SE460539B - Hybrida humanleukocyt interferoner, dna-sekvens kodande foer dem, vektor innehaallande dna-sekvensen samt farmaceutisk komposition innehaallande hybrida humanleukocytinterferonerna - Google Patents

Description

460 559 2 bakterier, företrädesvis E. coli K-12 stam 294, American type culture collection nr. 3l446, deponerad den 28 oktober 1975.

Arbetsinstrumentet i rekombinant DNA-teknologi är plasmiden, en icke kromosomal slinga av dubbelsträngad DNA som återfinnes i bakterier och andra mikrober, ofta i multipla kopior per cell.

Innefattad i den information som är inkodad i plasmid-DNA:t är den som erfordras för reproduktion av plasmiden i dotter- celler, dvs. en "replikon" och vanligen ett eller flera selek- *ionskaraktäristika såsom, när det gäller bakterier, beständig- het mot antibiotika som medger kloner av värdcellen innehållande plasmiden av intresse att igenkännas och preferentiellt växa i selektiva media. Plasmiders användbarhet ligger i det för- hállandet att de kan specifikt klyvas av ett eller anna restrik- tionsendonukleas eller "restriktionsenzym“, av vilka var och en igenkänner ett olikartat ställe på den plasmida DNA;n.

Därefter kan heterologa gener eller genfragment insättas i plasmiden genom ändvis sammansättning vid klyvningsstället eller vid rekonstruerade ändar som ligger intill klyvnings~ stället. DNA-rekombation utföres utom cellen men den resul- terande "rekombinanta" plasmiden kan införas däri enligt ett förfarande som är känt såsom transformation och stora kvantiteter av den heterologa genhaltiga rekombinanta plasmiden erhålles genom odling av transfcrmanten. När genen är rätt insatt med hänsyn till delar av plasmiden som styr transkrip-- tionen och translationen av det inkodade DNA-budskapet w kan den resulterande expressionsvehikeln dessutom användas för att verkligen framställa den polypeptidsekvens för vilken_ den insatta genen kodar ett förfarande som betecknas såsom expression. m . § ÉExpression initieras i en region som är känd såsom den promotqr åsom igenkännes av och bindes av RNA-polymeras. I vissa fall, I Ésåsom i tryptofan eller "trp"-promotor som föredrages vid å I :tillämpning av föreliggande uppfinning, överlappas promotor- 1 šregioner av "operator"-regioner till bildning av en kombinerad fpromotor-operator. Operatörer är_DNA-sekvenser, som igenkännes §i__.iLay§s.k.Arepressorproteiner, som tjänar till att reglera frek=J b blir oöversatt av ribosomerna. 460 539 vensen av transkriptionsinitiering vid en speciell promotor.

Polymerasen rör sig längs DNA och transkriberar den informa- tion som innehålles i den kodande strängen från dess 5'- till dess 3'-ände till budbärar-RNA, en polypeptid uppvisande den aminosyrasekvens som DNA kodifie- som i sin tur översättes till rar. Varje aminosyra är kodad medelst en nukleotidtriplet eller "codon" inom vad som i föreliggande sammanhang kan be- tecknas såsom den "strukturella genen", dvs. den del som kodar aminosyrasekvensen i den uttryckta produkten. Efter bindning till promotorn transkriberar RNA-polymeraset först de nukleotider som kodar ett ribosombindningsställe, där- efter en translationsinitiering eller "start"-signal (vanligt- vis ATG, som i den resulterande budbärar-RNA blir AUG), där- efter nukleotidcodonerna inom den strukturella S.k. stoppkodoner transkriberas vid änden av den strukturella genen i sig. genen, varefter polymeraset kan bilda en ytterligare sekvens av budbärar-RNA som, på grund av närvaron av stoppsignalen, Ribosomerna bindes till det bindningsställe som ástadkommits på budbärar-RNA, i bakterier vanligtvis när mRNA bildar, och producerar själva den kodade polypeptiden, med början vid translationsstartsignalen och med slut vid den ovannämnda stoppsignalen. Den önskade produk- ten bildas om de sekvenser som k0dar ribosombindnings- 1 stället är rätt belägna med avseende till AUG-initiatorcodonen :och om samtliga kvarvarande codoner följer initiatorcodonen _ 'i fas. Den resulterande produkten kan erhållas genom lysering§ av värdcellen och utvinning av produkten genom lämplig rening' :från annat bakteriellt protein.

§Kort sammanfattning av uppfinningen 3 i fleukocytinterferonerna uppdagar en grad av kommonalitet bland =ett flertal av dem med avseende på närvaro och lokalisering [av klyvningsställen som igenkännes av speciella restriktions- i i i i i ikommonalitet till bildning,genom DNA¥rekombination,av nya hyb y»Åridgener,Lsom=är användbara vid mikrobiell.framställning av | '°æhvbridleukocytinterferoner¿ som kan förväntas i större eller I Nukleotidsekvensstudier av gener som kodar de olika 'endonukleaser. Enligt uppfinningen kan fördel dragas av denna “I 460 539 4 mindre grad uppvisa de antivirala och de andra egenskaperna hos interferoner som kodats av modergenerna. Vid före- dragna utföringsformer av uppfinningen kan sådana hybridleuko- cytinterieroner uppvisa förbättrad aktivitet i relation till de som kodats av modergenerna.

En antiviral polypeptid innehållande 165-166 aminosyror, som kännetecknas av att aminosyrasekvensen i polypeptiden i följd innehåller avskilda subsekvenser som med avseende på amino- syraidentitet och antal motsvarar väsentliga andelar av sub- sekvenser av olika, naturlgt förekommande leukocytinterfoner, varvid aminosyrasekvensen i polypeptiden skiljer sig med av- seende på total komposition från aminosyrasekvensen i natur- ligt förekommande leukocytinterferoner.

Enligt en föredragen utföringsform av föreliggande uppfinning består den N-terminala delen av hybridpolypeptiderna av amino- syrorna 1-92 eller l-63 av LeIP-D eller av aminosyrorna l-91 eller l-62 av LeIF-A och den karboxiterminala delen testår av aminosyrorna 92-165 eller 63-165 av LeIF-A eller av amino- syrorna 93-166 eller 64-l66 av LeIF-D eller av aminosyrorna 93-166 av LeIF-B.

Föreliggande uppfinning hänför sig även till de dubbelsträn- gade DNA-sekvenser som kodar de ovannämnda hybridleukocyt- interferonerna till motsvarande replikerbara plasmida expres- sionsvehiklar vilka har förmåga att i en transformant bakterie uttrycka dessa interferoner och nämnda transformanta bakterie.

Slutligen hänför sig föreliggande uppfinning til? ett sätt för bildning av en dubbelsträngad DNA innefattande en sekvens som kodar en av de ovannämnda polypeptiderna liksom bildningen av ,dessa polypeptider genom deras expression i en bakteriell transformant. ~å \ \ _” 460 559 Moderleukocytinterferongenerna, som kodar den familj av leukocytinterferonproteiner som avses i föreliggande samman- hang, uppvisar naturliga alleliska variationer från individ till individ. Dessa variationer kan påvisas av (en) aminosyra- skillnad(er) i den totala proteinsekvensen genom deletioner, substitutioner, insertioner, inversioner eller tillsatser av en eller flera aminosyror i nämnda sekvens. För varje moder- leukocytinterferon därav, märkt LeIF A, LeIF B och LeIF J, innefattas sådana alleliska variationer inom ramen för märkningen eller den term som definierar denna och sålunda inom ramen för uppfinningen.

Det sätt på vilket denna och andra ändamål och fördelar med uppfinningen erhålles framgår av den detaljerade beskriv- ningen nedan och av de bifogade ritningarna, vari: Fig. l (a,b) återger nukleotidsekvenser i kodregionerna i 8 leuko- cytinterferon ("LeIF") komplementära DNA ("cDNA") kloner. Av dessa är en, på motsvarande sätt betecknad LeIF E, en appa- rent ”pseudogen", som inte kodar någon aktiv leukocyt- interferon under det att en annan, betecknad LeIF G, inne- håller mindre än den fulla sekvensen för motsvarande inter- feronart. Den ATG translationella initieringscodonen och avslutningstripletten för varje LeIF är understruken. I Pig. 2 åskådliggör restriktionsendonukleaskartor av åtta typer LeIF klonade cDNA '(A till H). Plasmider innehållande kloner konstruerades enligt dC:dG svansmetoden lšoeddel, D.v. et al.

§Nature 287, 411-416 (l980y]. Sålunda kan cDNA-insättningarna íutskäras med användning av Pst I, dvs. varje ände av varje šinsättning är ett Pst I restriktionsendonukleasklyvnings- c i__"iliställe. Linjerna vid varje ände av varje cDNA-insättning repre- 460 559 6 senterar de flankerande homopolymera cD:cG-svansarna. Positioner- na för Pvu II, Eco RI och Bgl II restriktionsställena indikeras.

Skuggade regioner i figuren representerar kodande sekven- ser av mogna LeIF; de tvärstreckade regionerna anger signal- peptidkodningssekvenser; och de öppna regionerna visar 3' och 5' icke kodade sekvenser.

Fig. 3 är en jämförelse av de åtta LeIF-proteinsekvenserna som förutsäges av nukleotidsekvenserna. De enbokstaviga förkortningarna som rekommenderas av IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature användes: A, alanin; C, cystein; D, asparaginsyra; E, glutaminsyra; F, fenylalanin; G, glycin; H, histidin; I,'isoleucin; K, lysin; L, leucin; M, metionin; N, asparagin; P, prolin; Q, glutamin; R, arginin; S, serin; T, treonin; V, valin; W, tryptofan; och Y, tyrosin. Siffrorna hänvisar till aminosyrapositionen (S avser signalpeptid).

Strecket i 165 aminosyra LeIF A-sekvensen vid position 44 'har införts för att jämställa LeIF A-sekvensen med l66 amino- syrasekvenserna i de andra LeIF. LeIF E-sekvensen bestämdes genom att ignorera den extra nukleotiden (position 187 i fig. 1) i dess kodningsregion, Asteriskerna indikerar terminationscodoner i fas. Aminosyror som är gemensama för samtliga LeIF (uteslutande pseudogen LeIF E) visas även och betecknas "all". De understrukna grupperna är aminosyror, som även är närvarande i humant fibroblastinterferon.

I fig. l svarar nukleotider +l till 69 mot S1 till S23 amino- ,syror i fig. 3. Codon TGT (nukleotider 70 till 72) i fig. l Émotsvarar cystein (C, aminosyra 1) i fig. 3. I fig. 3 före- i ¿kommer Pvu II restriktionsendonukleasklyvningsställe mellan §codonerna för aminosyror 92 och 93 i LeIF A,B,D,F och G, dvs. ïmeiian nuxieotiaerna 346 och 347 1 fig. 1. i c i \ v |I fig. 4 jämföras aminosyrasekvenserna i mogna leukocytinter-_ !feroner A och D, varvid ett utelämnande av aminosyra 44 i LeIF A indikeras med streck. Endast de LeIF D aminosyror som Askiljer sig från motsvarande aminosyror i LeIF A anges: aminoq i____i;syrasekvensen i LeIF D är i övrigt identisk med den i LeIF_AfJ 1 Y l É i 5 I i .~ ~ , . 11, _. tf I -E. coli x 1776 een n. cell x-1z“ecem zq4,>een aefiniereee even, j llerfandraimikrobiella stammar av vilka manga har deponerats .:çnfär§Jpotentiellt)'tillgängligaffrån-erkända/institutioner 7 460 539 Fig. 4 visar även den relativa positionen på motsvarande gen för Bgl II och Pvu II restriktionsendonukleasklyvningsställen som användes vid bildning av föredragna hybridleukocytgener en-J ligt uppfinningen.

Fig. 5 och 6 visar resultaten av jämförande testning av ett föredraget hybridleukocytinterferon enligt uppfinningen (“LeIF- A/D") med avseende på aktivitet gentemot encefalomyocarditis- virus ("EMC") och vesikulär stomatit-virus ("VSV") i musceller.

Fig. 7 och 8 visar resultaten av jämförande testning inne- fattande LeIF-A/D och andra interferoner gentemot infektioner av EMC-virus i möss resp. hamstrar. Uppgifterna i fig. 7 resul- terar från behandlingar i.p. tre timmar före infektion. Dose- ringar av LeIF-A/D och LeIF-A titreras på WISH-celler.

Fig. 9 anger DNA-sekvenserna för fem LeIF-proteiner därav inne- fattande typerna I och J.

Beskrivning av de föredragna utföringgformerna Använda mikroorganismer Det beskrivna arbetet innefattade användning av två mikro- organismer: E. coli xl776, såsom beskrivas i den amerikanska patentskriften 4 190 494 och E. coli K-12 stam 294 (ände A, thi', har-, hsmfl) såsom beskrives i den brittiska patentskriften 2055382A. Var och en därav har deponerats i American Type Cul-1 ture ceiieeuien, Awcc nr. 31537 een 31446, inianneae den 3 juli 1979 resp. 28 oktober 1978. Allt rekombinerande DNA-arbete har; ntförts i överensstämmelse med tillämpliga riktlinjer från f national Institutes of Health. 3 1 öppfinningen'i dess mest föredragna utföringsformer beskrivas med hänvisning till Er coli innefattande inte endast stammarna tanåäven med andra kända E. coli-stammar, såsom E. coli B ör deposition av mikroorganismer, såsom American Type Cultnre_ v--qu- k r I '-__.,._.._-_..-. Å _L¿, Y 460 559 8 Collection, ATCC. (Jämför ATCC-katalogen och även den tyska utlagda patentskriften 2 644 432.) Dessa andra mikroorganismer innefattar exempelvis baciller såsom Bacillus subtilis och andra enterobakteriace-arter bland vilka kan nämnas såsom exem- pel Salmonella typhimurium och Serratia marcesans, SDN Utnytt- jar plasmider som kan replikera och uttrycka neterologa gensekvenser däri. Jäster, såsom Saccharomyces cerevisiae, kan även användas med fördel såsom värdorganism vid framställ- ning av interferonproteinerna däri genom expression av genkoder därför under kontroll av en jästpromotor.

LeIF-hybriderna framställes enligt föreliggande uppfinning på så sätt att man drar fördel av restriktionsendonukleas- klyvningsställen som vanligen är belägna inom de individuella modergenerna och varje ände därav tillsammans med samma ställen i bärarexpressionsplasmider (vektorer). Exempelvis kan det stora (fv39OO bp) fragmentet av en Xba I till Pst I uppslutning av pLeIF A trp 25-expressionsplasmiden ligeras med Xba I till Pvu II och Pvu II till Pst I uppslutningsfragment av de olika LeIF-modergenerna för erhållning av expressionsplasmider som är användbara för erhållande av den motsvarande hybriden LeIF.

Varje LeIF-expressionsplasmid konstruerades oberoende med upp- slutningsfragment isolerade från olika LeIF-plasmider, t.ex. pLeIF A trp 25, pLeIF B trp 7, pLeIF C trp 35, pLeIF D trp ll,\ pLeIF F trp l, pLeIF G, pLeIF H och pLeIF I, etc., vars kon- struktion beskrives i Nature gål, 4ll (1980) eller från pBR322; vars konstruktion beskrivas I sens 3, ss (1917). I vissa sv f dessa plasmider betecknar "trp" ett tryptofanpromotor-operatorf system som är mest föredraget för bakteriell expression, såsomå beskrivas i den publicerade Europeiska patentansökningen 36776Å I Ü'birekt'expression av ett första moget leukocytinterferon I ° bet förfarande som följdes för att uttrycka neïšïn direkt såsoml >p'“en mogen*interferonpolypeptid innefattade kombinationen av_synte- _5[%iska }N-terminal) och komplementära DNA. h x 4 Ett äau§§a_restriktionsendonukleasställe är lämpligt beläget I ;:;@æ:" sà',~sd-i.. W,. ,» »V "gif , "a«,“»- ,» .ëçtfden¿först^fläckades med etidiumbromid, varvid fragmenten ' vav¿deÜdelar¿som hade intresse. Varje gelfragment placerades »refl f@“«w¿¿ ta, (31 t., * L »"";- t,, ' t "». -n-fmhïï-.vwrwlf 1,1.- ,. _ _. _' __ _. . : ~ « i 9 460 559 mellan condonerna l och 2-i Le-IF A. Två syntetiska deoxioligo- nukleotider designerades vilka innefattade en ATG-translationell initieringgcgdon, âterinförande av codonen för aminosyra l (cystein) och åstadkommande av en Eco RI kohesiv ände. Dessa oligomerer ligerades till ett 34 b.p. Sau 3a - Ave II-fragment av pL3l.

Den resulterande 45 b.p.-produkten ligerades till två ytter- ligare DNA-fragment för konstruktion av en 865 baspar syntetisk- naturlig hybridgen, som kodar för Le-IF A och som är bunden vid Eco RI och Pst I-restriktionsställen. Denna gen insattes i pBR322 mellan Eco RI och Pst I-ställen för erhàllning av plas- miden ppe-IF Al. , Plasmiden pGMl bär E. coli tryptofanoperoneh innehållande deletionefl ALEl4l3 [C.F. Miozzari et al., J. Bacteriology låg, l457-1466 (l978)] och uttrycker sålunda ett fusionsprotein innefattande de första 6 aminosyrorna i trp-ledaren och ungefär den sista tredjedelen av trp E-polypeptiden (nedan refererad till i föfßniflg såsom LE') såväl som trp D-polypeptiden i dess helhet, allt under kontroll av trp promotor-operator- systemet. Plasmiden, 20,ug, uppslöts med restriktionsenzymet Pvu II, som klyver plasmiden vid 5 ställen. Genfragmenten kom- binerades därefter med EcoRI-sammanbindare (bestående av en fl1Ü1Vk°NP1°m°Dt5f oligonukleotid med sekvensen: p ATGAATTCATG) som ger ett EcoRI-klyvningsställe för senare klonin:\š(en plasmid innehållande ett EcoRI-ställe. De 20/ug av DNA-fragment som erhållits från pGMl behandlades med lo enheter T4 DNA-ligas i närvaro av 200 pikomol 5'-fosforylerad syntetisk oligonukleo- :ia pcaæcnnæwcnwc een 1 2o,u1 w, nun-iiqaabufferc (20 mm tris, ps 7,6, o,s mm ATP, io mn Mgclz, s mn aitlotrelcol) vid 4°c över natten. Lösningen upphettades därefter 10 minuter vid 70°C rör att avbryta«ligering. Bindarna KIÖVB 9°fl°m E°°RI'UPPB1“t' ning och fragmenten, som nu hade EcoRI-andar, separerades med användning av 5 8 polyakrylamidgel-elektrofores (nedan "PAGE") oeh de tre största fragmenten isolerades från gelen pà så sätti i lokaliserades med ultraviolett ljus, samt utskärning från galen .......,.....5 460 559 10 tillsammans med 300 mikroliter O,lxTBE i en dialyspåse och underkastades elektrofores vid 100 V i en timme i O,lxTBE buffert (TBE buffert innehåller: 10,8 g trisbas, 5,5 g borsyra, 0,09 g Na2EDTA i l liter vatten). Vattenlösningen tillvara- togs från dialyspåsen, fenolextraherades, kloroformextrahera~ des och gjordes 0,2 M med avseende på natriumklorid och DNA tillvaratogs i vatten efter etanolfällning. Den trp promotor- operator-haltiga genen med EcoRI kohesiva ändar identifiera- des för det närmast nedan beskrivna förfarandet, som innefattar' insättning av fragment i en_tetracyklinkänslig plasmid, som efter promotor-operator-insättning, blir tetracyklinresistent.

Plasmid pBRHl (R.I. Rodriguez, et al., Nucleic Acids Re :arch á, 3267-3287 (1979)) uttrycker ampicillin-resistens och inne- håller genen för tetracyklinresistens men emedan det inte före- finnes någon associerad promotor uttryckes inte denna resistens.

'Plasmiden är följaktligen tetracyklinkänslig. Genom införande av ett promotor-operator-system i EcoRI-stället kan plasmiden göras tetracyklinresistent. pBRHl uppslöts med EcoRI och enzymet avlägsnades genom fenol- extraktion åtföljt av kloroformextraktion och tillvaratogs i vatten efter etanolfällning. Den resulterande DNA-molekylen kombinerades i separata reaktionsblandningar med var och en av de tre DNA-fragment som erhållits ovan och ligerades med T4 DNA-ligas såsom beskrivits ovan. DNA närvarade i reaktions- blandningen användes för att omvandla kompetent E. coli K-12 stam 294 (K. Backman et al.,'Proc. Natl. Acad. Soi. USA 12, Ä RI74-4198 (1976)) enligt standardteknik (V. Hershfield et a1.,, Éroc. Natl. Acad. Sci. USA Zl, 3455-3459 (1974)) och bakterier; pe1agaapa Lß-piau-.or innenauanae zo pg/ml ampiciiiin och s ; É9/ml tetracyklin. Flera tetracyklinresistenta kolonier utval-s des, plasmid DNA isolerades och närvaron av det önskade frag- f mentet bekräftades genom restriktionsenzymanalys. Den erhállnai z l 2 f gëlasmidenvbetecknades pBRHtrp. @§nfEçoßIroch'Bamfll-uppslutningsprodukt av det virala genomet t 'm _ . _ 11 460 559 av hepatit B erhölls på konventionellt sätt och klonades till EcoRI och BamHI-ställen på plasmid pGH6 (D.V. Goeddel et al., Nature åål, 544 (1979)) till bildning av plasmíden pHS32.

Plasmid pHS32 klövs med XbaI, fenolextraherades, kloroform- extraherades och etanolfälldes. Därefter behandlades den med l.pl E. coli polymeras I, Klenow-fragment (Boheringer-Mannheim) i 30 pl polymerasbuffert (50 mM kaliumfosfat pH 7,4, 7 mM MgCl2, l mM.,g-merkaptoetanol) innehållande 0,1 mm dTTP och 0,1 mm dCTP i 30 minuter vid O°C och därefter 2 timmar vid 37°C. Denna behandling förorsakade utfyllnad av 2 av de 4 nukleotiderna som var komplementära till den 5'-utskjutande änden av XbaI-klyvnings- stället: 5' cTAGA-- ______9 5' cTAGA-- 3' T-- 3' TCT Två nukleotider, dC och dT, inkorporerades för erhållning av en ände med två 5'-utskjutande nukleotider. Denna linjära rest av plasmid pHS32 (efter fenol- och kloroformextraktion och ut- vinning i vatten efter etanolfällning) klyvdes med EcoRI.

Det stora plasmidfragmentet separerades från det mindre EcoRI- Xbaï-fragmentet medelst PAGE och isolerades efter elektroelue- ring. Detta DNA-fragment från pHS32 (O,2lpg) ligerades under ïbetingelser som liknade de ovan beskrivna till EcoRI-Taq I- ïfragmentet av tryptofan-operonen (cv0,0l,ug), härrörande-från. ;psRucrp. ifiicricxi.

¿Vid förfarandet för ligering av fragmentet från pHS32 till ÉEoqRI+Taq I-fragmentet såsom beskrivits ovan ligerades den f :Tag I-utskjutande änden till den kvarvarande Xbaï-utskjutandeå fänden även om den inte var fullständigt basparad enligt Watson 1' -Q-T;~ cTAGA+-- ' --TCTAGA I . * w=-++aGc I flm g TcT-- A --Accrcm ä ß , l*¶f?š§;§ndel#av denna ligeringsreaktionshlandning transformerades, 11 E; c9;;}294eceiier,ïvarmebeàanalaaes can påfaraes pa _ . w- ..;f-', 460 559 12 plattor innehållande ampicillin. 24 kolonier utvaldes, odlades i 3 ml LB-media och plasmidisolerades. 6 av dessa visade sig ha XbaI-stället regenererat via E. coli-katalyserad DNA-repara- tion och replikation: --TcTAGA-- --AGATcT-- -*-TCTAGA --AGCTCT Plasmiderna visade sig även klyvas både med EcoRI och HpaI och ge de förväntade restriktionsfragmenten. En plasmid, be- tecknad pTrp 14% användes för expression av heterologa poly- peptider, såsom diskuteras nedan.

Plasmiden pHGH 107 (D.V. Goeddel et al, Nature, gâl, 544 (1979)) innehåller en gen för humant tillväxthormon bestående av 23 aminosyracodoner bildade av syntetiska DNA-fragment och 163 aminosyracodoner erhållna från komplementärt DNA bildat via omvänd transkription av humant tillväxthormonbudbärar-RNA. Även om den saknar codonerna i "pre"-sekvensen i humant till- växthormon innehåller denna gen en ATG-translationsinitierings- codon. Genen isolerades ur 10/ug pHGH 107 efter behandling :med EcoRI åtföljt av E. coli polymeras I Klenow-fragment och ¿dTTP och dATP såsom beskrivits ovan. Efter fenol- och kloroform- ¿extraktion och etanolfällning-behandlades plasmiden med BamHI.

§Humant tillväxthormon ("HGH") gen-haltigt fragment isolerades fmedelat PAGE åtföljt av elektroeluering. Det erhållna DNA- ïfragmentet innehåller även de första 350 nukleotiderna för itetracyklinreaistensstrukturgenen, men saknar tetracylin- 3promotor-operator-systemet så att efter k10niH9 i en Iexpressionsplasmid kan plasmiden innehållande insättningen L lokaliseras genom återbildning av tetracyklinresistens. ä 'Emedan EcoRI-änden av fragmentet fyllts upp enligt Klenow- E ipolymeras I-förfarandet har fragmentet en trubbig och en 'kohesiv ände, vilket tillförsäkrar rätt orientering vid >.{ïsenare insättning i en expressionsplasmid. l j! ”Qlgfišašggianlgphiaögmiaenö næipifa :bereades :faaref1-.er' för Amotuagning i 13 460 539 av det HGH-genhaltiga fragmentet som framställts ovan. Sålunda XbaI-uppslöts pTrpl4 och de resulterande kohesiva ändarna uppfylldes med Klenow polymeras I-förfarandet med användning av dATP, dTTP, dGTP och dCTP. Efter fenol- och kloroform- extraktion och etanolfällning behandlades den erhållna DNA med BamHI och det resulterande stora plasmidfragmentet isolerades medelst PAGE och elektroeluering. Det med pTrpl4 erhållna fragmentet hade en trubbig och en kohesiv ände vilket medgav rekombination i rätt orientering med det HGH-genhaltiga fragmentet såsom beskrivits ovanÄ HGH-genfragmentet och pTrpl4 4Xba-BamHI-fragmentet kombinerades och ligerades tillsammans under betingelser som liknade de ovan beskrivna. De fyllda XbaI och EcoRI-ändarna ligerades tillsammans genom ligering vid trubbig ände till återskapande både av Xbal- och EcoRI-ställena: XbaI ifylld EcoRI ifylld HGH-geninitiering --'rc'rAG AATTCTATG* --1rc'rAc;AA'rTcTA'rc-.

--AGATc * TTAAGATAC* --AGA'rc'r'rAAc;A'rAc-- XbaI EcoRI §Denna konstruktion återskapar även den tetracyklinresistenta ¿genen. Emedan plasmiden pHGH 107 uttrycker tetracyklinresi- lstens från en promotor som ligger uppströms från HGH-genen l(lac-promotorn) medger denna konstruktion, som betecknas pHGH :207, expression av genen för tetracyklinresistens under kon- štroll av tryptofan-promoter-operatorn. Ligeringsblandningen V Éomvandlades sålunda till E. coli 294 och kolonier utvalda âP¿apß-plattor innehållande 5,ug/ml tetracyklin;W i i Ifä§PlasmidÄpfl§H207*EcoRI-uppslötsåochAtrp-promotorn-innehållande lflett 300 bI§Å Eco RI-fragment~tillvaratogs$medelst»PAGE åt- i[Q,följtëavåelektroeluerinq} 300 b.p; Eco RI-fragmentet inne- lflflÜhåller§E¿§coliftrp-promotorn, operatornfochntrn-ledarribosom-; É a¿ Éfbinänin@sstållet¿menísaknar§enÄÅTG-sekvensffdr Åfiitiering av ;.i_.._....1==ïl " _; l:y: Dèt;¿a 'a uni-frsgmenfåjknnaaesi mfl: Ecpyfgxt-ggäil ,Nq~,¿' fšLešiÉïA;äy{yï¿ s¿, A l , M ¿m__._« ',_ - ¿yy»¿y_¿ 460 539 14 Det just omnämnda trp-fragmentet är en analog till E. coli tryptofan-operonen från vilken den s.k. trp-attenuatorn ute- lämnats, för att kontrollerbart höja expressionnivåerna. Expres- sionsplasmider innehållande den modifierade trp-regulonen kan odlas till förutbestämd grad i näringsmedia innehållande till- satt tryptofan i mängder som är tillräckliga för att under- trycka promotor-operator-systemet och därefter befrias från tryptofan för att åter undertrycka systemet och förorsaka expression av den avsedda produkten.

Närmare bestämt uppslöts 250/ug plasmid pe31 med Pst I och 1000 b.p. insättningen isolerades genom gelelektrofores på en _5 S polyakrylamidgel. Ungefär 40 pg av insättningen elektro- eluerades från gelen och uppdelades i 3 andelar för vidare uppslutning: a) Ett 16,ug prov av detta fragment uppslöts par- tiellt med 40 enheter Bgl II i 45 minuter vid 37°C och reak- tionsblandningen renades på en 6 polyakrylamidgel. Ungefär 2,ug av det önskade 670 b.p. fragmentet tillvaratogs. b) Ett annat prov (8/ug) av 1000 b.p. Pst I insättningen begränsades med Ava II och Bgl II. Ett pg av det indikerade 150 b.p.-fragmentet tillvaratogs efter gelelektrofores. c) lölug av 1000 b.p.- stycket behandlades med Sau 3a och Ava II. Efter elektrofores på en 10 polyakrylamidgel tillvaratogs ungefär 0,25,ug (unge- fär 10 pmol) av 34 b.p.~fragmentet. De två indikerade deoxi- oligonukleotiderna, 5'-dAATTCATGTGT (fragment 1) och 5'- dGATCACACATG (fragment 2) syntetiserades enligt fosfotriester- förfarandet (Maxam och Gilbert, Methods Enzymol. gå, 499-560 (1980)). Fragment 2 fosforylerades på följande sätt. 200¿u1 (ungefär 40 pmol) ev (7322) ATP (Ametenem, soøo ci/mmei) ; torkades och àtersuspenderades i 30,n1 60 mm tris-H01 (pH 8), il0 mM MgCl2, 15 mM /6-merkaptoetanol, innehållande 100 pmol EDNA-fragment och 2 enheter T4 polynukleotidkinas. Efter 15 minute: vid s1°c tineettee 1,11 io magen» een reaktionen flex: fiortskrida ytterligare 15 minuter. Blandningen upphettades harefter vid 70°C i 15 minuter. kombinerades”medfi100 pmol 5'- Qfišgragment 1 och 10 pmol av 34 b.p. Sau 3 ah- AvaAII-fragmentå ÉI-ä-séringlfutföraee 1 s-tnmner via 4°c 1 'soipi Å2o'L1qu_,,___j~ç1e-ncx I » ¿_._..»......_'í(pn';7dg,§) .jfloimm ngclz, "io mn a1t1etre1to1;*o,5*mn 'ATP-teen io... Å ä I r . )ter.vid"0°C uppbröts cellerna med ultraljud. Proven centr1_ 15 460 559 enheter T4 DNA-ligas . underkastades elektrofores på en 6 polyakrylamidgel och 45 b.p.-produkten tillvaratogs genom elektroeluering. 860.000 Cerenkov cpm tillvaratogs (ungefär 30 ng, l pmol), kombinerades med 0,5/uq (5 pmol) av 150 b.p.

Ava II - Bgl II-fragmentet och llpg (2 pmol) av 670 b.p. Bgl II - Pst I-fragmentet. Ligeringen utfördes vid 2000 i 15 timmar med användning av 20 enheter T4 DNA-ligas. Ligasen inaktivera- des genom upphettning till 65°C i 10 minuter. Blandningen upp- slöts därefter med Eco RI och Pst I för eliminering av polymerer av genen. Blandningen renades genom 6 % polyakrylamidgelelektro- fores. 36.000 cpm (ungefär 0,04 pmol, 20 ng) 865 b.p.-produkt isolerades. Hälften därav (10 ng) ligerades till pBR322 (0,3 Ing) mellan Eco RI och Pst I-ställena. Transformering av Er coli 294 gav 70 tetracyklinresistenta, ampicillin-sensitiva transformanter. Plasmid DNA isolerad från 18 av dessa transfor- manter uppslöts med Eco RI och Pst I. 16 av de 18 plasmiderna hade ett Eco RI-Pst I-fragment 865 b.p. i längd. Enlng av en av dessa, pLe-IF Al, uppslöts med Eco RI och ligerades till ett 300 b.p. Eco RI-fragment (0,l,ug) innehållande E. coli trp-promotorn och trp-ledarribosombindningsstället, framställt såsom beskrivits ovan. Transformanter innehållande trp-promotorn 32?-trp-sond i samband med identifierades med användning av en koloniscreeningsförfarandet enligt Grunstein-Hogness - Grun- stein et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) lå, 3961 (l975L7.

Ett asymmetriskt lokaliserat Xba I-ställe i trp-fragmentet medgav bestämning av rekombinanter vari trp-promotorn var orien- terad i riktning mot Le-IF A-genen. _Extrakt framställdes för IF-analys på följande sätt. Kulturer Éom 1 ml odlades i L-buljong innehållande Slpg/ml tetracyklin ëtill ett A550-värde av ungefär 1,0, varefter de utspäddes i š25 ml M9-media innehållande 5/ug/ml tetracyklin. 10 ml-prov lskördades genom centrifugering när A550 nått 1,0 och cell- :Pé1i§FB .suspenderades i 1 ml 15% sackaros, 50 mM tris-HCl )(pH 8,0), 50 mM EDTA. 1 mg lysozym tillsattes och efter 5 minuï Ifugerades 10 minuter vid 15.000 varv/minut i en Sorvall SM-24-I WrotorlÜInterferonaktivitet i supernatanterna"be-I' ' w: 16 460 539 stämdes genom jämförelse med Le-IF-standarder medelst analys på basis av,inhibering av den cytopatiska effekten (CPE).

För att bestämma antalet IF-molekyler per cell användes en »Le-IF-specifik aktivitet av 4 x 108 enheter/mg [kubinstein et al., Proc. Natl. Acad. Soi. (USA) lá, 640 (l979[Z.

Klon pLe-IF A trp 25, vari trp-promotorn insatts i den önskade orienteringen, ger höga aktivitetsgrader (sá hög som 2,5 x 108 enheter per liter). Den IF som produceras av E. coli K-12 stam 294/pLe-IF A trp 25 uppför sig som autentisk human Le-IF; den är stabil för behandling vid pH 2 och neutraliseras av anti- human leukocyt~antikroppar från kanin. Interferonet har en apparent molekylvikt av ungefär 20.000.

Isolering av CDNA för ytterligare leukocytinterferoner DNA från fullt karaktäriserad Le-IF A cDNA-haltig plasmid , uttogs vid Pst I, isolerades elektroforetiskt och märktes et al., Biochem.

Den erhållna radio- enligt ett publicerat förfarande [Taylor Biophys. Acta. gig, 324 (l976L] med 32P. aktivt märkta DNA användes såsom en sond för att screena ytter- ligare E. coli 294 transformanter enligt ett in situ koloni- soreeningsförfarande, Grunstein et al,. ovan. Kolonier isolera- des, som hybridiserades i varierande mängd till sonden. Plasmid DNA från dessa kolonier och de tio hybridiserande kolonierna :som omnämnts ovan isolerades medelst Pst-skärning och karak- 'täriserades enligt tre olika metoder. Först karaktäriserades ¿slutningsmönster med enzymerna Bgl II, Pvu II och Eco RI.

:Denna analys medgav klassifikation av åtminstone 8 olika typer l 1 x I I ! i z '"% >-__.--< J dessa Pst-fragment enligt deras restriktionsendonukleasupp- i (Le-IF A, Le-IF B, Le-IF C, Le-IF D, Le-IF E, Le-IF F, Le-IF Q och Le-IF H), som approximerar lokaliseringen av olika restri\- tionssnitt i relation till den nu kända försekvensen och kod-I 'ningssekvensen av Le-IF A. En av dessa Le-IF D, antages vara Q identisk med den som rapporteras av Nagata et al., Nature ggiq .rß16<1.2ß.<>_>- i i i _Éör.detyandra testades vissa DNA enligt ett publicerat hybrid Vseringsutvalsanalys}fiCl9veland at al.f Cell ßgf 95 (l980){ D âoch Bgl II för att utesluta självpolymerisation genom Sau 3a- ;:kohesivf§nde). Ett 242 b.p.-fragment isolerades. 1* u 11 460 539 med avseende på förmåga att selektivt avlägsna Le-IF mRNA från poly-A-haltig KG-l cell RNA. Le-IF A, B, C och F var positiva vid denna analys. För det tredje insattes de senare Pst- fragmenten i en expressionsplasmid, E. coli 294 transformerad med plasmiden, och fragmenten uttrycktes. Expressionsprodukter- na, som antages ha varit preinterferoner, var samtliga posi- tiva enligt CPE-analys med avseende på interferonaktivitet trots marginell aktivitet när det gäller Le-IF-F-fragmentet.

Utöver det ovan angivna hade samtliga av de beskrivna Le-IF- typerna sekvenserats.

Andra moget leukocytinterferon Sekvensen av de isolerade fragmenten innefattande genen för moget Le-IF-B visar att de första 14 nukleotiderna av typerna A och B är identiska. Följaktligen föreslogs isolation av _ett fragment från pLe-IF A25 uppvisande trp-promotor-operatorn, ribosombindningsställët och starten för Le4IF (A=B) genen och kombination därav med den kvarvarande delen av B-sekvensen i en expressionsplasmid.

För att erhålla det ungefär 950 b.p. Sau 3a till Pst I-fragmen- tet från den sekvens som visas i fig. 7a var ett flertal steg nödvändiga på grund av närvaron av en eller flera störande Sau 3a-restriktionsställen, dvs.: 1. Följande fragment isolerades: a) ll0b b.p. från Sau 3a till Eco RI; b) 132 b.p. från Eco RI till Xba; c) >700 b.p. från Xba till Pat. 1 E 2. Fragmenten (la) och (lb) ligerades och skars med Xba šoch Xhagändgrupper (det relevanta Sau 3a-stället var inom §ett.Bgl:II-ställe; B91 II avskär till bildning av en Sau 3a -tf di rrodukten fran (2) och (lc).ligerades och skars med ;:'.,.~_;-¿Å_¿,_ 'n - i o “ - » - :.--_ ~ ~ II åter :rl' förr l at? an iiföPh1flë# @;:aäfi äëšïmvmërèßéfiing- ydššéšàfïaso b;p;ffraqmentïqsauêaafitiiiïpgffixïišrig) vall.. 'iønäiiëèf 460 539 18 isolerades. Detta fragment innefattade den del av Le-IF B-genen som inte var gemensam med Le-IF A. 4: Ett ungefär 300 b.p.-fragment (Hind III till Sau 3a) innefattande trp-promotor-operatorn, ribosombindningsställe, ATG-startsignal och cysteincodon från Le-IF A isolerades från pLe-IF A25. 5. Ett ungefär 3600 b.p.-fragment Pst I till Hind III isolerades från pBr 322. Detta innefattade replikonen och k°däÖ9 tetracyklin- men inte ampicillin-resistens. 6. De i stegen 3, 4 och 5 erhållna fragmenten trippel- ligerades och den resulterande plasmiden transformerades till E. coli K-12 stam 294.

Transformanterna miniscreenades, Birnboim et al., Nucleic Acid Research 1, 1513 (1979) och plasmidprov uppslöts med Eco RI.

Uppslutningsprodukterna gav tre fragment karaktäristiska för: 1) Eco RI-Eco RI trp-promotor-fragmentet; 2) Det inre Eco RI till Eco RI-fragmentet av pL4; och 3) proteintransla- tionatartsignalen för Eco RI-fragment av pL4.

Vid CPE-analys gav bakterieextrakt från kloner framställda på föregående sätt vanligen värden av ungefär 10 x 106 enheter linterferonaktivitet per liter vid A550 = 1. En representativ .klen framställd på detta sätt var 294/pLIF B trp 7. ÉYtterligare mogna leukocytinterferoner *Ytterligare genfragment av full längd som innefattar andra ÉLe-IFftyper kan skräddarsys och placeras i expressions- I Avfivehiklar_för expression såsom i fallet Le-IE A. Fullständig fflgekvensering,païkonventione1lt~sätt~visar huruvida ett restrikë ^ _if*itiqqg§çaiiç'¿' ligger' 't'111rac_k11gtf_rnar; aan' »ggçrgçgí f gminqsgyra- i ' g 1 evf-fëëëfiefiílš¥*<ï=flrvffl°9f@i-1fïfif==f°f°=fi¥1°éflhra .för-ff ,ë?fii *íiëšäïfïiïafef in” bekvï. t Yproblemet~genomfanvändnin9JêVf¿ïiminerifi97ayfför-M ll w 460 559 sekvensen genom restriktionsavskärning och âterinsättning av cgdgner för de N-terminala aminosyror som fërloras vid försekvenseliminering genom ligering av ett syntetiskt DNA-fragment, såsom beskrivits ovan. Om detta inte går kan man använda det förfarande som beskrives av Kleid et al., ovan.

I korthet innefattar detta klyvning av det försekvenshaltiga fragmentet precis före den punkt vid vilken codonen för den första aminosyran av den mogna polypeptiden börjar, genom: 1. omvandling av dubbelsträngad DNA till enkelsträngad DNA i en region som omger denna punkt: 2. hybridisering till den enkelsträngade regionen som bildas vid steg (a) av en komplementär primerlänqd av enkel- strängad DNA, varvid 5'-änden av primern ligger mot den nukleotid som förenar det avsedda klyvningsstället; 3. återinförande av den del av den andra strängen som elimine- rats i steg 1, vilken ligger i 3'-riktning från Pfímeffl genom reaktion med DNA-polymeras i närvaro av adenin, tymin, guanin och cytosin-haltiga deoxinukleotid-' trifosfater; samt 4. uppslutning av den kvarvarande enkelsträngade längden av DNA som skjuter ut bortom den avsedda klyvninqs- * punkten.

En kort längd av syntetisk DNA som vid 3'-änden av kodnings- strängen avslutas med en translationsstartsignal ATG kan där-á :efter ligeras med exempelvis trubbändsligering till den resulf Étgggnågfskräddarsydda genen för mogna interferoner och den ' igen som insättas i en expressionsplasmid och bringas under škontroll av en promotor och dess associerade ribosombindnings- å§t511°ff l V Vi w__j Ä@§§d¿f¿ vi \ ¿ V ,.,h*¿ i _:]På¶ettYliknande sätt som det ovan använda konfigurerades fmgšåfišâgwéfiffsom kodar Le-lEfC_oeh.LefIFfD¿pa lämpligt j I.. ~,. . M- rn du A. »,«r_:~-,,~.=-i ,,, »v . A å fiy ¿P;§gtf:örïdirekt;bakter1ellïexpreseion¿gEkpressionstrategin í Vi* örÄdessa¶§tterIigarej eukocvtin'erferoner'innefattade}1wvartf_,,D ...rr 460 559 20 fall användning av det lämpliga 300 b.p.-fragmentet (Hind III till Sau 3a) innefattande trp-promotor-operatorn, ribosombind- ningsstället, ATG-startsignal och cysteincodon av Le-IF A från pLe-IF A25. Till detta kombinerades genfragment från ytterligare interferongener som kodar deras respektive aminosyrasek- venser bortom det initiella cystein som var gemensamt för samt- liga. Varje resulterande plasmid användes för transformering av E. coli K-12 stam 294. Ligeringar till bildning av de respek- tive generna var pá följande sätt: Le IF-C Isolera följande fragment från pLe IF-C: (a) 35 b.p. från Sau 3 a till Sau 96 (b) >9oo b.p. Sau 96 till Pst I (c) Isolera ett ungefär 300 b.p.-fragment (Bind III - Sau 3a) från pLe IF A-25 såsom i del N (4) ovan. (d) Isolera det ungfär 3600 b.p.-fragmentet från del N (5) OVa-n .

Konstruktion: (1) Ligera (a) och (c). Klyv med Bgl II, Hind III och isolera den ungefär 335 b.p.-produkten. :(2) Trippel-ligera (1) + (b) + (d) och transformera E. coli gmed den resulterande plasmiden.

;En representativ klon framställd på detta sätt är E. coli ÅK-12 stam 294/pre IF c crp as. ÉLé-IF D lïsolera från pLe IF-D: V (a) 35 b.p. från Saul3a till Ava II "_ (b) 150 b.p. från Ava II till sgl II ïo (c) ungefär 700 b.p; från Bgl II till Bst I dj' ïlsolera från pLe_IF_A25:_\ _ ëjayësgo bip; f;¿n nina III-till san saafrla figaiaräfifgsn Ps: azáff '* ^ ' ' >“ "" JF* e fufiééfärtis» 3600' :b 4323-) Iffsåê :fiëännd fI1I$ti11§àst_:. 3,) 21 460 539 Konstruktion: (1) Ligera (a) + (b), avskär med Bgl II och rena en 185 b.p.- produkt (l). (2) Ligera (1) + (d), avskär med Hind III, Bgl II och rena den ungefär 500 b.p.-produkten (2). (3) Ligera (2) + (c) + (e) och transformera E. coli med den erhållna plasmiden.

En representativ klon framställd på detta sätt är E. coli» K-12 stam 294/pLeIF D trp ll.

Le-IF F Det Le-IF F-haltiga fragmentet kan skräddarsys för direkt expres- sion genom återuppbyggnad som lätt :ker på grund av kom- plett homologi av aminosyror l-13 från Le-IF B och Le-IF F.

Ett trp-promotor-haltigt fragment (a) med lämpligt konfigurera- de ändar erhålles från pHGH 207, beskrivet ovan, via Pst I och Xba I-uppslutning åtföljt av isolering av det ungefär 1050 b.p.-fragmentet. Ett andra fragment (b) erhålles såsom det större av de fragment som resulterar från Pst I och Bgl II- uppslutning av plasmiden pHKY 10, ett derivat av pBR322 som innehåller ett sgl II-ställe mellan dem tetracyklinreßistenta promotorn och den strukturella genen. Fragment (a) innehåller unge- :fär hälften av den gen som kodar amqicillinresistens; frag- lment (b) innehåller återstoden av denna gen och hela genen lför tetracyklinresistensen bortsett från den associerade promotorn. Fragmenten (a) och (b) kombineras via T4 ligas och gproöukten{ behandlad med Xba [och Bgl II, för eliminering av :dimerisering, bildning av ett fragment (c) innefattande trp- êpromotor-operatorn och gener för tetracyklin- och ampicillin- : %resistensÄ "" I _~Ü*ÃEtt}fragment (d) med ungefär 580;h;p.¿erhalles av Ava_II och H'fßglfliï-uppslutning?avgpnefIF-F{-Detta innefattarkc9doner~för . »flfïàmïfläàwfl9f“?4¿l66¿1;Le-IF_b. ga §ÄV"' " °”)d"'“'"” 1. 1 *%mifléßYte#$3* Psalm nn1flä, r ”v '}nPL¿*I.Fs1@ Biš ïaia'tFräš19§flnš; i<,§ e: :pl f' šfi >fraq=fie:=*¿ i)f:L«fv< e> m1»- ph-fr r ,šrhëlifiß)rífr,sera9#i*diil Xb§ iir irlëšhllavaga-III- t «)r:i'~;)1¿:r~f ) .IÉ 22 460 539 Fragmenten (c), (d) och (e) trippel-ligeras i närvaro av T4 ligas. De kohesiva ändarna av respektive fragment är sådana att den sammansatta plasmiden cirkulerar korrekt och bringar tetracvklinresistensgenen under kontroll av trp-promotor- så att bakterier kan selekteras på operatorn längs genen för moget Le-IF F, transformerade med den önskade plasmiden tetracyklin-haltiga plattor. En representativ klon framställd på detta sätt är E. coli K-12 stam 294/pLeIF F trp l.

Le-IF H Den kompletta Le-IF H-genen kan konfigureras för expression såsom ett moget leukocytinterferon på följande sätt: -1. Plasmid pLe-IF H underkastas Hae II och Rsa I-uppslutning med isolering av de 816 basparfragmenten utgående från signal- Apeptidens aminosyra 10 till den 3'-icke kodande regionen. 2. Fragmentet denatureras och underkastas reparationssyntes med Klenow-fragment, Klenow et al., Proc. Natl. Acad. Soi.

,USA Qâ, 168 (1970), med användning av den syntetiska deoxi- Ü « | fm l É 1 x l 'J ~'_»»-s glfiigg av ett'fragment:V å V I å de ï\9_n~~"" N “,§|irfn . S i 'öisomakodaride_l6§gaminosYtornakitbešlrynr:fkÜ":fÜÉ*'3 ribooligonukleotidprimeni5'-dATG TGT AAT CTG TCT. Detta all- männa förfarande beskrivas även av Goeddel et al., den ameri- kanska patentansökningen l9O 799 av den 25 september 1980, 93. Den erhållna produkten klyves med Sau 3a och ett 452 baspar (“bp")-fragment representerande aminosyror l-150 isoleras. 4Å Sau 3a och Pst I-uppslutning av pLeIF H och isolation av det resulterande 500 b.p.-fragmentet ger en gen som kodar aminosyrorna 150 till slutet av kodningssekvensen. »5lhFragment isolerade 1 steg (3) och 14) ligeras till bild- 1 o 1fi6»l 9 1 " m°t==v= 9 9 <==P~=fi°Ps av ~ f Arc mer .._,,+_..=.§. saw TGaf..... Ps: I -_ Sau 3a'.” r” 1: "l““" lššnwpróàukfien?apPá1uuesImea§às"1: «nefi” :dra za 460 539 erhållna fragmentet kan isoleras och ligeras med produkten från steg (5) till bildning av en expressionsplasmid som efter transformation av E. coli K-l2 stam 294 eller andra värdbakterier kan uttrycka moget Le-IF H.

LeIF-I Fag 2,Gharon 4A rekombinantbiblioteket för den humana genomen som konstruerats av Lawn et al., Cell lä, ll57 (1978), screenades med avseende på leukocytinterferongener enligt förfaranden beskrivna av Lawn et al., ovan, samt Maniatis et al., Cell lä, 687 (1978). En radioaktiv LeIF-sond härrörande från cDNA klon LeIF A (Goeddel et al., ature gål, 411 (1980)) användes för att undersöka ungefär 500. 0 placker. Sex LeIF- genomkloner erhölls på detta sätt. Efter återscreening och plackrening utvaldes en av dessa kloner, ÄHLeIF2, för vidare analys.

Med användning av den ovan beskrivna metoden kan andra sonder användas med fördel för att isolera ytterligare LeIF-kloner från den humana genomen. Dessa kan i sin tur användas för att framställa ytterligare leukocytinterferonproteiner enligt uppfinningen. ' l. De 2000 baspar Eco Rlefragmenten av den genomiska klonen ().HLeIF2) subklonades till pBR325 vid Eco RI-stället. Den I resulterande plasmiden LeIF I klövß med ECO RI och 2000 basparfragmentet isolerades. Deoxioligonukleotiden dAATTCTGCAG (en Eco RI > Pst I konvertor) ligerades till 2000 baspar ' "EoofRI-fragmentet och den resulterande produkten klövs 1 m¿d pgt I för att ge ett 2000 baspar-fragment inne- š*hállande Pet Ieändar. Detta klövs med Sau 96 och ett 1100 _Å baspar-fragment isolerades, som hade en Pst-I-ande och en i@?Sau@§6Üände. b I.. J af' , aï¿2;§Élasmiden pLeIF C trp 35 uppslöts med Pst I ooh Xba I. ” fifërfllilfëflgmaflfi°t*flalfaafïïfirïyl i " i I 1 I 460 539 24 3. Det lilla Xba I - Pst I-fragmentet från pLeIF C trp 35 uppslöts med Xba I och Sau 96. Ett 40 baspar Xba I - Sau 96- fragment isolerades. 4. De fragment som isolerats i stegen 1), 2) och 3) ligerades till bildning av expressionsplasmiden pLeIF 1 trp 1.

LeIF-J l. Plasmiden pLeIF J innehåller ett 3,8 kilobas Hind III- fragment av humant genomiskt DNA som innefattar gensekvensen LeIF J. Ett 760 baspar Dde I - Rsa I-fragment isolerades från denna plasmid. 2. Plasmiden pLeIF B trp 7 klövs med flind III och Dde I , och ett 340 bp Hind III - Dde I-fragment isolerades. 3. Plaßmiden pBR322 klövs med Pst I, trubbändadeš genom inkubering med DNA Pol I (Klenow-fragment), uppslöts därefter med Hind III. Det stora (^v3600 bp) fragmentet isolerades. 4. Fragmenten som isolerades i steg 1), 2) och 3) ligerades till bildning av expressionsplasmiden pLeIF J trp 1.

De metoder och material som användes vid de följande konstruk- tionerna var såsom beskrivits ovan. Tabell I nedan ger detaljer för speciella konstruktioner av hybrid LeIF-plasmider därav; D 460 539 25 .__ =>Q. .Q_. .__ Q>Q_ Q.. .__ ...___ Q... :_ šQ. .F .__ 2,... Qb ... å: Q.. .__ I.

S. 2 .Q ...SQ s. :SQ _< Q_Q_Q 9. :SQ Q< :SQ ä :SQ 3.: .Fu ä :SQ ...__ .F e. ...SQ 2:: m... ä :SQ _ 2.:? __.. :SQ ...Enn-m -.~...ø.$~ä..w wmšmuwufidmæ E.. S.-. ._ Q... ._ :SQ .Q.. ...ö z. Q ...a ._ ...å >m _ iQ-.. ___... ä-. Q.SQ>m __ _:Q-_: E... ._ __... S.-. m.. Qb < :SQ E.. 8.. -_ Q ...a ._ . 3.-.. ...m _ å-.. ä.. ä-. :SQÉ _. 2%... E... ._ .Q.. 8. ..._ __... S.. -_ . Qb _ :S 2... 3 ...a < .SQÉ ..:-..... _ å-.. ...Q S.-. .mflfia ._ . __.. å. ß E.. SQ..

Q :SQ L.. ...__ n... 3 ...a 8.18 _ å-.. ä.. ..-_ < :S ä.. EQ.. å. _.. t... EQ... _ Q.. . :SQ 2... E. S: m... E. 8.-.. _ .QQ _. š.. _.-. _. :S ä: EQ.. å. Q E.. SQ..

Q Q: ._ :SQ LW .S an. m.. a.. . 8.-.. rxamwfimm: ___... S-. < :S en.. ac-. å. ~ ...Q SQ... 3 a.. .. Q.. ._ :QSQÉ _ ä.. _. :SQ ...Inst STS 333.... ...Q S.. flBm. SQ... .å - E.. 8.... ...~ m..

Z m... c ...ÉÉQÉ < m-...Ibm anala...

S73 _ SQ-.. E.. S-. ä. SQ-.. ...__ - .2 S.-. ...__ ä: ä Q... < :SQ 2... .. ß. ._ :SQÉ S72 _ SQ-.. a: ä.. _. 3.... å. .Q E.. S... ...__ 8... .\. _. E. ._ :SQ >m m.. E» ._ :SQÉ 8.-.. . iQ-.. 3.. S-. _. 2..-. å. . _ f Hwmumzzå ...ZQPE HOHMÛ-šl ...UPC »Logz 3.2.... _ Hmflxmfl Awwußouß ønsømmuèfnxu H Üunma. . _ 26 460 539 ka: ..- " A.. .__ _.. ___ .__ .:. __. .__ __. _..

E: =>@_ :>m~ 2.: :>@~ :>L~ 3>m~ :>m~ =>av S>mv uu. mg.

Q.. mg» mßu .ru W.. e..

A..

Q.. om cm nu mo om mn ut... 23.. 3.3.. ...zu 3.3.. m_u.n :Su ut...

:Su ut... . wwfiuwmfi mø~-mm ow~|mm mø.|mm .u.-~u uu.-~u uu.-.u uu.-.u wm_|mm møfinnm u ...Su ...m . 3% .

.Nwmmmm ä mfifisfimn... H än. HU UH E... ä »ändåmn 832. fiBm 3 . âmnuæmflääwunnsdwnwwûwmflfluhåäufißmüuæunuoumtu fioum .m 55Umašäuußwmfl0n«l .å u? a. 3 E. < ...zu ä. 3%.. .uu .à 8.... u :Su cflfl. 3%.. a...

E.. Sms.

.. E. u ßïuucwuw. 3%: a...

.S 8.: . E. _. =>.

.E Su... u.. e.. < ...Su 2.... 3%.. a...

.E 8.... u ...Su 2... 3%: a...

.B 87. . _... u ...Su 2... 3%.. a...

.E 8.:. . ...z u :Buš . .rvfiulm .. E..

.B 8.... u 32.12.... 3%.. E.. :z 8%.

. E. u ut... a.. . 3%.. ___... ~m~|~ ~m|~ Nunn Naufl Nmufl Nmuu ~m|~ ~m|~ ~m|~ Nunn ...u ST.. . u.. . 3.3.. >m : E... 3.., 2.322 . ...a h. ...wa >m .. 2%. å.

E.. 8: . ...u .. 3.3.. a... .. az-. å. .à 8: . E. u 3.3.. >m : 2%. å.

.E 82 . .ru h. ...ju 2... .. ac-. å. ...__ 82 .. .b u :view .. _:%. å. ...__ ä: .. ...a u 3.3.5 .. _.>%. å.

.S 82 .. ...a u.

...Juan .. ut.. å. »nu S... a. . .b u 0:3.. : 2%... E... ...u .nu a. ._ ...a ._ :v15 : 2%... 2....

.Yibí I. Vu l||\i|| cl-Iililulilil uu.

S. uu. uu... uu.

S.

S. u, . uu. _ ._ uu. _ ,¶ _ _ ~ 5 V _ ' ;”pLeIF DA trp (Bgl II): Det stora fragmentet fran en Bgl II VI§ochf§et¶Ifuppslutning av pLeIF D trglllëligerades till ett ';,.{ungefär*]0O;bpšfragment erhållet genom§PstQI+klyvning~av N 460 539 Med ytterligare hänvisning till tabell I har de första fyra beskrivna hybrid.LeIF-mpriderna framsüflhæ avtwå LeIF- expressionsplasmider. Ett Bgl II-ställe som är gemensamt för LeIF A och D cDNA har använts för konstruktion av en expressions- plasmid pLeIF trp AD (Bgl II) som k0dêr för de 63 amin0- terminala aminosyrorna i LeIF A och de 102 karboxiterminala aminosyrorna i LeIF D. Samma ställe användes vid konstruktion av en expressionsplasmid pLeIF trp DA (Bgl II) som kodar de 64 aminoterminala aminosyrorna i LeIF D och 102 karboxi- terminala aminosyror i LeIF A. Pvu II-stället har använts vid konstruktion av två andra hybridinterferonexpressionsplasmider: 91 aminoterminala aminosyror från A med 74 karboxiterminala -aminosyror från D (pLeIF trp AD (Pvu II)) och 92 aminoterminala aminosyror i LeIF D med 74 karboxiterminala aminosyror i LeIF A (pLerF¶trp DA (Pvu II)). sammanfattningsvis: 'pLeIF AD trp (Pvu II): Det stora (f~89DO bp) fragmentet av en Xba I och Pst I-uppslutning av pLeIF A trp 25 ligerades med ett 285 bp Xba I-Pvu II-fragment av pLeIF A trp 25 och ett ungefär 550 bp Pvu II-Pst I-fragment av pLeIF D trp ll; pLeIF DA trp (Pvu II): Det stora (A/3900 bp) fragmentet av en Xba I och Pst I-uppslutning av pLeIF A trp 25 ligerades med :ett 288 bp Xba I-Pvu II-fragment av pLeIF D trp ll och ett ungefär 550 bp Pvu II-Pat I-fragment av pLeIf A trp 25; pLeIF AD trp (Bgl II): Det stora fragmentet från en Bgl II, ÉPst~I-uppslutning av pLeIF A trp 25 ligerades med ett n«60O s, *Ibp~Bgl II-Pst I-fragment från pLeIF D trp ll: och * para A trp 25 aeföijt av p;;tre1rf3g1“rrfqppgiutningq ...-.-_-_~.->...-_... _...,.__'......_.~ ...I__.._ a- . r..,....~_..a.e..ga.à-l..t.._-_.._.r e. _. ._f,...,_ _ -._ WW.. 460 559 28 pLeIF AB trp (Pvu II): Det stora (n«39OO bp) fragmentet av en Xba I och Pst I-uppslutning av pLeIF A trp 25 ligerades med ett 285 bp Xba I - Pzu II-fragment av pLeIF A trp 25 och ett ungefär 750 bp Pvu II (partial)-Pst I-fragment av pLeIF B trp 7.

På liknande sätt definieras de andra konstruktionerna som avbildas i tabell I. Såsom ett ytterligare exempel vid konstruk- tion av en LeIF C och/eller LeIF H-delhaltig hybrid kan man dra fördel av vanliga Bbv I-ställen som förekommer vid unge- fär nukleotid 294 (dvs. GCTGC) i gensekvensen.

På liknande sätt kan man bilda plasmider som är lämpliga för mikrobiell expression av andra nya hybridleukocytinter- feroner genom lämplig manipulering av dUbb81Sfifäfi9äd DNÅ SOM kodar samtliga eller delar av aminosyrasekvenserna i naturligt förekommande leukocytinterferoner. Sålunda utväljes ett första dubbelsträngat DNA-f;agment_som kodar aminoterminalen av en första naturligt förekommande leukocytinterferonaminosyra- sekvens och, fortskridande därifrån 1 3'-riktning,'en väsentlig andel av aminosyrasekvensen därav. Fragmentet innefattar ett restriktionsendonukleasklyvningsställe som är beläget intill codonerna för aminosyra "n" i den första leukocytinterferonen, varvid n aminosyror utgör en väsentlig andel av aminosyra- sekvensen av det första interferonet. Klyvning med restriktione- endonukleas ger ett fragment innefattande aminoterminalen av ,det första interferonet och codoner för ungefär n aminosyror.

Ett andra fragment innefattande samtliga eller en del av codo-7 nerna för aminosyrasekvensen i ett andra; olikartat leukocyt- interferongutväljes, varvid fragmentet innefattande ett klyv- ningsställe för ett identiskt restriktionsendonukleas beläget ïintillmeodoner för denna aminosyra av det andra '_ .lll dnterferonet vars aminosyratal (fortskridande från aminoterm1_ nalen för det andra interferonet) är ungefär l66-n. Klyvning ,§v:det,andra fragmentet med detta restriktionsendonukleas 'af en produkt som är komplementär till den *nilterminala dele _ ÅIsšfiögÉëàšlöfiningsprodukten(av det första fragmentet saïatt uppslut- tii;iihingspro§ukten'av"den,andra¿kanlligerasitillfden¿från*den,första,“ 29 460 539 varvid det restriktionsendonukleasigenkännande stället åter- bildas och codonen för aminosyran n i det första interferonet ombildas, när denna förlorats i den första uppslutningen.

Produkten av restriktionsendonukleasuppslutning av det andra fragmentet fortskrider företrädesvis från den ände som resul- terar vid klyvning i 3'-riktningen genom nukleotider som kodi- fierar karboxiterminalen i det andra leukocytinterferonet.

Alternativt kan man bilda hybrider innehållande väsentliga delar av aminosyrasekvenserna i mer än två naturligt förekommande leukocytinterferoner, i vilket fall exempelvis det andra ovan- nämnda fragmentet ytterligare utväljes så att det innehåller ett andra restriktionsendonukleasställe nedströms från det första, varvid det andra stället är identiskt med ett på lik- nande sätt beläget ställe i ett fragment kodande den kar- boxiterminala delen av ett tredje leukocytinterferon, etc.

I det ifrågavarande exemplet kan produkterna av successiva restriktionsendonukleasoperationer trippel-ligeras till bild- ning av en hybridgen som kodar den aminoterminala delen av ett första interferon, mittdelen av aminosyrasekvensen i det andra och den karboxiterminala delen av det tredje(eller i en annan variation av det första, vari de första och tredje interferonerna är desammà.

Företrädesvis härrör det första ovannämnda fragmentet från en expressionsplasmid, dvs. en vari codonerna för den amino- terminala delen av det första leukocytinterferonet föregås av en ATG eller annan translationsinitierande codon och ett promotor- eller promotor-operator-system. Såsom ett resultat kommer slut-Ä Érodukten av de manipulativa operationer som beskrivas ovan ' att vara en plasmid som kan uttrycka den polypeptid som .

K0dåB av hybridgenen i bakterien eller annan mikrobiell orga- : nismftransformerad med plasmiden. Andra medel för konfigura- É tion av hybridgenen för mikrobiell exfiression är nppenbar för ï V - i;1“r_y: Å Å _ “AN öl lll i a i *¥«.*l; fij* ' ~ _ ,» **i"A j W A Vid dejföredragna utföringsformerna av uppfinningen kodar' Å ;;-;;,hybridgenerna-en ny leukocytinterferonaminosyrasekvens som --4, 460 539 30 innehåller ungefär 165-166 aminosyror utgörande ett konjugat av väsentliga aminosyrasekvenser dragna från 2 eller flera olika leukocytinterferoner utvalda bland gruppen bestående av LeIF A, LeIF B, LeIF C, LeIF D, LeIF E, LeIF F, LeIF G OCh LeIF H såsom återges i fig. 3. Mest föredraget innefattar de nya leukocytinterferonerna som k0dâS av hybrišgenerga .... "_ de aminosyror som specificeras och lokaliseras såsom anges i sekvensen "All" i fig. 3. Expressionsprodukterna av plasmider bildade enligt uppfinningen kan testas med avseende på anti- viral aktivitet på konventionellt sätt såsom vid de biologiska aktivitetsbestämningar som beskrives nedan.

Demonstration av antiviral aktivitet E. Coli K-12 stam 294 transformerades konventionellt med av -varandra plani-deßns æLelF 42129 A .2 S, 91-911" trp D, pLeIF trp A/D (Bgl II) och pLeIF trp D/A (Bgl II).

Transformanterna odlades separat i 5 ml-kulturer i L-buljong innehållande 5 mg/ml tetracyklin till ett värde A550 fär 1,0, och utspäddes därefter i en liter M9-media innehållande Slpg/ml tetracyklin. Celler skördades när A550 nått 1,0 och cellpellets suspenderades i 10 ml 15% sackaros, 50 mM tris- HCl (pH 8,0), 50 mM EDTA. 10 mg lysozym tillsattes och efter 5 minuter vid 0°C uppbröts celler med ultraljud. Proven cen- trifugerades i 10 minuter vid 15.000 varv/minut i en Sorvall SM-24-rotor. Interferonaktivitet i Bupernfltanterna underkastades test med avseende på antiviral aktivitet. av unge- Utbytena per liter kultur av dessa interferoner, titrerade A på en human cell-linje (WISH) anges i tabell 2, varav framgår; att LeIF-A/D-aktiviteten bildades i större mängd än de andra linterferonerna. Denna skillnad kunde bero på en större inne- fboende aktivitet för LeIF-A/D eller på ett större utbyte-ut- }tryckt såsom mg protein av detta interferon. Emedan den gene- iitiska uppbindningen var identisk för alla dessa interferoner förefaller det vara mest sannolikt att Lelg-A/D har väsent- ligen större aktivitet än de andra interferonerna;f fi" ( š l L I v--.-.--~-\..-.~..__..- å. -_¿...._,..,e..... ., .l e. _. ..,...» :dessa cell-linjer. Dessa resultat visar att kombinationen av :den N-terminala delen av LeIF-A och den C-terminala delen av fegenskaperna för moderinterferonerna. Detta framgår klart 460 539 31 Tabell 2 Utbyte av leukocytinterferoner från skakkolvkulturer av E. coli' ïyp interferon Aktivitet utbyte/liter (enheter på WISH)* A 8 x lO7 D 5 x 106 AD (B91 II)' 2 x 108 DA (sgl II) 1 X 106 * bestämd genom inhibering av den cytopatiska effekten på WISH-celler med VSV såsom angreppssubstans.

Potensen av de olika interferonerna inom ett intervall av däggdjurscell-linjer bestämdes (humant, WISH; African green monkey, VERO; hamster fibroblast, BHK; kaninnjurceller, RK-13; mus L-929; och bovinnjure, MDBK-celler). För att jämföra den relativa aktiviteten av interferonerna beräknades deras aktivif tet på olika celler i förhållande till deras aktivitet på WISH-celler som bestämdes såsom 100. Resultaten i tabell 3 visar att LeIF-A/D har mycket hög aktivitet på VERO och L-929-celler, under det att LeIF-D/A har låg aktivitet på LeIF-D inom en molekyl (LeIF-A/D) ger detta hybridprotein .speciell potens som manifesteras på flera däggdjursarter, }Dessa egenskaper är dessutom inte helt enkelt summan av när l ¿det gäller aktiviteten på L~929-celler (tabell 3) i vilket fall harken en blandning av LeIF-A och LeIF-D eller den andra hyb- siden, LeIF-D/A, har signifikant aktivitet. i I . g _ > \ 460 539 n Tabell 3 Titrering av olika leukocytinterferoner i cell-linjer från olika däggdjursarter Leukocytinterferoner* Cell-linje A D A/D D/A A+D Buffy-coat WISH 100 100 lOO l00 100 100 VERO 250 75 1.670 20 200 200 BHK 400 200 833 2.000 400 20 RK-13 12 500 6 N.D. N.D. 120 L-929 150 5 3.300 2 10 0,1 * Interferoner testade gentemot VSV-infektion på de olika cell-linjerna. Aktiviteter uttryckta såsom procent av den aktivitet som iakttages 1 WISH-celler.

Aktiviteten för LeIF-A/D mot andra virusarter undersöktes även.

Uppgifterna i fig. 5 visar antiviral aktivitet gentemot EMC- virusinfektion på L-celler och uppgifterna i fig. 6 visar effekter gentemot VSV-infektion på L-celler. Det är klart av dessa uppgifter att den större aktivzteten för LeIF-A/D inte är begränsad till ett virus (VSV) och dess större aktivitet utgör sannolikt en allmän egenskap gentemot många virusarter.

Naturligt human "buffy-coat" interferonpreparat har ingen effekt gentemot musceller (jämför tabell 2). Aktiviteten för LeIF-A/D gentemot EMC-virusinfektion av CD-l-möss bestämdes därför. Resultaten i fig. 7 visar att LeIF-A/D är extremt *potent gentemot letal EMC-virusinfektion och LeIF-A har även antiviral aktivitet såsom kan förväntas på basis av aktiviteten ii cell-linjerna (tabell 2). Uppgifterna i fig. 7.härrör från I :behandlingar i.p. 3 timmar före infektion. Doseringar av LeIF¿ @A/D~och LeIF-A är såsom titrerade på WISH. 1 ,. - ; f_fA/p'och@LelFfÄ (fig. 8)} varvid den förra är den mest effek- _,} Åtíšwåëshfikuäiyfssstï“inFs?šsr°n uppyisêšiêëšëst en ringa och »ïf3§5§fi¥§Fí§É#§iàå1šnifï¥ënt¿sš?§k#,}Nër¿de#;9ëlleräfi9;ï8*gavs. iLetal¿EMCfvirusinfektion av hamstrar påverkas även av LeIF- Ä . iaiiä*'nfiëgferanar~1.p;gs>fiinm§i”fa;epi§§agg1oa-viajenfaas avrt ,,__¿“_,¿, ._ 'ff ~ ~ *ff f' ~ ~~~~- f e fff-».«_ ._ Vff~ 33 460 559 5 x 105,09/kg, titrerat på WISH-celler.

Dessa resultat visar att de uttalade antivirala effekterna av LeIÉ-A/D vid ett intervall av däggdjursarter inte begränsas till cellkulturer utan iakttages även vid letala virusinfek- tioner.

EMC-virus kan anses utgöra ett modellsystem, en demonstration av antiviral effekt gentemot detta kan förutsäga antiviral effekt gentemot den representerade familjen av virus, t.ex. picornavirusfamiljen till vilken hör mul- och klövsjuka och polio. VSV-virus kan anses utgöra ett modellsystem och en demonstration av antiviral effekt gentemot denna kan anses förutsäga antiviral effekt gentemot den representerade familjen av virusarter, t.ex. rhabdovirusfamiljen av vilken rabies ut- gör en viktig medlem.

Tabell 4 anger aktiviteter för olika LeIF-hybrider på WISH- och MDBK-celler och aktivitetsförhállandena därav: Tabell 4 LeIF-hybrid (PvuII) Enheter/liter Enheter/liter Aktivitets- kultur WISH- kultur MDBK- förhållande celler celler ? WISH/MDB A0 2.4 X 108 4 X 10 6 A0 1.2 X 108 2 X 107 6 Ar 6 X 107 1 X 107 0 A0 4 X 107 1.s X 107 2.7 A1 3.2 X 107 1.2 X 107 2.7 en 1.s X 107 1iX 107 1.s 00 0 X 107 1.5 X 107 4 av 1 X 106 a.s X 105. 0.: _00 2 X 107| s'XA107_" 0.3 f«I0A a X 105 71.2 X 108 0.02s 0.04 2 X 106 '¿sjX,107 460 559 34 Tabell 4 (forts.) 0F-' 2 X 105 4 X 106 0.05 00 2 X 105 1.5 X 107 0.014 FA 2 X 105 6 X 107 0.003 Fa 2 X 106 s X 107 0.025 F0 1 X 107 2 X 107 o.s F0 1 X 105 4 X 107 0.025 1A 2.4 X 106 6 X 107 0.01 A* 0 X 107 1.2 X 108' 0.7 0* 0 X 107 4 X 108 0.2 c* 2 X 107 1.s X 107 1.3 0* s X 106 2.5 X 107 . 0.2 F* ' 2 X 107 2 X 108 0.1 1* X 1.0 X 107 1.2 X 107 1.3 * för jämförelseändamål .Parenteral tillförsel 'De hybrida leukocytinterferonerna enligt uppfinningen kan :tillföras parenteralt till patienter som erfordrar antitumör- :behandling eller antiviralbehandling och till patienter som Éüppvisar immunosuppressiva tillstånd. Dosering och doserings-. šhaatighet kan vara parallell med den som för närvarande an- švändes vid kliniska undersökningar av material härrörande från §mönniska.Xt,ex. ungefär (1-10) x 106 enheter dagligen och när§ det 9fi1ler[material med en renhet som är större än 1 %, sanno-É ilikt upp till exempelvis 5 x 107 enheter dagligen. Preliminära É 777'~indikationer¿vid~stfidier på apa som beskrivits ovan antyder g '_ attfidosefingar av bakteriellt erhållet LeflF kan signifikant 7ïf h§jaå@förf¿törre_effekt beroende på den väsentliga frånvaron ä 7 f å . X .X _ - . ,1 _ 4 -._ ne “°°hf ~+~ i 35 46Û 539 ger ogynnsamma effekter, t.ex. illamående, temperaturförhöj- ning etc.

Såsom ett exempel på en lämplig doseringsform för väsentligen homogent bakteriellt Le-IF i parenteral form som är tillämp- ligt härvid mutatis mutandis, kan 3 mg Le-IF med en specifik aktivitet av ungefär 2 x lO8 enheter/mg lösas i 25 ml 5 N serumalbumin (humant) - USP, varefter lösningen föres genom ett bakteriologiskt filter och den filtrerade lösningen upp- delas aseptiskt i 100 glaskärl, vilka vardera innehåller 6 x 106 enheter rent interferon som är lämpligt för parenteral tillförsel. Glaskärlen lagras företrädesvis i kyla (-20°C) före användning.

Föreningarna enligt uppfinningen kan formuleras enligt kända metoder för framställning av farmaceutiskt användbara komposi- tioner, varvid polypeptiden enligt uppfinningen kombineras i blandning med en farmaceutiskt godtagbar bärarvehikel. Lämp- liga vehiklar och deras formulering beskrives i Remingtons Pharmaceutical Sciences av E.w. Martin, som införlivas härmed såsom referens. Sådana kompositioner innehåller en effektiv mängd av interferonproteinet enligt uppfinningen tillsammans med en lämplig mängd vehikel för framställning av farmaceu- .tiskt godtagbara kompositioner, som är lämpliga för effektiv _tillförsel till patienter. É '_ 'r l 1 i æ f." i å, ,. fi O I 'vn-Q- ÄC.--»«--.-e~;-Q---

Claims (3)

1. 460 559 fzc» PATENTKRAV l. En antiviral polypeptid innehållande 165-166 amino- syror, k ä n n e t e c k n a d därav, att aminosyrasekvensen i polypeptiden i följd innehåller avskilda subsekvenser som med avseende på aminosyraidentitet och antal motsvarar väsent- liga andelar av subsekvenser av olika; naturligt förekommande leukocytinterferoner, varvid aminosyrasekvensen i polypeptiden skiljer sig med avseende på total komposition från aminosyrasek- vensen i naturligt förekommande leukocytinterferoner.

2. Polypeptid enligt patentkravet 1, k ä n n elt e c k n a d därav, att den N-terminala delen därav väsentligen består av aminosyror l-92 i LeIF-D och att den karboxiterminala delen därav väsentligen består av aminosyror 92-165 i LeIF-A.

3. Polypeptid enligt patentkravet l, k ä n n e t e c k n a d därav, att den N-terminala delen därav väsentligen består av aminosyror 1-91 i LeIF-A och att den karboxiterminala delen därav väsentligen består av aminosyror 93-166 i LeIF-D¿ 4. Polypeptid enligt patentkravet l, k ä n n e t e c k n a d därav, att den N-terminala delen därav väsentligen består av aminosyror 1-63 i LeIF-D.och den karboxiterminala delen därav .väsentligen består av aminosyror 63-165 i LeIF-A.~ 5. Polypeptid enligt patentkravet l, k ä n n e t e c k n a d Vdärav, att den N-terminala delen därav väsentligen består av _ ïaminosyrorfl-62 i LeIF-A och den karboxiterminala delen därav ïväsentligen består av aminosyror 64-166 1 LeIP~D. ' ?6§fPoly§eptid enligt patentkravet l,:k ä n nue t e c.k n a d ¶Édärav,7att den N-terminala delen därav väsentligen består av Ü I ltåamindsyrorfl-91 i LeIF-A och den karboxiterminala delen därav I L f V . i t _ : vi šl väsentligen består av aminosyror 93-166 i LelF-B, 5¶7¿iPplyoe§tid enligt oatentkravet l, k ä n n ett e_c kfn and 6' ih 6 tt den N-terminala_delen däravdväsentligenäbestår av_Å r f.;pflelFiDAfltrpg(Pvn II); ' -llilšrfïipläßmifi aA°tY=ifï främ gruppen bsßficående av i vrf-flere* AB 11» 460 539 aminosyror l-91 i LeIF-A och att den karboxiterminala delen därav väsentligen består av aminosyror 93-166 i LeIF-F. 8- Dußbelsträngat DNA innefattande en sträng som kodar en polypeptid enligt något av patentkraven l-5. 9- Dubbelsträngat DNA, k ä n n e t e c k n a t därav, att det iflfleffifitär en sträng som kodar en polypeptid enligt något av patentkraven 6 och 7. 10. Replicerbar plasmidisk expressionsvehikel som i en trans- formant mikroorganism kan uttrycka en polypeptid enligt något ¿ av kraven IFS. =ll.nReplicerbar plasmidisk expressionsvehikel som i en trans- -formant^mikroorganism kan uttrycka en polypeptid enligt något av kraven 6 och 7. 12. Transformant,mikroorganism innehållande expressionsvehikeln .enligt patentkravet_l0. ' ,l3.lTransformant mikroorganism innehållande expressionsvehikeln :enligt patentkzavet 11. \c 114. En plaamid utvald från gruppen bestående av pLeIF AD trp (ßg1¶I:)v;pLen- Alin-p (Pvu II) , pLeIF n trp (ßgl n) och i111vvä{;iï att §LeIFVAFÜ(Pvu Ii); »* g:- ._ , É. I 1 a - l v ' . -v s; 1: ßfwtva* =edärav,§a§tjdet innefattar: 460 559 3¶ 'delen av nämnda interferon och, åtskiljt i 3'-riktningen däri- från, ett första restriktionsendonukleasklyvningsställe; b. klyvning av nämnda fragment med nämnda restriktionsendo- .nukleas; c. utval av ett andra .dubbelsträngat DNA-fragment som kodar .hela eller en väsentlig andel av aminosyrasekvensen i ett andra olikartat naturligt förekommande leukocytinterferon, varvid det »andra fragmentet innefattar ett identiskt restriktionsendonukleas- V^klyvningsställe,_som är väsentligen identiskt beläget med av- seende påfaminosyranumreringen av de två interferonerna och som dessutom bortom nämnda ställe innefattar kodoner för den karboxi- terminalašdelen av det andra interferonet; d.1klyvning av det andra fragmentet med nämnda restriktions- endonukleas; och e. ligering av restriktionsendonukleasuppslutningsprodukter från stegen b och d för àterbildning av nämnda restriktione- andonukleaaställe och bildning av ett hybridfragment som i sekvens innefattar kodoner för den aminoterminala delen av det Éöratalinterferonet och den karboxiterminala delen åv det sandra. i'l7ÉäEörfa;ande för framställning av en antiviral polypeptid enlištÄnŧot av patentkraven'l-7; k ävn nie t^e e k'n“a-ti “_ . ¿aL$tillfdrse1ïav~det hybridaeDNA+f * arsa; ' “ i “q 460 559 18. Farmaceutisk komposition innehållande en terapeutiskt V ~~~ effektiv mängd av en polypeptid enligt något av patentkraven*:t l-7 och en farmaceutiskt godtagbar bärarvehikel. V ~'