL−2R発現Ｊαβ−２細胞
及びＪαβ−10細胞の数は発現したIL−2Rβ分子数と同
程度であった。さらにこれらの細胞のMik−β１抗体に
よる処理は細胞表面の高アフィニティIL−２結合部位を
完全に妨害する一方低アフィニティIL−2Rの発現を残存
させた（第4b図（４）、（５））。これらの観察はcDNA
にコードされるIL−2Rβ分子がIL−2Rα鎖と会合する高
アフィニティレセプター複合体の形成に直接関与するこ
とを明白に示している。先に述べたＴ細胞トランスホー
マントとは対照的に、Ｆβ−３細胞は同結合条件下細胞
表面におけるIL−２結合を示さなかった。興味深いこと
に同じような結果がβ鎖は発現するがIL−２は結合しな
いモンキーCOS細胞でも観察された（28）。従ってこの
結果は機能的IL−2Rβ鎖発現に対する細胞型特異的プロ
セシングメカニズム又は別の細胞成分又はその両方の関
与を示唆している。

さらに再構成したIL−2Rの分子構造の特性化を行うた
め我々は¹²⁵I−IL−２及び非切断化学的架橋剤、ジスク
シニミジルスベレート（DSS）を用いた化学的架橋実験
を行った。

第５図はIL−2Rポジティブトランスホーマントのアフ
ィニティー架橋実験の結果を示している。250倍モル過
剰量の未ラベルIL−２（レーン５−７）、500倍モル過
剰量のアフィニティカラム精製Mik−β１（レーン８−1
0）又は500倍モル過剰量のアフィニティカラム抗T
_ac（レーン11−13）の存在下又は非存在下（レーン１〜
４、14〜16）、5nM（レーン１〜13）又は100pM（レーン
14−16）の¹²⁵I−IL−２と細胞とインキュベートした。
その後先に報告されているように（16）ジスクシニミジ
ルスベレート（DSS）を用いて細胞を化学的に架橋し
た。その細胞を可溶化し、その上清を7.5％SDS−PAGEで
分析した。細胞は：ジャーカット（レーン１）;Jα−５
（レーン2,5,8,11,14）;Jβ−８（レーン3,6,9,12,1
5）;Jαβ−10（レーン4,7,10,13,16）を用いた。マー
カー（Ｍ）としては¹²⁵I−IL−２と架橋したYT細胞を用
いた。

¹²⁵I−ラベル化IL−２と架橋し、SDS−PAGE分析を行
ったIL−2Rβのみを発現する細胞に見られるように、90
KDメジャーバンド及び85KDマイナーバンドから成るダブ
レットバンドが検出され、その移動度プロフィールはYT
細胞とのものとは区別し得るものであった（第５図矢印
及び参考文献16,17参照）。このダブレットの出現は過
剰の未ラベルIL−２又はMik−β１により阻害された。
このダブレットの形成はレセプター−IL−２複合体の分
解に由来するものかもしれない。またこの両タンパク質
産物は個々の翻訳後修飾に由来する可能性もある。もし
くはこのダブレットの１つはレセプター複合体の第３の
成分を示しているのかもしれない。また150KD領域に泳
動するブロードバンドがトランスフェクタントＪαβ−
10及びYT細胞に検出された。このバンドの出現も未ラベ
ル化IL2又はMik−β１により阻害される。それはIL−
２、IL−2Rα及びIL−2Rβ分子の三者複合体を表わして
いる。第４図に示されている一連の化学的架橋実験にお
いてＪαβ−２の表面に発現されるレセプター複合体の
物理化学的性質は培養したＴ細胞又はPBL上に発現され
る高アフィニティレセプターの性質と区別し得るもので
あることが示された（12,16,17）。

非リンパ球におけるα及びβ鎖の発現が高アフィニテ
ィーレセプターを生成させるかどうかを決定するための
予備実験の結果は、α及びβ鎖cDNAがCOS細胞中で一時
的に共に発現される時同様に発現されたα鎖のみでは架
橋し得ない濃度（400nM）の¹²⁵I−IL−２と両鎖が架橋
し得ることを示している（28）。この結果は本非リンパ
細胞系列におけるαβヘテロ二量体レセプターの形成を
示唆している。

（再構成レセプターによるIL−２の取込み） 中及び高アフィニティIL−２レセプターはいずれもIL
−２を取込むことが報告されている（33−35）。リガン
ドの取込みは通常IL−２シグナルトランスダクションを
伴なう。このことはこの過程が不可欠であることを示し
ている。

第６図は再構成レセプターを介するIL−２取込みを示
している。IL−２取込みは先に報告されている方法（3
3）に従って試験した。簡単に言うと細胞（５×10⁷）を
０℃で30分間、最終濃度200pM（Ｊαβ−10）又は5nM
（Ｊα−5,Jβ−８及びELβ−13）の¹²⁵I−IL−２で処
理した。洗浄後、細胞を予熱した培養培地（37℃）に懸
濁し、ついでIL−２の取込みの速度論を先に報告されて
いる方法（33）で試験した。（ａ）ELβ−13、（ｂ）Ｊ
β−８、（ｃ）Ｊαβ−10、（ｄ）Ｊα−５。

取込まれたIL−2; 細胞表面に結合したIL−2; 遊離IL−２。

第６図に示されているように、我々は再構成したレセ
プターがIL−２を取込み得るかどうか試験した。事実、
IL−2Rβ鎖のみ、又はα及びβ両鎖を発現する細胞は天
然のレセプターについて報告されているものと同じ速度
論に従がいIL−２を取込み得る。一方、IL−2Rαのみを
発現するジャーカット細胞は先に報告されている観察と
同じく（33、34）IL−２を取込まなかった。予備実験で
は中又は高アフィニティレセプターを発現する細胞の増
殖はIL−２により選択的に阻害されることが示された
（14、36）。また我々は他の宿主細胞系列で発現される
β鎖はIL−２に応答してその細胞増殖を促進するという
予備的実験結果を得た（28）。

（マウスIL−2Rレセプターβ鎖のクローニング） マウスIL−２レセプターβ鎖に対する特異的抗体の存
在は知られていない。したがってヒトIL−2Rβ鎖のcDNA
単離に用いるスクリーニング法は使用されなかった。

cDNAライブラリーはコンカナバリンＡ感作マウス脾細
胞由来のポリ（A⁺）RNAを用いて調製した。このcDNAを
λgt10にクローン化し大腸菌で増殖した。

このライブラリーのスクリーニングはノンストリンジ
ェント条件下、プローブとして先に述べたヒトIL−2Rβ
鎖cDNAを用いて行った。陽性クローンからλMIL−2Rβ
−26と命名したクローンを選択した。このクローン中の
cDNA挿入物は全マウスIL−2Rβ鎖配列のうちのわずか54
0bpの配列しか含んでいなかった。それゆえこの配列はP
vu2を用いたλMIL−2Rβ−26の消化により単離し、標準
的手法によりマウス胸腺腫瘍細胞系列EL−４由来のポリ
（Ａ）^＋を用いて調製した別のcDNAライブラリーをスク
リーニングするのに使用し、かつcMDベクターのBstX I
部位にクローン化した後大腸菌にトランスフェクトされ
た。

このcDNAライブラリーのスクリーニングはヨーロッパ
特許出願第88119602.9号及びカシマ（Kashima）等（ネ
イチャー（Nature）、313、402−404（1985））の方法
に従がいハイストリンジェント条件下で行った。

陽性クローンの中からマウスIL−2Rβの構造遺伝子を
含む（第８図参照）クローンpMIL−2Rβ−36を選択し
た。このcDNAクローンの制限地図を第７図に示す。

プラスミドpMIL2Rβ−36にはブダペスト協定に基づき
1989年５月23日受理番号FERM BP−2435としてファーメ
ンテーションリサーチインスチチュートに大腸菌MC 106
1/P3株中に含まれる形で保管登録した。

（可溶性ヒトインターロイキン２レセプターβ鎖の調
製） 分泌型のhIL−2Rβ（以後可溶性β）はNIH 3T3繊維芽
細胞を本来のβ鎖の細胞質内ドメイン及び膜内ドメイン
の両方をコードする全DNA配列を欠く修正β鎖cDNA
（“アンカーマイナス"cDNA）でトランスフェクトする
ことにより生成した。

（可溶性β）をコードするアンカーマイナスcDNAを宿す
発現ベクター（BCMGNeo−Sol.β）の構築） β鎖cDNA（第1b図）を可溶性β生産用にアンカーマイ
ナス型に修正した。アンカーマイナスcDNAを含む発現ベ
クターを生成する方策を第９図に示す。まずCDM8ベクタ
ー中2.3Kbβ鎖cDNAを含むプラスミドpIL−2Rβ30をBssH
II及びSma I（全ての制限酵素はニューイングランドバ
イオラブ社製、ビバリー、MA、USA）で消化し、β鎖の
全コード配列（塩基121〜1773）を含む1.9Kb cDNA断片
（塩基58−1967）を得た。BssH II末端を充填後、1.9Kb
cDNAをｐブルースクリプト（pBluescript）SKベクター
（ストラタジーン社，サンディエゴ,CA,USA）のSma I制
限部位に挿入した。それからこのｐブルースクリプトSK
−β1.9プラスミドをSty I（制限部位、塩基825,934及
び1235）及びSma Iで消化して、ほとんどの細胞外領域
のほとんどを表す塩基121−840をそのまま残し全ての細
胞質内及び膜内領域を除いた。次に多重終止コドン（TA
G）及びNhe I認識配列を含む12塩基長の合成リンカー
（ニューイングランドバイオラブ社製，＃1060）をリン
酸化し、T4DNAリガーゼを用いてSty I/Sma I消化したプ
ラスミドDNAにライゲーションした。Nhe Iで消化して過
剰のリンカーを除いた後、このDNAをSKベクターにライ
ゲーションしてｐブルースクリプトSK−Sol.βを構築し
た。

このｐブルースクリプトSK−Sol.βをSal I及びNot I
で消化し（この制限部位はｐブルースクリプトSKベクタ
ーのポリリンカー領域内に存在する）、生成した可溶性
βを含む0.8KbのcDNA断片を単離した。このcDNA断片を
サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター及びネオマ
イシン耐性遺伝子を含むBCMGNeoベクター（カラスヤマ
（Karasuyama）等、ジャーナル・オブ・エクスペリメン
タル・メディシン（J.Exp.Med.），169,13−25（1989）
参照）のXho I/Not I消化物に導入し最終的発現プラス
ミドBCMGNeo−Sol.βを生成した。BCMGNeoは哺乳類細胞
中での染色体外複製を保証する仔ウシパピローマウイル
ス（BPV）配列の69％を含むシャトルベクターである。
本来のβ鎖及び可溶性βのヌクレオチド配列及び相当す
るアミノ酸配列を示す第10図に見られるように、可溶性
βcDNAは26個のアミノ酸からなるシグナルペプチドを伴
う212個のアミノ酸から成る成熟タンパク質をコード
し、一方本来のβ鎖cDNAはシグナルペプチド（26a,
a,）、細胞外（214a,a,）、膜内（25a,a,）及び細胞質
内（286a,a,）ドメインから成る膜タンパク質をコード
している。本来のβ鎖及び可溶性βのヌクレオチド配列
及び相当するアミノ酸配列を第10図に示す。

（BCMGNeo−Sol,βによるNIH3T3繊維芽細胞のトランス
フェクション及び可溶性βを分泌する安定なトランスホ
ーマントの確立） cDNAのトランスフェクションはカラスヤマ（Karasuya
ma）等（上述）により報告されたプロトプラスト融合技
術により行った。簡単に言うと、BCMGNeo−Sol,βを含
む細菌をプロトプラストに変換してマウス繊維芽細胞系
列NIH3T3とポリエチレングリコール2000（ワコーケミカ
ル社製、大阪、日本）を用いて融合した。それから10万
個のプロトプラスト融合NIH3T3細胞を４枚の24ウェルプ
レートに接種した。10％ウシ胎児血清（FCS）及び750μ
g/m G418（ジェネチシン、シグマ社、セントルイス、
MO州,USA）を含むRPMI 1640培地中での25日間培養の
後、104ウェルのうちの60ウェルでトランスホーマント
細胞の増殖が観察された。以下に述べるサンドイッチ酵
素結合免疫吸着検定法（ELISA）による測定で、60ウェ
ルのうちの18ウェルの培養上清が可溶性βに関して陽性
であることが分った。ELISA法で最も高い吸収を与えた
ウェルからの限定希釈物から５個のクローンを確認し、
それらが全て高レベルで可溶性βを分泌することが分っ
た（第１表）。一方、全長のβ鎖cDNAでトランスフェク
トしたNIH3T3細胞（3T3−β11と命名）はβ−鎖分子を
全く分泌しなかった。つづく実験では我々は高い量の可
溶性βを分泌するクローン3T3−Ｂ−14を使用した。

（ELISA法による可溶性βの検出） トランスフェクトした細胞の培養上清をサンドイッチ
酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）を用い、可溶性βの
存在についてスクリーニングした。この検定には２つの
モノクローナル抗体Mik−β１及び−β３（上述及びツ
ド（Tsudo）等、プロシーディング、イン・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc,Notl,Acad,Sc
i,）USA,86,1982−1986,1989））を用いた。これらはβ
鎖上の別個のエピトープを認識する。すなわち、Mik−
β１はIL−２結合部位を認識し、一方Mik−β３はIL−
２結合に関与しないエピトープを認識する。サンドイッ
チELISAを図的に示した第11図に見られるように、イム
ロン（Immulon）−Ｉマイクロプレート（ダイナテク
社，シャンチリー（Chamtilly,VA州,USA）をトリス緩衝
液（10mMトリス・塩酸,pH7.4,0.15M NaCl）中10μg/m
のMik−β３溶液50μを用いて一晩コーティングし
た。過剰の抗体を除去後未結合部位は１時間１％ウシ血
清アルブミンを含むTBSでインキュベートすることによ
りブロックした。0.05％トゥイーン20（Tween20）を含
むTBS（Ｔ−TBS）で洗浄後、トランスホーマントの培養
上清50μをウェルに入れ１時間インキュベートした。
洗浄後１μg/mのビオチン化Mik−β1 50μを第２抗
体として加え、プレート上の第１抗体Mik−β３に結合
する可溶性βを検出する。45分のインキュベーション及
び洗浄の後、50μのアルカリホスファターゼ結合アビ
ヂン（タゴ社，バーリンガム,CA州,USA）を加えた。45
分間のインキュベーション後、プレートを洗浄し、100
μのｐ−ニトロフェニルホスフェートを加え45分後に
各ウェルの405nmにおける吸光度を測定した。

（分泌された可溶性βの見かけ上の分子量） 可溶性βの分子サイズを決めるため、3T3−B4−14細
胞を³⁵S−メチオニンを用いて生合成的にラベルし、つ
いで可溶性βを培養上清に由来するMik−β1mAbにより
免疫沈殿化した。Mik−β１及び沈殿化のコントロール
としてのUPC10mAbを用いた種々の量の沈殿をSDSポリア
クリルアミドゲルにロードし電気泳動した。第12図に示
されているようにSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動
法（PAGE）で分析したとき、3T3−B4−14細胞の培養上
清中Mik−β１により見かけ上の分子量37000の単一のタ
ンパク質が同定された。一方コントロールUPC10mAbでは
これは観察されなかった。この分子サイズは全ての膜内
（25a,a,）及び細胞質内（286a,a,）領域を欠く端を切
断されたβ鎖について予想されるものとよく一致してい
た。

（可溶性βのIL−２結合能） その後β鎖がIL−２を結合し得るかどうか研究した。
最終的に“競合”サンドイッチELISA法を用いた。この
検定法においては培養上清中の可溶性βをIL−２結合に
関して非阻害的mAbであるMik−β3mAbにより固相に固定
した。その結果β鎖上の推定されるIL−２結合部位は占
有されないまま残されることになる。つぎにビオチン化
Mik−β１に対する競合者として一連のIL−２又は非ラ
ベルMik−β１の希釈物を加えた。第13図は競合的サン
ドイッチELISA法の結果を示している。この中で曲線 は非ラベルMik−β１の希釈物、 はIL−２の希釈物を示している。第13図に示されている
ように、非ラベルMik−β１は投与量に応じ吸光度が減
少した。このことはこのシステムの特異生を示してい
る。同様にIL−２は可溶性βへの結合に関しビオチン化
Mik−β１と投与量に応じ効果的に競合する。このこと
は可溶性βがIL−２と結合し得ることを示している。

この競合曲線はβ鎖のみを発現するYS細胞に由来する
本来のβ鎖を界面活性剤で可溶化したものに関する曲線
と同様であり、このことはIL−２に対する可溶性βのア
フィニティーが可溶化した本来のβ鎖と同程度であるこ
とを示している。IL−2Rβ鎖をコードする遺伝子を用い
ればIL−２システムの機能的な実験に対する新しい手法
を探る事を可能にする。IL−２システムで機能するレセ
プター構造は２つの構造的に区別される膜分子IL−2Rα
及びIL−2Rβ鎖の両方が独立にIL−２と結合する点でユ
ニークである。ここで述べられている一連のcDNA発現例
はα及びβ鎖がこの分子の非有結合的会合を介して高ア
フィニティーIL−2R複合体を構成するという以前の記述
を裏付けている（18,37）。従って、このシステムの特
殊性は１つのリガンド及び２つの別個のレセプター間の
三種の分子による相互作用の関与にある。そこで、本発
明によりこのユニークなサイトカインレセプターシステ
ムの機能ドメインを説明することが可能となる。クロー
ン化したβ鎖cDNAの突然変異分析はリガンド結合及びα
鎖との会合に関するドメインの同定への糸口を提供す
る。今日まで相同レセプターと相互作用するサイトカイ
ンにより引き起こされる生化学的事象の流れについては
ほとんど知られていない。本研究により我々はほぼ間違
いなくIL−２シグナル経路に関係するIL−2Rβ中の大き
い細胞質領域の存在を示してきた。この細胞質領域中に
存在する特定な酸性核はその他の細胞質シグナルトラン
スデューサとの結合を示唆している。それとは別に、核
内のIL−２の存在に関する報告（33）の見地から、IL−
2Rβ細胞質成分の酸性でしかもプロリンリッチな領域は
遺伝的プログラミングの活性化に一役を担っているかも
しれないという興味ある可能性がある。cDNAにコードさ
れたβ鎖が増殖シグナルを配給し得る発現系を使用すれ
ば、本レセプターの機能ドメインの理解をさらに深くす
ることができよう。今、免疫システムの発生及び調節に
おけるIL−２の基本的役割を研究することは可能であ
る。細胞表面レセプターβ鎖に相当する可溶性部分を使
用すれば、可溶性分子は不溶性分子よりも容易に結晶化
し得ることからβ鎖の構造解析が可能となるはずであ
る。またこの可溶性分子はレセプターの生物学的機能の
研究又は治療の目的で実際の細胞表面レセプターの中和
にも使用し得る。

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dmann）,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83,9694（1986）；
テシガワラら（K.Teshigawara,H.−M.Wang,K.Kato,K.A.
Smith）,J.Exp.Med.165,223（1987） 13. レオナードら（W.J.Leonard et al.）,Nature 31
1,626（1984），ニカイドーら（T.Nikaido et al.）,ib
id.,p.631（1984）；コスマンら（D.Cosman et al.）,i
bid.312,768（1984） 14. ハタケヤマら（M.Hatakeyama et al.）,ibid.318,
467（1985） 15. グリーンら（W.C.Greene et al.）,J.Exp.Med.16
2,363（1985），コンドーら（S.Kondo et al.）,ibid.3
20,75（1986）；ロブ（R.J.Robb）,Proc.Natl.Acad.Sc
i.U.S.A.83,3992（1986） 16. シャロンら（M.Sharon,R.D.Klausner,B.R.Cullen,
R.Chizzonite,W.J.Leonard）,Science 234,859（1986） 17. ロブら（R.J.Robb et al.）,Proc.Natl.Acad.Sci.
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C.K.Goldman,T.A.Waldmann）,ibid.,p 4215（1987）；
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（1987） 18. ハタケヤマら（M.Hatakeyama et al.）,J.Exp.Me
d.166,362（1987）；コンドーら（S.Kondo et al.）,Na
ture 327,64（1987） 19. ツドら（M.Tsudo,F.Kitamura,M.Miyasaka）,Proc.
Natl.Acad.Sci.U.S.A.in press. 20. ヨドイら（J.Yodoi et al.）,J.Immunol.134,1623
（1985） 21. シードら（B.Seed,A.Aruffo）,Proc.Natl.Acad.Sc
i.U.S.A.84,3365（1987）；シード（B.Seed）,Nature 3
28,840（1987） 22. パールマンら（D.Perlman,H.O.Halvorson）,J.Mo
l.Biol.167,391（1983）；ヘイン（G.von Heijne）,Nuc
leic Acids Res.14,4683（1986） 23. ウルリッチら（A.Ullrich et al.）,Nature 309,4
18（1984）；ウルリッチら（A.Ullrich et al.）,ibid.
313,756（1985）；エビナら（U.Ebina et al.）,Cell 4
0,747（1985） 24. コリンズら（L.Collins et al.）,Proc.Natl.Aca
d.Sci.U.S.A.85,7709（1988） 25. ハンクら（K.S.Hanks,A.M.Quinn,T.Hunter）,Scie
nce 241,42（1988） 26. アルコーバーら（A.Alcover et al.）,Immunol.Re
v.95,5（1987） 27. ハタケヤマら（M.Hatakeyama,S.Minamoto,T.Tanig
uchi）,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83,9650（1986） 28. ハタケヤマら（M.Hatakeyama,T.Doi,T.Kono,S.Min
amoto,T.Taniguchi），未発表文献 29. マースら（J.D.Marth,R.Peet,E.G.Krebs,R.M.Perl
mutter）,Cell 43,393（1985） 30. マンら（R.Mann,R.C.Mulligan,D.Baltimore）,ibi
d.33,153（1983） 31. フジイら（M.Fujii et al.）,J.Exp.Med.163,550
（1986） 32. ワイズマンら（A.M.Weissman et al.）,Proc.Nat
l.Acad.Sci.U.S.A.83,1463（1986） 33. ロブら（R.J.Robb,W.C.Greene）,J.Exp.Med.165,1
201（1987） 34. スガムラら（K.Sugamura et al.）,ibid.161,1243
（1985） 35. サラゴビら（H.Saragovi,T.R.Malek）,J.Immunol.
141,476,（1988） 36. カイトら（J.Kyte,R.F.Doolittle）,J.Mol.Biol,1
57,105（1982） 37. ロッターら（H.Potter,L.Weir,P.Leder）,Proc.Na
tl.Acad.Sci.U.S.A.81,7161（1984）

【図面の簡単な説明】

第1a図、第1b図はヒトIL−2Rβ鎖のcDNAの構造を示して
いる。 第２図は推定されるヒトIL−2Rα及びIL−2Rβ鎖前駆体
構造のハイドロパシープロット分析を示している。 第3a図は種々の細胞におけるヒトIL−2Rβ鎖mRNAの発現
を示している。 第3b図はヒトPBLにおけるIL−2Rβ及びIL−2RαmRNAの
発現を示している。 第4a図はヒトIL−2Rα及び、又はIL−2RβcDNAトランス
ファクタントの細胞表面染色パターンによるヒトIL−2R
α及び、又はIL−2Rβ鎖cDNAの発現を示している。 第4b図はクローン化したcDNAを発現するトランスフェク
タントに対する¹²⁵I−IL−２の結合のスキャッチャード
プロット分析によるα及びβ鎖の発現を示している。 第５図はIL−2R陽性トランスホーマントのアフィニティ
ー架橋実験の結果を示している。 第６図は再構成レセプターを介するIL−２の取り込みを
示している。 第７図はcDNAクローンの制限地図を示している。 第８図はマウスIL−2RβのcDNAの構造を示している。 第９図はアンカーマイナスcDNAを含む発現ベクターを作
る方策を示している。 第10図は天然のβ鎖及び可溶性βのヌクレオチド配列及
び対応するアミノ酸配列を示している。 第11図はサンドイッチELISA法を図式で示したものであ
る。 第12図は3T3−B4−14細胞培養物上清をモノクローナル
抗体（Mik−β１）との反応物の電気泳動の結果を示し
ている。 第13図（Ａ）は競合サンドイッチELISA法の結果を示し
ており、第13図（Ｂ）はその模式図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 1/16 // Ｃ１２Ｎ 1/16 Ｃ１２Ｒ 1:645 (Ｃ１２Ｎ 1/16 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:645） Ｃ１２Ｒ 1:91 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） 5/00 Ａ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−２３１３ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−２３１４ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−２３１５ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−２４３５ 前置審査 (72)発明者 河野 剛 大阪府池田市豊島北１‐８‐20 (72)発明者 土肥 武 東京都小平市花小金井南町１‐28‐６ (72)発明者 宮坂 昌之 埼玉県浦和市三室636‐104 (72)発明者 通堂 満 東京都板橋区成増３‐37‐１‐204 (72)発明者 烏山 一 東京都練馬区南大泉５‐21‐38 (56)参考文献 特開 平２−242695（ＪＰ，Ａ) 国際公開89／168（ＷＯ，Ａ１) 日本免疫学会総会記録，Ｖｏｌ．18 （1988），ｐ．337 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/26 C07K 14/47 - 14/55 ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (17)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列、 または、配列、 を有する構造遺伝子を特徴とする、IL−２レセプターの
   β鎖をコードする組換えDNA分子。
2. 【請求項２】IL−２β鎖またはその一部分をコードする
   DNA挿入断片を有するプラスミド、 pIL−2Rβ６（FERM BP−2312）、 pIL−2Rβ９（FERM BP−2313）、 pIL−2Rβ19（FERM BP−2314）、 pIL−2Rβ30（FERM BP−2315）または pMIL2Rβ−36（FERM BP−2435） のいずれかのDNA挿入断片を含む組換えDNA分子。
3. 【請求項３】請求項１に記載のいずれかの配列において
   79番塩基〜106番塩基のいずれかから始まり678番塩基〜
   738番塩基のいずれかで終わる配列を含む組換えDNA分
   子。
4. 【請求項４】配列、 で表されるヒトIL−2Rβ鎖の約１〜約210番アミノ酸を
   コードすることを特徴とする、請求項３に記載の組換え
   DNA分子。
5. 【請求項５】請求項３に記載の組換えDNA分子において
   塩基番号703〜717のヌクレオチドが、 GCC CTT GCT AGC TAG に改変された、可溶性ヒトIL−2Rβ鎖の誘導体をコード
   する組換えDNA分子。
6. 【請求項６】請求項１〜５のいずれか１項に記載された
   DNA分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
   することができ、IL−２に結合することができるタンパ
   ク質をコードする組換えDNA分子。
7. 【請求項７】IL−2Rβ鎖構造遺伝子に機能的に結合した
   制御配列を更に含む、請求項１〜６のいずか１項に記載
   の組換えDNA分子。
8. 【請求項８】プラスミドである、請求項７に記載の組換
   えDNA分子。
9. 【請求項９】pIL−2Rβ６（FERM BP−2312）、 pIL−2Rβ９（FERM BP−2313）、 pIL−2Rβ19（FERM BP2314）または pMIL2Rβ−36（FERM BP−2435） からなる群より選ばれるプラスミド。
10. 【請求項１０】請求項７〜９のいずれか１項に記載の組
    換えDNA分子によって形質転換された宿主細胞。
11. 【請求項１１】バクテリア細胞または酵母細胞または哺
    乳動物細胞である、請求項10に記載の宿主細胞。
12. 【請求項１２】請求項１〜６のいずれか１項記載のcDNA
    によってコードされる、実質的に純粋な、生物学的に活
    性なタンパク質。
13. 【請求項１３】適切なベクターを１以上の適切な制限エ
    ンドヌクレアーゼで消化し、DNAを単離することを含
    む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のDNAを調製す
    る方法。
14. 【請求項１４】望みのポリペプチドをコードする請求項
    １〜６のいずれか１項に記載のコード配列を発現のため
    の適切な位置に含む発現ベクターで適切な宿主生物を形
    質転換し、得られた形質転換体からタンパク質を単離す
    ることを含む、請求項12に記載のタンパク質を調製する
    方法。
15. 【請求項１５】発現ベクターが請求項８または９に記載
    したものである、請求項14に記載の方法。
16. 【請求項１６】適切な宿主が請求項７に記載のDNA分子
    を含むベクター又は請求項８若しくは９に記載のプラス
    ミドで形質転換される、請求項10または11に記載の宿主
    生物を調製する方法。
17. 【請求項１７】請求項１〜６に記載のDNA配列が適切な
    ベクターに挿入されている請求項７に記載の組換えDNA
    分子を含むベクター又は請求項８若しくは９に記載のプ
    ラスミドを調製する方法。