DE3144469A1 - Hybride human-leukozyten-interferone - Google Patents
Hybride human-leukozyten-interferoneInfo
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Description
Die Erfindung bezieht sich auf die mikrobielle Herstellung von Hybrid-Leukozyten-Interferonen durch rekombinante
DNA-Technologie zur Verwendung bei der Behandlung von viralen
und neoplastischen Erkrankungen sowie auf die Mittel, Maßnahmen und Endprodukte einer solchen Herstellung.
Verhältnismäßig homogene Leukozyten-Interferone sind aus
Leukozyten normaler oder leukämischer Spender gewonnen worden.
Diese Interferone sind eine Familie von Proteinen, die sich durch ein starkes Vermögen, in .ihren Target-Zellen einen
Virus-resistenten Zustand herzustellen, auszeichnen. Außerdem vermag Interferon auf die Zellvermehrung hemmend und die
Immunreaktion modulierend zu wirken. Diese Eigenschaften haben die klinische Verwendung von Interferon als therapeutisches
Mittel zur Behandlung viraler Infektionen und bösartiger Erkrankungen veranlaßt.
In jüngerer Zeit ist die rekombinante DNA-Technologie dazu herangezogen worden, die mikrobielle Herstellung einer
Reihe verschiedener Leukozyten-Interferone zu veranlassen,
Mez/3.11.81
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Stopsignals von den Ribosomen unübersetzt bleiben. Ribosomen
werden an die auf der messenger-RNA vorgesehene Bindestelle gebunden, in Bakterien gewöhnlich, wenn die mRNA gebildet
wird, und erzeugen selbst das verschlüsselte Polypeptid, beginnend
am Translations-Startsignal und endend mit dem zuvor genannten Stopsignal. Das gewünschte Produkt wird gebildet,
wenn die die Ribosomen-Bindestelle verschlüsselnden Sequenzen bezüglich des AUG-Initiatorcodons geeignet angeordnet sind
und wenn alle übrigen Codons dem Initiatorcodon in Phase folgen. Das anfallende Produkt kann durch Lyse der Wirtszelle
und Gewinnen des Produkts durch geeignete Reinigung von anderem Bakterienprotein erhalten werden.
Nucleotid-Sequenzstudien von Genen, die die verschiedenen
Leukozyten-Interferone verschlüsseln, lassen ein Maß an Allgemeinheit
unter verschiedenen von ihnen im Hinblick auf die Gegenwart und Anordnung von Spaltstellen erkennen, die von
bestimmten Restriktions-Endonucleasen erkannt werden. Erfindungsgemäß kann diese Allgemeinheit zur Bildung neuer Hybridgene
durch DNA-Rekombination benutzt werden, die bei der mikrobiellen Erzeugung von Hybrid-Leukozyten-Interferonen
brauchbar sind, von denen erwartet werden kann, daß sie in mehr oder weniger großem Ausmaß die antiviralen und andere
Eigenschaften von Interferonen, durch die elterlichen Gene verschlüsselt, zeigen.'Bei bevorzugten Ausführungsformen der
Erfindung können solche Hybrid-Leukozyten-Interferone verstärkte Aktivität relativ zu den durch die elterlichen Gene
verschlüsselten entwickeln.
Die elterlichen Leukozyten-Interferon-Gene, die die Familie
der hier betrachteten Leukozyten-Interferon-Proteine codieren, zeigen individuell natürliche allelomorphe Variationen. Diese
Variationen können durch einen oder mehrere Aminosäure—Unterschied
(e) in der Gesamtproteinsequenz oder durch Lücken, Substitutionen, Einfügungen, Umkehrungen oder zusätzliche Amino-
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säure(η) in der Sequenz nachgewiesen werden. Für jedes elterliche
Leukozyten-Interferon,mit LelF A, LeIF B ... LeIF J usw.
bezeichnet, fallen solche allelomorphen Variationen unter die Bezeichnung oder Definition und damit unter die Erfindung.
Weitere Aufgaben, Vorteile und Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der folgenden näheren Beschreibung und den Figuren;
von diesen zeigt:
Fig. 1 Nucleotidsequenzen der Codierbereiche von 8 Leukozyten-Interferon
("LeIF")-Komplementär-DNA ("cDNA")-Klonen. Von diesen ist eines, entsprechend mit LeiF E bezeichnet,
ein offensichtliches "Pseudogen", das kein aktives Leukozyten-Interferon codiert, während ein weiteres
, LeIF G,weniger als die volle Sequenz für die entsprechende Interferon-Art enthält. Das ATG-Translations-Startkodon
und das Stop - Triplett für jedes LeIF ist unterstrichen.
Fig. 2 Restriktions-Endonuclease-Karten von acht Arten LeIF
geklönter cDNAs (A bis H). Die Klone enthaltende Plasmide wurden nach der dC:dG-Tailingmethode aufgebaut
(D.V. Goeddel et al., Nature 287, 411-416 (198O)). Daher können die cDNA-Inserte mit Pst I herausgeschnitten
werden, d.h. jedes Ende eines jeden Inserts ist eine Pst I-Restriktions-Endonuclease-Spaltstelle. Die
Striche am Ende eines jeden cDNA-Inserts stellen die flankierenden Homopolymer-dCrdG-Schwänze dar. Die Positionen
von Pvu II-, Eco RI- und BgI II-Restriktionsstellen
sind angegeben. Schattierbereiche in der Figur stellen die Codiersequenzen ausgereifter LeIFs dar;
die schraffierten Bereiche zeigen Signal-Peptidcodiersequenzen
an; und die freien Bereiche zeigen nichtcodierende 31- und 5'-Sequenzen.
deren Aminosäure-Sequenzen größenordnungsmäßig 70 % Homologie, relativ zueinander, zeigen, wie von David V. Goeddel et al.
(Nature 290, 20-26 (1981)) offenbart. Gene, die Aminosäuresequenzen verschiedener Leukozyten-Interferone verschlüsseln,
die u.a. mit LeIF A, B, C, D, F, G bzw. H bezeichnet sind, werden aus dem von H. P. Koeffler und D.W. Golde (Science 200,
1153-1154 (1978)), von David V. Goeddel und Sidney Pestka beschriebenen Zellstamm KG-1 erhalten. Der Zellstamm KG1 ist
bei der American Type Culture Collection,ATCC-Zugangsnummer
CRL 8031, hinterlegt worden Solche Gene,in Plasmidträgern für
bakterielle Expression geeignet verbreitet, können dazu verwendet wirden, Wirtsbakterien, vorzugsweise E. coli K-12-,
Stamm 294, American type culture collection-Zugangsnummer 31446, hinterlegt am 28. Oktober 1978, zu transformieren.
Das Zugpferd der rekombinanten DNA-Technologie ist das Plasmid, eine nicht-chromosomale Schleife doppelsträngiger
DNA in Bakterien und anderen Mikroben, häufig in Vielfach-Kopien pro Zelle. In der in der Plasmid-DNA verschlüsselten
Information ist die enthalten, die zum Reproduzieren des Plasmids in Tochterzellen erforderlich ist (d.h. ein "Replicon")
und gewöhnlich ein oder mehrere Auswahlcharakteristika, wie im Falle von Bakterien, die Resistenz gegenüber Antibioticis,
die Klone der das Plasmid von Interesse enthaltenden Wirtszelle zu erkennen und bevorzugt in selektiven Medien zu
züchten erlauben. Die Brauchbarkeit von Plasmiden liegt in der Tatsache, daß sie durch die eine oder die andere Restriktions-Endonuclease
oder "Restriktions - Enzym" spezifisch gespalten werden können, die jeweils eine andere Stelle an der
Plasmid-DNA erkennen. Danach können heterologe Gene oder Genfragmente
in das Plasmid durch das Verbinden der Enden an der Spaltstelle oder an rekonstruierten Enden nahe der Spaltstelle
eingebaut werden. Die DNA-Rekombination erfolgt außerhalb der Zelle,
aber das anfallende "rekombinante" Plasmid kann nach einem
als Transformation bekannten Verfahren in sie eingeführt werden
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und große Mengen des heterologes Gen enthaltenden rekombinanten Plasmids können durch Kultivierung der transformierten
Zellen erhalten werden. Ferner kann, wenn das Gen bezüglich Teilen des Plasmids, die die Transkription und Translation
der verschlüsselten DNA-Botschaft.steuern, geeignet eingesetzt ist, der sich ergebende Expressionsträger tatsächlich
dazu verwendet werden, die Polypeptidsequenz zu produzieren, für die das eingesetzte Gen codiert, ein Verfahren, das als
Expression bezeichnet wird.
Expression beginnt in einem Bereich, der als Promoter bekannt ist, der von RNA-Polymerase erkannt und gebunden wird. In manchen
Fällen, wie beim Tryptophan- oder "trp"-Promoter, der bei der praktischen Durchführung der Erfindung bevorzugt ist,
überlappen sich Promoter-Bereiche mit "Operator"-Bereichen unter Bildung eines kombinierten Promoter-Operators.. Operator
ren sind DNA-Sequenzen, die von sogenannten Repressorproteinen erkannt werden, die dazu dienen, die Frequenz des Beginns
einer Transkription an einem besonderen Promoter, zu regeln. Die Polymerase geht an der DNA entlang und überträgt die im
Codierstrang enthaltene Information vom 51- zum 3'-Ende auf
Messenger-RNA, die wiederum in ein Polypeptid übertragen wird,
das die Aminosäuresequenz besitzt, die die DNA codiert. Jede Aminosäure wird durch ein Nucleotid-Triplett oder "Codon" in
etwas verschlüsselt, was für die vorliegenden Zwecke als "Strukturgen" bezeichnet werden kann, d.h. dem Teil, der die
Aminosäuresequenz des exprimierten Produkts verschlüsselt. Nach der Bindung an den Promoter transkribiert die RNA-PoIymerase
zuerst Nucleotide, eine Ribosomen-Bindestelle verschlüsselnd, dann eine Translationsinitiation oder "Start"-signal
(gewöhnlich ATG, das in der entstehenden Messenger-RNA zu AUG wird), dann die Nucleotid-Codons innerhalb des Strukturgens
selbst. Sogenannte Stop-Codons werden am Ende des Strukturgens transkribiert, worauf die Polymerase eine weitere Sequenz
von Messenger-RNA bilden kann, die aufgrund der Anwesenheit des
Fig. 3 ist ein Vergleich der acht von den Nucleotid-Sequenzen vorausgesagten LelF-Proteinsequenzen. Es werden die
von der IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature empfohlenden einbuchstabxgen Abkürzungen verwendet:
A = Alanin; C = Cystein; D = Asparaginsäure, E = Glutaminsäure; F = Phenylalanin; G = Glycin; H = Histidin;
I = Isoleucin; K = Lysin; L = Leucin; M = Methionin; N = Asparagin; P = Prolin; Q = Glutamin; R = Arginin,
S = Serin; T = Threonin; V = Valin; W = Tryptophan und Y = Tyrosin. Die Zahlen beziehen sich auf die Aminosäureposition
(S bezieht sich.auf.Signalpeptid). Der Strich
. in der 165 Aminosäure-LelF Α-Sequenz an Position 44 wurde
eingeführt, um diese Sequenz mit den 166 Aminosäuresequenzen der anderen LeIFs auszurichten. Die Sequenz
von LeIF E wurde durch Ignorieren des Extra-Nucleotids (Position 187 der Fig. 1) in seinem Codierbereich bestimmt.
Die Sternchen bezeichnen In-Phase-Stop-Codons. Allen LeIFs (ausgenommen das Pseudogen LeIF E)
gemeine Aminosäuren sind auch gezeigt. Die unterstrichenen Reste sind Aminosäuren, die auch in menschlichem
Fibroblasten-Interferon vorhanden sind.
In Fig. 1 entsprechen die Nucleotide +1 bis 69 den S1 bis S23-Aminosäuren der Fig. 3. Das Codon TGT
(Nucleotide 70 bis 72) der Fig. 1 entspricht Cystein (C, Aminosäure 1) der Fig. 3. In Fig. 3 tritt die Pvu II-Restriktions-Endonuclease-Spaltstelle
zwischen den Codons für Aminosäuren 92 und 93 in LeIF A, B, D, F und G auf, d.h. zwischen den Nucleotiden 346 und 347
der Fig.. 1.
Fig. 4 vergleicht die AminosäureSequenzen ausgereifter
Leukozyten-Interferone A und D, wobei ein Fehlen der Aminosäure 4 4 in LoIF A durch Striche angezeigt ist.
Nur solche LeIF D-Aminosäuren, die sich von den entsprechenden
Aminosäuren von LeIF A unterscheiden, sind dargestellt: Die Aminosäuresequenz von LeIF D ist sonst mit der von LeIF A
identisch. Fig. 4 zeigt auch die relative Stellung von BgI II-
und Pvu II-Restriktions-Endonuclease-Spaltstellen, zur Bildung
bevorzugter Hybrid-Leukozyten-Gene nach der Erfindung verwendet, am entsprechenden Gen an.
Die Fig. 5 und 6 veranschaulichen die Ergebnisse von Vergleichstests eines bevorzugten Hybrid-Leukozyten-Interferons gemäß
der Erfindung ("LeIF-A/D") auf Aktivität gegenüber Encephalomyocarditis-Virus
("EMC") und Vesicularstomatitis-Virus ("VSV") in Mauseζeilen.
Die Fig.7 und 8 zeigen die Ergebnisse eines Vergleichstests
mit LeIF-A/D und anderen Interferonen gegenüber EMC-Virus-Infektionen
in Mäusen bzw. Hamstern. Die Daten in Fig. 7 stammen aus Behandlungen i.p. 3h vor der Infektion. Die Dosierungen
von LeIF-A/D und LeIF-A sind, wie an Wish-Zellen titriert.
Fig. 9 zeigt die DNA-Sequenzen von fünf LeiF-Proteinen
einschließlich die Typen I und J,
Bei den beschriebenen Arbeiten wurden zwei Mikroorganismen eingesetzt: E. coli x1776, wie in der US-PS 4 190 495 beschrieben,
und E. coli K-12 Stamm 294 (Ende A, thi , hsr , hsm^.) , wie
in der GB-PS 2 055 382A beschrieben. Beide sind bei der American Type Culture Collection, ATCC-Zugangsnummer 31537 und 31446,
am 3. Juli 1979 bzw. 28. Oktober 1978 hinterlegt worden. Alle Arbeiten über rekombinante DNA erfolgten nach anwendbaren
Richtlinien der National Institutes of Health.
Die Erfindung wird in ihren am meisten bevorzugten Ausführungsformen unter Bezugnahme auf E. coli beschrieben, nicht nur mit
den oben beschriebenen Stämmen E. coli χ 1776 und E. coli K-12,
" τ" Ah,
Stamm 294, sondern auch mit anderen bekannten E. coli-Stämmen,
wie E. coli B, oder anderen Mikroben-Stämmen, von denen viele
hinterlegt und (möglicherweise) von anerkannten Hinterlegungsstellen für Mikroorganismen, wie der American Type Culture
Collection, ATCC, erhältlich sind. (Vgl. die ATCC-Katalogaufstellung
und auch die DE-OS 2 644 432). Diese'weiteren Mikroorganismen
umfassen z.B. Bazillen , wie Bacillus subtilis, und andere Enterobacteriaceae, unter denen beispielsweise
Salmonella typhimurium und Serratia marcescens erwähnt werden können, unter Verwendung von Plasmiden, die reduplizieren
und heterologe Gensequenzen exprimieren können. Hefe, wie Saccharomyces cerevisiae, kann auch vorteilhaft als Wirtsorganismus
bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Interferonproteine durch Expression von sie codierenden Genen unter der
Kontrolle eines Hefepromoters verwendet werden.
Die LeIF-Hybriden werden erfindungsgemäß hergestellt, indem
Die Restriktions-Endonuclease-Spaltstellen, die gewöhnlich in den einzelnen elterlichen Genen liegen, und deren jedes
Ende in Verbindung mit den gleichen Stellen in Träger-Expressions-Plasmiden
(Vektoren) genutzt werden. Beispielsweise kann das große (ca. 3900 bp) Fragment eines Xba I-Pst I-Verdauungsprodukts
des pLeIF-A trp 25-Expressionsplasmids mit Xba I-Pvu
II- und Pvu II-Pst I-Verdauungsfragmenten der verschiedenen LeIF-Elterngene zu Expressionsplasmiden verbunden werden,
die das -entsprechende Hybrid-LelF erhältlich machen*
Jedes LelF-Expressionsplasmid wurde unabhängig mit Verdauungsfragmenten aufgebaut, die aus verschiedenen LelF-Plasmiden
isoiert waren, z.B. pLeIF A trp 25, pLeIF B trp 7, pLeIF C trp 35, pLeIF D trp 11, pLeIF F trp 1, pLeIF G, pLeIF H und
pLeiF I usw., deren Aufbau in Nature 287, 411 (1980) beschrieben ist,oder aus pBR322, dessen Aufbau in Gene 2^ 95
(1977) beschrieben ist. In bestimmten dieser Plasmide bezeichnet "trp" ein Tryptophanpromoter-Operator-System, für
bakterielle Expression am meisten bevorzugt, wie in der veröffentlichen.
Europäischen Patentanmeldung Nr. 36 776 beschrieben ,
Direkte Expression eines ersten reifen Leukozyten-Interferons
Die Arbeitsweise, die befolgt wurde, um LeIf A direkt als
reifes Interferon-Polypeptid auszudrücken, umfaßte die Kombination
von synthetischen (N-terminalen) und komplementären DNAs..
Eine Sau 3a-Restriktion-Endonuclease-Stelle wird passenderweise zwischen Codons 1 und 2 von Le-IF A angeordnet. Zwei synthetische
Desoxyoligonucleotide wurden geschaffen, die ein ATG-Translations-Startcodon aufweisen, das Codon für Aminosäure 1
(Cystein) wieder herstellen und ein Eco Rl-kohaesives Ende schaffen. Diese Oligomeren wurden an ein 34 b.p. Sau 3a - Ava II-Fragment
von pL31 geheftet. Das anfallende 45 b.p.-Produkt wurde an zwei weitere DNA-Fragmente gehängt, um ein 865-Basenpaar-synthetisch/natürliches
Hybridgen aufzubauen, das Le-IF A codiert und durch Eco RI- und Pst I-Restriktionsstellen gebunden
wird. Dieses Gen wurde zwischen Eco RI und Pst I-Stellen
in pBR322 eingefügt, um das Plasmid pLe-IF A1 zu ergeben.
Das Plasmid pGM1 trägt das E. coli-Tryptophan-Operon mit der
Fehlstelle ALE1413 (G.F. Miozzari et al., J. Bacteriology 133,
1457-1466 (1978)) und führt folglich zur Expression eines Fusionsproteins mit den ersten 6 Aminosäuren des trp-'Leaders
und etwa dem letzten Drittel des trp-E-Polypeptids (nachfolgend im Zusammenhang als LE1 bezeichnet) sowie das trp-D-Polypeptid
in seiner Gesamtheit, alle unter der Kontrolle des trp-Promoter-Operator-Systems.
20 pg des Plasmids wurden mit dem Restriktionsenzym Pvu II verdaut, das das Plasmid an fünf
3UU69 _ lox_
Stellen spaltet. Die Genfragmente wurden sodann mit EcoRI-Verknüpfern
(bestehend aus einem selbst-komplementären Oligonucleotid der Sequenz pCATGAATTCATG) unter Bildung einer
EcoRI-Spaltstelle für ein späteres Klonen zu einem Plasmid
mit einer EcoRI-Stelle kombiniert. Die 20 ^g der aus pGMi
erhaltenen DNA-Fragmente wurden mit 10 Einheiten T^-DNA-Ligase in Gegenwart von 200 pico-Mol des 5'-phosphorylierten synthetischen
Oligonucleotids pCATGAATTCATG und in 20 pl Τ,-DNA-Ligase-Puffer
(20 mMol Tris, pH 7,6, 0,5 mMol ATP, 10 mMol
MgCl0, 5 mMol Dithiothreitol) bei 4°C über Nacht behandelt-Die
Lösung wurde dann 10 min auf 70 C erwärmt, um das Binden aufzuhalten. Die Bindeglieder wurden durch EcoRI-Abbau gespalten
und die Fragmente, nun mit EcoRI-Enden, wurden mittels
5 % Polyacrylamidgel-Elektrophorese (nachfolgend "PAGE") aufgetrennt und die drei größten Fragmente vom Gel zunächst
durch Anfärben mit Ethidiumbromid, Lokalisieren der Fragmente mit UV-Licht und Herausschneiden der interessierenden
Teile aus dem Gel isoliert. Jedes Gelfragment wurde mit 300 ul 0,IxTBE in einen Dialysebeutel gebracht und bei 100 V
1 h in 0,1xTBE-Puffer der Elektrophorese unterworfen (TBE-Etffer
enthält 10,8 g Tris-Base, 5,5 g Borsäure, 0,09 g Na-EDTA
in 1 1 H2O). Die wässrige Lösung wurde aus dem Dialysebeutel
geholt, mit Phenol extrahiert, mit Chloroform extrahiert und 0,2-molar an Natriumchlorid gemacht und die DNA nach Äthanol-Fällung
in Wasser gewonnen. Das trp-Promoter-Operator-haltige Gen mit EcoRI-kohäsiven Enden wurde in der nachfolgend beschriebenen
Arbeitsweise identifiziert, die den Einbau von Fragmenten in ein Tetracyclin-empfindliches Plasmid zur Folge
hat, das nach dem Einbau von Promoter-Operator Tetracyclinresistent
wird.
Das Plasmid pBRHi (R.I. Rodriguez et al., Nucleic Acids Research
6>, 3267-3287 (1979)) drückt Ampicillin-Resistenz aus und enthält das Gen für Tetracyclin-Resistenz, da aber kein zugeordneter
Promoter vorliegt, kommt diese Resistenz nicht zum Aus-
# * HI»
31U469
druck. Das Plasmid ist folglich Tetracyclin-empfindlich. Durch
Einführen eines Promoter-Operator-Systems an der EcoRI-Stelle
kann das Plasmid Tetracyclin-resistent gemacht werden.
Ein pBRHi wurde mit EcoRI verdaut und das Enzym durch Phenolextraktion
und anschließende Chloroform-Extraktion entfernt und nach üthanolfällung in Wasser gewonnen. Das anfallende DNA-Molekül,
wurde in getrennten Reaktionsgemischen jeweils mit den drei oben erhaltenen DNA-Fragmenten kombiniert und mit T,-DNA-Ligase,
wie zuvor beschrieben, verknüpft. Die im Reaktionsgemisch vorliegende DNA wurde zum Transformieren eines angemessenen
E. coli-K-12-Stammes 294 (K. Backman et al., Proc. Natl,
Acad. Sei. USA 21f 4174-4198 (1976)) nach Standard-Techniken
(V. Hershfield et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 7J_, 3455-3459
(1974)) verwendet und die Bakterien auf LB-Platten aufgebracht, die 20 ug/ml Ampicillin und 5 pg/ml Tetracyclin enthielten.
Mehrere Tetracyclin-resistente Kolonien wurden ausgewählt, Plasmid DNA isoliert und die Anwesenheit des gewünschten
Fragments durch Restriktions-Enzymanalyse bestätigt. Das anfallende Plasmid wird mit pBRHtrp bezeichnet.
Ein EcoRI- und BamHI-Abbauprodukt des viralen Genoms oder
Chromosomensatzes von Hepatitis B wurde nach herkömmlichen Maßnahmen erhalten und zu EcoRI und BamHI-Stellen von Plasmid
pGH6 (D.V. Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979)) zu dem
Plasmid pHS32 geklont. Das Plasmid pHS32 wurde mit Xbal gespalten,
mit Phenol extrahiert, mit Chloroform extrahiert und mit Äthanol gefällt. Dann wurde es mit 1 μΐ E. coli-Polymerase
I, Klenow-Fragment (Boehringer, Mannheim) in 30 ml Polymerase-Puffer (50 mMol Kaliumphosphat, pH 7,4, 7 mMol
MgCl2f 1 mMol ß-Mercaptoäthanol) mit 0,1 mMol dTTP und 0,1
mMol dCTP 30 min bei O0C, dann 2 h bei 37°C behandelt. Diese
Behandlung führt dazu, daß zwei der vier Nucleotide komplementär zu dem vorragenden 5'-Ende der Xbal-Spaltstelle aufgefüllt
wurden in;
5' | CTAGA ■— | 5' | CTAGA |
3· | T | 31 | TCT |
Zwei Nucleotide, dC und dT, wurden eingeführt und bildeten ein Ende mit zwei vorragenden 5'-Nucleotiden. .Dieser lineare
Rest von PlasmidpHS32 (nach Phenol- und Chloroform-Extraktion
und Rückgewinnung in Wasser nach Äthanol-Fällung) wurde mit EcoRI gespalten. Das große Plasmid-Fragment wurde vom kleineren
EcoRI-Xbal-Fragment durch PAGE getrennt und nach Elektroelution
isoliert. Dieses DNA-Fragment aus pHS32 (0,2 pg) wurde unter Bedingungen ähnlich den oben beschriebenen an das
EcoRI-Taq I-Fragment des Tryptophan-0perons (ca. 0,01 ug),
aus pBRHtrp stammend, gebunden.
Bei dem Verfahren zum Binden des Fragments von pHS32 an
Eco RI-Taq I-Fragment,wie oben beschrieben, wird das vorragende
Taq I-Ende an das verbleibende vorragende EndevoriXbal
gebunden," obgleich es nicht vollständig nach Watson-Crick Basen-gepaart ist:
—T . CTAGA— —TCTAGA
—AGC TCT— —AGCTCT
Ein Teil dieses Binde-Reaktionsgemischs wurde in E. coli 294-Zellen
transformiert, wärmebehandelt und auf Ampicillin enthaltende LB-Platten gebracht. 24 Kolonien wurden ausgewählt,
in 3 ml LB-Medium vermehrt und Plasmid isoliert. Bei sechs von ihnen wurde festgestellt, daß die Xbal-Stelle durch E. colikatalysierte
DNA-Reparatur und Replikation regeneriert war:
TCTAGA TCTAGA -—
AGCTCT AGATCT-
Auch wurde gefunden, daß diese Plasmide sowohl mit EcoRI als
auch mit Hpal spalteten und die erwarteten Restriktionsfragmente ergaben. Ein Plasmid, als pTrp 14 bezeichnet, wurde zur
Expression heterologer Polypeptide verwendet, wie nachfolgend erörtert.
Das Plasmid pHGH 107 (D.V. Goeddel et al., Nature 2j51_, 544
(1979)) enthält ein Gen für menschliches Wachstumshormon aus 23 Aminosäurecodons, hergestellt aus synthetischen DNA-Fragmenten
und 163 Aminosäurecodons, erhalten aus Komplementär-DNA,
hergestellt über reverse Transkription von menschlicher Wachstumshormon-mes
senger-ENA. Dieses Gen enthält, obgleich die Codons der "Vor"-Sequenz von menschlichem Wachstumshormon
fehlen, ein ATG-Translations-Startcodon. Das Gen wurde aus
10.ug pHGH 107 nach Behandlung mit EcORI und dann E. coli-Polymerase-I-Klenow-Fragment
und dTTP und dATP, wie oben beschrieben, isoliert. Nach Phenol- und Chloroformextraktion
und Äthanolfällung wurde das Plasmid mit BamHI behandelt.
Das Human-Wachstumshormon ("HGH")-Gen-enthaltende Fragment wurde durch PAGE isoliert, dann folgte Elektroelution. Das
anfallende DNA-Fragment enthält auch die ersten 350 Nucleotide des Tetracyclin-resistenten Strukturgens, ihm fehlt
aber das Tetracyclin-Promoter-Operator-System, so daß beim anschließenden Klonen zu einem Expressionsplasmid die das
Insert enthaltendenPlasmide durch die Wiederherstellung der Tetracyclin-Resistenz lokalisiert werden können. Da das EcoRI-Ende
des Fragments durch die Klenow-Polymerase I-Arbeitsweise auf gefüllt worden ist, hat das Fragment ein stumpfes
und ein kohäsives Ende, was die richtige Orientierung bei späterem Einschieben in ein Expressionsplasmid gewährleistet.
Sodann wurde das Expressionsplasmid pTrp14 hergestellt, um
das oben hergestellte HGH-Gen-haltige Fragment zu erhalten. So wurde pTrp14 mit Xbal verdaut und die erhaltenen kohäsiven
Enden nach der Klenow-Polymerase I-Arbeitsweise unter Verwendung
von dATP, dTTP, dGTP und dCTP gefüllt. Nach der Phenol- und Chloroformextraktion und der Äthanolfällung wurde die
anfallende DNA mit BamHI behandelt, und das anfallende große Plasmid-Fragment wurde durch PAGE und. Elektroelution isoliert..
Das aus pTrp14 abgeleitete Fragment hatte ein stumpfes und ein
kohäsives Ende, was die Rekombination in geeigneter Orientie-'
rung mit dem das HGH-Gen enthaltenden Fragment, zuvor beschrieben, erlaubt.
Das HGH-Gen-Fragment und das pTrp14 ΛXba-BamHI-Fragment wurden
kombiniert und unter ähnlichen Bedingungen, wie oben beschrieben, aneinander gehängt. Die aufgefüllten Xbal- und EcoRI-Enden
verbanden-sich miteinander über die Verbindung über die stumpfen
Enden unter Rückbildung sowohl der Xbal- als auch der EcoRI-Stelle:
Xbal aufgefüllt EcoRI aufgefüllt HGH-Gen-Anfang
—TCTAG AATTCTATG TCTAGAATTCTATG —
—AGATC TTAAGATAC — —AGATCTTAAGATAC —
Xbal EcoRI
Dieser Aufbau bildet auch wieder das Tetracyclin-resistente Gen zurück·. Da das.Plasmid pHGH 107 Tetracyclin-Resistenz von einem
Promoter vor dem HGH-Gen (dem Lac-Promoter)exprimiert, ermöglicht dieser Aufbau, mit pHGH 207 bezeichnet, die Expression
des Gens für Tetracyclin-Resistenz unter der Kontrolle des Tryptophan-Promoter-Operators. So wurde das Bindegemisch in.
E. coli 294 transformiert und Kolonien auf LB-Platten, die
5 ug/ml Tetracyclin enthielten, selektiert.
Das Plasmid pHGH2O7 wurde mit Eco RI verdaut und der trp-Promoter,
ein 300 b.p. Eco RI-Fragment enthaltend, durch PAGE
3U4/'59 i^ /ff
und anschließende Elektroelution gewonnen. Das 300 b.p. Eco RI-Fragment
enthält den E. coli-trp-Promoter, Operator und trp-Leaderribosomen-Bindestelle,
ihm fehlt aber eine ATG-Sequenz für das Einführen der Translation. Dieses DNA-Fragment wurde in
die Eco RI-Stelle von pLe-IF A geklont.
Das eben erwähnte trp-Fragment ist ein Analogon des E. coli-Tryptophan-Operons,
dessen sogenannter trp-Abschwächer beseitigt worden ist, um Expressionswerte kontrollierbar zu erhöhen.
Expressionsplasmide, die das modifizierte trp-Regulon enthalten,
können in Nährmedien, die zusätzliches Tryptophan in genügenden Mengen zum Unterdrücken des Promoter-Operator-Systems
enthalten, bis auf vorbestimmte Werte vermehrt werden, dann von Tryptophan befreit werden, um das System von Repressor zu
befreien, und die Expression des gewünschten Produkts veranlassen. . '
Im einzelnen wurden 250 pg Plasmid pL31 mit Pst I verdaut und
das 1000 b.p.-Insert durch Gelelektrophorese an einem 6%-Polyacrylamidgel
isoliert. Etwa 40 pg Insert wurden aus dem Gel elektroeluiert und in drei Teilmengen zu weiterem Aufschluß
unterteilt: a) eine 16 pg-Probe· dieses Fragments wurde mit
40 Einheiten BgI II 45' bei 37°C teilweise verdaut und das
Reaktionsgemisch an einem 6%_Polyacrylamidgel gereinigt. Etwa 2 pg des gewünschten 670 b»p.-Fragments wurden gewonnen,
b) Eine weitere Probe (8 pg) des 1000 b.p.-Pst I-Inserts wurde
mit Ava II und BgI II behandelt. 1 pg des angegebenen 150
b.p.-Fragments wurde nach Gelelektrophorese gewonnen, c) 16 pg des 1000 b.p.-Stücks wurden mit Sau 3a und Ava II behandelt.
Nach Elektrophorese an einem 10%-Polyacrylamidgel wurden etwa
0,25 pg (ca. 10 pMol) des 34 b.prFragments gewonnen. Die zwei
angegebenen Desoxyoligonucleotide, 5'-dAATTCATGTGT (Fragment 1)
und 5'-dGATCACACATG (Fragment 2) wurden nach der Phosphotriester-Methode
(Maxam und Gilbert, Methods Enzymol. 6_5, 499-560 (198O))
synthetisiert. Das Fragment 2 wurde wie folgt phosphoryliert.
200 pi (ca. 40 pMol) ( Jr32P) ATP (Amersham, 5000 Ci/mMol)
wurden durchgetrocknet und erneut in .30 pi 60 mmol. Tris-HCl
(pH 8), 10 mmol. MgCl2, 15 mmol. ß-Mercaptoäthanol, 100 pMol
DNA-Fragment und 2 Einheiten T4-Polynucleotidkinase enthaltend, suspendiert. Nach 15 min bei 37°C wurde 1 pl 10 mmol. ATP zugesetzt
und die Reaktion weitere 15 min ablaufen gelassen. Das Gemisch wurde dann 15 min auf 70°C erwärmt, mit 100 pMol
5'-OH-Fragment 1 und 10 pMol des 34 b.p.-Sau 3a-Ava II-Fragments
zusammengebracht» Das Binden erfolgte 5 h bei 4°C in 50 pl 20 mmol. Tris-HCl (pH 7,5), 10 mmol. MgCl2, 10 mmol.
Dithiothreitol, 0,5 mmol. ATP und 10 Einheiten T4-DNA-Ligase.
Das Gemisch wurde an einem 6-Polyacrylamidgel elektrophoretisch
behandelt, und das 45 b.p.-Produkt durch Elektroelution gewonnen.
86O.000 Cerenkov-cpm wurden gewonnen (ca. 30 ng, 1 pMol)
kombiniert mit 0,5 ug (5 pMol) des 150 b.p.-Ava II-Bgl II-Fragments
und 1 ug (2 pMol) des 670 b.p.-Bgl-II-Pst-I-Fragments.
Das Binden erfolgte bei 20°C 16 h unter.'Verwendung von 20 Einheiten
T4-DNA-Ligase. Die Ligase wurde durch lOminütiges Erwärmen auf 65 C inaktiviert. Das Gemisch wurde dann mit Eco RI
und Pst I zum Beseitigen von Polymeren des Gens verdaut. Das Gemisch wurde durch 6 % Polyacrylamidgel-Elektrophorese gereinigt.
36.000 cpm (ca. 0,04 pMol, 20 ng) 865 b.p.-Produkt wurden isoliert. Die Hälfte hiervon (10 ng) wurde an pBR322
(0,3 pg) zwischen . Eco RI und Pst I-Stellen gebunden. Die
Transformation von E. coli 294 ergab 70 Tetracyclin-resistente
Ampicillin-empfindliche Transformanten. Aus 18 dieser Transformanten
isolierte Plasitiid-DNA wurde mit Eco RI und Pst I
verdaut. 16 der. 18 Plasmide hatten ein Eco RI-Pst I-Fragment
von 865 b.p. Länge. 1 pg von einem von diesen, pLe-IF A1., wurde mit Eco RI verdaut und an ein 300 b.p. Eco RI-Fragment
(0,1 pg), das E. coli-trp-Promoter und trp-Leader-Ribosomen-Bindestelle
enthielt,hergestellt wie oben beschrieben, gebunden.
Den trp-Promoter enthaltende Transformanten wurden'mit einer
32
P-trp-Sonde nach der Grunstein-Hogness-Kolonie-Screeriing-
Methode identifiziert - Grunstein et al. (Proc.
31U469
Natl„ Acad. Sei. (USA) 12_, 3961 (1975)). Eine asymmetrisch
angeordnete Xba-I-Stelle im trp-Fragment erlaubte die Bestimmung
von Rekombinanten, in denen der trp-Promoter in Richtung
des Le-IF-Α-Gens orientiert war.
Extrakte wurden für den IF-Assay wie folgt hergestellt: 1 ml-'
Kulturen wurden in L-Brühe mit 5 ug/ml Tetracyclin zu einem A5CQ von etwa 1,0 gezüchtet, dann in 25 ml M9-Medien mit 5 ug/ml
Tetracyclin verdünnt. 10 ml-Proben wurden durch Zentrifugieren
gewonnen, wenn Acco 1/0 erreichte, und Zellkuchen wurden in
1 ml 15%iger Saccharose, 50mmol. Tris-HCl (pH 8,0), 50 mmol.
EDTA suspendiert. 1 mg Lysozym wurde zugesetzt, und nach 5 min
bei 0 C wurden die Zellen durch Beschallung aufgebrochen. Die
Proben wurden 10 min bei 15.000 UpM in einem Sorvall-SM-24-Rotor
zentrifugiert. Die Interferon-Aktivität in den überstehenden Flüssigkeiten wurde durch Vergleich mit Le-IF-Standards mit Hilfe
des Hemmtests des cytopathisehen Effekts (CPE) bestimmt. Zur
Bestimmung der Zahl der IF-Moleküle pro Zelle wurde eine Le-IF-
spezifische Aktivität von 4x10 Einheiten/mg verwendet (Rubinstein et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 76, 640 (1979)).
Der Klon pLe-IF-A-trp 25, in den der trp-Promoter in der gewünschten
Orientierung eingesetzt worden war, ergibt hohe
Aktivitätswerte (sogar 2,5x10 Einheiten/1). Das von E. coli K-12-Stamm
294/pLe-IF A-trp 25 gebildete IF verhält sich wie authentisches Human-Le-IF; es ist gegenüber einer Behandlung
bei pH 2 stabil und wird durch Kaninchen-Antihuman-Leukozyten-Antikörper neutralisiert. Das Interferon hat ein wahrnehmbares
Molekulargewicht von etwa 20.000.
Die Isolierung von cDNAs für weitere Leukozyten-Interferone
DNA aus dem vollständig charakterisierten Le-IF A cDNA-haltigen
Plasmid wurde mit Pst I herausgeschnitten, elektrophoretisch
isoliert und nach einer veröffentlichten Arbeitsweise (Taylor
32
et al., Biochem. Biophys. Acta. 442, 324 (1976)) mit· P markiert.
Die radioaktiv markierte DNA wurde als Sonde für das Screening weiterer E. coli 294-Transformanten durch.ein in situ-Kolonie-Testverfahren,
Grunstein et al., wie oben, verwendet. Kolonien wurden isoliert, die mit der Sonde in unterschiedlichen
Mengen hybridisierten. Plasmid-DNÄ aus diesen Kolonien und die oben erwähnten 10 hybridisierenden Kolonien
wurde durch Herausschneiden mit Pst isoliert und nach drei verschiedenen Methoden charakterisiert. Zuerst wurden diese
Pst-Fragmente durch ihre Restriktions-Endonuclease-Abbaumuster mit den Enzymen BgI II, Pvu II und Eco RI charakterisiert.
Diese Analyse erlaubte die Klassifizierung von wenigstens verschiedenen Typen (Le-IF A, Le-IF B, Le-IF C, Le-IF D,
Le-IF E, Le-IF F, Le-IF G und Le-IF H), was der Lokation verschiedener
Restriktionsschnitte relativ zu der derzeit bekannten Vorsequenz und Codiersequenz von Le-IF A nahekommt.
Einer von diesen, Le-IF D, ist vermutlich identisch mit dem von Nagata et al., Nature 284, 316 (1980) beschriebenen.
Sodann wurden bestimmte der DNAs nach einem veröffentlichten Hybridisierungs-Auswahltest, Cleveland et al., Cell £0, 95
(1980) ,auf ihr Vermögen zur selektiven Entfernung von Le-IF mRNA
aus Poly-A-haltiger KG-1-ZeIl-RNA getestet. Bei diesem Test
waren Le-IF A, B, C und F positiv. Drittens wurden die letzteren Pst-Fragmente in" ein Expressionsplasmid insertiert, E.coli
mit dem Plasmid exprimiert und die Fragmente ausgedrückt.
Die Expressionsprodukte, vermutlich Vor-Interferone, waren alle positiv beim CPE-Test auf Interferon-Aktivität, wenngleich
nur am Rande aktiv im Falle des Le-IF-F-Fragments. Außerdem wurden alle beschriebenen Le-IF-Typen in Sequenzen
aufgeteilt.
31U469
Zweites reifes Leukozyten-Interferon
Die Sequenz des isolierten Fragments mit dem Gen für reifes Le-IF-B zeigt, daß die ersten 14 Nucleotide der
Typen A und B identisch sind. Wir schlugen daher vor, ein Fragment aus pLe-IF A 25 zu isolieren, das den trp-Promoter-Operator,
Ribosomen-Bindestelle und den Beginn des Le-IF (A=B)-Gens trägt, und dieses mit dem übrigen Teil der B-Sequenz in
einem Expressionsplasmid zu kombinieren.
Um das etwa 950 b.p. Sau 3a — Pst I-Fragment aus der in Fig.
7a dargestellten Sequenz zu erhalten, waren mehrere Schritte nötig aufgrund des Vorliegens einer oder mehrerer störender
Sau Sa-Restriktionsstellen, d.h.:
"1. Die folgenden Fragmente wurden isoliert:
a) 110 b.p. aus Sau 3a — Eco RI;
b) 132 b.p. aus Eco RI — Xba;
c) über 700 b.p. aus XBa — Pst.
2. Die Fragmente (1a) und (1b) wurden gebunden und mit Xba und BgI -II geschnitten, um Selbstpolymerisation durch Sau 3a
und Xba-Endstellen auszuschließen (die relevante Sau Sa-Stelle
war innerhalb einer BgI II-Stelle; BgI II-schnitte
hinterlassen ein Sau·3a-kohäsives Ende). Ein 242 b.p.-Fragment.wurde
isoliert.
3. Die Produkte von (2) und (1c) wurden verbunden und mit Pst I und BgI II geschnitten, wiederum, um Selbstpolymerisation
zu verhindern. Ein Fragment von etwa 950 b.p., Sau 3a - Pst I , wurde isoliert. Dieses Fragment umfaßte
den Teil des Le-IF-B-Gens, den Le-IF A nicht hatte.
4. Ein etwa 300 b.p.-Fragment (Hind III — Sau 3a) mit trp-Promoter-Operator,
Ribosomen-Bindestelle, ATG-Startsignal
und Cysteincodon von Le-IF A wurde aus pLe-IF A 25 isoliert.
5. Ein etwa 3600 b.p.-Fragment Pst I — Hind III wurde aus pBr 322 isoliert. Dies umfaßte das Replikon und codierte
die Tetracyclin-,nicht aber Ampicillin-Resistenz.
6. Die in den Stufen 3, 4 und 5 erhaltenen Fragmente wurden dreifach verbunden und mit diesem Plasmid E. coli K-12- .
Stamm 294 transformiert.
Kleine Mengen Trans formant en wurden minigetestet, Birnboim et al. ,
Nucleic Acid Research Ί_, 1513 (1979) , und Plasmid-Proben wurden
mit Eco RI verdaut. Das verdaute Material lieferte 3 Fragmente, charakteristisch für
1) das Eco-RI-Eco RI-trp-Promoter-Fragment; 2) das innere Eco
RI — Eco RI-Fragment von pL4; und 3) das Fragment vom Protein-Translations-Startsignal
bis zur Eco Rl-Spaltstelle von pL4.
Beim CPE-Test ergeben bakterielle Extrakte von Klonen, hergestellt
in der obigen Weise, typischerweise Testwerte von etwa 10x10 Einheiten Interferon-Aktivität pro 1 bei A550 = 1. Ein
so hergestellter repräsentativer Klon ist 294/pLIF B trp 7.
Weitere reife Leukozyten-Interferone
Weitere Gen-Fragmente voller Länge, die andere Le-IF-Typen haben,
können maßgeschneidert und in Expressionsträger zur Expression, wie im Falle von Le-IF A, gebracht werden. Vollständige
Sequenzaufklärung nach herkömmlichen Maßnahmen wird zeigen, ob eine Restriktionsstelle nahe genug dem ersten Aminosäurecodon
des reifen Interferon-Typs liegt, um eine be-
3U4469
queme Zuflucht zu der Lösung zu ermöglichen, die Beseitigung
der Vorsequenz durch Restriktionsschnitt und Ersatz der Codons aminoendständig zusammen mit der Vorsequenz verlorengegangenen
Aminosäurecodona durch Anhängen eines synthetischen DNA-Fragments,
wie oben beschrieben, anzuwenden. Geht dies nicht, kann die oben beschriebene Arbeitsweise von Kleid et al. angewandt
werden. Kurz zusammengefaßt gehört hierzu die Spaltung des die Vorsequenz enthaltenden Fragments genau vor dem Punkt,
an dem der Codon für die erste Aminosäure des reifen Polypeptids beginnt, und zwar durch
1. Umwandeln der doppelsträngigen DNA in Einzelstrang-DNA in
einem Bereich um diesen Punkt herum;
2„ Hybridisieren des in Stufe 1 gebildeten Einzelstrang-Bereichs
mit einer komplementären Starter-Sequenz von Einzelstrang-DNA, wobei das 5'-Ende des Starters dem Nucleotid gegenüberliegt,
das an die beabsichtigte Spaltungsstelle grenzt;
3. Wiederherstellung des Teils des zweiten Stranges,in Stufe
eliminiert, der in 3'-Richtung des Starters liegt, durch Reaktion mit DNA-Polymerase in Gegenwart von 'Adenin, Thymin,
Guanin und Cytosin enthaltenden Desoxynucleotid-triphosphaten und
4. Abbauen der verbleibenden Einzelstranglänge der DNA, die über den gewünschten Spaltungspunkt hinwegreicht.
Ein kurzes Stück synthetischer DNA, das am 3'-Ende des codierenden
Stranges mit dem Translations-Startsignal ATG endet, kann dann, z.B. durch Verbinden mit dem stumpfen Ende, an das anfallende
maßgeschneiderte Gen für die reifen Interferone gebunden werden, und das Gen in ein Expressionsplasmid eingesetzt
und unter die Kontrolle eines Promoters und die zugehörige Ribosomen-Bindestelle gebracht werden.
Ähnlich wie oben wurden Genfragmente mit Codierung für Le-IF-C und Le-IF-D in geeigneter Weise für direkte bakterielle
Expression aufgebaut . Die Expressionsstrategie für diese zusätzlichen Leukozyten-Interferone beinhaltete in jedem Falle
den Rückgriff auf das etwa 300 b.p.-Fragment (Hind III — Sau 3a>
mit dem trp-Promoter-Opexator, Ribosomen-Bindestelle, ATG-Startsignal und Cysteincodon von Le-IF A von pLe-IF A25. Hiermit
wurden Genfragmente aus weiteren Interferongenen kombiniert, die ihre jeweiligen Aminosäure-Sequenzen über das allen gemeine
anfängliche Cystein hinaus codieren. Jedes anfallende Plasmid wurde zur Transformation von E. coli K-12 Stamm 294
verwendet. Bindungen zur Bildung der jeweiligen Gene waren wie folgt: ·
Le IF-C
Man isoliert "die folgenden Fragmente aus pLe IF-C:
(a) 35 b.p. von Sau 3a bis Sau -96
(b) 900 b.p. Sau 96 bis Pst I
(c) Man isoliert ein etwa 300 b.ρ.-Fragment (Hind Ill-Sau 3a)
aus pLe IF A-25 wie in Teil N (4) oben.
(d) Man isoliert das etwa 3600 b.p.-Fragment von Teil N [5)
oben.
Konstruktion
1) Man verknüpft (a) und (c) . Man spaltet mit BgI II, Hind III
und isoliert das Produkt von etwa 335 b.p. (Basenpaaren).
2) Dreifachverknüpfung von 1) + (b) + (d) und Transformieren von E. coli mit dem erhaltenen Plasmid.
Ein so hergestellter repräsentativer Klon ist E. coli K-12
Stamm 294/pLe IF C trp 35.
3UU69
• ·
Le-IF D
Man isoliert aus pLe'IF-D:
(a) 35 b.p. von Sau 3a bis Ava II
(b) 150 b.p. von Ava II bis BgI II
(c) ca. 700 b.p. von BgI II bis Pst I
Man isoliert aus pLe IF A25:
(d) 300 b.p. von Hind III bis Sau 3a
Man isoliert aus PBr 322:
(e) etwa 3600 b.p. von Hind III bis Pst I
Konstruktion
1) Man verknüpft (a) + (b) , spaltet mit BgI II und reinigt:
185 b.p.-Produkt (1).
2) Man verknüpft 1) + (d) , spaltet mit Hind III, BgI II und
reinigt.das ca. 500 b.p.-Produkt (2).
3) Man verbindet (2) + (c) + (e) und transformiert E. coli
mit dem anfallenden Plasmid.
Ein so hergestellter repräsentativer Klon ist E. coli K-12
Stamm 294/pLeIF D trp 11.
Le-IF F
Das Le-IF F enthaltende Fragment kann zur direkten Expression durch Wiederzusammensetzen zurechtgeschnitten werden, bequem
gemacht durch die vollständige Homologie von Aminosäuren 1-13
von Le-IF B und Le-IF F. Ein trp-Promoter-haltiges Fragment
(a) mit geeignet konfigurierten Enden wird aus pHGH 207, oben
31U469
beschrieben, über Pst I und Xba I-Behandlung mit anschließender
Isolierung des ca. 1050 b.p.-Fragments erhalten. Ein zweites Fragment, (b) wird als größeres der Fragmente aus dem Pst I-
und B.gl II-Abbau des Plasmids pHky 10 erhalten, ein Derivat
von pBR322, das eine BgI II-Stelle zwischen dem Tetracyclinresistenten
Promoter und dem Strukturgen enthält. Fragment (a) enthält etwa die Hälfte des die Ampicillin-Resistenz
codierenden Gens; Fragment(b) enthält den Rest jenes Gens und das gesamte Gen für die Tetracyclin-Resistenz, ausgenommen
den zugehörigen Promoter. Die Fragmente (a) und (b) werden über T4-Ligase kombiniert und das Produkt mit Xba I und BgI II
behandelt, um Dimerisierung zu beseitigen, was zu einem Fragment (c) mit dem trp-Promoter-Operator und Genen für Tetracyclin-
und Ampicillin-Resistenz führt.
Ein Fragment (d) von etwa.580 b.p. wird über Ava II und BgI II-Abbau
von pLe IF-F erhalten. Es weist Codons für Aminosäuren 14 - 166 von Le-IF F auf.
Ein Fragment (e) (49 b.p.) wird durch Xba I und Ava II-Abbau
von pLe-IF B erhalten. Fragment (e) codiert die Aminosäuren 1-13 von Le-IF F.
Fragmente (c), (d) und (e) werden in Gegenwart von T4-Ligase dreifach verbunden.Die aneinanderhängenden Enden der jeweiligen
Fragmente sind so, daß das zusammengesetzte Plasmid korrekt gebildet wird, wobei das Tetracyclin-Resistenz-Gen unter die Kontrolle
des trp-Promoter-Operators zusammen mit dem Gen für reifes Le-IF F gebracht wird, so daß mit dem gewünschten Plasmid
transformierte Bakterien auf Tetracyclin-haltigen Platten ausgewählt werden können. Ein so hergestellter repräsentativer
Klon ist E. coli K-12 Stamm 294 pLeIF F trp 1.
Le-IF H
Das vollständige Le-IF Η-Gen kann wie folgt zur Expression als
ausgereiftes Leukozyten-Interferon konfiguriert werden:
1. Plasmid-pLe-IF-H wird dem Hae II- und Rsa I- Abbau
Isolierung des 816-Basenpaar-Fragments, das von der Signalpeptid-Aminosäure
10 bis zum 3'-nichtcodierenden Bereich
reicht, unterworfen.
2. Das Fragment wird denaturiert, und der Reparatursynthese mit Klenow-Fragment unterworfen, Klehow et al., Proc. Natl.
Acad. Sei. USA j55_, 168 (1970), wobei das synthetische Desoxyribooligonucleotid-Starter
5'-dATG TGT AAT CTG TCT verwendet wird. Diese allgemeine Arbeitsweise wird auch von Goeddel et
al., US-SN 190 799 (25. 9. 1980) beschrieben.
3. Das anfällende Produkt wird mit Sau 3a gespalten und ein
452-Basenpaar ("bp")-Fragment, das die Aminosäuren 1 - 150
■darstellt, wird isoliert.
4. Sau 3a- und Pst I-Abbau von pLelF H und Isolierung des anfallenden
500 b.p.-Fragments liefert ein Gen, das die Aminosäuren 150 bis zum Ende der codierenden Sequenz codiert.
5. Die in den Stufen (3) und (4) isolierten Fragmente werden zum folgenden Fragment miteinander verknüpft:
1 1 166 met cys asp Stop ATG TGT . . 1 GAT TGA Pst I
Sau 3a das die 166 Aminosäuren von Le-IF H codiert.
31U469
6. pLeIF A trp 25 wird mit Xba I aufgeschlossen, mit DNA-Polymerase
I mit stumpfem Ende versehen und· das Produkt mit Pst I abgebaut. Das große anfallende Fragment kann mit dem
Produkt der Stufe (5) zu einem Expressions-Plasmid verknüpft werden, das nach Transformation von E. coli K-12 Stamm 294
oder anderen Wirtsbakterien reifes Le-IF H zu exprimieren vermag.
LeIF-I
.Die von Lawn et al., Cell 1_5, 1157 (1978) konstruierte Genbibliothek
des menschlichen Genoms im Phagen λ Charon 4A wurde nach Leukozyten-Interferon-Genen durch von Lawn et al.,
oben, und Maniatis et al., Cell ^5, 687 (197S) beschriebenen
Arbeitsweisen durchsucht. Eine radioaktive LeIF-Sonde, aus der cDNA,Klon LeIF A, stammend (Goeddel et al., Nature 287, 411
(1980)), wurde verwendet, um etwa 500.000 Plaques zu prüfen.
Dabei wurden 6 LeIF-Genom-Klone erhalten. Nach erneutem
Screening und Plaque-Reinigung wurde einer dieser Klone,HLeIF2, zur weiteren Analyse ausgewählt.
Nach dem oben beschriebenen Verfahren können weitere Sonden vorteilhaft
zur Isolierung zusätzlicher LeIF-Klone aus dem Human-Genom
verwendet werden. Diese wiederum können zur Herstellung weiterer Leukozyten-Interferon-Proteine gemäß der Erfindung
eingesetzt werden.
1. Das 20OO Basenpaar-Eco RI-Fragment des Ganom-Klons (XhLgIF2)
wurde an der Eco Rl-Stelle in pBR325 nochmals kloniert.
Das anfallende Plasmid LeIF I wurde mit Eco RI gespalten und
das 2000 Basenpaar-Fragment isoliert. Das Desoxyoligonucleotid dAATTCTGCAG (ein Eco. RI>
Pst I-Konverter) wurde an das 2000 Basenpaar-Exo RI-Fragment geknüpft und das anfallende
3HU69
Produkt mit Pst I zu einem 2000 Basenpaar-Fragment mit Pst I-Enden
gespalten. Dies wurde mit Sau 96 gespalten und ein 1100 Basenpaar-Fragment isoliert, das ein Pst I-Ende und ein
Sau 96-Ende aufweist.
2. Das Plasmid pLeIF C trp 35 wurde mit Pst I und Xba I abgebaut.
Das große Fragment wurde isoliert.
3. Das kleine Xba I-Pst I-Fragment von pLeIF C trp 35 wurde
mit Xba I und Sau 96 abgebaut. Ein 40 Basenpaar-Xba I Sau
96—Fragment wurde isoliert.
4. Die in den Stufen 1), 2) und 3) isolierten Fragmente wurden zu dem Expressions-Plasmid pLeIF I trp 1 verknüpft.
LeIF-J
1. Das Plasmid pLeIF J enthält ein 38OQ - Basen -Hind Ill-Fragment
von Humangenom-DNA, das die.LeIF J-Gen-Sequenz
aufweist. Ein 760 Basenpaar-Dde I-Rsa-I-Fragment wurde
aus diesem Plasmid isoliert.
2. Das Plasmid pLeIF B trp 7 wurde mit Hind III und Dde I gespalten
und ein 340 bP Hind III - Dde I-Fragment isoliert.
3. Das Plasmid pBR322 wurde mit Pst I gespalten, erhielt durch
Inkubation mit DNA Pol I (Klenow-Fragment) ein stumpfes Ende, wurde dann mit Hind III verdaut. Das große (ca. 3600 bp)
Fragment wurde isoliert.
4. Die in den Stufen 1), 2) und 3) isolierten Fragmente wurden zu dem Expressions-Plasmid pLeIF J trp 1 verknüpft.
Die bei den folgenden Aufbauvorgängen eingesetzten Methoden
und Materialien waren wie in der obigen Beschreibung. Die folgende Tabelle -1 liefert die Einzelheiten für den speziellen
Zusammenbau von Hybrid-LelF-Plasmiden:
LeIF itainosäuren Expressions- Vorderteil
Hybrid insgesamt*^ Plasmid
^ (Vektor) Fragment Aninosauren
^ (Vektor) Fragment Aninosauren
Hinterteil
Fragmejit Minosäuren
Fragmejit Minosäuren
anfallendes Expressions-Plasmid
165
166
165
166
165
165
165
165
166
166
Xba I-Pvu II 1-91
vonpLelF A trp 25
(205 bp)
Xba I-Pvu II 1-92
von pLelF 0 trp 11
(208 bp)
BgI II-Pst I großes 1-62
Fragment V. pLelF A trp 25
BqI II-Pst I großes 1-63
Fragment pLelF D
trp 11
Xba I-Pvu II V. LeIF A 1-91 trp 25 (285 bp)
Xba I-Pvu II V.. LeIF A 1-91 trp 25 (285 bp)
Xba I-Pvu II V. LeIF A 1-91 trp 25 (2S5 bp)
Xba I-BqI II partial vonpLelF A trp 25
(- 455 bp)
Hind III-Pvu Mv. pLelF 1-92
B trp 7 [~ 630 bp)
Hind III-Pvu Hv. pLeiF 1-92 B trp 7 (~630 bp)
Pvu II-Pst I 93-166
vonpLelF 0 trp 11 (-550 bp)
Pvu II-Pst 1 92-165
von pLelF A trp 25 (-550 bp)
BgI II-Pst I 64-166
von pLelF D trp 11 (-600 bp)
BgI II partial- 63-165 Pst I v. pLelF A
trp 25 (-700 bp)
Pvu II partial-Pstl 93-166 vohpLelF B trp 7
(-750 bp)
Pvu II Pst I 93-166
von pLelF F trp 1
(-700 bp)
Pvu II-Pst I 93-166
von pLelF G
(~75O bp)
BgI II-Pst I 151-165
von LeIF I trp 1
(- 650 bp)
Pvu II-Pst I von 92-165 pLelF A trp 25
(~55O bp)
Pvu II-Pst I von 93-166 pLelF D trp 11
(-550 bp)
pLelF AO trp(Pvu II)
pLelF DA trp (Pvu II)
pLelF AD trp (BgI II)
pLelF DA trp (BgI II)
pLelF AB trp (Pvu II) pLelF AF trp (Pvu II) pLelF AG trp (Pvu II)
pLelF AI trp (BgI II) pLelF BA trp (Pvu II) pLelF BO trp (Pvu II)
Tabelle 1 (Fortsetzung)
LeIF Aminosäuren Expressions- Vorderteil
Hybrid insgesamt Plasmid „ , -.
* "^ (Vektor^ Fragment Minosauren
r) Hinterteil
Fragment Aminosäuren
Fragment Aminosäuren
anfallendes Expressions-Plasmid
CO
OG DB DF DG FA
FB FD FG IA
1G6
1G6
1C6
1C6
166
16G
166
166
166
166
Hind III-Pvu II V. pLeIF 1-92 B trp 7 (-630 bp)
Hind III-Pvu Uv. pLeIF 1-92
B trp 7 (~ 630 bp)
D trp 11 (208 bp)
D trp 11 (2H8 bp)
D trp 11 (208 bp)
pLeIF F trp (208 bp)
pLeIF F trp (288 bp)
pLeIF F trp (288 bp)
pLeIF F trp (288 bp)
pLeIF I trp (~ 458 bp)
pLeIF F trp 1
(-700 bp)
(-750 bp)
Pvu II partial-Pst IvonpLelF B 93-166
trp 7 (-750 bp)
(-700 bp)
(-750 bp)
Pvu II-Pst IvonpLelF A trp 25 92-165 (-550 bp)
Pvu II partial-Pst IvonpLelF B 93-166 trp 7 (-750 bp)
Pvu II-Pst I von pLeIF D trp 11 93-166 (-550 bp) .
(-750 bp)
trp 25 (-430 bp)
# ohne N-endständiges Methionin
a großes (ca. 3900 bp)' Fragment von Xbal bis Pstl-Verdauurg von pleIF A trp 25.
b großes tea. 3600 bp)· Fragment von Hind III bis Pstl-Verdauung von pER322.
pLeIF BF trp (Pvu II)
pLeIF BG trp {Pvu II) pLeIF DB trp (Pvu II)
CO
pLeIF IF trp {Pvu II)
pLeIF DG trp (Hvu II)
pLeIF FA trp {Pvu II).
pLeIF FB.trp (Pvu II)
pLeIF FO trp (Pvu II)
pLeIF FG trp (Pvu II) *....*
pLeIF IA trp (BgI II)
3HU69
' - ve-
Unter weiterer Bezugnahme auf Tabelle 1 wurden die ersten vier beschriebenen Hybrid-LelFs aus zwei Lelf-Expressions-Plasmiden
hergestellt. Eine BgI Il-Stelle, wie sie LeIF A
und D cDNÄs gemein ist, wurde zum Aufbau eines Expressions-Plasmids
pLelF trp AD (BgI II) verwendet, was die 63 in Aminogruppen
endenden Aminosäuren von LeIF A und die 102 als Carboxylgruppen endenden Aminosäuren von LeIF D codiert. Die
gleiche Stelle wurde beim Aufbau eines Expressions-Plasmids pLelF trp DA (BgI II) verwendet, das 64 in Aminogruppen endende
Aminosäuren von LeIF D und 102 in Carboxylgruppen endende Aminosäuren von LeIF A codiert. Die Pvu Il-Stelle ist
beim Aufbau der beiden anderen Hybrid-Interferon-Expressions-Plasmide
verwendet worden: 91 in Aminogruppen endende Aminosäuren von A mit 74 in Carboxylgruppen endenden Aminosäuren
von D (pLelF trp AD (Pvu II)) und 92 in Aminogruppen endende Aminosäuren von LeIF D mit 74 in Carboxylgruppen endenden
Aminosäuren von LeIF A (pLelF trp DA (Pvu II)) . Zusammengefaßt:
pLelF AD trp (PvuII): Das große (ca. 3900 bp) Fragment eines
Xba I- und Pst I-Abbaus von pLelF A trp 25 wurde mit einem
285 bp Xba I-Pvu II-Fragment von pLelF A trp 25 und einem ca. 550 bp Pvu Il-Pst I-Fragment von pLelF D trp 11 verknüpft;
pLelF DA trp (Pvu II): Das große (ca. 3900 bp) Fragment von
einem Xba I- und Pst I-Abbau von pLelF A trp 25 wurde mit einem
288 bp Xba I-Pvu II-Fragment von pLelF D trp 11 und einem ca.
550 bP Pvu Il-Pst I-Fragment von pLelF A trp 25 verknüpft;
pLelF AD trp (BgI II): Das große Fragment von einem BgI II-,
Pst I-Abbau von pLelF A trp 25 wurde mit einem ca. 600 bp BgI Il-Pst I-Fragment von pLelF D trp 11 verknüpft; und
pLelF DA trp (BgI II): Das große Fragment von einem BgI II-,
und Pst I-Abbau von pLelF D trp 11 wurde mit einem ca.700 bp-
Fragment, erhalten durch Pst I-Spaltung von pLeIF A trp 25
und nachfolgende BgI Il-Verdauung, verknüpft*
Beim 5. angegebenen Hybrid:
pLelF AB trp (Pvu II): Das große (ca. 3900 bp) Fragment von
einem Xba I und Pst I-Abbau von pLeIF A trp 25 wurde mit einem
285 bp Xba I-Pvu II-Fragment von pLeIF A trp 25 und einem ca.
750 bp Pvu II-(partial)-Pst I-Fragment von pLelF B trp 7 verknüpft.
Ähnlich sind die anderen in Tabelle 1." wiedergegebenen Zusammensetzungen
festgelegt.'Als weiteres Beispiel kann man beim Aufbau
eines LeIF C und/oder LeIF Η-Teil enthaltenden Hybrids Vorteil ziehen aus gemeinsamen Bbv I-Stellen, die etwa beim Nucleotid
294 (d.h. GCTGC) der Gen-Sequenzen auftreten.
Ähnlich können Plasmide, die sich zur mikrobiellen Expression anderer neuer Hybrid-Leukozyten-Interferone eignen, durch geeignete
Manipulation der alle oder Teile der Aminosäuresequenzen natürlich auftretender Leukozyten-Interferone codierenden
Doppelstrang-DNA gebildet werden. So wird ein erstes Doppelstrang-DNA-Fragment gewählt, das das Aminoende einer ersten,
natürlich vorkommenden Leukozyten-Interferon-Aminosäuresequenz und, in 3'-Richtung fortschreitend, einen erheblichen Teil der
Aminosäuresequenz codiert. Das Fragment weist eine Restriktions-Endonuclease-Spaltstelle
nahe den Codons für die Aminosäure "n" des ersten Leukozyten-Interferons auf, wobei η Aminosäuren
einen erheblichen Teil der Aminosäuresequenz des ersten Interferons bilden. Die Spaltung mit der Restriktions-Endonuclease
liefert ein Fragment mit dem Aminoende des ersten Interferons und Codons für etwa η Aminosäuren. Ein zweites Fragment mit
allen oder einem Teil der Codons für die Aminosäure-Sequenz eines zweiten, anderen Leukozyten-Interferons wird gewählt,
wobei das Fragment eine Spaltstelle für eine identische Restriktions-Endonuclease
nahe Codons für jene Aminosäure des
3UU69
zweiten Interferons aufweist, deren Aminosäurezahl (vom Aminoeride
des zweiten Interferons fortschreitend) etwa 166-n ist.
Die Spaltung des zweiten Fragments mit der Restriktions-Endonuclease liefert ein Produkt komplementär zu dem "n"-Endteil
des Verdauung^sprodukts des ersten Fragments, so daß das Verdauungsprodukt
des zweiten mit dem des ersten verknüpft werden kann, unter Rückbildung der Restriktions-Endonuclease-Erkennungsstelle
und erneuter Bildung des Codons für die Aminosäure η des ersten Interferons, sofern bei der ersten Verdauung
verlorengegangen. Das Produkt der Restriktions-Endonuclease-Verdauung des zweiten Fragments läuft vorzugsweise
von dem Ende aus ab, das bei der Spaltung in 3'-Stellung
durch Nucleotide anfällt, die das Carboxylende des zweiten
Leukozyten-Interferons codieren.
Andererseits können Hybride, die erhebliche Teile der Aminosäure-Sequenzen
von mehr als zwei natürlich vorkommenden Leukozyten-Interferonen enthalten, gebildet werden, wobeidann
z.B. das oben erwähnte zweite Fragment außerdem dazu ausgewählt wird, eine zweite Restriktions-Endonuclease-Stelle
hinter der ersten zu enthalten, wobei die zweite Stelle identisch einer ähnlich gelagerten Stelle innerhalb eines Fragments
ist, das das Carboxy1-Endteil eines dritten Leukozyten-Interferons
codiert usw. In dem genannten Beispiel können die Produkte der aufeinanderfolgenden Restriktions-Endonuclease-Einsätze
dreifach verknüpft werden, um ein Hybridgen.zu bilden,
das den Amino-Endgruppenteil eines ersten Interferons, den Mittelbereich der Aminosäuresequenz des zweiten und den
Carboxyl-Endteil des dritten codiert (oder einer weiteren Variante des ersten, wobei das erste und das dritte Interferon
gleich sind).
Vorzugsweise leitet sich das erste oben erwähnte Fragment von
einem Expressions-Plasmid ab, d.h. einem solchen, bei dem
Codons für den Amino-Endteil des ersten Leukozyten-Interferons
als Vorgänger ein ATG- oder anderes Translations-Initiations-Codon
und einen Promoter oder Promoter-Operator-System haben. Im Ergebnis wird das Endprodukt der oben beschriebenen Manipulationen
ein Plasmid sein, das das vom Hybridgen in Bakterien oder anderen mikrobiellen, mit den Plasmid transformierten
Organismen codierte Polypeptid zu exprimieren vermag. Weitere Maßnahmen zur Gestaltung des Hybridgens für mikrobielle
Expression liegen für den Fachmann auf der Hand.
Bei bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung codieren die Hybridgene eine neue Leukozyten-Interferon-Aminosäure-Sequenz
von etwa 165 bis 166 Aminosäuren, ein Konjugat wesentlicher
Aminosäure-Sequenzen von zwei oder mehr verschiedenen Leukozyten-Interferonen
darstellend, ausgewählt unter LeIF A, LeIF B, LeIF C, LeIF D, LeIF E, LeIF F, LeIF G und LeIF H,
wie in Fig. 3 dargestellt. Am meisten bevorzugt weisen die neuen, von den Hybridgenen codierten Leukozyten-Interferone
die genannten und wie in der Sequenz "alle" der Fig. 3 angegeben angeordneten Aminosäuren auf. Die Expressionsprodukte
von Plasmiden, erfindungsgemäß hergestellt, können in herkömmlicher
Weise auf antivirale Aktivität getestet werden, wie in den nachfolgend beschriebenen.biologischen Aktivitätsbestimmungen.
Nachweis der antiviralen Aktivität
E. coli K-12 Stamm 294 wurden in herkömmlich-er Weise unabhängig
mit den Plasmiden pLelF trp A 25, pLelF trp D, pLelF
trp A/D (BgI II) und pLelF trp D/A (BgI II) transformiert.
Die Transformanten wurden getrennt in 5 ml-Kulturen in L-Brühe
mit 5 mg/ml Tetracyclin zu einem Aj-^-Wert von 1,0 gezüchtet,
dann in 1 1 M9-Medium mit 5 ug/ml Tetracyclin verdünnt. Die
Zellen wurden geerntet, wenn A55 1,0 erreichte, und die
Zellen in 10 ml 15 %iger Saccharose, 50 mmol. Tris-HCl (pH 8,0),
50 mmol. EDTA suspendiert. 10 mg Lysozym wurden zugesetzt, und
nach 5 min bei 00C wurden die Zellen durch Schalleinwirkung aufgebrochen.
Die Proben wurden 10 min bei 15.000 UpM in einem Sorvall SM-24-Rotor zentrifugiert. Die Interferon-Aktivität
der überstehenden Flüssigkeiten wurde auf antivirale Aktivität getestet.
Die Ausbeuten pro 1 Kultur dieser Interferone, an einem menschlichen
Zellstamm (Wish) titriert, sind in Tabelle 2 gezeigt, aus der klar wird, daß die LeIF-A/D-Aktivität in größerem Maße
hervorgerufen wird als die anderer Interferone. Dieser Unterschied
könnte auf der größeren vorgegebenen Aktivität des LeIF-A/D- oder auf größerer Ausbeute, ausgedrückt in mg Protein
dieses Interferons,beruhen. Da die genetische Verbindung für ■
alle diese Interferone identisch war, erscheint es am wahrscheinlichsten,
daß LeIF-A/D praktisch eine größere Aktivität als die anderen Interferone besitzt.
T a b e lie
Ausbeute an Leukozyten-Interferonen aus Schüttel-. kolbenkulturen von E. coil .
Art des Interferons Aktivität, Ausbeute/l
(Einheiten an Wish) +)
A 8x1O7
D . 5x1O6 AD (BgI II) 2x1O8
DA (BgI II) 1x1O6
+) getestet durch Hemmung des cytopathischen Effekts an Wish-Zellen
mit VSV als Testsubstanz
^ fre.
Die Wirksamkeit der verschiedenen Interferone in einer Reihe von Säugetier-Zellstämmen wurde bestimmt (vom Menschen Wish;
von der afrikanischen grünen Meerkatze Vero; Hamster-Fibroblast
BHK; Nierenzellen vom Kaninchen, RK-13; Maus L-929; und Rinderniere,
MDBK-Zellen). Um die relative Aktivität der Interferone zu vergleichen, wurde ihre Aktivität an verschiedenen Zellen,
relativ zu ihrer Aktivität an Wish-Zellen als 100 angesetzt, berechnet. Die Ergebnisse in Tabelle 3 zeigen, daß LeIF-A/D
eine sehr hohe Aktivität in VERO und L-929-Zellen hat, während LeIF-D/A eine geringe Aktivität in diesen Zellstämmen hat. Diese
Ergebnisse zeigen, daß die Kombination des N-Endteils von LeIF-A und des C-Endteils von LeIF-D innerhalb eines Moleküls
(LeIF-A/D) zu der besonderen Wirksamkeit des Hybrid-Proteins beiträgt, die in verschiedneh Säugetierarten ihren Ausdruck
findet. Weiter sind diese Eigenschaften nicht eine einfache Summierung der Eigenschaften der Ausgangs-Interferone. Dies
zeigt sich deutlich im Fall der Aktivität an L-929-Zellen (Tabelle 3), in welchem Falle weder ein Gemisch aus LeIF-A und
LeIF-D noch das andere Hybrid, LeIF-D/A, eine erhebliche Aktivität aufweist.
Tabelle . . 3
Titration verschiedener Leukozyten-Interferone in Zellstämmen aus .verschiedenen Säugetierarten
Leukozyten-Interferone
Zellstamm A D A/D D/A A+D Leukozytenfilm in
zentrifugiertem Blut
WISH | • 100 | 100 | 1. | 100 | 100 | 100 | 100 |
VERO | 250 | 75 | 670 | 20 | 200 | 200 | |
BHK | 400 | 200 | 833 | 2.000 | 400 | 20 | |
RK-13 | 12 | 500 | 3. | 6 | N.D. | N-. D. | 120 |
L-929 | 150 | 5 | 300 | 2 | 10 | 0,1 | |
3H4469
Anmerkung zu Tabelle 3:
Interferone, getestet gegen VSV-Infektion der verschiedenen
Zellstämme. Aktivitäten ausgedrückt als Prozentsatz der in WISH-Zellen beobachteten Aktivität.
Die Aktivität von LeIF-A/D gegen andere Viren wurde auch untersucht.
Die Daten in Fig. 5 zeigen antivirale Effekte gegenüber EMC-Virusinfektion von'L-Zellen, und die Daten in Fig. 6 zeigen
Effekte gegenüber VSV-Infektion von L-Zellen. Aus diesen Daten wird klar, daß die größere Aktivität von LeIF-A/D nicht auf ein
Virus (VSV) beschränkt ist und die größere Aktivität offenbar eine allgemeine Eigenschaft gegenüber vielenViren ist. Natürliche
Human-Leukozytenfilm-Interferon-Präparate haben keine
Wirkung gegenüber Mauszellen (siehe Tabelle 2). Die Aktivität von LeIF-A/D gegen EMC-Virusinfektion von CD-1-Mäusen wurde
daher untersucht. Die Ergebnisse in Fig. 7 zeigen, daß LeIF-A/D extrem wirksam ist gegenüber letaler EMC-Virusinfektion und
LeIF-A auch antivirale Aktivität hat, wie von der Aktivität in Zellstämmen (Tabelle 2) zu erwarten ist. Die Daten in Fig. 7
stammen aus Behandlungen i.p. 3h vor der Infektion. Die Dosen an LeIF-A/D und LeIF-A sind wie an WISH titriert.
Letale EMC-Virusinfektion von Hamstern wird auch durch LeIF-A/D
und LeIF-A (Fig. 8) beeinträchtigt, wobei ersteres das wirksamste ist,und Leukozytenfilm-Interferon zeigt nur einen kleinen
und statistisch insignifikanten Effekt. Im Falle von Fig. 8 wurden alle Interferone i.p. 3h vor der Infektion in einer
Dosis von 5x10 pg/kg, titriert an WISH-Zellen,gegeben.
Diese Ergebnisse zeigen an, daß die ausgeprägten antiviralen Effekte von LeIF-A/D bei einer Reihe von Säugetierarten nicht
auf Zellkulturen beschränkt sind, sondern auch bei letalen Virusinfektionen beobachtet werden.
3H44-69
EMC-Virus kann als Modellsystem angesehen werden, wobei eine
Demonstration der antiviralen Wirkung gegen dieses System eine Voraussage der. antiviralen Wirkung gegen die verkörperte Virusfamilie
ermöglichen mag, z.B. die Picornavirus-Familie, für die Maul- und Klauenseuche und Polio Vertreter sind. VSV-Virus
kann als Modellsystem betrachtet werden, und eine Demonstration
der antiviralen Wirkung gegen dieses mag eine Voraussage
zur antiviralen Wirkung gegen die verkörperte Virusfamilie gestatten, z.B. die Rhabdovirus-Familie, deren wichtiger Vertreter
Rabies ist.
Tabelle 4 enthält eine Zusammenstellung der Aktivitäten verschiedener
LeIF-Hybride an WISH- und MDBK-Zellen und deren Aktivitätsverhältnisse:
3HU69
LeIF Hybrid | (PvuII) Einheiten/1 Kultur WISH-Zellen |
Einheiten/1 Kultur MDBK-Zellen |
Äktivitäts- verhältnis WISH/MDB |
AB | 2.4 χ 108 | 4 χ 1O7 | 6 |
AD | 1.2 χ 108 | 2 χ 1O7 | 6 |
AF | 6 χ ΙΟ7 | 1 χ 1O7 | 6 |
AG | 4 χ 1O7 | 1.5 χ 1O7 | 2.7 |
AI | 3.2 χ 1O7 | 1.2 χ 1O7 | 2.7 |
BA | 1.5 χ 1O7 | 1 χ 1O7 | 1.5 |
BD | 6 χ ΙΟ7 | 1.5 χ 1O7 | 4 |
BF | 1 χ 106 | 3.5 χ 105 | 0.3 |
BG | 2 χ 1O7 | 6 χ 1O7 · | 0.3 |
DA | 3 χ 106 | 1.2 χ 108 | 0.025 |
DB | 2 χ 1O6 | 5 χ 1O7 | 0.04 |
DF | 2 χ 105 | 4 χ 106 | 0.05 |
DG | 2 χ 1O5 | 1.5 χ 1O7 | 0.014 |
FA | 2 χ 1O5 | 6 χ ΙΟ7 | 0.003 |
FB | 2 χ 106 | 8 χ ΙΟ7 | 0.025 |
FD | 1 χ 1O7 | 2 χ 107 | 0.5 |
FG | 1 χ 1O6 | 4 χ 107 | 0.025 |
IA | 2.4 χ 106 | 6 χ 1O7 | 0.04 |
A* | 8 χ 1O7 . | 1.2 χ 108 | 0.7 |
B* | 8 χ 107 | 4 χ 108 | 0.2 |
C* | 2 χ 1O7 | 1.5 χ 1O7 | 1.3 |
D* | 5 χ 106 | 2.5 χ 1O7 | 0.2 |
F* | 2 χ 1O7 | 2 χ 108 | 0.1 |
■I* | 1.6 χ 1O7 | 1.2 χ 1O7 | 1.3 |
Zu Vergleichszwecken
Die Hybrid-Leukozyten-Interferone können Personen, die Antitumor-
oder antivirale Behandlung benötigen, und solchen,
die immunsuppressive Bedingungen zeigen, parenteral verabreicht werden- Do.sierung und Dosisrate können denen gleichen,
die derzeit bei klinischen Untersuchungen von aus Menschen stammenden Materialien angewandt werden, z.B. etwa
(1 bis 10) χ 10 Einheiten täglich, und im Falle von Material
lien größerer Reinheit als 1 %, ohne weiteres bis zu beispielsweise
5 χ 10 Einheiten täglich. Vorläufige Hinweise bei der oben beschriebenen Affenuntersuchung lassen vermuten,
daß Dosierungen von bakteriell erhaltenem Le-IF zwecks größerer Wirkung erheblich erhöht werden könnten, dank dem
praktischen Fehlen von anderen menschlichen Proteinen als Le-IF, die in aus Leukozyten stammenden Materialien als
Fieber erzeugende Stoffe wirken können und dabei nachteilige
Effekte, z.B. Unwohlsein, Temperaturerhöhung, usw. zeigen.
Als ein Beispiel für eine geeignete Dosierungsform für im wesentlichen homogenes bakterielles Le-IF in parenteraler
Form, hier mit den nötigen Änderungen anzuwenden, können 3 mg Le-IF der spezifischen' Aktivität von z.B. 2 χ 10 E/mg
in 25 ml 5 η Serumalbumin (human) - USP gelöst werden, die Lösung durch ein bakteriologisches Filter geführt und, die
filtrierte Lösung aseptisch in 100 Ampullen unterteilt werden, von denen diese 6 χ 10 Einheiten reines Interferon,
für parenterale Verabreichung geeignet, enthält. Die Ampullen werden vor ihrer Verwendung vorzugsweise in der Kälte (-200C)
gelagert.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können nach bekannten Methoden
zur Herstellung pharmazeutisch brauchbarer Mittel zusammengestellt werden, wodurch das Polypeptid mit einem phar-
3UU69
mazeutisch annehmbaren Träger zusammengemischt wird. Geeignete
Träger und deren Zusammenstellung sind.in Remington's.
Pharmaceutical Sciences von E. W. Martin beschrieben, dessen Offenbarung durch diese Bezugnahme in die vorliegende Anmeldung aufgenommen wird. Solche Mittel enthalten eine wirksame Menge des Interferon-Proteins zusammen mit einer geeigneten Menge eines Trägers zur Herstellung pharmazeutisch annehmbarer Mittel, die sich zur wirksamen Verabreichung eignen.
Pharmaceutical Sciences von E. W. Martin beschrieben, dessen Offenbarung durch diese Bezugnahme in die vorliegende Anmeldung aufgenommen wird. Solche Mittel enthalten eine wirksame Menge des Interferon-Proteins zusammen mit einer geeigneten Menge eines Trägers zur Herstellung pharmazeutisch annehmbarer Mittel, die sich zur wirksamen Verabreichung eignen.
Leerseite
Claims (19)
- Patentansprüche1* Antivirales Polypeptid von etwa 165 bis 166 Aminosäuren, dessen Aminosäure-Sequenz in Sequenz diskrete, in der Aminosäureidentität und -zahl UnterSequenzen verschiedener natürlich vorkommender Leukozyten-Interferone entsprechende UnterSequenzen aufweist, wobei die Aminosäuresequenz des Polypeptidsin der Ge.samtzusammensetzung von der Aminosäuresequenz natürlich vorkommender Leukozyten-Interferone verschieden ist.
- 2. Polypeptid nach Anspruch 1, dessen N-terminaler Teil im wesentlichen aus Aminosäuren 1 bis 92 von LeIF-D und dessen Carboxyl-Endteil im wesentlichen aus Aminosäuren 92 bis 165 von LeIF-A besteht.31U469 -2-DS GE 4100/17
- 3. Polypeptid nach Anspruch 1, dessen N-terminaler Teil im wesentlichen aus Aminosäuren 1. bis 91 von LeIF-A und dessen Carboxyl-Ehdteil im wesentlichen aus Aminosäuren 93 bis 166 von LeIF-D besteht.
- 4. Polypeptid nach Anspruch 1, dessen N-terminaler Teil im wesentlichen aus Aminosäuren 1 bis 63 von LeIF-D und dessen Carboxy1-Endteil im wesentlichen aus Aminosäuren .63 bis 165 von LeIF-A besteht.
- 5. Polypeptid nach Anspruch 1, dessen N-terminaler Teil im wesentlichen aus Aminosäuren 1 bis 62 von LeIF-A und dessen Carboxyl-Endteil im wesentlichen aus Aminosäuren 64 bis 166 von LeIF-D besteht.
- 6. Polypeptid nach Anspruch 1, dessen N-terminaler Teil im wesentlichen aus Aminosäuren 1 bis 91 von LeIF-A und dessen Carboxyl-Endteil im wesentlichen aus Aminosäuren 93 bis 166 von LeIF-B besteht.
- 7. Polypeptid nach Anspruch 1, dessen N-terminaler Teil im wesentlichen aus Aminosäuren 1 bis 91 von LeIF-A und dessen Carboxyl-Endteil im wesentlichen aus Aminosäuren 93 bis 166 von LeIF-F besteht.
- 8. Doppelsträngige DNA mit einem ein Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 codierenden Strang.
- 9. Doppelsträngige DNA mit einem ein Polypeptid gemäß den Ansprüchen 6 und 7 codierenden Strang. ·
- 10. Replizierbarer plasmidischer Expressionsträger, der in einem transformanten Mikroorganismus ein Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 zu exprimieren vermag... Jk3UU69 - 3 -DS GE 4100/17
- 11. Replizierbarer plasmidischer Expressionsträger, der in einem tr ans form an ten Mikroorganismus ein Polypeptid gemäß den Ansprüchen 6 und 7 zu exprimieren vermag.
- 12. Transformanten Mikroorganismus, der den Expressionsträger gemäß Anspruch 10 enthält.
- 13. Tr an s form anten Mikroorganismus, der den Expressionsträger gemäß Anspruch 11 enthält.
- 14. Plasmid aus der Gruppe pLelF AD trp (BgI II), pLelF AD trp (Pvu II), pLelF DA trp (BgI II) und pLelF DA trp (Pvu II).
- 15. Plasmid aus der Gruppe pLelF AB (Pvu II) und pLelF AF (Pvu II).
- 16. Verfahren zur Herstellung einer doppelsträngigen DNA gemäß Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß.a) ein erstes, doppelsträngiges DNA-Fragment mit Codons, die gesamte oder einen Teil der Aminosäuresequenz eines ersten, natürlich vorkommenden Leukozyten-Interferons codierend, das Codons für den Amino-Endteil des Interferons und, im Abstand davon in 3'-Richtung, eine erste Restriktions-Endonuclease-Spaltstelle aufweist, ausgewählt,b) das Fragment mit der Restriktions-Endonuclease gespalten,c) ein zweites doppelsträngiges DNA-Fragment, das die gesamte oder einen Teil der Aminosäuresequenz eines zweiten, anderen, natürlich vorkommenden Leukozyten-Interferons codiert und eine identische Restriktions-Endonuclease-Spaltstelle im wesentli-3UU69" 4 DS GE 4100/17chen identisch unter dem Gesichtspunkt der Aminosäurebezifferung der beiden Interferone angeordnet und außerdem über die Stelle hinaus Codons für das Carboxyl-Endteil des zweiten Interferons aufweist, ausgewählt,d) das zweite Fragment mit der Restriktions-Endonuclease gespalten wird unde) die Res.triktions-Endonuclease-Verdauungsprodukte der Stufen b) und d) zur Wiederherstellung der Restriktions-Endonuclease-Stelle und Bildung eines Hybrid-Fragments mit, in der Sequenz, Codons für das Amino-Endteil des ersten Interferons und das . Carboxyl-Endteil· des zweiten verknüpft werden.
- 17. Verfahren zur Bildung eines antiviralen Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daßa) das aus dem Verfahren gemäß Anspruch 16 stammende Hybrid-DNA-Fragment innerhalb eines replizierbaren plasmidischen Expressionsträgers entwickelt, ein Mikroorganismus mit ihm transformiert, der Mikroorganismus kultiviert und die Expression des durch das Hybrid-DNA-Fragment codierten Polypeptids veranlaßt undb) der anfallende Mikroorganismus lysiert und aus ihm das Poiypeptid gewonnen wird.
- 18. Arzneimittel· mit einer therapeutisch wirksamen Menge eines Polypeptide gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 und einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.
- 19. Verwendung eines Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Behandiung viraier oder neoplastischer Erkrankungen oder bei der Herstellung von bei solcher Be-' handlung brauchbaren Arzneimittein.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US20557980A | 1980-11-10 | 1980-11-10 | |
US06/237,388 US4414150A (en) | 1980-11-10 | 1981-02-23 | Hybrid human leukocyte interferons |
US06/305,657 US4456748A (en) | 1981-02-23 | 1981-09-25 | Hybrid human leukocyte interferons |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
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