NL8105078A - Hybride menselijke leukocyt-interferons. - Google Patents

Description

* > L * N.0. 3Ο.555 -1-._ ^

Hybride menseli.ike leukocyt-interferons .♦

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op .de microbiële bereiding, via recombinant DM-technologie, van hybride leukocyt-in-terferons voor toepassing bij de behandeling van virale en neoplas-tische ziekten en op de middelen en eindprodukten van een dergelijke 5 bereiding.

Achtergrond van de uitvinding.

Relatief homogene leukocyt-interferons zijn afgeleid van leu-kocyten van normale of leukemische donors. Deze interferons zijn een groep van proteïnen, die gekenmerkt worden door. een krachtig vermo-10 gen een tegen virus bestand zijnde toestand inhöndoelcellen te verlenen. Bovendien kan interferon fungeren om celproliferatie te remmen en immuun reactie te regelen. Deze eigenschappen hebben het klinische gebruik van interferon als een therapeutisch middel voor de behandeling van virusinfekties en kwaadaardige ziekten ingegeven.

1.5 Meer recent is de recombinant DM-technologie toegepast om de microbiële produktie van een aantal verschillende leukocyt-interferons, waarvan de aminozuurvolgorden de ordegrootte van 70?i> homologie laten zien, de één betrekking hebbend op de ander, alle zoals beschreven door David Y. Goeddel c.s, [Nature 290, (1981), 20-26] te 20 veroorzaken. Genen, die de aminozuurvolgorden coderen van verschillende leukocyt-interferons onder andere aangeduid als respectievelijk lelE A, B, C, D, F, G en H, worden verkregen uit de celreeks EG-1 beschreven door Koeffler, Ξ.Ρ. en Golde, D.W. [Science 200, (1978), 1153-1154] volgens David V. Goeddel en Sidney Pestka. De celreeks 25 EG-1 is gedeponeerd bij de "American type culture collectiori', ATCC toelatingsnummer CRI 803I· Dergelijke genen, op geschikte wijze ontplooid in plasmideachtige dragers voor bacteriële expressie, kunnen worden toegepast om gastheerbacteriën te transformeren, bij voorkeur E. coli E-12 stam 294» American type culture collection toelatings-30 nummer 31448, gedeponeerd 28 oktober 1978.

Het werkpaard van de recombinant DM-technologie is het plasmi-de, een non-chromosomale lus van dubbelstrengig DM aangetroffen in bacteriën en andere microben, vaak in veelvoudige kopieën per cel. Opgenomen in de in het plasmide DM gecodeerde informatie is die ver-35 eist om het plasmide in dochtercellen (dat wil zeggen een "replicon") en gewoonlijk, één of meer selectie-eigens^ha^en^i^als^in het geval van bacteriën, resistentie tegen antibiotica,*die het mogelijk maken klonen van de gastheercel, die het plasmide van interesse bevat- 8105078 κ - *

‘ - .- -2- --A

ten en bij voorkeur ie laten herkennen in selectieve media· te - ' groeien. De gebruiksmogelijkheden van piasmi den liggen in het feit, dat zij specifiek gesplitst worden door een of ander restric- tie-endonuclease of "restriotie-enzym,V, die elk een Verschillende 5 plaats op het plasmide-achtige DNA herkennen. Daarna kunnen hetero- loge genen of genfragmenten opgenomen worden in het piasmi de door eindstandige vereniging bij de splitsingsplaats of bij geherstruktu- reerde einden, die grenzen aan de splitsingsplaats. DNA-recombinatie wordt buiten de cel uitgevoerd, maar het verkregen "recombinant"- 10 plasmide kan erin worden ingevoerd volgens een werkwijze, bekend als transformatie en grote hoeveelheden van het verkregen heterologe gen ' kunnen worden verkregen bevattende r ecombmant-pl asmi de- door de transformant te doen groeien; Bovendien kan, wanneer het gen op geschikte wijze is opgenomen onder verwijzing naar gedeelten van het plasmide, die de transcriptie en 15 omzetting van de gecodeerde DNA-boodschap sturen, de verkregen ex-, pressiedrager gebruikt worden om feitelijk de polypeptidevolgorde voort te brengen, waarvoor het opgenomen gen codeert, een werkwijze, die wordt aangeduid als expressie.

Expressie wordt geïnitieerd in een gebied bekend als de promo-20 tor, die herkend wordt door en gebonden wordt door ENA-polymerase.

In sommige gevallen worden, zoals in de tryptofaan of "trp" promotor, die bij de uitvoering van de onderhavige uitvinding de voorkeur verdient, promotorgebieden overlapt door ,,operator"-gebieden onder vorming van een gecombineerde promotor-operator. Operators zijn DNA-25 volgorden, die herkend worden door zogenaamde repressorproteïnen, die dienen om de frequentie van transcriptie-initiëring bij een bijzondere promotor te regelen. Het polymerase plant zich voort langs het DNA, óndèc overschrijving van de informatie,. aanwezig in de code-ringsstreng van het 5'-einde ervan tot het 3'-einde ervan in bood-50 schapper ENA, die op zijn beurt vertaald wordt in een polypeptide met de aminozuurvolgorde, waarvoor het DNA codeert. Elk aminozuur wordt gecodeerd door een nucleotide triplet of "codon", waarbinnen voor de onderhavige doeleinden kan worden verwezen naar het "struk-turele gen", dat wil zeggen dat gedeelte, dat de aminozuurvolgorde 35 van het geëxprimeerde produkt codeert. Na het binden aan de promotor schrijft het RNA-polymer&se eerst nucleotiden over, die een ribosoom bindingsplaats coderen, vervolgens een vertalingsinitiering of "start"-signaal (gewoonlijk ATG, dat in de resulterende boodschapper HNA AUG wordt), daarna de nucleotide codons binnen het strukturele 40 gen zelf. Zogenaamde stopcodons worden getranscribeerd bij het einde 8105078 % -3-

% I

van het strukturele gen, waarna de polymerase een additionele volgorde van boodschapper ΕΝΑ kan vormen, die, vanwege de aanwezigheid van het stopsignaal, door de ribosomen niet vertaald zal blijven. Ei-bosomen binden aan de bindingsplaats, die verschaft wordt op de 5 boodschapper ENA, in bacteriën gewoonlijk naarmate het mBNA wordt gevormd, en brengen zelf het gecodeerde polypeptide voort, beginnende bij het vertalingsstartsignaal en eindigende bij het hiervoor vermelde stopsignaal. Het gewenste prodokt wordt voortgebracht, wanneer de volgorden, die de ribosoom-bindingsplaats coderen, op ge-10 schikte wijze geplaatst zijn met betrekking tot het AÏÏG initiatorco-don en wanneer alle overblijvende codons het initiatorcodon in fase volgen. Het resulterende produkt kan verkregen worden door de gastheercel en het produkt door geschikte zuivering van ander bacterieel proteïne te winnen.

15 Korte samenvatting van de uitvinding.

Nucleotide volgorde-onderzoekingen van genen, die de verschillende leukocyt-interferons coderen, openbaren een gemeenschapsplaats onder verschillende ervan met betrekking tot de aanwezigheid en lo-katie van splitsingsplaatsen, die herkend worden door bijzondere res-20 trictie-endonucleasen. Volgens de onderhavige uitvinding kan van. deze gemeenschappelijkheid voordeel worden getrokken voor het vormen, door DNA-recombinatie, van nieuwe hybride genen, die geschikt zijn bij de microbiële bereiding van hybride leukocyt-interferons, waarvan verwacht kan worden, dat deze in meerdere of mindere mate de an-25 tivirus en andere eigenschappen van interferons, gecodeerd door de -oudergenen, bezitten. Bij voorkeurs-uitvoeringsvormen van de uitvinding kunnen dergelijke hybride leukocyt-interferons een verbeterde activiteit vertonen met betrekking tot die, die door de oudergenen zijn gecodeerd.

30 De ouder-leukocyt-interferongenen, die de hierin beoogde fami lie van leukocyt-interferonproteïnen coderen, vertonen van individu tot individu natuurlijke allelische variaties. Deze variaties kunnen gedemonstreerd worden bij een aminozuurverschil of aminozuurverschil-len in de totale protexnevolgorde of door doorhalingen, substituties, 35 invoegingen, inversies of toevoegingen van een aminozuur of aminozuren in deze volgorde. Yoor elk ouderleukocyt-interferon ervan, gemerkt LelP A, LelE B ... Lei? J, enz., zijn dergelijke allelische variaties opgenomen binnen het kader van het merkteken of de uitdrukking, die dit en derhalve de onderhavige uitvinding definiëren.

40 ' · 8105078 »; · 5 -4- - '

De wijze waarop deze en andere oogmerken en voordelen van de uitvinding worden verkregen, zal verder duidelijk worden uit de gedetailleerde beschrijving die volgt en uit de hijgevoegde figuren, waarin: 5 fig. 1 nucleotide volgorden van de coderingsgebiedei van 8 leu- kocyt-interferon ("LelF") complementaire DNA ("cDNA") klonen beschrijft. Hiervan is één., overeenkomstig aangeduid als LelF E, een schijnbaar ."pseudogen", dat geen actief 1eukocyt-interferon codeert, terwijl een ander, aangeduid als LelF & minder dan de volledige 10 volgorde voor de overeenkomstige interferonsoorten bevat. Het ATS vertaalbaar init i ërings co don en het eindstandige triplet voor elke LelF is onderstreept.

Fig. 2 stelt restrictie-endonucleasekaarten voor van acht typen LelF gekloonde cDNA's (A tot en met H)· PIasmiden, die de klonen be-15 vatten, werden geconstrueerd door de dC:dG staartmethode [Goeddel, D.Y. c.s. Nature 287, (1980), 411 - 416]· Daarom kunnen de cDNA-inlassen weggenomen worden onder toepassing van Pst I, dat wil zeggen elk einde van elke inlas is een Pst I restrictie-endonucleasesplit-singsplaats. De lijnen aan het einde van elke cDNA-inlas stellen de 20 flankerende homopolymere dC:dG-staarten voor. De plaatsen van Pvu II, Boo RI en Bgl II restrictieplaatsen·zijn aangegeven. Beschaduwde gebieden van de figuur stellen de coderingsvolgorden voor van volwassen LelF's; de kruislings gearceerde gebieden geven signaalpeptide-coderingsvolgorden aan en de open gebieden laten 3' en 5' noncode-25 rende volgorden zien.

Fig. 3 is een vergelijking van de acht LelF protelnevolgorden voorspeld uit de nucleotide volgorden. De éénletterige afkortingen aanbevolen door de IUPAC-IDB commissie over biologische nomenclatuur zijn gebruikt: A, alanine; C, cysteine; D, asparaginezuur; E, gluta-30 minezuur; F, fenylalanine; G, glycine; Ξ, histidine·; I, isoleucine; K, lysine; L, leucine; M, methionine.; N, asparagine; P, proline; Q, glutamine; R, arginine; S, serine; T, threonine; V, valine; ¥, tryp-tofaan en Y, tyrosine. De getallen verwijzen naar de aminozuurposi-tie (S verwijst naar signaalpeptide). Het streepje in de 165 amino-35 zuur LelF A-volgorde bij positie 44 is ingevoerd om de LelF A-volg-orde in lijn te brengen met de 1.66 aminozuurvolgorden van de andere LelF's. De LelF E-volgorde werd bepaald door; negering van hef extra nucleotide (positie 187 van fig., 1) in het coderingsgebied ervan. De sterretjes wijzen op in-fase eindstandige codons. Aminozuren, die ge-40 meenschappelijk zijn voor alle LelF's (met uitsluiting van het pseu- 8105078 -5- ' * 1 dogen IeIF E) zijn eveneens aangegeven. De onderstreepte residuen zijn aminozuren, die eveneens aanwezig zijn in menselijk fibroblast-interferon.

Onder verwijzing naar fig. 1 corresponderen nucleotiden +1 tot 5 69 met S1 - S23 aminozuren van fig. 3· Codon TGT (nucleotiden 70 -72) van fig. 1 komen overeen met cysteine (C, aminozuur 1) van fig.

3* In fig. 3 komt de Pvu. II restrictie endonuclease splitsingsplaats voor tussen de codons voor aminozuren 92 en 93 in LelF 1, B, D, F en-G, dat wil zeggen tussen nucleotiden 34-6 en 347 van fig. 1.

10 In fig. 4 worden de aminozuurvolgorden van volwassen leukocyt- interferons A en II vergeleken, een doorhaling van aminozuur 44 in.

IeIF A ia daarbij aangegeven door streepjes. Alleen die IeIF D aminozuren, die verschillen van overeenkomstige amino zuren van IeIF A zijn voorgesteld; de aminozuurvolgorde van IeIF D is overigens iden-15 tiek met IeIF A. Fig. 4 geeft eveneens de relatieve positie aan op het overeenkomstige gen van Bgl II en Pvu II restrictie endonuclease splitsingsplaatsen, die worden toegepast bij de vorming van hybride leukocyt-genen van de uitvinding, die de voorkeur verdienen.

De fig. 5 en 6 lichten de resultaten toe van de vergelijkende 20 beproeving van een hybride leukocyt-Interferon van de uitvinding ("LelF-A/D'OQP activiteit tegen encefalomyocarditis-virus ("EMC') en blaasachtige stomatitisvirus ("YSY"), respectievelijk in muiscellen.

De fig. 7 en 8 stellen de resultaten voor van vergelijkende proeven, met inbegrip van DeIF-A/D en andere interferons tegen EMC-25 virusinfekties bij respectievelijk muizen en hamsters. De gegevens in fig. 7 resulteren uit intraperitoneale behandelingen 5 uren voor de inf-ektie. Doses van LeIF-A/D en LeIF-A worden getitreerd bij WISH-cellen.

Fig. 9 verschaft de DM-volgorden van vijf LelF-proteïnen hier-30 van, met inbegrip van de typen I en J.

Beschrijving van de voorkeurs-uitvoeringsvormen.

Toegeoaste microörganismen.

Het beschreven werk hield het gebruik in van twee microörganis-men: E. coli x1776, zoals beschreven in het Amerikaanse octrooi-35 schrift 4*190.495 en E. coli K-12 stam 294 (einde A, thi”, hsr”, hsm^), zoals beschreven in het Britse octrooischrift 2.055-382. Elk is gedeponeerd bij de American Type Culture Collection, ATCC ontheffing nummers 31537 en 31446, gedeponeerd 3 juli 1979 respectievelijk 28 oktober 1978. Alle recombinant DM-werk werd uitgevoerd overeen-40 komstig de toepasselijke richtlijnen van de National Institutes of 8105078 - ' . -6- 1 ί·

Health.

De uitvoering wordt in de uitvoeringsvormen, die het meest de voorkeur verdienen, beschreven onder verwijzing naar E. coli, met inbegrip van niet alleen de stammen 33. coli· x 1776 en E. coli K-12 5 stam 294, zoals hiervoor gedefinieerd, maar ook andere bekende E. co- li-stammen zoals E. coli B, of andere microbiële stammen, waarvan vele gedeponeerd en (eventueel) verkrijgbaar zijn bij erkende micro- ' organisme" deponeringsinstellingen, zoals the American Type Culture Collection, ATCC (zie de ATCC-kataloguslijst en eveneens het'Duitse 10 Offenlegungsschrift 2.644*432). Tot deze andere microörganismen behoren bijvoorbeeld Bacilli, zoals Bacillus subtilis en andere entero-bacteriaceae, waaronder als voorbaalden vermeld kunnen worden Salmonella typhimurium en Serratia marcesans, onder toepassing van plasmiden, die heterologe genvolgorden daarin kunnen repliceren en exprimeren.

15 Gist, zoals Saccharomyces cervisiae, kan ook met "voordeel worden toegepast als gastheerorganisme' bij de bereiding van de interferon-protelnen hiervan door exprimeren van genencodering daarvoor onder de controle van een gistpromotor.

De LelE-hybriden worden volgens de onderhavige uitvinding be-20 reid door voordeel te trekken van restrictie endonuclease splitsings-plaatsen, die gewoonlijk gelokaliseerd zijn binnen de individuele oudergenen en elk einde daarvan geconjugeerd met dezelfde plaatsen in dragerexpressieplasmiden (vectoren). Bijvoorbeeld kan het grote (aj 3900 bp) fragment van een Xba I tot Pst I ontsluiting van het 25 pLelE A trp 25 expres si eplasmi de afgebonden worden met Xba I tot

Pvu II en Pvu II tot Pst I ont slui tings fragment en van de verschillende LelE-oudergenen voor het verschaffen van expressieplasmiden, die exploiteerbaar zijn voor het verkrijgen van het overeenkomstige hybride LelE.

30 Elk lelÉ-expressieplasmide werd onafhankelijk geconstrueerd met ont sluitingsfragment en, geïsoleerd uit verschillende LelF-plasmiden, bijvoorbeeld pLelE A trp 25, pLelF B trp 7, pLelE C trp 35, pLelE D trp 11, pLelE E trp 1, pLelE G, pLelE H én plelE I, enz., waarvan de constructie beschreven is in Nature- ëSJy '( 1980) of uit pBR322, 35 waarvan de constructie beschreven is in Gene 2, 95 (1977)· In bepaalde van deze plasmiden betekent '’trp" een tryptofan-promotor -operatorsysteem, dat het meest de voorkeur verdient voor bacteriële expressie, zoals beschreven in de Europese octrooiaanvrage 36776. Direkte expressie van een eerste volledig ontwikkeld leükooyt-inter-40 feron. ' 8105078 * - Λ \ -7-

De gevolgde methode om Le-IP A direkt uit te drukken als een volledig ontwikkeld interferon-polypeptide hield de combinatie in van synthetische (l-eindstandig) en complementaire DÏTA's.

Een Sau 3a restrictie ëndonucleaseplaats is doelmatig gelokali-5 seerd tussen codons 1 en 2 van Le-IE A. Twee synthetische deöxyoligo-nucleotiden werden ontworpen, die een ATG vertaalbaar initiëringsco-don opnemen, het codon voor aminozuur 1 (cysteine) herstellen en een Eco EI klevend einde vóórtbrengen. Deze oligomeren werden afgebonden tot een 34 b.p. Sau 5a - Ava II fragment van pi31 * Het resulterende 10 45 b.p. produkt werd afgebonden tot twee additionele DUA-fragmenten voor het construeren van een 865 basispaar synthetis ch-natuurlijk hybride gen, dat codeert voor le-IE A en dat gebonden is door Eco EI en Pst I restrictieplaatsen. Dit gen werd opgenomen in pBE322 tussen de Eco EI en Pst I-plaatsen voor het geven van het plasmide 15 -pLe-IE A1.

Plasmide., pGM1 draagt het E. coli tryptofan operon, dat de doorhaling ΛΙΕ1413 [G.E. Miozzari e.s., J. Bacteriology 155. (.1978)., 1457 - 1466] bevat en dientengevolge een fusieproteïne uitdrukt, dat de eerste 6 aminozuren van de trp-leider en ongeveer het laatste der-20 de van het trp E polypeptide (hierna aangeduid in conjunctie als IE'), alsmede het trp D polypeptide in zijn geheel bevat, alle onder de controle van het trp promotor-operatorsysteem. Het plasmide, 20 yug,. werd ontsloten met het restrictie-enzym Pvu II, dat het plasmide splitst op vijf plaatsen. De genfragmenten werden vervolgens ge-25 combineerd met EcoEI-verbindingsmiddelen (bestaande uit een zelf-complementair oligonucleotide van de volgorde: pCATGAATTCATG), waarbij een EcoEI-splitsingsplaats verschaft wordt voor een latere kloon-vorming tot een plasmide, dat een EcoEI-plaats bevat. De 20 yug van DÏTA-fragmenten verkregen uit pGM1, werden behandeld met 10.eenheden 50 T^ DSA-ligase bij aanwezigheid van 200 pico mol van het 5'-gefosfo-ryleerde synthetische oligonucleotide pCATGAATTCATG en in 20 ^ul T^ DUA ligasebuffer (20 mmol trls, pH 7,6, 0,5 mmol ATP, 10 mmol MgClg, 5 mmol dithiothreitol)bij 4°c gedurende de nacht. De oplossing werd vervolgens 10 minuten tot 70°C verwarmd om de afbinding te stoppen.

35 De verbindingsmiddelen werden gesplitst door EcoEI-ontsluiting en de fragmenten, nu met EcoEI-einden werden gescheiden onder toepassing van 5% polyacrylamidegel-elektroforese (hierna "PAGE") en de drie grootste fragmenten werden uit de gel geïsoleerd door eerst te kleuren met ethidiumbromide, de fragmenten te lokaliseren met ultravio-40 let licht en uit de gel de van belang zijnde gedeelten te snijden.

8105078 -8-

Elk gelfragment, met 300 midroliter 0,1xTBE, werd in een dialysezak geplaatst en onderworpen aan elektroforese bij 100 7 gedurende één . uur in .0,1xTBE buffer (TBE-buffer bevat: 10,8 g trisbase, 5,5 S hoor-zuur, 0,09 g NagEDTA in 1 liter HgO). Dé water bevattende oplossing 5 werd uit de dialysezak verzameld, met fenol geëxtraheerd, met chloroform geëxtraheerd en 0,2 M natriumchloride gemaakt en het MA wérd ^ in water teruggewonnen na precipitatie met ethanol. Eet trp promotor- operator bevattende gen met EcoRI klevende einden werd geïdentificeerd bij de hierna beschreven procedure, die de opname omvat van ! 10 fragmenten in een voor tetracycline gevoelig plasmide, dat na pro-motor-operatoropname, tegen tetracycline bestand wordt.

Plasmide pBRHI (R.I. Rodriguez c.s., Nucleic Acids Research 6, [1979] » 3267 - 3287) exprimeert ampicilliheresistentie en bevat’ het gen voor tetracyclineresistentie maar exprimeert die resistentie 15 niet omdat er geen samenhangende promotor is. Het plasmide is dientengevolge gevoelig voor tetracycline. Door invoering van een promo-tor-operatorsysteem in. de EcoRI-plaats, kan het plasmide tegen tetracycline bestand worden gemaakt.

pBRHI werd ontsloten met EcoRI en het enzym werd verwijderd 20 door extraktie met fenol gevolgd door extraktie met chloroform en werd in water gewonnen na precipitatie met ethanol. Het verkregen DNA-molecuul werd, in gescheiden reactiemengsels, gecombineerd met elk van de drie DNA-fragmenten zoals hiervoor verkregen en afgebon-• den met DNA ligase zoals hiervoor beschreven. Het in het reactie-25 mengsel aanwezige DNA werd gebruikt om competente E. Coli È-12 stam 294 (E. Backman c.s,, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 21, [1976], 4174 - * 4198 volgens standaardtechnieken te transformeren (Y. Hershfield c.s., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 21, [1974]» 3455 - 3459) en de bacteriën als laag aan te brengen op IB-platen, die 20 yug/ml ampicil-30 line en 5 yUg/ml tetracycline bevatten. Terschillende tegen tetracycline bestand zijnde kolonies werden geselecteerd, plasmide DNA werd geïsoleerd en de aanwezigheid van het gewenste fragment werd bevestigd door restrictie-enzymanalyse. Het verkregen plasmide wordt aangeduid als pBRHtrp.

35 Een EcoRI en BamHI ontsluitingsprodukt van het virale genom van hepatitis B werd verkregen volgens gebruikelijke methoden en tot kloonvorming gebracht in de EcoRI en BamHI plaatsen van plasmide pGHG (D.Y. Goeddel c.s., Nature 281, [1979], 544) voor de vorming van het plasmide pHS32. Plasmide pHS32 werd gesplitst met Xbal, met 40 fenol geëxtraheerd, met chloroform geëxtraheerd en met ethanol ge- 8105078 -9- ' ' preeipiteerd. Het werd vervolgens behandeld met 1 ^ul E. coli polymerase I, KLenow fragment (Boehringer-Mannheim) in 30 ƒul polymerase-buffer (50 mmol kaliumfosfaat pH 7,4? 7 mmol MgOlg, 1 mmol β-mercap-toëthanol), die 0,1 mmol dTTP en 0,1 mmol dCTP bevat gedurende 30 5 minuten bij 0°C en daarna 2 uren bij 37°C· Deze behandeling veroorzaakte dat twee van de vier nucleotiden complementair met het 5 ' uitstekende einde van de Xbal splitsingsplaats werden ingevuld: 5' CTAGA- 5 * CTAGA- ’ ' -> 31 £- 3 r · rjjQip- 10 Twee nucleotiden, dC en dT, werden opgenomen en gaven een einde met twee 5' uitstekende nucleotiden. Dit lineaire residu van plas-mide pHS32 (na extraktie met fenol en chloroform en winning in water na precipitatie met ethanol) werd gesplitst met EcoEI. Het grote plasmidefragment werd gescheiden van het kleinere EcoEI-Xbal frag-15 ment door PAGE en werd na elektro-elutie geïsoleerd. Dit DMA-fragment van pHS32 (0,2 jv.g), werd onder soortgelijke omstandigheden als die hiervoor beschreven gebonden aan het EcoRI-Taq I fragment van het tryptofan operon (^0,01 jug), afkomstig van pBEHtrp.

Bij de werkwijze van het verbinden van het fragment van pHS32 15 aan het EcoRI-Taq. I fragment, zoals hiervoor beschreven, wordt het Taq. I uitstekende einde verbonden met het Xbal overblijvende uitstekende einde, zelfs hoewel het niet volledig Vatson-Crick basis gepaard is: -T CTAGA- --TCTAGA- — + 20 -AGC TCT- -AGCTCT-

Een deel van dit verbindingsreactiemengsel werd getransformeerd iri E. coli 294 cellen, met warmte behandeld en als laag aangebracht op LB-platen, die ampicilline bevatten. 24 Kolonies werden geselecteerd, werden in 5 uil DB media gekweekt en het plasmide werd afge-25 scheiden. Bij zes ervan bleek de Xbal-plaats ontwikkeld te zijn via met E. coli gekatalyseerd DMA herstel en kopievorming: -TCTAGA- -TCTAGA- -AGCTCT- -AGATCT-

Deze plasmiden bleken eveneens te splitsen met zowel EcoEI als 30 Hpal en de verwachte restrictiefragmenten te geven. Eén plasmide, aangeduid met pTrp 14 werd gebruikt voor’’1expressie van heterologe polypeptiden, zoals hierna besproken.

8105078 -10- ^

Het piasmi de pHGH 107 (D.V. Goeddel c. s., Nature, 281, Γ19791» 544) bevat een gen voor menselijk groeihormoon samengesteld nit 23 aminozuurcodons voortgebracht nit synthetische DNA-fragmenten en 163 aminozuurcodons verkregen uit complementair DM voörtgebracht ' 5 via omgekeerde transcriptie van menselijke groeihormoonboodschapper RNA. Dit gen bevat , hoewel de codons van de "pre" volgorde van menselijk groeihormoon ontbreken, een ATG vert alings ini t i ërings c o don.

Het gen werd geïsoleerd uit 10 pig pHGH 107 na behandeling met EcoRI gevolgd door E. coli polymerase I KI enow fragment en dTTP en dATP 10 zoals hiervoor beschreven. Na extraktie met fenol en chloroform en precipitatie met ethanol werd het plasmide behandeld met BamHI.

Het menselijk groeihormoon ("HGH") gen bevattende fragment werd geïsoleerd door PAGE gevolgd door elektro-elutie. Het resulterende DNA-fragment "bevat ook de eerste 350 nucleotiden van het tegen tetra-15 cycline "bestand zijnde strukturele gen, maar mist het tetracycline-promotor-operatorsysteem, zodat, wanneer vervolgens gekloond wordt tot een expressieplasmide, piasmiden, die de inlas bevatten, gelokaliseerd kunnen worden door het herstel van de bestandheid tegen tetracycline. Doordat het EcoRI-einde van het fragment is ingevuld 20 volgens de Klenow polymerase I methode, heeft het fragment één stomp en één klevend einde, dat een geschikte oriëntatie waarborgt bij latere opname in een expressieplasmide.

Het expressieplasmide p5?rp14 werd vervolgens gereed gemaakt om het HGH-gen bevattende fragment, zoals hiervoor bereid, te ontvangen.

25 Derhalve werd pTrp14 met Xbal ontsloten en de verkregen klevende einden werden ingevuld met de Klenow polymerase I methode onder toepassing van dATP, dTTP, dGTP en dCTP. Ha extraktie met- fenol en chloroform en precipitatie met ethanol werd het verkregen DM behandeld met BamHI en het verkregen grote plasmidefragment werd geïsoleerd 30 door PAGE en elektro-elutie. Het van!pTrp14 afgeleide fragment had één stomp en één klevend einde, wat de recombinatie in geschikte oriëntatie mogelijk maakt met het HGH-gen, dat het hiervoor beschreven fragment bevat.

Het HGH-genfragment en het pTrp14 AXba-BamHI-fragment werden 35 gecombineerd en tezamen verbonden onder omstandigheden, die soortgelijk zijn aan die hiervoor "beschreven. De ingevulde Xbal en EcoRI-einden werden met elkaar verbonden door stomp eindeverbinding voor het herscheppen van zowel de Xbal als de EcoRIplaats: 8105078 -11-

> I

Ingevuld Xbal Ingevuld EcoEI HGE genji.nitiëring -ICTAG AAÏTCTATG -TGTAGAATTCTATG-— —AGATC TTAAGAÏAC --AGATCTÏAAGATAC-

Xbal EcoEI

Deze constructie herschept eveneens het gen met bestandheid te- ..

5 gen tetracycline. Aangezien het plasmide pHGH 107 bestandheid tegen tetracycline exprimeert uit een promotor, die stroomopwaarts ligt van het HGH-gen (de lae-promotor), maakt deze constructie, aangeduid met pHGH 207, exprimering mogelijk van het gen voor bestandheid tegen tetracycline onder de controle van de tryptofan-promotor-opera-10 tor. Derhalve werd het afbindingsmengsel getransformeerd in E. coli 294 en werden kolonies geselecteerd op EB-platen, die 5 yug/ml tetra-cycline b evatten.

Plasmide pHGH207 werd met EcoEI ontsloten en de trp-promotor, die een 300 b.p. EcoEI-fragment bevatte, werd gewonnen door PAGE ge-15 volgd door elektro-elutie. Eet 300 b.p. EcoEI-fragment bevat de E. coli trp-promotor, operator en trp leider ribosoom-bindingsplaats, maar mist een ATG-volgorde voor de vertalingsinitiëring. Dit DHA-fragment werd gekloond in de EcoEI-plaats van pLe-IE A.

Het zo juist aangehaalde trp-fragmënt is een analoog van het 20 E. coli tryptofan-operon, waaruit de zogenaamde trp-verdunner is doorgehaald om de expressieniveau's op regelbare wijze te verhogen. Expressieplasmiden, die het gemodificeerde trp-regulon bevatten, kunnen gekweekt worden tot vooraf bepaalde niveau's in voedingsmedia, die extra tryptofan bevatten in voldoende hoeveelheden om het promo-25 tor-operatorsysteem te onderdrukken, daarna worden beroofd van tryptofan, om de onder drukking van het systeem op te heffen en de expressie van het beoogde produkt te doen plaats hebben.

Meer in het bijzonder werden 250 yug plasmide pL31 ontsloten met Pst I en de 1000 b.p. inlas werd geïsoleerd door gelelektrofore-30 se op een 6 polyaerylamidegel. Ongeveer 40 yug inlas werden geëlek-troëlueerd uit de gel en verdeeld tot 3 evenmatige hoeveelheden voor verdere ontsluiting: a) een monster van 16 ^ug van dit fragment werd ten dele ontsloten met 40 eenheden Bgl II gedurende 45 minuten bij 37°G en het reactiemengsel werd gezuiverd op een 6 polyaerylamidegel.

55 Ongeveer 2 yug van het gewenste 670 b.p. fragment werden gewonnen, b) Een ander monster (8yug) van de 1000 b.p. Pst I inlas werden beperkt met Ava II en Bgl II. Eén y-ug van het aangegeven 150 b.p. fragment werd gewonnen na geleiektroforese. c) 16 /ug van het 1000 b.p.

8105078 -12- * stuk werden behandeld met Sau 3a en Ava II. Ha elektroforese op een 10 polyacryl amidegel werd ongeveer 0,25 ^ug (/u10 pmol) van het 34 b.p. fragment gewonnen. De twee aangegeven deoxyoligonucleotiden, 6'-dAATTCATGTGT (fragment 1) en 5'-d GATCACACATG (fragment 2) werden 5 bereid volgens de fosfotriëstermethode (Maxam en Gilbert,' Methods Enzymol. 6£, [1980], 499 - 560). Fragment 2 werd als volgt gefosfo-ryleerd. 200 jv.1 (/\j4Ö pmol) (jr^P) ATP (Amersham, 5000 Ci/mmol) werden gedroogd en opnieuw gesuspendeerd in 30 yul 60 mmol Tris-HCl (pH 8), 10 mmol MgClg, 15 mmol β-mercaptoëthanol, die 100 pmol BHA-10 ' fragment en 2 eenheden T4 polynucleotide kinase bevatten. Ha 15 minuten bij 37°C werd 1 yul 10 mmol ATP toegevoegd en werd de reactie nog eens 15 minuten voortgezet. Het mengsel werd vervolgens 15 minuten tot 70°C verwarmd, gecombineerd met 100 pmol 5'-OH fragment 1 en 10 pmol van het 34 b.p. Sau 3a - Ava II fragment. Verbinding werd 15 gedurende 5 uren uitgevoerd bij 4°C in 50 yul 20 mmol Tris-HCl (pH 7,5) 10 mmol MgClg, 10 mmol dithiotreitol, 0,5 mmol ATP en 10 eenheden T4 BHA ligase. Het mengsel werd aan elektroforese onderworpen op een 6 polyaorylamidegel en het 45 b.p. produkt werd door elektro-elutie gewonnen. 860.000 Cerenkov cpm werden gewonnen (n> 30 ng, 20 1 pmol), werden gecombineerd met 0,5 yng (5 pmol) 150 b.p. Ava II -Bgl II fragment en 1 yug (2 pmol) 670 b.p. Bgl II - Pst I fragment. Be verbinding werd bij 20°C gedurende 16 uren uitgevoerd onder toepassing van 20 eenheden T4 DHA ligase. Be ligase werd geïnactiveerd door 10 minuten te verwarmen tot”"65°C. Het mengsel werd vervolgens 25 ontsloten met Eco EI en Pst I om polymeren van het' gen te elimineren. Het mengsel 'weFdTge zuiver d door 6% po lyacryl ami degel- el ekt r o f o-rese. 360.000 cpm (ru 0,04 pmol, 20 ng) 865 b.p. produkt werden geïsoleerd. Be helft hiervan (10 ng) werd gebonden in pBR322 (0,3 yug) tussen de EcoEI en Pst I plaatsen. Transformatie van E. coli 294 gaf 30 70 tegen tetracycline bestand zijnde, voor ampicilline gevoelige trans formant en. Piasmi de DHA geïsoleerd uit 18 van deze transformanten werd ontsloten met EcoEI en Pst I. 16 Van de 18 plasmidén hadden een EcoEI -Pst I fragment 865 b.p. in lengte. Eén /Ug van één met / daarvan, pLe-IF A1 ,· werd ontsloten J2coRI en verbonden aan 300 b.p.

35 EcoEI fragment (O,1 ^ug), dat.de Ξ. coli trp-promotor en trp-leider ' ribosoom bindingsplaats bevatte, bereid zoals hiervoor beschreven.

Transformanten, die de trp-promotor bevatten, werden geïdentificeerd 32 onder toepassing van een P-trp-monster in samenhang met de Grunstein-Hogness kolonie zeefprocedure—Grunstein c.s. [Proc. Hatl. 40 Acad. Sci. (ïïSA) (1975), 5961]· Een asymmetrisch gelokaliseerde 8105078 -13-

Xba I plaats in het trp-fragment maakte de bepaling van recombinanten mogelijk, waarin de trp-promotor georiënteerd was in de richting van het Le-IP A gen.

Extrakten voor IP-bepaling werden als volgt bereid. Kultures 5 van 1 ml werden gekweekt in I vloeistof die 5 ^ug/ml tetracycline bevatte, tot een van ongeveer 1,0 en werden vervolgens verdund in 25 ml M9 media, die 5. yug/ml tetracycline bevatten. Monsters van 10 ml werden verzameld door centrifugeren wanneer A^q 1,0 bereikte en celkorrels werden gesuspendeerd in 1 ml 13% sucrose, 50 mmol 10 Tris-HCl (pH 8,0), 50 mmol EDTA. Eén mg lysozyme werd toegevoegd en na 5 minuten bij 0°C werden cellen gebroken door geluidsgolven. De monsters werden 10 minuten bij 15*000 omwentelingen pér minuut gecentrifugeerd in een Sorvall SM-24 rotor. De interferon-activiteit in de bovenstaande vloeistoffen werd bepaald door vergelijking met 15 Le-IP normen door de remmingsproef voor het cytopatische effekt (CPE). Yoor het bepalen van het aantal IP-moleculen per cel werd een Le-IP specifieke activiteit van 4x10 eenheden/mg gebruikt [Rubinstein c.s., Proc. Matl. Acad. Sci. (ïïSA) 76, (1979)> 640].

Kloon pLe-IP A trp 25» waarin de trp-promotor was opgenomen in 20 de gewenste oriëntatie, geeft hoge activiteitsniveau's (zoals 2,5x g 10 eenheden per liter). Het IP, geproduceerd door E^ coli K-12 stam 294/pLe-IP A trp 25 gedraagt zich als authentiek menselijk Le-IP; het is stabiel ten opzichte van een behandeling bij een pH van 2 en wordt geneutraliseerd door konijnen anti-menselijk leukocyt antili-25 chamen. Het interferon heeft een schijnbaar molecuulgewicht van ongeveer 20.000.

Isolatie van cDHA's voor additionele leukocyt-interferons.

DRA van het volledig gekenmerkte le-IP A cDÏTA bevattende plas-mide werd weggenomen met Pst I, werd elektroforetisch geïsoleerd en 30 werd volgens een gepubliceerde methode [laylor c.s., Biochem.

70

Biophys. Acta. 442, (1976), 324 met 5 P gemerkt. Het verkregen ra-dio-actief gemerkte DMA werd gebruikt als een monster om additionele E. coli 294 transformanten te zeven volgens een in situ kolonie-zeefmethode, Grunstein'c.s., zie hiervoor. Kolonies werden geïso-35 leerd, die hybridiseerden in verschillende hoeveelheden ten opzichte van het monster. Plasmide DMA uit deze kolonies en de tien hiervoor gehybridiseerde kolonies werden geïsoleerd door Pst-snijding en werden gekenmerkt door drie verschillende methoden. Eerst werden deze Pst-fragmenten gekenmerkt door hun restrictie endonuclease-ontslui-40 tingspatronen met de enzymen Bgl II, Pvu II en EcoRI. Deze analyse 8105078 - ' * -14- / N . . .

maakte de klassificatie mogelijk van ten minste acht verschillende -typen (Le-IP A, Le-IP B, Le-IP C, Lê-IP D, Le-IP E, Le-IP P, Le-IP G en Le-IP H), die de lokatie van verschillende restrietïe-afsnijdingen "benaderen in verband met de nu bekende voorvolgorde en code-5 ringsvolgorde van Le-IP A. Eén daarvan, Le-IP D, wordt verondersteld identiek te zijn met die vermeld door Nagata c.s., Nature 284> (1980), 316.

In de tweede plaats werden bepaalde van de DNA’s beproefd volgens een gepubliceerde hybridiseringsselectieproef, Cleveland .c.s., 10 Cell 20, (1980), 95» °P het vermogen selectief Le-IP mRNA uit poly-A bevattend KG-1 cel RNA te verwijderen. Le-IP A, B, C en P waren bij deze bepaling positief. In de derde plaats werden de laatste Pst-fragmenten opgenomen in een expressieplasmide. E. coli 294 werd getransformeerd met het plasmidé en dé fragmenten werden geëxprimeerd. 15 Be expressieprodukten, waarvan verondersteld wordt dat zij pre-inter-ferons waren, waren alle positief volgens de CPE-bepaling óp inter-feronactiviteit, zij het marginaal actief in het geval van het Le-lP-P-fragment. Naast het voorgaande waren alle beschreven Le-IP-typen in sekwentie gebracht.

20 Tweede volledig ontwikkeld leukocyt-interferon.

Be volgorde van het geïsoleerde fragment, dat het gen voor volledig ontwikkeld Le-IP-B bevat, laat zien, dat de eerste veertien nucleotiden van de typen A en B identiek zijn. Wij stelden dienovereenkomstig voor een fragment te isoleren uit pLe-IP A25·, dat de trp-25 promotor-operator, ribosoom bindingsplaats en het begin van het

Le-IP (A=B) gen draagt, en dit te combineren met het resterende deel van de B-volgorde in een expressieplasmide.

Voor het verkrijgen Van het benaderde 950 b.p. Sau 3a aan Pst I fragment uit de volgorde, zoals aangegeven in fig. 7a, waren ver-30 schillende trappen noodzakelijk vanwege de aanwezigheid van één of meer interveniërende Sau 3a restrictieplaai;sen, dat wil zeggen: 1. De volgende fragmenten werden geïsoleerd: a) 110b b.p. uit Sau 3a aan EcoRI5 b) 132 b.p. uit EcoRI aan Xba; 35 c) >700 b.p. uit Xba aan Pst.

2. Pragmenten (la) en (1b) werden verbonden en gesneden met Xba en Bgl II om zelf-polymerisatie uit te sluiten door Sau 3a en Xba eindstandige groepen (de relevante Sau 3a-plaats was binnen een Bgl

Il-plaats* Bgl II snijdt en laat een Sau 3a klevend einde achter).

40 Een 242 b.p.-fragment werd geïsoleerd; 8105078 * / , { -15- 3· Het produkt van (2) en (lc) werd verbonden en gesneden met Pst I en 23 gl XI, opnieuw om zelf-polymerisatie te voorkomen. Een benaderd 950 b.p.-fragment, Sau 3a aan Pst I van fig. 7a werd geïsoleerd. Dit fragment bevatte dat gedeelte van het Le-IP B-gen, dat 5 niet gemeenschappelijk was met Le-IP A.

4· Een benaderd 300 b.p.-fragment (Hind III aan Sau 3a), dat de trp promotor-operator, de ribosoom bindingsplaats, het ATG-start-signaal en het cysteïnecodon van Le-IP A bevatte, werd geïsoleerd uit pLe-IP A25.

10 5* Een benaderd 3600 b.p.-fragment Pst I aan Hind III werd ge ïsoleerd uit pBr 322. Dit bevatte het replicon en gecodeerd tetracycline, maar geen bestandheid tegen ampicilline.

6. De fragmenten verkregen bij de trappen 3, 4 en 5 werden drievoudig verbonden en het verkregen plasmide werd getransformeerd 15 in E· coli K-12 stam 294-

Transformanten werden aan een minizeefbehandeling onderworpen, Birhboim c.s., Nucleic Acid Research 2» (1979), 1513 en plasmide-monsters werden ontsloten met EcoRI. Ontsluitingen gaven drie fragmenten kenmerkend voor: 20 1) Het Eco RI-Eco RI trp-promotorfragment; 2) het inwendige

EcoRI aan EcoRI-fragment van pL4 en 3) proteïne verlatend startsig-naal aan EcoRI-fragment van pL4·

Bij de CEE—bepaling leveren bacteriële ertrakten uit klonen, bereid op de voorafgaande wijze, gewoonlijk 10 x 106 eenheden inter-25 feron activeert per liter op bij Α^0=1 . Eén op deze wijze bereide kloon is 294/pLIP B trp 7· _ _ ______________ ______

Andere volledig ontwikkelde leukocvt-interferons.

Additonele genfragmenten van volle lengte, die andere Le-IP-typen bevatten, kunnen pasklaar gemaakt worden en geplaatst worden 30 in expressiedragers voor expressie zoals in het geval'van Le-IP A. Volledige volgordevorming volgens gebruikelijke methoden zal onthullen of een restrictieplaats voldoende dicht bij het eerste aminozuur-codon van het volledig ontwikkelde interferontype ligt om een doelmatige toevloed mogelijk te maken voor de toegang onder toepassing 35 van de eliminatie van de voorvolgorde door restrictiesnijding en vervanging van codons voor de N-eindstandige aminogroepen, die verloren gaan bij de voorvolgorde-eliminering door verbinding van een synthetisch DNA-fragment, zoals hiervoor beschreven. Ontbreekt dat, dan kan de methode beschreven in Kleid c.s., zie hiervoor, worden toege-40 past. In het kort omvat dit splitsing van het voorvolgorde bevatten- 8105078 -- -16- ' _ de fragment juist voor het punt, waarbij het codon voor het eerste aminozuur van het volledig ontwikkelde polypeptide begint, door: 1# omzetting van het dubbelstrengige DNA tot een enkelstrengig DNA in een gebied, dat dat punt omgeeft $ 5 2. hybridisering aan het enkelstrengige gebied gevormd bij trap (a) van een complementaire inleiderlengte van een enkelstrengig DNA, waarvan het'5'-einde van de inleider tegenover het nucleotide ligt, dat grenst aan de beoogde splitsingsplaats; 3· herstel van dat deel van de tweede streng, geëlimineerd bij 10 trap 1, die in de 3’-richting ligt van de inleider door reactie met DNA-ροlymerase bij aanwezigheid van adenine, thymine, guanine en cytosine bevattende deoxynucleotide-trifosfaten; en 4. ontsluiting van de resterende enkelstrengige lengte van DNA, die uitsteekt buiten het beoogde splitsingspunt.

15 Een korte lengte van synthetisch DNA, dat eindigt, bij het 3'-einde van de coderingsstreng, met het vertalingsstartsignaal ATG, kan vervolgens, verbonden worden door, bijvoorbeeld stompeindige verbinding aan het verkregen pasklaar gemaakte gen voor de volledig ontwikkelde interferons en het gen kan opgenomen worden in een ex-20 pressieplasmide en onder de controle worden gebracht van een promotor en de daarmee samenhangende ribosoom bindingsplaats.

Op een Soortgelijke wijze als hiervoor toegepast werden genfragmenten, die le-IE-C en le-IE-D coderen, op geschikte wijze geconfigureerd voor direkte bacteriële expressie. De expressiestrate-25 gie voor deze additionele leukocyt-interferons omvat, in elk geval, het begeven naar het benaderde 300 b.p.-fragment (Hind III aan.Sau 3a), dat de trp promotor-operator, ribosoom bindingsplaats, ATG-startsignaal en cysteinecodon van Le-IE A uit pLe-IE A25 bevat. Hieraan werden genfragmenten gecombineerd uit de additionele interferon-30 genen, die hun respectievelijke aminozuurvolgorden buiten het initiële cysteine, dat voor alle gemeenschappelijk is, coderen. Elk resulterend plasmide werd gebruikt om E. coli K-12 stam 294 te transformeren. Verbindingen om de respectievelijke genen te vormen waren als volgt:

35 De If-C

Isoleer de volgende fragmenten uit pLe IE-C: (a) 35 b.p. uit Sau 3a aan Sau 96. * (b) >900 b.p. Sau 96 aan Pst I.

(c) Isoleer een benaderd 5OO b.p.-fragment- (Hind III - Sau 3a) uit 40 pLe IE A-25 zoals in deel N (4) hiervoor.

8105078 * » » -17- (d) Isoleer het benaderde 36OO b.p.-fragment uit deel H (5) hiervoor. Constructie: (1) Verbindt (a) en (c). Splits met Bgl II, Hind III en isoleer het benaderde 355 b.p.-produkt.

5 (2) Verbindt drievoudig (l) + (b) + (d) en transformeer E. coli met het resulterende plasmide.

Een representatieve kloon, die op deze wijze is gemaakt, is E. coli K-12 stam 294/pLe IE C trp 35·

Le-IE I) 10 Isoleer uit pLe IE-D: a) 35 b.p. uit Sau 3a aan Ava II.

b) 150 b.p. uit Ava II aan Bgl II.

c) Benaderd JOÖ b.p. uit Bgl II aan Pst I.

Isoleer uit pLe IE A25: 15 d) 300 b.p. uit Hind III aan Sau 3a.

Isoleer uit PBr 322: e) benaderd 3600 b.p. uit Hind III aan Pst I.

Constructie.

(1) Verbindt (a) + (b), snij met Bgl II en zuiver een 185 b.p.-20 produkt (1).

(2) Verbindt (1) + (d), snij met Hind III, Bgl II en.zuiver het benaderde 500 b.p.-produkt (2).

(3) Verbindt (2) + (c) + (e) en transformeer E. coli met het resulterende plasmide.

25 Een representatieve kloon, die op deze wijze is bereid, is E.' coli E-12 stam 294/pLeIE D trp 11.

Le-IE E

Het Le-IE E bevattende fragment kan pasklaar worden gemaakt voor direkte expressie door herverzameling geschikt gemaakt door de 30 volledige homologie van aminozuren 1-13 van Le-IE B en-Le-IE E. Een trp promotor bevattend fragment (a) met geschikt geconfigureerde einden wordt verkregen uit hiervoor beschreven pHGH 207 via Pst I en Xba I ontsluiting gevolgd door isolering van het benaderde 1050 b.p.-fragment. Een tweede fragment (b) wordt verkregen als de grotere van 35 de fragmenten resulterend uit Pst I en Bgl II ontsluiting van het plasmide pHKT 10, een derivaat van pBR322, dat een Bgl II-plaats bevat tussen de tetracycline resistentiepromotor en het strukturele gen. Fragment (a) bevat ongeveer de helft van de gen coderende am-picillineresistentie; fragment (b) bevat de rest van dat gen en het 40 totale gen voor tetracycline-resistentie behalve de geassocieerde 8105078 > ' ' -18- promotor. Fragmenten (a) ©n (b) worden gecombineerd via T4 ligase en het produkt. wordt behandeld met Xba I en Bgl XI om dimerisatie te elimineren, onder vorming van een fragment (c), dat de trp promotor-operator en genen voor tetracycline en ampi’eilline resistentie be-5 vat. -

Ben fragment (d) van ongeveer 580 b.p. wordt verkregen door Ava II en Bgl II ontsluiting van pLe IF-F. Dit bevat codons voor aminozuren 14-166 van Le-IF F.

Een fragment (e) (49 "b»p·) wordt'verkregen door Sba I en Ava 10 II ontsluiting van pLe-IF B. Fragment (e) codeert aminozuren 1-15 van Le-IF F.

Fragmenten (c), (d) en' (e) zijn drievoudig verbonden bij de aanwezigheid van T4 ligase. De cohesieve einden van dë respectievelijke fragmenten zijn zodanig, dat-de plasmidesamenstelling juist 15 circuleert, waarbij het tetracycline resistentie^en onder de controle wordt gebracht van de trp promotor-operator tezamen met het gen voor volledig ontwikkeld Le-IF F, zodanig dat bacteriën, die getransformeerd zijn met het gewenste plasmide, geselecteerd kunnen worden op tetracycline bevattende platen. Een representatieve kloon, die op 20 deze wijze is bereid, is E. coli K-12 stam 294/pIiélF F trp' 1.

Le-IF Ξ.

Het volledige Le-IF H-gen kan geconfigureerd worden voor expressie als een volledig ontwikkeld leukocyt-interferon als volgt: 1. Plasmide pLe-IF H wordt aan Hae II en Hsa I ontsluiting on-25 derworpen met isolatie van. het 816 basispaarfragment, dat zich uitstrekt van het signaalpeptide-aminozuur 10 tot het 3’ niet coderende gebied.

2. Het fragment wordt gedenatureerd en onderworpen aan herstel- ' synthese met KIenow-fragment, Klenow c.s., Próc. ïïatl. Acad. Sci. USA

30 65. (1970), 168, onder toepassing van de synthetische deoxyriboöligo-nucleotide-inleider 5'-dATG TGT AAT CTG TOT. Deze algemene methode wordt eveneens beschreven door Goeddel c.s., ÏÏ.S. Serial nr. 190799» ingediend 25 september 19.80.

3. Het verkregen produkt wordt gesplitst met Sau 3a en een 452 35 basispaar ("bp") fragment, dat geïsoleerde aminozuren 1 - 150 voorstelt.

4· Sau 3a en Pst I ontsluiting van pLelF H en isolering van het verkregen 500 b.p.-fragment geeft een gen - 'dat "aminozuren 150 'tot het einde van de coderingsvolgorde.codeert.

40 5· Fragmenten geïsoleerd bij de trappen (3) en (4) worden ver- 8105078 -19- bonden onder vorming van een fragment: 1 166 met cys asp stop

ATG TGT . .· -)- ... GAT TGA .... Pst I

5 San 3a dat de 166 aminozuren van Le-IF H codeert.

6. pLelF A trp 25 wordt ontsloten met Xfaa I, stonpeindig. gpnazkbmet DHA-polymerase I .en het produkt wordt ontsloten met Pst I. Eet grote resulterende fragment kan · geïsoleerd en verbonden worden met het 10 produkt van trap (5) onder vorming van een expressieplasmide, dat na transformatie van E. coli K-12 stam 294 of andere gastheerbacte-riën, in staat is volledig ontwikkeld iie-IF H te exprimeren.

LeIF-I

De fage \ Charon 4A recombinant bibliotheek van het menselijk 15 genom geconstrueerd door lawn c.s., Cell 15. (1978)» 1157» werd gezeefd op leukocyt-interferon'genen volgens methoden .beschreven door lawn c.s., zie hiervoor en Maniatis c.s,, Cell (1978), 687. Een radioactief LelF-monster afkomstig van de cMA-kloon IeIF A (Goeddel c.s., Hature 287, (1980), werd gebruikt om ongeveer 500.000 plaatjes 20 te zeven. Zes LelF genomklonen werden bij deze uit ze ving verkregen.

Ha herzeving en plaat jeszuivering werd één van deze klonen, ^HLeIF2, uitgekozen voor verdere analyse.

Onder toepassing van de hiervoor beschreven methode kunnen andere monsters met voordeel gebruikt worden om additionele LelF-klo-25 nen uit het menselijk genom te isoleren. Deze kunnen op hun beurt worden toegepast voor het voortbrengen van additionele leukocyt-interferonproteïnen volgens de onderhavige uitvinding.

1. Het 2000 basispaar EcoRI-fragment van de genomische kloon (XHDeXFZ) werd aan- een subkloonbehandeling onderworpen in pBR325 bij 30 de EcoRI-plaats. Het resulterende plasmide LelF I werd gesplitst met EcoRI en het 2000 basispaarfragment werd geïsoleerd. Het deoxyoligo-nucleotide dAATTCTGCAG (een EcoRI > Pst I convertor) werd gebonden aan het 2000 basispaar EcoRI-fragment en het verkregen produkt werd gesplitst met Pst I, waarbij een 2000 basispaarfragment verkregen 35 werd, dat Pst I einden bevat. Dit werd gesplitst met Sau 96 en een 1100 basispaarfragment werd geïsoleerd, dat één Pst I einde en één Sau 96 einde heeft.

2. Het plasmide pLelF C trp 35 werd ontsloten met Pst I en Xba I. Het grote fragment werd geïsoleerd.

40 3* Het kleine Xba I - Pst I fragment uit plelP C trp 35 werd 8105078 .-- " ' -20- ontsloten mei Xba I err Sau $6. Ben 40 basispaar Xba X - Sau 96 frag-. ment werd geïsoleerd.

4. De fragmenten geïsoleerd bij de trappen 1), 2) en 3) werden verbonden onder vorming van het expressieplasmide pLelF I trp 1.

5 ' BelF-J

1. Het plasmide pLelF J bevat een 3,8 kilobasis Hind ΪΓΙ-fragment van menselijk genomisch Mi, dat de LelF J genvolgorde bevat. Een 76Ο basispaar Bde I - Rsa I fragment werd uit dit plasmide ge- . N, isoleerd.

10 2. Het plasmide pLelE B trp 7 werd gesplitst met Hind III en

Dde I en een 340 b.p. Hind III - Dde I fragment werd geïsoleerd.

3. Het plasmide pBR3Si2 werd gesplitst met Hst I, stcmpeindig ganaëcb door inkubatie met DNA Pol I (KIenow-fragment) en vervolgens ontsloten met Hind III. Het grote (oj3600 bp) fragment werd geïsoleerd.

15 4· Fragmenten geïsoleerd bij trappen 1), 2) en 5) werden ver bonden onder vorming van het expressieplasmide pLelF J trp 1.·

Be methoden en produkten toegepast in de volgende constructies waren zoals in de voorafgaande beschrijving. Be volgende tabel A geeft de details voor bijzondere constructies van hybride LelE plas-20 miden hiervan.

8105078 <21- ρΓ ρΓ 1η η Η Η Η Η d d Η γ| £ > to £ pH ft Ή ft X—V ^ ft ft ft Ρ*

.· 1 , HKHHS£SSS

S?£ 9? gg 9¾ 3¾ 9η 5 3 « 3 ' += © ·Η ft .(¼ r ^ Γ=,Η &, Εα (¾ ft

dgg HW HW Η H d Η Η Η H

m ft © ©ft a) ft © ft ©ft ® £ ® *5 j ,¾ © Η H ftH ftH ft ft ^ ftft ft *5 ftjSft ft -P ft 43 ft+= ft+= ft'—' ft p< ft ft

\Q LPv VO LTV VO VO VO ΙΛ IA

VOVO VO VO VO VO VO VO

OflT- τ- 7 7 7 7 7 7 7 • 5 8 Λ CM lA Λ Λ £ £ j: g* a a © σν σν VO vo σν σν σ\ “} σ\

-Ρ -¾ Ν rH

φ © d Q 3 rS ft © © +3 ft -p Τ' ft © © to += CM T- ft «4 ft ft ft 43 Ο |_i £“ ^

?7 H v η Η I O 1 H H m H i- P

I +,g· ïsa h,^ +=¾- -pp. p&

S a ft a -Pp-v m-pp-xo®2 ¢¢¢- mi=ii ©< ® j+T' JP

o+= η. n o ft ftft ft =d ft < =d ft ? ftH ft ^ n S1 -< 3 J3ï;^'1 H^H^HrtO h“ Ah' 5 HP,jHfeOHftOHgcHgt-HP,[jHg HsS«5g ö © d © ©iK h ©=§ ft !> ft d > ft d ^ g ^ ^ £, CceT-pft^öO ft? to HP H £ © i>ft''ftfi0©2<r,,52 ft ft {> ^- ft ft'ft' pq ftvS pq h += ft H += ft>t- ft ft ft pqftwft ft--^ . I ° <d O Ö T- CM CM 1°= t- 7 7 101 © © σν σν vo vo σν σν σ\ 7 σν ft ·η Η ι . 1 I 1 · I J. I J_ J.

©Spit- T- t- =“ T- T- T- T- T-

ft -==1 N

CÖ a 1*,

I ' ' H

toirv 1--3)-4-=1 ft ® a a, © cm 1- .,=°¾ ,α,αΗ ft ft ft © ft

^ ftft ftH H H © LiV

φ in 00 H += H © ® © +s co 00+=+= O += ft ft ft © _ _j CM CM 0 0 ft ? 1 s“ S~ I3 h ft1 t ^ 10 S HÖ ^ ^ ^ ^0 to ft Η ΗΦ ΗΦΗ Η Η H ?_ += ft ft ft ft ft ft Hm H in H ir\ Hft £ ^ rj SJ £j-PP,+=Pi CO CO CO H ft 2

0 d -P Ö-P m O d CM d CM d CM ft+= IvS

S+-P t> > CL, d ft+= t>'_' £n_x i>----- ώ H

ft ö ft «4 ftft I I d ft P+ P+ FQ-4 W t*~

P+H ft-a. ftft H H 0 I LTV I ltv I in I H

a HP, HP+ H HÖ η CM H CM H CM Hg ft 6 Π l-j +3 fcn Η ό η S' π)Φ cö© Hd H© cdft eg ft cgft g© d+=

H pft ftft to© 60 H [QH H

(¾ Sft Rft PRS PQft H+= ‘M -P H!-P R ft WfH

© •H ©^ a =d H a -H 0

Hao© © I I © eg © © ft ft © © X H ^ m ft^

© IM

'©©©m vo in vo in - in m m 'ft _p tH H vo vo vo vo vo vo vo vo vo a § n ^- © =©

•H

Hft q «© ft -4 pq p+ cü h *4 ©'g.q ft ^ ft 5J «4 «4 <g pq ft ft 8105078 ' -22-

^4 ΊΗ *1η Η Η Η Η Η W

Η Η Η Η Η Η Η Η Η t t g f ρ t f.....j $

Pm P-i Pm Pm Pm Pm Pm Ph Pm

v./ N*_> v '«w' 'w' V-/ —S

A A A A A A A A A

-d p p p P fM Η P) H fM

ÖI +> +3 -p -P -P -P +3 -P -P

Ρ ·π Φ ft Pm CÖ 0 Ig C5 p ft p Φ ra >d ft ft ft ft ft ft Ph Pm Ph Ρ Φ ·Η I—I Q) Ö Ph Pm Pm Pm Ph PmPm Pm Ph

d Ρ Φ Η Η Η Η Η ΗΗ Η H

0} ft 3 Φ Φ Φ Φ Φ ΦΦ Φ Φ Φ H ft P P P ft PP ft ft (Xj Φ Pi Pi Pi Ph Pi Pi ft ft ft ft

VO VO VO VO VO VO ITV VO VO

I vo vo vo vo vo vo vo vo vo OÖT- 1— -I— 1— *- T-T— T- M—

p φ I II I I II I I

•Η p KV NV NV NV KV NV CVI KV N"V

s d σν ον σν σ\ σν σν σν σν σν .

«3 N

£ S Pm § Φ i> Ο H !> φ irv · Φ

•d ^ H> ft H

® p gft ? ö ft g δο ö 3 3 ft P 3 3 -ρ ·η p Or > t> 01 > ö > tn m 3r <D i> 1— T- Oftt— v- 3 CM Pm t- T-

+3 Η H in I H i> Η I H

ft Hft ft C— H ft ft ' ' ft H ft Pi O ftp ftp ft ? Φ P +3 p ft Pi ft Ρ ®P +>p <j m +3^-% oi +>^ οίο φ+> oi +>-—> οι ft oi +>/—* φ p^-- ra p'-s 43 pH ft Pm ft Pm 'd Pm PmPm PH Aid ftft ft d I pp I Ph Ρ Ί ö ft I Pm ft I O I' «1 ft ft Ρ I ft ft

φ Η Η Η Ρ H Hin Η Η H

&r a HPhOhPhO hPh hPm η Ph ο h c— hPhOHPmohPmO

H 60 Hin HO Η H HO 0 H LTV H IT\ _H ITV

o 3 d ® m d Φ t- d ® d Φ d Φ C— d v3 daim d®D~- p Φ ΐΛ

> - p > P ? > P ? i>P fppiFP? > >P? >P? >PP

p Pm Pm Pr-S' Pm Pr-S ft ft ft ft P ft ft CiJ ft ftp ft ft'P ft ft'P' Φ l>

^—- I

O d CM CM CM CM CM CMCM CM CM

-a| δ φ σν σν σν σν σν σν σν σν σν

•Η Ρ ι 1 I I I II I I

Η g d f V” τ- Μ— Μ— τ— Τ“ Μ— Μ— ω <tj ν 'd ft Pm Pm Pm Pm Pm

ΕΜΦ HHHH HH

43 φ φ 0) Φ Φ φ

H ÖO ÖO ÖOP· P PP ft P

φ O NV 3 NV cöKV .ft ft Pi ft ft ft

Φ l> vO !> vo > VO

<d ? i 2 0 ft q ft g ft gó g-o Φ h ^3 h^ h^> 3p 3p 3 p 3 ft 3 ft 3 ft

δ0 Η Η H t> !> I> i> P PP r* P

43 c co co co d d 3 3 Hcohcohcohcohco hco

o |>ft ^ft >ft HCM H CM H CM H 00 Η0Ο H CO

p ftp ftp ftp w v— w CM CM CM

Pm IP ip ip 3 3 3 3W

P H H H t>T- f>-r-i>-r-p> F> ï> d HPQ Hft Hft fti-- Ρμ·γ- ft v ft v ftT- fti— Φ Η Η Η I III I ΙΑ Pm Pm Pm Hft Hft HftHft Hft H ft

a -dH dH ·3Η ^ P- . Ρ Ρ P

3 d φ /-N ö Φ dP^dP 3 P 3 P 3P 3 P 3 P

ft ftftja ftPiPHftP ^ft èft β ft è Pm ^Ph èft <!)

•Η Φ Μ—N ra nd P οι ·η o φ S P

ρ ra O ft ft ft 3 3 33 3 3 ft 3 Φ Μ H r* pq ft·-'

Φ HH HOS

3d®vo vo vo vo vo vo vo vo vo Ρ Ή p vo vo VO vo vo VO vo vo vo o a d 1- v~ 1— τ- r- T-T- τ- T-

EH 3 N

Φ rd

•H

Hft ft Pm O ft ia Ü51! p p φ|»5 ft ft ft'ft ft ft Pm Ph h ft ft 8105078 -23- /

H H

Η Η Ρ Η t> 60 ft m V_/ >_' ft 'ft 'Ö f4 f4

SI -P

O Φ

f4 ·Η Φ CiJ «aJ

φ (Π ad ft H

43 m -h h ra 6 ft ft

pi f4 m h H

ra ft cd ra <o ra M H pI Pi

Pd ra ft ft ft

MD MD

I MD MD

OS T- T-

s φ I I

•H f4 K\ CM

SS σ\ ιτν «aj N ·*- ra · 43 ir\

H <M

ra o ft rtf ^ f4 · ra 43 ft S 43 cj 60 £? , Si ra ° - Ö

43 H Lf\ H R

ri C— H ft o 43 2 43 ra

<ri rav_^ ra t-3 S

43 ft ft ft ® S I ÜJ I > ra Η h 5 3 H ft H ro to

t£ 60 Η > H

1-4 cd p © 1-1 e ‘H

O f4 ? S 60 60 43 i> ft ft ft ft S *jj

f4 -HP

ffi 43 r4 ·> I t- Ή ra ^ o S cm in P 43

S ra ON v r4 S

<ί t4 s i i F? 0

Ö d r r -P

H S N S H

Φ O

pq pq · *p cd ra η H 5 H m P4 43 rara S ft H rt 3 -H t -

ra ft ft S ra S

φ . O HH ® »ö S S ft ·Η dj

ra cd ft cd fii ,S S

60 ϊ>&> -P S H

_p 00 O CÖ H

s H(D Hin S H

0 H CO H -3* H

f4 CM J to .

Gu ιΗΝ^' ·Η CÖ ft 43 £>60 ad ,η ·Η

S ft v- ft t- SMW

ra 1 I CÖ a 44 ft H ft 43 s s 60 ^ f4 f4 <2 P £ cd 1Ö43 cd43 d i> ft èftèi-4 5 43 -p

raSS

1 I ra ra

3 a 8 I

ra >d S S cd cd ra <h o P U f4 ©343 cd cd !> ft *h f4 ra o ft cd ra • Η H !> fi ft ft ft -H ft ft ' S o o ra HH P o o

1-4 O S r-4 CT\ MD

CdS® MD MD BJfC\fC\ 43 Ή fl MD MD 43-,-,

O 3 S v- a ·Η i C

ft cd N s w w S 43 43 ra ra o o rd ad o o •H S S S4 ft f4 O Ü Ö

HS C5 «aJ

ft ft ^ H * cö ft 8105078 -24- *

Onder verdere verwijzing naar tabel A zijn de vier eerst beschreven hybride LelF * s bereid uit twee LelF expressieplasmiden. Een Bgl II plaats gemeenschappelijk met LelF A en D cDNA's is gebruikt om een expressieplasmide pLelF trp- AD (Bgl II) t.e construeren, dat 5 codeert voor de 63 aminozuren met eindstandige aminogroepen van LelF A en de 102 aminozuren met eindstandige carboxylgroepen van LelF D. Dezelfde plaats werd gebruikt bij de constructie van een expressieplasmide pLelF trp DA (Bgl II), dat codeert voor 64 aminozuren met eindstandige aminogroepen van LelF D en 102 aminozuren met.

10 eindstandige carboxylgroepen van LelP A. De Pvu II plaats is gebruikt bij de constructie van twee andere hybride interferon expressieplasmiden: '91 aminozuren met eindstandige aminogroepen’van A met 74 aminozuren met eindstandige carboxylgro epen van D (pLelF trp AT) (Pvu II)) en 92 aminozuren met eindstandige. aminogroepen van LelP D 15 met 74 aminozuren met eindstandige carboxylgro epen van LelP A (pLelP trp DA (Pvu II)). Samenvattend, voor: * •pLelP AD trp (Pvu II): het grote (λ>3900 bp) fragment van een Xba I en'Pst I ontsluiting van pLelP A trp 25 werd verbonden met een 285 "bp Xba Ι-Pvu II fragment van pLelP A trp 25 en een ongeveer 550 20 bp Pvu II-Pst I fragment' van pLeÏP D trp 11; pLelP DA trp (Pyu II): het grote (rv3900 bp) 'fragment van een Xba I en Pst I ontsluiting van pLelP A trp 25 werd verbonden met een 288 bp Xba Ι-Pvu II fragment van pLelP D. trp 11 en een ongeveer 550 bp Pvu II-Pst I'fragment van pLelP A trp 25;

25 pLelP AD trp (Bgl II'): het grote fragment uit een Bgl II, Pst I

ontsluiting van pLelP A trp 25 werd verbonden met een ruöOO bp Bgl II-Pst I fragment uit pLelP D trp 11; en pLelP DA trp (Bgl II): het grote fragment uit een Bgl II en Pst I ontsluiting van pLelP D trp/11 werd verbonden aan een ongeveer 30 7OO bp fragment verkregen door Pst I splitsing van'pLelF A trp 25 gevolgd door partiële Bgl II ontsluiting.

In het vijfde voorgestelde hybride: pLelP AB trp (Pvu II): het grote (<\j3900 bp) fragment van een Xba I en Pst I ontsluiting van pLelF A trp 25 werd verbonden met een 35 285 bp Xba I - Pvu II fragment van pLelP A trp 25 en een ongeveer 750 bp Pvu II (partieel) - Pst I fragment van pLelF B trp 7· i Op soortgelijke wijze worden de andere constructies voorgesteld in tabel A aldus gedefinieerd. Als een verder voorbeeld kan men bij de constructie van een LelP C en/of LelP H deel bevattend hybride, 40 voordeel trekken van gemeenschappelijke Bbv I plaatsen, die voorko- 8105078 • *, i -25- men "bij ongeveer nucleotide 294 (dat wil zeggen GCTGC) van de genvolgorden.

Op dezelfde manier kannen plasmiden die geschikt zijn voor de microbiële expressie van andere nieuwe hybride leukocyt-interferons 5 gevormd worden door geschikte manipulatie van dubbelstrengig DNA, onder het coderen van alle of een deel van de aminozuurvolgorden van in de natuur voorkomende leukocytinterférons. Derhalve wordt een eerste dubbelstrengig DNA-fragment geselecteerd, dat het eindstan-dige aminodeel van een eerste, in de natuur voorkomende leukocyt-10 interferon aminozuurvolgorde codeert en eruit voortkomende in de 3'~ riehting^een aanzienlijk deel van de aminozuurvolgorde ervan.' Het fragment bevat een restrictie endonuclease splitsingsplaats voor geplaatste aangrenzende codons voor aminozuur "n" van het eerste leu-kocyt-interferon, n-aminozuren, die een aanzienlijk deel van de 15 aminozuurvolgorde van het eerste interferon vormen. Splitsing met het restrictie endonuclease geeft een fragment, dat het eindstandige amino Van het eerste interferon en codons voor ongeveer n aminozuren bevat. Een tweede fragment, dat alle of een deel van de codons voor* de aminozuurvolgorde van een tweede, verschillend leukocyt-interfe-20 ron bevat, wordt geselecteerd, waarbij het fragment een splitsingsplaats bevat voor een identiek restrictie endonuclease geplaatst aangrenzende codons voor dat aminozuur van het tweede interferon, waarvan het aminozuurgetal (voortkomend uit het eindstandige amino van het tweede interferon) ongeveer 166-n is. Splitsing van het twee-25 de fragment met dat: restrictie endonuclease geeft een produkt, dat complementair is voor het "n” eindstandige deel van het ontsluitings-produkt van het eerste fragment, zodanig dat het ontsluitingsprodukt van het tweede verbonden kan worden met dat van het eerste, onder het opnieuw vormen van de restrictie endonuclease herkenningsplaats 50 en het opnieuw samenstellen van het codon voor aminozuur en van het •r i eerste interferon, waar verloren gegaan bij de initiële ontsluiting.

Het produkt van de restrictie endonuclease ontsluiting van het tweede fragment komt bij voorkeur voort uit het einde, dat resulteert uit splitsing in de 3'-richting door nucleotiden, die de eindstandi-35 ge carbosylgroepen van het tweede leukocyt-interferon coderen.

Ook kunnen hybriden, die aanzienlijke hoeveelheden van de aminozuurvolgorden van meer dan twee in de natuur voorkomende leukocyt-interferons bevatten, gevormd worden, in welk geval bijvoorbeeld het hiervoor vermelde tweede fragment additioneel gekozen wordt om een 40 tweede restrictie endonucleaseplaats stroomafwaarts van de eerste te 8105078 v * -ί -26- bevatten, waarbij de tweede plaats identiek is aan een soortgelijk opgestélde plaats binnen een fragment, dat het eindstandige carboxy-deel van een derde leukocyt-interferon codeert, enz.. In-het aangehaalde voorbeeld kannen de produkten van opeenvolgende restrictie 5 endonuc1ease-bewerkingen drievoudig verbonden worden onder vorming van een hybride-gen, dat het eindstandige aminodeel van een eerste interferon, de middentrajekt-aminozuurvolgorde van het tweede en het eindstandige carboxydeel van het derde (of volgens een andere variatie van het eerste, wanneer de eerste en derde interferons dezelfde 10 zijn) codeert..

Bij voorkeur is het hiervoor vermeide eerste fragment afkomstig van een expressieplasmide, dat wil zeggen één waarin codons voor het eindstandige aminodeel van het eerste 1eukocyt-interferon zijn vooraf gegaan door een ATG of een ander vertalingsinitiëringscodon en 15 een promotor of promotor-operatorsysteem. Als resultaat zal het hiervoor beschreven eindprodukt van dé manipulerende bewerkingen een plasmide zijn, dat in staat is het polypeptide uit te drukken, dat gecodeerd is door het hybridegen in bacteriën of andere micro-biële organismen, die met het plasmide zijn getransformeerd. Andere 20 middelen voor het configureren van het hybridegen voor microbiële expressie zullen voor de deskundige duidelijk zijn.

Bij voorkeurs-uitvoeringsvormen van de uitvinding coderen de hybridegenen een nieuwe leukocyt-interferon aminoz'uurvolgorde van ongeveer 165 - 166 aminozuren, die een conjugaat vormen van in hoofd-25 zaak aminozüurvolgorden zoals voorgesteld in fig. 3· Het meest bij voorkeur bevatten de nieuwe leukocyt-interferons, gecodeerd door de hybridegenen, de aminozuren, gespecificeerd en geplaatst zoals aangegeven in de volgorde ΛΑ11" van.fig. 3· De expressieprodukten van plasmiden gevormd volgens de uitvinding kunnen onderzocht worden op 30 antivirusactiviteit op gebruikelijke wijze, zoals bij de biologische activiteitsbepalingen hierna beschreven.

Aantonen van antivirusactiviteit.

E. coli K-12 stam 294 werd op gebruikelijke wijze getransfor-meer met onafhankelijk, de plasmiden plelF trp A 25, pLelP trp D, 35 pDelF trp A/D (Bgl II) en pLelF trp d/A (Bgl II). De transformanten werden gescheiden gekweekt in kultures van 5 ml in L-vloeis-tof, die 5 mg/ml tetracycline bevatte tot een A^q van ongeveer 1,0 en werden vervolgens verdund in één liter van M9 media, die 5 yug/ml tetracycline bevatten. Cellen werden verzameld wanneer Acc-, de waarde

55U

40 1,0 had bereikt-en celkorrels werden gesuspendeerd in 10 ml 15^ su- 8105078 * » : -27- crose, 50 mmol tris-HGl (pH 8,0), 50 mmol EDTA. 10 mg lysozyme werden toegevoegd en na 5 minuten bij 0°C werden cellen door geluidsgolven gebroken. De monsters werden 10 minuten bij 15.000 omwentelingen per minuut gecentrifugeerd in een Sorvall SM-24 rotor. De in-5 terferonactiviteit in de bovenstaande vloeistoffen werd onderworpen aan een proef op de antivirusactiviteit.

De opbrengsten per liter kultuurvloeistof van deze interferons, getitreerd op een menselijke celreeks (WISH) worden in tabel B aangegeven, waaruit blijkt, dat LeIE-A/D activiteit in een grotere hoe-10 veelheid wordt voortgebracht dan de andere interferons. Dit verschil kan een gevolg zijn van de grotere intrinsieke activiteit van het DelE-A/D of aan een grotere opbrengst uitgedrukt in mg proteïne van dit interferon. Omdat de genetische verbinding identiek was voor al deze interferons, lijkt het het meest waarschijnlijk, dat LeIE-A/D 15 essentieel een grotere activiteit heeft dan de andere interferons.

label B.

Q-pbrengst van leukoovt-interferons uit schud-kolfkultures van E. ooli.

Type interferon Activiteit opbrengst/liter (eenheden op 20 WISH) A 8x1O7 D 5x106 AD (Bgl II) ' 2x1O8 DA (Bgl II) 1x1Q6 25 * Bepaald door remming van het cytopathische effekt op WISH-cellen met YSY als opwekmiddel.

De potentie van de verschillende interferons in een reeks zoog-diercelreeksen werd bepaald (mens, WISH; Afrikaanse groene aap, YER0; hamster-fibroblast, BHK; konijneniercellen, RK-13; muis 1-929 en 30 rundernier, MDBK-cellen). Teneinde de relatieve activiteit van de interferons te vergelijken werd hun activiteit op verschillende cellen berekend in verband met hun activiteit op WISH-cellen, die als 100 worden genomen. De resultaten in tabel C laten zien, dat LelE-A/D een zeer grote activiteit in YER0 en L-929 cellen heeft, terwijl 35 LeIE-D/A een geringe 'activiteit heeft in deze celreeksen. Deze resultaten wijzen erop, dat de combinatie van het U-eindstandige deel van LeIE-A en het C— eindstancLige deel van LeIE-D binnen één molecuul (LeïE-A/D) van het hybrideproteïne een bijzondere potentie verleent, die manifest is in verschillende zoogdiersöorten. Bovendien zijn de-40 ze eigenschappen niet eenvoudig de som van de eigenschappen van de 8105078 . : / " < -28- . _ •:o»derinterferons. Bit blijkt duidelijk in het geval van dé.activiteit . op 1-929 cellen (tabel C), in welk geval noch een mengsel van LeIF-A en LeIE-B noch het andere hybride, LeIF-B/A, duidelijke activiteit heeft.

5 Tabel C.

. Titratie van verschillende leuke cvt.-int erf er ons in celreeksen van verschillende zoogdiersoorten.

:g

Leukocyt-interferons

Celreeks A B A/B B/A A+B Buffy-coat '10 WÏSH 100 100 100 100 . 100 100 7ER0 250 75 1670 20 200 200 BHK 400 200 ' 833 2000 400 · 20 ' 1K-13 12 300 6 n.b. n.b. . . 120 L-929 150 5 3500. . 2 10 ' 0,1 15 * Interferons onderzocht tegen 7S7-infektie van de Verschillende celreeksen. Activiteiten uitgedrukt als‘percentage activiteit ... waargenomen in WISH-cellen.

Be activiteit van lelE-A/B tegen andere virussen werd eveneens onderzocht.. Be gegevens in fig. 5 laten antiviruseffekten zien tegen 20 EMC-virusinfektie van I-cellen en de gegevens in fig. 6 laten 'dé effekt en zien tegen 7S7-infektie van I-cellen. Het is uit deze gegevens duidelijk, dat de grotere activiteit van LelE-A/B niet beperkt is tot één virus (YS7) en de grotere activiteit ervan is waarschijnlijk een algemene eigenschap tegen vele.virussen. Natuurlijke men-25 selijke leder-kolder int erferonprep arat en hebben geen effekt tegen muiscellen (zie tabel B). Be activiteit van LelP-A/B tegen EMC-virusinfektie van CB-1 muizen ...... . werd daarom onderzocht. Be: re sultaten in fig. 7 laten zién, dat IeIP-A/B uiterst potent is tegen lethale EMC-virusinfektie en dat LeIF-A eveneens antivirusactiviteit 3q heeft, zoals verwacht kan worden uit de activiteit in de celreeksen (tabel B). Be gegevens in fig. 7 resulteren uit intraperitoneale behandelingen 3 uren voor de infektie. Boses van IeIE-A/B en LeIE-A worden als zodanig getitreerd op WISH.

Lethale EMC-virusinfektie van hamsters doet zich eveneens' voor 35 cLoor LeIF-A/B en LeIE-A (fig. 8), waarbij de eerstgenoemde het meest effektief is en leren kolderinterferon laat slechts een klein en statistisch onbetekenend.effekt zien. In het geval van fig. 8 werden al-• le interferons, intraperitoneaal toegediend 3 uren voor de infektie ... met een dosering van 5x10^ yug/kg, getitreerd .op WISH-cellen.

8105078 • * 6 -29- <*

Beze resultaten geven aan, dat de uitgesproken antiviruseffek- ten van LeIE-A/B in een reeks van zoogdiersoorten niet beperkt wordt .

'J

tot celkultures, maar ook wordt waargenomen bij lethale virusinfek-ties.

5 EMC-virus kan als een modelsysteem worden beschouwd, een demon stratie van antiviruseffekt tegen wat voorspellend kan zijn van anti-viruseffekt tegen de voorgestelde groep virussen, dat wil zeggen de picomavirusgroep waarvan mond- en klauwzeer en polio leden zijn.

YSV—virus kan worden opgevat als een modelsysteem, een demonstratie 10 van antiviruseffekt tegen wat voorspelbaar kan zijn van antivirus-effekt tegen de voorgestelde groep virussen, dat wil zeggen de rhab-dovirusgroep, waarvan rabies een belangrijk lid is.

Tabel B somt de activiteiten in tabelvorm op van verschillende van de LelE-hybriden ervan op WISH en MBBK-cellen en de activiteits-15 verhoudingen daarvan:

Tabel D.

EelE-hybride (Pvull) Eenheden/liter Eenheden/liter Verhouding ac- kultuur kuituur tiviteiten

WISH-cellen MBBK-cellen WISH/MBB

20 AB 2,4 Σ 108 4 x 107 6 AD 1,2 x 108 2 x 107 -6 AP 6 X 107 Ί x107 6

Afi 4 x 107 1,5 x 107 2,7 AI 3,2 x 107 1,2 x 107 2,7 25 BA 1,5 x 107 1 x 107 1,5 BB 6 x 10 7 ' ' ' 1,5. x 10 7 4 BE 1 x 106 3,5 x 105 0,3 BG 2 x 107 6 x 107 0,3 BA 3 x 106 1,2 x 108 0j025 30 BB 2 x 106 5 x 107 0,04 BE 2 x 105 4 x 108 0,05 ~ BG 2 x 105 1,5 x 107 0,014 EA 2 x 10^ 6 x 107 0,003 EB 2 x 106 8 x 10 7 0,025 35 EB 1 x 107 2 x 107 0,5 EG 1 x 106 4 x 107 0,025 IA 2,4 x 108 6 x 107 0,04 A* 8 x 107 1,2 x 108 0,7 B* 8 x 107 4' x 108 0,2 40 C* 2 x 107 1,5 x 107 1,3 81 0 5 0 78 -30- fabél I) (vervolg)

LelE-hybride (Pvull) Eenheden/liter Eenheden/liter Yerhouding ac- .kultuur kuituur tiviteiten

¥ISH-cellen MDBK-cellen ¥ISH/MDB

5 D* 5 X 106 2,5 x 107 0,2 ï* 2 x 107 2 X 108 0,1 I* 1,6 X 107 1,2 X 107 1,5 x Voor vergeli j kings doeleinden.

Parenterale toediening.

10 De hybride leukocyt-interferons hiervan kunnen parenteraal wor den toegediend aan' individuen, die een antitumor of an'tivirusbehan-deling nodig hebben en aan die individuen, die immunosuppressieve toestanden vertonen. Dosering en doseringssnelheid kunnen parallel zijn aan,wat thans in gebruik is bij klinische onderzoekingen van 15 van de méns afkomstige materialen, bijvoorbeeld ongeveer (1—10) x 6 ' 10 eenheden per dag en in het geval van produkten met een grotere zuiverheid dan 1%, bijvoorbeeld tot 5 x 107 eenheden per dag. Voorlopige indikaties bij het hiervoor beschreven onderzoek bij apen suggereren dat doseringen van bacterieel verkregen Le-IP aanzienlijk 20 kunnen worden verhoogd voor een groter effekt, toe te schrijven aan de essentiële afwezigheid van menselijke proteïnen anders dan Le-IP, welke proteïnen in van leukocyt afgeleide produkten kunnen fungeren als pyrogenen, die ongunstige effekten laten zien, bijvoorbeeld malaise, temperatuurverhoging, enz.

25 Als één voorbeeld van een geschikte doseringsvorm voor in hoofd zaak homogeen bacterieel De-IE in parenterale vorm, hier mutatis mutandis toepasbaar, kunnen 5 mg Le-IP van specifieke activiteit van bijvoorbeeld 2 x 10 eenheden/mg worden opgelost in 25 ml 5 ¥ serum-albumine (menselijk) - ITSP, kan de oplossing worden geleid door een 30 bacteriologisch filter en kan de gefiltreerde oplossing aseptisch worden onderverdeeld in 100 ίΐβφε, die elk 6x10 eenheden zuiver , interferon bevatten, dat geschikt is voor parenterale toediening.

De flesjes worden bij voorkeur in de koude (-20°C) vóór gebruik opgeslagen.

35 De verbindingen van de onderhavige uitvinding kunnen geformu leerd worden volgens bekende methoden voor de bereiding van farmaceutisch geschikte preparaten, waarbij het polypeptide in mengsel gecombineerd wordt met een farmaceutisch aanvaardbare drager. Geschikte dragers en hun formulering zijn beschreven in Remington’s Pharmaceu- 40 tical Sciences door E.¥. Martin. Dergelijke preparaten zullen een 8105078 Λ · i -51- werkzame hoeveelheid bevatten van het interferon-proteïne tezamen met een geschikte hoeveelheid drager teneinde farmaceutisch aanvaardbare samenstellingen te bereiden, die voor een effektieve toediening aan de gastheer geschikt zijn.

8105078

Claims (20)

1. Antiviraal · polypeptide van ongeveer 165 - 166 aminozuren, waarvan de aminozuurvolgorde van het polypeptide in volgorde afzonderlijke sub-volgorden bevat, die overeenkomen in -aminozuuridenti.teit : 5 en aantal met sub-volgorden van verschillende, in de natuur voorkomende leukocyt-interferons, waarbij de aminozuurvolgorde van het po-lypeptide in totale samenstelling verschilt van de aminozuurvolgorde van in de natuur voorkomende leukocyt-interferons.'

2. Polypeptide volgens conclusie 1, waarvan het N-eindstandige 10 deel in hoofdzaak bestaat uit aminozuren 1 - 92 van LeIP-D en het eindstandige carboxyldeel in hoofdzaak bestaat uit aminozuren 92 - 165 van IeIP-A.

3. Polypeptide volgens conclusie 1, waarvan het N-eindstandige deel in hoofdzaak bestaat uit aminozuren 1 - 91 van LeIP-A en het 15 eindstandige carboxyldeel in hoofdzaak bestaat uit aminozuren 95 - 166 van LeIP-D. ·

4· Polypeptide volgens conclusie 1, waarvan het N-ëindstandige deel in hoofdzaak bestaat uit aminozuren 1 - 63 van LeIP-D en het eindstandige carboxyldeel in hoofdzaak bestaat uit aminozuren 63 -20 165 van LeIP-A.

5· Polypeptide volgens conclusie 1, waarvan het N-eindstandige deel in hoofdzaak bestaat .uit aminozuren 1 - 62 van LeIP-A en het eindstandige carboxyldeel in hoofdzaak bestaat uit aminozuren 64 -166 van LeIP-D.

6. Polypeptide volgens conclusie 1, waarvan het' N-eindstandige deel in hoofdzaak bestaat uit aminozuren 1 - 91 van LeIP-A en het eindstandige carboxyldeel in hoofdzaak bestaat uit aminozuren 93 - , 166 van LeIP-B.

7· Polypeptide volgens conclusie 1, waarvan het N-eindstandige 30 deel in hoofdzaak bestaat uit aminozuren 1 - 91 van LeIP-A, het eindl standige carboxyldeel in hoofdzaak bestaat uit aminozuren 93 - 166 van LeIP-F.

8. Dubbelstrengig DNA» dat een streng bevat, die een polypeptide volgens elk van de conclusies 1-5 codeert. 35

9· Dubbelstrengig. DNA, dat een streng bevat, die een polypep tide volgens conclusies 6 en 7 codeert.

10. Repliceerbare, piasmideaehtige expressiedrager, die in staat is in een transformant microörganisme een polypeptide volgens elk van de conclusies 1 - 5 uit te drukken.

11. Repliceerbare, plasmideaehtige expressiedrager, die in 8 f 0 5 0 78 4t -33- staat is in een transformant microörganisme een polypeptide volgens conclusie 6 en 7 uit te drukken.

12. Transformant microörganisme, dat de expressiedrager van conclusie 10 bevat. 5

13· Transformant microörganisme, dat de expressiedrager van conclusie 11 bevat..

14· Plasmide gekozen uit de groep bestaande uit pLelF AD trp (Bgl II), pLelF AD trp (Pvu II), pLelF DA trp (Bgl II) en plelF DA trp (Pvu II). 10

15· Plasmide gekozen uit de groep bestaande uit pDelF AB (Pvu II) en plelF AF (Pvu II).

16. Werkwijze voor het vormen van een dubbelstrengig DNA volgens conclusies 8 of 9» met het kenmerk, dat men a. een eerste, dubbelstrengig DNA-fragment selecteert, dat codons 15 bevat, die de totale of een deel van de aminozuurvolgorde coderen van een eerste, in de natuur voorkomend leukocyt-interferon, welk fragment codons omvat voor het eindstandige am inode el van het interferon en op een afstand in de 3'-richting daarvan een eerste restrictie endonuclease splitsingsplaats; 20 b. het fragment met de restrictie endonuclease splitst; c. een tweede dubbelstrengig DNA-fragment selecteert, dat de gehele of eenjieel van de amino zuurvolgor de van een tweede, verschillend, in de natuur voorkomend leukocyt-interferon codeert, welk tweede fragment een identieke restrictie endonuclease splitsingsplaats be- 25 vat, die in hoofdzaak identiek geplaatst is vanuit het oogpunt van de aminozuurnummering van de twee interferons en bovendien voorbij deze plaats codons bevat voor het eindstandige carboxyldeel van het tweede interferon; d. het tweede fragment met de restrictie endonuclease splitst en 30 e. restrictie endonuclease ontsluitingsprodukten van de trappen b en d verbindt voor het herstel van da restrictie endonucleaseplaats en een hybridefragment vormt, dat in volgorde codons bevat voor het eindstandige aminodeel van het eerste interferon en het eindstandige carboxyldeel van het tweede interferon. 35

17· Werkwijze voor de vorming van een antiviraal " polypep tide volgens elk van de conclusies 1 — 7» met het kenmerk, dat men a. het hybride DNA-fragment afkomstig van de werkwijze volgens conclusie 16 laat ontplooien binnen een repliceerbare plasmideach-40 tige expressiedrager, een microörganisme daarmee transformeert, het 8105078 a . : ; : . -34- . microörganisme kweekt en de expressie van het polypeptide, gecodeerd door het hybride MA-fragment laat plaats hebben en b. het verkregen microörganisme laat lyseren en daaruit het polypeptide wint. ,

18. Farmaceutisch preparaat, dat een therapeutisch werkzame hoe veelheid van een polypeptide volgens één of meer van de conclusies 1 - 7 en een farmaceutisch aanvaardbare drager bevat.

19· Toepassing van het polypeptide volgens één of meer van de conclusies 1-7 bij de behandeling van " virale of neoplasti-10 sche ziekten of voor de bereiding van farmaceutische preparaten, die vooreen dergelijke behandeling geschikt zijn.

20. Produkten en werkwijzen voor hun bereiding zoals hiervoor beschreven., 8105078