DK164063B - Fremgangsmaade til fremstilling af praktisk taget rent uglycosyleret rekombinant humant immuninterferonprotein - Google Patents

Description

DK 164063 B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af praktisk rent uglycosyleret rekombinant humant immuninterferonprotein med en specifik aktivitet på mindst 107 E/mg ved dyrkning af en transformant af Escherichia coli, 5 hvis DNA indeholder en basesekvens, som koder for humant immuninterferon, således at humant immuninterferon dannes og akkumuleres i transformantcellerne, lysering af cellerne og rensning af den dannede, humant immuninterferonholdige opløsning.

10 Interferoner (i det følgende ofte betegnet IF) er proteiner, som dannes af cellerne i højere stående dyr ved stimulering med vira, nucleinsyrer osv., og som bl.a. har antiviral virkning og antitumor virkning.

Interferoner klassificeres sædvanligvis i tre forskelli-15 9e typer med karakteristiske egenskaber, nemlig a-, β- og γ-typen, og a- og β-typerne induceres ved hjælp af vira eller nucleinsyrer, og γ-typen induceres ved hjælp af mitogener osv.

Undersøgelser af interferon af α-typen (i det følgende 20 betegnet IF-a) og af β-typen (i det følgende betegnet IF-β) har gjort store fremskridt, og mekanismerne ved deres fremstilling er blevet klarlagt i væsentligt omfang. Endvidere har fremskridt indenfor gensplejningsteknikken gjort det muligt at fremstille IF-a, IF-β^ og IF-a^ som 25 biologisk aktive proteiner i store mængder ved dyrkning af Escherichia coli (IF-α og IF-β^) og gær (IF-a^) [D.V. Goeddel et al., Nature, 287, 411 (1980), E. Yelver-ton et al., Nucleic Acids Res., jJ, 731 (1981), D.V. Goeddel et al., Nucleic Acids Res., 8, 4057 (1980) og R. Hitzeman 30 et al., Nature, 293, 717 (1981)]. Det forsøges endvidere at gennemføre produktion i stor målestok med henblik på klinisk afprøvning af interferonerne.

Interferon af γ-typen (i det følgende forkortet IF-γ) fremstilles ud fra immunologisk kompetente celler (immunocyter)

DK 164063 B

2 under sådanne betingelser, hvor der foregår lymfocytransformation (ændring til blast celler) eller lymfokinproduk-tion, og dette kaldes derfor også immuninterferon (i det følgende forkortet I-IF). I-IF menes at have større 5 anti-celle-prolifererende virkning eller antitumor virkning sammenlignet med IF-α og IF-β, og der stilles derfor store forventninger til dette stof med hensyn til klinisk anvendelse. Som følge af forskellige begrænsninger, såsom krav om friske lymfocyter til fremstillingen af I-IF, har 10 det hidtil ikke været muligt at etablere effektive produktionssystemer. Det er blevet foreslået, at forskellige cellearter i forskellige forsøgssystemer muligvis kan producere forskellige molekylarter af I-IF. Imidlertid er der mange uklare punkter med hensyn til deres 15 struktur og egenskaber.

Interferoner er yderst artsspecifikke, og interferoner til anvendelse til mennesker skal derfor være human afledte. Da produktion i stor målestok af humant immuninterferon er vanskeligt, har dets anvendelse i klinisk 20 praksis ikke været muligt, og der er derfor et stort behov for udvikling af en teknik, hvorved der let kan fremstilles yderst rent humant I-IF i store mængder og med lave omkostninger.

Fremgangsmåde ifølge den foreliggende opfindelse er baseret 25 på en teknologi, der gør det muligt at fremstillede det ønskede humane I-IF protein, og som involverer kloning af det humane I-IF gen ved anvendelse af rekombinant DNA-teknik og indføring af det således fremstillede rekombinant DNA molekyle i en vært til ekspression af det humane I-IF gen.

30

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at rensningen udføres ved hjælp af et monoklonalt antistof, som kan danne binding med humant immuninterferon, og som er rettet mod polypeptider med formlen 35 (N) (C) H-X-Lys Arg Ser Gin Met Leu Phe Arg Gly-Y-OH (IV) 3

DK 164063 B

hvori X betyder en binding eller en peptid- eller aminosyre-rest med 1-16 carbonatomer regnet fra C-terminalen i peptidkæden 5 (N)

Ile Gin Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala (C)

Ala Lys Thr Gly Lys Arg 10 og Y er en peptid- eller aminosyrerest med 1-5 aminosyrer regnet fra N-terminalen i peptidkæden (N) (C)

Arg Arg Ala Ser Gin.

15

Ud fra den antagelse, at man havde klonet et af human I-IF generne, beskrev man aminosyresekvensen for et polypeptid afledt deraf [Nature, 295. 503 (1982) og beskrivelsen til DK-patentansøgning nr. 4602/82]. Senere er der fremkommet lignende 20 rapporter [Nucleic Acids Research, 10, 2487 (1982) og sammesteds, 10, 3605 (1982)]. Endelig er det kendt fra beskrivelsen til DK-patentansøgning nr. 1321/83 at fremstille humant I-IF ved hjælp af rekombinant DNA-teknik. Tilstedeværelsen af IF-lignende stoffer er imidlertid kun en formodning baseret på 25 den påviste antivirale aktivitet. En fremgangsmåde til fremstilling af praktisk taget rent uglycosyleret humant immunin-terferonprotein med en specifik aktivitet på mindst 107 E/mg er hverken kendt eller nærliggende på baggrund af ovennævnte kendte teknik.

30

Fra EP offentliggørelsesskrift nr. 63.482 er det kendt at ekstrahere glycosyleret IFN-τ fra en human leukocytkultur. Heller ikke i dette tilfælde fremstilles praktisk taget rent, uglycosyleret humant immuninterferonprotein.

Fra C.A., bind 97 (1982), nr. 21866e svarende til Nature, 35

DK 164063 B

4 296, 258-259, (1982) kendes et monoklonalt antistof mod naturligt glycosyleret IFN—r. Imidlertid kendes hverken renheden eller egenskaberne af dette glycosylerende IFN—t, og det er derfor sandsynligt, at dets sukkerkæder indgår i genkendelses-5 lederne for det monoklonale antistof. Dette antistof kan således ikke identificeres, og det er derfor ikke nærliggende at anvende'det ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen til rensningen af det uglycosylerede IFN—r.

10 Ved en udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen har basesekvensen, som koder for humant immuninterferon, formlen

(5') TGT TAC TGC CAG GAC CCA TAT GTA AAA GAA GCA 15 GAA AAC CTT AAG AAA TAT TTT AAT GCA GGT CAT TCA

GAT GTA GCG GAT AAT GGA ACT CTT TTC TTA GGC ATT

TTG AAG AAT TGG AAA GAG GAG AGT GAC AGA AAA ATA

ATG CAG AGC C AA ATT GTC TCC TTT TAC TTC AAA CTT

TTT AAA AAC TTT AAA GAT GAC CAG AGC ATC CAA AAG

20 AGT GTG GAG ACC ATC AAG GAA GAC ATG AAT GTC AAG

TTT TTC AAT AGC AAC AAA AAG AAA CGA GAT GAC TTC

GAA AAG CTG ACT AAT TAT TCG GTA ACT GAC TTG AAT

GTC CAA CGC AAA GCA ATA CAT GAA CTC ATC CAA GTG

ATG GCT GAA CTG TCG CCA GCA GCT AAA ACA GGG AAG

25 CGA AAA AGG AGT CAG ATG CTG TTT CGA GGT CGA AGA

GCA TCC CAG -X (3') (I) hvori X betyder TAA, TGA eller TAG.

Dette DNA (I) kan ved 5’-enden indeholde 5' ATG AAA TAT ACA AGT TAT ATC TTG GCT TTT CAG 30 CTC TGC ATC GTT TTG GGT TCT CTT GGC 3' (H) eller ATG (III).

DNA'et (I) er fortrinsvis tilknyttet nedenfor eller efter (downstream) en promotor, såsom tryptophan (trp) promotor, lactose (lac) promotor eller proteinkædeforlængelsesfaktor 35 Tu (tufB) promotor, fortrinsvis trp promotor.

DK 164063 B

5 I formlen (I) er oligonucleotidet repræsenteret ved X, fortrinsvis TAA.

Symbolerne anvendt i forbindelse med den foreliggende opfindelse har de nedenfor i tabel 1 anførte betydninger.

5 Tabel Tabel 1 DNA: Deoxyribonucleinsyre A: Adenin T: Thymin G: Guanin 10 C: Cytosin RNA: Ribonucleinsyre dATP: Deoxyadenosin-triphosphat dTTP: Deoxythymidin-triphosphat dGTP: Deoxyguanosin-triphosphat 15 dCTP: Deoxycytidin-triphosphat ATP: Adenosin-triphosphat EDTA: Ethylendiamintetraeddikesyre SDS: Natriumdodecylsulfat

Gly: Glycin 20 Ala: Alanin

Val: Valin

Leu; Leucin Ile: Isoleucin

Ser: Serin 25 Thr: Threonin

Cys: Cystein

Met: Methionin

Glu: Glutaminsyre

Asp: Asparaginsyre 30 Lys: Lysin

Arg: Arginin

His: Histidin

Phe: Phenylalanin

Tyr: Tyrosin 35 Trp: Tryptophan

Pro: Prolin

Asn: Asparagin 6

DK 164063 B

Gin: Glutamin Z: Carbobenzoxy

Boc: t-Butoxycarbonyl

Mtr: 4-Methoxy-2,3,6-trimethylbenzensulfonyl 5 Pme: Pentamethylbenzensulfonyl OBu: t-Butyl-ester ONB: N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximido-ester DCC: N,N1-Dicyclohexylcarbodiimid DCU: Ν,Ν'-Dicyclohexylurinstof 10 HONB: N-Hydroxy~5-norbornen-2,3-dicarboximid HOBt: N-Hydroxybenzotriazol CHA: Cyclohexylamin DCHA: Dicyclohexylamin TEA: Triethylamin 15 TFA: Trifluoreddikesyre MSA: Methansulfonsyre THF: Tetrahydrofuran DMF: Dimethylformamid ’

MeOH: Methanol 20 AcOEt: Ethylacetat

Et dobbeltstrenget DNA, som koder for humant I-IF, kan fremstilles f.eks. ved dyrkning af humane I-IF-udskillende celler, såsom humane perifere blodlymfocyter, isolering af et humant I-IF-kodende messenger (m) RNA fra kulturvæsken, syntetise-25 ring af et enkeltstrenget komplementært DNA (c-DNA) baseret derpå under anvendelse af f.eks. en revers transskriptase, afledning af et dobbeltstrenget DNA derfra, indsætning af dette i et plasmid, transformation af f.eks. Escherichia coli med det dannede plasmid og isolering af et c-DNA-30 holdigt plasmid.

De humane perifere blodlymfocyter, som skal anvendes, kan være celler, som enten er gjort følsomme eller ikke er gjort følsomme.

I-IF-induceren, som skal anvendes ved den praktiske gennem-35 førelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen, kan være af

DK 164063 B

7 vilkårlig art, bår blot den er i stand til at inducere produktionen af I-IF i humane lymfocytceller. Der kan således bl.a. anvendes fytohemagglutinin (PHA), concanavalin A (ConA), staphylococ-enterotoxi A (SEA), neuramindidase-galactose-5 oxidase (NAGO) og 12-0-tetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA). Disse kan anvendes alene eller i indbyrdes blandinger.

I-IF-induceringen kan gennemføres ved dyrkning af cellerne i et i og for sig kendt medium, såsom RPMI-1640-medium eller MEM-medium, fortrinsvis i RPMI-164O-medium indeholdende fø-10 talt kalveserum. Dyrkningen gennemføres ved en temperatur på 35-39°C, fortrinsvus 36-38°C, i et tidsrum på 12-72 timer, fortrinsvis 22-26 timer. Cellerne isoleres på i og for sig kendt måde og lyseres efter tilsætning af en RNase-in-hibitor, såsom guanidinthiocyanid, bentonit, heparin, poly-15 vinylsvovlsyre, aurintricarboxylsyre, vanadiumkompleks, di-ethylpyrocarbonat (DPC) eller natriumdodecylsulfat (SDS) ved tilsætning af N-lauroylsarcosin, "Tween"®80 eller "Nonidet P-40". Derefter foretages ekstraktion af RNA. Om nødvendigt gentages ekstraktionen efter tilsætning af phen-20 ol, phenol-chloroform eller lignende til denne RNA-holdige ekstrakt. RNA-fraktionen isoleres ved fældning med ethanol.

Da det er kendt, at det meste mRNA, som findes i cytoplasma-et i eukaryote celler, har en poly A-sekvens ved 3'-enden, isoleres poly(A+) RNA'er f.eks. ved anvendelse af oligo(dT)-25 cellulose eller poly(U)sepharose og fraktioneres ved hjælp af saccharosedensitetsgradientcentrifugering. En alikvot af hver fraktion injiceres i oocyter af Xenopus laevis til translation [J.B. Gurdon et al., Nature, 233, 177 (1971)].

Det fremkomne protein afprøves for antiviral virkning. På 30 denne måde kan der fremstilles en 12-16S-fraktion indeholdende mRNA for I-IF. mRNA'et kan også renses ved formamid-polyacrylamidgelelektroforese eller agarosegelelektroforese under anvendelse af glyoxal.

Ved anvendelse af det således fremstillede mRNA som skabelon 35 syntetiseres en komplementær DNA (cDNA)-kæde på i og for sig kendt måde, f.eks. ved anvendelse af en reverstrans-skriptase, og cDNA'et omdannes til et dobbeltstrenget 3

DK 164063 B

DNA [T. Mania ti s et al., Cell, 8^, 163 (1976)].

Dette DNA indsættes f.eks. i plasmidet pBR322 ved Pstl-eller SphI-restriktionsendonucleasespaltningsstedet, f.eks. ved anvendelse af dG-dG- eller dA-dT-homopolymertailings-5 fremgangsmåden [T.S. Nelson, Methods in Enzymology, 68, 41 (1979), Academic Press Inc., New York]. Rekombinant DNA1 et_indføres f.eks. i Escherichia coli X1776 til transformation. Transformantselektion kan foretages på basis af tetracyclinresistensen eller ampicillinresistensen. Kemisk 10 syntetiseres separat et oligonucleotid med en basesekvens, som formentlig svarer til aminosyresekvensen i I-IF-poly-peptidet, hvorpå det mærkes med P til dannelse af en sporingsdel, og under anvendelse af denne foretages sekundær screening med de ovenfor fremstillede tetracyclin-15 eller ampicillinresistente transformanter for de ønskede kloner, f.eks. ved anvendelse af den kendte kolonihybri-diseringsmetode [M. Grunstein og D.S. Hogness, Proc. Natl.

Acad. Sci. USA, 72, 3961 (1975)].

Klonerne, som er positive ved denne kolonihybridisering, 20 undersøges med hensyn til basesekvensen f.eks. ved anvendelse Maxam-Gilbert-metoden [A.M. Maxam & W. Gilbert, Proc.

Natl. Acad. Sci. USA, 1_A, 560 (1977)] eller dinucleotidsyn-tesekædetermineringsmetoden under anvendelse af fag M13 [J. Messin et al., Nucleic Acids Res., £, 309 (1981)] til 25 bekræftelse af tilstedeværelsen af I-IF-genet. Derefter fraspaltes I-IF-genet helt eller delvis fra den på denne måde fremstillede klon, hvorpå det tilknyttes nedenfor (downstream) for en passende promotor og SD (Shine og Dalgarno)-sekvensen til indføring i en passende vært.

30 Som eksempler på promotorer kan anføres de ovenfor beskrevne. Foretrukne værter er Escherichia coli-stammer (294, W3110, C600 osv.), blandt hvilke især stamme 294 foretrækkes .

Escherichia coli 294 er en kendt bakteriestamme [K.Backman 35 et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73, 4174 (1976)], og . 9

DK 164063 B

den er også deponeret i Institute for Fermentation, Osaka, JP under deponeringsnummeret IFO-14171.

Transformationen af en vært med DNA'et ifølge den foreliggende opfindelse gennemføres f.eks. under anvendelse 5 af den kendte fremgangsmåde [S. N. Cohen et al., Proc.

Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)].

Værten dyrkes i et i og for sig kendt medium.

Mediet er f.eks. et M9-medium indeholdende glucose og casa-minosyre [J. Miller, Experiments in Molecular Genetics, 10 431-433 (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1972)I .

For at promotoren kan virke effektivt kan der, om nødvendigt, tilsættes 33-indolylacrylsyre eller et lignende middel.

Dyrkningen gennemføres sædvanligvis ved en temperatur på 15-43°C i et tidsrum på 3-24 timer, om nødvendigt med be-15 luftning og/eller omrøring.

Efter dyrkningen isoleres cellerne på kendt måde, hvorpå de lyseres, f.eks. efter suspendering i en pufferopløsning, f.eks. ved ultralydsbehandling, ved behandling med lysozym og/eller ved frysning/optøning. Derefter isoleres 20 supernatanten ved centrifugering. Til lysering af cellerne foretrækkes frysning/optøning efterfulgt af behandling med lysozym.

Humant I-IF i supernatanten renses ved anvendelse af et monoklonalt antistof, so, kan bindes til humant I-IF, og 25 som er rettet mod polypeptidet med formlen (N) (C) H-X-Lys Arg Ser Gin Met Leu Phe Arg Gly-Y-OH (IV) hvori X betyder en binding eller en peptid- eller amino-syrerest med 1-16 aminosyrer regnet fra C-enden i peptidkæden

DK 164063 B

10 (N)

Ile Gin Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala (C)

Ala Lys Thr Gly Lys Arg og Y er en peptid- eller aminosyrerest med 1-5 aminosyrer regnet fra N-enden i peptidkæden (N) (C) 5 Arg Arg Ala Ser Gin som er et nyt polypeptid.

I polypeptidet (IV) foretrækkes det, at Y er Arg Arg Ala Ser Gin, og/eller X er Lys Arg. Endvidere foretrækkes det, at polypeptidet (IV) indeholder 15-25 aminosyrerester.

10 Det monoklonale antistof kan med fordel anvendes i form af en antistofsøjle.

Antistofsøjlen kan eksempelvis fremstilles ved at koble det monoklonale antistof, i renset tilstand, som det fås fra ascitesvæsken inokuleret med hybridomet med en egnet bærer 15 som beskrevet i det følgende.

Bæreren kan være af en vilkårlig art, når blot I-IF efter kobling kan adsorberes specifikt og effektivt og derefter kan elueres på passende måde. Eksempelvis kan agarosegel i form af perler, som er aktiveret for at lette bindingen 20 af den primære aminogruppe i et protein, f.eks. AFFI-GEL 10 (Bio-Rad Lab, USA) med fordel anvendes på følgende måde. Reaktionen af AFFI-GEL 10 med antistoffet gennemføres i en pufferopløsning, såsom 0,01-1 M , fortrinsvis 0,1 M hydrogencarbonat. Der kan anvendes reaktionsbetingelser 25 på 0-20°C, fra 10 minutter til 24 timer og varierende pH-værdi, og de foretrukne betingelser er 4°C, 4 timer og en pH-værdi på 3-10. Det kvantitative forhold mellem AFFI-GEL 10 og antistoffet kan vælges i området op til ca. 50 mg antistof pr. ml AFFI-GEL, da mængden af antistof koblet 30 med AFFI-GEL forøges i dette område med stigende mængde

DK 164063 B

11 antistof. Af hensyn til effektiv kobling anvendes antistoffet i en mængde på højst 30 mg på denne basis. Det således fremstillede antistof-bærer-koblingsprodukt vaskes grundigt med samme pufferopløsning som anvendes til 5 reaktionen, hvorefter det henstår i flere dage eller behandles med ethanolamin-hydrochlorid i en slutkoncentra-tion på 0,05 M ved 4°C i 1 time eller på anden måde til blokering af de resterende uomsatte aktive grupper, hvorefter produktet pakkes i en passende søjle til dannelse 10 af en antistofsøjle.

Til rensning med antistofsøjlen opløses en human immun-interferonproteinholdig opløsning, f.eks. supernatanten fra lyseringen af cellerne, i en næsten neutral puffer, såsom en phosphatpuffer eller Tris-hydrochloridpuffer, 15 hvorefter den adsorberes på antistofsøjlen. Søjlen vaskes med den samme puffer, og derefter elueres I-IF. Som eksempler på egnede elueringsmidler kan nævnes svagt sure opløsninger (f.eks. eddikesyreopløsning), en polyethylen-glycolholdig opløsning, en opløsning indeholdende et 20 peptid med en større affinitet til antistoffet end det pågældende protein, en saltopløsning med stor koncentration og kombinationer deraf. De elueringsmidler, som ikke fremmer nedbrydningen af humant I-IF i væsentligt omfang, foretrækkes .

25 Eluatet fra søjlen neutraliseres med en puffer på konventionel måde. Om nødvendigt kan rensningstrinnet med anvendelse af antistofsøjlen gentages.

Den således fremstillede humane I-IF-proteinopløsning dialyseres og kan om nødvendigt bringes på pulverform ved 30 lyofilisering. Ved gennemførelsen af lyofiliseringen kan der tilsættes en stabilisator, f.eks. sorbitol, mannitol, dextrose, maltose eller glycerol.

Ved afprøvning for antiviral aktivitet i en test til bedømmelse af inhiberingsvirkningen på degenereringen af 35 humane amnionafledte WISH-celler med det vesikulære sto-

DK 164063 B

12 matitisvirus (VSV), udviser det fremstillede humane immun-interferonprotein en specifik virkning på mindst 10^ E/mg.

IF-aktiviteten i E/ml (enheder/ml) bestemmes på følgende måde. En international standard IF-a, hvor enheden er ble-5 vet fastlagt, og leukocytafledt råt IF-α analyseres ved testen til bestemmelse af inhiberingsvirkningen mod celledegenerering fremkaldt i en human·amnionafledt FL cellelinie af VSV, værdien for det lymfocytafledte IF-γ bestemmes ved sammenligning med den fundne værdi, og dette IF-γ 10 anvendes som laboratoriestandard IF-γ. Ved beregning af indholdet af IF-γ i et materiale, anvendes dette laboratoriestandard IF-γ altid parallelt i den ovenfor beskrevne analyse i WISH-VSV-systemet, og indholdet beregnes på basis af forholdet mellem de opnåede værdier.

15 Det humane immuninterferonprotein fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen indeholder fortrinsvis et polypep-tid med aminosyresekvensen med formlen (N)H-Y-Z^ Tyr Z2 Gin Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn Ala Gly His 20 Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly

Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys

Ile Met Gin Ser Gin Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys

Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gin Ser Ile Gin

Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val 25 Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp

Phe Glu Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu

Asn Val Gin Arg Lys Ala Ile His Glu Leu Ile Gin

Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly

Lys Arg Lys Arg Ser Gin Met Leu Phe Arg Gly Arg 30 Arg Ala Ser Gln-OH(C) (V) hvori Y betyder Met eller en kemisk binding, og Z^ og Z2 hver for sig betyder Cys eller 1/2 Cys. Det humane I-IF-protein indeholder fortrinsvis polypeptidet i en renhed på mindst 90%, især mindst 95%, på tørbasis.

DK 164063 B

13

Det humane immuninterferonprotein fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen har følgende karakteristika: 1) En molekylvægt på 17.000 +1.000 ved SDS-polyacryl-amidgel (17,5%) elektroforese, 5 2) indeholder cystein eller halvcystein eller methionin som den terminale aminosyre, 3) danner kombination med et monoklonalt antistof mod H-Lys-Arg-Lys-Arg-Ser-Gln-Met-Leu-Phe-Arg-Gly-Arg-Arg-Ala-Ser-Gln-OH.

10 Det humane interferonprotein fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan anvendes til samme formål og på samme måde som I-IF-arter fremstillet på konventionel måde. Som følge af dets mindre indhold af kontaminerende proteiner og pyrogen kan det anvendes med større sikker-15 hed til fremstilling af f.eks. injektionspræparater.

Det humane I-IF-protein fremstillet ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse har antiviral virkning, antitumor virkning, inhiberende virkning på cellevækst og immun-potenserende virkning. Det humane I-IF-protein kan anvendes 20 til medicinske formål som det er eller som en blanding med steriliseret vand, humant serumalbumin (HSA), fysiologisk saltopløsning eller/og andre kendte fysiologisk acceptable bærestoffer eller fortyndingsmidler til dannelse af et farmaceutisk præparat indeholdende det humane 25 I-IF, og det kan indgives parenteralt eller lokalt. Det kan eksempelvis indgives intravenøst eller intramuskulært eller på anden måde i doser på 10-10 enheder, fortrinsvis 7 7 5 x 10 -6 x 10 enheder pr. voksen person pr. dag.

De farmaceutiske præparater indeholdende det humane I-IF-30 protein kan også indeholde andre fysiologisk acceptable indifferente bestanddele, såsom salt, fortyndingsmiddel, hjælpemidler, andre bærestoffer, puffere, bindemidler, overfladeaktive stoffer og konserveringsmidler. Til parenteral indgift formuleres præparaterne i form 35 af en suspension i en steriliseret vandig opløsning

DK 164063 B

14 eller et fysiologisk acceptabelt opløsningsmiddel i ampuller eller i form af et steriliseret pulver (fremstilles sædvanligvis ved lyofilisering af en I-IF-opløsning), som skal fortyndes med et fortyndingsmiddel inden an-5 vendeisen.

Endvidere kan præparaterne indeholdende det humane immune interferonprotein indeholde andre aktive bestanddele, såsom IF-α eller IF-β eller en lymfokin (f.eks. interleukin 2) i en mængde på 1-99%, baseret på det humane immuninterferon-10 protein fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen forklares nærmere i det følgende under henvisning til tegningen.

Fig. 1 viser restriktionsenzymspaltningskortet for plasmi-det pHIT3709 fremstillet i eksempel 1 (7), hvori delen 15 1%¾¾¾%¾¾ angiver den del, som koder for det peptid, som an tages -at være signalpeptidet, og delen f\\\\\N angiver den del, som koder for. I-IF-polypeptidet.

Fig. 2 viser primærstrukturen (basesekvensen) for den indsatte del i plasmidet pHIT3709 fremstillet ifølge eksempel 1 (7) .

20 Fig. 3 viser skematisk reaktionerne til fremstilling af ptrp701 og ptrp771 beskrevet i henholdsvis eksempel 2(1) og (2) .

Fig. 4 viser skematisk reaktionerne fra fremstillingen af pHITtrpllOl beskrevet i eksempel 2 (3).

25 Fig. 5 viser skematisk reaktionerne for fremstillingen af pHITtrp2101 beskrevet i eksempel 2 (4).

Fig. 6 viser resultatet af elektroforesen beskrevet i eksempel 6 (1).

Fig. 7 viser resultatet af moleky.lvægtbestemmelsen fore-

DK 164063 B

15 taget i eksempel 6 (1).

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen forklares nærmere i de efterfølgende udførelseseksempler og referenceeksempler.

Muse b hybridom γ 2-11.1 anvendt i de efterfølgende refe-5 renceeksempler er deponeret i C.N.C.M. i Pasteur Instituted Paris, Frankrig under deponeringsnummeret 1-242.

Eksempel 1 (1) Isolering af mRNA, som koder for humant I-IF.

Lymfocyter fremstillet ud fra humant perifert blod inkube-10 res ved 37°C i RPMI-164O-mediet (indeholdende 10% føtalt kalveserum) indeholdende 15 ng/ml 12-O-tetradecanoylphor-bol-13-acetat (TPA) og 40 yg/ml concanavalin A til induktion af I-IFN. Efter 24 timers forløb nedbrydes de således inducerede humane lymfocyter (1 x 10^ celler) i en thio-15 guanidinopløsning (5 M guanidinthiocyanat, 5% mercapto-ethanol, 50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 10 mM EDTA) i et teflonhomogeniseringsapparat. Derefter tilsættes natrium-N-lauroyl-sarcosinat i en koncentration på 4%, og efter homogenisering anbringes blandingen i et lag oven på 6 mm 5,7 M 20 cesiumchlorid [5,7 M cesiumchlorid, 0,1 M ethylendiamin-tetraacetat (EDTA)], og der centrifugeres ved 15°C og 24.000 o/m i 30 timer under anvendelse af en Beckman SW27 rotor til dannelse af et RNA-bundfald. Dette bundfald opløses i 0,25% natrium-N-lauroylsarcosinat, hvorefter der 25 fældes med ethanol, og der fås 8,3 mg RNA. Dette RNA adsor-beres i en saltopløsning med høj koncentration (0,5 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,6, 1 mM EDTA, 0,3% SDS) på en oligo (dT)cellulosesøjle, og det mRNA-holdige poly(A) elueres med en saltopløsning med lav koncentration (10 mM Tris-30 HCl, pH 7,6, 1 mM EDTA, 0,3% SDS), hvorved der fås

700 yg mRNA. Dette mRNA fældes atter med ethanol, hvorefter det opløses i 0,2 ml opløsning (10 mM Tris HCl, pH

7,6, 2 mM EDTA, 0,3% SDS), behandles i 65°C i 2 minutter * og fraktioneres ved anvendelse af 10-35% saccharosedensi-35 tetsgradientcentrifugering ved 20°C og 25.000 o/m i 21 ti-

DK 164063 B

16 mer under anvendelse af en Beckman SW27 rotor, hvorved der fås 22 fraktioner. Alikvoter af hver fraktion injiceres i Xenopus laevis oocyter, og de dannede proteiner afprøves for interferonaktivitet [antiviral virkning be-5 stemt ved inhiberingstest'en for den cytopatiske virkning af det vesikulære stomatitis virus mod humane amnion-afledte WISH-celler (W.E. Stewart, The Interferon System, Springer New York, 1979, side 11)]. Det konstateres på denne måde, at fraktion 12 (sedimentationskonstanten er 10 12-14S) har en aktivitet på 195 enheder pr. yg RNA. mRNA'et i den ovenfor fremstillede fraktion 12 vejer ca. 20 yg.

(2) Syntese af enkeltstrenget RNA.

Ved anvendelse af det ovenfor fremstillede mRNA og en revers transskriptase inkuberes 100 yl reaktionsblanding 15 (5 yg mRNA, 50 yg oligo (dT), 100 enheder revers trans skriptase, 1 mM af henholdsvis dATP, dCTP, dGTP og dTTP, 8 mM MgCl2/ 50 mM KC1, 10 mM dithiothreitol og 50 mM Tris-HC1, pH 8,3) ved 42°C i 1 time, hvorefter der foretages deproteinisering med phenol og behandles med 0,1 N natrium-20 hydroxidopløsning ved 70°C i 20 minutter til fjernelse af RNA ved nedbrydning.

(3) Syntese af dobbeltstrenget DNA.

Det fremstillede enkeltstrengede komplementære DNA omsæt-. tes i 50 yl reaktionsblanding (samme blanding som ovenfor 25 men uden indhold af mRNA og oligo dT) ved 42°C i 2 timer til fremstilling det dobbeltstrengede DNA.

(4) Addering af dC-ender.

Det dobbeltstrengede DNA behandles med nuclease SI i 50 yl reaktionsblanding (dobbeltstrenget DNA, 0,1 M natriumacetat, 30 pH 4,5, 0,25 M NaCl, 1,5 mM ZnSO^, 60 enheder Sl-nuclease) ved stuetemperatur i 30 minutter. Reaktionsblandingen depro-teiniseres ved tilsætning af phenol, og DNA fældes med ethanol. Det således fremstillede DNA omsættes med terminal 17

DK 164063 B

transferase i 50 μΐ reaktionsblanding (dobbeltstrenget DNA, 0,14 M kaliumcacodylat, 0,3 M Tris (base), pH 7,6, 2 inM dithiothreitol, 1 mM C0CI2, 0,15 mM dCTP, 30 enheder terminal transferase) ved 37°C i 3 minutter til forlængel-5 se af det dobbeltstrengede DNA med ca. 20 deoxycytidinenhe-der (ca. 20) ved hver 3'-ende i DNA'et. Ved denne reaktionsrække fås ca. 300 ng dobbeltstrenget DNA med deoxy-cy tidin^-ender.

(5) Spaltning Escherichia coli-plasmid og addering af 10 dG-ender.

Separat behandles 10 jjg Escherichia coli-plasmid PBR322DNA med restriktionsenzym PstI i 50 n1 reaktionsblanding [10 tg DNA, 50 mM NaCl, 6 mM Tris-HCl, pH 7,4, 6 mM MgC^, 6 mM 2-mercaptoethanol, 100 pg/mg okseserumalbumin, 20 en-15 heder PstI] ved 37°C i 3 timer til spaltning ved det ene Pstl-genkendelsessted i pBR322DNA'et, hvorefter reaktionsblandingen deproteiniseres med phenol, og DNA'et behandles yderligere med terminal transferase i 50 μΐ reaktionsblanding [10 tg DNA, 0,14 M kaliumcacodylat, 0,3 M Tris (base), 20 pH 7,6, 2 mM dithiothreitol, 1 mM CoC^, 0,15 mM dGTP, 30 enheder terminal transferase] ved 37°C i 3 minutter til forlængelse af ovennævnte pBR322-plasmid DNA ved ca. 8 deoxyguanidinenheder ved hver af 3'-enderne.

(6) Anellering af cDNA og transformation af Escherichia 25 coli.

Anelleringen gennemføres ved opvarmning af 0,1 tg af det ovenfor fremstillede syntetiske dobbeltstrengede DNA og 0,5 tg af det ovenfor nævnte pBR322~plasmid i en opløsning indeholdende 0,1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 1 mM EDTA 30 ved 65°C i 2 minutter og derefter ved 45°c i 2 timer, hvorefter der foretages gradvis afkøling. Transformationen af Escherichia coli X1776 gennemføres under anvendelse af fremgangsmåden ifølge Enea et al. [J. Mol. Biol., 9_6, 495 (1975)].

DK 164063 B

18 (7) Isolering af cDNA-holdigt plasmid.

Ca. 8.500 tetracyclin-resistente kolonier isoleres,, og DNA'et fra hver koloni fikseres på et nitrocellulosefilter [M. Grunstein og D.S. Hogness, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 5 72, 3961 (1975)].

Baseret- på aminosyresekvensen for IF-γ som beskrevet af [D.V.

Goeddel et al., Nature, 295, 503 (1982)] fremstilles ved

kemisk syntese to oligonucleotider A A

_ _ 5'TCCTGGCAGTAGC3' og kj Cj i 1 5'ACATTCATATCCTCCT31, der formentlig svarer til henholdsvis 10 aminosyrerne nr. 1-5 (Cys. Try. Cys. Gin. Asp) og aminosy- rerne nr. 77-82 (Lys. Gin. Asp. Met. Asn. Val) i I-IFN- sekvensen ved anvendelse af triesterfremgangsmåden [R. Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 7i>, 5765 (1978)]. Disse oligonucleotider behandles med T4 polynucleotidkinase i 15 50 μΐ reaktionsblanding (0,2 yg oligonucleotid, 50 mM Tris-

HC1, pH 8,0, 10 mM MgC^/ 10 mM mercaptoethanol, 50 μ Ciy-^P

ATP, 3 enheder T4 polynucleotidkinase) ved 37°C i 1 time.

32

De således ved 5'-enden med P mærkede oligopeptider anvendes som sporingsdel og anelleres med DNA'et på det oven-20 for beskrevne nitrocellulosefilter ved anvendelse af fremgangsmåden ifølge Lawn et al. [Nucleic Acids Res., 9_, 6103 (1981)].

Ved anvendelse af autoradiografi isoleres 4 stammer, som reagerer med de ovenfor anførte oligonucleotidsporings-25 dele.

Plasmid DNA'er isoleres fra bakteriecellerne fra hver af disse stammer ved anvendelse af alkalimetoden [H.C. Birnboim og J. Doly, Nucleic Acids. Res., ]_, 1513 (1979)] - De indsatte dele i plasmid DNA'erne fraspaltes med Pstl-restriktions-30 enzymet. Blandt de isolerede plasmider udvælges det plasmid, som indeholder den længste indsatte del, og det betegnes "pHIT3709".

Strukturen (basesekvensen) af cDNA-sekvensen indsat i

DK 164063 B

19 pHIT3709 plasmidet bestemmes derefter ved anvendelse af dinucleotid-syntetisk-kædetermineringsfremgangsmåden og ved anvendelse af Maxam-Gilbert-metoden. Primær strukturen er vist i fig. 2 (jfr. DK-patentansøgning nr. 1321/83).

5 Basesekvensen for IF-γ kodningsområdet (codon nr. SI til nr. 146) i pHIT3709 er identisk med den, som er vist i fig. 3 i Nucleic Acids. Res. 10, 2487 og følgende (1982).

Eksempel 2 (1) Plasmid ptrp601 (vektor er pBR322) indeholdende promo-10 tordelen for tryptophansyntese i Escherichia coli [promotor-og operatorholdigt DNA fragment^ 276 basepar, G.N. Bennett et al., J. Mol. Biol., 121, 113 (1978)] konstrueres som ekspressionsplasmidet.

Separat spaltes plasmid pBR322 med restriktionsenzymerne 15 EcoRI og Aval. De således dannede klæbrige ender af EcoRI-Aval-fragment, som indeholder det tetracyclinresistente gen, udfyldes med DNA-polymerase I stort fragment. Dette fragment konjugeres til PvuII-spaltningsstedet i ptrp601 under anvendelse af T4DNA-ligase. På denne måde dannes 20 ptrp701 (fig. 3).

(2) Til udelukkelse af begge de to restriktionsenzym Clal spaltningssteder i ptrp701 underkastes ptrp701 partiel nedbrydningsbehandling med Clal til dannelse af ptrp701, hvori begge de to Clal-spaltningssteder er blevet spaltet. Efter 25 udfyldning af de klæbrige med DNA-polymerase I stort fragment, konjugeres det således fremstillede ptrp701 atter under anvendelse af T4DNA-ligase til dannelse af ptrp771 (fig. 3).

(3) pHIT3709 spaltes med restriktionsenzymet PstI til dan-30 nelse af Pstl-fragmentet indeholdende strukturgenet for IF-γ.

Dette fragment underkastes yderligere partiel nedbrydning med restriktionsenzymet BstNI til dannelse af BstNI-Pstl-fragmentet, som spaltes ved BstNI-stedet i IF-y-struktur-

DK 164063 B

20 genet. De klæbrige ender ved BstNI-spaltningsstedet udfyldes med DNA-polymerase I stort fragment. Det således dannede fragment og oligonucleotidadapteren

CGATAATGTGTTACTGCC

TATTACACAATGACGG

5 som er fremstillet af kemisk vej ved den ovenfor nævnte triesterfremgangsmåde/ og som indeholder proteinsyntese-startcodonet ATG, sammenbindes under anvendelse af T4 DNA-ligase.

Separat indsættes IF-y-genet bundet til ovennævnte adapter 10 i Pstl-Clal-stedet i plasmidvektor ptrp771 nedenfor trypto-phanpromotoren under anvendelse T4DNA-ligase. På denne måde fremstilles et IF-γ ekspressionsplasmid pHITtrpllOl (fig. 4).

(4) pHITtrp2101 fremstilles ved yderligere forbedring af 15 pHITtrpllOl på følgende måde.

ptrp601 behandles først med restriktionsenzymerne Clal og Hpall til dannelse af 0,33 Kb af Clal-Hpall-fragmentet indeholdende trp-promotor. Dette fragment bindes med pHITtrpllOl, som spaltes med Clal og behandles med alkalisk phosphatase 20 under anvendelse af T4DNA-ligase. På denne måde fremstilles pHITtrp2101 indeholdende to på hinanden følgende trp-promo-torer (fig. 5).

En stamme Escherichia coli 294/pHIT.trp2101 dannes ved transformering af Escherichia coli 294 med plasmid pHIT.trp2101 25 ved anvendelse af den ovenfor anførte fremgangsmåde ifølge Cohen et al.

Eksempel 3

Escherichia coli 294/pHITtrp2101 inkuberes i 200 ml M9-medium indeholdende 8 yg/ml tetracyclin, 0,4% casaminosyre 30 og 1% glucose i 1-liter kolbe ved 37°C. Når bakteriernes vækst når KU220, tilsættes 3P-indolylacrylsyre (IAA) til

DK 164063 B

21 en koncentration på 30 pg/ml, og blandingen inkuberes i yderligere 4 timer.

Eksempel 4 1,2 liter kulturopløsning fremstillet ifølge eksempel 3 5 centrifugeres, cellerne isoleres og suspenderes i 60 ml 0,05 M Tris-Hc (pH 7,6) indeholdende 10% saccharose. Til denne c.ellesuspension sættes 0,3 ml 0,2 M phenylmethyl-sulfonylfluorid (PMSF), 24 ml 5 M NaClopløsning, 2,4 ml 0,2 M ethylendiamintetraacetat (EDTA), 2,4 ml 1 M spermi-10 din og 2,4 ml lysozym (5 mg/ml). Blandingen henstår ved 0°C i 1 time, inkuberes ved 37°C i 5 minutter, hvorefter den nedbrydes ved 0°C i 30 sekunder under anvendelse af en ARTEK (USA) ultralydsdesintegrator.

Dette lysat centrifugeres ved 105.000 G i 1 time, hvorved 15 der fås 66 ml supernatant.

Eksempel 5 60 ml af supernatanten fremstillet i eksempel 4 fortyndes med 20 mM Tris-HCl indeholdende 1 mM EDTA og 0,15 M NaCl (pH 7,6) (TEN) til 150 ml, og den fortyndede supernatant 20 sættes til en anti-IFN-y-antistofsøjle (9 ml) fremstillet under anvendelse af fremgangsmåden ifølge referenceeksempel 10. Søjlen vaskes grundigt med TEN og endvidere med TEN indeholdende 0,01% "Nonidet" P-40 (Shell) og 0,5 M NaCl.

Derefter elueres IFN-γ med 0,1 M eddikesyre indeholdende 25 0,25 M NaCl. Eluatet neutraliseres straks med 1 M Tris-HCl (pH 7,6). Den fremkomne opløsning dialyseres mod destilleret vand ved 4°C i 16 timer, hvorefter der foretages frysetørring med acetone-fast carbondioxid og lyofilisering, hvorved der fås et pulver. Resultatet er anført nedenfor.

30 Protein Total Specifik Genvinding aktivitet Aktivitet _(mg)_(E)_(E/mq)_(%)

Supernatant fra , lysat 250,8 4xl0y 1,6x10°

Efter behandling på anti- 7 stofsøjle_2,0_1,5x10 7,5x10/_37,5 22

DK 164063 B

Den specifikke aktivitet af det således færdige humane im- muninterferonproteinprodukt [baseret på virusaktiviteten bestemt ved hjælp af den cytopatiske effektinhiberingsana- lyse (under anvendelse af VSV og WISH celler (beskrevet 7 5 ovenfor)] er 7,5 x 10 E/mg. Karakteriseringen af dette protein er beskrevet nedenfor.

Eksempel 6

Karakterisering af humant immuninterferonprotein.

(1) Molekylvægt.

10 Proteinet fremstillet i eksempel 5 behandles med 2-mercapto-ethanol, underkastes SDS-polyacrylamidgel (17,5%) elektrofo-rese (15 mV, 6 timer) og farves med Coomassie blåt. Proteinet kan indetificeres som et enkelt bånd (fig. 6). Fra forholdet mellem migrationsafstanden for molekylvægtmarkørerne, der 15 samtidig underkastes elektroforese, og migrationsafstanden for proteinet, kan proteinets molekylvægt bestemmes til 17.000 + 1.000 (fig. 7). For proteinet, som ikke er behandlet med 2-mercaptoethanol, påvises et yderligere bånd ved en position svarende til en molekylvægt på 33.000 + 2.000.

20 Denne værdi er ca. dobbelt så stor som molekylvægten for IFN-γ, nemlig 17.000 + 1.000, hvilket antyder, at båndet skyldes dimeriseret IFN-γ.

(2) Aminosyreanalyse.

En alikvot af proteinet fremstillet i eksempel 5 anbringes 25 i et glasrør til hydrolyse, og der tilsættes en 200 gange så stor mængde (rumfang/vægt) konstant kogende saltsyre indeholdende 4% thioglycolsyre. Røret forsegles under formindsket tryk, og hydrolysen gennemføres ved 110°C i 24, 48 og 72 timer. Efter hver hydrolyse åbnes røret, saltsyren 30 fjernes under formindsket tryk og remanensen opløses i 0,02 N saltsyre og analyseres under anvendelse af en Hitachi Model 835 high-speed aminosyreanalysator.

DK 164063 B

23

Til bestemmelse af cystin og cystein oxideres det ovenfor omtalte protein med permyresyre i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge Hirs et al. [Methods in Enzymology, 11, 197, (1967)], hvorefter der foretages hydrolyse på samme 5 måde som beskrevet ovenfor i 24 timer, og cystiensyre bestemmes kvantitativt ved anvendelse af aminosyreanalysatoren. Gennemsnittet af 3 værdier opnået efter en hydrolysetid på 24, 48 .og 72 timer anvendes som den fundne værdi for hver aminosyre, bortset fra i tilfældene med serin, threonin, 10 thyrosin og tryptophan, hvor værdierne beregnes ved ekstrapolation af hydrolysetiden til 0 timer. De opnåede resultater er anført i nedenstående tabel 2.

Tabel 2

Aminosyre påvist mol-% Aminosyre påvist mol-% 15 Asparaginsyre 13,4 Methionin 2,9

Threonin 3,6 Isoleucin 4,8

Serin 7,4 Leucin 6,8

Glutaminsyre 12,5 Thyrosin 3,4

Prolin 1,4 Phenylalanin 6,7 20 Glycin 3,8 Lysin 13,5

Alanin 5,3 Histidin 1,5

Cysteinsyre 1,3 Arginin 5,4

Valin 5,7 Tryptophan 0,9 (3) Amino terminal aminosyreanalyse.

25 Proteinet fremstillet i eksempel 5 oxideres med permyresyre i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge Hirs et .al., [Methods in Enzymology, 11, 197, (1967)], hvorefter det underkastes amino terminal aminosyreanalyse ved anvendelse af den modificerede Edman nedbrydningsmetode ifølge Iwanaga 30 et al. [Eur. J.Biochem., 8_, 189, (1969)]. De dannede phenyl-thiohydantoin-aminosyrer (PTH-amino-syrer) identificeres og bestemmes kvantitativt på en Varian (USA) model 5040 HPL kromatograf under anvendelse af en Ultrasphere-ODS-søjle (Altex, USA, 4,6 x 250 mm, partikelstørrelse 5 ym) ved 35 anvendelse af fremgangsmåden ifølge Archer et al. [Altex Chromatogram 3, 8, (1980)]. Ved analysen påvises PTH-meth-ioninsulfon og PTH-cysteinsyre.

DK 164063 B

24

Det fremgår af ovenstående eksempler, at der ved rensningsfremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse kan fremstilles praktisk taget rene humane immuninterferonproteiner 7 med en specifik aktivitet på mindst 7,5 x 10 E/mg.

5 Eksempel 7

Inj ektionspræparat.

5 mg af humant I-IF protein ifølge opfindelsen (specifik aktivitet 2 x 10^ E/mg) opløses i 100 ml 5%'s HSA. Opløsningen filtreres under anvendelse af et membranfilter 10 (porestørrelse: 0,2 pm) og fordeles i 100 hætteglas under aseptiske betingelser. Opløsningen i hætteglassene lyofi-liseres aseptisk, hvorved der fås brugsfærdige injektionspræparater .

Præparatet opløses i 1 ml destilleret vand inden anvendelsen.

15 I de efterfølgende referenceeksempler foretages tyndtlags-kromatografi under anvendelse af Merck 60F254 silicagel-plader eller Funakoshi Yakuhins AVICEL SF celluloseplader og følgende fremkaldelse:

Rf : Chlorof orm-methanol-eddikesyre = 9:1:0,5 2 20 Rf : Ethylacetat-pyridin-eddikesyre-vand = 30:10:3:5 3

Rf : Chloroform-methanol-vand = 7:3:0,5 4

Rf : n-Butanol-pyridin-eddikesyre-vand = 30:20:6:24 5

Rf : Ethylacetat-n-butanol-eddikesyre-vand = 1:1:1:1.

Referenceeksempel· 1 25 (1) Fremstilling af Z-Ser-Gln-OBut 10,1 g Z-Gln-OBut opløses i 500 ml methanol, og der foretages katalytisk reduktion i en hydrogengasstrøm under anvendelse af palladiumsort som katalysator. Katalysatoren fra-filtreres, og opløsningsmidlet afdestilleres. Remanensen op-30 løses sammed med 7,5 g Z-Ser-OH og 6,8 g HONB i 250 ml DMF, og opløsningen afkøles med is. Der tilsættes 7,15 g DCC under afkøling med is, og blandingen omrøres ved 0°C i 4 timer og derefter ved stuetemperatur i 12 timer. Det dannede 25 DCU frafiltreres, og opløsningsmidlet afdestilleres. Remanensen ekstraheres med 300 ml AcOEt, og ekstrakten vaskes med 4%'s vandig natriumhydrogencarbonatopløsning, 0,2 N saltsyre og vand i nævnte rækkefølge, hvorefter den tørres 5 over vandfrit natriumsulfat· Opløsningsmidlet afdestilleres, og det fremkomne krystallinske bundfald frafiltreres, tørres og omkrystalliseres fra CH^CN. Udbytte 6,5 g (51,2%), smp. 97-100°C. [a]^5 = -24,1° (c = 0,40, methanol), Rf1 = 0,64.

10 Elementæranalyse:

Beregnet for C2oH29®7^3: C 56,72, H 6,90, N 9,92 Fundet: C 56,21, H 6,72, N 9,76.

(2) Fremstilling af Z-Ala-Ser-Gln-OBut 15 4,23 g Z-Ser-Gln-OBu1" opløses i 300 ml methanol, og der foretages katalytisk reduktion i en hydrogengasstrøm under anvendelse af palladiumsort som katalysator. Katalysatoren frafiltreres, og opløsningsmidlet afdestilleres. Remanensen opløses sammen med 2,34 g Z-Ala-OH og 2,27 g HONB i et blan-20 det opløsningsmiddel bestående af 200 ml AcOEt, 200 ml dioxan og 100 ml DMF, og opløsningen afkøles med is, hvorefter der tilsættes 2,38 g DCC under afkøling, hvorpå blandingen omrøres ved 0°C i 4 timer og derefter ved stuetemperatur i 12 timer. DCU frafiltreres, og opløsningsmidlet afdestille-25 res. CH3CN og ether sættes til remanensen, og det dannede krystallinske bundfald frafiltreres, tørres og omkrystalliseres fra CH^CN. Udbytte 3,72 g (75,3%), smp. 165-170°C, [a]^5 = -41,2°, (c = 0,50, methanol), Rf1 = 0,60. Elementæranalyse: 30 Beregnet for C23H34°8N4: C 55,86, H 6,93, N 11,33 Fundet: C 55,58, H 6,74, N 11,12.

DK 164063 B

26 (3) Fremstilling af Z-Arg(Pme)-Ala-Ser-Gln-OBu^ 3,46 g Z-Ala-Ser-Gln-OBut opløses i 300 ml methanol, og der foretages katalytisk reduktion i en hydrogengasstrøm under anvendelse af palladiumsort som katalysator. Katalysatoren 5 frafiltreres, og opløsningsmidlet afdestilleres. Remanensen opløses i 150 ml DMF sammen med Z-Arg(Pme)-OH [fremstillet ud fra .4,54 g Z-Arg(Pme)-OH-CHA] og 1,9 g HOBt, og opløsningen afkøles med is. Til opløsningen sættes 1,9 g DCC, og blandingen omrøres ved 0°C i 4 timer og derpå ved stue-10 temperatur i 15 timer. DCU frafiltreres, og opløsningsmidlet afdestilleres. AcOEt sættes, til remanensen, og det dannede bundfald frafiltreres, tørres og genfældes fra methanol og AcOEt. Udbytte 4,55 g (75,5%), smp. 130-134°C, [a]p5 = -24,1° (c = 0,26, methanol), Rf1 = 0,57.

15 Elementæranalyse:

Beregnet for C4øH6o°llN8S . 1/2H20: C 55,22, H 7,07, N 12,88, S 3,69 Fundet: C 55,23, H, 6,93, N 12,54, S 3,48.

(4) Fremstilling af Z-Arg (Pme) -Arg (pme) -Ala-Ser-Gln-OBu*" 20 4,3 g Z-Arg (Pme)-Ala-Ser-Gln-OBut opløses i 400 ml methanol, og der foretages katalytisk reduktion i en hydrogengasstrøm under anvendelse af palladiumsort som katalysator. Katalysatoren frafiltreres, og opløsningsmidlet afdestilleres. Remanensen opløses i 200 ml DMF sammen med Z-Arg(Pme)-OH 25 [fremstillet ud fra 3,24 g Z-Arg(Pme)-OH.CHA] og 1,42 g HOBt, og opløsningen afkøles med is. Til opløsningen sættes 1,41 g DCC' og blandingen omrøres ved 0°C i 4 timer og derpå ved stuetemperatur i 20 timer. DCU frafiltreres, og opløsningsmidlet afdestillerés. AcOEt sættes til remanensen, 30 og det dannede bundfald frafiltreres, tørres og genfældes fra methanol og AcOEt. Udbytte 4,4 g (71,7%), smp. 125-130°C, [a]p5 = -18,0° (c = 0,40, methanol), Rf1 = 0,63.

Elementæranalyse:

Beregnet for C^^HggO^^N^2S2 27 C 54,96, Η 7,12, N 13,50, S 5,15 Fundet: C 54,66, H 6,92, N 13,32, S 5,34.

(5) Fremstilling af Z-Arg (Pme) -Gly-OBu*" 13,0 g Z-Gly-OBu*" opløses i 500 ml methanol, og der fore-5 tages katalytisk reduktion i en hydrogengasstrøm under an-vendelse af palladiumsort som katalysator. Katalysatoren frafiltreres, og filtratet koncentreres under formindsket tryk. Remanensen opløses i 200 ml DMF, og der tilsættes Z-Arg(Pme)-OH [fremstillet ud fra 20,0 g Z-Arg(Pme)-OH.CHA] 10 og 5,4 g HOBt, hvorefter der foretages afkøling med is.

8,2 g DCC sættes til blandingen, som omrøres i 48 timer. Det dannede DCU frafiltreres, og filtratet koncentreres. Remanensen opløses i 500 ml AcOEt, og AcOEt-opløsningen vaskes med 4%'s vandig natriumhydrogencarbonatopløsning 15 og 10%'s vandig citronsyreopløsning, tørres over Na2S04 og koncentreres. Der tilsættes petroleumsether, og bundfaldet frafiltreres. Udbytte 19,8 g (96,8%), smp. 71-73°C, [а] 33 = +0,2° (c = 0,9, DMF), Rf1 = 0,62.

Elementæranalyse: 20 Beregnet for C3iH45°7N5S· C 58,93, H 7,18, N 11,09, S 5,08 Fundet: C 59,42, H 7,58, N 10,95, S 4,84.

(б) Fremstilling af Z-Phe-Arg(Pme)-Gly-0But 10,0 g Z-Arg(Pme)-Gly-0But opløses i 500 ml methanol, og 25 der foretages katalytisk reduktion. Produktet opløses derefter i 300 ml DMF. Der tilsættes 4,72 g Z-Phe-OH og 2,35 g HOBt, og blandingen afkøles med is. 3,59 g DCC tilsættes, og hele blandingen omrøres i 15 timer. Det dannede DCU fra-filtreres, og filtratet koncentreres. Remanensen opløses i 30 400 ml AcOEt, og AcOEt-opløsningen vaskes med 4%'s vandig natriumhydrogencarbonatopløsning og 10%'s vandig citronsyreopløsning, tørres over Na2S04 og koncentreres. Der tilsættes ether, og det dannede krystallinske bundfald frafiltreres og omkrystalliseres fra en blanding af methanol og

DK 164063 B

28 ether. Udbytte 10,5 g (85,3%), smp. 101-103°C, [ct]^6 = -8,3° (C = 0,9, DMF), Rf1 = 0,64.

Elementæranalyse:

Beregnet for C4oH54°8N6S: 5 C 61,67, H 6,99, N 10,79, S 4,12

Fundet: C 61,66, H 6,56, N 10,93, S 4,14.

(7) Fremstilling af Z-Leu-Phe-Arg (pme) -Gly-OBu*1 5,5 g Z-Phe-Arg(Pme) -Gly-OBu^ reduceres katalytisk i 300 ml methanol, og produktet opløses derefter i 300 ml DMF.

10 Z-Leu-OH (fremstillet ud fra 3,31 g Z-Leu-OH.DCHA) og 1,47 g HONB tilsættes, og blandingen afkøles med is. Der tilsættes 1,68 g DCC, og hele blandingen omrøres i 48 timer.

Det dannede DCU frafiltreres, og filtratet koncentreres. Remanensen opløses i 300 ml AcOEt, og AcOEt-opløsningen 15 vaskes med 4%'s vandig natriumhydrogencarbonatopløsning og 10%’s vandig citronsyreopløsning, tørres over Na2SO^ og koncentreres. Der tilsættes ether, og bundfaldet fra-filtreres. Udbytte 6,2 g (98,3%), smp. 171-173°C, [a]^6 = -15,5° (c = 0,9, DMF), Rf1 = 0,64.

20 Elementæranalyse:

Beregnet for C46H65°9N7S: C 61,93, H 7,34, N 10,99, S 3,59 Fundet: C 62,02, H 7,37, N 11,08, S 3,59.

(8) Fremstilling af Boc-Met-Leu-Phe-Arg (Pme) -Gly-OBu*” 25 6,0 g Z-Leu-Phe-Arg (Pme) -Gly-OBu1" reduceres katalytisk i 200 ml methanol, hvorefter produktet opløses i 150 ml DMF. Boc-Met-OH (fremstillet ud fra 3,0 g Boc-Met-OH-DCHA) og 1,39 g HONB tilsættes, og blandingen afkøles med is. Der tilsættes 1,59 g DCC, og hele blandingen omrøres i 15 timer.

30 Det dannede DCU frafiltreres, og filtratet koncentreres. Remanensen opløses i n-BU'OH-AcOEt, og opløsningen vaskes med 10%'s vandig citronsyreopløsning, tørres over Na2S04 og koncentreres. Der tilsættes ether, og de dannede krystaller frafiltreres. Udbytte 6,2 g (93,1%), smp. 192-195°C, 29 [α]ρ6 = -19,7° (c = 1,0, DMF), Rf1 = 0,64.

Elementæranalyse:

Beregnet for C48H76°ioN8S2: C 58,27, H 7,47, N 11,33, S 6,48 5 Fundet: C 58,48, H 7,79, N 11,34, S 5,98.

(9) Fremstilling af Boc-Gln-Met-Leu-Phe-Arg(Pme)-Gly-OH

Til 5,5 g Boc-Met-Leu-Phe-Arg(Pme)-Gly-OBu^" sættes 50 ml TFA, og blandingen rystes ved stuetemperatur i 10 minutter, hvorefter den koncentreres. Der tilsættes ether, og bund-10 faldet frafiltreres og tørres. Bundfaldet opløses i 50 ml DMF, og opløsningen afkøles med is, hvorefter der tilsættes 1,8 ml TEA. Boc-Gln-ONB (fremstillet ud fra 1,85 g Boc-Gln-OH, 1,49 g HONB og 1,90 g DCC) tilsættes, og blandingen omrøres i 15 timer, hvorefter den koncentreres. Der tilsæt-15 tes AcOH og derefter AcOEt, og det dannede bundfald frafiltreres. Udbytte 5,3 g (89,8%), smp. 181-183QC (sønderdeling), [a]^6 = -19,6° (c = 1,0, DMF), Rf1 = 0,30.

Elementæranalyse:

Beregnet for C49H76012nioS2: 20 C 55,45, H 7,22, N 13,20, S 6,04

Fundet: C 55,39, H 7,17, N 13,34, S 6,20.

(10) Fremstilling af Z-Ser-NHNH-Boc 10,0 g Z-Ser-OH og 6,2 g t-butylcarbazat opløses i 150 ml DMF, og opløsningen afkøles med is. 8,0 g HONB og 9,3 g 25 DCC tilsættes, og blandingen omrøres i 15 timer. Det dannede DCU frafiltreres, og filtratet koncentreres. Remanensen eks-traheres med AcOEt, og AcOEt-opløsningen vaskes med 4%'s vandig natriumhydrogencarbonatopløsning og med 10%'s vandig citronsyreopløsning, tørres over Na2S04 og koncentreres. Der 30 tilsættes ether, og de dannede krystaller frafiltreres. Udbytte 7,3 g (50,4%), smp. 95-98°C, [a]p6 = -6,2° (c = 0,8, DMF), Rf1 = 0,62.

Elementæranalyse:

Beregnet for ci6H23°6N3: C 54,38, H 6,56, N 11,89

Fundet: C 54,77, H 6,88, N 12,29.

30

DK 164063 B

(11) Fremstilling af Z-Arg(Pme)-Ser-NHNH-Boc 3.9 g Z-Ser-NHNH-Boc reduceres katalytisk i 300 ml methanol,

5 hvorefter produktet opløses i 50 ml DMF. Z-Arg(Pme)-OH

(fremstillet ud fra 6,2 g Z-Arg(Pme)-OH-CHA) og 1,5 g HOBt tilsættes, og blandingen afkøles med is. Der tilsættes 2,3 g DCC, og hele blandingen omrøres i 15 timer. Det dannede DCU frafiltreres, og filtratet koncentreres. Remanensen 10 opløses i AcOEt, og AcOEt-opløsningen vaskes med 4%'s vandig natriumhydrogencarbonatopløsning med 10%'s vandig citronsyreopløsning, tørres iver Na2SO^ og koncentreres. Der tilsættes ether, og det dannede bundfald frafiltreres. Udbytte 7,45 g (93,7%), smp. 100-101°C, [a]^6 = -10,9° (c = 1,2, DMF), 15 Rf1 = 0,51.

Elementæranalyse:

Beregnet for C^H^gOgN^S: C 55,06, H 6,86, N 13,62, S 4,46 Fundet: C 55,49, H 6,94, N 13,14, S 3,86.

20 (12) Fremstilling af Z-Lys(mtr)-Arg(Pme)-Ser-NHNH-Boc 3.9 g Z-Arg(Pme)-Ser-NHNH-Boc opløses i 300 ml methanol, og der foretages katalytisk reduktion. Produktet opløses i 50 ral DMF, og der tilsættes Z-Lys(Mtr)-OH [fremstillet ud fra 3,4 g Z-Lys(Mtr)-OH.DCHA] og 0,88 g HOBt. Blandingen afkø- 25 les med is, og der tilsættes 1,34 g DCC. Hele blandingen omrøres i 20 timer. Det dannede DCU frafiltreres, og filtratet koncentreres. Der tilsættes AcOEt, og det pulverformige bundfald frafiltreres og omkrystalliseres fra MeOH-AcOEt.

Udbytte 5,1 g (93,4%), smp. 103-105°C, [ct]^6 = -7,2° (c = 30 0,8, DMF), Rf1 = 0,57.

Elementæranalyse:

Beregnet for C49H73°13N9S2: C 55,50, H 6,94, N 11,89, S 6,05 Fundet: C 55,70, H 7,15, N 11,60, S 5,63.

DK 164063 B

31 (13) Fremstilling af Z-Arg(Pme)-Lys(Mtr)-Arg(Pme)-Ser-NHNH-Boc 4,8 g Z-Lys (Mtr) -Arg(Pme) -Ser-NHNH-Boc opløses i 300 ml methanol, og der foretages katalytisk reduktion. Produktet oplø-5 ses i 70 ml DMF, og der tilsættes Z-Arg(Pme)-OH [fremstillet ud fra 2,8 g Z-Arg(Pme)-OH-CHA] og 0,74 g HOBt. Blandingen afkøles med is, og der tilsættes 1,12 g DCC. Hele blandingen omrøres i 15 timer. Det dannede DCU frafiltreres, og filtratet koncentreres. Remanensen opløses i AcOEt, og 10 AcOEt-opløsningen vaskes med 4%’s natriumhydrogencarbonat-opløsning og med 10%'s vandig citronsyreopløsning, tørres over Na2SO^ og koncentreres. Der tilsættes ether, og det dannede bundfald isoleres ved filtrering og genfældes fra MeOH-ether. Udbytte 5,8 g (89,9%), smp. 136-137°C, [a]^6 = 15 -6,6° (c = 1,0, DMF), Rf1 = 0,58.

Elementæranalyse:

Beregnet for C^H^O^N^: C 55,56, H 6,99, N 12,76, S 6,74 Fundet: C 55,34, H 7,07, N 12,50, S 6,59.

20 (14) Fremstilling af Z-Lys(Mtr)-Arg(Pme)-Lys(Mtr)-Arg(pme)-

Ser-NHNH-Boc 3,0 g Z-Arg(Pme)-LYs(mtr)-Arg(Pme)-Ser-NHNH-Boc opløses i 150 ml methanol, og der gennemføres katalytisk reduktion. Produktet opløses i 60 ml DMF, og der tilsættes Z-Lys(Mtr)-25 OH [fremstillet ud fra 1,54 g Z-Lys(mtr)-OH-DCHA] og 0,31 g HOBt. Blandingen afkøles med is, ig der tilsættes 0,57 g DCC. Hele blandingen omrøres i 15 timer. Det dannede DCU frafiltreres, og filtratet koncentreres. Remanensen opløses i AcOEt, og AcOEt-opløsningen vaskes med 4%'s vandig natriumhydrogen-30 carbonatopløsning og med 10%'s vandig citronsyreopløsning, tørres over Na2S0^ og koncentreres. Der tilsættes ether, og det krystallinske bundfald frafiltreres og omkrystalliseres fra AcOEt. Udbytte 2,70 g (72,8%), smp. 123-125°C, [a]j^ = -5,9° (c = 1,1, DMF), Rf1 = 0,57.

DK 164063 B

32

Elementæranalyse:

Beregnet for : C 55,73, H 7,02, N 11,89, S 7,26 Fundet: C 55,89, H 7,30, N 11,72, S 7,08.

5 (15) Fremstilling af Boc-Gln-Met-Leu-Phe-Arg(Pme)-Gly-

Arg(Pme) -Arg(Pme)-Ala-Ser-Gln-OBut 1,0 g Z-Arg(Pme)-Arg(Pme)-Ala-Ser-Gln-OBut opløses i 100 ml methanol, og der foretages katalytisk reduktion. Produktet opløses derefter i 20 ml DMF, og der tilsættes 0,85 g Boc-10 Gln-Met-Leu-Phe-Arg (Pme)-Gly-OH og 135 mg HOBt. Blandingen afkøles med is, og der tilsættes 210 mg DCC. Hele blandingen omrøres i 20 timer. Det dannede DCU frafiltreres, og filtratet koncentreres. Der tilsættes methanol, og det dannede bundfald frafiltreres. Udbytte 1,50 g (87,4%), smp. 216-217°C 15 (sønderdeling), [a]^6 = -11,8° (c = 1,0, DMF), Rf1 = 0,43. Elementæranalyse:

Beregnet for C^H^O^N^: C 55,09, H 7,27, N 14,24, S 6,00 Fundet: C 54,81, H 7,33, N 14,23, S 5,79.

20 (16) Fremstilling af H-Lys-Arg-Lys-Arg-Ser-Gln-Met-Leu-

Phe-Arg-Gly-Arg-Arg-Ala-Ser-Gln-OH

Til 1,0 g Boc-Gln-Met-Leu-Phe-Arg (Pme)-Gly-Arg (Pme)-Arg (Pme)-Ala-Ser-Gln-OBu*· sættes 10 ml TFA, og blandingen rystes ved stuetemperatur i 50 minutter, hvorefter den koncentreres.

25 Der tilsættes ether, og bundfaldet frafiltreres og tørres.

Separat sættes 10 ml TFA til 0,83 g Z-Lys(Mtr)-Arg(Pme)-Lys(Mtr)-Arg(Pme)-Ser-NHNH-Boc, og blandingen rystes ved stuetemperatur i 10 minutter, hvorpå den koncentreres. Der tilsættes ether, og bundfaldet frafiltreres og tørres. Bund-30 faldet opløses i 10 ml DMF, og opløsningen afkøles med et bad af fast carbondioxid og acetone, hvorefter der tilsættes 9,23 ml 6,2 N HCl/AcOEt og 9,075 ml isoamylnitrit. Temperaturen holdes på -25 til -20°C i 20 minutter (negativ hydrazintest) , og reaktionsblandingen afkøles igen med et køle- 33 bad af fast carbondioxid og acetone, hvorpå den neutrali-eres med 0,25 ml TEA. Aminkomponenten opløses i 40 ml DMF, og opløsningen afkøles med is. Der tilsættes 0,16 ml TEA, og den ovenfor beskrevne azidopløsning tilsættes. Hele blan-5 dingen omrøres ved 4°C i 72 timer, hvorefter den hældes i fortyndet eddikesyre. Det dannede bundfald frafiltreres og vaskes med vandig CH^CN. Udbytte 1,40 g (81,5%), Rf^ = 0,09. 400 mg af dette produkt opløses i 60 ml TFA-thianisol-meth-ylsulfid (8:1:1) indeholdende 0,15 M MSA, og opløsningen 10 rystes ved stuetemperatur i 2 timer. 400 mg AcONH^ tilsættes, og blandingen koncentreres. Der tilsættes ether, og bundfaldet frafiltreres og tørres. Bundfaldet opløses i en lille mængde 1 N AcOG, opløsningen ledes gennem en "Sephadex"® G-25-søjle (2,2 x 120 cm) under anvendelse af 1 N AcOH som 15 elueringsmiddel. Fraktioner fra 160 ml til 260 ml kombineres og lyofiliseres. Lyofilisatet ledes derpå gennem en søjle af "Amberlite"® IRA-410 (acetatform) og lyofiliseres. Dette lyofilisat renses ved HPLC under anvendelse af en TSK-LS-410-søjle (2,14 x 7,5 cm + 2,14 x 30 cm) , hvorved der fås den 20 ovenfor anførte forbindelse. Udbytte 45 mg, [a]^ = -45,9° (c = 0,7, 0,1 N AcOH), Rf3 (cellulose) 0,20.

Aminosyre analyse: Lys 1,71, Arg 4,71, Ser 1,69, Glu 2,12,

Gly 1,00, Ala 1,03, Met 0,32, Leu 1,30, Phe 1,08 (gennemsnitlig genvinding 77%).

25 Referenceeksempel 2

Fremstilling af bærerprotein-polypeptidkompleks.

Polypeptidet fremstillet i referenceeksempel 1 (16) kobles med thyroglobulin (i det følgende betegnet TG) under anvendelse af fremgangsmåden ifølge Goodfriend et al. [Science, 144, 1334 (1964)], hvorved 2,5 mg polypeptid blandes med 30 3,75 mg TG, hvorpå der tilsættes 2 ml 50 mM phosphatpuffer, og blandingen omrøres grundigt i isvand. Til blandingen sættes dråbevis en opløsning af 30,4 mg carbodiimid-hydro-chlorid i 200 ml destilleret vand. Derefter omrøres blandingen i isvand i 3 timer. Efter endt omsætning foretages dia-35 lyse mod destilleret vand i tilstrækkeligt omfang, hvorefter foretages lyofilisering, og der fås 4,7 mg proteinkompleks.

34

DK 164063 B

Referenceeksempel 3

Fremstilling af enzymbundet antigen til antistof påvisning af EIA.

Det enzymbundne antigen til EIA fremstilles ifølge Kita-5 gawa et al. [Journal of Biochemistry, _79, 233, (1976)].

(1) Indføring af en maleimidogruppe i polypeptidet.

350 nmol af polypeptidet fremstillet i referenceeksempel 1 (16) opløses i 1 ml 100 mM phosphatpuffer (pH 6,8), og opløsningen sættes til en opløsning af 585 yg (1,75 ymol) N-10 (4-carboxycyclohexylmethyl)maleimid-N-hydroxysuccinimid-ester i 70 yl Ν,Ν-dimethylformamid. Blandingen omrøres ved 30°C i 30 minutter. Efter endt omsætning foretages fraktionering under anvendelse af en "Sephadex"® G-25-søjle, hvorved der fås 185 nmol af en polypeptidfraktion indeholdende maleimido-15 gruppen.

(2) Kobling af det maleimidogruppeholdige polypeptid med |3-D-galactosidase.

16,5 nmol af det maleimidoholdige polypeptid fremstillet i referenceeksempel 3 (1) blandes med 3.,3 nmol 3~D-galactosida-20 se. Efter en reaktionstid på 18 timer ved 4°C tilsættes 412,5 nmol 3-mercaptoethanol til afslutning af reaktionen. Det 3“D-galactosidase-koblede polypeptid fraktioneres på en "Sepha-rose" 6B-søjle og anvendes i de følgende eksempler.

Referenceeksempel 4 2 5 ElA-metoden.

Påvisning af antistofaktivitet i serum fra mus immuniseret med proteinkomplekset fremstillet i referenceeksempel 2 eller i hybridom supernatanten gennemføres ved hjælp af EIA-metoden [Immunology, 1, 3, (1978)]. Serumet eller hybridomsupernatan-30 ten fortyndes med puffer A (20 mM Na2HPO^, 100 mM NaCl, 0,1% NaN^, 1 mM MgC^/ pH 7,0), 100 yl af fortyndingen blandes med 100 yl af polypeptidderivatet fremstillet i eksempel 35 3, og omsætningen gennemføres ved 24°C i 24 timer. Derefter tilsættes 100 μΐ 3%'s cellulose koblet med kanin anti-muse IgG, og reaktionen gennemføres ved 24°C i 4 timer. Efter endt reaktion vaskes cellulosen grundigt med puffer A indehol-5 dende 0,5% "Tween"® 20, hvorefter der tilsættes 500 μΐ 20 pg/ml 4-methylumbelliferyl-3-D-galactosid, og efter en reaktionstid på 2 timer ved 37°C tilsættes 3 ml 100 mM carbonatpuffer (pH 10,5) til afslutning af reaktionen. Fluorescensintensiteten måles med et fluorometer (excitation: 365 nm, emission: 450 nm).

10 Referenceeksempel 5

Immunisering.

6 BALB/C hunmus med en alder på 7-8 uger inokuleres subkutant med 40 yg (på proteinbasis) af proteinkomplekset fremstillet i referenceeksempel 2 (som antigenet) i intim blanding med 15 Freunds komplet adjuvans (primær immunisering). To uger efter den primære immunisering inokuleres musene subkutant med antigenet i samme dosis som ovenfor i intim blanding med Freunds ukomplette adjuvans (sekundær immunisering). Efter ydeligere to ugers forløb foretages en tredje immunisering på samme må-20 de som ved den sekundære immunisering. Seks dage efter den tredje immunisering udtages partielle blodprøver fra musene, og serumantistofindholdet bestemmes under anvendelse af den i referenceeksempel 4 beskrevne ElA-metode. Mus nr. γ-2 viser det største antistofindhold, og denne mus underkastes den 25 endelige immunisering ved intravenøs inokulation med 120 yg af antigenet opløst i 0,5 ml vandig natriumchloridopløsning. Antistofindholdet for hver enkelt mus er anført i nedenstående tabel 3.

DK 164063 B

36

Tabel 3

Antipeptid-antistofindhold i immuniserede mus.

Mus nr. ......- - ---------<«>

Primær Sekundær Tredje _immunisering 1) immunisering 2) immunisering 3) 5 γ-l ' N.D. 24,5 2 N.D. 19,3 35,3 3 - N.D. 24,7 4 N.D. 1,3 1,7 5 N.D. 1,8 5,0 10 6 - N.D. 0,8

Normal mus 0,6 0,1 N.D.

1) Serumfortyndingsforhold: 1/1000 2) Serumfortyndingsforhold: 1/6300 3) Serumfortyndingsforhold: 1/7800 4) -: ikke påviselig 15 5) ND: ikke bestemt B/T: (bundet enzymaktivitet/total tilsat enzymaktivitet) x 100 Referenceeksempel 6

Cellefusion.

Der foretages immunisering under anvendelse af fremgangsmåden 20 beskrevet i referenceeksempel 5. 3 dage efter den endelige immunisering udtages milten fra γ-2 musen, filtreres under tryk gennem en rustfri sigte og suspenderes i Eagles minimum essential medium (MEM) til dannelse af en miltcellesus-pension. Til cellefusionen anvendes P3-x63.Ag8.U1 (P3U1) 25 myelomceller udvundet fra BALB/C mus [Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1, (1978)]. Cellefusionen gennemføres ved anvendelse af den oprindelige fremgangsmåde [Nature, 256, 495, (1975)], idet miltceller og P3U1 celler hver for sig vaskes 3 gange med serumfrit MEM, hvorpå de blan-30 des i et forhold på 5:1 (celleantal). Blandingen centrifugeres ved 800 o/m i 15 minutter, hvorved cellerne aflejres.

37

Efter omhyggelig fjernelse af supernatanten løsnes bundfaldet let, der tilsættes 0,3 ml 45%'s polyethylenglycol (PEG) 6000 (Koch-Light), og blandingen henstår i en varmtvandsbeholder ved en temperatur på 37°C i 7 minutter til 5 frembringelse af cellefusion. Derefter tilsættes MEM i en mængde på 2 ml pr. minut. Efter tilsætning af i alt 12 ml MEM centrifugeres den dannede blanding med 600 o/m i 15 minutter, hvorefter supernatanten fjernes. De aflejrede celler suspenderes i RPMI-1640 medium tilsat 10% føtalt kalveserum 10 (RPMI1640-10FCS) i en koncentration på 2 x 10^ P3U1 celler/ml, og i alt 144 huller på 24-hullers multiplader (Linbro) podes med 1 ml suspension pr. hul. Efter podningen inkuneres cellerne ved 37°C i en 5%'s carbondioxidgasinkubator. Efter 24 timers forløb startes HAT-selektiv dyrkning ved tilsætning 15 af RPMI1640-10FCS medium tilsat HAT (1 x 10^ M hypoxanthin, -7 -5 4 x 10 M aminopterin, 1,6 x 10 M thymidin) (HAT medium) i en mængde på 1 ml pr. hul. Den HAT-selektive dyrkning fortsættes, medens 1 ml af det gamle medium erstattes med 1 ml frisk HAT medium 3, 5 og 7 dage efter dyrkningens start. 20 Væksten af hybridomer noteres 10-14 dage efter cellefusionen.

C

Når dyrkningsvæsken bliver gul (ca. 1 x 10 celler/ml), udtages supernatanten, hvorefter den undersøges for tilstedeværelse af antistof ved hjælp af EIA-metoden. På denne måde undersøges supernatanter fra 141 huller, hvori der er kon-25 stateret hybridomvækst. To huller (γ2τ·11 og γ3-100) giver kraftig antistofaktivitet, og to andre huller (γ2-62 og γ2-70) giver svag antistofaktivitet.

Referenceeksempel 7

Kloning.

30 Hybridomer fra 3 huller (γ2-11, 62 og 100), som er positive med hensyn til antistofaktivitet, klones under anvendelse af den begrænsende fortyndingsmetode, idet hybridomerne suspenderes i PRMI1640-20FCS i en koncentration på 2 hybridomer pr. ml, og suspensionen fordeles i mængder på 0,1 ml i hul-35 lerne på en 96 hullers mikroplade (Nunc). I denne fordeling tilsættes 5 x 10 BALB/C muse-thymocyter pr. hul som føde-

DK 164063 B

38 celler. I løbet af ca. 2 uger konstateres celledeling. Super-natanten udtages og undersøges for indhold af antistoffer ved hjælp af EIA-metoden som beskrevet i referenceeksempel 4.

Der konstateres antistofaktivitet i 8 ud af 19 kloner fra 5 γ2-11, i 3 ud af 54 kloner fra γ2-62 og i 5 ud af 47 kloner fra γ2-100.

Referenceeksempel 8

Ascites dannelse ved hjælp af monoklonale antistofproducerende hybridomer.

10 Ascites dannelse frembringes ved intraperitoneal inokulation af BALB/C mus, som er forbehandlet intraperitonealt med g 0,5 ml mineralolie med 1 x 10 γ2-11.1 klonceller, som er i stand til at danne antistoffer med IFN-γ-bindingsaktivitet. Ti dage efter intraperitoneal indgift af hybridomer 15 udtages ascitesvæsken, hvorpå den undersøges for antistof-aktivitet op til en fortynding på 10 . Medens antistofaktiviteten i den tilsvarende kloncellekultursupernantant påvises op til en fortynding på 10^, bevirker dannelsen af ascites (ascitisering) forøgelse af antistofaktiviteten på 20 ca. 1000 gange.

Referenceeksempel 9 Rensning af monoklonalt antistof.

Under anvendelse af 4 ml af den i referenceeksempel 8 fremstillede ascitesvæske som udgangsmateriale foretages monoklo-25 nal antistofrensning under anvendelse af fremgangsmåden ifølge Staehelin et al. [Journal of Biological Chemistry, 256, 0750, (1981)], idet ascitetvæsken først centrifugeres ved 10.000 o/m i 15 minutter til fjernelse af fibrinlignende stoffer, hvorefter den fortyndes med phosphatpuffer-salt-30 opløsning (PBS: 8,1 mM NaH2PC>4, 1,5 mM KH2PC>4, 2,7 mM KCl, 137 mM NaCl, pH 7,2) til en koncentration, hvor den ultra-violette absorption ved 280 nm (A2gg) for fortyndingen ville ligge fra 12 til 14. Derefter sættes mættet vandig ammonium-sulfatopløsning til den fortyndede prøve til en koncentra-35 tion på 47% med hensyn til sulfatet. Blandingen omrøres ved 39 4°C i 60 minutter til udsaltning, hvorefter den centrifugeres (10.000 o/m, 15 minutter) til dannelse af et bundfald. Bundfaldet opløses i 20 mM Tris-puffer (pH 7,9) indeholdende 50 mM NaCl, hvorefter der dialyseres mod 2 liter af den 5 samme puffer. To timer senere erstattes dialyseringsopløsningen med en frisk 2-liter portion af samme opløsning, og dialysen fortsættes i yderligere 15 timer. Derpå fjernes bundfaldet ved centrifugering ved 10.000 o/m i 15 minutter, og supernatanten indstilles på en sådan koncentration, at der 10 fås en A280""væri^ på 20-30. Denne prøve underkastes fraktionering på en "DEAE"-cellulosesøjle (8 ml, Whatman DE^)t som er ækvilibreret med en tilstrækkelig mængde Tris-puffer indeholdende 50 mM NaCl. Efter vidtgående vaskning med den samme puffer ved en strømningshastighed på 1,5 ml/min. for-15 øges NaCl-koncentrationen lineært fra 50 mM til 500 mM. Under disse betingelser påvises antistofaktiviteten hovedsagelig i afgangsfraktionerne.

Referenceeksempel 10 25 ml (65,3 mg) af det monoklonale antistof fra afgangs-20 fraktionerne renset ved anvendelse af fremgangsmåden ifølge referenceeksempel 8 dialyseres natten over mod 0,1 M NaHCO^ (pH 8,3). Separat vaskes 25 ml "AFFI-GEL" 10 (Bio-Rad) omhyggeligt med vand under anvendelse af et glasfilter, hvorefter den suspenderes i 0,1 M NaHCO^-opløsning (pH 8,3) og blandes 25 med ovennævnte antistof. Blandingen omrøres forsigtigt ved 4°c i 4 timer til frembringelse af reaktion, hvorefter den henstår natten over ved 4°C. Den dannede AFFI-GEL 10 vaskes grundigt med 0,1 M NaHCOg-opløsning (pH 8,3) under anvendelse af et glasfilter. Til gelen sættes 25 ml af en opløsning 30 (pH 8,0) indeholdende 0,1 M ethanolamin og 0,15 M NaCl.

Blandingen rystes ved 4°c i en time til blokering af eventuelle uomsatte aktive grupper. Derefter vaskes gelen grundigt med PBS, hvorpå den suspenderes i 25 ml 0,1%'s NaN^-holdig PBS. Suspensionen opbevares ved 4°C. Baseret på 35 mængden af det tilsatte antistof og mængden af antistoffet i det udvundne filtrat viser det sig, at antistoffet er konjugeret til gelen i et forhold på 2,35 mg/ml gel. En søjle

DK 164063 B

40 pakkes med det på denne måde dannede reaktionsprodukt og anvendes som antistofsøj le.

Claims (4)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af praktisk taget rent uglycosyleret rekombinant humant immuninterferonprotein 7 med en specifik aktivitet på mindst 10 E/mg ved dyrkning af 5 en transformant af Escherichia coli, hvis DNA indeholder en basesekvens, som koder for humant immuninterferon, således at humant immuninterferon dannes og akkumuleres i transfor-mantcellerne, lysering af cellerne og rensning af den dannede, humant immuninterferonholdige opløsning, kendetegnet 10 ved, at rensningen udføres ved hjælp af et monoklonalt antistof, som kan danne binding med humant immuninterferon, og som er rettet mod polypeptider med formlen (N) (C) H-X-Lys Arg Ser Gin Met Leu Phe Arg Gly-Y-OH (iv) 15 hvori X betyder en binding eller en peptid- eller aminosyre-rest med 1-16 aminosyrer regnet fra C-terminalen i peptidkæden (N) Ile Gin Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala (C)

20 Ala Lys Thr Gly Lys Arg og Y er en peptid- eller aminosyrerest med 1-5 aminosyrer regnet fra N-terminalen i peptidkæden (N) (C) Arg Arg Ala Ser Gin.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet 25 ved, at basesekvensen, som koder for humant immuninterferon har formlen DK 164063 B (5') TGT TAC TGC CAG GAC CCA TAT GTA AAA GAA GCA GAA AAC CTT AAG AAA TAT TTT AAT GCA GGT CAT TCA GAT GTA GCG GAT AAT GGA ACT CTT TTC TTA GGC ATT TTG AAG AAT TGG AAA GAG GAG AGT

5 GAC AGA AAA ATA ATG CAG AGC CAA ATT GTC TCC TTT TAC TTC AAA CTT TTT AAA AAC TTT AAA GAT (I) GAC CAG AGC ATC CAA AAG AGT GTG GAG ACC ATC AAG GAA' GAC ATG AAT GTC AAG TTT TTC AAT AGC AAC AAA AAG AAA CGA GAT GAC TTC GAA AAG CTG

10 ACT AAT TAT TCG GTA ACT GAC TTG AAT GTC CAA CGC AAA GCA ATA CAT GAA CTC ATC CAA GTG ATG GCT GAA CTG TCG CCA GCA GCT AAA ACA GGG AAG CGA AAA AGG AGT CAG ATG CTG TTT CGA GGT CGA AGA GCA TW CAG-X(3 1) 15 hvor X er TAA, TGA eller TAG.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at Y er Arg Arg Ala Ser Gin.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, 2 eller 3, kendetegnet ved, at X er Lys Arg.