FR2493867A1 - Interferons de leucocytes humains hybrides et procede pour leur preparation microbiologique - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENTION CONCERNE UN POLYPEPTIDE ANTIVIRAL D'ENVIRON 165-166 ACIDES AMINES, LA SEQUENCE D'ACIDES AMINES DUDIT POLYPEPTIDE COMPRENANT, EN SEQUENCE, DES SOUS-SEQUENCES DISCRETES CORRESPONDANT, QUANT A L'IDENTITE ET AU NOMBRE DES ACIDES AMINES, A DES SOUS-SEQUENCES D'INTERFERONS DE LEUCOCYTES DIFFERENTS, SE TROUVANT DANS LA NATURE, LA SEQUENCE D'ACIDES AMINES DUDIT POLYPEPTIDE DIFFERANT DANS SA COMPOSITION GLOBALE DE LA SEQUENCE D'ACIDES AMINES D'INTERFERONS DE LEUCOCYTES SE TROUVANT DANS LA NATURE.

Description

La présente invention concerne la production

microbienne, par la technologie de ltAOUj recombinant, d'in-

terFérons de leucocyte hybrides aux Fins d'application dans le traitement des maladies virales et néoplasiques, et les moyens et produits finaux d'une telle production. On a obtenu des interférons de leucocyte relativement homogènes à partir de leucocytes de donneurs normaux ou leucémiques. Ces interférons sont une famille de protéines caractérisées par une puissante aptitude à conférer un

état de résistance aux virus à leurs cellules-cibles.

on outre, l'interféron peut agir pour inhiber la proliFé-

ration cellulaire et moduler la réponse immunitaire. Ces

propriétés ont incité à l'application clinique de l'inter-

Féron comme agent thérapeutique pour le traitement des

infections virales et des états malins.

Plus récemment, on a employé la technologie de 1'AON recombinant pour déclencher la production microbienne d'un certain nombre d'interFérons de leucocyte différents dont la séquence d'acides aminés présente une homolouie de l'ordre de 70% l'une par rapport a l'autre, le tout de la manière décrite par David V. Goeddel et coll. [Nature a9o, -2S (1Y81)). Les gènes encodant les séquences d'acides aminés de divers interférons de leucocyte appelés, entre autres, LeIF A, B, C, 0, F, et H, respectivement, s'obtiennent à partir de la lignée cellulaire KG-1 décrite

par KoeFFler, H.P. et Golde, O.W. CScience D00, 11S3-

1154 C1278]), par Oavid V. Soeddel et Sidney Pestka.

La lignée cellulaire KG-1 a été déposée à l'American Type

Culture Collection, ATCC n CHL 8U31. Ces gènes, correcte-

ment déployés dans des véhicules plasmidiques d'expression bactérienne, peuvent être employés pour transformer les bactéries-hôtes, de préFérence Z. coli K-1î souche e94,

ATCC n 3144G, déposée le 2U octobre 1978.

La cheville ouvrière de la technologie de l'AUN 33 recombinant est le plasmide, boucle non-chromosomique

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d'ADN à deux brins que lton'trouve chez les bactéries et d'autres microbes, souvent à de multiples exemplaires par cellule. Dans l'information encodée dans I#AON du

plasmide est comprise celle qui est nécessaire pour repro-

duire le plasmide dans les cellules filles Cc'est-à-dire

un "réplicon") et, ordinairement, une ou plusieurs carac-

téristiques de sélection comme, dans le cas des bactéries, la résistance aux antibiotiques qui permet à des clones de la cellulose contenant le plasmide en question d'être reconnus et cultivés préférentiellement dans des milieux sélectifs. L'utilité des plasmides tient au fait qu'ils peuvent être spécifiquement clives par l'une ou l'autre des endonucléases de restriction ou "enzymes de restriction",

dont chacune reconnaît un site différent sur l'ADN plasmi-

dique. On peut ensuite insérer des gènes ou fragments de gènes hétérologues dans le plasmide en les adjoignant à la suite

au site de clivage ou aux extrémités reconstruites adjacen-

tes au site de clivage. La recombinaison de l'ADN s'effec-

tue à l'extérieur de la cellule, mais le plasmide "Srecom-

binant" qui en résulte peut y être introduit par un processus connu sous le nom de transformation et l'on obtient de grandes quantités de piasmide recombinant contenant le gène hétérologue en cultivant le transformant. De plus, lorsque le gène est correctement inséré par rapport aux Fractions du plasmide qui gouverne la transcription et la traduction du message d'AON encodé, le véhicule d'expression obtenu peut être utilisé pour produire effectivement la séquence polypeptidique pour laquelle le gène inséré code, processus

appelé expression.

- L'expression est amorcée dans une région connue sous le nom de promoteur qui est reconnue et liée par l'ARHN polymérase. Dans certains cas, comme dans

le promoteur de tryptophane ou "trp" préféré dans la prati-

qua de l'invention, les régions promotrices se chevauchent

33 avec des régions "opératrices" pour Former un-promoteur-

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opérateur combiné. Les opérateurs sont des séquences d'ADN qui sont reconnues par ce qu'on appelle des protéines répresseurs qui servent à régler la Fréquence d'initiation de transcription à un promoteur particulier. La polymérase se déplace le long de P'ADN, transcrivant l'information contenue dans le brin d'encodage de son extrémité 5' à son extrémité 3' dans un ARN messager qui est à son tour traduit en un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés pour laquelle l'AON code. Chaque acide aminé est encodé par un triplet de nucléotides ou "codon" au sein de ce qu'on peut appeler dans l'optique présente le "gène de structure", c'est-à-dire la partie qui encode la séquence d'acides aminés du produit exprimé. Après s'être liée au promoteur, 1ARN polymérase commence par transcrire les nucléotides qui encodent un site de liaison ribosomique, puis un

signal d'initiation de traduction ou signal "dépar-té [ordi-

nairement ATG, qui dans i'ARi4 messager résultant devient AUG), puis les codons de nucleotides dans le Sène de structure lui-même. Ce qu'on appelle des codons d'arrêt sont transcrits à l'extrémité 'du ène de structure, après quoi la polymérase peut former une séquence additionnelle d'ARN messager qui, à cause de la présence du signal

d'arrêt, restera non traduite par les ribosomes. Les ribo-

somes se Fixent au site de liaison ménagé sur 'ARN messa-

Z5 ger, chez les bactéries ordinairement au fur et à mesure que l'ARi4m est formé, et produisent eux-mêmes le polypeptide encodé, en commendant au signal de départ de traduction et en finissant au signal d'arrêt mentionné ci-dessus. Le produit désiré est produit si les séquences qui encodent

le site de liaison ribosomique sont positionnées correcte-

ment vis-à-vis du codon d'initiation AUG et si tous les

codons restants suivent le codon d'initiation en phase.

Le produit résultant peut être obtenu en lysant la cellule-

hote et en recueillant le produit par une purification

appropriée à partir d'autres protéines bactériennes.

Les études de séquences nucléotidiques de gènes encodant les divers interférons de leucocytes révèlent un certain degré de similitude entre plusieurs d'entre eux quant à la présence et à la localisation de sites de clivage

S reconnus par des endonucléases de restriction particulières.

Selon l'invention, on peut tirer parti de cette similitude pour former, par recombinaison de 1'ADH, de nouveaux gènes

hybrides utiles dans la production microbienne d'interfé-

rons de leucocytes hybrides dont on peut s'attendre qu'ils

présentent dans une plus ou moins grande mesure les proprié-

tés antivirales ou autres des interférons encodés par les gènes parentaux. Dans les modes de réalisation préférés de l'invention, de tels interférons de leucocytes hybrides peuvent présenter une activité améliorée par rapport à ceux

qui sont encodés par les gènes parentaux.

Les gènes d'interFérons de leucocytes parentaux, encodant la famille des protéines d'interférons de leucocytes

ici considérée, présentent des variations alléliques natu-

relles d'un individu à l'autre. Ces variations peuvent être mises en évidence par une ou plusieurs différences d'acides

aminés dans la séquence protéique globale ou par des délé-

tions, substitutions, insertions, inversions ou additions

d'un ou de plusieurs acides aminés dans ladite séquence.

Pour chaque interféron de leucocyte parental ici envisagé, dénoté LeIF A, LelF B... LeIF J, etc, ces variations alléliques sont comprises dans la portée de la désignation ou du terme définissant ainsi ces interférons, et de cette

manière l'invention.

La manière dont ces objets et avantages de l'in-

vention, ainsi que d'autres, sont obtenus, apparaîtra mieux

d'après la description détaillée qui suit et d'après les

dessins joints, o: La figure I représente la séquence nucléotidique des régions dlencodage de huit clones d'ADN complémentaire 33 [AAOUc] d'interférons de leucocytes ["LeIF"). Parmi celles-ci, l'une, désignée de manière correspondante par LeIF E, est un "pseudogène" apparent n'encodant pas d'interféron de leucocyte actif tandis qu'une autre, désignée par LeIF G, ne contient pas la séquence entière de l'espèce d'interféron correspondante. Le codon d'initiation de traduction ATG et

le triplet de terminaison de chaque LeIF sont soulignés.

La figure 2 représente les cartes d'endonucléases

de restriction de huit types d'AONc clones de LeIF CA à H).

Les plasmides contenant les clones ont été construits par

le procédé d'allongement dC:dG [Goeddel),-D.V. et coll.

Nature 287, 411-416 [1980)3]. On peut donc exciser les inser-

tions d'AONc en utilisant Pst I, c'est-à-dire que chaque ex-

trémité de chacune des insertions est un.site de clivage d'endonucléqse de restriction Pst I. Les traits à l'extrémité .

de chaque insertion d'AONc représentent les queues homopo-

lymériques latérales dC:dG. Les positions des sites de restriction Pvu II, Eco RI et Bgl II sont indiqués. Les régions pointillées de la figure représentent les séquences d'encodage de LeIF mûrs; les régions hachurées indiquent les ao séquences dtencodage des peptides signaux; et les régions

blanches montrent les séquences hon codantes 31 et 5S.

La figure 3 est une comparaison des huit séquences

protéiques de LeIF prédites d'après les séquences nucléoti-

diques. On utilise les abréviations à une lettre recommandées s5 par la Commission de nomenclature biochimique de l'UICPA-UIB CIUPAC-IUB]: A, alanine; C, cystéine; 0, acide aspartique;

9, acide glutamique; F, phénylalanine; G, glycine; H, his-

tidine; 1, isoleucine; K, lysine; L, leucine; M, méthionine; N, asparagine; P, proline; Q, glutamine; R, arginine; S,

sérine; T, thréonine; Vs valine; W, tryptophane; et Y, tyro-

sine. Les numéros se réfèrent à la position des acides aminés CS désigne le peptide signal). Le tiret en position

44 de la séquence de 163 acides aminés du LeIF A est intro-

duit pour aligner la séquence du LeIF A avec les séquences 33 à IS6 acides aminés des autres LeIF. Un détermine la

séquence du LeIF E en négligeant le nucléotide supplémentai-

re Cposition 187 de la figure 1) dans sa région d'encodage.

Les astérisques indiquent les codons de terminaison en phase.

Les acides aminés communs à tous les LeIF [non compris le pseudogène LeIF E) sont également montrés. Les résidus soulignés sont des acides aminés qui sont également présents

dans l'interféron de fibroblaste.,humain.

Si l'on se réfère à la figure 1, les nucléotides -+1 à 69 correspondent aux acides aminés SI à S23 de la Figure 3. Le codon TGT [nucléotides 70 à 72) de la figure 1

correspond à la cystéine [C, acide aminé 1] de la figure 3.

Dans la figure 3, le site de clivage de l'endonucléase de restriction Pvu II se situe entre les codons donnant les

acides aminés 92 et 93 dans LeIF A, B, De F et G, c'est-à-

dire les nucléotides 348 et 347 de la Figure 1.

La Figure 4 compare les séquences d'acides aminés des interférons de leucocytes mûrs A et 0, une délétion de

l'acide aminé 44 dans LeIF A étant indiquée par des tirets.

Seuls las acides aminés du LeIF D qui diffèrent des acides

aminés correspondants du LeIF A sont représentés: la séquen-

ce d'acides aminés du LeIF D est par ailleurs identique à celle du LeIF A. La figure 4 indique également la position relative sur le gène correspondant des sites de clivage des endonucléases de restriction 8gl II et Pvu II employés pour Former les gènes de èeucocytes hybrides préFérés de

l' invention.

Les Figures 5 et S illustrent les résultats d'une

m.esure comparative de l'activité d'un interféron de leuco-

cyte hybride préféré de l'invention ["LeIF-A/D") vis-à-vis du virus de l'encéphalomyocardite ["EMC"] et du virus de la stomatite vésiculaire ("VSV"), respectivement, dans des

cellules de souris.

Les Figures 7 et 8 décrivent les résultats d'ex-

périences comparatives mettent en jeu le LeIF-A/D et d'autres 3' interFérons contre des infections à virus -MC chez des souris et des hamsters, respectivement. Les données de

la figure 7 résultent de traitements i.p. 3 h avant l'infec-

tion. Les doses de LeIF-A/0 et de LeIF-A sont telles que

titrées sur cellules WISH.

La figure 9 fournit la séquence d'AON de cinq protéines de LeIF de linvention, y compris les types I et J. Microorganismes employés

Les travaux décrits font appel à deux microorga-

nismes: E. coli x1776, tel que décrit dans le brevet

américain n 4 190 495, et E. coli K-12 souche 294 [extré-

mité A, thi-, hsr-, hsm+], tel que décrit dans le brevet

anglais n 2 055 382 A. Tous deux ont été déposés à l'Ameri-

can Type Culture Collection, 'n ATCC 31527 et 31446, dépo-

sés le 3 juillet 1979 et le 28 octobre 1978, respectivement.

Tous les travaux sur l'ADN recombinant ont été effectués selon les directives applicables des instituts nationaux de

la Santé [National Institutes of Health).

L'invention, dans ses modes de réalisation les

plus appréciés, est décrite avec réFérence à E. coli, com-

prenant non seulement les souches E. coli x 1776 et E. coli K-12 souche 294, définies ci-dessus, mais aussi d'autres souches d'E. coli connues comme E. coli B, ou d'autres souches microbiennes dont beaucoup sont déposées auprès d'institutions reconnues de dépôts de microorganismes, comme

l'American Type Culture Collection, ATCC, et y sont [poten-

tiellement) disponibles. [Voir la liste du catalogue ATCC ainsi que la demande de brevet publiée en Allemagne sous le n 2 644 432). Ces autres microorganismes comprennent, par exemple, des bacilles comme Bacillus subtilis et d'autres entérobactériacées parmi lesquelles on peut mentionner comme exemples Salmonella typhimurium et Serratia marcescens, utilisant des plasmides qui peuvent répliquer et exprimer

les séquences de gènes hétérologues qui s'y trouvent.

Il peut être également intéressant d'employer-une levure, comme Saccharomyces cerevisiae, comme organisme-hâte dans la préparation des présentes protéines d'interférons par expression de gènes qui en donnent le code sous la commande

d'un promoteur de levure.

Selon l'invention, on prépare les hybrides de LeIF en tirant parti des sites de clivage d'endonucléases de restriction communément situés dans les gènes parentaux

individuels et de chacune de leurs extrémités en conjono-

tion avec les mêmes sites dans les plasmides d'expression supports [vecteurs). Ainsi, le grand (env. 3900 pb) Fragment d'un produit de digestion de Xba I à Pst I du plasmide

d'expression de pLeIF A trp 25 peut être lié avec les frag-

ments de digestion de Xba I à Pvu Il et de Pvu II à Pst I

des divers gènes parentaux de.-LeIF pour fournir des plasmi-

des d'expression que l'on peut Faire Fonctionner pour obte-

nir le LeIF hybride correspondant. -

Chaque plasmide d'expression de LeIF est construit indépendamment avec des Fragments de digestion isoleés dtaprès divers plasmides de LeIF, p. ex. pLeIF A trp;5, pLeIF B trp 7, pLeIF C trp 35, pLeIF D trp 11, pLeIF F

trp 1, pLeIF G, pLeIF Hs et pLeIF 1, etc, dont la construc-

tion est décrite dans Nature 287, 411 [1980) ou d'après pBR322, dont la construction est décrite dans Gene 2$ 95 (1977). Dans certains de ces plasmides, "trp"' désigne un système promoteur-opérateur tryptophane particulièrement apprécié pour l'expression bactérienne, comme il est dit dans le demande de brevet européen publiée sous le n

36776.

Expression directe d'un premier interféron de leucocyte mûr Le procédé suivi pour exprimer LeIF A directement

comme polypeptide d'interFéron mûr Fait intervenir la combi-

naison des ADN de synthèse (N-terminal).et complémentaire.

Un site d'endonucléase de restriction Sau 3a est communément situé entre les codons 1 et 2 de LeIF A. On a

congu deux désoxyoligonucléotides de synthèse qui incorpo-

rent un codon dtinitiation de traduction ATG, restaurent le codon de l'acide aminé 1 Ccystéine] et créent une extré-

mité agglutinante Eco RI. Ces oligomères sont liés à un Frag-

ment Sau 3a - Ava II à 34 pb de pL31. Le produit à 45 pb obtenu est lié à deux fragments d'ADN supplémentaires pour -construire un gène hybride synthétique-naturel à 865 paires de bases qui code pour LeIF A et qui est limité par les sites de restriction Eco RI et Pst I. Ce gène est inséré en pBR322 entre les sites Eco RI et Pst I pour donner le

plasmide pLeIF-A1.

Le plasmide pGM1 porte l'opéron tryptophane dtE.

s15 coli contenant la délétion 6LE1413 CG.F. Miozzari et coll., J. Bacteriology 133, 1457-1468 [1978)) et donc exprime une protéine de Fusion comprenant les six premiers acides aminés de la séquence directrice trp et environ Ne dernier

tiers du polypeptide trp E [appelé ci-dessous concurrem-

ment LE'), ainsi que le polypeptide trp O dans sa totalité,

le tout sous la commande du système promoteur-opérateur trp.

Le plasmide 20 eg$ est digéré avec l'enzyme de restriction Pvu II qui clive le plasmide en cinq sites. Les Fragments de gène sont alors combinés avec des protéines de liaison EcoRI [composées d'un oligo- nucléotide auto-complémentaire de séquence pCATGAATTCATG] Fournissant un site de clivage EcoRI pour un clonage ultérieur dans un plasmide contenant un site EcoRI. On traite les 20 Lg de Fragments d'ADN obtenus par pGM1 avec 10 unités dtADN ligase T4 en présence de 200 picomoles de l'oligonuoléotide de synthèse pCATGAATTCATG phosphorylé en 5' et dans 20 el de tampon d'ADN ligase T4 (20 mM de tris, pH 7,6, 0,5 mM d'.ATP,

mM de MgCl2s 5 mM de dithiothréitol) à 40C pendant la nuit.

On chauffe alors la solution pendant 10 minutes à 70C pour arrêter la ligation. On clive les protéines de liaison t493867 par digestion EcoRI et on sépare les fragments portant

maintenant des extrémités EcoRI en utilisant une électro-

phorèse sur gel de polyacrylamide à 5% (ci-dessous "PAGE"] et on isole les trois plus grands fragments du gel en colorant tout d'abord avec du bromure d'éthidium, en localisant les fragments à la lumière ultraviolette, et en découpant dans le gel les fractions intéressantes. Chacun des fragments de gels avec 300 microlitres O,1xTBE, est disposé dans un sac -de dialyse et soumis à une électrophorèse à 100 V pendant I h dans un tampon 0OIxTBE (le tampon TBEcontient: 10,8 g de tris base, 5,5 g d'acide borique, 0,09 g de Na2 EDTA dans 1 litre dtH20). On recueille la solution aqueuse à

partir du sac de dialyse, on l'extrait au phénol, on Vex-

trait au chloroforme et on la rend 0,2 M avec du chlorure

de sodium, et on recueille ltA-DN dans l'eau après precipi-

tation à l'éthanol. On identifie le gène contenant le promoteur-opérateur trp à extrémités agglutinantes EcoRI dans le procédé décrit ci-dessous, qui Fait intervenir l'insertion de fragments dans un plasmide sensible à la tétracycline qui, après insertion du promoteur-opérateur,

devient résistant à la tétracycline.

Le plasmide pBRHI [R.I..Rodriguez et coll., Nucleic Acids Research 6, 3267-3287 [t1979)) exprime la

résistance à l'ampicilline et contient le gène de la résis-

tance à la tétracycline mais, comme il n'y a pas de promo-

teur associé, n'exprime pas cette résistance. Le plasmide est donc sensible à la tétracycline. En introduisant un système promoteuropérateur dans le site EcoRI, on peut

rendre le plasmide résistant à la tétracycline.

On digère le pBRHI avec EcoRI et on retire l'enzy-

me par extraction au phénol suivie par extraction au chloro-

forme et on la recueille dans l'eau après précipitation à l'éthanol. Dans des mélanges réactionnels séparés, on combine la molécule d'ADN résultante avec chacun des trois fragments d'ADN obtenus ci-dessus et on la lie avec l'AON ligase 4 comme il est dit ci-dessus. On utilise l'ADN présent dans t49386? Il le mélange réactionnel pour transformer l'E. coli K-12 souche 294 compétente [K. Backman et coll., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73, 4174-4198 [1976)) par des techniques classiques [V. Hershfield et coll., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71, 3455-3459 [1974)) et on étend les bactéries sur des plaques LB contenant 20 Lg/ml d'ampicilline et 5 Lg/ml de tétracycline. On choisit plusieurs colonies résistant à la tétracycline, on isole l'AON du plasmide et on confirme la

présence du fragment désiré par analyse à l'enzyme de res-

triction. Le plasmide résultant est désigné par pBRHtrp.

On obtient un produit de digestion à EcoRI et

BamHI du génome viral de l'hépatite B par des moyens clas-

siques et on le clone dans les sites EcoRI et BamHI du plas-

mide pGH6 [D.V. Goeddel et coll., Nature 281, 544 (1979]) pour former le plasmide pHS32;- On clive le plasmide pHS32

avec XbaI, on l'extrait au phénol, on l'extrait au chlorofor-

me et on le précipite à l'éthanol. On le traite alors avec

I el d'E. coli polymérase I, fragment de Klenow (BBhringer-

Mannheim] dans 30 el de tampon de polymérase S50 mM de phosphate de potassium pHi 7,4, 7 mM de MgC12, ImM de C-mercaptoéthanol) contenant 0,1 mM de dTTP et 0X1 mM de dCTP pendant 30 minutes à 0 C puis pendant 2 h à 371C. Ce traitement provoque l'introduction de 2 des 4 nucléotides

complémentaires de l'extrémité saillante 5' du site de cliva-

ge XbaI:

' CTAGA- 5' CTAGA-

3' T- > 3' TCT-

On incorpore deux nucléotides, dC et dT, donnant une extrémité avec deux nucléotides saillants en 5'. On clive

avec EcoRI ce résidu linéaire de plasmide pHS32 (après extrac-

tion au phénol et au chloroForme et récupération dans l'eau après précipitation à l'éthanol). On sépare le grand fragment de plasmide du plus petit fragment EcoRI-XbaI par PAGE et on isole après électroélution. On lie ce fragment d'ADN provenant de pHS3E [0,2 ug]), dans des conditions analogues à celles qui sont décrites ci-dessus, au Fragment EcoRI-Taq I

de l'opéron tryptophane Cenv. 0,01 ug)s, provenant de pBRHtrp.

Dans le processus consistant à lier le fragment provenant de pHS32 au fragment EcoRI-Tmqs comme décrit ci-dessuss on lie l'extrémité saillante Taq I à l'extrémité

saillante restante Xba I bien qu'elle ne soit pas complète-

ment appariée par bases selon Watson-Crick:

-T CTAGA- -TCTAGA-

+.

-AGC TCT- -AGCTCT

On transforme une Fraction de ce mélange réaction-

nel de ligation dans des cellules dIE. coli 294, on la

traite à la chaleur et on l'étend sur des plaques LB conte-

nant de l'amplcilline. On choisit vingt-quatre colonies, on

les cultive dans 3 ml de milieu LBs et on isole le plasmide.

On trouve que six d'entre eux ont le site XbaI régénéré par réparation et réplication de l'AON catalysée par E. coli:

-TCTAGA- -TCTAGA-

AGCTCT- -AGATCT-

On trouve également que ces plasmides se clivent tant avec EcoRI qu'avec HpaI et qu'ils donnent les Fragments de restriction escomptés. Un plasmide, appelé pTrp 14, est utilisé pour l'expression de polypeptides hétérologues, comme

il est dit ci-dessous.

- Le plasmide pHGH 107 [O.V. Goeddel et coll., Nature, 281, 544, [19793) contient un gène pour l'hormone de croissance humaine constitué de 23 codons d'acides aminés produits à partir de fragments d'AON de synthèse et de 163 codons d'acides aminés obtenus à partir dtAON complémentaire produit par transcription inverse d'ARiN messager d'hormone de croissance humaine. Ce gène, bien qu'il lui manque les codons de la "prét séquence de l'hormone de croissance humaine, contient bien un codon d'initiation de traduction ATG. On isole le gène à partir de 10 ug de pHGH 107 après traitement avec EcoRI suivi par le fragment de Klenow de polymérase I d'E. coli et dTTP et dATP comme il est dit S ci-dessus. Après extraction au phénol et au chloroforme et précipitation à l'éthanol, on traite le plasmide avec BamHI.

On isole le fragment contenant le gène de lthor-

mone de croissance humaine CY"HOH") par PAGE suivie par

électroélution. Le fragment d'AON résultant contient éga-

lement les 350 premiers nucléotides du gène de structure de résistance à la tétracycline, mais ne possède pas le système promoteur-opérateur tétracycline, si bien que,

lorsqu'on le clone ultérieurement dans un plasmide d'expres-

sion, les plasmides contenant l'insertion peuvent être

situés par la restauration de la résistance à la tétracy-

cline. Etant donné que l'extrémité EcolI du Fragment a été introduite par le procédé de la polymérase I de Klenow, le Fragment possède une extrémité non agglutinante et une extrémité agglutinante, ce qui assure une orientation correcte lorsqu'on l'insère ensuite dans un plasmide d'expression. On prépare ensuite le plasmide d'expression pTrp14 à recevoir le Fragment contenant le gène HGH préparé ci-dessus. Ainsi, on digère pTrp14 avec XbaI et on introduit les extrémités agglutinantes obtenues par le procédé de la polymérase I de Klenow en employant dATP, dTTP, dGTP et dCTP. Après extraction au phénol et au chloroforme et précipitation à l'éthanol, on traite l'AON obtenu avec BamHI et on isole le grand Fragment de plasmide résultant par PAGE et électroélution. Le Fragment dérivé de pTrp14 a une extrémité non agglutinante et une extrémité agglutinante, ce qui permet une recombinaison dans une orientation appropriée

avec le fragment contenant le gène HGH décrit ci-dessus.

On combine et on relie l'un à l'autre le fragment de gène HGH et le Fragment pTrp14 &Xba-BamHI dans des conditions semblables à celles qui sont décrites ci-dessus. On relie l'une à l'autre les extrémités XbaI et EcoRI introduites par ligation de l'extrémité.non agglutinan- te pour recréer les sites XbaI et EcoRI: XbaI introduit EcoRI introduit Oébut du gène HGH

-TCTAG AATTCTATG- -TCTAGAATTCTATG-

+.* , -

-AGATC TTAAGATAC- - AGATCTTAAGATAC--

XbaI EcoRI Cette construction recrée également le gène de résistance à la tétracycline. Comme le plasmide pHGH 107 exprime la résistance-à la tétracycline à partir d'un-promoteur se situant en amont à partir du gène HGH [Cl promoteur--lac], cette construction, appelée pHGH 207, permet l'expression du gène de la résistance à la tétracycline sous la commande du promoteur-opérateur tryptophane. Ainsi le mélange de ligation est transformé dans E. coli ZS4 et des colonies

choisies sur plaques LB contenant 5 eg/ml dé tétracycline.

On digère le plasmide pHGH207 avec Eco AI et on recueille le promoteur trp contenant un fragment Eco RI à 300 pb par PAGE suivie par électroélution. Le fragment Eco RI à 300 pb contient le promoteur- opérateur trp d' E. coli et le site de liaison ribosomique à directeur trp mais ne

contient pas de séquence ATG pour l'initiation de la traduc-

tion. On clone ce fragment d'ADN dans le site Eco RI de pLeIF A. Le Fragment trp qui vient d'être mentionné est un analogue de l'opérontryptophane d'E. coli dont on a retiré ce qu'on appelle l'atténuateur trp, - afin d'accroître de fagon contrôlable les niveaux d'expression. Les plasmides d'expression contenant le régulon trp modifié peuvent être cultivés à des niveaux prédéterminés dans des milieux

nutritifs contenant du tryptophane supplémentaire en quanti-

tés suffisantes pour réprimer le système promoteur-opérateur, puis être privés de tryptophane de manière à déréprimer le

système et à occasionner l'expression du produit visé.

Plus particulièrement, on digère 250 iug de plas-

mide pL31 avec Pst I et on isole l'insertion à 1000 pb par

électrophorèse sur gel sur un gel de polyacrylamide 6.

On électroélue environ 40 eg d'insertion à partir du gel et on divise en 3 fractions aux fins de digestion ultérieure: a) on digère partiellement un échantillon de 16 pg de ce fragment avec 40 unités de Bgl II pendant 45 minutes à 370C et on purifie le mélange réactionnel sur un gel de polyacrylamide 6. On recueille environ a pg du Fragment à 670 pb désiré. b) on restreint un autre échantillon

ES ug) de l'insertion Pst I à 1000 pb avec Ava II et 8gl II.

On recueille 1 Lg du fragment à 150 pb indiqué après élec-

trophorèse sur gel. c) on traite 16 eg du fragment à 1000 pb avec Sau 3a et Ava II. Après électrophorèse sur un gel de polyacrylamide 10, on recueille environ 0,a5}g (env. 10

pmoles] du fragment à 34 pb. Les deux désoxyoligonucl6oti-

des indiqués, 5'-dAATTCATGTGT [fragment 1) et 5'-dGATAACAOATG

[fragment 2) sont synthétisés par le procédé du phospho-

triester [Maxam et Gilbert, Methods Enzymol. 65, 499-560 (1980)). On phosphoryle le fragment 2 comme suit. On assèche 200 el Cenv. 40 pmoles) de C[ 32P] ATP (Amersham, 5000 Ci/ mmole) et on remet en suspension dans 30 el de Tris-HCl mM [pH 8), 10 mM de MgCi2, 15 mM de (-mercaptoéthanol,

contenant 100 pmoles de fragment d'ADN et a unités de poly-

nucléotide kinase T4. Au bout de 15 minutes à 370C, on ajoute 1 el dtATP 10 mM et on laisse la réaction continuer pendant encore 15 minutes. On chauffe alors le mélange à 70 0C pendant minutes, on le combine avec 100 pmoles de fragment 1

St-OH et 10 pmoles du fragment Sau 3a - Ava II à 34 pb.

* La ligation steffectue pendant 5 h à 4 C dans 50 il de Tris-HOCl 20 mM [pH 7,5S) MgCl2 10 mM, dithiothréitol 10 mM, ATP 0,5 mM et 10 unités d'ADN ligase T4. On élecotrophorèse le mélange sur un gel de polyacrylamide 6 et on recueille le produit à 45 pb par électroélution. On recueille 860 000 Cerenkov cpm [env. 30 ng, I pmole], on combine avec 0,5 eg (5 pmoles] du Fragment Ava II - Bgl II à 150 pb et 1 ug [2 pmoles] du fragment Bgl II Pst I à 670 pb. La

ligation s'efFectue à 20'C pendant 16 h en utilisant 20 uni-

tés d'ADN ligase T4. On inactive la iigase en chauffant à C pendant 10 minutes. On digère alors le mélange avec Eco RI et Pst I pour éliminer les polymères du gène. On

purifie le mélange par électrophorèse sur gel de poly-

acrylamide à 6%. On isole 36 000 opm Cenv. 0,04 pmole, 20 ng) de produit à 865 pb. On lie la moitié [10 ng] de ce produit dans pBR322 [0,3 eg) entre les sites Eco RI et Pst I. La

transformation dtE. coli 294 donne 70 transformants résis-

tant à la tétracyoline, sensibles à l'ampicilline. fin

digère l'ADN de plasmide isolé à partir de 18 de ces trans-

Formants avec Eco RI et Pst I. 10 des 18 plasmides ont un fragment Eco MI - Pst I de 865 pb de longueur. On digère O 1 i g de l'un d'entre eux, pLeIF AI, avec Eco RI et on le lie

à un fragment Eco RI à 300 pb [(q,I g) contenant le promo-

teur trp d'E. coli et le site de liaison ribosomique du

directeur trp, préparé comme il est dit ci-dessus. On iden-

tiFie les transformants contenant le promoteur trp en utilisant un échantillon 3P-trp en conjonction avec le procédé de tri des colonies de Grunstein-Hogness --Grunstein et colil. (Proc. Natl. Acad. Soi. [USA) 7E, 3961 [(1975]. Un site Xba I situé de Fagon asymétrique dans le fragment trp permet la détermination de recombinants o le promoteur trp est orienté dans la direction du gène de LeIF A. On prépare les extraits pour le dosage IF comme suit. On cultive des cultures d'1 ml dans un bouillon L contenant 5 Lg/ml de tétracycline jusqu'à un As5u d'environ 1,0, puis on dilue dans _5 ml le milieu M9 contenant 5 eg/ml de tétracycline. On recueille des échantillons

249386?

de 10 ml par centrifugation lorsque A550 atteint 1,0 et on met en suspension les pastilles cellulaires dans I ml de saccharose à 15%, TrisHCl 50 mM [pH 8,0]), EDTA 50 mM. On ajoute I mg de lysozyme et, au bout de 5 minutes à 0 C, on disloque les cellules par traitement aux ultra- sons. On centrifuge les échantillons pendant 10 minutes à 15 000 tpm

dans un rotor Sorvall SM-24. On détermine l'activité d'in-

terféron dans les surnageants par comparaison avec les standards de LeIF par dosage de l'inhibition de l'effet cytopathique CCPE). Pour déterminer le nombre de molécules d'IF par cellule, on utilise une activité spéciFique de LeIF de 4 x 108 unités/mg (Rubinstein et coll., Proc.

Natl. Acad. Sci. (USA) 76, 640 [1979)).

Le clone pLeIF A trp 25, dans lequel on a inséré le promoteur trp dans l'orientation désirée, donne de hauts

niveaux d'activité Callantjusqu'à 2,5 x 10a unités par litre).

L'IF produit par E. coli K-12 souche a94/pLeIF A trp Z5 se comporte comme un LeIF humain authentique; il est stable vis-à-vis du traitement à pH 2 et est neutralisée par les anticorps de leucocytes anti-humains de lapin. L'interféron

a un poids moléculaire apparent d'environ û0 0O0.

Isolement d'ACNc pour des interférons de leucocytes addition-

nels On excise l'ADN provenant du plasmide contenant l'AONc de LeIF A pleinement caractérisé avec Pst I, on isole par électrophorèse, et on marque avec 3P selon un

procédé publié (Taylor et coll., Biochem. Biophys. Acta.

442, 324 (1976)). On utilise l'ADN à marquage radioactif

obtenu comme échantillon pour trier des transformants supplé-

mentaires d'E. coli 294 par un procédé de tri des colonies in situ, Grunstein et coll., supra. On isole des colonies

qui s'hybrident en quantités variables à l'échantillon.

On isole l'ADN de plasmidcb provenant de ces colonies et les dix colonies hybridantes mentionnées ci-dessus par t495867 clivage à Pst et on caractérise selon trois procédés différents. On caractérise tout d'abord ces fragments Pst

par leurs schémas de digestion à l'endonucléase de restric-

tion avec les enzymes Bgl Il, Pvu Ils et Eco RI. Cette analyse permet la classification d'au moins huit types différents [LeIF A, LeIF 8, LeIF C, LeIF D, LeIF E, LeIF F, LeIF G et LeIF H), ce qui donne une approximation de la localisation de divers clivages de restriction par rapport -à la pré-séquence et à la séquence de codage du LeIF A, maintenant connues. On pense que l'un d'entre eux, LeIF O0 est identique à celui mentionné par Nagata et coll., Nature

264, 316 ú1980)].

En second lieu, on teste certains des ADN par un dosage de sélection d'hybridation publié, cF Cleveland et coll., Cell 20, 95 (1980), pour déterminer leur aptitude

à retirer sélectiverment l'ARNm de LeIF à partir dtAFN cel-

lulaire KG-1 contenant du poly-A. Les LeIF A, B, C et F sont positifs selon ce dosage. En troisième lieu, on insère ces derniers Fragments Pst dans un plasmide d'expression, E. coli

294 transformé avec le plasmide, et on exprime les fragments.

Les produits d'expression, dont on pense qu'ils ont été des préinterférons, sont tous positifs dans le dosage CPE de l'activité d'interféron, bien que marginalement actifs dans le cas du fragment LeIF F. Outre ce qui précède, tous

les types de LeIF décrits ont été séquencés.

Second interféron de leucocyte mûr La séquence du Fragment isolé comprenant le gène du LeIF B mur présente les quatorze premiers nucléotides des types A et 8 à être identiques. On a donc proposé d'isoler

un fragment-à partir de pLeIF A25 pontant le promoteur-

operateur trp, le site de liaison ribosomique et le début du gène de LeIF [A=B3, et de combiner ceci avec la partie

restante de la séquence B dans un plasmide d'expression.

Pour obtenir le fragment Sau 3a à Pst I à environ t49586? 950 pb à partir de la séquence montrée dans la figure 7a, plusieurs étapes sont nécessaires étant donné la présence

d'un ou plusieurs sites de restriction Sau 3a qui intervien-

nent, autrement dit: 1. On isole les Fragments suivants: a) 110 pb de Sau 3a à Eco RI; b) 132 pb dtEco RI à Xba;

c] plus de 700 pb dtXba à Pst.

2. On lie les fragments (ta] et [lb] et on les clive avec Xba et Bgl II pour exclure une auto-polymérisation à travers les extrémités terminales Sau 3a et Xba [le site Sau 3a intéressé est compris dans un site Bgl II; Bgl II clive pour laisser une extrémité agglutinante Sau 3a). On isole un

Fragment à 242 pb.

3. On lie le produit dm '2) et [1c) et on clive avec Pst I

et Ogl II, là encore pour empêcher une auto-polymérisation.

On isole un Fragment à environ 950 pb, Sau 3a à Pst I de la Figure 7a. Ce Fragment comprend la Fraction du gène de LeIF B qui n'est pas commune avec LeIF A. 4. On isole à partir de pLeIF A25 un Fragment à environ

300 pb [Hind III à Sau 3a) comprenant le promoteur-opéra-

teur trp, le site de liaison ribosomique, le signal de départ ATG et le codon cystéine du LeIF A. 5. On isole à partir de pBr 3aZ un Fragment Pst I à Hind III à environ 3600 pb. Ceci comprend le réplicon et encode la

résistance à la tétracycline mais non à l'ampicilline.

6. On lie triplement les fragments obtenus dans les étapes 3,4 et 5 et on transForme le plasmide obtenu dans E. coli

K-12 souche 294.

On soumet les transFormants à un mini-tri,cf Sirnboim et coll., Nucleic Acide Hesearch, 7, 1513 [1979], et on digère les échantillons de plasmide avec Eco RI. Les

produits de digestion donnent trois Fragments caractéristi-

249386?

ques du:

1) Fragment promoteur trp Eco FI - Eco RI; a] fragment inter-

ne Eco RI à Eco RI de pL4; et 3) signal de départ de traduc-

tion protéique au fragment Eco RI de pL4.

Dans le dosage GPE, les extraits bactériens prove-

nant de clones réalisés de la manière précédente sont typi-

quement dosés à environ 10 x 10 unités d'activité d'inter-

Féron par litre à A550 = 1. Un clone representatif préparé

de cette manière est 294/pLeIF B trp 7.

Autres interférons de leucocytes mûrs On peut découper d'autres Fragments de gènes de longueur complète comprenant d'autres sites de LeIF et les placer dans des véhicules d'expression aux Fins d'expression comme dans le cas de LeIF A. La détermination compleète de la

1 séquence par des moyens classiques révèle si un site de res-

triction se situe suffisamment près du premier codon d'acide aminl du type d'interféron mur de manière qu'on puisse avoir commodément recours au procédé employant l'élimination de la préséquence par clivage de restriction et remplacement de

codons pour les acides aminés N-terminaux perdus dans l'éli-

mination de la préséquence par ligation d'un fragment d'AON de synthèse, comme il est dit ci-dessus. Si l'on n'y parvient pas, on peut employer le procédé décrit dans Kleid et coll.$

supra. En bref, ceci implique de cliver le Fragment conte-

nant la préséquence précisément avant le point auquel commen-

ce le codon du premier acide aminé du polypeptide mûr, en: 1. transformant l'ADN à deux brins en un ADN à un seul brin dans une région entourant ce point; 2. hybridant à la région à un seul brin Formée dans l'étape Ca] une longueur d'amorce complémentaire d'ADt à un seul brin, l'extrémité 5' de l'amorce se situant à l'opposé du nucléotide adjacent au site de clivage recherché; 3. rétablissant la fraction du second brin éliminée dans

249386E

l'étape 1 qui se situe en direction 3' à partir de l'amorce

par réaction avec une AON polymérase en présence de désoxy-

nucléotide-triphosphates contenant de l'adénine, de la thymine, de la guanine et de la cytosine; et 4. digési&nt lalongueur d'ADN à un seul brin qui fait sail-

lie au-delà du point de clivage visé.

On peut alors lier une courte longueur d'AON de synthèse se terminant, à l'extrémité 3' du brin de codages par le signal de départ de traduction ATG, p. ex. par une ligation à son extrémité non agglutinant'e au gène découpé obtenu pour les interfér ons mûrs et on peut insérer le gène dans un plasmide d'expression et l'amener sous le contrôle d'un promoteur et de son site de liaison ribosomiqpe associé. De manière semblable à celle employée ci-dessus, on donne à des Fragments de gène encodarrt LeIF C et LeIF L la configuration appropriée pour une expression bactérienne directe. La stratégie d'expression pour ces interférons de leucocytes supplémentaires impliques dans chaque cas, d'avoir recours au Fragment à environ 300 pb [Hind III à Sau 3a) comprenant le promoteur-opérateur trp, le site de liaison ribosomique, le signal de départ ATG et le codon cystéine de LeIF A provenant de pLeIF AZ5. A ceci on combine des

fragments de gène provenant des gènes d'interféron supplé-

mentaires qui encodent leurs séquences d'acides aminés res-

pectives au-delà de la cystéine initiale commune à tous.

Chacun des plasmides obtenus est utilisé pour transformer E. coli K-12 souche 294. Les ligations pour Former les gènes respectifs s'efFectuent comme suit: LeIF C Isoler les Fragments suivants de pLeIF C: Ca) 35 pb de Sau 3a à Sau 96 [b] plus de 900 pb de Sau 96 à Pst I

Cc) isoler un Fragment à environ 300 pb CHind III-

- Sau 3a] à partir de pLeIF A$5 comme dans la

249386?

partie N C4) ci-dessus.

Cd] isoler le fragment à environ 3600 pb de la

partie N[S) ci-dessus.

Construction: [1) Lier Ca) et Cc). Cliver avec 5gl II, Hindci III et isoler

le produit à environ 335 pb.

[2] Lier triplement [1) + Cb) + Cd) et transFormer E. coli

avec le plasmide obtenu.

E. ooli K-12 souche 294/pLeIF C trp 35 est un

clone représentatiF constitué de cette manière.

LeIF D Isoler à partir de pLeIF 0: a) 35 pb de Sau 3a à Ava II b) 150 pb de Ava II à Bgl Il ac] environ 700 pb de Bgl II à Pst I Isoler à partir de pLeIF A25: d] 300 pb de Hind III à Sau 3a Isoler à partir de PSr 322: e) environ 3600 pb de Hind III à Pst I. Construction: [4) Lier [a] + Cb), cliver avec Bgl II et purifier un produit

à 185 pb [1).

[2) Lier C1) + Cd), cliver avec Hind III, gl 11, et puri-

Fier le produit à environ 500 pb (2).

[3) Lier [2) + Cc) + Ce] et transFormer E. coli avec le

plasmide obtenu.

E. coli K-12 souche 294/pLeIF O trp 11 est un

clone représentatiF constitué de cette manière.

t49386? LeIF F On peut ajuster le Fragment contenant LeIF F pour l'expression directe par un réassemblage rendu commode par l'homologie complète des acides aminés 1-13 de LeIF B et LeIF F. On obtient un fragment contenant le promoteur trp Ca) ayant des extrémités de configuration appropriée à partir de pHGH 207, décrit ci-dessus, en passant par une

digestion à Pst I et Xba I suivie par un isolement du Frag-

ment à environ 1050 pb. On obtient un second Fragment Cb) sous la Forme du plus grand des Fragments résultant de la digestion par Pst I et Bgl II du plasmide pHKY 10, dérivé de pBR322 qui contient un site Bgl II entre le promoteur de résistance à la tétracycline et le gène de structure. Le Fragment [a) contient environ la moitié du gène qui encode la résistance à l'ampicilline; le Fragment (b) contient le reste de ce gène et le gène entier de la résistance-à la tétracycline sauf le promoteur associé. On combine les Fragments Ca) et (b) via la T4 ligase et on traite le produit avec Xba I et Bgl II pour éliminer la dimérisation, formant un Fragment Cc) comprenant le promoteur-opérateur trp et les

gènes de la résistance à la tétracycline et à ltampicilline.

Dn obtient un Fragment Cd] d'environ 580 pb par digestion avec Ava II et Bgl II de pLeIF F. Ceci comprend les codons pour les acides aminés 14-166 de LeIF F. On obtient un fragment Ce] [49 pb) par digestion avec Xba I et Ava II de pLeIF F. Le Fragment [e) encode les acides aminés 1-13 de LeIF F. Les fragments Cc], [d) et Ce) sont triplement liés

en présence de T4 ligase. Les extrémités cohésives des Frag-

ments respectifs sont telles que le plasmide composite se circularise correctement, amenant le gène de résistance à la tétracycline sous la commande du promoteur-opérateur trp avec le gène du LeIF F mûr, de manière que des bactéries transFormées avec le plasmide désiré puissent être choisies

sur des plaques contenant de la tétracycline.

249386?

E. coli K-12 souche 194/pLeIF F trp 1 est un clone représen-

tatif préparé de cette manière.

LeIF H

On peut donner au gène LeIF H complet la conFigu-

ration permettant son expression sous Forme d'interféron de leucocyte mûr comme suit: 1. On soumet le plasmide pLeIF H à une digestion avec Hae II

et Rsa I en isolant le fragment à 816 paires de base stéten-

dant de l'acide aminé 10 du peptide signal à la région de

non codage 3t.

2. On dénature le Fragment et on le soumet à une synthèse de réparation avec le fragment de Klenow, of Klenow et coll., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 65, Io8 (1970] en employant l'amorce désoxyribooligonucléotlde de synthèse 5'-dATG TOT AAT CTS TOT. Ce procédé général est décrit également par Goeddel et coll., U.S. Serial na 190799, du e5saptembre 1980. 3. On clive le produit obtenu avec Sau 3a et on isole un fragment à 452 paires de base C"pb") représentant les acides

aminés 1 à 150.

4. La digestion par Sau 3a et Pst I de pLeIF H et l'isole-

ment du fragment à 500 pb obtenu donnent un gène encodant les acides aminés 150 jusqu'à la fin de la séquence de codage. 5. On lie les Fragments isolés dans les étapes C3] et [4) pour former un Fragment:

1 166

met cys asp arrêt ATG TGT....- SAT TGA.... Pst I - Sau 3a encodant les 166 acides aminés de LeIf H. 6. On digère pLeIF A trp E5 avec Xba 1, on:ui donne une extrémité non agglutinante avec l'ADN polymérase I

249S86?

as et on digère le produit aveo Pst 1. On peut isoler le grand Fragment obtenu et le lier avec le produit de l1'étape (5) pour former un plasmide d'expression capable, après

transformation d'e. coli K-12 souche 294 ou d'autres bac-

téries-hotes, d'exprimer le'LeIF H mûr.

LeIF I On trie la bibliothèque de recombinants de phage Charon 4A de génome humain construite par Lawn et coll., Cell 15, 1157 [1978], pour y détecter des gènes d'interférons de leucocytes par des procédés décrits par Lawn et coll., supra, et Maniatis et coll., Cell 15, ES7 C1978]. On utilise un échantillon de LeIF radioactif dérivé du LeIF A du clone d'AONc [Goeddel et coll., Nature 287, 411 CIS9B0) pour trier environ 500 000 plaques. On obtient six clones de génome

de leIF dans ce tri. Après un nouveau triage et une puriFi-

cation de plaque, on choisit un de ces clones, A HLeIFa,

aux Fins d'analyse ultérieure.

Cn utilisant le procédé décrit ci-dessus, on peut utiliser d'autres échantillons de manière intéressante pour

isoler des clones de LeIF supplémentaires à partir du géno-

me humain. Ceux-ci, à leur tours peuvent être employés pour

produire des protéines d'interférons de leucocytes supplé-

mentaires selon l'invention.

1. On subclone le fragment Eco RI à 2000 paires de base du clone génomiqpe ( HLeIF 2) dans pBR325 au site Eco RI. On clive le LeIF I de plasmide obtenu avec Eco RI et on isole

le fragment à 2000 paires de base. On lie le désoxycligo-

nucléotide dAATTCTGCAG [un convertisseur Eco RI > Pst 1) au fragment Eco RI à 2000 paires de base et on clive le produit obtenu avec Pst I pour donner un fragment à 2-U00D paires de base contenant des extrémités Pst I. On clive ceci avec Sau 96 et on isole un fragment à 1100 paires de

249386?

base qui possède une extrémité Pst I et une extrémité

Sau 96.

2. On digère le plasmide pLeIF C trp 35 avec Pst I et Xba I.

On isole le grand fragment.

3. On digère le petit fragment Xba I - Pst I provenant de pLeIF C trp 35 avec Xba I et Sau 96. On isole un Fragment

Xba I - Sau 96 à 40 paires de base.

4. On lie les fragments isolés dans les étapes 1), 2) et 33

pour former le plasmide d'expression pLeIF I trp 1.

LeIF J 1. Le plasmide pLeIF J contient un fragment Hind III à 3,8 kilobase d'AON génomique -humain qui comprend la séquence

de gène ide-LeIF J. On isole à partir de ce plasmide un frag-

ment Dde I -Rsa I à 760 paires de base.

2. On clive le plasmide pLeIF B trp 7 avec Hind III et Dde I

et on isole un Fragment Hind III - Ode I à 340 pb.

3. On clive le plasmide pBR32Z avec Pst 1, on lui donne une extrémité non agglutinante par incubation avec de l'ADN

Pol I (Fragment de Klenow), puis on digère avec Hind III.

On isole le grand Fragment [env. 3600 pb).

4. On lie les fragments isolés dans les étapes 1), 2) et 3)

pour former le plasmide d'expression pLeIF J trp 1.

Les-.procédés et matériaux employés dans les cons-

tructions suivantes sont tels que dans la description qui

précède. Le Tableau I ci-dessous Fournit les détails de constructions particulières des présents plasmides de LeIF hybrides: TABL

Hybride -

de TotH Plasmide Partie avant LeIF acides d'expression aminés [vecteur] Fragment Ac amin'E AD 165 a Xba I-Pvu II 1-91 de pLeIF A trp 25 (285pb) DA 166 a Xba I-Pvu Il 1-92 de pLeIF D trp Il (288Pb) AD 165 - gl Il-PstI grand 1-62 tragllent de pLeIF A

trp 25.

DA 166 - Bl Il-Pst I grand 1-63 fragment pLeIF D trp il AB 165 a Xba IPvu 1I deLelE.A 1-91 trp 25 (285 Pq AF 165 a Xba l-Pvu II deLeIF A 1-91 trp 25 (285,Pb AG 165 a Xba I-Pvu lde LelF A 1-91 tp 25 (285 pL AI 1l5 a Xba Z-lgll Ipart3el 1-15( de pLetP A trp 25 (- 455pb) GA 166 b 'Hind IIIPvu lIde pLeIF 1-92 B trp 7 (- 630 pli LD 166 b iind II-Pvu Ilde pLelF 192 B trp 7 (C 630 pb' EAU 1 Partie arrière Fragment Acaminés cfvu Il-Pst I 93-166 a pLelF 0 trp Il (550Pb) Pvu Il-Pst I 92-165 de pLelF A trp 25 (550pb) Bgl 11-Pst I 64-166 de pLoIF D trp '11

(000P)...

Bgl II.partbl- 63-165 Pst Ide pLotF A trp 25 (,700 pb) P.vu 'I partielPstl 93-166 de pLeI B trp 7

(-150V)

Pvu Il Pst l 93-166 de pLeIF F trp 1 (-700 pb) Pvu l-Pst I 93-166 de pLV G

(750 '),.

0 Bql II-Pt I 151-165 de LeIF I trp 1

(650 P4

Pvu Il-Pst de 92-165 pLelF A trp 25 (550 pH I'vu 1I-'.t I de pLeIF D trp Il

(-.550 P

93-166

Plasmide dtexpression résultant pLeIF AD trp ( Pvu Il1) pLelF DA trp (Pvu II) pLelF AD trp (Ogl II) pLelF DA trp (Bgl II) pLelF AB trp (Pvu Il) pLelF AF trp (Pvu I) pLelF AG trp (Pvu lf) pLeIF AI tep (Bgl Il) pLoIF IA trp (Pvu Il) pLelF BDU trp I'vu 11) W,. co ú0 -4 Hybride de Total Plasmide Partie avant P leIF acides d' expression amin6s [vecteur) Fragmient Ac.amines Fr OF 166 b Ilind 1II-Pvu I depLelF 1-92 Pl B trp 7 (- 630pb) Pl DIG 166 b Hind III-Pvu II ge pLeIF 1-92 P B trp 7 (- 630P) DB IG6 a Xba I-Pvu II de pLeIF 1-92 Pl D trp 11 (288 Pt ti DF 166 a Xba I- Pvu II de pLeIF 1-92 Pl

D trp 11 (2VI8 P 4-

)G ILt a Xba l-Pvu I depLeIF 1-92 p D trp 1] (288 p (P FA 16b a Xba I-Pvu II de 1-92 Pl pLeIF F trp 1 ( (2388 pb FB 166 a Xba I-Pvu Il de 1-92 Pl pLeIF F trp 1 ti (288 pi FD 166 a XLa l-Pvu II de 1-92 Pl

pleIFfj trp 1 (-

(288 F"T

FG 166 a Xba I-Pvu Il de 1-92 P pLeIF F trp 1 (288 p4 IA 166 a Xba I-Bql Il de 1-151 Bl pLeIF J trp 1 ti (- 458 pb) *non compris la méthionine Nterminale

a oran 3900 pU fra9glent deXba I à Pst I digé parpLeIF A trp 25.

bgran"(. 3600 P fragmeit dellind IlIl à Pst I dig9reparpBR322.

artie arrière fraqen t Ac lvu Il-Pst I de LeIF F trp 1

-700 P=4

vu 1 I-Pst I depLeIF G

-750 P4

eu II part;el -Pst Ide pLeIF B rp 7 (-/5o0Pb vu II-Pst I depLelF F trp 1

-700 P4

vu II-Pst I depie'IF G -75o0 P i vu 11-Pst I depLeIF A trp 25 -550 pb) !, vu II partiel-Pst I de pLeIF B rp 7 (<,750 P>1 vu Il-Pst I de pLeIF 0 trp 11

-550 P4

vu II0pt I de pLeIF G

-150 P

) lI-Pst I dspLeIF A ?-p 25 (- 430P) aminés

93-166

93-166

93-166

À 93-166

9J3-16f

92-165

93-166

93-166

93-166

152-166

Plasmide d'expression résul tant pLeIF UF trp (Pvu II) pLeIF BG pLelF DB pLelF DF pLeIF DG pLelF FA tp' (Pvu 1 1) trp (Pvu 11) trp (Pvu 11) trp (l'vu 11) trp (Pvu I1) pLeIF F8 trp (Pvu II) pLeIF F1 trp (Pvu 11) pLelF FG trp (Pvu 11) pLeIF IA trp (Bgl 11) ru CD w.9 Co 0.

249386'

Si l'on se réfère encore au Tableau 1, les quatre premiers LeIF hybrides décrits ont été produits à partir de deux plasmides d'expression de LeIF. Un site Bgl II commun aux AONc de LeIF A et O a été utilisé pour construire un plasmide d'expression pLeIF trp AD [Bgl II) qui code pour les 63 acides aminés amino-terminaux de

LeIF A et les 102 acides aminés carboxy-terminaux de LeIF 0.

On utilise le même site dans la construction d'un plasmide d'expression pLeIF trp DA CBgl II) qui code pour 64 acides aminés amino-terminaux de LeIF D et 102 acides aminés carboxy-terminaux de LeIF A. Le site Pvu II est utilisé dans la construction de deux autres plasmides d'expression d'interférons hybrides: 91 acides aminés amino-terminaux de A avec 74 acides aminés carboxy-terminaux de O (pLeIF trp AD [Pvu II]] et 92 Ecides aminés amino-terminaux de LeIF D avec 74 acides aminés carboxy-terminaux de LelF A _[pLeIF trp DA CPvu II]). En résumée pour

pLeiF AD trp [Pvu II3: On lie le grand [env. 3900 pb] Frag-

ment dtun produit de digestion par Xba I et Pst I de pLeIF A trp 25 avec un fragment Xba I-Pvu II à 285 pb de pLeIF A trp 25 et un fragment Pvu IIPst I à environ 550 pb de pLeIF O trp 11;

pLeIF DA trp [Pvu II): On lie le grand Cenv. 3900 pb) frag-

ment d'un produit de digestion par Xba I et Pst I de pLeIF A trp 25 avec un Fragment Xba I-Pvu II à 288 pb de pLeIF D trp 11 et un Fragment Pvu IIPst I à environ 550 pb de pLeIF A trp 25;

pLeIF AD trp [Bgl II): On lie le grand fragment d'un pro-

duit de digestion par Bgl II - Pst I de pLeIF A trp Z5 avec un fragment à environ 600 pb Bgl II-Pst I de pLeIF [ trp 11; et pLeIF DA trp CBgl II]: On lie le grand Fragment d'un produit de digestion par Bgl II et Pst I de pLeIF D trp 11 à un fragment d'environ 700 pb obtenu par clivage à Pst I de t49586E

pLeIF A trp 25 suivi par une digestion partielle Bgl II.

Dans le cinquième hybride décrit: pLeIF AB trp CPvu II]: On lie le grand (env. 3900O pb] Fragment d'un produit de digestion par Xba I et Pst I de pLeIF A trp 25 avec un Fragment Xba I-Pvu II à Z85 pb de pLeIF A trp 25 et un Fragment Pvu II Cpartiel)-Pst I à

environ 750 pb de pLeIF B trp 7.

De manière analogue, on définit ainsi les autres constructions décrites au Tableau 1. Comme autre exemple, dans la construction d'une portion de LeIF C et/ou de LeIF H contenant un hybride, on peut tirer parti des sites Bbv I communs qui se trouvent aux environs du nucleéotide

294 Cctest-à-dire GCTGC) des..àéquences de gènes.

De manière analogue, on peut former des plasmides appropriés à l'expression microbienne d'autres nouveaux interFérons de leucocyteshybrides en manipulant de Façon appropriée l'AON à deux brins encodant la totalité ou des Fractions des séquences d-'acides aminés d'interférons de leucocytes se trouvant dans la nature. Ainsi, on choisit un premier Fragment d'ADN à deux brins qui encode la séquence amino-terminale d'acides aminés d'un premier interféron de leucocyte se trouvant dans la nature et, en procédant à

partir de là dans la direction 3', une Fraction substantiel-

le de sa séquence d'acides aminés. Le Fragment comprend un site de clivage d'endonucléase de restriction positionné de manière adjacente aux codons de l'acide aminé "r'" du premier interféron de leucocyte, n acides aminés constituant une Fraction substantielle de la séquence d'acides aminés du

premier interféron. Le clivage avec ltendonucléase de restric-

tion donne un Fragment comprenant la partie amine-terminale du premier interFéron et les codons pour environ n acides aminés. On choisit un second Fragment comprenant la totalité ou une partie des codons de la séquence d'acides aminés d'un

second interFéron de leucocyte, différent, le Fragment compre-

nant un site de clivage pour une endonucléase de restriction

249386?

identique positionné de manière adjacente aux codons pour l'acide aminé du second interféron dont le numéro d'acide aminé Cen partant de l'extrémité amino-terminale du second

interféron) est environ 166 n. Le clivage du second frag-

ment avec cette endonucléase de restriction donne un produit complémentaire de la partie 'n" terminale du produit de digestion du premier fragment, de manière que le produit de digestion du second puisse être lié à celui du premier, - en reformant le site de reconnaissance de l'endonucléase de restriction et en reconstituant le codon de l'acide aminé

n du premier interféron, lorsqu'il est perdu dans la diges-

tion initiale. Le produit de la digestion par l'endonucléase de restriction du second fragment procède de préférence à partir de l'extrémité résultant du clivage en direction 3' en passant par les nucléotides encodant l'extrémité sarboxy

du second interféron de leucocyte.

On peut également Former des hybrides contenant des parties substantielles des séquences d'acides aminés de plus de deux interférons de leucocytes se trouvant dans la nature,

auquel cas, par exemple, le second Fragment mentionné ci-

dessus est en outre choisi de manière à contenir un second

site d'endonucléase de restriction en aval à partir du pre-

* mier, le second site étant identique à un site positionné de manière analogue au sein d'un Fragment encodant l'extrémité carboxy d'un troisième interféron de leucocyte, etc. Dans l'exemple mentionné, on peut triplement lier les produits

d'opérations successives avec une endonucléase de restric-

tion pour Former un gène hybride encodant la fraction amino-

terminale d'un premier interféron, la séquence d'acides aminés

moyenne du second et la partie carboxy-terminale du troisiè-

me [ou, dans une autre variante, du premier, lorsque le

premier et le troisième interférons sont semblables).

Il est préférable que le premier Fragment mention-

né ci-dessus soit dérivé d'un plasmide d'expression, c'est-à-

dire d'un plasmide dans lequel les codons de la partie amino-terminale du premier interFéron de leucocyte sont t493861 3a précédés par un codon ATG ou un autre codon d'initiation de

traduction et un promoteur ou un système promoteur-opérateur.

Il s'ensuit que le produit final des opérations de manipu-

lation décrites ci-dessus est un plasmide capable d'expri-

mer le polypeptide encodé par le gène hybride dans les bac- téries ou d'autres organismes microbiens transformes avec le plasmide. D'autres moyens de donner aux-.gênes hybrides une configuration appropriée à l'expression microbienne

apparattront aux specialistes.

la0 Dans les modes de réalisation préférés de l'inven-

tion, les gènes hybrides encodent une nouvelle séquence d'acides aminés d'interférons de leucocytes ayant environ -156 acides aminés constituant un conjugué de séquences substantielles d'acides aminés tirées de deux ou plusieurs interférons de leucocytes différents choisis dans le groupe constitué par LeIF A, LeIF Bs, LeIF Cs LeIF J, LeIF A, LeIF F, LeIF G et LeIF H tel que décrit dans la Figure 3. Il est préférable que les nouveaux interférons de leucocytes encodés

par les gènes hybrides comprennent les acides aminés spéci-

ZU ffiés et positionnés comme il est indiqué dans la séquence "A11" de la figure 3. On peut tester de fagon classique l'activité antivirale des produits d'expression de plasmides formés selon l'invention, comme dans les déterminations

d'activité biologique décrites ci-dessous.

DEMONSTRATION DE L'ACTIVITE ANTIVIFRALE

On transforme classiquement E. coli K-12 souche 294 avec, indépendamment, les plasmides pLeIF trp 25, pLeIF

trp O, pLeIF trp A/D [Cgl II] et pLeIF trp O/A [tBgl I)I].

On cultive séparément les transformants dans des cultures de 5 ml dans du bouillon L contenant 5 mg/ml de tétracycline jusqu'à un Aso d'environ 1,U, puis on dilue dans I litre de milieu M9 contenant 5 ig/ml de tétracycline. Un récolte les cellules lorsque ASU atteint 1,U et on met en suspension les pastilles cellulaires dans 10 ml de saccharose à 15%,

-49386?

tris-HC1 50 mM [pH 8,0), EDTA 50 mM. On ajoute 10 mg de lysozyme et, au bout de 5 minutes à OOC, on disloque les cellules par traitement aux ultrasons. On centrifuge les échantillons pendant 10 minutes à 15 000 tpm dans un rotor Sorvall SM-24. On soumet l'activité d'interféron dans les

surnageants à un test pour déterminer l'activité antivirale.

Les rendements par litre de culture de ces inter-

férons, titrés sur une lignée cellulaire humaine [WISH) sont donnés au Tableau a d'après lequel il apparaît que l'activité de LeIF A/O est produite en plus grande quantité que celle des autres interférons. Cette différence pourrait être due à une plus grande activité intrinsèque du LeIF A/D ou à un meilleur rendement en termes de mg de protéine de cet interféron. Etant donné que le linkage génétique est identique pour tous ces interFérons, il semble très probable que le LeIF A/D ait essentiellement une activité supérieure

à celle des autres interférons.

Tableau 2

Rendement des interférons de leucocytes à partir de cultures d'E. coli en ballon agité Type d'interféron Activité: Rendement/litre Cunités sur

WISH]*

A 8 x 10 O 5 x 106 AD [Bgl II) a x 108 DA [Bgl II] 1 x 106 dosé par inhibition de l'effet cytopathique sur les

cellules WISH avec VSV comme épreuve.

On détermine la puissance des divers interférons dans une gamme de lignées de cellules de mammifères [homme, WISH; singe vert d'Afrique, VúRO; fibroblaste de hamster, BHK; cellules de rein de lapin, HK-13; souris L-929; et rein de boeuf, cellules MOBK]. Afin de comparer l'activité

249386?

relative des interférons, on calcule leur activité sur diverses cellules par rapport à leur activité sur des cellules WISH prises comme indice 100. Les résultats du Tableau 3 montrent que LeIF A/O a une activité très élevée chez les cellules VERO et L-9?9 tandis que LeIF D/A a une faible activité dans ces lignées cellulaires. Ces résultats indiquent que la combinaison de la partie N-terminale de LeIF A et de la partie Cterminale de LeIF D au sein d'une seule molécule [LeIF A/D] confère à la protéine hybride une puissance particulière qui est manifeste -chez plusieurs espèces de mammifères. De plus, ces propriétés ne sont pas

simplement la somme des propriétés des interférons parents.

On le voit clairement dans le cas de l'activité sur les cellules L-929 [Tableau 3) auquel cas ni un mélange de LeIF A et de LeIF D, ni l'autrFe hybride, LeIF O/A, n'a

d'activité significative.

Tableau 3

Titrage de divers interférons de leucocytes dans des lignées cellulaires provenant de diverses espèces de mammifères Interférons de leucocytes lignée couche cellulaire n n nAt nA An leuoocvt i m M - A h UtI h-- -p _"

WISH - 100 100 100 100 100 100

VERO 250 75 1 670 20 200 200

BHK 400 200 833 2 000 400 20

RK-13 12 500 6 - - 120

L-929 150 5 3 300 2 10 0,1

*Interférons testés vis-à-vis de l'infection par VSV des

diFférentes lignées cellulaires. Activités exprimées en,.

de l'activité observée dans les cellules WISH.

On examine également l'activité de LeIF A/D vis-

à-vis d'autres virus. Les données de la figure 5 montrent les effets antiviraux contre l'infection pur un virus EMC des cellules L et les données dans la figure 6 montrent les effets vis-à-vis de l'infection par VSV des cellules L. Il est clair d'après ces données que la plus grande activité de LeIF A/O ne se confine pas à un virus CVSV] et que sa plus grande activité est vraisemblablement une propriété générale vis-à-vis de nombreux virus. Les préparations naturelles d'interféron de couche leucocytaire humalne n'ont pas d'effet contre les cellules de souris Cof Tableau 2). On examine donc l'activité de LeIF A/D vis-à-vis de l'infection par le virus EMC des souris CD-1. Les résultats

de la figure 7 montrent que LeIF A/D est extrêmement puis-

sant contre l'infection léthale due au virus EMC et que LeIF A présente également une activité antivirale, comme on peut s'y attendre d'après l'activité dans les lignées cellulaires [Tableau 2]. Les données de la figure 7 résultent de traitements i.p. 3 h avant l'infection. Les doses de

LeIF A/O et LeIF A sont telles que titrées sur WISH.

L'infection léthale des hamsters due au virus EMC est également affectée par LeIF A/D et LeIF A (figure 8)3, le premier étant le plus efficace, et l!iinterféron de couche leucocytaire ne présente qu'un effet faible et sans signification statistique. Dans le cas de la figure 8s

tous les interférons sont administrés i.p. 3 h avant l'tin-

faction à une dose de 5 x 10 ug/kg, titrée sur des

cellules WISH.

Ces résultats indiquent que les effets antiviraux prononcés de LeIF A/D dans une série d'espèces de mammifères ne se confinent pas aux cultures cellulaires mais s'observent

également dans les infections virales léthales.

Le virus EMC peut être considéré comme un système modèle, démonstration d'effet antiviral qui peut permettre de prédire un effet antiviral contre la famille de virus représentée, p. ex. la famille des picornavirus à laquelle

249386?

appartiennent les virus de la Fièvre aphteuse et de la poliomyélite. Levirus VSV peut être considéré comme un

système modèle, une démonstration d'effet antiviral permet-

tant de prévoir un effet antiviral contre la Famille de virus représentée, c'est-à-dire la Famille des rhabdovirus dont

le virus de la rage est un membre important.

Le Tableau 4 présente l'activité de plusieurs des présente hybrides de LeIF sur des cellules WISH et MOBSK et leurs rapports d'activités: Hybride d LeIF AB AD AF AG AI BA BD BF BG DA DB DF DG FA FB FD FG IA A* B* C* D* F* I*

TABLEAI

Unites/litre de (PvuI) celelules WIu urSH (PvulI) cellules WISH 2,4 1,2

- 6 X

4x 3;2 1)5 6x lx 1 X 2x 3x 2x 2x 2x 2x 2x 1 x 1 x 2Y4 8x 8x 2x x 2x 1,6 x 108 X 108 x 107 x 107 o106 0 6 X 106 X 107

249386?

J 4 Unités/liîre de Cuture cellules MOBK 4 x 107 2 x 107 1 x 107

X 107

1>2 x 107 I x 107 1,5 x 107 3,5 x 105 6 x--' 107 1,2 x 108 x 107 4 x 106 1,5 x 107 6 x 10 8x 107 2 x 107 4 x 107 6 x 107 1,2 x 10 4 x 108 1,5 x 107 2,5 x 107 2 x 107 1,2 x 108

Rap art d'ac-

l? Ites lP1 vl uss

WISH/1DB

2>7. 2;7 2,7 1,5 0,3 0,3 0,025 0O04 0,05 0,014 0,003 0,025 0,5 0>025 0,04 0,7 0,2 1,3 0,2 0,1 1,3

Aux Fins de comparaison.

Administration parentérale Les-présents interférons de leucocytes hybrides peuvent être administrés par voie parentérale à des sujets nécessitant un traitement anti-tumoral, ou antiviral, et à ceux qui présentent un état d'immunosuppression. La posologie et le rythme d'administration peuvent se conformer à ce qui est actuellement utilisé dans les recherches cliniques sur des matériaux dtorigine humaine, c'est- à-dire environ Cl-103 x 100 unités par jour, et dans le cas de matériaux de pureté supérieure à 1%, vraisemblablement jusqu'à, p. ex., x 10 unités par jour. Les indications préliminaires dans l'étude sur le singe décrite ci-dessus suggèrent que les doses de LeIF obtenu par voie bactérienne pourraient être

augmentées de fagon significatives pour avoir un effet supé-

rieur étant donné l'absence essentielle de protéines humai-

nes autres que les LeIF, protéines qui dans les matériaux dérivés de leucocytes peuvent jouer un rale de pyrogène, causant des effets nocifs, p. ex. des malaises, des élévations de température, etc. A titre d'exemple de posologie appropriée pour un

LeIF bactérien essentiellement homogène sous forme paren-

térale applicable ici mutatis mutandis, on peut dissoudre 3 mg de LeIF d'une activité spécifique, p. ex., de Z x 10a U/mg dans 25 ml de sérumalbumine [humaine] - USP 5 N, faire S25 passer -la solution à travers un filtre bactériologique et répartir aseptiquement la solution filtrée dans 100 Flacons, contenant chacun S x 10 unités d'interféron pur approprié à l'administration parentérale. Les flacons sont stockés de

préférence à froid C-20)C] avant l'emploi.

Les composés de l'invention peuvent être Formulés selon des procédés connus pour préparer des compositions

pharmaceutiquement utiles, en combinant le présent polypep-

tide mélangé à un véhicule support pharmaceutiquement accep-

table. Les véhicules appropriés et leur formulation sont décrits dans Remington's Pharmaceutical Sciences par

249386?

E.W. Martin, ici mentionné à titre de référence. Ces compo-

sitions contiennent une quantité efficace de la présente protéine d'interféron avec une quantité appropriée de

véhicule aFin de préparer des compositions pharmaceuti-

quement acceptables appropriées à l'administration efficace

à l'hôte.

249386?

-u iiL VEJ IJ CATI DNS 1. Polypeptide antiviral d'environ 165-166 acides aminés, la séquence d'acides aminés dudit polypeptide comprenant, en séquence, des sous-séquences discrètes correspondant, quant à l'identité et au nombre des acides aminés, à des sous-séquences d'interférons de leucocytes différents, se trouvant dans la nature, la séquence d'acides aminés dudit polypeptide différant dans sa composition globale de la séquence d'acides aminés d'interférons de leucocytes se

trouvant dans la nature.

2. Polypeptide selon la revendication I dont la partie N-

terminale se compose essentiellement des acides aminés

1-92 du LeIF D et dont la partie carboxy-terminale se compo-

se essentiellement des acides aminés 92-165 du LeIF A.

15. 3. Polypeptide selon la revendication 1 dont la partie N-

terminale se compose essentiellement des acides aminés 1-91 du LeIF A et dont la partie carboxy-terminale se compose

essentiellement des acides aminés 93-166 du LeIF-D.

4. Polypeptide selon la revendication I dont la partie,-

terminale se compose essentiellement des acides aminés 1-63 du LeIF D et dont la partie carboxy-terminale se compose essentiellement des acides aminés 63-165 du LeIF A.

5. Polypeptide selon la revendication I dont la partie N-

terminale se compose essentiellement des acides aminés 1-62 du LeIF A et dont la partie carboxy-terminale se compose essentiellement des acides aminés 65-166 du LeIF D.

6. Polypeptide selon la revendication 1 dont la partie N-

terminale se compose essentiellement des acides aminés 1-91 du LeIF A et dont la partie carboxy-terminale se compose

249386?

4 1 essentiellement des acides aminés 93-166 du LelF B.

7. Polypeptide selon la revendication I dont la partie 4N-

terminale se compose essentiellement des acides aminés 1-91 du LelF A, et dont la partie carboxy-terminale se compose essentiellement des acides aminés 93-166 du LeIF F.

B. ADN à deux brins comprenant un brin encodant un polypep-

tide selon l'une quelconque des revendications 1-5.

9. ADN à deux brins comprenant un brin encodant un polypep-

tide selon les revendications 6 et 7.

10. Véhicule d'expression plasmidique réplicable capable,

dans un microorganisme transformant, d'exprimer un polypepti-

de selon l'une quelconque des revendications 1-5.

11. Véhicule d'expression plasmidique réplicable capable,

dans un microorganisme transFormant, d'exprimer un poly-

peptide selon les revendications 6 et 7.

12. Microorganisme transformant contenant le véhicule

d'expression de la revendication 10.

13. Microorganisme transformant contenant le véhicule

d'expression de la revendication 11.

14. Plasmide choisi dans le groupe constitué par pLeIF AD trp [Bgl II], pLeIF AD trp [Pvu Il), pLeIF DA trp [Bgl II]

et pLeIF DA trp [Pvu II).

15. Plasmide choisi dans le groupe constitué par pLeIF AB

[Pvu II] et pLeIF AF [Pvu II].

16. Procédé pour former un ADN à deux brins selon les 4a

revendications 8 ou 9, qui implique:

a. de choisir un premier fragment d'ADN à deux brins comprenant des codons encodant la totalité ou une partie de le séquence d'acides aminés d'un premier interféron de leucocytese trouvant dans la nature, ledit fragment comprenant des codons pour la partie amino-t-erminale dudit interféron et, espacé en direction 3t à partir de làs un premier site de clivage d'endonucléase de restriction; b. de cliver ledit fragment avec ladite endonucléase de restriction;

c. de choisir un second fragment d'ADN à deux brins enco-

dent la.totalité ou une partie de la séquence d'acides aminés d'un second interféron de leucocyte différent, se trouvant dans la nature, le second fragment comprenant

un site de clivage d'endonucléase de restriction identi-

que positionné de manière essentiellement identique du point de vue de la numérotation des acides aminés des deux interférons et comprenant en outre, au-delà dudit site, des codons pour la partie carboxy-terminale du second interféron; d. de cliver le second fragment avec ladite endonucléase de restriction; et e. de lier les produits de digestion par des endonucléases de restriction des étapes b et d pour reconstituer ledit site dtendonucléase de restriction et Former un fragment hybride comprenant, en séquence, des codons pour la partie amino-terminale du premier interféron et la partie

carboxy-terminale du second.

17. Procédé pour former un polypeptide antiviral selon l'une

quelconque des revendications 1-7, qui implique:.

a. de déployer le fragment d.AON hybride résultant du procédé revendiqué dans la revendication 16 avec un véhicule d'expression plasmidique réplicable, de transFormer un microorganisme avec ce ragment, de cultiver le microorganisme et d'occasionner l'expression du polypeptide encodé par le fragment d'ADIN hybride; et b. de lyser le microorganisme résultant et de recueillir à partir de celui-ci le polypeptide.

18. Composition pharmaceutique contenant une quantité thé-

rapeutiquement efficace d'un polypeptide selon l'une

quelconque des revendications 1-7 et un véhicule support

pharmaceutiquement acceptable.

19. Application d'un polypeptide tel que revendiqué dans

l'une quelconque des revendications 1-7 au traitement des

maladies virales ou néoplasiques ou à la préparation de

compositions pharmaceutiques utiles dans un tel traitement.