JPH05252977A - インターフェロンの製造法 - Google Patents
インターフェロンの製造法Info
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- JPH05252977A JPH05252977A JP4113784A JP11378492A JPH05252977A JP H05252977 A JPH05252977 A JP H05252977A JP 4113784 A JP4113784 A JP 4113784A JP 11378492 A JP11378492 A JP 11378492A JP H05252977 A JPH05252977 A JP H05252977A
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ヒト白血球型インターフェロンαc の遺伝子
工学技術による製造法が提供される。 【構成】 ヒト白血球インターフェロンαc をコードす
る配列を含むヒト遺伝子ＤＮＡ断片をλ−ファージに導
入し、得られるファージ組換え体で細菌を感染し、感染
細胞を培養することにより、ヒト白血球型インターフェ
ロンαc が製造される。
工学技術による製造法が提供される。 【構成】 ヒト白血球インターフェロンαc をコードす
る配列を含むヒト遺伝子ＤＮＡ断片をλ−ファージに導
入し、得られるファージ組換え体で細菌を感染し、感染
細胞を培養することにより、ヒト白血球型インターフェ
ロンαc が製造される。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はインターフェロン（ＩＦ
Ｎ）の製造法に関する。さらに詳細には、本発明はヒト
遺伝子ＤＮＡの断片を導入した適当な細菌によって線維
芽細胞（β）型または白血球（α）型のヒトインターフ
ェロンの大量生産方法に関する。血球から直接取ったヒ
トＤＮＡは適当なλ−ファージにクローン化される。こ
の組換え体λ−ファージによって感染された細菌中に高
インターフェロン生産が得られ、そのインターフェロン
はこの感染によって生じる細菌溶菌液から採取および精
製することができる。遺伝子ＤＮＡはまたプラスミド発
現ベクターを介して導入された細菌中で発現される。
Ｎ）の製造法に関する。さらに詳細には、本発明はヒト
遺伝子ＤＮＡの断片を導入した適当な細菌によって線維
芽細胞（β）型または白血球（α）型のヒトインターフ
ェロンの大量生産方法に関する。血球から直接取ったヒ
トＤＮＡは適当なλ−ファージにクローン化される。こ
の組換え体λ−ファージによって感染された細菌中に高
インターフェロン生産が得られ、そのインターフェロン
はこの感染によって生じる細菌溶菌液から採取および精
製することができる。遺伝子ＤＮＡはまたプラスミド発
現ベクターを介して導入された細菌中で発現される。
【０００２】
【従来の技術及び解決すべき課題】インターフェロン、
特にヒトインターフェロンは多分野で重要性を増しつつ
あるが、その生産は困難で、生産方法の改良が非常に重
要になっている。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌
における哺乳動物遺伝子の発現は、通常遺伝子の暗号配
列を中断する介在配列の存在により妨げられる。しかし
ながら、イントロンを持たない遺伝子もかなり存在す
る。最近、ナガタら（Ｎａｇａｔａｅｔ ａｌ）（１９
８０）〔Ｎａｔｕｒｅ ２８７，４０１−８〕はヒトの
白血球インターフェロン−α遺伝子がイントロンを欠く
ものの一つであることを示した。彼等は大腸菌内でのこ
れら遺伝子の低レベル発現を見出した。
特にヒトインターフェロンは多分野で重要性を増しつつ
あるが、その生産は困難で、生産方法の改良が非常に重
要になっている。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌
における哺乳動物遺伝子の発現は、通常遺伝子の暗号配
列を中断する介在配列の存在により妨げられる。しかし
ながら、イントロンを持たない遺伝子もかなり存在す
る。最近、ナガタら（Ｎａｇａｔａｅｔ ａｌ）（１９
８０）〔Ｎａｔｕｒｅ ２８７，４０１−８〕はヒトの
白血球インターフェロン−α遺伝子がイントロンを欠く
ものの一つであることを示した。彼等は大腸菌内でのこ
れら遺伝子の低レベル発現を見出した。
【０００３】二重鎖ＲＮＡによって誘導されたヒト二倍
体線維芽細胞は少なくともインターフェロンをコードす
る２つのｍＲＮＡを含んでいる〔ワイゼンバッハら（Ｗ
ｅｉｓｓｅｎｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．）、１９８０、
（ＰＮＡＳ）７７，７１５２−７１５６〕。０．９キロ
ベース（Ｋｂ）長（１１Ｓ）のｍＲＮＡはこれら細胞に
より生産される主インターフェロン種ＩＦＮ−β1 に相
当するが、そのアミノ酸配列は部分的に決定されている
〔ナイトら（Ｋｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，）１９８
０，Ｓｃｉｅｎｃｅ２０７，３２５−６〕。ベクターと
して大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２を用い、このＩＦＮ
−β1 ｍＲＮＡのｃＤＮＡを介するクローニングが達成
された〔ゲッデルら（Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａ
ｌ．），１９８０，Ｎｕｃｌｅｉｏ Ａｃｉｄ Ｒｅ
ｓ．，８，４０５７−４０７５〕。これらＤＮＡクロー
ンのヌクレオチド配列は決定された蛋白質配列に相当
し、発現プラスミド生成後、ＩＦＮ−β1 ｃＤＮＡは大
腸菌内でのヒトインターフェロンの合成を指令している
と証明された。
体線維芽細胞は少なくともインターフェロンをコードす
る２つのｍＲＮＡを含んでいる〔ワイゼンバッハら（Ｗ
ｅｉｓｓｅｎｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．）、１９８０、
（ＰＮＡＳ）７７，７１５２−７１５６〕。０．９キロ
ベース（Ｋｂ）長（１１Ｓ）のｍＲＮＡはこれら細胞に
より生産される主インターフェロン種ＩＦＮ−β1 に相
当するが、そのアミノ酸配列は部分的に決定されている
〔ナイトら（Ｋｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，）１９８
０，Ｓｃｉｅｎｃｅ２０７，３２５−６〕。ベクターと
して大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２を用い、このＩＦＮ
−β1 ｍＲＮＡのｃＤＮＡを介するクローニングが達成
された〔ゲッデルら（Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａ
ｌ．），１９８０，Ｎｕｃｌｅｉｏ Ａｃｉｄ Ｒｅ
ｓ．，８，４０５７−４０７５〕。これらＤＮＡクロー
ンのヌクレオチド配列は決定された蛋白質配列に相当
し、発現プラスミド生成後、ＩＦＮ−β1 ｃＤＮＡは大
腸菌内でのヒトインターフェロンの合成を指令している
と証明された。
【０００４】本発明者らは、ＩＦＮ−β1 遺伝子〔モー
リイら（Ｍｏｒｙ ｅｔ ａｌ．），１９８１，Ｅｕ
ｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２０，１９７−２０２〕
ならびにＩＦＮ−αc 遺伝子を担うヒト遺伝子断片を単
離した。これらの遺伝子はイントロンを欠き、従って大
腸菌内で直接発現させることができる。
リイら（Ｍｏｒｙ ｅｔ ａｌ．），１９８１，Ｅｕ
ｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２０，１９７−２０２〕
ならびにＩＦＮ−αc 遺伝子を担うヒト遺伝子断片を単
離した。これらの遺伝子はイントロンを欠き、従って大
腸菌内で直接発現させることができる。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、ヒト血球から
抽出したヒト遺伝子ＤＮＡの特定断片をバクテリオファ
ージベクターにクローン化しそれを直接利用して細菌内
でＩＦＮを合成させるようにし、その細菌を培養してイ
ンターフェロンを生産する方法に関する。従って、この
方法では長い工程は必要なく、ｍＲＮＡから全長の相補
的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）をクローニングする必要がない。
本発明に従えば、適当なＤＮＡ断片を容易に入手し得る
白血球のようなヒト細胞から直接取り、λ−ファージベ
クターにクローン化する。目的のＩＦＮ遺伝子はイント
ロンで中断されておらず、細菌内でＩＦＮ合成を指示で
きる。
抽出したヒト遺伝子ＤＮＡの特定断片をバクテリオファ
ージベクターにクローン化しそれを直接利用して細菌内
でＩＦＮを合成させるようにし、その細菌を培養してイ
ンターフェロンを生産する方法に関する。従って、この
方法では長い工程は必要なく、ｍＲＮＡから全長の相補
的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）をクローニングする必要がない。
本発明に従えば、適当なＤＮＡ断片を容易に入手し得る
白血球のようなヒト細胞から直接取り、λ−ファージベ
クターにクローン化する。目的のＩＦＮ遺伝子はイント
ロンで中断されておらず、細菌内でＩＦＮ合成を指示で
きる。
【０００６】ＩＦＮ−β1 遺伝子またはＩＦＮ−αc 遺
伝子を挿入したヒトＤＮＡを含む組換え体λファージに
よって大腸菌のような適当な細菌を感染させることによ
り高ＩＦＮ活性を生産した。ＩＦＮを感染によって生じ
る細菌溶解液から採取、精製した。ファージは細菌にヒ
トＤＮＡ断片を導入するための適当なベクターであるこ
とを見出した。とくにλ Ｃｈａｒｏｎ ４Ａファージ
は優れており、高ＩＦＮ生産をもたらした。さらに本発
明は強いプロモーターを備えたプラスミド発現ベクター
へのクローン化したヒト遺伝子ＤＮＡ断片の導入に関す
る。この方法はイントロンを欠くものであればＩＦＮ−
β1 同様ＩＦＮ−αでも実施できる。
伝子を挿入したヒトＤＮＡを含む組換え体λファージに
よって大腸菌のような適当な細菌を感染させることによ
り高ＩＦＮ活性を生産した。ＩＦＮを感染によって生じ
る細菌溶解液から採取、精製した。ファージは細菌にヒ
トＤＮＡ断片を導入するための適当なベクターであるこ
とを見出した。とくにλ Ｃｈａｒｏｎ ４Ａファージ
は優れており、高ＩＦＮ生産をもたらした。さらに本発
明は強いプロモーターを備えたプラスミド発現ベクター
へのクローン化したヒト遺伝子ＤＮＡ断片の導入に関す
る。この方法はイントロンを欠くものであればＩＦＮ−
β1 同様ＩＦＮ−αでも実施できる。
【０００７】一実施態様において、ヒト成人からのＤＮ
ＡをＥｃｏＲＩ消化で断片化しλＣｈａｒｏｎ ４Ａに
クローン化した。そのようにして得られたクローンをＣ
ｌｏｎｅ Ｃ１５と名付けた。そのクローンには約１７
ＫｂのヒトＤＮＡが挿入されており、また、それは線維
芽細胞インターフェロンＩＦＮ−β1 に対応する遺伝子
を含んでいると同定した。制限地図作成は１．８Ｋｂの
ＥｃｏＲＩ断片上に位置するこの遺伝子がイントロンに
よって中断されていないことを示した。このヒト遺伝子
ＤＮＡ断片は大腸菌や他の適当な細菌内で活性を有する
ヒトＩＦＮ−β1 の合成を指令することができる。ファ
ージ溶菌液から高ＩＦＮ活性が回収される。一定条件下
で、１０7 単位／リットル程度の活性をファージ溶菌液
から回収した。溶菌液をクロマトグラフィー、好ましく
はシバクロン・ブルー・セファロース（Ｃｉｂａｃｒｏ
ｎ Ｂｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）あるいは同様のカ
ラムにかける。かくして得られたインターフェロンはヒ
ト線維芽細胞が生産するＩＦＮと同じ免疫学的性質およ
び種特異性を有している。１３Ｋｂのヒト遺伝子断片を
含むクローン１８−３中に同定された遺伝子、ＩＦＮ−
αc で同様の結果を得た。
ＡをＥｃｏＲＩ消化で断片化しλＣｈａｒｏｎ ４Ａに
クローン化した。そのようにして得られたクローンをＣ
ｌｏｎｅ Ｃ１５と名付けた。そのクローンには約１７
ＫｂのヒトＤＮＡが挿入されており、また、それは線維
芽細胞インターフェロンＩＦＮ−β1 に対応する遺伝子
を含んでいると同定した。制限地図作成は１．８Ｋｂの
ＥｃｏＲＩ断片上に位置するこの遺伝子がイントロンに
よって中断されていないことを示した。このヒト遺伝子
ＤＮＡ断片は大腸菌や他の適当な細菌内で活性を有する
ヒトＩＦＮ−β1 の合成を指令することができる。ファ
ージ溶菌液から高ＩＦＮ活性が回収される。一定条件下
で、１０7 単位／リットル程度の活性をファージ溶菌液
から回収した。溶菌液をクロマトグラフィー、好ましく
はシバクロン・ブルー・セファロース（Ｃｉｂａｃｒｏ
ｎ Ｂｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）あるいは同様のカ
ラムにかける。かくして得られたインターフェロンはヒ
ト線維芽細胞が生産するＩＦＮと同じ免疫学的性質およ
び種特異性を有している。１３Ｋｂのヒト遺伝子断片を
含むクローン１８−３中に同定された遺伝子、ＩＦＮ−
αc で同様の結果を得た。
【０００８】他の実施態様では、ＩＦＮ−β1 あるいは
ＩＦＮ−αc 遺伝子を含むヒト遺伝子ＤＮＡ断片を大腸
菌のｒｅｃＡプロモーターを含むプラスミドｐＢＲ３２
２のようなプラスミドに導入した。これらの組換え体プ
ラスミドによって形質転換された大腸菌の培養で、ナリ
ジクス酸（ｎａｌｉｄｉｘｉｃ ａｃｉｄ）によりｒｅ
ｃＡプロモーターを誘導したとき、著量のＩＦＮ−βあ
るいはＩＦＮ−αが生産された。ＩＦＮ−β1 遺伝子断
片を成熟ＩＦＮ−β1 の最初のメチオニンに対応するコ
ドンの隣りで切り大腸菌ｌａｃプロモーターのリボゾー
ム結合部位に連結した。このｌａｃプロモーターをトリ
プトファンプロモーターのＲＮＡポリメラーゼ結合部位
を含むように改良した。この混成ｔｒｙｐ−ｌａｃプロ
モーターにより、遺伝子ＩＦＮ−β1 ＤＮＡは大腸菌ミ
ニセル株ｐ６７９−５４内で１０ 8 単位／リットルのＩ
ＦＮ−β1 を生産することができた。同様にＩＦＮ−α
c遺伝子をｔｒｙｐ−ｌａｃプロモーターに適切に継ぐ
ことにより充分量のＩＦＮ−αc を得た。いずれの場合
も、ＩＦＮ活性はリゾチームと３０％プロピレングリコ
ールで溶菌した細菌細胞から回収し、ファージ溶菌液の
ときと同様疎水性クロマトグラフ担体上で精製した。Ｉ
ＦＮ−β1 の好適な担体はシバクロン・ブルー・セファ
ロース（Ｃｉｂａｃｒｏｎ ｂｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅ）である。溶出はエチレングリコールや好ましくは
プロピレングリコールで行なうことができる。ＩＦＮ−
β1 あるいはαc の精製は、さらにモノクローナル抗体
カラム上の免疫親和性クロマトグラフィあるいは他の常
法によって行なわれる。
ＩＦＮ−αc 遺伝子を含むヒト遺伝子ＤＮＡ断片を大腸
菌のｒｅｃＡプロモーターを含むプラスミドｐＢＲ３２
２のようなプラスミドに導入した。これらの組換え体プ
ラスミドによって形質転換された大腸菌の培養で、ナリ
ジクス酸（ｎａｌｉｄｉｘｉｃ ａｃｉｄ）によりｒｅ
ｃＡプロモーターを誘導したとき、著量のＩＦＮ−βあ
るいはＩＦＮ−αが生産された。ＩＦＮ−β1 遺伝子断
片を成熟ＩＦＮ−β1 の最初のメチオニンに対応するコ
ドンの隣りで切り大腸菌ｌａｃプロモーターのリボゾー
ム結合部位に連結した。このｌａｃプロモーターをトリ
プトファンプロモーターのＲＮＡポリメラーゼ結合部位
を含むように改良した。この混成ｔｒｙｐ−ｌａｃプロ
モーターにより、遺伝子ＩＦＮ−β1 ＤＮＡは大腸菌ミ
ニセル株ｐ６７９−５４内で１０ 8 単位／リットルのＩ
ＦＮ−β1 を生産することができた。同様にＩＦＮ−α
c遺伝子をｔｒｙｐ−ｌａｃプロモーターに適切に継ぐ
ことにより充分量のＩＦＮ−αc を得た。いずれの場合
も、ＩＦＮ活性はリゾチームと３０％プロピレングリコ
ールで溶菌した細菌細胞から回収し、ファージ溶菌液の
ときと同様疎水性クロマトグラフ担体上で精製した。Ｉ
ＦＮ−β1 の好適な担体はシバクロン・ブルー・セファ
ロース（Ｃｉｂａｃｒｏｎ ｂｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅ）である。溶出はエチレングリコールや好ましくは
プロピレングリコールで行なうことができる。ＩＦＮ−
β1 あるいはαc の精製は、さらにモノクローナル抗体
カラム上の免疫親和性クロマトグラフィあるいは他の常
法によって行なわれる。
【０００９】上記から、ヒト遺伝子ＤＮＡ断片が大腸菌
および他の適当な宿主細菌中でヒトＩＦＮを高収率で生
産するために使えることは明らかである。上述のごと
く、本発明の方法は、ヒト遺伝子ＤＮＡの断片をファー
ジのような適当なベクターに導入し、細菌培養物を該フ
ァージで感染させることにより溶菌させ、溶菌物中の生
成インターフェロンを採取することからなる。本発明は
ヒト遺伝子ＤＮＡの導入によって得られる新規ファー
ジ、とくにＩＦＮ−β2 の生成に関与するｃｌｏｎｅ
Ｃ１５、ＩＦＮ−αc の生成に関与するクローン１８．
３のようなλ−型の組換え体ファージに関する。さらに
本発明はヒト遺伝子ＤＮＡを適当なファージに導入し、
該ファージから適当なＤＮＡ断片を採取し、これを適当
な細菌の発現プラスミドに導入し、該細菌を培養して目
的とするインターフェロンを採取することからなるイン
ターフェロンの製造法に関する。本発明の他の目的は下
記詳細な記載から明らかになるが、該記載は本発明を制
限するものではない。本発明の重要な利点は健康人ある
いは病人から得た遺伝子のＩＦＮ生産性を比較して、Ｉ
ＦＮ生産における遺伝的欠陥を研究することができるこ
とにある。
および他の適当な宿主細菌中でヒトＩＦＮを高収率で生
産するために使えることは明らかである。上述のごと
く、本発明の方法は、ヒト遺伝子ＤＮＡの断片をファー
ジのような適当なベクターに導入し、細菌培養物を該フ
ァージで感染させることにより溶菌させ、溶菌物中の生
成インターフェロンを採取することからなる。本発明は
ヒト遺伝子ＤＮＡの導入によって得られる新規ファー
ジ、とくにＩＦＮ−β2 の生成に関与するｃｌｏｎｅ
Ｃ１５、ＩＦＮ−αc の生成に関与するクローン１８．
３のようなλ−型の組換え体ファージに関する。さらに
本発明はヒト遺伝子ＤＮＡを適当なファージに導入し、
該ファージから適当なＤＮＡ断片を採取し、これを適当
な細菌の発現プラスミドに導入し、該細菌を培養して目
的とするインターフェロンを採取することからなるイン
ターフェロンの製造法に関する。本発明の他の目的は下
記詳細な記載から明らかになるが、該記載は本発明を制
限するものではない。本発明の重要な利点は健康人ある
いは病人から得た遺伝子のＩＦＮ生産性を比較して、Ｉ
ＦＮ生産における遺伝的欠陥を研究することができるこ
とにある。
【００１０】材料および方法 ヒト遺伝子ライブラリー（ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｌｉ
ｂｒａｒｙ）の調製： 高分子量ＤＮＡをβ−地中海貧血
（β−ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ）の成人の末梢血球から
調製した。ＤＮＡの一部（４０μｇ）をＥｃｏＲＩの１
００、２００、３００単位で３０分間別個に消化し、６
５℃で１０分間加熱し、前述したように一緒に１０〜４
０％蔗糖勾配にかけた。１０〜２０Ｋｂの間のＤＮＡ断
片を、マニアティスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａ
ｌ．）〔１９７８，セル（Ｃｅｌｌ）１５，６８７−７
０１〕の方法に従ってＥｃｏＲＩ消化により調製したλ
Ｃｈａｒｏｎ ４Ａ ＤＮＡアームに、モリィら（Ｍｏ
ｒｙ ｅｔ ａｌ．）〔１９８０，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．
Ｒｅｐｏｒｔｓ ６，２０３−２０８〕の記述に従って
Ｔ4 ＤＮＡリガーゼで連結した。
ｂｒａｒｙ）の調製： 高分子量ＤＮＡをβ−地中海貧血
（β−ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ）の成人の末梢血球から
調製した。ＤＮＡの一部（４０μｇ）をＥｃｏＲＩの１
００、２００、３００単位で３０分間別個に消化し、６
５℃で１０分間加熱し、前述したように一緒に１０〜４
０％蔗糖勾配にかけた。１０〜２０Ｋｂの間のＤＮＡ断
片を、マニアティスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａ
ｌ．）〔１９７８，セル（Ｃｅｌｌ）１５，６８７−７
０１〕の方法に従ってＥｃｏＲＩ消化により調製したλ
Ｃｈａｒｏｎ ４Ａ ＤＮＡアームに、モリィら（Ｍｏ
ｒｙ ｅｔ ａｌ．）〔１９８０，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．
Ｒｅｐｏｒｔｓ ６，２０３−２０８〕の記述に従って
Ｔ4 ＤＮＡリガーゼで連結した。
【００１１】試験管内パッケージング（ｐａｃｋａｇｉ
ｎｇ）は、ホーンおよびマレイ（Ｈｏｈｎ ａｎｄ Ｍ
ｕｒｒａｙ）〔１９７７，ＰＮＡＳ，．７４，３２５９
−３２６３〕の記述に従い、連結反応液（０．５μｇの
ベクターＤＮＡおよび０．１２５μｇのヒトＤＮＡ）８
μｌ数部を大腸菌ＢＨＢ２６８８〔Ｎ２０５ｒｅｃＡ -
（λ ｉｍｍ ４３４ ｃＩｔｓ ｂ ２ ｒｅｄ ３
Ｅａｍ ４ Ｓａｍ７）／λ〕とＢＨＢ２６９０〔Ｎ
２０５ｒｅｃＡ- （λ ｉｍｍ ４３４ ｃＩｔｓ ｂ
２ ｒｅｄ ３ Ｄａｍ １５ Ｓａｍ ７）／λ〕
の抽出物５０μｌと混合することにより行なった。
ｎｇ）は、ホーンおよびマレイ（Ｈｏｈｎ ａｎｄ Ｍ
ｕｒｒａｙ）〔１９７７，ＰＮＡＳ，．７４，３２５９
−３２６３〕の記述に従い、連結反応液（０．５μｇの
ベクターＤＮＡおよび０．１２５μｇのヒトＤＮＡ）８
μｌ数部を大腸菌ＢＨＢ２６８８〔Ｎ２０５ｒｅｃＡ -
（λ ｉｍｍ ４３４ ｃＩｔｓ ｂ ２ ｒｅｄ ３
Ｅａｍ ４ Ｓａｍ７）／λ〕とＢＨＢ２６９０〔Ｎ
２０５ｒｅｃＡ- （λ ｉｍｍ ４３４ ｃＩｔｓ ｂ
２ ｒｅｄ ３ Ｄａｍ １５ Ｓａｍ ７）／λ〕
の抽出物５０μｌと混合することにより行なった。
【００１２】組換え体ＤＮＡ １μｇ当り３×１０5 ｐ
ｆｕが得られた。一方手をつけていないλ ＤＮＡでは
１０8 ｐｆｕ／μｇであった。総量で１．８×１０6 の
組換え体ファージを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH
７．５）、１０ｍＭ ＭｇＳＯ 4 および０．０１％ゼラ
チンを含む液６mlで希釈した。０．１mlのクロロホルム
を加え、破砕物をミクロフュージ（ｍｉｃｒｏｆｕｇ
ｅ）遠心にて除き、ファージを大腸菌ＤＰ５０〔レーダ
ーら（Ｌｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．）１９７７，Ｓｃｅｉ
ｎｃｅ １９６，１７５−１７７）に４×１０3 ｐｆｕ
／１５cmプレートの割で植えて１０5 倍に増やした。選
別のために２×１０4 ｐｆｕを１５cmのプレートに植
え、二枚のニトロセルロースフィルターに、ベントンら
（Ｂｅｎｔｏｎｅｔ ａｌ．）〔１９７７，Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ １９６，１８０−１８２）〕の記述に従って、つ
づけて写した。この操作はＰ3 の封じ込め条件のもとに
行なった。
ｆｕが得られた。一方手をつけていないλ ＤＮＡでは
１０8 ｐｆｕ／μｇであった。総量で１．８×１０6 の
組換え体ファージを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH
７．５）、１０ｍＭ ＭｇＳＯ 4 および０．０１％ゼラ
チンを含む液６mlで希釈した。０．１mlのクロロホルム
を加え、破砕物をミクロフュージ（ｍｉｃｒｏｆｕｇ
ｅ）遠心にて除き、ファージを大腸菌ＤＰ５０〔レーダ
ーら（Ｌｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．）１９７７，Ｓｃｅｉ
ｎｃｅ １９６，１７５−１７７）に４×１０3 ｐｆｕ
／１５cmプレートの割で植えて１０5 倍に増やした。選
別のために２×１０4 ｐｆｕを１５cmのプレートに植
え、二枚のニトロセルロースフィルターに、ベントンら
（Ｂｅｎｔｏｎｅｔ ａｌ．）〔１９７７，Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ １９６，１８０−１８２）〕の記述に従って、つ
づけて写した。この操作はＰ3 の封じ込め条件のもとに
行なった。
【００１３】ＩＦＮ−β1 ｃＤＮＡプローブの調製：１
００μｇ／mlポリ（ｒＩ）：（ｒＣ）と５０μｇ／mlシ
クロヘキシイミド（最後の１時間は２μｇ／mlアクチノ
マイシンＤを含む）によって４時間誘導したヒト包皮線
維芽細胞ＦＳ１１からポリＡ+ を調製し、ワイゼンバッ
ハら（Ｗｅｉｓｓｅｎｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．）〔１９
８０，ＰＮＡＳ ７７，７１５２−７１５６：１９７
９，（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）９８，１−８〕
によって詳述された蔗糖勾配遠心分離によってインター
フェロンｍＲＮＡの２つのピークを分画した。
００μｇ／mlポリ（ｒＩ）：（ｒＣ）と５０μｇ／mlシ
クロヘキシイミド（最後の１時間は２μｇ／mlアクチノ
マイシンＤを含む）によって４時間誘導したヒト包皮線
維芽細胞ＦＳ１１からポリＡ+ を調製し、ワイゼンバッ
ハら（Ｗｅｉｓｓｅｎｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．）〔１９
８０，ＰＮＡＳ ７７，７１５２−７１５６：１９７
９，（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）９８，１−８〕
によって詳述された蔗糖勾配遠心分離によってインター
フェロンｍＲＮＡの２つのピークを分画した。
【００１４】１１ＳのｍＲＮＡ（１．５μｇ）を使いト
リ背髄芽球症ウイルス（Ａｖｉａｎｍｙｅｌｏｂｌａｓ
ｔｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）（Ｊ．Ｂｅａｒｄ）由来逆転
写酵素およびオリゴ（ｄＴ）とともに先のワイゼンバッ
ハら（Ｗｅｉｓｓｅｎｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．）〔１９
８０，ＰＮＡＳ７７，７１５２−７１５６〕の方法に従
ってＲＮＡ−ｃＤＮＡハイブリッドを調製した。このＲ
ＮＡ−ｃＤＮＡハイブリッドをハイブリッドの鎖延長の
ためのｄＣＴＰおよびｄＧ−鎖延長しＰｓｔＩ切断した
ｐＢＲ３２２ベクター〔チャンら（Ｃｈａｎｇ ｅｔ
ａｌ．），１９７８，Ｎａｔｕｒｅ ２７５，６１７−
６２４〕を用い、ザインら（Ｚａｉｎｅｔ ａｌ．）
〔１９７９，Ｃｅｌｌ １６，８５１−８６１〕に従っ
て直接クローン化した。ステンランドら（Ｓｔｅｎｌｕ
ｎｄ ｅｔ ａｌ．）〔１９８０，Ｇｅｎｅ １０，４
７−５２〕によって概説されたようにして総数１２，５
００のｔｅｔr ａｍｐs の大腸菌ＭＭ２９４形質転換株
を得た。
リ背髄芽球症ウイルス（Ａｖｉａｎｍｙｅｌｏｂｌａｓ
ｔｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）（Ｊ．Ｂｅａｒｄ）由来逆転
写酵素およびオリゴ（ｄＴ）とともに先のワイゼンバッ
ハら（Ｗｅｉｓｓｅｎｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．）〔１９
８０，ＰＮＡＳ７７，７１５２−７１５６〕の方法に従
ってＲＮＡ−ｃＤＮＡハイブリッドを調製した。このＲ
ＮＡ−ｃＤＮＡハイブリッドをハイブリッドの鎖延長の
ためのｄＣＴＰおよびｄＧ−鎖延長しＰｓｔＩ切断した
ｐＢＲ３２２ベクター〔チャンら（Ｃｈａｎｇ ｅｔ
ａｌ．），１９７８，Ｎａｔｕｒｅ ２７５，６１７−
６２４〕を用い、ザインら（Ｚａｉｎｅｔ ａｌ．）
〔１９７９，Ｃｅｌｌ １６，８５１−８６１〕に従っ
て直接クローン化した。ステンランドら（Ｓｔｅｎｌｕ
ｎｄ ｅｔ ａｌ．）〔１９８０，Ｇｅｎｅ １０，４
７−５２〕によって概説されたようにして総数１２，５
００のｔｅｔr ａｍｐs の大腸菌ＭＭ２９４形質転換株
を得た。
【００１５】誘導したＦＳ１１細胞の１１ＳｍＲＮＡ
（６μｇ）または非誘導細胞の総ポリＡ+ −ＲＮＡ
（３．７μｇ）から転写した32ｐ−ｃＤＮＡプローブで
コロニーハイブリッド化（ｃｏｌｏｎｙ ｈｙｂｒｉｄ
ｉｚａｔｉｏｎ）を行なった。ｃＤＮＡ合成は、合成相
補プライマー〔ナラングら（Ｎａｒａｎｇ ｅｔ ａ
ｌ．），１９７９，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．
６８，９０−９８参照〕であり、ＩＦＮ−β1 配列のＢ
ｇｌ II部位を含む５′ＧＡＧＡＴＣＴＴＣＡＧＴＴＴ
Ｃ ３′で開始した。32Ｐ−５′末端ラベル〔ヒュート
ンら（Ｈｏｕｇｈｔｏｎｅｔ ａｌ．），１９８０，Ｎ
ｕｃｌ．Ａｃ．Ｒｅｓ ８，１９１３−１９３１〕した
プライマーを用いて、予期した６４０ヌクレオチド長の
ｃＤＮＡがみられるのは誘導したＲＮＡを鋳型として用
いたときだけであった。プローブを調製するために、２
０ｐ ｍｏｌｅｓのプライマーを４μｌの０．４ＭＫＣ
ｌ中で３０℃６０分間各ＲＮＡとアニール（ａｎｎｅａ
ｌ）し、各２００μＣｉの32Ｐ−α−ｄＡＴＰとｄＣＴ
Ｐ（両方で４００Ｃｉ／ｍ ｍｏｌ）、各０．５ｍＭの
ｄＧＴＰとｄＴＴＰ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH
８．３）、４ｍＭ ＭｇＣｌ2 、５ｍＭジチオスレイト
ール、５０μｇ／mlアクチノマイシンＤ、４ｍＭピロ燐
酸および３０単位の逆転写酵素の混液２５μｌ中３７℃
で２時間インキュベートした。２５μｇの大腸菌ＤＮＡ
を加えた後、０．３Ｎ ＮａＯＨで７０℃６０分間処理
して反応を中和し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH
８）、０．１ＭＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５
％ドデシル硫酸中セファデックスＧ−５０（Ｓｅｐｈａ
ｄｅｘ Ｇ−５０）を通して濾過した。
（６μｇ）または非誘導細胞の総ポリＡ+ −ＲＮＡ
（３．７μｇ）から転写した32ｐ−ｃＤＮＡプローブで
コロニーハイブリッド化（ｃｏｌｏｎｙ ｈｙｂｒｉｄ
ｉｚａｔｉｏｎ）を行なった。ｃＤＮＡ合成は、合成相
補プライマー〔ナラングら（Ｎａｒａｎｇ ｅｔ ａ
ｌ．），１９７９，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．
６８，９０−９８参照〕であり、ＩＦＮ−β1 配列のＢ
ｇｌ II部位を含む５′ＧＡＧＡＴＣＴＴＣＡＧＴＴＴ
Ｃ ３′で開始した。32Ｐ−５′末端ラベル〔ヒュート
ンら（Ｈｏｕｇｈｔｏｎｅｔ ａｌ．），１９８０，Ｎ
ｕｃｌ．Ａｃ．Ｒｅｓ ８，１９１３−１９３１〕した
プライマーを用いて、予期した６４０ヌクレオチド長の
ｃＤＮＡがみられるのは誘導したＲＮＡを鋳型として用
いたときだけであった。プローブを調製するために、２
０ｐ ｍｏｌｅｓのプライマーを４μｌの０．４ＭＫＣ
ｌ中で３０℃６０分間各ＲＮＡとアニール（ａｎｎｅａ
ｌ）し、各２００μＣｉの32Ｐ−α−ｄＡＴＰとｄＣＴ
Ｐ（両方で４００Ｃｉ／ｍ ｍｏｌ）、各０．５ｍＭの
ｄＧＴＰとｄＴＴＰ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH
８．３）、４ｍＭ ＭｇＣｌ2 、５ｍＭジチオスレイト
ール、５０μｇ／mlアクチノマイシンＤ、４ｍＭピロ燐
酸および３０単位の逆転写酵素の混液２５μｌ中３７℃
で２時間インキュベートした。２５μｇの大腸菌ＤＮＡ
を加えた後、０．３Ｎ ＮａＯＨで７０℃６０分間処理
して反応を中和し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH
８）、０．１ＭＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５
％ドデシル硫酸中セファデックスＧ−５０（Ｓｅｐｈａ
ｄｅｘ Ｇ−５０）を通して濾過した。
【００１６】各ＲＮＡから５×１０6 ｃｐｍ ｃＤＮＡ
を得た。ニトロセルローズフィルター上に生育したコロ
ニーを固定し、ＤＮＡをサイヤー（Ｔｈａｙｅｒ）〔１
９７９、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９８，６０−６
３〕の記述に従って変性させた。各フィルターを６×Ｓ
ＥＴ〔ＳＥＴ＝１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８）〕、１０×デ
ンハルツ溶液（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏ
ｎ）〔デンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）１９６６，Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ，Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２
３，６４１−６４６）〕，０．１％ピロリン酸ソーダ、
０．１％ドデシル硫酸、５０μｇ／ml変性大腸菌ＤＮＡ
の混液１０mlを使い６７℃で４時間プレハイブリッド化
した。フィルターを各０．５×１０6 ｃｐｍ／フィルタ
ーの二つの32Ｐ−ｃＤＮＡプローブ、１０μｇ／mlのポ
リＡおよび２．５μｇ／mlのポリＣを有する同じ溶液中
で６７℃、１４−１８時間ハイブリッド化した。プレイ
ハイブリッド化溶液中で６７℃、１時間、次に３×ＳＥ
Ｔ、０．１％ピロリン酸、０．１％ドデシル硫酸で６７
℃、３０分間３回以上、ついで４×ＳＥＴで２５℃、６
０分間フィルターを洗浄した〔マニアティス（Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ）１９７８、セルＣｅｌｌ １５、６８７−７
０１参照〕。フィルターを乾燥させ、増感紙をもったＡ
ｇｆａ Ｃｕｒｉｘ Ｘ−ｒａｙフィルムに−７０℃で
１−２日間感光させた。
を得た。ニトロセルローズフィルター上に生育したコロ
ニーを固定し、ＤＮＡをサイヤー（Ｔｈａｙｅｒ）〔１
９７９、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９８，６０−６
３〕の記述に従って変性させた。各フィルターを６×Ｓ
ＥＴ〔ＳＥＴ＝１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８）〕、１０×デ
ンハルツ溶液（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏ
ｎ）〔デンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）１９６６，Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ，Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２
３，６４１−６４６）〕，０．１％ピロリン酸ソーダ、
０．１％ドデシル硫酸、５０μｇ／ml変性大腸菌ＤＮＡ
の混液１０mlを使い６７℃で４時間プレハイブリッド化
した。フィルターを各０．５×１０6 ｃｐｍ／フィルタ
ーの二つの32Ｐ−ｃＤＮＡプローブ、１０μｇ／mlのポ
リＡおよび２．５μｇ／mlのポリＣを有する同じ溶液中
で６７℃、１４−１８時間ハイブリッド化した。プレイ
ハイブリッド化溶液中で６７℃、１時間、次に３×ＳＥ
Ｔ、０．１％ピロリン酸、０．１％ドデシル硫酸で６７
℃、３０分間３回以上、ついで４×ＳＥＴで２５℃、６
０分間フィルターを洗浄した〔マニアティス（Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ）１９７８、セルＣｅｌｌ １５、６８７−７
０１参照〕。フィルターを乾燥させ、増感紙をもったＡ
ｇｆａ Ｃｕｒｉｘ Ｘ−ｒａｙフィルムに−７０℃で
１−２日間感光させた。
【００１７】選別にかけた３，５００コロニーのうち、
１４個が誘導したｍＲＮＡから鋳型化したｃＤＮＡに優
先的にハイブリッド化し、１３０個が非誘導ｍＲＮＡの
鋳型化したｃＤＮＡにもハイブリッド化した。最初の群
からのプラスミドのＤＮＡ（０．３μｇ）を、６×ＳＳ
Ｃ、１０×デンハルツ溶液中５′−末端32Ｐラベルした
プライマー（０．３ｐ ｍｏｌｅｓ，４×１０6 ｃｐ
ｍ）でフィルター〔カファトスら（Ｋａｆａｔｏｓ ｅ
ｔ ａｌ．）１９７９，Ｎｕｃｌ．Ａｃ．Ｒｅｓ．７，
１５４１−１５５２〕上に３５℃で２１時間ハイブリッ
ド化し、ついで３５℃で６×ＳＳＣ（９００ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ，９０ｍＭクエン酸ソーダ）で洗浄した。クローン
Ｉ−６−５は強度の陽性でＤＮＡ配列決定〔マキサムら
（Ｍａｘａｍ ｅｔ ａｌ．）１９８０，Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，６５，４９９−５６０〕によりそ
のクローンがＩＦＮ−β1 配列の３′−末端から約３７
０ヌクレオチドを含んでいることがわかった。蔗糖勾配
精製した誘導ｍＲＮＡ由来ｄＣ鎖延長二重鎖ＤＮＡ（ｄ
Ｃ−ｔａｉｌｅｄ ｄＳ−ＤＮＡ）をｐＢＲ３２２のＰ
ｓｔ Ｉ部位に導入することによって前記のように調製
した他の５０，０００のクローンを選別した：ＩＦＮ−
β1 クローンの割合は０．１６％（８０クローン）であ
るのに比べてＩＦＮ−β2 クローンの割合は０．６５％
であることがわかった。上記したＦＳ−１１ｍＲＮＡか
ら調製されたクローンＩＦＮ−β1 １−６−５はヒトラ
イブラリーを選別するのに使われた。
１４個が誘導したｍＲＮＡから鋳型化したｃＤＮＡに優
先的にハイブリッド化し、１３０個が非誘導ｍＲＮＡの
鋳型化したｃＤＮＡにもハイブリッド化した。最初の群
からのプラスミドのＤＮＡ（０．３μｇ）を、６×ＳＳ
Ｃ、１０×デンハルツ溶液中５′−末端32Ｐラベルした
プライマー（０．３ｐ ｍｏｌｅｓ，４×１０6 ｃｐ
ｍ）でフィルター〔カファトスら（Ｋａｆａｔｏｓ ｅ
ｔ ａｌ．）１９７９，Ｎｕｃｌ．Ａｃ．Ｒｅｓ．７，
１５４１−１５５２〕上に３５℃で２１時間ハイブリッ
ド化し、ついで３５℃で６×ＳＳＣ（９００ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ，９０ｍＭクエン酸ソーダ）で洗浄した。クローン
Ｉ−６−５は強度の陽性でＤＮＡ配列決定〔マキサムら
（Ｍａｘａｍ ｅｔ ａｌ．）１９８０，Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，６５，４９９−５６０〕によりそ
のクローンがＩＦＮ−β1 配列の３′−末端から約３７
０ヌクレオチドを含んでいることがわかった。蔗糖勾配
精製した誘導ｍＲＮＡ由来ｄＣ鎖延長二重鎖ＤＮＡ（ｄ
Ｃ−ｔａｉｌｅｄ ｄＳ−ＤＮＡ）をｐＢＲ３２２のＰ
ｓｔ Ｉ部位に導入することによって前記のように調製
した他の５０，０００のクローンを選別した：ＩＦＮ−
β1 クローンの割合は０．１６％（８０クローン）であ
るのに比べてＩＦＮ−β2 クローンの割合は０．６５％
であることがわかった。上記したＦＳ−１１ｍＲＮＡか
ら調製されたクローンＩＦＮ−β1 １−６−５はヒトラ
イブラリーを選別するのに使われた。
【００１８】遺伝子クローン：ＩＦＮ−β1 クローン１
５の単離 リグビィら（Ｒｉｇｂｙ ｅｔ ａｌ．）〔１９７７，
Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１１３，２３７−２５１〕に
従い、ＩＦＮ−β1 ｃＤＮＡからのプラスミドＤＮＡを
ニックトランスレーションによって２×１０8 ｃｐｍ／
μｇ ＤＮＡに標識し、ヒト遺伝子ライブラリーに１０
6 ｃｐｍ／フィルターでハイブリッド化した。フィルタ
ーの調製、ＤＮＡ変性およびハイブリッド化操作は上記
のごとく行なった。ハイブリッド化陽性のプラークから
のファージを９cmプレートに１−２×１０2 ｐｆｕの濃
度で再び植え、再選別を行なった。この操作を３回繰返
してプレート上のプラークの９５％以上をＩＦＮ−β1
ｃＤＮＡにハイブリッド化した。ファージクローンＣ１
５をそのプラークの一つから単離した。
５の単離 リグビィら（Ｒｉｇｂｙ ｅｔ ａｌ．）〔１９７７，
Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１１３，２３７−２５１〕に
従い、ＩＦＮ−β1 ｃＤＮＡからのプラスミドＤＮＡを
ニックトランスレーションによって２×１０8 ｃｐｍ／
μｇ ＤＮＡに標識し、ヒト遺伝子ライブラリーに１０
6 ｃｐｍ／フィルターでハイブリッド化した。フィルタ
ーの調製、ＤＮＡ変性およびハイブリッド化操作は上記
のごとく行なった。ハイブリッド化陽性のプラークから
のファージを９cmプレートに１−２×１０2 ｐｆｕの濃
度で再び植え、再選別を行なった。この操作を３回繰返
してプレート上のプラークの９５％以上をＩＦＮ−β1
ｃＤＮＡにハイブリッド化した。ファージクローンＣ１
５をそのプラークの一つから単離した。
【００１９】ファージをブラトナーら（Ｂｌａｔｔｎｅ
ｒ ｅｔ ａｌ．）〔１９７７，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９
６，１６１−１６９〕の記述に従い液体培地に増殖させ
た。大腸菌ＤＰ５０を１％トリプトン、０．５％ＮａＣ
ｌ、０．５％酵母エキス、０．２％マルトース、０．２
５％ＭｇＳＯ4 、０．０１％ジアミノピメリン酸、０．
００４％チミジンで一夜増殖させた。約０．３mlの培養
物を前吸着のために１０ｍＭ ＭｇＳＯ4 、１０ｍＭ
ＣａＣｌ2 および１０7 ファージの混液０．３mlと３７
℃で２０分間混合した。その培養物を２リットルフラス
コ中１％ＮＺアミン、０．５％酵母エキス、０．５％Ｎ
ａＣｌ、０．１％カザミノ酸、０．２５％ＭｇＳＯ4 、
０．０１％ジアミノピメリン酸および０．００４％チミ
ジンを含み予備加熱した培地５００mlで希釈し、よく通
気しながら、３７℃で１５−１８時間インキュベートし
た。溶菌完了後、細胞破砕物をソルバールＧＳＡロータ
ー（Ｓｏｒｖａｌｌ ＧＳＡ ｒｏｔｏｒ）中、冷却下
７，０００rpm で１５分間遠心分離して除いた。この清
澄溶菌液からファージを７％ポリエチレングリコール６
０００で沈澱させ、続いて２回塩化セシウム勾配を行っ
て精製した。
ｒ ｅｔ ａｌ．）〔１９７７，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９
６，１６１−１６９〕の記述に従い液体培地に増殖させ
た。大腸菌ＤＰ５０を１％トリプトン、０．５％ＮａＣ
ｌ、０．５％酵母エキス、０．２％マルトース、０．２
５％ＭｇＳＯ4 、０．０１％ジアミノピメリン酸、０．
００４％チミジンで一夜増殖させた。約０．３mlの培養
物を前吸着のために１０ｍＭ ＭｇＳＯ4 、１０ｍＭ
ＣａＣｌ2 および１０7 ファージの混液０．３mlと３７
℃で２０分間混合した。その培養物を２リットルフラス
コ中１％ＮＺアミン、０．５％酵母エキス、０．５％Ｎ
ａＣｌ、０．１％カザミノ酸、０．２５％ＭｇＳＯ4 、
０．０１％ジアミノピメリン酸および０．００４％チミ
ジンを含み予備加熱した培地５００mlで希釈し、よく通
気しながら、３７℃で１５−１８時間インキュベートし
た。溶菌完了後、細胞破砕物をソルバールＧＳＡロータ
ー（Ｓｏｒｖａｌｌ ＧＳＡ ｒｏｔｏｒ）中、冷却下
７，０００rpm で１５分間遠心分離して除いた。この清
澄溶菌液からファージを７％ポリエチレングリコール６
０００で沈澱させ、続いて２回塩化セシウム勾配を行っ
て精製した。
【００２０】ファージＣ１５ＤＮＡをフェノール精製
し、その構造を、制限酵素消化、および２０ｍＭトリス
塩基、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ中、
０．５μｇ／mlエチジウム・ブロマイドを用いる水平型
アガロースゲル電気泳動により分析し、ニトロセルロー
スフィルター〔サザーン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）、１９７
５，Ｊ．Ｍｏｌ，Ｂｉｏｌ．９８，５０３−５１７〕へ
の転写および上記したニック−トランスレーション化し
たＩＦＮ−β1 ｃＤＮＡへのハイブリッド化を行なっ
た。Ｃ１５ＤＮＡのＥｃｏＲＩ断片をプラスミドＤＮＡ
の正確な制限地図作成のためにｐＢＲ３２２のＥｃｏＲ
Ｉ部位に確立した操作〔ボリバー（Ｂｏｌｉｖａｒ）、
１９７９、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８，２
４５−２６７参照〕に従って二次クローン化した。
し、その構造を、制限酵素消化、および２０ｍＭトリス
塩基、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ中、
０．５μｇ／mlエチジウム・ブロマイドを用いる水平型
アガロースゲル電気泳動により分析し、ニトロセルロー
スフィルター〔サザーン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）、１９７
５，Ｊ．Ｍｏｌ，Ｂｉｏｌ．９８，５０３−５１７〕へ
の転写および上記したニック−トランスレーション化し
たＩＦＮ−β1 ｃＤＮＡへのハイブリッド化を行なっ
た。Ｃ１５ＤＮＡのＥｃｏＲＩ断片をプラスミドＤＮＡ
の正確な制限地図作成のためにｐＢＲ３２２のＥｃｏＲ
Ｉ部位に確立した操作〔ボリバー（Ｂｏｌｉｖａｒ）、
１９７９、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８，２
４５−２６７参照〕に従って二次クローン化した。
【００２１】ファージ溶菌液中のインターフェロン活性
分析 上記のごとく調製した清澄ファージＩＦＮ−β1 Ｃ１５
溶菌液をリン酸緩衝化した食塩水（ＰＢＳ）に７時間透
析した。透析液１０mlをＣｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ−
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ ６ Ｂ〔Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ ＦｉｎｅＣｈｅｍ．〕の０．３mlカラム上に乗せ
た。カラムを１０−１５mlの１Ｍ ＮａＣｌ、０．０２
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（pH７．２）、ついで洗液中
５０％プロピレン・グリコール１０mlで洗浄した。画分
（０．５ml）を集め４℃で保存した。場合により０．１
％ヒト血清アルブミンを安定化の為に加えた。ワイゼン
バッハら（Ｗｅｉｓｓｅｎｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．）
〔１９７９，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９８，１−
８〕の記述に従い、各画分を９５−ウエル・ミクロプレ
ートに連続的に希釈してインターフェロン活性を分析し
た。各ウエルには、２−３×１０4 ＦＳ １１ヒト線維
芽細胞を含む０．１mlのミニマム・エッセンシャル・メ
ディウム（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅ
ｄｉｕｍ，Ｇｉｂｃｏ），５％胎生子牛血清（ＦＣ
Ｓ）、０．５％ゲンタミシンを入れた。
分析 上記のごとく調製した清澄ファージＩＦＮ−β1 Ｃ１５
溶菌液をリン酸緩衝化した食塩水（ＰＢＳ）に７時間透
析した。透析液１０mlをＣｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ−
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ ６ Ｂ〔Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ ＦｉｎｅＣｈｅｍ．〕の０．３mlカラム上に乗せ
た。カラムを１０−１５mlの１Ｍ ＮａＣｌ、０．０２
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（pH７．２）、ついで洗液中
５０％プロピレン・グリコール１０mlで洗浄した。画分
（０．５ml）を集め４℃で保存した。場合により０．１
％ヒト血清アルブミンを安定化の為に加えた。ワイゼン
バッハら（Ｗｅｉｓｓｅｎｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．）
〔１９７９，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９８，１−
８〕の記述に従い、各画分を９５−ウエル・ミクロプレ
ートに連続的に希釈してインターフェロン活性を分析し
た。各ウエルには、２−３×１０4 ＦＳ １１ヒト線維
芽細胞を含む０．１mlのミニマム・エッセンシャル・メ
ディウム（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅ
ｄｉｕｍ，Ｇｉｂｃｏ），５％胎生子牛血清（ＦＣ
Ｓ）、０．５％ゲンタミシンを入れた。
【００２２】３７℃、１８時間後、培地を取り、水胞性
口炎ウィルス（ｖｅｓｉｃｕｌａｒｓｔｏｍａｔｉｔｉ
ｓ ｖｉｒｕｓ，ＶＳＶ）を２％ＦＣＳ含有培地に１ｐ
ｆｕ／細胞で加えた。細胞変性効果（ｃｙｔｏｐａｔｈ
ｉｃ ｅｆｆｅｃｔ）の阻害を、ＩＦＮ−β ＮＩＨ標
準Ｇ０２３−９０２−５２７と比較して、感染後３０〜
４０時間記録した。また抗ウィルス活性は、先に記述し
たごとく〔ワイゼンバッハら（Ｗｅｉｓｓｅｎｂａｃｈ
ｅｔ ａｌ．），１９７９，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．９８，１−８〕，ＶＳＶ感染後の、 3Ｈ−ウリジ
ン取込みの減少によって測った。ＩＦＮ−βの抗血清は
ウサギから得、先のごとく〔Ｗｅｉｓｓｅｎｂａｃｈ
ｅｔ ａｌ．，１９７９，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．９８，１−８〕分析した。中和試験のために、０．
１mlの抗血清（力価１０4 単位／ml）あるいは非免疫血
清をＰＢＳ中蛋白Ａ−セファローズビーズ（ｐｒｏｔｅ
ｉｎ Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｂｅａｄｓ）（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ ＦｉｎｅＣｈｅｍ．）の５０％懸濁液
０．２mlと３７℃で１時間混合した。ビーズをＰＢＳで
２度洗い０．１mlの細菌インターフェロン（１００単位
／ml）を加えた。３７℃、２時間後、ビーズを遠心分離
し、上清を分析してＶＳＶ感染細胞中の 3Ｈ−ウリジン
取り込みの阻害を調べた。
口炎ウィルス（ｖｅｓｉｃｕｌａｒｓｔｏｍａｔｉｔｉ
ｓ ｖｉｒｕｓ，ＶＳＶ）を２％ＦＣＳ含有培地に１ｐ
ｆｕ／細胞で加えた。細胞変性効果（ｃｙｔｏｐａｔｈ
ｉｃ ｅｆｆｅｃｔ）の阻害を、ＩＦＮ−β ＮＩＨ標
準Ｇ０２３−９０２−５２７と比較して、感染後３０〜
４０時間記録した。また抗ウィルス活性は、先に記述し
たごとく〔ワイゼンバッハら（Ｗｅｉｓｓｅｎｂａｃｈ
ｅｔ ａｌ．），１９７９，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．９８，１−８〕，ＶＳＶ感染後の、 3Ｈ−ウリジ
ン取込みの減少によって測った。ＩＦＮ−βの抗血清は
ウサギから得、先のごとく〔Ｗｅｉｓｓｅｎｂａｃｈ
ｅｔ ａｌ．，１９７９，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．９８，１−８〕分析した。中和試験のために、０．
１mlの抗血清（力価１０4 単位／ml）あるいは非免疫血
清をＰＢＳ中蛋白Ａ−セファローズビーズ（ｐｒｏｔｅ
ｉｎ Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｂｅａｄｓ）（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ ＦｉｎｅＣｈｅｍ．）の５０％懸濁液
０．２mlと３７℃で１時間混合した。ビーズをＰＢＳで
２度洗い０．１mlの細菌インターフェロン（１００単位
／ml）を加えた。３７℃、２時間後、ビーズを遠心分離
し、上清を分析してＶＳＶ感染細胞中の 3Ｈ−ウリジン
取り込みの阻害を調べた。
【００２３】遺伝子クローン：ＩＦＮ−αc クローン１
８−３の単離 上記のごとく化学合成した２つの短い単鎖オリゴヌクレ
オチドを使って直接ヒト遺伝子ライブラリーを選別し
た。該オリゴヌクレオチドはＩＦＮ−α遺伝子の共通配
列に相補的で５′ＣＴＣＴＧＡＣＡＡＣＣＴＣＣＣ３′
および５′ＣＣＴＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧ３′の配列を有
していた。これらオリゴヌクレオチドは上記のごとく
５′標識した後直接、またはセンダイウイルス誘導した
ヒト白血病細胞からのＲＮＡ上ｃＤＮＡ合成の為の鋳型
（プライマー、ｐｒｉｍｅｒ）として使われた。32Ｐ−
オリゴヌクレオチドあるいは鋳型化したｃＤＮＡを上記
のごとく総数５００，０００のλ組換え体ファージにハ
イブリッド化した。９cmニトロセルロースフィルター当
り約５×１０5 ｃｐｍ使用した。ハイブリッド化はプラ
スチックの密封した料理用袋中最少容量の液で行なっ
た。１５塩基のプライマーでのハイブリッド化を以下の
ごとく行なった。
８−３の単離 上記のごとく化学合成した２つの短い単鎖オリゴヌクレ
オチドを使って直接ヒト遺伝子ライブラリーを選別し
た。該オリゴヌクレオチドはＩＦＮ−α遺伝子の共通配
列に相補的で５′ＣＴＣＴＧＡＣＡＡＣＣＴＣＣＣ３′
および５′ＣＣＴＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧ３′の配列を有
していた。これらオリゴヌクレオチドは上記のごとく
５′標識した後直接、またはセンダイウイルス誘導した
ヒト白血病細胞からのＲＮＡ上ｃＤＮＡ合成の為の鋳型
（プライマー、ｐｒｉｍｅｒ）として使われた。32Ｐ−
オリゴヌクレオチドあるいは鋳型化したｃＤＮＡを上記
のごとく総数５００，０００のλ組換え体ファージにハ
イブリッド化した。９cmニトロセルロースフィルター当
り約５×１０5 ｃｐｍ使用した。ハイブリッド化はプラ
スチックの密封した料理用袋中最少容量の液で行なっ
た。１５塩基のプライマーでのハイブリッド化を以下の
ごとく行なった。
【００２４】まず、６×ＳＳＣ、１０×デンハルト溶液
（Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ）中３７℃で４時間プレハイブリ
ッド化、次いで６×ＳＳＣ、１０×デンハルト溶液（Ｄ
ｅｎｈａｒｄｔｓ）中３７℃で１８時間ハイブリッド化
し、６×ＳＳＣ中３７℃で各３０分間３〜４回、洗液に
放射能が検出されなくなるまで洗浄した。１３塩基のプ
ライマーでのハイブリッド化では、ハイブリッド化およ
び洗浄の温度を３０℃に下げた。ハイブリッド化陽性を
示した総数１６のファージをさらに制限地図作成および
ＤＮＡ配列化により分析した。クローン１８−３は３個
のＩＦＮ−α遺伝子を担い、そのうちの１個は、ゲッデ
ルら（Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ．）〔１９８１，Ｎ
ａｔｕｒｅ，２９０，２０−２５〕のｃＤＮＡクローン
αc と同じ配列を持っていることが証明された。クロー
ン１８−３は上記クローンＣ１５と同様に精製した。ク
ローン１８−３のλバクテリオファージ中での発現およ
び発現プラスミドベクター中に挿入後の発現を下記「結
果」で説明する。
（Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ）中３７℃で４時間プレハイブリ
ッド化、次いで６×ＳＳＣ、１０×デンハルト溶液（Ｄ
ｅｎｈａｒｄｔｓ）中３７℃で１８時間ハイブリッド化
し、６×ＳＳＣ中３７℃で各３０分間３〜４回、洗液に
放射能が検出されなくなるまで洗浄した。１３塩基のプ
ライマーでのハイブリッド化では、ハイブリッド化およ
び洗浄の温度を３０℃に下げた。ハイブリッド化陽性を
示した総数１６のファージをさらに制限地図作成および
ＤＮＡ配列化により分析した。クローン１８−３は３個
のＩＦＮ−α遺伝子を担い、そのうちの１個は、ゲッデ
ルら（Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ．）〔１９８１，Ｎ
ａｔｕｒｅ，２９０，２０−２５〕のｃＤＮＡクローン
αc と同じ配列を持っていることが証明された。クロー
ン１８−３は上記クローンＣ１５と同様に精製した。ク
ローン１８−３のλバクテリオファージ中での発現およ
び発現プラスミドベクター中に挿入後の発現を下記「結
果」で説明する。
【００２５】結 果 1. 遺伝子ＩＦＮ−β1 Ｃ１５クローンの構造：ファー
ジクローンをＥｃｏＲＩで部分消化しλ Ｃｈａｒｏｎ
４Ａのアームにクローン化したヒトＤＮＡのライブラ
リーから分離した。該クローンはヒト線維芽細胞の二株
のｍＲＮＡ画分から別々に調製した二つの異なるＩＦＮ
−β1 ｃＤＮＡプローブに強くハイブリッド化した。Ｅ
ｃｏＲＩによる該ファージＤＮＡの消化は、２つのλア
ームに加えて、１２、２．６、１．８４および０．６キ
ロベース（第１Ａ図）の４断片を示した。サザーン（Ｓ
ｏｕｔｈｅｒｎ）〔１９７５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．
９８，５０３−５１７〕の方法によるニトロセルロース
への転写およびＩＦＮ−β1 Ｉ−６−５ｃＤＮＡクロー
ンからニック−トランスレーション化したＤＮＡとのハ
イブリッド化により１．８４Ｋｂ断片がＩＦＮ−β1 遺
伝子を含むことがわかった。このＥｃｏＲＩ断片をｐＢ
Ｒ３２２のＥｃｏＲＩ部位に再クローン化した。この
１．８４Ｋｂ亜クローンのＢｇｌ II、Ｐｖｕ II、Ｐ
ｓｔ Ｉ、Ｈｉｎｃ IIおよびＴａｑ Ｉによる制限酵
素分析および部分ないし完全長ＩＦＮ−β1 ｃＤＮＡプ
ローブとのハイブリッド化によりＩＦＮ−β1 プレ蛋白
のコード配列（Ｈｉｎｃ II部位）はＥｃｏＲＩ部位か
ら約３５０ヌクレオチドで始まると結論した（第１Ａ
図）。遺伝子ＤＮＡ中の種々の制限酵素部位の間の距離
は実験誤差の範囲でｃＤＮＡ配列のそれと同じである
（第１表）。
ジクローンをＥｃｏＲＩで部分消化しλ Ｃｈａｒｏｎ
４Ａのアームにクローン化したヒトＤＮＡのライブラ
リーから分離した。該クローンはヒト線維芽細胞の二株
のｍＲＮＡ画分から別々に調製した二つの異なるＩＦＮ
−β1 ｃＤＮＡプローブに強くハイブリッド化した。Ｅ
ｃｏＲＩによる該ファージＤＮＡの消化は、２つのλア
ームに加えて、１２、２．６、１．８４および０．６キ
ロベース（第１Ａ図）の４断片を示した。サザーン（Ｓ
ｏｕｔｈｅｒｎ）〔１９７５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．
９８，５０３−５１７〕の方法によるニトロセルロース
への転写およびＩＦＮ−β1 Ｉ−６−５ｃＤＮＡクロー
ンからニック−トランスレーション化したＤＮＡとのハ
イブリッド化により１．８４Ｋｂ断片がＩＦＮ−β1 遺
伝子を含むことがわかった。このＥｃｏＲＩ断片をｐＢ
Ｒ３２２のＥｃｏＲＩ部位に再クローン化した。この
１．８４Ｋｂ亜クローンのＢｇｌ II、Ｐｖｕ II、Ｐ
ｓｔ Ｉ、Ｈｉｎｃ IIおよびＴａｑ Ｉによる制限酵
素分析および部分ないし完全長ＩＦＮ−β1 ｃＤＮＡプ
ローブとのハイブリッド化によりＩＦＮ−β1 プレ蛋白
のコード配列（Ｈｉｎｃ II部位）はＥｃｏＲＩ部位か
ら約３５０ヌクレオチドで始まると結論した（第１Ａ
図）。遺伝子ＤＮＡ中の種々の制限酵素部位の間の距離
は実験誤差の範囲でｃＤＮＡ配列のそれと同じである
（第１表）。
【００２６】
【表１】第１表 ＩＦＮ−β1 ｃＤＮＡおよび遺伝子中の制限部位 部 位 間 の 距 離 制限部位 β1 ｃＤＮＡ配列 β1 遺伝子ＤＮＡ からの計算値* からの測定値** ヌクレオチド ヌクレオチド Ｔａｑ Ｉ−Ｐｖｕ II ２５５ ２５０ Ｈｉｎｃ II−Ｐｖｕ II ２０４ ２１０ Ｈｉｎｃ II−Ｂｇｌ II ５７０ ５７０ Ｐｖｕ II−Ｂｇｌ II ３６６ ３６０Ｐｓｔ Ｉ−Ｂｇｌ II ３６３ ３６０ * タニグチら（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａ
ｌ．），１９８０ジーン（Ｇｅｎｅ）１０（１１−１
５）による。** １．８４Ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片から測定。
ｌ．），１９８０ジーン（Ｇｅｎｅ）１０（１１−１
５）による。** １．８４Ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片から測定。
【００２７】考慮したＨｉｎｃ IIとＴａｑ Ｉ部位は
遺伝子の５′末端に最も接近したものである。予期しな
い制限酵素部位はＩＦＮ−β1 コード領域のどこにも見
出せなかった。これは検出できる介在配列（ｉｎｔｅｒ
ｖｅｎｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）が存在しないことを
示している。Ｃ１５ＤＮＡのＥｃｏＲＩ部分消化は、
０．６Ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片が１．８４と２．６Ｋｂ
ＥｃｏＲＩ断片の間に位置することを示した。ＢａｍＨ
Ｉ部位が２．６Ｋｂに１箇所見出されたが挿入したヒト
ＤＮＡの他のＥｃｏＲＩ断片には見出されなかった。Ｉ
ＦＮ−β1 ｃＤＮＡにハイブリッド化する１．８４Ｋｂ
のＥｃｏＲＩ断片はＣ１５ＤＮＡの９．６Ｋｂ Ｂａｍ
ＨＩ断片上に見出された。第１図に示したとおり、この
断片はλ右アーム（ＥｃｏＲＩから５．１Ｋｂ）のＢａ
ｍＨＩ部位からのみ由来し、挿入したヒトＤＮＡのＥｃ
ｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片に当たる４．５Ｋｂを遊離して
いるが、このことは１．８４Ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片がλ
右アームに隣接しているにちがいないことを示してい
る。遺伝子方向づけ（第１Ａ図）は以下のごとく決定し
た。
遺伝子の５′末端に最も接近したものである。予期しな
い制限酵素部位はＩＦＮ−β1 コード領域のどこにも見
出せなかった。これは検出できる介在配列（ｉｎｔｅｒ
ｖｅｎｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）が存在しないことを
示している。Ｃ１５ＤＮＡのＥｃｏＲＩ部分消化は、
０．６Ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片が１．８４と２．６Ｋｂ
ＥｃｏＲＩ断片の間に位置することを示した。ＢａｍＨ
Ｉ部位が２．６Ｋｂに１箇所見出されたが挿入したヒト
ＤＮＡの他のＥｃｏＲＩ断片には見出されなかった。Ｉ
ＦＮ−β1 ｃＤＮＡにハイブリッド化する１．８４Ｋｂ
のＥｃｏＲＩ断片はＣ１５ＤＮＡの９．６Ｋｂ Ｂａｍ
ＨＩ断片上に見出された。第１図に示したとおり、この
断片はλ右アーム（ＥｃｏＲＩから５．１Ｋｂ）のＢａ
ｍＨＩ部位からのみ由来し、挿入したヒトＤＮＡのＥｃ
ｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片に当たる４．５Ｋｂを遊離して
いるが、このことは１．８４Ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片がλ
右アームに隣接しているにちがいないことを示してい
る。遺伝子方向づけ（第１Ａ図）は以下のごとく決定し
た。
【００２８】Ｃ１５ＤＮＡをＰｖｕIIで切断してＩＦＮ
−β1 ｃＤＮＡの完全長または３′側半分にハイブリッ
ド化したとき、ＩＦＮ−β1 の５′末端にのみハイブリ
ッド化している０．６６Ｋｂ断片が見出された。しか
し、１．８４Ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片をＰｖｕIIで切断し
たときは、ＩＦＮ−β1 の５′末端が、より小さい０．
５４Ｋｂ断片上に見られた。挿入したヒトＤＮＡの０．
６Ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片にはＰｖｕII部位は見出されな
いので、０．６６Ｋｂ ＰｖｕII断片はλ右アームで終
るはずであり、従ってＩＦＮ−β1 の５′末端はλ右ア
ームに最も接近している。第１Ａ図に示される構造は、
Ｈｉｎｄ III 、Ｓｍａ ＩおよびＢｇｌII消化を用い
る数種の他の制限地図作製実験からも確認される。クロ
ーンＣ１５中のＩＦＮ−β1 遺伝子のコード配列は、従
って、左方向転写を調節する強力なλＰL プロモーター
〔ウイリアムスら（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａ
ｌ．），１９８０，Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒ
ｉｎｇ Ｖｏｌ II，ｐｐ２０１−２８１，プレナム社
（Ｐｌｅｎｕｍ Ｃｏｒｐ）〕から約１，７７５ヌクレ
オチド離れて、適切な左方向性に挿入されていた。この
ことが検出可能なイントロンの不在とともにＣ１５組換
え体ファージ感染大腸菌でインターフェロンを生産する
可能性の検討を促した。
−β1 ｃＤＮＡの完全長または３′側半分にハイブリッ
ド化したとき、ＩＦＮ−β1 の５′末端にのみハイブリ
ッド化している０．６６Ｋｂ断片が見出された。しか
し、１．８４Ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片をＰｖｕIIで切断し
たときは、ＩＦＮ−β1 の５′末端が、より小さい０．
５４Ｋｂ断片上に見られた。挿入したヒトＤＮＡの０．
６Ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片にはＰｖｕII部位は見出されな
いので、０．６６Ｋｂ ＰｖｕII断片はλ右アームで終
るはずであり、従ってＩＦＮ−β1 の５′末端はλ右ア
ームに最も接近している。第１Ａ図に示される構造は、
Ｈｉｎｄ III 、Ｓｍａ ＩおよびＢｇｌII消化を用い
る数種の他の制限地図作製実験からも確認される。クロ
ーンＣ１５中のＩＦＮ−β1 遺伝子のコード配列は、従
って、左方向転写を調節する強力なλＰL プロモーター
〔ウイリアムスら（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａ
ｌ．），１９８０，Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒ
ｉｎｇ Ｖｏｌ II，ｐｐ２０１−２８１，プレナム社
（Ｐｌｅｎｕｍ Ｃｏｒｐ）〕から約１，７７５ヌクレ
オチド離れて、適切な左方向性に挿入されていた。この
ことが検出可能なイントロンの不在とともにＣ１５組換
え体ファージ感染大腸菌でインターフェロンを生産する
可能性の検討を促した。
【００２９】2. ＩＦＮ−β1 Ｃ１５ファージ感染大
腸菌溶菌液からのインターフェロン生物活性の回収 クローンＣ１５からのファージをメソッズ（Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ）に記載のとおり大腸菌ＤＰ５０の培養液５００ml
で増殖させた。清澄溶菌液１０mlを透析し、Ｃｉｂａｃ
ｒｏｎ Ｂｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ小カラム（０．
３ml）にのせ、画分を水胞性口内炎ウィルス（ＶＳＶ）
細胞変性効果の阻害について、標準ＩＦＮ−βを対照と
して用いて、分析した。溶菌液中のファージ濃度１．３
×１０10ファージ／mlで行なった一実験例におけるイン
ターフェロン活性パターンを第２図に示した。カラムか
ら５０％プロピレングリコール−１Ｍ ＮａＣｌで溶出
した画分中に総量７，５００単位のＩＦＮ活性を回収し
た。これは溶菌液１リットル当り０．７５×１０6 単位
に相当する。しかし粗溶菌液中では測定可能な活性が非
常に低く、そのことは溶菌液中の物質がＩＦＮ活性の正
確な分析を妨げていることを示唆している。再造成実験
で、標準ヒトＩＦＮ−βを野生型λ Ｃｈａｒｏｎ ４
Ａ溶菌液に加えたとき、活性は投入したものの１０分の
１であった。この混合物をＢｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓ
ｅカラムに通すと、投入活性の７５％が回収された。対
照としてＩＦＮ添加しない野生型λ λ Ｃｈａｒｏｎ
４Ａファージからの溶菌液を分析したが、ＩＦＮ活性
は見出せなかった（第２図）。
腸菌溶菌液からのインターフェロン生物活性の回収 クローンＣ１５からのファージをメソッズ（Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ）に記載のとおり大腸菌ＤＰ５０の培養液５００ml
で増殖させた。清澄溶菌液１０mlを透析し、Ｃｉｂａｃ
ｒｏｎ Ｂｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ小カラム（０．
３ml）にのせ、画分を水胞性口内炎ウィルス（ＶＳＶ）
細胞変性効果の阻害について、標準ＩＦＮ−βを対照と
して用いて、分析した。溶菌液中のファージ濃度１．３
×１０10ファージ／mlで行なった一実験例におけるイン
ターフェロン活性パターンを第２図に示した。カラムか
ら５０％プロピレングリコール−１Ｍ ＮａＣｌで溶出
した画分中に総量７，５００単位のＩＦＮ活性を回収し
た。これは溶菌液１リットル当り０．７５×１０6 単位
に相当する。しかし粗溶菌液中では測定可能な活性が非
常に低く、そのことは溶菌液中の物質がＩＦＮ活性の正
確な分析を妨げていることを示唆している。再造成実験
で、標準ヒトＩＦＮ−βを野生型λ Ｃｈａｒｏｎ ４
Ａ溶菌液に加えたとき、活性は投入したものの１０分の
１であった。この混合物をＢｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓ
ｅカラムに通すと、投入活性の７５％が回収された。対
照としてＩＦＮ添加しない野生型λ λ Ｃｈａｒｏｎ
４Ａファージからの溶菌液を分析したが、ＩＦＮ活性
は見出せなかった（第２図）。
【００３０】クローンＣ１５の溶菌液からのＩＦＮのク
ロマトグラフ挙動は一定でない。ファージ濃度が３×１
０11ｐｆｕ／mlの実験では、ＩＦＮ活性は高いが、Ｂｌ
ｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムには保持されなかっ
た。この実験で、カラムから回収された総活性は１０ml
の溶菌液（７−８×１０6 単位／リットル）の投入に対
し７０−８０，０００単位のＩＦＮであった。溶出画分
を第２のＢｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに再吸着
させた。このときは活性がカラムに保持されたが、ＰＢ
Ｓでカラムを洗うと再び溶出された。ヒトＩＦＮ−β1
は通常疎水性溶媒によってのみＢｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅから溶出されるはずである〔ナイトら（Ｋｎｉｇ
ｈｔ ｅｔ ａｌ．），１９８０，Ｓｃｉｅｎｃｅ２０
７，５２５−５２６〕、従って標準ヒトＩＦＮ−βを同
じファージ溶菌液と混合しカラムにかけた。活性の３０
％が保持されず、活性の回収は２５％にすぎなかった。
このことは、この溶菌液の成分がＩＦＮ−β、特に細菌
によって生産されるＩＦＮ−βとＢｌｕｅ−Ｓｅｐｈａ
ｒｏｓｅの相互作用を不安定化したことを示唆してい
る。インターフェロンはカラムに保持されなかったが、
溶菌液の蛋白質の９０％以上が比活性４−５×１０5 単
位／mg蛋白質を有する活性画分から取除かれた。この部
分精製は粗溶菌液中の活性を隠蔽した化学物質を取り除
くために欠かせない。別の実験では、また溶菌液をカル
ボキシメチル−セファロース クロマトグラフィーにか
けてクローンＣ１５ ＩＦＮ活性を回収した（図には示
さない）。
ロマトグラフ挙動は一定でない。ファージ濃度が３×１
０11ｐｆｕ／mlの実験では、ＩＦＮ活性は高いが、Ｂｌ
ｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムには保持されなかっ
た。この実験で、カラムから回収された総活性は１０ml
の溶菌液（７−８×１０6 単位／リットル）の投入に対
し７０−８０，０００単位のＩＦＮであった。溶出画分
を第２のＢｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに再吸着
させた。このときは活性がカラムに保持されたが、ＰＢ
Ｓでカラムを洗うと再び溶出された。ヒトＩＦＮ−β1
は通常疎水性溶媒によってのみＢｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅから溶出されるはずである〔ナイトら（Ｋｎｉｇ
ｈｔ ｅｔ ａｌ．），１９８０，Ｓｃｉｅｎｃｅ２０
７，５２５−５２６〕、従って標準ヒトＩＦＮ−βを同
じファージ溶菌液と混合しカラムにかけた。活性の３０
％が保持されず、活性の回収は２５％にすぎなかった。
このことは、この溶菌液の成分がＩＦＮ−β、特に細菌
によって生産されるＩＦＮ−βとＢｌｕｅ−Ｓｅｐｈａ
ｒｏｓｅの相互作用を不安定化したことを示唆してい
る。インターフェロンはカラムに保持されなかったが、
溶菌液の蛋白質の９０％以上が比活性４−５×１０5 単
位／mg蛋白質を有する活性画分から取除かれた。この部
分精製は粗溶菌液中の活性を隠蔽した化学物質を取り除
くために欠かせない。別の実験では、また溶菌液をカル
ボキシメチル−セファロース クロマトグラフィーにか
けてクローンＣ１５ ＩＦＮ活性を回収した（図には示
さない）。
【００３１】3. クローンＣ１５感染大腸菌産生インタ
ーフェロンの性質 クロマトグラフ処理で回収したインターフェロン活性は
アクチノマイシンＤで処理したＶＳＶ−感染ヒト細胞中
の 3Ｈ−ウリジンの取り込みを減少させた〔ワイゼンバ
ッハ（Ｗｅｉｓｓｅｎｂａｃｈ），１９７９，Ｅｕｒ．
Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９８，１−８〕。細菌ＩＦＮ−β
で得られた力価曲線は標準ヒトＩＦＮ−βで得られたも
のと同じであった（第３図）。細菌ＩＦＮの免疫学的性
質を調べるために、部分精製物をウサギ抗ＩＦＮ−β血
清（ＩＦＮ−αには不活性）または蛋白質Ａ−セファロ
ース（ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）に予
備結合したウサギ非免疫血清と混合した。遠心分離後、
上清のＩＦＮ活性を分析した。抗ＩＦＮ−β血清はイン
ターフェロン活性を全て取除いたが非免疫血清を用いた
ときは活性が残った（第３図）。細菌ＩＦＮ（２０単位
／ml）は細胞培養物上で抗ＩＦＮ−β（２０単位／ml）
と混合するだけで同様に中和され、ＶＳＶ細胞変性効果
の阻害によって分析された。細菌インターフェロンの種
特異性を種々の細胞型の比較により分析した。
ーフェロンの性質 クロマトグラフ処理で回収したインターフェロン活性は
アクチノマイシンＤで処理したＶＳＶ−感染ヒト細胞中
の 3Ｈ−ウリジンの取り込みを減少させた〔ワイゼンバ
ッハ（Ｗｅｉｓｓｅｎｂａｃｈ），１９７９，Ｅｕｒ．
Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９８，１−８〕。細菌ＩＦＮ−β
で得られた力価曲線は標準ヒトＩＦＮ−βで得られたも
のと同じであった（第３図）。細菌ＩＦＮの免疫学的性
質を調べるために、部分精製物をウサギ抗ＩＦＮ−β血
清（ＩＦＮ−αには不活性）または蛋白質Ａ−セファロ
ース（ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）に予
備結合したウサギ非免疫血清と混合した。遠心分離後、
上清のＩＦＮ活性を分析した。抗ＩＦＮ−β血清はイン
ターフェロン活性を全て取除いたが非免疫血清を用いた
ときは活性が残った（第３図）。細菌ＩＦＮ（２０単位
／ml）は細胞培養物上で抗ＩＦＮ−β（２０単位／ml）
と混合するだけで同様に中和され、ＶＳＶ細胞変性効果
の阻害によって分析された。細菌インターフェロンの種
特異性を種々の細胞型の比較により分析した。
【００３２】
【表２】第２表 遺伝子ＩＦＮ−β1 Ｃ１５クローンにより生産された細菌インターフェ ロンの種特異性 ──────────────────────────────────── インターフェロン力価 単位／ml ヒト サル ウシ マウス マウス インターフェロン起源 FS-11 BSC-1 MDBK L A9 細胞 細胞 細胞 細胞 細胞 ──────────────────────────────────── 1. ヒトFS11細胞 1,500 32 32 <4 <4 2. C15 クローン感染大腸菌 1,000 32 32 <4 <4 ────────────────────────────────────
【００３３】細菌ＩＦＮは第２図のようにＣ１５溶菌液
のＣｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ上
クロマトグラフィー後に用いた。ヒトＩＦＮ−βとして
のクローンＣ１５感染大腸菌生産物の活性はサル腎細胞
ＢＳＣ−１およびウシＭＤＢＫ細胞ではヒト細胞の場合
の１０％以下であった。マウスＬあるいはＡ９細胞につ
いては検出可能な抗ウィルス活性はなかった。クローン
Ｃ１５によって生産される細菌ＩＦＮ６，０００単位／
mlでも同じ結果が得られた。
のＣｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ上
クロマトグラフィー後に用いた。ヒトＩＦＮ−βとして
のクローンＣ１５感染大腸菌生産物の活性はサル腎細胞
ＢＳＣ−１およびウシＭＤＢＫ細胞ではヒト細胞の場合
の１０％以下であった。マウスＬあるいはＡ９細胞につ
いては検出可能な抗ウィルス活性はなかった。クローン
Ｃ１５によって生産される細菌ＩＦＮ６，０００単位／
mlでも同じ結果が得られた。
【００３４】本発明は、従ってヒト遺伝子ＤＮＡのＥｃ
ｏＲＩ部分消化断片からλ Ｃｈａｒｏｎ ４Ａ中への
クローニングによって直接単離されたＩＦＮ−β1 遺伝
子が発現可能で培養物の溶菌液中に著量のＩＦＮ活性を
蓄積させることができることを示した。生産された活性
は免疫学的性質ならびに種特異性から明らかに線維芽細
胞インターフェロン（β）である。活性はＩＦＮ−β1
Ｃ１５ファージクローンによる感染細菌を培養したとき
にだけ生産される。大腸菌中のクローンＣ１５によって
生産されるＩＦＮ活性はＣｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ−
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ上のクロマトグラフにおける性質が
ヒトＩＦＮ−βとよく似ている。細菌溶菌液から高活性
（７×１０6 単位／リットル）を回収するためにはクロ
マトグラフ処理が必須である。インターフェロンは、従
って一個体の遺伝子から直接採取したヒトＤＮＡ断片の
指示のもとに細菌により生産される生物学的活性蛋白質
の最初の例となる。
ｏＲＩ部分消化断片からλ Ｃｈａｒｏｎ ４Ａ中への
クローニングによって直接単離されたＩＦＮ−β1 遺伝
子が発現可能で培養物の溶菌液中に著量のＩＦＮ活性を
蓄積させることができることを示した。生産された活性
は免疫学的性質ならびに種特異性から明らかに線維芽細
胞インターフェロン（β）である。活性はＩＦＮ−β1
Ｃ１５ファージクローンによる感染細菌を培養したとき
にだけ生産される。大腸菌中のクローンＣ１５によって
生産されるＩＦＮ活性はＣｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ−
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ上のクロマトグラフにおける性質が
ヒトＩＦＮ−βとよく似ている。細菌溶菌液から高活性
（７×１０6 単位／リットル）を回収するためにはクロ
マトグラフ処理が必須である。インターフェロンは、従
って一個体の遺伝子から直接採取したヒトＤＮＡ断片の
指示のもとに細菌により生産される生物学的活性蛋白質
の最初の例となる。
【００３５】4. 遺伝子ＩＦＮ−αc １８−３クローン クローンを、化学合成された短いオリゴヌクレオチドの
直接ハイブリッド化によって、ＩＦＮ−αの配列に相補
的であると同定した。総数０．５×１０6 の遺伝子中１
６のクローンがハイブリッド化陽性であった。オリゴヌ
クレオチドにハイブリッド化するＥｃｏＲＩ断片の配列
を調べた結果、クローン１８−３は、第１Ｂ図に示した
ように、ＩＦＮ−αc の遺伝子が位置する２Ｋｂ Ｅｃ
ｏＲＩ断片１８−３３（第１Ｂ図の挿入部分）を含んで
いることがわかった。この遺伝子は、明らかにゲッデル
ら（Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ．）〔１９８１，Ｎａ
ｔｕｒｅ ２９０，２０−２５〕によって報告されたＩ
ＦＮ−αc クローンを生じるｍＲＮＡの起源である。ク
ローン５−１は重複するＤＮＡ断片を表わす。クローン
５−１およびクローン１８−３はともに、ＩＦＮ−αc
に加えて、α−c 2およびα−c 4 と名付けた二つの他
のＩＦＮ−α遺伝子を担っている（第１Ｂ図）。
直接ハイブリッド化によって、ＩＦＮ−αの配列に相補
的であると同定した。総数０．５×１０6 の遺伝子中１
６のクローンがハイブリッド化陽性であった。オリゴヌ
クレオチドにハイブリッド化するＥｃｏＲＩ断片の配列
を調べた結果、クローン１８−３は、第１Ｂ図に示した
ように、ＩＦＮ−αc の遺伝子が位置する２Ｋｂ Ｅｃ
ｏＲＩ断片１８−３３（第１Ｂ図の挿入部分）を含んで
いることがわかった。この遺伝子は、明らかにゲッデル
ら（Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ．）〔１９８１，Ｎａ
ｔｕｒｅ ２９０，２０−２５〕によって報告されたＩ
ＦＮ−αc クローンを生じるｍＲＮＡの起源である。ク
ローン５−１は重複するＤＮＡ断片を表わす。クローン
５−１およびクローン１８−３はともに、ＩＦＮ−αc
に加えて、α−c 2およびα−c 4 と名付けた二つの他
のＩＦＮ−α遺伝子を担っている（第１Ｂ図）。
【００３６】5. ｒｅｃＡプロモーター調節下のヒトＩ
ＦＮ遺伝子断片の発現 ｒｅｃＡプロモーータは最強の大腸菌プロモーターのひ
とつと考えられている。通常、ｐＢＲ３２２のような多
数コピープラスミド上に存在するときでも、ｌｅｘ遺伝
子の生産物によって強く抑制されている。ｒｅｃＡプロ
モーターは損傷を受けたＤＮＡの存在下にそれ自身の抑
制体を切断して誘導され、誘導は非常に高い程度まで行
なわれる。〔サンカーおよびラップ（Ｓａｎｃａｒ ａ
ｎｄ Ｒｕｐｐ），１９７９，ＰＮＡＳ７６，３１４４
−３１４８〕。ｒｅｃＡの標準誘導物質はＤＮＡ合成を
妨げるナリジクス酸あるいはＤＮＡを交叉連結するマイ
トマイシンＣである。
ＦＮ遺伝子断片の発現 ｒｅｃＡプロモーータは最強の大腸菌プロモーターのひ
とつと考えられている。通常、ｐＢＲ３２２のような多
数コピープラスミド上に存在するときでも、ｌｅｘ遺伝
子の生産物によって強く抑制されている。ｒｅｃＡプロ
モーターは損傷を受けたＤＮＡの存在下にそれ自身の抑
制体を切断して誘導され、誘導は非常に高い程度まで行
なわれる。〔サンカーおよびラップ（Ｓａｎｃａｒ ａ
ｎｄ Ｒｕｐｐ），１９７９，ＰＮＡＳ７６，３１４４
−３１４８〕。ｒｅｃＡの標準誘導物質はＤＮＡ合成を
妨げるナリジクス酸あるいはＤＮＡを交叉連結するマイ
トマイシンＣである。
【００３７】約１キロベースのＴａｑ Ｉ−ＢａｍＨＩ
断片上のプロモーターを分離するためにクローン化した
ｒａｃＡを含むプラスミドｐＤＲ１４５３を使った。こ
れをＣｌａ ＩおよびＢａｍ Ｉで開裂したｐＢＲ３２
２に連結しプラスミドＲＡＰ−１を造成した。この場合
Ｔａｑ Ｉ−Ｃｌａ Ｉ結合はＣｌａ Ｉ部位を回復
し、その結果プラスミドはｒｅｃＡ遺伝子の第３番目の
コドン中で唯一開裂されることを可能にした。ＲＡＰ−
２はＲＡＰ−１をＥｃｏＲＩおよびＣｌａ Ｉで切断
し、粘着末端を埋め込み（ｆｉｌｌｉｎｇ ｉｎ）、Ｒ
Ｉ部位を回復する再連結を行なって造成した。ＲＡＰ−
２をＲＩ部位で開裂し、外来ＤＮＡをｒｅｃＡ蛋白の第
３番目のコドンに挿入することができる。ＲＡＰ−１ベ
クターをヒト遺伝子ライブラリーからの遺伝子断片によ
るインターフェロン活性の間接発現に使った。ＩＦＮ−
β1 遺伝子および数個の単離したαc 亜種のＩＦＮ−α
遺伝子はこのプラスミドに挿入したとき、標準抗ウィル
ス分析によると強いインターフェロン活性を生産するこ
とが認められた。これらの遺伝子が存在するＤＮＡのＲ
Ｉ断片（第１ＡおよびＢ図）をＲＡＰ−１プラスミドの
ＲＩ部位に二次クローン化した。該プラスミドをｒｅｃ
Ａ+ 宿主菌株に入れ、該細菌を培養し、ナリジクス酸で
誘導し、細胞を採集し、リゾチームおよび３０％プロピ
レングリコールで溶菌し、抽出物の抗ウィルス活性を分
析した。活性の程度は明らかにナリジクス酸による誘導
に依存し、最高５０μｇ／mlであった（第３表）。
断片上のプロモーターを分離するためにクローン化した
ｒａｃＡを含むプラスミドｐＤＲ１４５３を使った。こ
れをＣｌａ ＩおよびＢａｍ Ｉで開裂したｐＢＲ３２
２に連結しプラスミドＲＡＰ−１を造成した。この場合
Ｔａｑ Ｉ−Ｃｌａ Ｉ結合はＣｌａ Ｉ部位を回復
し、その結果プラスミドはｒｅｃＡ遺伝子の第３番目の
コドン中で唯一開裂されることを可能にした。ＲＡＰ−
２はＲＡＰ−１をＥｃｏＲＩおよびＣｌａ Ｉで切断
し、粘着末端を埋め込み（ｆｉｌｌｉｎｇ ｉｎ）、Ｒ
Ｉ部位を回復する再連結を行なって造成した。ＲＡＰ−
２をＲＩ部位で開裂し、外来ＤＮＡをｒｅｃＡ蛋白の第
３番目のコドンに挿入することができる。ＲＡＰ−１ベ
クターをヒト遺伝子ライブラリーからの遺伝子断片によ
るインターフェロン活性の間接発現に使った。ＩＦＮ−
β1 遺伝子および数個の単離したαc 亜種のＩＦＮ−α
遺伝子はこのプラスミドに挿入したとき、標準抗ウィル
ス分析によると強いインターフェロン活性を生産するこ
とが認められた。これらの遺伝子が存在するＤＮＡのＲ
Ｉ断片（第１ＡおよびＢ図）をＲＡＰ−１プラスミドの
ＲＩ部位に二次クローン化した。該プラスミドをｒｅｃ
Ａ+ 宿主菌株に入れ、該細菌を培養し、ナリジクス酸で
誘導し、細胞を採集し、リゾチームおよび３０％プロピ
レングリコールで溶菌し、抽出物の抗ウィルス活性を分
析した。活性の程度は明らかにナリジクス酸による誘導
に依存し、最高５０μｇ／mlであった（第３表）。
【００３８】
【表３】第３表 ｒｅｃＡ−プラスミドＲＡＰ−１中の遺伝子断片により生産されるＩＦ Ｎ−αおよびβ活性 ──────────────────────────────────── 実験 クローン 条 件 ＩＦＮ活性 （単位／ml） 1. ＲＡＰ−１（１８３３）−ＩＦＮ−αc ＋ナリジクス酸 ５００ ＲＡＰ−１（１８３３）−ＩＦＮ−αc −ナリジクス酸 ＜３２ 2. ＲＡＰ−１（１８３３）−ＩＦＮ−αc 右方向 １０００ ＲＡＰ−１（ ６３１）−ＩＦＮ−β1 右方向 ３０００ ＲＡＰ−１（ ６３１）−ＩＦＮ−β1 逆方向 ７５０
【００３９】クローンＲＡＰ−１（１８３３）はＩＦＮ
−αc 遺伝子を持つＥｃｏＲＩ断片を含む（第１Ｂ図） クローンＲＡＰ−１（６３１）はＩＦＮ−β1 遺伝子を
持つＥｃｏＲＩ断片を含む（第１Ａ図） 断片はｒｅｃＡ遺伝子の始めに導入した。方向はｒｅｃ
Ａプロモーター配向に関するものである。興味深いこと
には、遺伝子断片はｒｅｃＡプロモーターに関連する二
つの可能な配向で活性を生産することもある。活性を示
すＩＦＮ−β1 およびＩＦＮ−α遺伝子はすべて１．８
−２キロベースのＤＮＡ ＥｃｏＲＩ断片上に位置して
いたので、プロモーターからインターフェロン遺伝子の
ＡＴＧ開始コドンまでの距離はおよそ数百ヌクレオチド
である。これらの実験からプロモーターが予期したとお
り機能することは明らかであり、遺伝子ライブラリーか
らのインターフェロン様遺伝子の活性の有無を迅速に決
定することが可能である。
−αc 遺伝子を持つＥｃｏＲＩ断片を含む（第１Ｂ図） クローンＲＡＰ−１（６３１）はＩＦＮ−β1 遺伝子を
持つＥｃｏＲＩ断片を含む（第１Ａ図） 断片はｒｅｃＡ遺伝子の始めに導入した。方向はｒｅｃ
Ａプロモーター配向に関するものである。興味深いこと
には、遺伝子断片はｒｅｃＡプロモーターに関連する二
つの可能な配向で活性を生産することもある。活性を示
すＩＦＮ−β1 およびＩＦＮ−α遺伝子はすべて１．８
−２キロベースのＤＮＡ ＥｃｏＲＩ断片上に位置して
いたので、プロモーターからインターフェロン遺伝子の
ＡＴＧ開始コドンまでの距離はおよそ数百ヌクレオチド
である。これらの実験からプロモーターが予期したとお
り機能することは明らかであり、遺伝子ライブラリーか
らのインターフェロン様遺伝子の活性の有無を迅速に決
定することが可能である。
【００４０】6. ｔｒｙｐ−ｌａｃ混成プロモーター調
節下のＩＦＮ−β1 遺伝子の高発現 プラスミドＰＬＪ ３〔ジョンスラド（Ｊｏｈｎｓｒｕ
ｄ），ＰＮＡＳ，１９７８，７５，５３１４−５３１
８〕は関連のない９５ヌクレオチドで隔てられた各９５
塩基対長の２つのｌａｃプロモーターを含んでいる。こ
の２８５ヌクレオチド断片をプラスミドＰＭＢ９のＥｃ
ｏＲＩ部位に挿入する。９５塩基対長のｌａｃ配列はオ
ペレーターおよびプロモーター配列を含み、β−ガラク
トシダーゼのＡＴＧの直前で停止する。β−ガラクトシ
ダーゼのリボゾーム結合部位から適当な距離に挿入し
た、ＡＴＧ開始コドンを有するコード化ＤＮＡ配列は大
腸菌細胞中で正確に発現されるはずである。２８５塩基
対のＥｃｏＲＩ断片をｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位に
再クローン化した。組換え体を４０μｇ／mlＸ−ｇａｌ
および１５μｇ／mlテトラサイクリン含有プレートで細
胞を増殖させて選別した。陽性の青色コロニーだけを集
めＤＮＡを塩化セシウム勾配遠心で精製した。
節下のＩＦＮ−β1 遺伝子の高発現 プラスミドＰＬＪ ３〔ジョンスラド（Ｊｏｈｎｓｒｕ
ｄ），ＰＮＡＳ，１９７８，７５，５３１４−５３１
８〕は関連のない９５ヌクレオチドで隔てられた各９５
塩基対長の２つのｌａｃプロモーターを含んでいる。こ
の２８５ヌクレオチド断片をプラスミドＰＭＢ９のＥｃ
ｏＲＩ部位に挿入する。９５塩基対長のｌａｃ配列はオ
ペレーターおよびプロモーター配列を含み、β−ガラク
トシダーゼのＡＴＧの直前で停止する。β−ガラクトシ
ダーゼのリボゾーム結合部位から適当な距離に挿入し
た、ＡＴＧ開始コドンを有するコード化ＤＮＡ配列は大
腸菌細胞中で正確に発現されるはずである。２８５塩基
対のＥｃｏＲＩ断片をｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位に
再クローン化した。組換え体を４０μｇ／mlＸ−ｇａｌ
および１５μｇ／mlテトラサイクリン含有プレートで細
胞を増殖させて選別した。陽性の青色コロニーだけを集
めＤＮＡを塩化セシウム勾配遠心で精製した。
【００４１】ｌａｃプロモーターにはｐＢＲ３２２のア
ンピシリン遺伝子方向とテトラサイクリン遺伝子方向の
二方向が予期できる。本発明者らの興味はｌａｃリボゾ
ーム結合部位とｐＢＲ３２２配列の間に位置するＥｃｏ
ＲＩ部位のみを得ることにあるので、プラスミドＤＮＡ
にＲＮＡポリメラーゼを結合することによってこの部位
を保護し、一方末梢部位をＥｃｏＲＩ制限で開裂し、Ｄ
ＮＡポリメラーゼのクレノーフラグメント（Ｋｌｅｎｏ
ｗ ｆｒａｇｍｅｎｔ）で埋め込みを行ない、再結合し
た。ＭＭ２９４大腸菌細胞を形質転換後、プラスミドを
分離し、ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位とＢａｍＨＩ部
位の間の距離を測った。３７５塩基対断片を含むプラス
ミドはｌａｃプロモーターがテトラサイクリン遺伝子方
向で、６７０塩基対断片（３７５±２９５ｂ．ｐ．）を
含むプラスミドはｌａｃプロモーターがアンピシリン遺
伝子方向であった。ＩＦＮ−β1 遺伝子断片のＥｃｏＲ
Ｉ １．８４Ｋｂ二次クローンから、本発明者らはプレ
インターフェロン配列を含むＨｉｎｃII−ＢｇｌII断片
を切出した。
ンピシリン遺伝子方向とテトラサイクリン遺伝子方向の
二方向が予期できる。本発明者らの興味はｌａｃリボゾ
ーム結合部位とｐＢＲ３２２配列の間に位置するＥｃｏ
ＲＩ部位のみを得ることにあるので、プラスミドＤＮＡ
にＲＮＡポリメラーゼを結合することによってこの部位
を保護し、一方末梢部位をＥｃｏＲＩ制限で開裂し、Ｄ
ＮＡポリメラーゼのクレノーフラグメント（Ｋｌｅｎｏ
ｗ ｆｒａｇｍｅｎｔ）で埋め込みを行ない、再結合し
た。ＭＭ２９４大腸菌細胞を形質転換後、プラスミドを
分離し、ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位とＢａｍＨＩ部
位の間の距離を測った。３７５塩基対断片を含むプラス
ミドはｌａｃプロモーターがテトラサイクリン遺伝子方
向で、６７０塩基対断片（３７５±２９５ｂ．ｐ．）を
含むプラスミドはｌａｃプロモーターがアンピシリン遺
伝子方向であった。ＩＦＮ−β1 遺伝子断片のＥｃｏＲ
Ｉ １．８４Ｋｂ二次クローンから、本発明者らはプレ
インターフェロン配列を含むＨｉｎｃII−ＢｇｌII断片
を切出した。
【００４２】成熟ＩＦＮ−β1 蛋白はそのアミノ基末端
に大腸菌内で開始コドンとして用いることができるメチ
オニンを含んでいる。このＡＴＧコドンに接して１３ヌ
クレオチド隔てられた２つのＡｌｕＩ部位がある。１つ
はＡＴＧの前８ヌクレオチド、他はＡＴＧの後２ヌクレ
オチドである。部分的ＡｌｕＩ消化をＨｉｎｃII−Ｂｇ
ｌII断片で行ない、約５１０塩基対の断片をアガロース
ゲルで単離した。テトラサイクリン遺伝子方向のｌａｃ
プロモーターを含むベクターをＥｃｏＲＩで制限し、制
限部位をＤＮＡポリメラーゼで埋め込みを行ないＢａｍ
ＨＩで再切断した。ＡｌｕＩ−ＢｇｌII断片と埋め込み
を行なったＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩベクターの連結でＥ
ｃｏＲＩ部位が回復した。ＡＴＧコドンを含むクローン
（１３ヌクレオチド長）の間の区別を可能にするために
得られたクローンをＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで制限し、予
期した１５１塩基対の断片を含むクローンの配列を決め
た。次いでＥｃｏＲＩ部位を再開裂し、リボゾーム結合
部位とＡＴＧの間の距離をＢａｌ３１消化と再結合で短
くした。これらのプラスミドで形質転換した大腸菌はＩ
ＦＮ−β1 生産により選別した。
に大腸菌内で開始コドンとして用いることができるメチ
オニンを含んでいる。このＡＴＧコドンに接して１３ヌ
クレオチド隔てられた２つのＡｌｕＩ部位がある。１つ
はＡＴＧの前８ヌクレオチド、他はＡＴＧの後２ヌクレ
オチドである。部分的ＡｌｕＩ消化をＨｉｎｃII−Ｂｇ
ｌII断片で行ない、約５１０塩基対の断片をアガロース
ゲルで単離した。テトラサイクリン遺伝子方向のｌａｃ
プロモーターを含むベクターをＥｃｏＲＩで制限し、制
限部位をＤＮＡポリメラーゼで埋め込みを行ないＢａｍ
ＨＩで再切断した。ＡｌｕＩ−ＢｇｌII断片と埋め込み
を行なったＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩベクターの連結でＥ
ｃｏＲＩ部位が回復した。ＡＴＧコドンを含むクローン
（１３ヌクレオチド長）の間の区別を可能にするために
得られたクローンをＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで制限し、予
期した１５１塩基対の断片を含むクローンの配列を決め
た。次いでＥｃｏＲＩ部位を再開裂し、リボゾーム結合
部位とＡＴＧの間の距離をＢａｌ３１消化と再結合で短
くした。これらのプラスミドで形質転換した大腸菌はＩ
ＦＮ−β1 生産により選別した。
【００４３】クローン、Ｌ−１１は約３×１０6 単位／
リットルのＩＦＮ−βを生産した。このクローン中のｌ
ａｃプロモーター領域をＨｐａＨＩで、すなわちｍＲＮ
Ａ開始前１７ヌクレオチドで切断した。ＩＦＮ−β1 遺
伝子を切出すため、酵素Ｓａｕ ３ａを用いそのＤＮＡ
をＩＦＮ−β1 の停止コドンを越えて３ヌクレオチドで
切断した。このＨｐａII−Ｓａｕ ３ａ ｌａｃ−ＩＦ
Ｎ−β1 断片を下記のごとくに調製したｔｒｙｐプロモ
ータープラスミドのＣｌａＩ部位とＨｉｎｄIII 部位の
間に導入した。ｔｒｙｐ ｍＲＮＡの開始前−２１〜−
２０１の１８０ヌクレオチド長のＴａｑＩ−ＴａｑＩ断
片をｔｒｙｐプラスミドｐＥＰ１２１−２２１から切出
し、ｐＢＲ３２２のＣｌａＩ部位にクローン化した。本
発明者らは、ｔｒｙｐプロモーター断片が時計方向に向
いた配向のものを選んだ。この操作によりｔｒｙｐプロ
モーターの−２１の位置にＣｌａＩ部位が回復する。ｌ
ａｃ−ＩＦＮ−β1 断片に連結後、混成プロモーターｔ
ｒｙｐ−ｌａｃがＩＦＮ−β1 遺伝子の前に形成され
る。このプラスミドＴＬ−１１を大腸菌ＭＭ２９４ある
いは大腸菌ミニセル株ｐ６７９−５４の形質転換に使っ
た。これらの細菌はＯ Ｄ650 １０の発酵槽培養で１０
8 単位／リットルのＩＦＮ−β1 を生産する。このこと
はこのＩＦＮ−β1 遺伝子ＤＮＡ断片が高い活性を有す
ることを示している（第４図）。
リットルのＩＦＮ−βを生産した。このクローン中のｌ
ａｃプロモーター領域をＨｐａＨＩで、すなわちｍＲＮ
Ａ開始前１７ヌクレオチドで切断した。ＩＦＮ−β1 遺
伝子を切出すため、酵素Ｓａｕ ３ａを用いそのＤＮＡ
をＩＦＮ−β1 の停止コドンを越えて３ヌクレオチドで
切断した。このＨｐａII−Ｓａｕ ３ａ ｌａｃ−ＩＦ
Ｎ−β1 断片を下記のごとくに調製したｔｒｙｐプロモ
ータープラスミドのＣｌａＩ部位とＨｉｎｄIII 部位の
間に導入した。ｔｒｙｐ ｍＲＮＡの開始前−２１〜−
２０１の１８０ヌクレオチド長のＴａｑＩ−ＴａｑＩ断
片をｔｒｙｐプラスミドｐＥＰ１２１−２２１から切出
し、ｐＢＲ３２２のＣｌａＩ部位にクローン化した。本
発明者らは、ｔｒｙｐプロモーター断片が時計方向に向
いた配向のものを選んだ。この操作によりｔｒｙｐプロ
モーターの−２１の位置にＣｌａＩ部位が回復する。ｌ
ａｃ−ＩＦＮ−β1 断片に連結後、混成プロモーターｔ
ｒｙｐ−ｌａｃがＩＦＮ−β1 遺伝子の前に形成され
る。このプラスミドＴＬ−１１を大腸菌ＭＭ２９４ある
いは大腸菌ミニセル株ｐ６７９−５４の形質転換に使っ
た。これらの細菌はＯ Ｄ650 １０の発酵槽培養で１０
8 単位／リットルのＩＦＮ−β1 を生産する。このこと
はこのＩＦＮ−β1 遺伝子ＤＮＡ断片が高い活性を有す
ることを示している（第４図）。
【００４４】図面の説明 第１Ａ図 ：ＩＦＮ−β1 クローンＣ１５ＤＮＡの模式構
造 (a) λ Ｃｈａｒｏｎ ４Ａの模式図。２つのアーム
は実線で示す。 (b) クローンＣ１５に挿入したヒトＤＮＡの構造、黒
塗部分はＩＦＮ−β1ｃＤＮＡにハイブリッド化するＥ
ｃｏＲＩ断片を示す。 (c) ｂからの黒塗断片の拡大は二重線として示す。単
線はλ右アームの部分である。ＰL はλ左方向プロモー
ターである。 (d) ＩＦＮ−β1 ｍＲＮＡの位置。上方の目盛りは
(a) と(b) に対応する。下方の目盛りは(c) と(d) に対
応する。詳細は本文参照。第１Ｂ図 ：ＩＦＮ−αc クローン１８−３の模式構造 ２つのλ Ｃｈａｒｏｎ ４Ａクローン挿入部分の制限
地図を示す。ＩＦＮ−αc 遺伝子は矢印アルファーＣ*
で示される。他の２つのＩＦＮ−αc 遺伝子がＩＦＮ−
αc の近くに存在する。挿入部分はＩＦＮ−αc 遺伝子
を含み、本文に説明したようにｒｅｃＡプラスミド中に
クローン化したＥｃｏＲＩ ２Ｋｂフラグメント１８−
３３を示す。制限酵素部位に対応する記号を示す。第２図 ：遺伝子クローンＩＦＮ−β1 Ｃ１５により生産
されたインターフェロンのＢｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓ
ｅでの分析 ファージＣ１５感染大腸菌ＤＰ５０の粗溶菌液を“材料
および方法”に記載のごとく分画し、ＩＦＮ活性を各画
分について分析した（●──●）。蛋白濃度を同じ画分
について測った（●──●）。λ Ｃｈａｒｏｎ ４Ａ
ファージからの溶菌液の平行クロマトグラフィと分析を
示す（□──□）。
造 (a) λ Ｃｈａｒｏｎ ４Ａの模式図。２つのアーム
は実線で示す。 (b) クローンＣ１５に挿入したヒトＤＮＡの構造、黒
塗部分はＩＦＮ−β1ｃＤＮＡにハイブリッド化するＥ
ｃｏＲＩ断片を示す。 (c) ｂからの黒塗断片の拡大は二重線として示す。単
線はλ右アームの部分である。ＰL はλ左方向プロモー
ターである。 (d) ＩＦＮ−β1 ｍＲＮＡの位置。上方の目盛りは
(a) と(b) に対応する。下方の目盛りは(c) と(d) に対
応する。詳細は本文参照。第１Ｂ図 ：ＩＦＮ−αc クローン１８−３の模式構造 ２つのλ Ｃｈａｒｏｎ ４Ａクローン挿入部分の制限
地図を示す。ＩＦＮ−αc 遺伝子は矢印アルファーＣ*
で示される。他の２つのＩＦＮ−αc 遺伝子がＩＦＮ−
αc の近くに存在する。挿入部分はＩＦＮ−αc 遺伝子
を含み、本文に説明したようにｒｅｃＡプラスミド中に
クローン化したＥｃｏＲＩ ２Ｋｂフラグメント１８−
３３を示す。制限酵素部位に対応する記号を示す。第２図 ：遺伝子クローンＩＦＮ−β1 Ｃ１５により生産
されたインターフェロンのＢｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓ
ｅでの分析 ファージＣ１５感染大腸菌ＤＰ５０の粗溶菌液を“材料
および方法”に記載のごとく分画し、ＩＦＮ活性を各画
分について分析した（●──●）。蛋白濃度を同じ画分
について測った（●──●）。λ Ｃｈａｒｏｎ ４Ａ
ファージからの溶菌液の平行クロマトグラフィと分析を
示す（□──□）。
【００４５】第３図：遺伝子クローンＩＦＮ−β1 Ｃ１
５インターフェロンの力価 第２図のカラムからのファージＣ１５ＩＦＮの画分（約
１０3 単位／ml）を１：４０に希釈し、ついでＶＳＶ
ＲＮＡ合成の希釈によるＩＦＮの分析の為にミクロプレ
ート上で連続的に希釈した（○──○）。標準ヒト線維
芽細胞インターフェロン２５単位／mlを平行して分析し
た（●──●）。ＶＳＶなしの対照（□）およびＶＳＶ
ありＩＦＮなしの対照（■）を示す。右の２つのカラム
は“方法”で示したように、固定化した抗ＩＦＮ−βま
たは非免疫ＩｇＧに吸着後のファージＣ１５ＩＦＮの残
存活性（最終希釈１：４０）を示す。第４図 ：プラスミドＴＬ１１含有大腸菌の増殖とＩＦＮ
生産 ＴＬ１１プラスミドは本文に示したごとく混成ｔｒｐｙ
−ｌａｃプロモーターおよびヒト遺伝子断片由来成熟ヒ
トＩＦＮ−β1 をコードする配列を含んでいる。細菌を
１リットルのニュー・ブルンスウィック発酵槽（Ｎｅｗ
Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ）中で増殖
し、指示した時間に、細菌をリゾチーム−プロピレング
リコールで溶菌し、ＶＳＶにヒト細胞を攻撃させてＩＦ
Ｎ活性を測定した。ＩＦＮ活性は細菌培養物１ml当りで
計算する。
５インターフェロンの力価 第２図のカラムからのファージＣ１５ＩＦＮの画分（約
１０3 単位／ml）を１：４０に希釈し、ついでＶＳＶ
ＲＮＡ合成の希釈によるＩＦＮの分析の為にミクロプレ
ート上で連続的に希釈した（○──○）。標準ヒト線維
芽細胞インターフェロン２５単位／mlを平行して分析し
た（●──●）。ＶＳＶなしの対照（□）およびＶＳＶ
ありＩＦＮなしの対照（■）を示す。右の２つのカラム
は“方法”で示したように、固定化した抗ＩＦＮ−βま
たは非免疫ＩｇＧに吸着後のファージＣ１５ＩＦＮの残
存活性（最終希釈１：４０）を示す。第４図 ：プラスミドＴＬ１１含有大腸菌の増殖とＩＦＮ
生産 ＴＬ１１プラスミドは本文に示したごとく混成ｔｒｐｙ
−ｌａｃプロモーターおよびヒト遺伝子断片由来成熟ヒ
トＩＦＮ−β1 をコードする配列を含んでいる。細菌を
１リットルのニュー・ブルンスウィック発酵槽（Ｎｅｗ
Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ）中で増殖
し、指示した時間に、細菌をリゾチーム−プロピレング
リコールで溶菌し、ＶＳＶにヒト細胞を攻撃させてＩＦ
Ｎ活性を測定した。ＩＦＮ活性は細菌培養物１ml当りで
計算する。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１（第１Ａ図）はＩＦＮ−β1 クローンＣ１
５ＤＮＡの構造を示す。
５ＤＮＡの構造を示す。
【図２】図２（第１Ｂ図）はＩＦＮ−αc クローン１８
−３の構造を示す。
−３の構造を示す。
【図３】図３（第２図）はインターフェロンのＢｌｕｅ
−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅでの分析を示す。
−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅでの分析を示す。
【図４】図４（第３図）は遺伝子クローンＩＦＮ−β1
Ｃ１５インターフェロンの力価を示す。
Ｃ１５インターフェロンの力価を示す。
【図５】図５（第４図）はプラスミドＴＬ１１含有大腸
菌の増殖とＩＦＮ生産を示す。
菌の増殖とＩＦＮ生産を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ユテイ ケルナヨフスキー イスラエル国レホボト，エム．ミズラキ ストリート 12 (72)発明者 ルイセ チエン イスラエル国ラマツト アビブ，タゴール ストリート 52 (72)発明者 シエルドン イスラエル フエインステイ ン アメリカ合衆国コネチカツト州ニユー ヘ ブン，フアーンハム アベニユー 33
Claims (7)
- 【請求項１】 ヒト白血球型インターフェロンαc をコ
ードする配列を含むヒト遺伝子ＤＮＡ断片をλ−ファー
ジに導入し、そのようなファージ組換え体で適当な細菌
を感染し、そのような細菌を培養し、次いでインターフ
ェロンを採取することを特徴とする、実質的量のヒト白
血球型インターフェロンαc の製造法。 - 【請求項２】 ヒト白血球型インターフェロンαc をコ
ードする配列を含むヒト遺伝子ＤＮＡ断片をλ−ファー
ジに導入し、そのようなファージからヒト白血球型イン
ターフェロンαc をコードする配列を含むＤＮＡ断片を
採取し、該ＤＮＡ断片を適当な細菌に感染後ヒト白血球
型インターフェロンαc の合成を誘導し得るプラスミド
に導入し、そのような細菌を培養し、次いでインターフ
ェロンを採取することを特徴とする、実質的量のヒト白
血球型インターフェロンαc の製造法。 - 【請求項３】 ファージが第１Ｂ図に示した遺伝子地図
を有するＣｌｏｎｅ１８−３を得ることのできるλ−Ｃ
ｈａｒｏｎ ４Ａである、請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 感染される細菌が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）である、請求項１又は２記載の方法。 - 【請求項５】 ヒト遺伝子ＤＮＡ断片をファージから採
取し、適当な細菌においてヒト白血球型インターフェロ
ンαc の合成を誘導することができる強力なプロモータ
ーを備えたプラスミド発現ベクターに導入する、請求項
２記載の方法。 - 【請求項６】 プラスミドが大腸菌のｒｅｃＡプロモー
ターを含むｐＢＲ３２２である、請求項５記載の方法。 - 【請求項７】 インターフェロンαc 遺伝子を含むヒト
遺伝子ＤＮＡ断片をファージまたはプラスミドから取
り、トリプトファンプロモーターのＲＮＡポリメラーゼ
結合部位を含むように改良された大腸菌ｌａｃプロモー
ターのリボゾーム結合部位に連結した成熟ＩＦＮの最初
のメチオニンに対当するコドンの隣りを切断し、混成ｔ
ｒｙｐ−ｌａｃプロモーターを得、該プラスミドを適当
な細菌に再導入し、該細菌を培養してインターフェロン
を生産する、請求項１又は２記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| IL63327 | 1981-07-16 | ||
| IL63327A IL63327A (en) | 1981-07-16 | 1981-07-16 | Production of interferon beta1 and alpha-phage recombinants for its production in host bacteria |
Related Parent Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP57124313A Division JP2501549B2 (ja) | 1981-07-16 | 1982-07-16 | インタ−フエロンの製造法 |
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|---|---|
| JPH05252977A true JPH05252977A (ja) | 1993-10-05 |
| JP2500174B2 JP2500174B2 (ja) | 1996-05-29 |
Family
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Family Applications (2)
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|---|---|---|---|
| JP57124313A Expired - Lifetime JP2501549B2 (ja) | 1981-07-16 | 1982-07-16 | インタ−フエロンの製造法 |
| JP4113784A Expired - Lifetime JP2500174B2 (ja) | 1981-07-16 | 1992-05-06 | インタ―フェロンの製造法 |
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| CH (1) | CH664761A5 (ja) |
| DE (1) | DE3226319A1 (ja) |
| FR (1) | FR2509614B1 (ja) |
| GB (1) | GB2103222B (ja) |
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| IT (1) | IT1195940B (ja) |
| SE (1) | SE464088B (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013520184A (ja) * | 2010-02-24 | 2013-06-06 | ザイムネックス エー／エス | 組み換えリソソームα−マンノシダーゼの生産および精製のための方法 |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3220116A1 (de) * | 1982-05-28 | 1983-12-01 | Dr. Karl Thomae Gmbh, 7950 Biberach | Mikrobiologisch hergestellte (alpha)- und ss-interferone, dna-sequenzen, die fuer diese interferone codieren, mikroorganismen, die diese genetische information enthalten, und verfahren zu ihrer herstellung |
| JPS5965099A (ja) * | 1982-10-05 | 1984-04-13 | Takeda Chem Ind Ltd | 発現用プロモ−タ−およびその用途 |
| JPS6054685A (ja) * | 1983-09-02 | 1985-03-29 | Suntory Ltd | 改良発現ベクタ−およびその利用 |
| ZA846554B (en) * | 1983-09-20 | 1985-04-24 | Hoffmann La Roche | Immune interferon and method for its purification |
| US4707445A (en) * | 1984-07-31 | 1987-11-17 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Intact gene and method of excising and cloning same |
| CN101772650B (zh) | 2007-08-07 | 2012-11-21 | 松下电器产业株式会社 | 悬吊式电风扇 |
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|---|---|---|---|---|
| ES8302096A1 (es) * | 1980-04-03 | 1982-12-16 | Biogen Nv | Un metodo de producir un polipeptido que muestra una actividad immunologica obiologica de interferon de fibroblasto hu- mano. |
| ATE25985T1 (de) * | 1980-06-12 | 1987-04-15 | Japan Found Cancer | Plasmid. |
| ZA816621B (en) * | 1980-09-25 | 1982-09-29 | Genentech Inc | Microbial production of human fibroblast interferon |
-
1981
- 1981-07-16 IL IL63327A patent/IL63327A/xx not_active IP Right Cessation
-
1982
- 1982-06-23 SE SE8203890A patent/SE464088B/sv not_active Application Discontinuation
- 1982-07-06 GB GB08219499A patent/GB2103222B/en not_active Expired
- 1982-07-13 CH CH4268/82A patent/CH664761A5/de not_active IP Right Cessation
- 1982-07-14 DE DE19823226319 patent/DE3226319A1/de active Granted
- 1982-07-15 IT IT22411/82A patent/IT1195940B/it active
- 1982-07-15 CA CA000407391A patent/CA1339829C/en not_active Expired - Lifetime
- 1982-07-16 FR FR8212437A patent/FR2509614B1/fr not_active Expired
- 1982-07-16 JP JP57124313A patent/JP2501549B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-05-06 JP JP4113784A patent/JP2500174B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013520184A (ja) * | 2010-02-24 | 2013-06-06 | ザイムネックス エー／エス | 組み換えリソソームα−マンノシダーゼの生産および精製のための方法 |
| US10159718B2 (en) | 2010-02-24 | 2018-12-25 | Chiesi Farmaceutici S.P.A | Process for production and purification of recombinant lysosomal alpha-mannosidase |
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| GB2103222B (en) | 1985-05-15 |
| IT8222411A1 (it) | 1984-01-15 |
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| DE3226319A1 (de) | 1983-02-03 |
| CA1339829C (en) | 1998-04-21 |
| IT1195940B (it) | 1988-11-03 |
| SE8203890L (sv) | 1983-01-17 |
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| SE8203890D0 (sv) | 1982-06-23 |
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