NO311181B1 - Rekombinant DNA-molekyl som koder for et protein som modulerer cellul¶r respons overfor type I inter feron,fremgangsmåte til fremstilling av proteinet samt celler forproduksjon av proteinet - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører rekombinant DNA-molekyl som koder for et protein som modulerer cellulær respons overfor type I interferon, idet et slikt protein er en antatt komponent av interferon type I reseptorsystem og ekspresjon av genet i en egnet vert. Foreliggende oppfinnelse vedrører selve proteinet, aktive analoger derav og fremgangsmåter for tilveiebringing av proteiner med slike egenskaper, samt celler for produksjon av proteinet.

Humane og murine celler kan bli indusert til å lage tre klasser av interferon (IFN) betegnet alfa, beta og gamma på basis av deres antigeniske egenskaper og på type av celle som produserer dem. Disse IFN induserer igjen et antall forandringer i humane celler som resulterer i etablering av en antiviral, antitumor og/eller anticellulær tilstand og forårsaker et antall endringer i cellemembranen omfattende induksjon og/eller øket ekspresjon av hovedhistokompatibili-tetskompleks (MHC) antigener. Lindahl, P. et al (1973), "Enhancement by interferon of the expression of surface antigens on murine leukemia L 1210 cells", Proe. Nati. Acad. Sei. (USA), 70, s. 2785-2788; og Fellous, M. et al (1982), "Interferon-dependent induction of mRNA for the major histocompatibility antigens inhuman fibroblast and lympho-blastoid cells", Proe. Nati. Acad. Sei. (USA), 79, s. 3082-3086. De fleste, eller alle, forandringene blir utløst av signalet dannet ved interaksjon av IFN og deres celle-overflatereseptorer.

Direkte ligandbindingsstudier og bindingssetekonkurranse-studier samt indirekte immunologiske og somatiske celle-genetiske studier demonstrerer at de tre klassene av INF reagerer med interferonsensitive celler gjennom spesifikk binding til en av to typer av reseptorer med høy affinitet på celleoverflaten (beskrevet i Rubinstein, M. og Orchansky, P.

(1985), "The Interferon Receptors", CRC Critical Reviews in Biochemistry, 2 s. 249). Alle humane IFN-alfa og humane IFN-beta (type I IFN) bindes til en kromosom 21-kodet type I reseptor, mens human IFN-gamma (type II IFN) bindes til en kromosom 6-kodet type II reseptor som krever et kromosom 21-kodet genprodukt for å utvise sensitivitet. IFN-reseptoren nødvendig for MHC-induksjon og IFN-reseptor som utløser antiviral tilstand (AVS) induksjon har felles antigene determinater og er kodet på humant kromosom 21.

Human type I IFN-reseptor er beregnet å ha en molekylvekt på 95-140 kDa, basert på eksperimenter hvori cellemembranen har bundet <125>I-IFN blir kryssbundet og kjørt på SDS-PAGE (Razziudin, A. et al. (1984), Proe. Nati. Acad. Sei. (USA), 81, s. 5504-5508 og Thompson, M.R. et al. (1985 ), J. Biol. Chem. , 260, s. 563-571 ). Det er visse spor som tyder på at respetoren er et glykoprotein, og de lavere verdiene kan være nærmere størrelsen på polypeptidet.

Ingen innrømmelser blir hevdet om at noen referanser sitert heri kvalifiserer som relevant teknikkens stand. Alle publikasjoner sitert heri er herved inkorporert som referanse .

Til tross for den store interessen i interferonsystemet og kloning av alfa og beta interferongenene for flere år siden, har type I reseptor hverken blitt isolert fra naturen og renset, eller produsert ved rekombinante DNA-teknikker.

Det har ikke vært mulig å isolere IFN-a, p-reseptorer ved direkte proteinrensning på grunn av mangelen på disse (noen få tusen molekyler pr. celle) og på grunn av fravær av cellelinjer med et amplifisert antall reseptorer. For å unngå denne vanskeligheten er dette problemet blitt tilnærmet i foreliggende oppfinnelse ved DNA-mediert genoverføring. Ved transformering av museceller med humant genomisk DNA og selektering av cellekloner som har oppnådd øket evne til reagere overfor human alfa- og beta-IFN, ble genet for en proteinkomponent av type I IFN-reseptorsystemet isolert på en vellykket måte. Det er her valgt å anvende økningen av H2-antigenene til celleoverflaten som et middel for å isolere humane IFN-responderende celler.

Foreliggende oppfinnelse vedrører et rekombinant DNA-molekyl, kjennetegnet ved at det omfatter en DNA-sekvens som koder for et protein som er en komponent av type 1 interferonreseptorsystem, som har evnen til å modulere cellulaerresponsen overfor type I interferon, i det sekvensen er vesentlig homolog med, og har samme biologiske aktivitet som proteinet som kodes av den kodende regionen 899 - 3253 ifølge figur 1.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også en fremgangsmåte for fremstilling av et protein som er en komponent av type I interferonreseptorsystem som modulerer den cellulære responsen overfor type I interferon og kodes av region 899-3253 i DNA-sekvensen i figur 1, kjennetegnet ved at transformerte celler ifølge oppfinnelsen dyrkes i et egnet dyrkingsmedium under betingelser egnet for ekspresjon av proteinet, og isolering av proteinet fra nevnte celler eller fra kulturmediet.

Den vedrører videre vertsceller, fortrinnsvis eukaryote, f.eks. pattedyrceller, transformert med et rekombinant DNA ifølge oppfinnelsen på en måte som muliggjør at vertscellen uttrykker nevnte protein. Figur 1 viser nukleotidsekvensen til antatt type I interferonreseptorkomponent cDNA-klon L7. Den kodende sekvensen er identifisert og antatt translasjon til amino-syrene er gitt. Figur 2 er en skjematisk illustrasjon av en foretrukket protokoll for kloning av proteiner som modulerer cellulær respons overfor type I interferoner, idet slike proteiner er antatte komponenter av human type I IFN-reseptorsystem. Figur 3 er et restriksjonskart av L7 cDNA som il-lustrerer det strukturelle forholdet mellom tre molekyler anvendt for å tilveiebringe antistoffene og L7-proteinet. Figur 4 er et kolonnekart som viser ampiifikasjonen av L7 cDNA-ekspresjonen i CHO-celler ved metotrexat (MTX) uttrykt som responsen til celler overfor humant IFN, (dvs. ganger økning av (2 '-5 ' )-A-syntetetase). Økningen for CHO-pSVL7-klonene valgt med hver MTX-konsentrasjon ble beregnet ved sammenligning med kontroll CHO-DHFR-kloner utsatt for samme behandling. (2'-5')-A-syntetase øker i ikke-amplifiserte kloner (0 MTX) var to ganger over CHO-DHFR, og i ordinaten blir denne verdien satt til 1 for sammenligning med amplifiserte kloner. Figur 5A er en graf som plotter (2'-5') A synte-taseaktivitet i CH0-pSVL7-transformanter (ved 300 nM MTX) overfor aktiviteten i CHO-DHFR-kontroller for celler indusert av enten humant IFN-P (firkanter) eller hamster IFN (kryss).

Figur 5b viser et utvidet plot av data i figur 5A.

Figur 6 er en FACS-analyse av Daudi-celler farvet med Rhodamin-konjugert protein A i nærvær av kaninanti-L7 (PSN) antistoff. Abscissen er fluorescence-vilkårlige enheter, og ordinatet er antall celler. Det venstre panelet angir lysspredning som viser at det ikke er noen forskjeller i cellestørrelse med eller uten anti-L7. Høyre panel viser Rhodamin-fluorescence; de to kurvene som har topper ved 60 er celler uten kaninantiserum eller med normalt (ikke-imunt) kaninserum; kurven som har topp ved 110 er fra celler med anti-L7 antiserum. Forskyvningen viser at alle Daudi-celler har L7 på deres overflate. Figur 7 er en kolonnegraf som viser binding av humane IFN-a til Daudi-celler og virkningen av forskjellige tilsetninger på deres binding. Kald IFN-P konkurrerer, og det gjør også antistoffer, mot celler med kromosom 21 (<krom.21), mens anti-L7-antistoff (<L7) ikke inhiberer. NRS og NMS er henholdsvis normalt kanin- og museserum.

Reseptorer for cytokiner eller andre proteinhormoner er proteinmolekyler på overflaten av celler som reagerer med spesifisitet med en ligand (dvs. cytokin eller hormon) tilstede i det ekstracellulære miljøet, og overfører et signal til det intracellulære rommet for å utføre den biologiske virkningen til liganden. Kjente reseptorer for cytokiner (f.eks. interleukin-2 (IL-2), interferon-^ (IFN-^)) består av flere forskjellige proteinkjeder som sammen utgjør reseptorsystemet. Funksjonen til disse proteinkjedene er 1) å binde liganden spesifikt ved høy affinitet, 2) å reagere med det aktive setet til liganden som ofte danner en konforma-sjonsf orandring og 3) å overføre et signal inn i det intracellulære rommet. Samarbeid mellom de forskjellige proteinene som danner reseptorsystemet ansees å være en nødvendighet for disse funksjonene. For eksempel krever høy affinitetsbinding av IL-2 to komponenter (Hatakeyama M, et al

(1989), "Interleukin-2 receptor P chain gene: Generation of three receptor forms by cloned human a and g chain cDNAs", Science, 244, 551-556). II-interferonreseptorsystemet består av minst to komponenter; en bindingsenhet og en overførings-enhet (Langer J.A. og Pestka S. , (1988) "Interferon receptors", Immunology Today, 9, 393-400). Det er sannsynlig at type I IFN-reseptorsystemet er likeledes sammensatt av flere proteiner involvert i artsspesifikk binding av IFN, interaksjon med IFN-aktivt sete og overføring av signalet som aktiverer transkripsjonen av spesifikke gener.

Det er kjent innenfor fagområdet å kryssbinde et interferon til dets celleoverflatereseptor, men denne fremgangsmåten kan ikke bli anvendt praktisk for å identifisere transformerte celler som bærer type I reseptor eller å oppnå tilstrekkelig reseptor for å rense og karaktertisere det, på grunn av at antallet reseptorer pr. celle er lavt (vanmligvis mindre enn 5000). Denne fremgangsmåten ville heller ikke ha identifisert L7-protei.net på grunn av at det ikke ser ut til å binde IFN med høy affinitet.

I et aspekt vedrører foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for identifisering av et gen kodende for en reseptorkomponent for et cytokin, spesielt et interferon, og mere spesielt en type I interferon, som unngår nødven-digheten av å forsøke å kryssbinde et merket cytokin til en overflatereseptor uttrykt ved transformerte celler og deretter, gjennom deteksjon av den bundede markøren, skjelne celler som uttrykker slik reseptor fra de som ikke gjør dette. Foreliggende oppfinnelse er i steden basert på evnen som cytokin har til å indusere en påvisbar forandring i et celleo<y>erflatekaraktertrekk. I en foretrukket utførelsesform er denne forandringen en antigenforandring. Forandringen kan være en økning eller en reduksjon i en eller flere antigener. Som eksempel, med interferon er en slik forandring en økning i MHC-antigener; det er foretrukket å påvise den økte ekspresjonen av H2-antigenet, men andre MHC-antigener kan likeledes bli påvist, som for eksempel <p>2-mikroglobulin eller klasse II MHC-antigener.

Denne prosedyren har flere fordeler i forhold til fremgangsmåten diskutert ovenfor. Den kan for det første identifisere cytoplasmiske reseptorer, ikke bare celleover-flatereseptorer. For det andre kan den identifisere reseptorer som bare indirekte reagerer med den korresponderende liganden, ikke bare de som binder liganden direkte. Den forsikrer til slutt de valgte klonene kan reagere overfor liganden. Den enkle fremgangsmåten kan selektere kloner som uttrykker et molekyl som binder interferon men utløser ikke noen ytterligere cellulær aktivitet som et resultat av denne interaksjonen.

Celleoverflateantigenet blir fortrinnsvis gjenkjent av et antistoff, spesielt et monoklonalt antistoff. I visse tilfeller kan en annen klasse bindingsmolekyl, så som et lektin eller et enzym, være egnet. I en utførelsesform må bindingsmolekylet være merket. En hvilken som helst kjent markør innenfor analysefeltet, så som radioaktiv markør, enzymmarkør eller fluoriserende markør kan bli anvendt, idet flurioserende markør er foretrukket. Markøren kan være direkte eller indirekte, kovalent eller ikke-kovalent bundet. Alternativt kan bindingsmolekylet være bundet til en affinitetskromatografibærer, og celler som bærer reseptoren kan deretter bli af f initetsseparert fra de som ikke gjør dette.

Separasjon av ønskede kloner fra andre transformerte celler blir fortrinnsvis oppnådd ved fluorescence-aktivert cellesortering, (FACS). Nivået av ekspresjonen av påvist overflatestruktur må selvfølgelig være innenfor sensitivi-tetsgrensene til FACS, vanligvis over 20.0000 molekyler/celle.

Reseptorkomponentgenet må bli isolert fra DNA'et inneholdende urelaterte gener samt sekvenser uten kodende funksjon. DNA'et som skal blik screenet må være genomisk DNA eller cDNA. Det kan være avledet fra hele genomet til donoren, eller fra et valgt kromosom. Det kan være anriket for DNA med en spesiell størrelse. DNA kan bli introdusert inn i vertscellen ved enkel transfeksjon av DNA-fragmentene, eller DNA-fragmentene kan bli subklonet inn i en egnet viral eller plasmidvektor som deretter blir anvendt for å transformere vertsceller.

Vertscellen anvendt for screening er fortrinnsvis en som, før transformasjon med et funksjonelt reseptorgen, ikke kan reagere overfor interferon (eller annen cytokin av inter-esse). Derimot kan en vertscelle med et lavt responsnivå bli anvendt dersom den genetiske modifikasjonen vesentlig forsterker responsen som skal blik påvist. På grunn av at interferoner er artsspesifikke, er anvendelse av en ikke-human vertscelle foretrukket, når det human IFN-reseptorkomponentgenet blir lett etter.

Når reseptorkomponentgenet er blitt isolert, blir ikke-naturlig oppstående analoger av reseptorkomponenten lett preparert ved setespesifikk mutagenese av genet, eller ved kjemisk behandling (f.eks. med proteolytiske enzymer). Analoger som sannsynligvis er funksjonelle kan bli identifisert ved grundig studering av sekvensen. Potensiell fosforylering og transmembrane regioner er sannsynligvis essensiell for aktiviteten. Det er bedre å erstatte en aminosyre med en med lignende størrelse og ladning enn med en radikalt forskjellig aminosyre. N- og C-terminale ender kan bli forkortet for å bestemme hvilke som er nødvendig for aktivitet.

Reseptorkomponentgenet kan bli koblet til en ikke-nativt assosiert promoter, som kan være konstitutiv eller induser-bar. Foretrukket promoter er SV40 tidlig promoter. Valg av kodon for genet kan bli modifisert for å være i overensstem-melse med kodonpreferansenne til verten for å eliminere uønsket dannelse av sekundær struktur, eller for å lette ytterligere modifikasjoner av genet ved å danne eller eliminere restriksjonsseter. Genet kan bli introdusert inn i en egnet vertscelle.

I en spesielt foretrukket utførelsesform ble oppkuttet humant DNA ført inn i muse-LTK" celler sammen med et herpesvirus TK-gen og LTK<+> transfekterte museceller som reagerer overfor human type I IFN ble valgt ved f luorescence-aktivert cellesortering (FACS). Indirekte, i steden for direkte, FACS-seleksjon for reseptorkomponent, ble anvendt på grunn av at antallet type I IFN-reseptorer/celle er under det som kan bli påvist ved FACS-analyse. IFN-indusert økning i MHC-antigener på celleoverflaten ble valgt for anvendelse som en markør for å separere reagerende celler.

Celler som uttrykker biologisk aktive reseptorkomponenter som sees ved øket H2-ekspresjon etter behandling med HAT-resistente celler med human type I IFN ble screenet for. Dette er en tilnærmelse som blir understøttet ved demonstre-ring at human IFN regulerer ekspresjon av muse-H2 i human x musesomatiske cellehybrider som uttrykker humane IFN-reseptorer. Celler ble dyrket og FACS-seleksjonen ble gjentatt. Mengden av humant DNA i museceller ble redusert ved å utføre en sekundær transfeksjon ved anvendelse av DNA fra humane IFN-sensitive klonede celler fra primære transfeksjoner. Sekundære transfektanter som uttrykker reseptorkomponenten ble tilveiebragt ved FACS-screening som beskrevet ovenfor.

Genomiske DNA-bibliotek ble preparert fra DNA ekstrahert fra sekundære transfektanter ved anvendelse av bakteriofag EMBL3. Humane DNA restriksjonsfragmenter fra disse fagene ble analysert ved Southern blot-analyse for å oppnå unike sekvenser uttrykt i celler inneholdende humant kromosom 21. Et fagisolat inneholdt et unikt 2,1 kb EcoR-restriksjons-fragment som så ut til å være fra humant kromosom 21 på basis av differensialhybridisering til genomisk DNA fra museceller, henholdsvis humant placental DNA og DNA fra en human x musesomatisk cellelinje hvori humant kromosom 21 var det eneste gjenværende humane kromosomet. Det ble bekreftet at dette var et stykke av humant kromosom 21 ved dets hybridi-seringsmønstre på pulsfelt gel-blotter ved anvendelse av DNA fra human x muse og human x hamstersomatiske cellehybrider med eller uten humant kromosom 21. Det er blitt vist ved anvendelse av Northern blot-hybridisering at dette unike fragmentet hybridiserer med humant poly-A<+> RNA som er stort nok til å kode for reseptorkomponenten. Dette stykket ble subklonet inn i plasmidvektor pGEM 4 og anvendt for å screene et humant placenta Xgtll cDNA-bibliotek forhandlet fra Clontech Laboratories (Palo Alto, Calif.). Syv cDNA-kloner ble isolert. Det humane DNA er blitt subklonet inn i Bluescript plasmidvektor til Stratagene Cloning-systemer (San Diego, Calif. ).

EKSEMPEL 1

Isolering av antatt type I IFN- reseptorkomponent gen

Muse LM-TK"-celler (som mangler enzymet tymidylat kinase, TK)ble transfektert av totalt humant DNA fra T-celle-leukemia Molt-4-celler ved anvendelse av et plasmid pAGO inneholdende Herpes Simplex-virus TK~-cDNA som selekterbar markør i hypoksantin-aminopterin-tymidin (HAT) selektivtmedium. LM TK<+ >celler ble utsatt for 200 U/ml humant IFN-pl og farvet med monoklonalt antistoff anti-H2K<k> 12-41 (se Rosa, et al.

(1986), Interferon, 7, 47-87, Academic Press, inkorporert som referanse) og FITC-(Fab') kaninantimuse IgG. Ved anvendelse av cytofluorograf 50HH (Orthodiagnostics ), ble 10$ av de mest fluoriserende celler sortert sterilt, dyrket pånytt og utsatt for en ny seleksjonsrunde. Preliminære eksperimenter viste at populasjonen sortert to ganger var anriket i celler som reagerer overfor human IFN-alfa eller beta (men ikke gamma) i multiple tester så som induksjon av (2'-5')-oligo-A-synte-tase, resistens overfor Vesicular Stomatitis-virus og <125>j_ IFN-alfa-binding. Kloning med denne fenotypen ble oppnådd ved fortynning.

Polyklonale og monoklonale antistoff overfor muse-humane hybrider bare inneholdende humant kromosom 21 som hemmer binding og respons overfor humant (men ikke muse) IFN (se Razziudin et al., angitt ovenfor), blokkerte H2-økningen ved humant IFN i positive kloner som tyder på tilstedeværelse av human IFN-overflatereseptor. DNA fra en slik primær transfor-mant ble transfektert inn i nye LM-TK~-celler og sekundære transformanter ble tilveiebragt ved anvendelse av pAGO for seleksjon. Sekundære transformanter ble igjen utsatt for FACS-seleksjon som ovenfor, og etter tre sykluser ble kloner oppnådd ved fortynning og human IFN-reagerende celler identifisert i testene beskrevet ovenfor. DNA ble preparert fra subklonekulturer som samtidig ble testet for (2'-5')-oligo-A-syntaseinduksjon ved humant IFN. Subkloning eller gjentatt FACS-seleksjon ble funnet å være nødvendig for å opprettholde nødvendige nivåer av fenotypisk respons. En klon betegnet pII-19-26 ble valgt for ytterligere analyse.

Southern blot-analyse med en total human DNA-probe viste at innholdet av humant DNA i noen av klonene var lavt nok for å berettige forsøk på molekylær kloning av transformerende DNA. Et genomisk bibliotek ble preparert fra klon gII-19-26 ved anvendelse av EMBL-3 vektor, og screenet med total human DNA som probe. Omtrent 20 EMBL-3-fag inneholdende humant repeterende DNA ble renset. Fra to av fagene med sterkest signal (15-4 og 6-40), ble BamHI-restriksjonsfragmenter på 2,1 og 1 kb som ikke inneholder repeterende DNA, isolert. Southern blot-analyser av genomisk DNA bekreftet at disse fragmentene hybridiserte med humant, men ikke muse-DNA. De fleste fag med humant DNA fra pII-19-26-bibliotek hybridiserte med BamHI 2,1 kb-fragmentet (probe 6-40-3) som indikerer at dette er en hovedbestanddel av humant DNA i PII-19-26-celler. Den kromosomale opprinnelsen av 6-40-3-proben ble bestemt ved hybridisering til Southern DNA-blot fra muse-human og hamster-humane hybrider, som bekreftet at 6-40-3-proben identifiserer et 300 kb Notl-fragment med opprinnelse fra kromosom 21. 6-40-3 BamHI-fragmentet på 2,1 kb overlapper to EcoRI-f ragmenter på 2 og 4 kb, idet totallengden til innskuddet i fag 6-40 er 16 kb. DNA fra transformantsubkloner som enten reagerer overfor humant IFN eller mangler fenotypen, ble probet med 6-40-3; og bare responderende celler viste hybridisering til proben.

For å bestemme om 6-40-3-proben var del av en transkripsjonsenhet, ble lambda-gtll-cDNA-bibliotek screenet fra human morkake med denne proben. Syv positive cDNA-kloner ble identifisert i 2xl0<6> fag. En klon (L7) har et EcoRI-innskudd på 3,9 kb som indikerer en lang transkripsjonsenhet. Dette ble bekreftet på Northern blot hvor samme probe påviste et 4,5 kb RNA, og et større 5,1 kb bånd. EcoRI-innskudd av cDNA-klon L7 på 3,9 kb ble subklonet i en Bluescript-vektor

(Stratagen Co.) og E.coli TC1-kompetente bakterier ble transformert med denne L7-BS2-vektoren. Disse transformerte bakteriene ble deponert til "Collection Nationale de Cultures de Microorganismes" (C.N.C.M.), Paris, Frankrike, 14. november 1988, under aksesjonsnummer C.N.C.M. 1-816, i henhold til Budapest-avtalen. Subkulturer vil bli gjort tilgjengelig for offentligheten ifølge avtalen, men ingen lisens kan oppnåes fra deponeringen.

Subkloning ble utført i to orienteringer. T7-RNA-polymerase-transkripter translatert i retikulocyttlysater produserte 100 kd protein i én orientering, men ikke i den andre. Et 62 kD-protein ble dannet av samme transkripter som produserer 100 kD-proteinet, og kan bli translatert fra et indre ATG-kodon.

EKSEMPEL 2

Karakterisering av klonet antatt IFN type I- reseptorkomponent

Nukleotidsekvensen til L7-cDNA ble oppnådd ved sekvensering av nestede delesjoner fra begge tråder i Bluescript-vektoren. Sekvensen vist i fig. 1 angir et RNA på 3870 nukleotider etterfulgt av en poly A hale. En åpen leseramme begynner ved nukleotid 899 og slutter ved 3253 kodende for et protein på 785 aminosyrer. Beliggenheten av den kodende region 899-3253 ble bekreftet ved translasjon av delesjonstranskripter i retikulocyttlysater.

Lengden på proteinet angir en molekylvekt på 86.000 som er nære ved de lavere verdiene beregnet ved gelelektroforese. Fra elektroforese av translasjonsproduktet til L7-cDNA i retikulocyttlysatet ser det ut som om proteinet migrerer saktere enn teoretisk ventet, med en tilsynelatende molekylvekt på 100.000. Dette kan forklares ved hyppigheten av sure aminosyrer i sekvensen.

Et interessant trekk ved L7-proteinet er regionen på 12 kontinuerlige seriner flankert av 6 glutaminsyrer (basene 1710-1760 i fig. 1). Denne regionen kan bli fosforylert. En potensiell transmembranregion med 15 uladede aminosyrer er tilstede fra nukleotidene 3056 til 3100 i fig. 1. Et hydrofobt signalpeptid er observert ved den N-terminale enden av proteinet. Disse trekkene er i samsvar med beliggenheten av dette proteinet i cellemembranen som ventet for IFN type I-reseptoren. Det er ingen signifikant homologi mellom L7-proteinsekvensen og IFN-7- reseptoren eller et hvilket som helst annen kjent gen.

På grunn av at endelig bevis på identitet krever demonstra-sjon av oppnådd sensitivitet overfor humant IFN i ikke-humane celler transfektert med denne cDNA-klonen, ble forbigående og stabile transfeksjoner av cDNA-genet kondensert til SV40 tidlig promoter analysert i forskjellige ikke-humane celle-1inj er.

For å undersøke den biologiske aktiviteten til proteinet kodet av L7-cDNA, ble en ekspresjonsvektor pSVE3-L7 kon-struert, inneholdende hele L7-cDNA koblet til Simian-virus 40 tidlig genpromoter. For transient ekspresjon ble dette plasmidet transfektert inn i museceller og 24 timer senere ble cellene behandlet med 500 U/ml humane IFN-pl eller beholdt ubehandlet (Benech, P., etal. (1987), Mol. Cell. Biol., 7, s. 4498-4504). Etter ytterligere 24 timer ble celleekstraktet preparert og (2'-5')-oligo-A-syntetase ble målt som beskrevet (Revel M. et al. (1981), Meth. Enzylmol. , 79, s. 143). (2'-5')-oligo-A-syntetaseaktivitet i transfekterte celler behandlet med humant IFN minus den i ikke-behandlede celler, ble beregnet. Som vist i tabell 1, var denne økningen gjennomsnittlig 4,5 ganger høyere i celler som hadde mottatt ekspresjonsvektoren inneholdende L7-cDNA i forhold til celler som hadde mottatt den tomme ekspresjonsvektoren. Sistnevnte viste ingen signifikant økning i forhold til celler som ikke hadde mottatt DNA (tabell 1).

Stabile transformanter av kinesiske hamsterovarieceller (CHO) ble preparert ved kotransfeksjon av cDNA kondensert til SV40 tidlig promoter og vektorer inneholdende DHFR-genet. Klonale cellepopulasjoner ble isolert fra transfeksjonen etter hensiktsmessig seleksjon, og disse klonale linjene ble screenet for tilstedeværelse av cDNA og for respons overfor humant IFN-e som vist ved induksjon av (2'-5')-A-syntetase. Kloner inneholdende L7-DNA ved Southern blot analyser og som reagerer overfor 100 U/ml humant IFN-P^ ved (2'-5')-A-syntetaseinduksjon høyere enn CH0-DHFR<+-> celler, ble isolert og utsatt for amplifikasjon ved trinnvis seleksjon med metotreksat (MTX). I kloner resistente overfor 50 nM eller 300 nM MTX, blir L7-RNA-ekspresjonen påvisbar ved Northern blots av totalt RNA. Respons overfor 100 U/ml humant IFN-p^ er 4-5 ganger høyere i 50 nM MTX-kloner enn i CHO-celler inneholdende bare pSVDHFR, som ble amplifisert på lignende måte (tabell 2). Ved 300, 750 og 1000 nM MTX, viste CHO-DHFR+L7-klonene en økning i respons overfor humant IFN-p sammenlignet med høyeste respons i CHO-DHFR-kontrollkloner som på lignende måte ble behandlet med M

TX (fig. 4). Amplituden til responsen overfor humant IFN-P øker derfor ved genamplifikasjon med en faktor på 8 ganger. Responsen til slike amplifiserte kloner overfor 100 U/ml humant IFN var omtrent 15$ i forhold til den til 20 U/ml i hamster IFN.

Det er her blitt konkludert at til tross for at ekspresjon av L7-cDNA under SV40-promoterkontroll fører til at cellene har øket respons overfor humant IFN, forblir amplituden til responsen lav. Dette kan være forårsaket av problemer ved ekspresjon av proteinet eller at L7-proteinet bare er en del av IFN-reseptorsystemet. Sistnevnte mulighet er mer sannsynlig på grunn av at signifikant høy affinitetsbinding til humant 125j-IFN-a til CHO-transformanter ikke kunne bli demonstrert. Dersom reseptoren består av mer enn én kjede, kan bindingsaffiniteten være meget lav i nærvær av bare én av proteinkjedene.

At L7-proteinet er en komponent av IFN-reseptoren som ikke er direkte ansvarlig for artsspesifikk binding av humant IFN, blir videre vist ved det faktum at i amplifiserte CH0-pSVL7-kloner er responsen overfor hamster IFN også øket. Fig. 5 viser at ved lav konsentrasjon av hamster eller humant IFN, som produserer lav stimulering av (2'-5')-A-syntetase-aktivitet i kontroll CHO-DHFR-klon (abscissa), ga en CHO-pSVL7-klon (300 nM MTX) en 5 ganger høyere respons med begge IFN-artene (den rette linjen i fig. 5 er den ventede linjen dersom begge klonene reagerer likt). Ved høyere IFN-konsentrasjoner som produserer høyere induksjon av (2'-5')-A-syntetase, var forskjellen mellom CH0-pSVL7 og CHO-DHFR-klonen mindre markert. Det er her blitt konkludert at mer L7-protein på overflaten, muliggjør at cellene reagerer bedre overfor lave IFN-konsentrasjoner. Dette resultatet er i samsvar med hypotesen om at L7 er en av kjedene av type I IFN-reseptorsystemet, som overfører signalet innenfor cellen.

EKSEMPEL 3

Antistoff overfor L7- protein viser proteinet på

overflaten av cellene

Et peptid med 27 aminosyrer nær ved den aminoterminale enden av L7-proteinet (fig. 3) ble syntetisert, konjugert til KLH og anvendt for å oppnå kaninantiserum. Antistoffene ble renset på en kolonne av immobilisert peptid og anvendt i Western blot. I Daudi- og U937-celler blir et protein på 130 kDa påvist i Triton X-100-deoksycholatlysater og i membran-preparater. Dette er sannsynligvis en glykosylert form av L7 som har et N-glykosyleringssete nær ved den N-terminale regionen. Immunpresipitasjonen var derimot ikke mulig med peptidantistoffene.

L7-cDNA ble koblet gjennom kodon 113 til protein A-genet i vektor pRIT-2 (Pharmacia Fine Chemicals) og uttrykt i E. coli. Koblet protein PSN og PN2 (fig. 3) renset på en immunoglobulinkolonne ble anvendt for immunisering for å oppnå polyklonale kaninantistoff overfor L7-proteinet. Disse antistoffene immunopresipiterer fra humane Daudi-celler i 7 timer med <35->metionin, hovedbånd ved 80-85 kDa og mindre bånd ved omtrent 130 kDA. 80-85 kDA-bånd kan bli dannet av proteinet som mangler de den N-terminale regionen gjenkjente av ovennevnte antipeptid-antistoff.

Med kaninantiserum mot L7 (anti-PSN og -PN2) er det mulig å demonstrere at L7-proteinet er på overflaten av humane lymfoblastoidceller (Daudi). Fig. 6 viser en fluorescense-aktivert cellesorterer (FACS) analyse som demonstrerer tilstedeværelse av L7 på overflaten av Daudi-celler. Det høyre panelet viser at med Rhodaminisotiocyanatmerket protein A alene eller med normalt kaninserum blir en fluorescense-topp oppnådd ved 60 arbitrære enheter. Med tilsatt anti-L7-serum blir fluorescensetoppen derimot forskjøvet til høyere verdier (gjennomsnittlig 110) som viser at anti-L7-antistoff bindes til cellene og dermed blir mer Rhodaminmerket Protein A koblet. Formen på kurvene viser at alle Daudi-cellene viser L7-proteinet på overflaten.

Anti-L7-antistof f hemmet ikke binding av <125>I-IFN-o<2 til humane lymfoblastoide Daudi-celler. Fig. 7 viser at bindingen ble inhibert av kald IFN-p av antistoffer mot musehumane hybridceller inneholdende bare kromosom 21 (<chr.21), men ikke av anti-L7 (<L7), heller ikke av normalt kaninserum (NRS) ellert normalt museserum (NMS). L7-proteinet ser derfor ikke ut til å være direkte involvert i binding av IFN-a til disse humane cellene. Dette ville skjelne L7-proteinet fra protein kryssbundet til IFN-a på humane celler (Razziudin et al, locus angitt). Det er ikke utelukket at proteinet som binder IFN-a kan være forskjellig fra det som binder IFN-p. På grunn av at L7-proteinet ble identifisert ved dets virkning på responsen på cellene overfor IFN-p, er det blitt gjort et forsøk på å se om L7 kan bli kryssbundet til IFN-p. På grunn av at radioaktiv iodinering av aktivt IFN-p ikke var vellykket, ble kald IFN-p kryssbundet til Daudi-celler ved superimidatbehandling og den elektroforetiske mobiliteten til L7-proteinet (påvist ved immunobloter med antipeptid) ble analysert for å bestemme om det blir redusert ved denne behandlingen. I et eksperiment ble et saktere 150 kDa-bånd obervert i tillegg til 130 kDa L7-protein, men to andre eksperimenter viste ikke dette fenomenet.

Konklusj oner:

Identifikasjon av L7-proteinet som et protein som modulerer cellulær respons overfor type I-interferon og en komponent av type I IFN-reseptorsystem, er basert på følgende: 1. Transient ekspresjon av L7-cDNA forårsaker at museceller oppnådd en høyere respons overfor humant

IFN-p.

2. Stabile transformanter av hamster CHO-celler med L7-DNA viser en øket respons overfor IFN. Økningen er korrelert med amplifikasjon av integrert L7-DNA. Den økte responsen sees med humant hamster IFN, og er mer markert ved lave konsentrasjoner av IFN, og dette tyder på at L7 forsterker affiniteten til

cellene overfor IFN.

3. L7-proteinet er på overflaten av humane celler.

4. Genet kodende for L7-protein er på kromosom 21 i regionen (22) hørende til type I-reseptorgen(er) ved somatisk cellegenetikk.

Som når det gjelder andre cytosiner (f.eks., IL-2, IFN--Y ), blir type I-IFN-reseptoren sannsynligvis dannet av flere forskjellige proteinkjeder. L7-proteinet er sannsynligvis en komponent av type I IFN-reseptorsystemet og involvert i responsen til cellene overfor IFN. Det er sannsynligvis ikke kjeden til reseptorsystemet som binder humant IFN på en artsspesifikk måte. Det er sannsynligvis en kjede av reseptoren som øker signalet produsert ved binding av IFN.

Identifikasjon av L7-proteinet muliggjør studier av dets strukturfunksjonsforhold, for å danne et modifisert en-zymprotein med det mål å øke eller redusere responsen til cellene, vevene og hele organismer overfor interferon av a-eller p-type, og å produsere ved rekombinant DNA-teknologi oppløselig eller lipidbundet L7-protein, som kan virke som en konkurrent overfor IFN. Disse oppfinnelsene kan anvendes på patologiske situasjoner hvor man ønsker å enten forsterke eller redusere responsen overfor disse typene av interferoner (f.eks. autoimmune prosesser, kroniske og akutte infeksjoner, svulster og leukemier osv.).

L7-proteinfragmenter eller analoger som reagerer med IFN, eller antidiotypiske antistoffer dannet mot antistoffer til L7-proteinet, kan bli injisert inn i en pasient virkende som "lokkemidler" for tilstedeværende interferonmolekyler. Genterapi med funksjonelle reseptorgener kan bli anvendt for å tilveiebringe flere reseptorer og dermed øke responsen overfor IFN.

Det er å bemerke at til tross for at et enkelt spesifikt protein, og det genetiske materiale derav, beskrevet heri skal foreliggende oppfinnelse ikke bli begrenset til dette. Protokoll for ekstrahering av genetisk materiale kodende for et protein som modulerer cellulær respons overfor interferon, er blitt vist å være effektiv ifølge det eksperiment-elle resultatet beskrevet heri. Fagfolk forstår at dersom foreliggende protokoll blir gjentatt, kan forskjellige proteiner som også modulerer cellulær respons overfor interferon, idet proteinene omfatter andre kjeder av type I-reseptorsystem, bli tilveiebragt. Idet protokollen er spesifikk for proteiner som forårsaker øket H2-antigenproduk-sjon, er det i sin helhet ventet at ytterligere proteiner som er forskjellig fra de som spesifikt er beskrevet heri, også har slike egenskaper og foreliggende oppfinnelse omfatter genetisk alle disse.

Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan også bli gjentatt ved anvendelse av andre markører for interferon-aktivitet, f.eks. andre forandringer av celleoverflate-karaktertrekk forårsaket av interferon, for påvisning av interferonreseptorsystemkomponenter. Slike karaktertrekk kan omfatte øket <p>2-mikroglobulin eller klasse II MHC-antigener. Når disse teknikkene blir anvendt, vil proteiner som modulerer cellulær respons overfor interferon også bli oppnådd, og slike rensede proteiner og genetisk materiale som koder for disse, er også del av foreliggende oppfinnelse.

Det er kjent at et hvilket som helst protein oppnådd i henhold til foreliggende oppfinnelse modulerer cellulær respons overfor interferon. Dette er ved definisjon sant på grunn av at det er den egenskapen som rettleder seleksjon av det genetiske materialet. Det antas at alle slike proteiner er en del av interferonreseptorsystemet, men søkerne vil ikke være begrenset til en slik teori. Det er derimot kjent at slike proteiner ikke bare er interferoninduserende middel i lys av deres aktivitet med hensyn på respons overfor interferon, i steden for å danne det.

Humant IFN-p anvendt ved 100 enheter/ml. I

Claims (7)

1. Rekombinant DNA-molekyl, karakterisert ved at det omfatter en DNA-sekvens som koder for et protein som er en komponent av type 1 interferonreseptorsystem, som har evnen til å modulere cellulærresponsen overfor type I interferon, i det sekvensen er vesentlig homolog med, og har samme biologiske aktivitet som proteinet som kodes av den kodende regionen 899 - 3253 ifølge figur 1.

2 . Molekyl ifølge krav 1, karakterisert ved at det koder for et protein som har evnen til å modulere cellulær respons overfor type I interferon, som målt ved en økning i 2',5'-oligosyntetase aktiviteten.

3. Molekyl ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte DNA-sekvens videre omfatter en promoter som nevnte DNA sekvens ikke er nativt assosiert med, hvorved nevnte protein kan bli uttrykt, og hvori nevnte promoter fortrinnsvis er SV40 tidlig promoter.

4 . Transformert celle, karakterisert ved at den omfatter et rekombinant DNA-molekyl ifølge krav 3, idet nevnte celle har evne til å uttrykke nevnte protein.

5 . Fremgangsmåte for fremstilling av et protein som er en komponent av type I interferonreseptorsystem som modulerer den cellulære responsen overfor type I interferon og kodes av region 899-3253 i DNA-sekvensen i figur 1, karakterisert ved at transformerte celler ifølge krav 4 dyrkes i et egnet dyrkingsmedium under betingelser egnet for ekspresjon av proteinet, og isolering av proteinet fra nevnte celler eller fra kulturmediet.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at ekspresjon av proteinet blir amplifisert ved metotreksatseleksjon, idet nevnte celler er DHFR<+>, modulering av den cellulære responsen til type I interferon til proteinet er ikke-spesis spesifikt, og cellene er CHO-celler.

7. Ikke-humane celler, karakterisert ved at de inneholder og kan uttrykke et humant gen som innbefatter den kodende regionen 899 - 3253 ifølge DNA-sekvensen figur 1.