CH664761A5 - Verfahren zur herstellung von interferon aus menschlichen genen. - Google Patents

Description

BESCHREIBUNG

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Herstellung von Interferon (IFN). Insbesondere bezieht sie sich auf die Herstellung von grossen Mengen an Human-Interfero-nen des Fibroblasten-(ßi)- oder des Leucocyten-(ac)-Typus durch geeignete Bakterien, in welche ein Fragment von menschlicher Genom DNA eingeführt wurde. Menschliches DNA, welches direkt aus Blutzellen entnommen wird, wird in einen geeigneten Phagen clonisiert. Eine hohe Interferon-Erzeugung kann erhalten werden in Bakterien, welche durch diesen Rekombinant-Phagen infiziert sind, und das Interferon kann aus den Bakterien-Lysaten, welche aus dieser Infektion resultieren, gewonnen und gereinigt werden. Das Genom-DNA-Fragment wird auch in Bakterien exprimiert, in welche es über einen Plasmid-Expressions-Vektor eingeführt wurde.

Interferon und insbesondere Human-Interferon erzielt eine wachsende Bedeutung in zahlreichen Gebieten. Seine Herstellung ist ziemlich umständlich, und Verbesserungen im Verfahren zu seiner Herstellung sind von grosser Wichtigkeit und grossem Wert.

Die Expression von Säugetier-Genen in Bakterien, wie E. coli, wird üblicherweise durch die Gegenwart von dazwischentretenden Folgen verhindert, welche die Codierungssequenz des Genes unterbrechen. Es gibt jedoch eine gewisse Anzahl von Genen, welche keine Introne aufweisen. Kürzlich zeigten Nagata et al. (Nature 287, 401-8, 1980), dass Human-Leucocyten-Interferon-a-Gene auch keine Introne aufweisen. Sie konnten niedere Mengen an Expression dieser Gene in E. coli nachweisen

Human-Diploid-Fibroblaste, welche durch doppelsträn-gige RNA induziert wurden, enthalten mindestens zwei mRNA-Codierungen für Interferon (Weissenbach et al., PNAS 77, 7152-7156, 1980). Eine mRNA,0,9 kb läng (IIS) entspricht der Hauptinterferonart IFN-ß,, welche durch diese Zellen erzeugt wird, deren Aminosäurefolge teilweise bestimmt wurde (Knight et al., Science 207, 325-6, 1980). Die Clonierung über cDNA von dieser IFN-ßrmRNA unter Verwendung von E. coli-Plasmid pBR322 als Vector wurde durchgeführt (Goeddel et al., Nucleic Acid Res., 8, 4057-4075, 1980). Die nucleotide Sequenz dieser DNA-Clo-

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ne entspricht derjenigen, welche für das Protein bestimmt wurde, und nach Konstruktion von Expressions-Plasmiden wurde gezeigt, dass IFN-ßrcDNA die Synthese von Humaninterferon in E. coli leitet. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben bereits früher menschliche Genom-Fragmente isoliert, welche das IFN-ßrGen und das IFN-ac-Gen tragen (Mory et al., Eur. J. Biochem. 120, 197-202,1981). Diese Gene weisen keine Introne auf und können daher direkt in E. coli exprimiert werden.

Die erfindungsgemässen Verfahren sind in den Patentansprüchen 1, 2, 8 und 9 definiert.

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren, in welchem ein spezifisches menschliches Genom-DNA-Fragment, extrahiert z.B. aus menschlichen Blutzellen, in einen bakteriopha-gen Vektor clonisiert und direkt verwendet wird, um die Synthese von IFN in Bakterien zu programmieren, welche gezüchtet werden und in der Erzeugung von Interferon resultieren. Diese Methode erfodert daher keine langwierige Herstellung und Clonisierung der komplementären DNA (cDNA) von voller Länge aus mRNA. Gemäss der vorliegenden Erfindung wird ein massgebliches DNA-Fragment, direkt aus einer leicht zugänglichen menschlichen Zelle, z.B. einer weissen Blutzelle, entnommen und in einen Phagen-Vektor clonisiert.

Das erforderliche IFN-Gen ist nicht durch Introne unterbrochen und ist daher fähig, die IFN-Synthese in Bakterien zu leiten. Eine hohe IFN-Aktivität wurde erzeugt durch Infektion geeigneter Bakterien, wie E. coli, durch ein Recombi-nant-Phagen, welches eine menschliche DNA-Insertion enthält, mit dem IFN-ßrGen oder IFN-ac-Gen. Das IFN wurde aus bakteriellem Lysat, welches aus einer solchen Infektion erhalten wurde, gewonnen und gereinigt. Phagen haben sich als geeignete Vektoren zur Einführung von menschlichen DNA-Fragmenten in Bakterien erwiesen; der X-Cha-ron 4A-Phage ist besonders geeignet und führt zu hoher IFN-Erzeugung. Die Erfindung umfasst ferner die Einführung von derartigen clonisierten menschlichen Genom-DNA-Fragmenten in Plasmid-Expressions-Vektoren, welche mit starken Promotoren versehen werden können. Das Verfahren kann mit verschiedenen IFN-a- wie auch IFN-ßi-Genen durchgeführt werden, sofern diese keine Introne enthalten.

In einer Ausführungsform wurde DNA aus einem Erwachsenen durch partielle Eco-RI-Digestion fragmentiert und in X-Charon 4A clonisiert. Das derart erhaltene Clon, bezeichnet als Clon C15, mit einem Einschluss an menschlicher DNA von etwa 17 kb, wurde als ein solches identifiziert, welches ein Gen für das Fibroblast-Interferon IFN-ß] enthält. Die Restriktions-Ortung zeigte, dass dieses Gen, welches sich auf einem 1,8 kb Eco-RI-Fragment befand,

nicht durch Introne unterbrochen ist. Dieses menschliche Genom-DNA-Fragment ist fähig, die Synthese von aktivem Human-IFN-ßj in E. coli und in anderen geeigneten Bakterien zu lenken. Eine hohe IFN-Aktivität kann aus Phagen-Lysaten gewonnen werden. Unter gewissen Bedingungen wurde eine Aktivität in der Grössenordnung von 107 E/Liter aus Phagen-Lysaten gewonnen. Die Lysate werden mit Vorteil der Chromatographie unterworfen, vorzugsweise auf Ci-bacron-Blau-Sepharose- oder ähnlichen Säulen, und das derart erhaltene Interferon weist dieselben immunologischen Eigenschaften und Artspezifität auf wie IFN, welches aus menschlichen Fibroblasten erzeugt wurde. Ähnliche Resultate wurden mit IFN-ac erhalten, dessen Gen in Clon-18-3, welches ein 13 kb menschlies Genom-Fragment enthielt, identifiziert wurde.

In einem weiteren Verfahren wird das menschliche Genom-DNA-Fragment, welches die IFN-ßr oder IFN-ac-Ge-ne enthält, in ein Plasmid eingeführt, z.B. Plasmid pBR322,

welches den recA-Promotor von E. coli enthält. Kulturen von E. coli, transformiert durch diese Recombinant-Plasmi-de, erzeugen grosse Mengen an IFN-ß] bzw. IFN-ac, wenn der recA-Promotor durch Nalidixinsäure eingeführt wird. Das IFN-ßrGenomenfragment wird sodann in der Nähe des Codons für das erste Methionin des reifen IFN-ß] geschnitten und an die ribosomale Bindungsstelle des E. coli lac-Pro-motors gebunden. Dieser lac-Promotor ist derart modifiziert, dass er die RNA-Polymerase-Bindungsstelle des Trypto-phan-Promotors enthält. Mit diesem hybriden Tryp-lac-Promotor ist die Genomen-IFN-ßrDNA fähig, 108 E/Liter IFN-ß] in E. coli, Minizellen-Stamm P679-54, zu erzeugen. Ähnlich befriedigende Ausbeuten an IFN-ctj werden erhalten, wenn das IFN-ac-Gen in geeigneter Weise an den Tryp-lac-Promotor angeknüpft wird. In allen Fällen wird die IFN-Aktivität aus den Bakterienzellen durch Lysis mit Ly-sozym und 30%igem Propylenglykol gewonnen und anschliessend wie bei den Phagen-Lysaten auf einer hydrophoben chromatographischen Unterlage gereinigt. Für IFN-ßi bildet Cibacron-Blau-Sepharose eine bevorzugte Unterlage. Die Eluierung kann mit Substanzen wie Äthylenglykol oder vorzugsweise Propylenglykol erfolgen. Eine weitere Reinigung des IFN-ß] oder IFN-ac kann durch Immunoaffinität-Chromatographie an monoclonalen Antikörpersäulen oder nach einer anderen bekannten Methode erfolgen.

Es ist aus dem obigen ersichtlich, dass menschliche Ge-nom-DNA-Fragmente verwendet werden können zur Herstellung von menschlichem IFN in E. coli und anderen geeigneten Gastbakterien in hoher Ausbeute.

Ein wichtiger Vorteil der Anwendung dieser Erfindung besteht darin, dass Gene von gesunden und kranken Individuen inbezug auf ihre Fähigkeit, IFN zu erzeugen, verglichen werden können, wodurch es möglich wird, genetische Defekte in der IFN-Erzeugung zu untersuchen.

Materialien und Methoden

Herstellung von menschlicher Gen-Bibliothek

DNA von hohem Molekulargewicht wurde aus peripheren Blutzellen eines Erwachsenen mit ß-Thalassemia hergestellt. Aliquote Teile (40 (ig) von DNÄ wurden getrennt während 30 Minuten mit 100, 200 oder 300 Einheiten Eco-RI digeriert, dann während 10 Minuten auf 65 °C erwärmt und zusammen auf einen 10 bis 40% Saccharosegradienten aufgebracht, wie beschrieben. DNA-Fragmente zwischen 10 und 20 kb wurden mit T4-DNA-Ligase, wie beschrieben von Mory et al. (Mol. Biol. Reports 6,203-208,1980) an X-Cha-ron 4A-DNÄ-Arme gebunden, welche durch Eco Ri-Dige-stion gemäss Maniatis et al. (Cell 15, 687-701, 1978) hergestellt wurden.

Das Packen in vitro erfolgte wie von Hohn und Murray beschrieben (PNAS 74, 3259-3263, 1977) durch Vermischen von mehreren 8 (ü-Aliquoten der Ligationsreaktion (0,5 (ig Vektor-DNA und 0,125 |ig menschliche DNA) mit 50 (ü Extrakten von E. coli BHB2688 [N205 recA" (X imm 434 clts b2 rot 3 Eam4 Sam7)/À] und BHB2690 [N205 recA~ (X imm 434 clts b2 rot 3 Dam 15 Sam7)/A,]. Pro ng Recombinant-DNA wurden 3 x 105 pfu erhalten, verglichen mit 108 pfu/ (ig intakte A.-DNA Ein Total von 1,8 x 106 Recombinant-Phagen wurden in 6 ml 10 mM Tris-HCl vom pH 7,5, 10 mM MgS04, 0,01% Gelatine verdünnt. Nach Zusatz von 0,1 ml Chloroform und Entfernung der Bruchstücke durch Mi-krofugen-Zentrifugierung wurden die Phagen 105-fach vermehrt durch Belegen auf E. coli DP50 (Leder et al., Science 196, 175/177, 1977) mit 4 x 103 pfu /15 cm Platte. Für das Screening wurden 2 x 104 pfu auf 15 cm Platten beimpft und doppelte Nitrocellulosefilter nacheinander abgehoben, wie von Benton et al. offenbart (Science 196, 180-182, 1977). Diese Arbeit erfolgte unter P3-Bedingungen.

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Herstellung von JFN-ßrcDNA-Probe

Poly-A" aus menschlichen Vorhaut-Fibroblasten-SFll-Kulturen, welche 4 Stunden durch 100 jxg/'ml Poly(rl): (rC), 50 |ig ml Cycloheximid (mit 2 (ig/ml Actinomycin-D während der letzten Stunde) induziert wurden, wurde hergestellt, und die beiden Spitzen von Interferon mRNA wurden durch Saccharosegradient-Zentrifugierung fraktioniert, wie ausführlich beschrieben von Weissenbach et al. (PNAS 77, 7152-7156, 1980), Weissenbach et al. (Eur. J. Biochem. 98, 1-8, 1979). Die IIS mRNA (1,5 (ig) wurde verwendet, um RNA-cDNA-Hybride mit umgekehrter Transcriptase aus Vogel-(avian)-Myeloblastosis-Virus (J. Beard) und Oli-go(dT) herzustellen, wie von Weissenbach et al. (PNAS 77, 7152-7156, 1980) beschrieben. Die RNA-cDNA-Hybride wurden direkt clonisiert gemäss Zain et al. (Cell 16, 851-861, 1979) jedoch unter Verwendung von dCTP als Ende der Hybride und dG-endständiges, Pst I-abgespaltenes pBR322 als Vektor (Chang et al, Nature 275, 617- 624, 1978). Ein Total von 12 500 tetr amps-Transformanten von E. coli MM294 wurden erhalten, wie ausgeführt von Stenlund et al. (Gene 10, 47-52, 1980). Die Kolonie-Hybridisierung erfolgte mit 32P-c DNA-Proben, welche entweder aus IIS mRNA (6 (ig) von induzierten SF 11-Zellen oder von Total Poly A+-RNA (3,7 (ig) von nicht-induzierten Zellen transkribiert worden waren. Die cDNA-Synthese wurde mit einem synthetischen komplementären Primer initiiert (siehe Narang et al., Methods Enzymol. 68, 90-98, 1979), nämlich 5'GA-GATCTTCAGTTTC 3', welches den Bgl Ii-Sitz der IFN-ßr Sequenz umfasst. Mit 32P-5'-endmarkiertem Primer (Hough-ton et al., Nucl. Ac. Res. 8, 1913-1931, 1980) wurde eine erwartete 640 nucleotide lange cDNA nur beobachtet, wenn induzierte RNA als Templat verwendet wurde. Um diese Proben herzustellen, wurden 20 pMoles Primer mit jeder RNA in 4 (il 0,4 M KCl bei 30 C während 60 Minuten umgesetzt, dann in 25 (il mit je 200 (iCi 32P-cc-dATP und dCTP (beide 400 Ci mMol), je 0,5 mM dGTP und TTP, 50 mM Tris-HCl pH 8,3, 4 mM MgCl2, 5 mM Dithiotreitol, 50 (ig/ ml Actinomycin-D, 4 mM Pyrophosphat und 30 Einheiten Reverese-Transcriptase, während 2 Stunden bei 37 C inkubiert. Nach Zusatz von 25 |ig E. coli-DNA wurde das Reaktionsgemisch mit 0,3 N NaOH während 60 Minuten bei 70 C behandelt, anschliessend neutralisiert und durch Sepha-dex G-50 in 50 mM TrisHCl pH 8, 0,1 M NaCl, 10 mM ED-TA, 0.5% Dodecylsulfat filtriert. Von jeder RNA wurden 5 x 106 cpm cDNA erhalten. Auf Nitrocellulosefiltern gewachsene Kolonien wurden fixiert und DNA denaturiert, wie von Thayer (Anali. Biochem. 98, 60-63, 1979) beschrieben. Jeder Filter wurde mit 10 ml 6XSET (SET =150 mM NaCl. 2 mM EDTA, 30 mM Tris-HCl pH 8) 10 x Den-hardt's-Lösung (Denhardt, Biochem. Biophys. Res. Comm. 23, 641-646, 1966), 0,1% Natriumpyrophosphat, 0,1% Dodecylsulfat. 50 (ig/ml denaturierter E. coli-DNA während 4 Stunden bei 67 C vorhybridisiert. Die Filter wurden bei 67 C während 14 bis 18 Stunden in derselben Lösung mit 0,5 x 106 cpm Filter einer der beiden 32P-cDNA-Proben, 10 (ig/ ml Poly-A und 2,5 (ig/ml Poly-C hybridisiert. Die Filter wurden während 1 Stunde bei 67 C in der Vorhybridisie-rungslösung gewaschen, dann dreimal während 30 Minuten bei 67 C mit 3XSET, 0,1 % Pyrophosphat, 0,1 % Dodecylsulfat, dann 60 Minuten bei 25 C mit 4XSET, siehe Mania-tis (Cell 15, 687-701, 1978). Die Filter wurden getrocknet und während 1 bis 2 Tagen bei —70 C Agfa Curix Röntgenfilmen mit Verstärkungsschirm ausgesetzt.

Von 3500 untersuchten Kolonien hybridisierten 14 bevorzugt zu primered cDNA aus induzierter mRNA, während 130 auch zu primered cDNA von nicht-induzierter mRNA hybridisierten. DNA (0,3 (ig) Plasmide aus der ersten Gruppe wurden auf Filtern hybridisiert (Kafatos et al.,

Nucl. Ac. Res. 7,1541-1552,1979) mit dem 5'-end-32P-mar-kierten Primer selbst (0.3 pMoles, 4 x 106 cpm) in 6XSSC, 10 x Denhardt -Lösung bei 35 C während 21 Stunden, worauf sie mit 6XSSC (900 mM NaCl 90 mM Natriumci-trat) bei 35 C gewaschen wurden. Ein Clon 1-6-5 war stark positiv und das DNA-Sequencing (siehe Maxam et al., Methods Enzymol. 65. 499-560, 1980) zeigte, dass er etwa 370 Nucleotide aus der 3'-Seite der IFN-ßrSequenz enthielt. Weitere 50 000 Clone, hergestellt wie zuvor durch Einführen von dC-endständiger ds-cDNA aus Saccharose-Gradient gereinigter induzierter mRNA im Pst I-Sitz von pBR322 wurden untersucht: das Verhältnis von IFN-ß,-Clonen betrug 0,16% (80 Clone) im Vergleich zu 0,65% IFN-ß2-Clonen.

Der oben beschriebene Clon IFN-ß, 1-6-5, welcher aus SF-11 mRNA hergestellt worden war, wurde verwendet, um die menschliche Bibliothek zu untersuchen.

Isolierung des genomischen Clons IFN-ßrClon 15

Plasmid DNA aus IFN-ß, cDNA-Clone wurde durch Nick-Translation, gemäss Rigby et al., (J. Mol. Biol. 113, 237-351, 1977) zu 2 x 108 cpm/|ig DNA markiert und hybridisiert bei 106 cpm/Filter zur menschlichen Gen-Bibliothek. Die Herstellung der Filter, die DNA-Denaturierung und die Hybridisierungsverfahren waren dieselben wie oben beschrieben. Phagen aus «Plaques», welche positive Hybridisierung ergaben, wurden bei einer Dichte von 1 bis 2 x 102 pfu auf 9 cm-Platten wieder angesiedelt und erneut untersucht. Dieses Vorgehen wurde dreimal wiederholt, bis mehr als 95% der «Plaques» auf der Platte zu IFN-ß! cDNA hybridisierten. Das Phagen-Clon C15 wurde auf einer derartigen «Plaque» isoliert.

Phagen wurden in Flüssigkulturen gezüchtet, wie beschrieben von Blattner et al. (Science 196, 161-169, 1977). E. coli DP50 wurden über Nacht in 1% Trypton, 0,5% NaCl, 0,5% Hefeextrakt, 0,2% Maltose, 0,25% MgS04, 0,01% Diaminopimelinsäure, 0,004% Thymidin gezüchtet. Etwa 0,3 ml der Kultur wurde zur Voradsorption mit 0,3 ml 10 mM MgS04, 10 mM CaCl: und 107 Phagen während 20 Minuten bei 37 C vermischt. Die Kulturen wurden sodann in einem 2-Liter-Kolben mit 500 ml vorgewärmtem Medium, welches 1% NZ-Amin, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% NaCl, 0,1% Casaminosäuren, 0.25% MgS04, 0,01% Diaminopimelinsäure, 0,004% Thymidin enthielt, verdünnt und unter guter Belüftung während 15 bis 18 Stunden bei 37 C inkubiert. Nach Vollendung der Lyse wurden die Zellbruchstücke durch Zentrifugieren in der Kälte während 15 Minuten bei 7000 Touren pro Minute in einem Sorvall GSA-Rotor entfernt. Aus diesem geklärten Lysat wurden die Phagen mit 7% Polyäthylenglykol 6000 ausgefällt und durch zwei aufeinanderfolgende CsCl-Gradienten gereinigt. Die Phagen C15-DNA wurde phenolgereinigt und seine Struktur durch Restriktions-Enzymdigestionen, horizontale Agarosegel-Elektrophorese in 20 mM Tris-Base, 10 mM Natriumacetat, 1 mM EDTA mit 0,5 (ig/ml Äthidiumbromid analysiert, auf Nitrocellulosefilter übertragen (Southern, J. Mol. Biol. 98, 503-517, 1975) und zu translatierter IFN-ß, cDNA hybridisiert wie oben. Eco RI-Fragmente von C15 DNA wurden in Eco RI-Sitz von pBR322 für eine genaue Restriktions-«Mapping» der Plasmid-DNA subclonisiert nach dem eingeführten Verfahren von Bolivar (Methods Enzymol, 68, 245-267, 1979).

Untersuchung der Interferon-Aktivität in Phagen-Lysaten

Gereinigte Phagen IFN-ß, C15-Lysate, hergestellt wie oben, wurden während 7 Stunden gegen mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung (PBS) dialysiert. Eine 10 ml Portion wurde auf eine 0,3 ml Säule aus Cibacron-Blau-Sepharose CL6B (Pharmacia Fine Chem.) geladen. Die Säule wurde

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mit 10 bis 15 ml 1 M NaCl, 0,02 M Natriumphosphatpuffer pH 7,2 gewaschen und dann mit 10 ml 50%igem Propylenglykol in der Waschlösung. Fraktionen (0,5 ml) wurden gesammelt und bei 4 3C gelagert; in einigen Fällen wurde 0,1% menschliches Serumalbumin zugesetzt zur Stabilisierung. Die Interferon-Aktivität wurde untersucht, wie durch Weissenbach et al. (Eur. J. Biochem. 98, 1-8, 1979) beschrieben, durch Verdünnen jeder Fraktion in Serie in einer Mikroplatte mit 95 Vertiefungen. Jede Vertiefung erhielt 2 bis 3 x IO4 SF11 menschliche Fibroblaste in 0,1 ml «Minimum Essential Medium» (Gibco), 5% fötales Kalbserum (FCS), 0,5% Gentamycin. Nach 18 Stunden bei 37 °C wurde das Medium entfernt und vesiculare Stomatitis-Viren (VSV) in einer Menge von 1 pfu/Zelle in Medium mit 2% FCS zugesetzt. Die Inhibierung der cytopathischen Wirkung wurde 30 bis 40 Stunden nach der Infektion aufgezeichnet. Im Vergleich zu IFN-NIH-Standard G023-902-527. Die antivirale Aktivität wurde ferner gemessen durch Reduktion von 3H-Uridin-Einverleibung nach VSV-Infektion wie zuvor beschrieben (Weissenbach et al., Eur. J. Biochem. 98, 1-8, 1979). Ein Antiserum zu IFN-ß wurde von Kaninchen erhalten und wie zuvor beschrieben untersucht (Weissenbach et al., Eur. J. Biochem. 98, 1-8, 1979). Für den Neutralisie-rungstest wurde 0,1 ml Antiserum (mit einem Titer von 104 U/ml) oder Nichtimmunoserum mit 0,2 ml einer 50%igen Suspension von Protein-A-Sepharoseperlen (Pharmacia Fine Chem.) in PBS während 1 Stunde bei 37 °C vermischt. Die Perlen wurden zweimal mit PBS gewaschen und 0,1 ml bakterielles Interferon (100 U/ml) wurden zugesetzt. Nach 2 Stunden bei 37 C wurden die Perlen zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit auf die Inhibierung von 3H-Uridin-Einverleibung in VSV-infizierte Zellen untersucht.

Isolierung von genomischem Clon: IFN-a c-Clon 18-3

Zwei kurze einsträngige Oligonucleotide, welche chemisch wie oben synthetisiert worden waren, wurden verwendet, um die menschliche Gen-Bibliothek direkt zu sieben. Die Oligonucleotide sind komplementär zu gewöhnlichen Sequenzen von IFN-a-Genen und wiesen die Sequenz 5'OTCTGACAACCTCCC 3' und 5'CCTTCTGGAA CTG 3' auf. Die Oligonucleotide wurden verwendet nach 5'-Markie-rung, wie oben, entweder direkt oder als Primer für cDNA-Synthese auf RNA als mit Sendai-Virus induzierte menschliche Leukämie-Zellen. Die 32P-01igonucleotide oder primed cDN As wurden hybridisiert zu einem Total von 500 000 X-Recombinant-Phagen, wie oben dargestellt. Etwa 5 x 105 cpm wurden pro 9 cm Nitrocellulosefilter verwendet. Die Hybridisierungen wurden in minimalen Flüssigkeitsvolumina in versiegelten Kunststoff-Kochbeuteln durchgeführt. Die Hybridisierung mit den 15 «base primers» erfolgte wie folgt:

Zuerst Vorhybridisierung in 6xSSC, 10 x Denhardts bei 37 C während 4 Stunden; dann Hybridisierung in 6xSSC, 10 x Denhardts bei 37 C während 18 Stunden und drei- bis viermaliges Waschen, je 30 Minuten in 6xSSC bei 37 °C oder bis keine Zählung mehr in der Waschflüssigkeit erfolgen konnte. Für die Hybridisierung mit dem 13 «base primer» wurden die Hybridisierung- und Waschtemperaturen auf 30 C gesenkt. Ein Total von 16 Phagen ergab positive Hybridisierung und wurde ferner durch «restriction map-ping» und DNA-Sequenzen analysiert. Es wurde nachgewiesen, dass Clon 18-3 drei IFN-a-gene trägt, von denen eines eine identische Sequenz wie diejenige von cDNA-Clon-ac von Goeddel et al. (Nature 290, 20-25, 1981) aufweist. Clon 18-3 wurde gereinigt, wie für Clon C15 oben beschrieben. Die Expression von Clon 18-3 X,-Bakterio-Phagen und nach Einführung in Expressions-Plasmid-Vektor ist in den Resultaten beschrieben.

Resultale

1. Struktur von Genom-IFN-ßrCJ5-Clon

Dieser Phagen-Clon wurde aus einer Bibliothek von menschlicher DNA isoliert, welche partiell mit Eco RI digeriert und in den Armen von /.-Charon 4A clonisiert worden war. Der Clon hybridiserte stark zu zwei verschiedenen IFN-ß, cDNA-Proben, die unabhängig voneinander aus mRNa-Fraktionen von zwei Stämmen menschlicher Fibroblaste hergestellt worden waren. Die Digestion des Phagen DNA durch Eco RI zeigte zusätzlich zu den zwei X-Armen vier Fragmente von 12, 2,6, 1,84 und 0,6 Kilo-basen (Fig. 1A). Der Transfer von Nitrocellulose nach der Methode von Southern (J. Mol. Biol. 98, 503-517, 1975) und die Hybridisierung mit translatierter DNA auf dem IFN-ß, 1-6-6 cDNA-Clon zeigte, dass das 1,84 kb Fragment das IFN-ß,-Gen enthält. Dieses Eco RI-Fragment wurde in den Eco RI-Sitz von PBR322 reclonisiert. Die Restriktionsanalyse dieses 1,84 kb Subclons mit Bgl II, Pvu II, Pst I, Hinc II und Taq I sowie die Hybridisierung mit IFN-ß, cDNA-Proben von Teil- und ganzer Länge erlaubten die Folgerung, dass die Codierungssequenz für IFN-ß,-Präprotein (Hinc Ii-Sitz) etwa 350 Nucleotide vom Eco RI-Sitz anfängt (Fig. 1A). Die Distanzen zwischen den verschiedenen Restriktionssitzen in der Genom-DNA sind dieselben wie in der cDNA-Sequenz innerhalb der experimentellen Fehlergrenzen (Tabelle I). Keine unerwarteten Restriktionssitze wurden innerhalb der IFN-ß,-Codierungsregion gefunden, was die Abwesenheit von jeder fassbaren Störsequenz anzeigte.

Partielle Eco RI-Digeste von C15 DNA zeigten, dass das 0,6 kb Eco RI-Fragment zwischen den 1,84 und 2,6 kb Eco RI-Fragmenten liegt. Ein Bam HI-Sitz wurde in dem 2,6 kb, doch keiner in den anderen Eco RI-Fragmenten der menschlichen DNA-Insertion gefunden. Das 1,84 kb Eco Ri-Fragment, welches zu IFN-ß, cDNA hybridisert, wurde auf einem 9,6 kb Bam HI-Fragment von C15 DNA gefunden. Wie in Fig. 1 dargestellt, kann dieses Fragment nur aus dem Bam HI-Sitz des ^-rechten Armes (5,1 kb von Eco RI entfernt) herrühren, wobei 4,5 kb für das Eco RI-Bam HI-Segment des menschlichen Einflusses belassen werden, und anzeigen, dass das 1,84 kb Eco RI-Fragment im Anschluss an den X-rechten Arm liegen muss. Die Gen-Orientierung (Fig. 1A) wurde wie folgt bestimmt. Wenn C15 DNA mit Pvu II geschnitten und zu der vollen Länge oder zu der 3'-Hälfte von IFN-ß, cDNA hybridisiert wurde, wurde ein 0,66 kb Fragment gefunden, welches nur an das 5'-Ende von IFN-ß, hybridisierte Wenn jedoch das 1,84 kb Eco RI-Stück mit Pvu II geschnitten wurde, befand sich das 5'-Ende von IFN-ß, auf einem kleineren 0,54 kb Fragment. Da kein Pvu Ii-Sitz in 0,6 kb Eco RI-Stück des menschlichen Einschlusses gefunden werden konnte, muss das 0,66 kb Pvu II-Fragment im X-rechten Arm enden und daher ist das 5'-Ende von IFN-ß, am nächsten zum Anrechten Arm. Die in Fig. 1A dargestellte Struktur wird durch verschiedene andere «restriction map-ping» -Versuche unter Verwendung von Hind III, Sma I und Bgl II-Digestionen unterstützt. Die Codierungssequenz des IFN-ß,-Gens in Clon C15 war daher etwa 1,775 Nucleotide entfernt vom starken À.PL-Promotor eingeführt, welcher die linksgerichtete Transcription reguliert (Williams et al.. Gene-tic Engineering, Vol. II, Seiten 201- 281, 1980, Plenum Corp.), und in der richtigen linksgerichteten Orientierung. Dies zusammen mit der Abwesenheit von feststellbaren In-tronen führte zur Untersuchung, ob Interferon in E. coli erzeugt werden konnte, welche mit dem C15-Recombinant-Phagen infiziert sind.

2. Gewinnung von biologischer Interferönaktivitcit aus Lysaten von E. coli, welche durch das IFN-ß/ C 15-Phagen infiziert wurden:

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Phagen aus Clon C15 wurden in 500 ml Kulturen von E. coli DP50. wie oben bei den Verfahren beschrieben, gezüchtet. 10 ml des geklärten Lysates wurden dialysiert und auf eine kleine Cibacron-Blau Sepharose-Säule (0,3 ml) geladen, worauf die Fraktionen auf die Inhibierung der cytopathi-schen Wirkung von vesicularem Stromatitis-Virus (VSV) untersucht wurden, mit einen IFN-ß-Standard als Referenz. In einem Versuch, in welchem der Phagentiter im Lysat 1,3 x 10'" Phagen ml betrug, wurde das Interferon-Aktivitätsmu-ster. das in Fig. 2 dargestellt ist, beobachtet. Ein Total von 7500 Einheiten IFN-Aktivität wurde auf den Fraktionen gewonnen. welche mit 50% Propylenglykol - 1 M NaCl aus der Säule eluiert worden waren. Dies würde 0,75 x 106 Einheiten Liter Lysat entsprechen. Im rohen Lysat war jedoch die messbare Aktivität wesentlich geringer, was darauf schliessen lässt. dass gewisse Materialien im Lysat die korrekte Bestimmung der IFN-Aktivität verhindert. In einem Rekonstruktionsversuch wurde Standard-Menschen-IFN-ß zu einem Wildtypus A.-Charon 4A-Lysat zugesetzt, und die gemessene Aktivität war tatsächlich nur ein Zehntel der Zugabe. Wenn dieses Gemisch durch die Blau-Sepharose-Säule geleitet wurde, wurden 75% der ursprünglichen Aktivität gewonnen. In einem Kontrollversuch wurde das Lysat vom Wildtypus /.-Charon 4A-Phagen (ohne Zusatz von IFN) analysiert, und es wurde keine IFN-Aktivität gefunden (Figur 2).

Das chromatographische Verhalten von IFN aus Lysaten von Clon C15 kann variieren. In einem Versuch, in welchem der Phagen-Titer 3 x 10" pfu/ml betrug, war die IFN-Aktivität hoch, wurde jedoch nicht zurückgehalten auf der Blau-Sepharose-Säule. In diesem Versuch betrug die gesamte aus der Säule gewonnene Aktivität 70-80 000 Einheiten IFN bei einem Einsatz von 10 ml Lysat (7 bis 8 x 106 Einheiten/Liter). Die ausfliessenden Fraktionen wurden auf einer zweiten Blau-Sepharose-Säule readsorbiert; diesmal wurde die Aktivität auf der Säule zurückgehalten, jedoch wiederum durch Waschen der Kolonne nur mit PBS eluiert. Menschliches IFN-ß, sollte normalerweise aus Blau-Sepharose nur mit hydrophoben Lösungsmitteln eluiert werden (Knight et al., Science 207, 525 -526, 1980). Standard menschliches IFN-ß wurde daher mit demselben Phagen-Lysat vermischt und auf die Säule verbracht: 30% der Aktivität wurde nicht zurückgehalten und die Gewinnung der Aktivität betrug lediglich 25%. Dies legt nahe, dass Komponenten dieses Lysates wahrscheinlich die Zusammenwirkung von IFN-ß, insbesondere dasjenige, welches durch Bakterien erzeugt wird, mit Blau-Sepharose destabilisiert. Obwohl Interferon auf der Säule nicht zurückgehalten wurde, wurden über 90% des Proteins des Lvsates aus den aktiven Fraktionen entfernt, welche eine spezifische Aktivität von 4 bis 5 x 105 U mg Protein aufwiesen Diese partielle Reinigung war wesentlich, um die Chemikalien zu entfernen, welche die Aktivität in den rohen Lysaten markiert hatten. In einem Versuch wurde die Clon C15 IFN-Aktivität auch gewonnen nach der Chromatographie des Lysates an Carboxymethyl-Sepharose (nicht dargestelt.)

3. Eigenschaften von Interferon, welches in E. coli erzeugt wurde, welche durch Clon C15 infiziert waren.

Die nach der Chromatographie-Stufe gewonnene Interferon-Aktivität reduzierte 3H-Uridin-Einverleibung in VSV-in-fizierten menschlichen Zellen, welche mit Actinomycin-D behandelt waren (Weissenbach, Eur. J. Biochem. 98, 1-8, 1979). Die Titrationskurve, welche für das bakterielle IFN-ß erhalten wurde, war ähnlich derjenigen für Standard menschliches IFN-ß (Fig. 3). Um die immunologischen Eigenschaften des bakteriellen IFN zu untersuchen, wurde das teilweise gereinigte Produkt mit Kaninchen-Anti-IFN-ß-Se-

rum (inaktiv auf IFN-a) oder mit Kaninchen-Nichtimmun-Serum, welches an Protein A-Sepharose vorgebunden worden war, vermischt. Nach dem Zentrifugieren wurde die überstehende Flüssigkeit auf IFN-Aktivität untersucht: An-ti-IFN-ß-Serum entfernte jegliche Interferon-Aktivität, während die Aktivität verblieb, wenn Nichtimmun-Serum verwendet wurde (Fig. 3). Das bakterielle IFN (20 U/ml) wurde auf ähnliche Weise neutralisiert, wenn es lediglich mit Anti-IFN-ß (20 U/ml) auf der Zellkultur vermischt wurde und durch Inhibition der cytopathischen Wirkung VSV untersucht wurde.

Die Artspezifität des bakteriellen Interferons wurde untersucht durch Vergleich von verschiedenen Zelltypen. Als menschliches IFN-ß zeigte das Produkt von mit Clon C15 infizierten E. coli weniger als 10% Aktivität auf Affennierenzellen BSC-1 und Rinder- MDBK-Zellen verglichen mit menschlichen Zellen. Es wurde keine nachtweisbare Antivirale Aktivität an Maus L- oder A9-Zellen beobachtet (Tabelle II). Dieselben Resultate wurden erhalten mit 6000 U/ml des bakteriellen IFN, das durch Clon C15 erzeugt worden war.

Die vorliegende Erfindung zeigt somit, dass das IFN-ßr Gen, welches direkt aus partiellen Eco RI-Fragmenten von menschlicher genomischer DNA durch Clonisierung in X-Charon 4A isoliert wurde, exprimiert werden kann und zur Ansammlung von beträchtlichen Mengen an IFN-Aktivität in den Kulturlysaten führt. Die erzeugte Aktivität ist klarerweise Fibroblast-Interferon (ß), wie durch dessen immunologische Eigenschaften und Artspezifität gezeigt wurde. Die Aktivität wird durch die Bakterienkultur nur als Antwort auf die Infektion durch den IFN-ß| C15-Phagen -Clon erzeugt. Die durch Clon 15 in E. coli erzeugte IFN-Aktivität gleicht dem menschlichen IFN-ß in seinen chromatographischen Eigenschaften auf Cibacron-Blau-Sepharose. Der chromatographische Schritt ist wesentlich, um hohe Aktivität (bis zu 7 x 106 U Liter) aus dem Bakterienlysat zu gewinnen. Interferone ergeben somit die ersten Beispiele von biologisch aktiven Proteinen, welche durch Bakterien unter Leitung eines Stückes von menschlicher DNA erzeugt werden, welche direkt aus dem Genom eines Individuums entnommen wurde.

4. Genomisches IFN-a, 18-3 Clon

Dieser Clon wurde durch direkte Hybridisierung auf kurzen Oligonucleotiden identifiziert, welche chemisch synthetisiert wurden, um komplementär zu Sequenzen in IFN-a zu sein. Aus einem Total von 0,5 x 106 Genomen waren 16 Clone positiv in der Hybridisierung. Die Eco RI-Fragmente, welche zu den Oligonucleotiden hybridisierten, wurden sequenziert und es zeigte sich, dass Clon 18-3 (wie in Fig. 1B) ein 2 kb Eco RI-Fragment 18-33 (Einschluss von Fig. 1B) enthält, in welchem das Gen für IFN-ac enthalten ist. Dieses Gen ist klarerweise die Quelle der mRNA, welche zu dem IFN-ac-Clon führte, der von Goeddel et al. (Nature 290, 20-25. 1981) beschrieben wurde. Clon 5-1 stellt ein überlappendes -DNA-Fragment dar. Clon 5-1 und Clon 18-3 tragen zusammen zusätzlich zu IFN-ac zwei weitere IFN-a-Gene, welche als at.2 und a -c4 bezeichnet werden (Fig. 1B).

5. Expression von menschlichem IFN genomischem Fragment unter recA-Promotor-Regulierung

Der recA-Promotor wird als einer der stärksten E. coli-Promotoren betrachtet. Normalerweise wird er dicht zurückgedrängt durch das Produkt des lex-Genes, selbst wenn er auf einem Multikopie-Plasmid, wie pBR322 zugegen ist. In Gegenwart von beschädigter DNA wird er dazu induziert, seinen eigenen Repressor zu spalten und er erfährt Induktion in sehr hohem Masse (Sancar und Rupp, PNAS 76,

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3144 3148, 1979). Die Standard-Induktoren für recA sind Nalidixinsäure (welche die DNA-Synthese blockiert oder Mitomycin-C (welches DNA vernetzt).

Ein Plasmid, pDRI453, welches das clonisierte recA-Gen enthält, wurde verwendet, um den Promotor auf einem Taql-BamHI-Fragment von etwa 1 Kilobase zu isolieren. Dieses wurde in pBR322 gebunden, welches mit Clal und BamI aufgeschlossen worden war, um Plasmid RAP-1 zu bilden. Die Tagl-CIal-Ligation stellt den Clal-Sitz in diesem Fall wieder her, wodurch dem Plasmid ermöglicht wird, einzig im dritten Codon des recA-Genes geöffnet zu werden. RAP-2 wurde konstruiert durch Schneiden von RAP-1 mit Eco Ri und Clal, Einfüllen der stumpfen Enden und Wiederverbinden, wodurch der RI-Sitz wieder hergestellt wird. Wenn RAP-2 am RI-Sitz geöffnet wird, kann fremde DNA am dritten Codon des recA-Proteins eingeführt werden.

Der RAP-1-Vektor wurde für die indirekte Expression von Interferonaktivität durch genomische Fragmente aus der menschlichen genomischen Bibliothek verwendet. Das IFN-ßi-Gen und verschiedene isolierte IFN-u-Gene der ac-Unter-klasse erzeugten starke Interferon-Aktivität (bestimmt durch die Standard antiviralen Untersuchungen), wenn sie in dieses Plasmid eingeführt wurden. Die Ri-Fragmente von DNA, aufweichen diese Gene sich befinden (Fig. 1A und 1B) wurden in den RI-Sitz des RAP-1-Plasmides subclonisiert. Das Plasmid wurde in einen reeA "-Gastgeber verbracht, die Bakterien gezüchtet und mit Nalidixinsäure induziert, die Zellen geerntet, durch Lysozym plus 30% Propylenglykol der Lyse unterworfen und der Extrakt auf seine antivirale Aktivität untersucht. Die Höhe der Aktivität hängt klar von der Induktion durch Nalidixinsäure ab, wobei das Optimum bei 50 |ig ml liegt (Tabelle III). Interessanterweise erzeugt das genomische Fragment in einigen Fällen Aktivität in beiden möglichen Richtungen inbezug auf den recA-Promotor. Die IFN-ßr und IFN-a-Gene, welche Aktivität zeigten, befanden sich alle auf DNA-Eco RI-Fragmenten von 1,8 bis 2 Kilobasen, so dass die Distanz vom Promotor zum ATG-Start-Codon des Interferon-Genes in der Grössenordnung von Hunderten von Nucleotiden liegt.

Diese Versuche zeigen, dass der Promotor wie erwartet funktioniert, und sie ermöglichen rasche Bestimmungen, welche interferonähnliche Gene aus der Gen-Bibliothek aktiv sein können.

6. Hohe Expression von IFN-ß,-Gen unter der Regulierung des hybriden Trip-kic-Promotors

Das Plasmid PLJ3 (Johnsrud, PNAS, 75, 5314-5318, 1978) enthält zwei lac-Promotoren, jeder 95 Basenpaar lang, getrennt durch 95 nichtverwandte Nucleotide. Dieses 285 Nucleotiden Fragment wird in den Eco RI-Sitz des Plasmides PMB9 eingesetzt. Diese 95 Basenpaar langen lac-Sequen-zen enthalten die Operator- und Motor-Sequenz und hört unmittelbar vor der ATG der ß-Galactosidase auf. Eine codierende DNA-Sequenz mit einem ATG-Initiator, eingesetzt in der richtigen Distanz von der ribosomalen Bindungsstelle des ß-Gaiactosidase-Genes entfernt, sollte korrekt in E. coli-Zellen experimentiert werden. Das 285 Basenpaare-Eco RI-Fragment wurde in pBR322 am Eco RI-Sitz reclonisiert; die Recombinanten wurden durch Züchten der Zellen auf Platten, welche 40 |.ig;ml X-gal und 15 (ig/ml Tetracyclin enthielten, gescreent. Nur positiv blaue Kolonien wurden gesammelt und die DNA durch CsCl-Gradientenzentrifugation gereinigt.

Zwei Richtungen der lac-Promotoren wurden erwartet; gegen das Ampicillin-Gen oder gegen das Tetracyclin-Gen von pBR322. Da wir daran interessiert sind, nur den Eco RI-Sitz zu haben, welcher zwischen der lac-ribosomalen Bindungsstelle und der pBR322-Sequenz liegt, wurde dieser Sitz geschützt, indem RNA-Polymerase an das Plasmid DNA gebunden wurde, während der distale Sitz durch Eco RI-Re-striktion offen war, mit dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase gefüllt und wieder gebunden wurde. Nach Transformation von MM294 E. coli-Zellen wurden Plasmide isoliert und die Distanz zwischen dem Eco RI-Sitz und dem Bam Hi-Sitz von pBR322 gemessen. Die Plasmide, welche ein 375 ßasenpaarfragment enthielten, waren jene, in welchen die lac-Promotoren gegen das Tetracyclin-Gen gerichtet sind, während jene, welche ein 670 ßasenpaarfragment (375 ± 295 b.p.) enthielten, die lac-Promotoren gegen das Ampicillin-Gen gerichtet enthielten.

Aus dem Eco RI 1,84 kb Subclon des IFN-ß, genomischen Fragmentes wurde ein HincII-Bglll-Fragment geschnitten, welches die Prä-Interferon-Sequenz enthielt. Das reife lFN-ßrProtein enthält an seinem NH2-Ende ein Methionin, welches als Initiator-Codon in E. coli verwendet werden kann. Es bestehen zwei Alul-Sitze nahe an diesem ATG-Codon, getrennt durch 13 Nucleotide, ein Alul-Sitz ist 8 Nucleotide vor dem ATG, während der andere 2 Nucleotide nach dem ATG liegt. Eine partielle Alul-Digestion wurde an dem HinclI-ßglll-Fragment durchgeführt und Fragmente etwa 510 BaSenpaare wurden aus Agarosegelen isoliert. Der. Vektor, welcher die lac-Promotoren gegen das Tetracyclin-Gen enthielt, wurde mit Eco RI eingeschränkt, der Sitz durch DNA-Polymerase gefüllt und mit BamHI wieder geschnitten. Nach Verbindung der AluI-BgHI-Fragmente an den gefüllten Eco Ri-BamHI-Vektor wurden die Eco RI-Sit-ze wieder hergestellt. Um zwischen den Clonen, welche das ATG-Codon (13 Nucleotide länger) enthalten, unterscheiden zu können, wurden die erhaltenen Clone mit Eco RI und Pstl eingeschränkt; die Clone, welche die erwarteten 151 Ba-senpaaren-Fragmente enthielten, wurden sequenziert. Der Eco RI-Sitz wurde dann wieder geöffnet und die Distanz zwischen der ribosomalen Bindungsstelle und dem ATG durch Bai 31-Digestion gekürzt, und wieder geschlossen. E. coli-Zeilen, welche durch diese Plasmide transformiert worden waren, wurden für die IFN-ßrErzeugung ausgewählt.

Es wurde gefunden, dass ein Clon L-ll etwa 3 x IO6 U/ Liter IFN-ß erzeugte. Die lac-Promotor-Region in diesem Code wurde mit HpaHI geschnitten, d.h. 17 Nucleotide vor Beginn der mRNA. Um das IFN-ßrGen auszuschneiden, wurde das Enzym Sau3a verwendet, welches die DNA genau 3 Nucleotide hinter dem End-Codon von IFN-ß] schneidet. Dieses HpaII-Sau3a-lac-IFN-ßrFragment wurde zwischen den Clal und Hindill-Sitzen eines Tryp-Promotor-Plasmides eingeführt, welches wie folgt hergestellt worden war. Ein 180 Nucleotide langes Taql-Taql-Fragment aus —21 bis —201 vor Beginn der Tryp-mRNA wurde aus dem Tryp-Plasmid pEP 121-221 ausgeschnitten und in den Clal-Sitz von pBR322 clonisiert. Es wurde diejenige Richtung gewählt, in welcher das Tryp-Promotor-Fragment uhrzeigerweise orientiert ist. Diese Operation stellt einen Clal-Sitz in Stellung — 21 des Try-Promotors wieder her. Nach Bindung an das lac-IFN-ßrFragment wird ein hybrider Promotortryp-lac vor dem IFN-ßrGen gebildet. Dieses Plasmid TL-11 wurde verwendet, um E. coli MM294 oder E. coli Minizellenstamm p679-54 umzuwandeln. Diese Bakterien erzeugen 108 U/Liter IFN-ß, unter Fermentorkultur zu einem OD650 von 10, was zeigt, dass das IFN-ß, genomische DNA-Fragment sehr aktiv ist (Fig. 4).

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Tabelle /

Restriktionssitz in IFN-ßi -cDNA und Gen

Restriktionssitze

Distanz zwischen den Sitzen berechnet aus

ß, cDNA-Sequenz*

gemessen von ß, aenomischer DNA **

Taq I - Pvu II Hinc II - Pvu II Hinc II - Bel II Pvu II - Bgl II Pst I - Bal II

Nucleotide

255

204

570

366

363

Nucleotide

250

210

570

360

360

* Aus Taniguchi et al. (Gen 10, 11-15. 1980)

** gemessen von 1.84 kb Eco RI-Fragment

Die berücksichtigten Hinc II und Taq 1-Sitze sind die nächsten zum 5 -Ende des Genes.

Tabelle II

Art-Spezifität von bakteriellem Interferon, das durch genomischen IFN-ßi CI5-Clon erzeugt wurde

Interferon

Interferon Titer.

U ml

quelle

Mensch

Affe

Rind

Maus

Maus

FS-1I-

BSC-1-

MDKB-

L-Zellen

-A9-Zellen

Zellen

Zellen

Zellen

1. Menschliche

1.500

32

32

<4

<4

SF11-Zellen

2. E. coli infiziert

1.00

32

32

<4

<4

durch C15-Clon

Das bakterielle IFN wurde nach Chromatographie des C15-Lysates an Cibacron-Blau-Sepharose. wie in Fig. 2. verwendet.

Tabelle III

IFN-a und ß-Aktivitäten erzeugt durch genomische Fraamente im recA-Plasmid RAP-1

Versuch Clon

Bedingungen

IFN-Akti-vität U ml

1. RAP-1 (1833)- + Nalidinsäure 500 IFN-a,

RAP-1 (1833)-

IFN-ac — Nalidinsäure

2. RAP-1 (1833)- richtige

IFN-a,

RAP-1 (631)-IFN-ß,

RAP-1 (631)-IFN-ß,

Clon RAP-1

Clon RAP-1

Orientierung richtige Orientierung gegenteilige Orientierung

<32

1000

3000

750

(1833) enthält das Eco RI-Fragment mit lFN-atGen (Fig. 1B).

(631) enthält das Eco RI-Fragment mit IFN-ß |-Gen (Fig. 1A)

Fragmente werden zu Beginn des recA-Genes eingeführt. Die Orientierung wird inbezug auf recA-Promotor-Orientie-45 rung gegeben.

Legenden für die Figuren:

Fig. IA: Schematische Struktur von IFN-ßrClon CI5 DNA

(a) Schematische Karte von X-Charon 4A. Die beiden 50 Arme sind in ausgefüllten Strichen dargestellt.

(b) Struktur der menschlichen DNA-Insertion in Clon C15, die geschwärzte Fläche zeigt das Eco RI-Fragment, welches zu IFN-ß, cDNA hybridisiert.

(c) Vergrösserung der geschwärzten Fragmentfläche aus 55 (b), als Doppellinie ungeschwärzt dargestellt. Die Einzellinie ist Teil des rechten >.-Armes. PL ist der rückwärtige I-Promo-tor.

(d) Position der IFN-ß, mRNA. Die obere Skala ist für (a) und (b). Die untere Skala für (c) und (d). Für Einzelhei-

60 ten siehe Text.

Fig. IB: Schema tische Struktur von IFN-a,.-Clon 18-3.

Die Restriktionskarte der Einschlüsse von zwei ^-Charon 4A-Clonen ist dargestellt. Das IFN-ac-Gen ist durch den 65 Pfeil Alph-c* bezeichnet. Zwei andere IFN-a-Gene sind in der Nähe von IFN-ac vorhanden. Die Einschlüsse zeigen das Eco RI 2 kb-Fragment 18-33, welches die IFN-ac-Gene enthält und in das recA-Plasmid reclonisiert wurde, wie im Text

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ausgeführt. Die Symbole für Restiktionsenzymsitz sind angegeben.

Fig. 2: Bestimmung von Interferon, welches durch den genomischen Clon IFN-ß) C15 auf Blau-Sepharose erzeugt wurde Rohes Lysat von E. coli DP50, infiziert durch Phagen C15 wurde fraktioniert, wie im Abschnitt Methoden und Materialien beschrieben, und die IFN-Aktivität wurde in jeder Fraktion bestimmt (• •). Die Proteinkonzentration wurde in denselben Fraktionen gemessen (• ■•). Eine parallele Chromatographie und Bestimmung des Lysates aus X-Charon 4A-Phagen ist dargestellt (□—□).

Fig. 3: Titration von genomischem Clon IFN-ß; C15-Interfe-ron

Eine Fraktion von Phagen C15 IFN aus der Säule in Fig. 2 (etwa 103 U/ml) wurde 1:40 verdünnt und dann serienmäs-sig in der Mikroplatte zur Bestimmung von IFN durch Verdünnung von VSV RNA-Synthese verdünnt, (o—o).

Menschliches Standard-Fibroblast-Interferon 25 U/ml wurde parallel dazu bestimmt (9- — •#). Kontrolle ohne VSV ( i i ) und mit VSV ohne IFN ( ywm ) sind dargestellt. Die beiden Kolonnen rechts zeigen die restliche Aktivität der s Phagen C15 IFN (Bei der Endverdünnung 1:40) nach Adsorption auf immobilisiertem Anti-IFN- oder nicht-immunem IgG, wie im Abschnitt Methoden beschrieben.

Fig. 4: Wachstum und IFN-Erzeugung in E. coli enthaltend 10 Plasmid TL11

Das TL11-Plasmid enthält einen hybriden Tripylac-Pro-motor und die Codierungssequenz für reifes menschliches IFN-ßb aus dem menschlichen genomischen Fragment, wie im Tex beschrieben. Bakterielle Kulturen wurden in einem 15 Einliter-New Brunswick-Fermentator gezüchtet, und zur angegebenen Zeit wurden Bakterien durch Lysozym-Propylen-glykol lysiert und die IFN-Aktivität auf menschlichen Zellen, welche mit VSV herausgefordert wurden, bestimmt. Die IFN-Aktivität ist berechnet pro Milliliter Bakterienkultur.

20

C

5 Blatt Zeichnungen

Claims (16)

1. 664 761

   2

   PATENTANSPRÜCHE

   1. Verfahren zur Herstellung von Human-Fibroblasten-Interferon-ß), dadurch gekennzeichnet, dass man ein menschliches Genom-DNA-Fragment, welches die genetische Information für Human-Fibroblasten-Interferon-ß, enthält, in einen Phagen einführt, Bakterien mit dem erhaltenen Phagen infiziert, die Bakterien züchtet und das Interferon gewinnt.
2. 2. Verfahren zur Herstellung von Human-Fibroblasten-Interferon-ß|. dadurch gekennzeichnet, dass man ein menschliches Genom-DNA-Fragment, welches die genetische Information für Human-Fibroblasten-Interferon-ßi enthält, in einen Phagen einführt, aus diesem Phagen ein DNA-Fragment, welches die genetische Information für Human-Fibroblasten-Interferon-ß, enthält, gewinnt, das derart gewonnene Fragement in ein Plasmid einfügt, welches befähigt ist, nach Einführung in ein Bakterium die Synthese von Hu-man-Fibroblasten-Interferon-ßi zu bewirken, Bakterien mit dem erhaltenen Plasmid infiziert, die derart infizierten Bakterien züchtet, und das erzeugte Interferon gewinnt.
3. 3. Verfahren nach Patentanspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Phage À-Charon 4A ist, aus welchem Clon C 15 mit der Gen-Karte gemäss Fig. 1A erhalten wird.
4. 4. Verfahren nach Patentanspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das infizierte Bakterium E. coli ist.
5. 5. Verfahren nach Patentanspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das menschliche Genom-DNA-Fragment aus dem Phagen gewonnen, in einen Plasmid-Expressions-Vek-tor eingeführt wird, welches mit einem starken Promotor versehen ist. welcher befähigt ist, die Synthese von Human-Fibroblasten-Interferon-ß, in einem Bakterium zu bewirken.
6. 6. Verfahren nach Patentanspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das verwendete Plasmid pBR322 ist, welches den recA-Promotor von E. coli enthält,
7. 7. Verfahren nach Patentanspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das menschliche Genom-DNA-Frag-ment, welches das IFN-ßrGen enthält, aus dem Plasmid entfernt wird, nahe am Codon für das erste Methionin des reifen IFN geschnitten wird und an die ribosomale Bindungsstelle des E. coli-lac-Promotors gebunden wird, der derart modifiziert ist, dass er die RNA-Polymerase-Bindungsstelle des Tryptophan-Promotors enthält, wodurch ein hybrider Tryp-lac-Promotor erhalten wird, das Plasmid wieder in das Bakterium eingeführt wird, und die Bakterien gezüchtet werden, um Interferon zu erzeugen.
8. 8. Verfahren zur Herstellung von Human-Leukozyten-Interferon-ac, dadurch gekennzeichnet, dass man ein menschliches Genom-DNA-Fragment, welches die genetische Information für Human-Leukozyten-Interferon-ac enthält, in einen À-Phagen einführt, Bakterien mit dem erhaltenen Phagen infiziert, die Bakterien züchtet und das Interferon gewinnt.
9. 9. Verfahren zur Herstellung von Human-Leukozyten-Interferon-ac, dadurch gekennzeichnet, dass man ein menschliches Genom-DNA-Fragment, welches die genetische Information für Human-Leukozyten-Interferon-ac enthält, in einen À-Phagen einführt, aus diesem Phagen ein DNA-Fragment, welches die genetische Information für Hu-man-Leukozyten-Interferon-ac enthält, gewinnt, das derart gewonnene Fragement in ein Plasmid einfügt, welches befähigt ist, nach Einführung in ein Bakterium die Synthese von Human-Leukozyten-Interferon-ac zu bewirken, Bakterien mit dem erhaltenen Plasmid infiziert, die derart infizierten Bakterien züchtet und das erzeugte Interferon gewinnt.
10. 10. Verfahren nach Patentanspruch 9, dadurch gekennzeichnet. dass der Phage À-Charon 4A ist, aus welchem Clon 18-3 mit der Gen-Karte gemäss Fig. 1B erhalten wird.
11. 11. Verfahren nach Patentanspruch 8 oder 9. dadurch gekennzeichnet, dass das infizierte Bakterium E. coli ist.
12. 12. Verfahren nach Patentanspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das menschliche Genom-DNA-Fragment aus dem Phagen gewonnen und in einen Plasmid-Expressions-Vektor eingeführt wird, welcher mit einem starken Promotor versehen ist, welcher befähigt ist, die Synthese von Human-Leukozyten-Interferon-ac in einem Bakterium zu bewirken.
13. 13. Verfahren nach Patentanspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das verwendete Plasmid pBR322 ist, welches den recA-Promotor von E. coli enthält.
14. 14. Verfahren nach Patentanspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass das menschliche Genom-DNA-Frag-ment, welches das IFN-ac-Gen enthält, aus dem Plasmid entfernt wird, nahe am Codon für das erste Methionin des reifen IFN geschnitten wird und an die ribosomale Bindungsstelle des E. coli-lac-Promotors gebunden wird, der derart modifziert ist, dass er die RNA-Polymerase-Bindungsstelle des Trypthophan-Promotors enthält, wodurch ein hybrider Tryp-lac-Promotor erhalten wird, das Plasmid wieder in das Bakterium eingeführt wird, und die Bakterien gezüchtet werden, um Interferon zu erzeugen.
15. 15. Human-Fibroblasten-Interferon -ßh hergestellt nach einem der Patentansprüche 1 bis 7.
16. 16. Human-Leukozyten-Interferon-ac, hergestellt nach einem der Patentansprüche 8 bis 14.