JPH0653067B2 - 新規ハイブリドーマおよびその製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は新規ハイブリドーマおよびその製造法に関す
る。

従来の技術 ケーラーとミルスタインにより開発され〔ネイチヤー，
２５６，４９５（１９７５）〕、近年盛んになって来た
ハイブリドーマを用いたモノクローナル抗体の製造法
は、各々の抗原決定基に対し、単一特異性を示す抗体が
得られることや、粗精製標品に対して得られた抗体につ
いて吸収操作を必要としないことなどのすぐれた特徴を
もっている。またこの他に、抗体取得という面からも、
ハイブリドーマの腹水化により、高力価の抗体が、自由
に、多量に、しかも常に均質な標品を再現性よく得られ
るなど多くの利点がある。この様な意味からハイブリド
ーマによるモノクローナル抗体取得の手法は、多方面に
わたってその有用性が高く評価されている。また、その
使い方も単に抗原検出にとどまらず、抗体カラム作製を
通じて、微量成分の精製に用いたり〔ネイチヤー，２８
５，４４６−４５０，（１９８０）〕、更には、診断
薬，治療薬への応用〔ヨーロピアン ジャーナル オブ
イムノロジー，９，９４−９６，（１９７９）〕も展
開されている。

ヒトのインターフエロン（ＩＦＮ）には、抗原的に異な
るα，β，γ型の少くとも３種のタイプが存在すること
が知られている〔ネーチヤー，２８６，１１０，（１９
８０）〕。γ型インターフエロン（ＩＦＮ−γ）につい
ては、マイトージエンや抗原刺激によって、主としてＴ
リンパ球から産生されることが判っており、別名免疫イ
ンターフエロン（Ｉ−ＩＦＮ）とも呼ばれている〔ザ
インターフエロン システム，スプリンガー社，ニユー
ヨーク，１１頁−２６頁（１９７９）〕。ＩＦＮ−γは
生体内で、種々の免疫反応にともなって産生されること
が予想され、免疫調節に重要な役割を果たしていると考
えられている。また、ＩＦＮ−γの性質としては、α型
インターフエロン（ＩＦＮ−α）やβ型インターフエロ
ン（ＩＦＮ−β）と抗原性が異なることや、誘起剤の種
類が異なることの他に、酸や熱に対する安定性が悪いこ
となども判っている〔ザ インターフエロン システ
ム，スプリンガー社，ニユーヨーク，１１−２６（１９
７９）〕。

一般的にＩＦＮは、生体の産生する抗ウイルス作用をも
つものとして定義されているが、この他に多くの生物活
性をもつことが証明されており、特に抗腫瘍効果を有す
る点で注目されている〔ブラツド，５５，７１１−７２
１，（１９８０）；同誌，５５，８７５−８８４，（１
９８０）〕。

腫瘍の増殖を抑制する方法として、腫瘍細胞の増殖を直
接抑制する方法と、宿主の免疫反応を介して、間接的に
腫瘍を抑制する方法が考えられ、後者の場合、例えばナ
チユラルキラー細胞（ＮＫ）や、マクロフアージの活性
化、或いはキラーＴ細胞の活性化などが考えられる。実
際、ＩＦＮには直接作用の他に、この様な種々の免疫増
強活性があることが証明されている〔バイオケミカ エ
ト バイオフイジカ アクタ，５１６，２３１−２４
７，（１９７８）〕。ＩＦＮ−γはインビトロでのこれ
ら抗腫瘍につながる各種の活性、およびインビボに於け
る抗腫瘍活性が、ＩＦＮ−αやＩＦＮ−βに比べ遥かに
高いことから、その重要性が強く指摘されている〔セル
ラーイムノロジー，４９，３９０−３９４，（１９８
０）〕。

然しながら、インビトロで誘導されるＩＦＮ−γの力価
は一般に低いことや適切なＩＦＮ−γ産生株細胞が少な
いこと、さらに熱や酸に対する安定性が悪いため精製が
むつかしいことなどのためにＩＦＮ−γの大量生産およ
び精製はＩＦＮ−αやＩＦＮ−βに比べ大幅に遅れてい
た。

最近、天然のＩＦＮ−γが単一に出来たという報告があ
るが（プロシジング オブ ナシヨナル アカデミー
オブ サイエンス，７９，１８２０−１８２４，（１９
８２）〕、活性の回収が大変悪く、より効果的な精製法
が待望されている。

一方最近に至り、ヒトＩＦＮ−γ遺伝子のクローニング
がなされ、少くともＩＦＮ−γの一種として、１４６個
のアミノ酸から成る約１７キロダルトンの分子種が、大
腸菌で得られたと報告〔ネーチヤー，２９５，５０３−
５０８，（１９８２）；ヌクレイツク アシツズ リサ
ーチ，１０，２４８７−２５０１，（１９８２）〕さ
れ、遺伝子組み換え法を用いたＩＦＮ−γ（ｒＩＦＮ−
γ）の大量生産が期待出来るようになったが、抗体を用
いない通常の精製法で単一化することは大変な困難が予
想される。

このような視点から、ＩＦＮ−γに対する各種のモノク
ローナル抗体を得ることは、分子種間の対応をつけるの
に重要なだけでなく、天然の、あるいは遺伝子組み換え
法により大腸菌などで作らせたＩＦＮ−γを精製する上
に極めて強力な武器となる。最近に至り、天然のＩＦＮ
−γに対するモノクローナル抗体の取得が報告され〔ネ
ーチヤー，２９６，２５８−２５９，（１９８２）；ザ
エンボジヤーナル，２，１５２７−１５３０，（１９
８３），ジヤーナル オブ イムノロジー，１３３，１
３００−１３０４（１９８４），ジヤーナル オブ バ
イオケミストリー ２５９，４３０１−４３０４（１９
８４），ジヤーナル オブ イムノロジカル メソツゾ
６９，６１−７０（１９８４）〕、該抗体が天然のＩ
ＦＮ−γの精製や定量に用いられることが報告された
が、これらの報告においては、得られたモノクローナル
抗体がＩＦＮ−γのどの部分を認識しているかは全く不
明である。最近に至り、ＩＦＮ−γのＮ末端１番目から
２０番目迄のアミノ酸配列に相当する合成ペプチドに対
する抗体の取得が報告〔ジヤーナル オブ イムノロジ
ー，１２９，２３５７−２３５９（１９８２）〕された
が、報告による抗体は兎で作製されたポリクローナル抗
体である。ポリクローナル抗体に比べ、モノクローナル
抗体は供給面（抗原認識部位，抗体価，親和性等に関し
て、常に一定のものを随時、多量に供給し得る）ですぐ
れているのみならず、ＩＦＮ−γの精製、検出等の応用
面でも結果の再現性が遥かに高く有効である。

発明が解決しようとする問題点 本発明者らは既に、ＩＦＮ−γのｃＤＮＡから推定され
たそのアミノ酸配列のＣ末端部分のアミノ酸配列に相当
する合成ポリペプチドに対するモノクローナル抗体（Ｅ
ＰＣ公開第０１０３８９８号公報）およびＮ末端部分の
アミノ酸配列に相当する合成ポリペプチドに対するモノ
クローナル抗体（特開昭６０−１０７５６９号公報を製
造し、それらの応用開発を行ったが、これらに加え、Ｉ
ＦＮ−γにおいてこれらのモノクローナル抗体の認識部
位以外の部位を認識するモノクローナル抗体を取得する
ことはＩＦＮ−γ，とりわけ遺伝子組み換え法により作
られたＩＦＮ−γをより効率よく精製したり、より感度
よく検出したりする上に極めて重要である。また、モノ
クローナル抗体を用いてＩＦＮ−γを精製したり検出す
る上において、その抗体がペプチドのどの部分を認識し
ているかを確かめ、認識部位の異なる複数のモノクロー
ナル抗体を取得し、それらを目的に応じて使い分けるこ
とができれば、その応用価値は急増する。

本発明者らは、上記課題を解決する新規モノクローナル
抗体を製造し、その性状を明らかにし、さらにその用途
を開発し本発明を完成した。

問題点を解決するための手段および作用 本発明は、遺伝子組み換え技術で製造されたインターフ
エロン−γ蛋白質で免疫したマウスの脾臓細胞由来のリ
ンパ球と、マウスミエローマ細胞株とからなる、第１図
に示されるポリペプチド（II）と結合し、ペプチドPyrr
o Glu-Asp-Pro-Tyr-Val-Lys-Glu-Ala-Glu-Asn-Leu-Lys-
Lys-Tyr-Phe-Asn-Ala-Gly（III）およびペプチドLys-Ar
g-Lys-Arg-Ser-Gln-Met-Leu-Phe-Arg-Gly-Arg-Arg-Ala-
Ser-Gln（IV）のいずれとも結合しないモノクローナル
抗体を産生するクローン化されたハイブリドーマＷＮγ
３−２９．３３株，およびその製造法を提供するもので
ある。

以下本願明細書において特に注記した場合を除きＩＦＮ
−γとは、天然のＩＦＮ−γ（ｎＩＦＮ−γ）および遺
伝子組み換え技術で製造されたＩＦＮ−γ（ｒＩＦＮ−
γ）の双方を包含する。

ｎＩＦＮ−γとは、天然から得られるＩＦＮ−γ（例え
ば、ヒト末梢血リンパ球をインデユーサーで誘導したも
の）やそのＮ末端部分またはＣ末端部分を欠くフラグメ
ント〔ジヤーナル オブ バイオロジカル ケミストリ
ー，２５９，６７９０−６７９７（１９８４）〕の中、
抗ウイルス活性を有するものを意味し、通常糖鎖を有す
る。

ｒＩＦＮ−γには、第１図に示される１４６個のアミノ
酸からなるポリペプチド（II）ならびにポリペプチド
（II）の９番目のアミノ酸がGlnのものおよび１４０番
目のアミノ酸がGlnのものが包含される。またポリペプ
チド（II）のＮ末端アミノ酸から１３１番目までのアミ
ノ酸残基を含み１３２番目以降のいずれかの部分で切断
された１５Ｋスピーシーズやその他のフラグメントも包
含する。さらにポリペプチド（II）のＮ末端アミノ酸か
ら４番目までのいずれかのアミノ酸残基またはペプチド
を欠除したポリペプチドならびにこれらのＣ末端部分を
欠く対応するフラグメントをも包含する。

マウスを免疫には大腸菌を用いて製造された精製ｒＩＦ
Ｎ−γ蛋白質（ＥＰＣ公開第０１１００４４号公報）が
有利に使用できる。

免疫方法は、例えばマウスを免疫する場合、皮下，腹腔
内，静脈内，筋肉内，皮内等のいずれのルートからでも
可能であるが、主として皮下，腹腔内，静脈内に（とり
わけ皮下）注入するのが好ましい。また、接種間隔，接
種量等も可変度は高く、種々の方法が可能であるが、例
えば２週間隔で２〜８回接種し、最終免疫後、１〜５
日、好ましくは２〜４日後の脾細胞を用いる方法がよく
用いられる。接種量は１回にポリペプチド量として、マ
ウス当り０．１μｇ以上、好ましくは１０μｇ〜３００
μｇ用いることが望ましい。

またＩＦＮ−γのアミノ酸配列の一部を有するペプチ
ド、例えば前記したペプチド（III）を用いて、上記ポ
リペプチド（II）と二重免疫によっても製造することが
できる。すなわち、例えばまずポリペプチド（II）を接
種し、その後ペプチド（III）の蛋白複合体を接種し、
さらにポリペプチド（II）およびペプチド（III）の蛋
白複合体を合せて接種する。なおこの免疫方法において
は、接種の順序および免疫原の構成は自由に変更でき、
各接種時の免疫原の総量は上記の範囲で行う。

リンパ球源として脾臓細胞を用いる場合において、脾臓
を摘出する場合はその前に、部分採血を行い、血中の抗
体価の上昇を確認した上で、融合実験を行うことが望ま
しい。

上記の細胞融合は、例えば免疫したマウスのリンパ球
（とりわけ脾臓細胞由来のもの）をヒポキサンチン−グ
アニン−ホスホリボシルトランスフエラーゼ欠損（HGPR
T^-）や、チミジンキナーゼ欠損（TK^-）の様なマーカー
を持った適切な同種ミエローマ等の、リンパ球様細胞株
との間で融合させる。融合には、センダイウイルス，ポ
リエチングリコール（ＰＥＧ）等の融合剤が用いられ
る。もちろんジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）その他
の融合促進剤を加えることも可能である。ＰＥＧの重合
度は、ふつう１０００〜６０００，時間は０．５〜３０
分，濃度は１０％〜８０％等が用いられるが、好ましい
条件の一例として、ＰＥＧ６０００を３５〜５５％で４
〜１０分処理することにより、効率よく融合させること
が出来る。融合細胞は、ヒポキサンチン−アミノプテリ
ン−チミジン培地〔ＨＡＴ培地；ネイチヤー，２５６，
４９５−４９７（１９７５）〕等を用いて、選択的に増
殖させることが出来る。

マウスの血清や増殖して来た細胞の培養上清は、目的と
する抗体産生があるか否かについてスクリーニングを行
うことができるが、抗体価のスクリーニングは次の様に
行うことが出来る。即ち、ＲＩＡ法またはＥＩＡ法等の
方法で調べることが出来るが、これらの方法についても
種々の変法が可能である。好ましい測定法の一例とし
て、ＥＩＡを用いる方法について述べる。固相にｒＩＦ
Ｎ−γを常法に従って固定（例えば９６穴のマイクロタ
イタープレートを固相として用いるとマルチスキヤン等
を用いた迅速な測定が可能となり有利である）させてお
き、これに測定したい培養上清や、マウスの血清を加
え、一定時間、定温（以下４〜４０℃を示す）で反応さ
せる。この後、反応物をよく洗った後、酵素で標識した
抗マウス抗体（山羊，兎などのポリクローナル抗体に例
えばホースラデイツシユペルオキシダーゼ等の酵素を結
合したものを市販品として入手出来る）を加え、一定時
間、定温で反応させる。反応物をよく洗った後、酵素基
質を加え、一定時間，定温で反応させ、その後、生成発
色物を吸光度または螢光度等で測定することができる。

選択培地で増殖を示し、かつＩＦＮ−γへの結合能や免
疫に用いたポリペプチド（Ｉ）に対する抗体活性のみら
れたウエルの細胞は、限界稀釈法等によりクローニング
を行うことが望ましい。クローン化された細胞の上清に
ついて同様にスクリーニングを行い抗体価の高いウエル
の細胞を増やすことにより、免疫したポリペプチド
（Ｉ）と反応性を示すと考えられるモノクローナル抗体
産生ハイブリドーマクローンが得られる。

これらポリペプチド（Ｉ）と反応性を示すハイブリドー
マやそのクローンの産生するモノクローナル抗体がＩＦ
Ｎ−γのどの部分を認識するかということを調べること
は、単にモノクローナル抗体を特定化するという意味だ
けでなく、ＩＦＮ−γの検出や精製におけるモノクロー
ナル抗体の使い方を明確にし、また認識部位の異なる複
数のモノクローナル抗体の組み合わせによる応用展開を
広くする上で重要である。

この目的のためには、例えばペプチド（III），ペプチ
ド（IV）および第１図における５番目から１４６番目ま
でのアミノ酸からなるポリペプチド（Ｖ）を用いること
により、上記により得られるモノクローナル抗体が、ｒ
ＩＦＮ−γのＮ末端部分を認識しているか、Ｃ末端部分
を認識しているか、或いはＮ末端，Ｃ末端以外の部分を
認識しているかを容易に知ることができる。即ち、ポリ
ペプチド（Ｉ）に反応性のあるモノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマのスクリーニング法について前に
述べたが、この方法の中で、固相にポリペプチド（Ｉ）
を固定する代りに、ペプチド（III）またはペプチド（I
V）を用いる方法により有利にこの目的を達成すること
ができる。

さらにこれらクローンの産生する抗体がｎＩＦＮ−γ
（例えばヒト末梢血リンパ球からレクチンとホルボール
エステル等で誘導したもの）およびｒＩＦＮ−γ（例え
ばポリペプチド（II），ポリペプチド（Ｖ）など）を吸
収する能力について生物活性を用いて調べることができ
る。その方法として有利に用いられる一例を次に述べる
が、もちろん種々の変法も可能である。例えばウサギ抗
マウスイムノグロブリン抗体をセルロースビーズ等の担
体に常法に従いカプリングさせておき、これに測定した
いハイブリドーマ上清またはマウスの血清を加え、一定
時間、定温で反応させる。この後反応物をよく洗い一定
量のＩＦＮ−γを加える。ＩＦＮ−γとして、例えばｎ
ＩＦＮ−γやｒＩＦＮ−γを加えた後、一定時間，定温
で反応させ、反応上清中に含まれるＩＦＮ−γの活性を
測定する。この様にして目的とする抗体のＩＦＮ−γ活
性の吸収能を測定することができる。

次に、これらクローンの産生する抗体が、ｒＩＦＮ−γ
（例えばポリペプチド（II），ポリペプチド（Ｖ）な
ど）やｎＩＦＮ−γのもつ抗ウイルス作用（以後ＡＶＡ
と略す）を中和する能力があるか否かを調べることもで
きる。中和活性のある抗体の取得は、該抗体が直接生物
活性に関連した部位を認識していることになるので、Ｉ
ＦＮ−γを含むサンプルから、ＩＦＮ−γを精製した
り、ＥＩＡ法やＲＩＡ法を用いて定量したりする上に於
て、極めて重要である。抗体の中和活性は例えば次の様
にして測ることができる。即ち、一定量のＩＦＮ−γに
対して大過剰量の抗体を加え、一定時間、一定温度で反
応させた後、反応物を後述するＡＶＡにて測定すること
ができる。

このようにしてクローン化されたハイブリドーマは、液
体培地中または哺乳動物の腹腔内で増殖させる。例え
ば、液体培地たとえばＲＰＭＩ−１６４０に０．１〜４
０％の牛血清を加えた培地等で２〜１０日間、好ましく
は３〜５日間培養することにより、培養液から該モノク
ローナル抗体を得ることができるが、この他にマウス等
の適切な哺乳動物の腹腔内に接種し、細胞を増殖させ、
腹水を採取することにより、細胞培養上清よりも遥かに
高力価の抗体を、多量に効率よく取得することができ
る。このためには、例えばマウスの場合、ミネラルオイ
ル等を前もって接種したＢＡＬＢ／Ｃ等のマウスに１×
１０^４〜１×１０^７個、好ましくは５×１０^５〜２×１
０^６個のハイブリドーマを腹腔内等に接種し、７〜２０
日後、好ましくは１０〜１４日後に腹水液等を採取す
る。腹水に生成蓄積した抗体は、例えば硫安分画，ＤＥ
ＡＥ−セルロースカラムクロマト等により、容易にモノ
クローナル抗体を純粋な免疫グロブリンとして単離する
ことができる。

本発明のモノクローナル抗体は、下記の性状を有する。

(1)ｎＩＦＮ−γおよびポリペプチド（II）と結合す
る。

(2)第１図における第１番目から第１３１番目までのア
ミノ酸からなるポリペプチド（１５Ｋスピーシーズ）と
結合する。

(3)ペプチド（III）およびペプチド（IV）のいずれとも
結合しない。

(4)ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βとは結合しない。

(5)ｎＩＦＮ−γおよびポリペプチド（II）の抗ウイル
ス活性を中和する。

(6)ポリペプチド（Ｖ）を認識しその抗ウイルス活性を
中和する。

(7)オクタロニー法による検定によりＩｇＧ１のサブク
ラスの抗体に属する。

(8)ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動におい
て、標準免疫グロブリンのＨ鎖およびＬ鎖の分子量に完
全に一致する２本のバンドのみを示す。

なお本モノクローナル抗体は安全に製造，使用保管する
ことができる。

本発明により得られるモノクローナル抗体は、ＥＩＡ法
〔イムノケミストリー，１５，４２９−４３６（１９７
６）〕或いはＲＩＡ法〔サイエンス，１５８，１５７０
−１５７２（１９６７）〕を活用することにより、生体
中の、或いは試験管内での微量のＩＦＮ−γの検出に用
いることができることの他に、たとえば抗体カラムを作
製することにより、今迄大変困難とされていた天然の、
或いは遺伝子組みかえにより作られるＩＦＮ−γを、非
常に効率良く精製するのに使用することができる。

当発明において得られたモノクローナル抗体をＩＦＮ−
γの定量に用いる場合、例えば当抗体とＩＦＮ−γを含
む資料とを一定時間，定温で反応させた後、予め固相に
固定したＩＦＮ−γに上記反応物を加え一定時間，定温
で反応させ洗った後、酵素標識した抗マウス抗体を加え
反応させ、更に酵素基質を加え一定時間反応させマルチ
スキヤンを用いた色素量の定量を行うことにより間接的
にＩＦＮ−γ量を測定するいわゆるＥＬＩＳＡ（エンザ
イム リンクド、イムノソルベントアツセイ）法等によ
る測定が可能である。

又、これらのモノクローナル抗体はＩＦＮ−γのＮ末端
およびＣ末端部分以外の部分を認識する抗体であるの
で、例えばこれらの抗体と別個に、ＩＦＮ−γのＮ末端
（特開昭６０−１０７５６９号公報）又はＣ末端部分
（ＥＰＣ公開第０１０３３９８号公報）を認識するモノ
クローナル抗体を用いて、これら各々の抗体を第１抗
体，第２抗体として用い、第１抗体を固相に固定し、こ
れに測定したいＩＦＮ−γを含む試料を加え、一定時
間，定温で反応させよく洗った後、例えば酵素標識した
第２抗体を加え、一定時間，定温で反応させ、さらに酵
素基質を加えて一定時間反応させた後、マルチスキヤン
等を用い比色法により定量する、いわゆるサンドウイツ
チ法による定量が可能となるがその組合せにより非常に
高感度にＩＦＮ−γが検出できまた特殊な分子種のみを
測定し分けたりすることもできる。

これらの反応において、酵素標識抗体の代りに¹²⁵Ｉな
どのラジオアイトープ標識抗体を用いたＲＩＡによる定
量法も可能であるし、また個々の反応ステツプについて
は種々の変法はもちろん可能であり、当発明に記載した
方法に限定されるものではない。

また本発明において得られるモノクローナル抗体を用い
てＩＦＮ−γを効率よく精製することができる。該モノ
クローナル抗体はしかるべき担体に化学的に結合させ、
カラムに充填し抗体カラムとして有利に使用できる。

抗体カラムの製造は、例えばハイブリドーマを接種した
腹水等から純粋に精製した本発明のモノクローナル抗体
を適切な担体とカプリングさせることにより、以下の様
な方法でできる。

用いる担体は、カプリングの後にＩＦＮ−γが特異的に
効率よく吸着され、その後適切な溶出が可能なものであ
ればどの様なものでもよいが、一例として蛋白の一級ア
ミンが結合し易い様に活性化されたアガロースゲルビー
ズ、例えばアフイゲル−１０（バイオラド社製）などが
以下に述べる様な方法で好都合に用いられる。アフイゲ
ル−１０と抗体との反応は、０．００１〜１Ｍ、好まし
くは０．１Ｍのバイカーボネート等の緩衝液中で反応を
行なう。反応条件は０°〜２０℃，１０分〜２４時間、
種々のpHが可能であるが、好ましくは４℃，４時間，pH
３〜１０の条件が用いられる。混合するアフイゲル−１
０と抗体の量比は、アフイゲル１mlに対し抗体量が約５
０mg位迄は多ければ多い程多くの抗体がつくので、この
範囲内でいくらでもよいが、結合効率およびアフイニテ
イカラムクロマトグラフイーにおける精製効率を考慮し
て１０〜３０mgの抗体が好都合に用いられる。この様に
してできた抗体−担体結合物は、反応に用いた緩衝液で
よく洗った後、数日放置するか、もしくは最終濃度０．
０５〜０．１Ｍのエタノールアミン・塩酸を加え４℃で
１時間反応させる等の方法により、残存する未反応の活
性基をブロツクした後、適切なカラムにつめることによ
り、抗体カラムとして使用できる。

上記の抗体カラムで精製するに際しては、たとえばヒト
ＩＦＮ−γ（ポリペプチド（II）など）含有資料を中性
附近の緩衝液、たとえばリン酸緩衝液やトリス・塩酸緩
衝液に溶解して抗体カラムに吸着させる。次にカラムを
同じ緩衝液で洗浄したのち、ＩＦＮ−γを溶出する。溶
出液としては、例えばグアニジン塩（塩酸塩，硫酸塩な
ど）や尿素等のたん白変性剤を含む溶液，チオシアン化
カリなどカオトロピツクイオンを含む溶液，弱酸性溶液
たとえば酢酸溶液，エチレングリコールを含む溶液，資
料にくらべ抗体に、より結合し易いペプチドを含む溶
液，高濃度塩溶液などおよびこれらを組み合せた溶液な
どが用いられ、ヒトＩＦＮ−γの分解をあまり促進しな
いものが好ましい。

カラム溶出液は、常法により緩衝液で中和する。必要に
より再度上記の抗体カラムによる精製操作を行なうこと
ができる。

ここで得られるヒトＩＦＮ−γ蛋白質溶液は透析に付
し、必要によりこれを凍結乾燥により粉末とすることが
できる。凍結乾燥に際しては、血清アルブミン，ヒドロ
キシエチル澱粉，ソルビトール，マンニトール，デキス
トロース，マルトース，グリセロース，グルタチオン，
アスコルビン酸ソーダー，グリシンなどの安定剤を加え
ることができる。

該抗体カラムを用いれば、ポリペプチド（II）などのｒ
ＩＦＮ−γのみならず、そのＮ末端から４番目までのい
ずれかのアミノ酸残基またはペプチドを欠除したポリペ
プチド（ポリペプチド（Ｖ）など）やこれらをコードす
る塩基配列を含有する形質転換体等を用いるＩＦＮ−γ
を製造，精製する際に生成するＣ末端部分を欠いた各種
ＩＦＮ−γフラグメント（１５Ｋスピーシーズなど）
〔カポン，D.J.ら，第３回 アニユアル インターナシ
ヨナル コングレス フオア インターフエロン リサ
ーチ（１９８２），マイアミ，フロリダ；ＥＰ−Ａ−０
１３８０８７号公報〕の精製も有利に実施することがで
きる。

本願明細書中記載したウイルス活性測定は、ヒト羊膜由
来ＷＩＳＨ細胞に対する水泡性口内炎ウイルス（ＶＳ
Ｖ）の細胞変性効果阻止試験によった。

なおここでＩＦＮの活性としてのＵ／ml（ユニツト／m
l）の出し方は以下の様に行った。ユニツトの確定した
国際標準ＩＦＮ−αと白血球由来の粗ＩＦＮ−γをヒト
羊膜由来ＦＬ細胞株に対するＶＳＶの細胞変性効果阻止
試験を用いて測定し、その力価の比較から白血球由来粗
ＩＦＮ−γの力価を決定しＩＦＮ−γの標準品とした。
目的とする資料中のＩＦＮ−γの力価算定のためには、
常にこの標準ＩＦＮ−γを並べて前述のＷＩＳＨ−ＶＳ
Ｖの系でアツセイを行い、その比率から力価を算出し
た。

本願明細書において、アミノ酸，ペプチド，その他に関
し略号で表示する場合、それらはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ
（Commission on Biological Nomenclature）による略
号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであ
り、その例を次に挙げる。また、アミノ酸などに関し光
学異性体がありうる場合は、特に明示しなければＬ体を
示すものとする。

ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン ＲＮＡ ：リボ核酸 ｄＡＴＰ：デオキシアデノシン三リン酸 ｄＴＴＰ：デオキシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン三リン酸 ｄＣＴＰ：デオキシシチジン三リン酸 ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸 ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム Ｇｌｙ ：グリシン Ａｌａ ：アラニン Ｖａｌ ：バリン Ｌｅｕ ：ロイシン Ｉｌｅ ：イソロイシン Ｓｅｒ ：セリン Ｔｈｒ ：スレオニン Ｃｙｓ ：システイン Ｍｅｔ ：メチオニン Ｇｌｕ ：グルタミン酸 Ｐｙｒｒｏ Ｇｌｕ：ピログルタミン酸 Ａｓｐ ：アスパラギン酸 Ｌｙｓ ：リジン Ａｒｇ ：アルギニン Ｈｉｓ ：ヒスチジン Ｐｈｅ ；フエニールアラニン Ｔｙｒ ：チロシン Ｔｒｐ ：トリプトフアン Ｐｒｏ ：プロリン Ａｓｎ ：アスパラギン Ｇｌｎ ：グルタミン 実施例 以下、実施例および参考例により本発明をより具体的に
説明するが、本発明はこれらに制限されるものではな
い。

なお実施例において開示するマウス Ｂ ハイブリドー
マＷＮγ３−２９．３３は、財団法人 発酵研究所（Ｉ
ＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ−５０００１として寄託されて
いる。

また参考例において開示する形質転換体エシエリヒア
コリ２９４／pHITtrp１２０１−ｄ４は財団法人 発酵
研究所（ＩＦＯ）にＩＦＯ−１４３６５として、昭和５
９年９月４日から通商産業省工業技術院微生物工業研究
所（ＦＲＩ）に受託番号ＦＥＲＭＰ−７８２８として寄
託されている。

実施例１ (i)免疫原の製造 免疫原として用いた、ポリペプチド（II）（ｒＩＦＮ−
γ）はＥＰＣ公開第０１１００４４号公報記載の方法に
より、ポリペプチド（III）と牛サイログロブリンの結
合物（ＩＦＮ−γＮＰ−ＴＧ）は特開昭６０−１０７５
６９号公報記載の方法により製造した。

(ii)免疫 ポリペプチド（II）をタンパク量として５０μｇ，フロ
インドコンプリートアジユバントとよく混合し、７〜８
週令のＢＡＬＢ／Ｃ雌マウスの皮下に接種した（初回接
種）。初回接種の２週後、同量のポリペプチド（II）を
フロインドインコンプリートアジユバント（ＦＩＡ）と
よく混合し、皮下に接種した（二次接種）。三次・四次
接種は２週間隔で二次接種と同じ方法で行なった。五
次，六次，七次接種は、ポリペプチド（II）をタンパク
量として４０μｇおよびＩＦＮ−γＮＰ−ＴＧをタンパ
ク量として４０μｇ，ＦＩＡとよく混合し、皮下に２週
間隔で接種した。七次接種の２週後、ポリペプチド（I
I）２５μｇ，ＩＦＮ−γＮＰ−ＴＧ４０μｇを０．５m
lの生理食塩水に浮遊させ、静脈内に最終免疫を行なっ
た。

(iii)ＥＬＩＳＡ法を用いた抗体アツセイ法 上記(ii)の方法で免疫したマウス血清あるいは実施例１
(iv)および(v)で得られるハイブリドーマ培養上清中の
抗体活性はエンザイム リンクド イムノソーベント
アツセイ（ＥＬＩＳＡ）法を用いて検索した。即ち、ポ
リペプチド（II）を１５μg/mlになるよう０．１Ｍ重炭
酸ナトリウムを含有したリン酸緩衝液（pH８．０）に浮
遊させ、９６ウエルマイクロプレートの各ウエルに１０
０μｌずつ分注し、４℃で２４時間反応させた。反応
後、ウエルの余剰の結合部位をふさぐため２％牛血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）含有リン酸緩衝液を１００μｌずつ
分注し、４℃で２４時間処理し、ＥＬＩＳＡに使用する
プレートを作製した。

以上のように調製したプレートに血清あるいはハイブリ
ドーマ培養上清１００μｌを加え、２４℃で３時間反応
させた。反応後、生理食塩水でよく洗浄し、ホースラデ
イシユペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）でラベルしたヤギ抗
マウスイムノグロブリン抗体を各ウエルに１００μｌ加
え、室温で３時間反応させた。反応終了後、各ウエルを
リン酸緩衝液でよく洗浄し、１０μｌの０．１Ｍクエン
酸緩衝液に２２mgのオルソフエニレンジアミン，１０μ
ｌのＨ_２Ｏ_２を加えた酵素基質溶液１００μｌを各ウエ
ルに加えて、酵素反応を室温で１５分行ない、４規定硫
酸で反応を停止させた。反応停止後、タイターテツクマ
ルチスキヤン（フロー社製）を用いて波長４９２ｎｍで
発色色素量を測定し、抗体の活性を判定した。

(iv)細胞融合およびハイブリドーマ上清の抗体の測定 実施例１(ii)の最終免疫の３日後マウスの脾臓を摘出
し、ステンレスメツシユで圧迫，過し、イーグルズ・
ミニマム・エツセンシヤルメデイウム（ＭＥＭ）に浮遊
させ、脾臓細胞浮遊液を得た。細胞融合に用いる細胞と
して、ＢＡＬＢ／Ｃマウス由来ミエローマ細胞Ｐ３−×
６３，Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）を用いた〔カレント
トピツクス イン マイクロバイオロジー アンド イ
ムノロジー，８１，１−７（１９７８）〕。細胞融合
は、原法〔ネイチヤー，２５６，４９５−４９７（１９
７５）〕に準じて行なった。即ち、リンパ球含有脾臓細
胞およびＰ３Ｕ１をそれぞれ血清を含有しないＭＥＭで
３度洗浄し、脾臓細胞とＰ３Ｕ１数の比率を５：１にな
るよう混合して、８００回転で１５分間遠心を行なって
細胞を沈殿させた。上清を充分に除去した後、沈殿を軽
くほぐし、４５％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）６
０００（コツホライト社製）を０．３ml加え、３７℃温
水槽中で７分間静置して融合を行なった。融合後細胞に
毎分２mlの割合でＭＥＭを添加し、合計１２mlのＭＥＭ
を加えた後６００回転１５分間遠心して上清を除去し
た。この細胞沈殿物を１０％牛胎児血清を含有するＲＰ
ＭＩ１６４０メデイウム（ＲＰＭＩ１６４０−１０ＦＣ
Ｓ）にＰ３Ｕ１が１ml当り２×１０^５個になるよう浮遊
し、２４穴マルチデイシユ（リンブロ社製）に１ウエル
１mlずつ１４４ウエルに播種した。播種後、細胞を３７
℃で５％炭酸ガスフラン器中培養した。２４時間後、Ｈ
ＡＴ（ヒポキサンチン１×１０^-4Ｍ，アミノプテリン４
××１０^-7Ｍ，チミジン１．６×１０^-5Ｍ）を含んだＰ
ＲＭＩ１６４０−１０ＦＣＳ培地（ＨＡＴ培地）を１ウ
エル当り１mlずつ添加することにより、ＨＡＴ選択培養
を開始した。ＨＡＴ選択培養は、培養開始３，５，７日
後に旧液を１ml捨てたあと、１mlのＨＡＴ培地を添加す
ることにより継続した。ハイブリドーマの増殖は、細胞
融合後１０〜１４日で播種した全ウエルに認められ、培
養液が黄変したとき（約１×１０^６／ml）、上清を採取
し、ポリペプチド（II）をコートしたマイクロプレート
を用いたＥＬＩＳＡ法（実施例１(iii)記載）で、抗体
の有無を検討した。抗体活性は、１４４ウエル中３ウエ
ルに認められた。

次に、これら３ウエルの抗体が、ＩＦＮ−γを認識する
かどうか抗ウイルス活性の吸収により検索した。すなわ
ち、ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体を結合させた３％セルロ
ース溶液５００μｌに培養上清を５００μｌ加え、４℃
で２４時間反応させ。反応後セルロースを生理食塩水で
よく洗浄し、２２００Ｕ／mlのＩＦＮ−γを加え、４℃
で２４時間反応させ、上清中のＩＦＮ活性を測定した。
ＩＦＮ−γサンプルとして、実施例１(i)記載のポリペ
プチド（II）を用いた。

ＩＦＮ活性の測定は、マイクロプレートを用いた細胞変
性効果（ＣＰＥ）リーデイング法で測定した〔アプライ
ド マイクロバイオロジー，１６，１７０６−１７０７
（１９６８）〕。すなわち、９６穴マイクロプレート
（ヌンク社製）全てのウエルに５０μｌのＭＥＭを入
れ、最初のウエルにＩＦＮサンプルを５０μｌ加えて、
連続的に２倍希釈を行なった。このようにした各ウエル
に、ＷＩＳＨ細胞を２０％ＦＣＳ含有ＭＥＭに１ml当り
４×１０^５個になるよう調整した細胞浮遊液５０μｌを
加え、２４時間，３７℃，炭酸ガスフラン器で培養し
た。培養後、水泡性口内炎ウイルス（ニユージヤーシー
株）を２０００TCID₅₀（テイツシユーカルチユアインフ
エクテイングドーズ５０）になるようＭＥＭで調整し、
その５０μｌを各々のウエルに加え、３７℃，炭酸ガス
フラン器内で培養した。約３５時間後、ＩＦＮサンプル
を加えていないウエルの細胞が１００％ＣＰＥを起こし
た時点で、各ウエルのＣＰＥを顕微鏡で観察し、５０％
のＣＰＥを起こしているウエルのＩＦＮ−サンプルの希
釈数の逆数をもってＩＦＮの力価とした。

その結果、３ウエル（ＷＮγ３−１６，２９，４５）か
らの抗体がｒＩＦＮ−γ（ポリペプチド（II））の抗ウ
イルス活性を吸収することが分り、そのうちの１つ（Ｗ
Ｎγ３−２９）は、強い吸収能を示した（第１表）。

(v)クローニング 上記(iv)で得られたポリペプチド（II）に強い結合性を
示す抗体を産生するハイブリドーマＷＮγ３−２９を、
限界希釈法によりクローニングを行なった。すなわち、
ハイブリドーマが２個/mlになるようＲＰＭＩ−２０Ｆ
ＣＳに浮遊させ、９６穴マイクロプレート（ヌンク社
製）に１ウエル当り、０．１mlずつ分注した。分注する
際、フイーダー細胞としてＢＡＬＢ／Ｃマウスの胸腺細
胞をウエル当り５×１０^５個になるように加えた。この
ようにして、約２週間後に細胞の増殖が認められるよう
になった細胞の培養上清を採取して、抗体の有無を実施
例１(iii)記載のＥＬＩＳＡ法で調べた。その結果、得
られた４８クローン中３８クローンに抗体活性を認めた
（第２図）。

以後の実験ではこれらクローンの中の代表的なクローン
としてマウス Ｂ ハイブリドーマＷＮγ３−２９．３
３を選んで実験に用いた。

(vi)抗体の認識部位の検討 上記(v)で得られたポリペプチド（II）に強い結合性を
示すモノクローナル抗体が、ＩＦＮ−γのどの部位を認
識するのかを検討した。すなわち、ハイブリドーマＷＮ
γ３−２９．３３の培養上清５０μｌとペプチド（II
I）（ＩＦＮ−γＮＰ）またはペプチド（IV）（ＩＦＮ
−γＣＰ）をそれぞれ２０μg/mlに調製したもの５０μ
ｌとを混合し、３７℃で１時間反応させた後、この混合
液中の抗体価を、実施例１(iii)記載のＥＬＩＳＡ法で
検討した。なお対照はペプチド（III）またはペプチド
（IV）溶液のかわりにＨＡＴ培地を用いた。この実験
で、抗体がＩＦＮ−γＮ末部を認識するものならばＩＦ
Ｎ−γＮＰにより、ＩＦＮ−γＣ末部を認識するものな
らば、ＩＦＮ−γＣＰにより抗体の活性基がマスクさ
れ、マイクロプレート上のｒＩＦＮ−γに結合しない筈
である。結果は第２表に示したように、ＷＮγ３−２
９．３３モノクローナル抗体のマイクロプレート上のｒ
ＩＦＮ−γへの結合は、ＩＦＮ−γＮＰまたはＩＦＮ−
γＣＰによって阻害されなかった。

従ってこの抗体は、第１図における４番目から２１番目
および１３１番目から１４６番目以外のアミノ酸部分を
認識することが分かった。なお、対照として用いたＩＦ
Ｎ−γＮ末部を認識するＷＮγ２−７６．５３モノクロ
ーナル抗体特開昭６０−１０７５６９号公報参照），Ｃ
末部を認識するγ２−１１．１モノクローナル抗体（Ｅ
ＰＣ公開No.０１０３８９８号公報参照）のマイクロプ
レート上のポリペプチド（II）への結合は、それぞれペ
プチド（III）およびペプチド（IV）によって阻害され
た。

実施例２モノクローナル抗体の製造 (i)抗体産生ハイブリドーマの腹水化および腹水からの
抗体精製 クローニングによって得られたマウスＢハイブリドーマ
ＷＮγ３−２９．３３細胞１×１０^６個を、あらかじめ
０．５mlのミネラルオイルを腹腔内に投与しておいたＢ
ＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内に接種することにより腹水化
を行なった。ハイブリドーマを腹腔に投与して１０日
後、腹水を採取した。得られた腹水９．７mlから、ステ
ーリンら〔ジヤーナル オブ バイオロジカルケミスト
リー，２５６，９７５０−９７５４（１９８１）〕の方
法に準じてモノクローナル抗体を精製した。まず腹水か
らフイブリン様物質を除去するため１０，０００回転１
５分間遠心した後、リン酸緩衝液−食塩水（ＰＢＳ：
８．１ｍＭ−Na₂HPO₄，１．５ｍＭ KH₂PO₄，２．７ｍ
Ｍ KCl，１３７ｍＭ NaCl，pH７．２）で２８０ｎｍ
の紫外部吸収（Ａ₂₈₀）が１２〜１４の値を示す濃度に
希釈した。希釈後サンプルに飽和硫酸アンモニウム溶液
を４７％の濃度になるように加え、４℃で攪拌しながら
６０分間塩析を行ない、その後遠心（１０，０００回
転，１５分間）を行なって沈殿物を得た。沈殿物を５０
ｍＭ NaCl含有２０ｍＭトリス緩衝溶液（pH７．９）に
溶遊し、同溶液２に対して透析を行なった。２時間
後、２の新しい同じ透析液に換え、さらに１５時間透
析を行なった。透析後、沈殿を除去するため１００００
回転１５分間遠心を行ない、上清をＡ₂₈₀の値が２０〜
３０の濃度になるように調整した。このサンプルを充分
量の５０ｍＭ−NaCl含有トリス緩衝溶液で平衡化した１
７mlのＤＥＡＥセルロースカラム（ワツトマンＤＥ₅₂）
にかけ、５０ｍＭ NaCl含有トリス緩衝溶液でよく洗っ
た後、５０ｍＭ−５００ｍＭ NaClを含む同緩衝液の濃
度勾配塩溶液を用いて１．５ml／分の流出速度で分画を
行なって素通り分画を濃縮し、モノクローナル抗体ＷＮ
γ３−２９．３３を得た。抗体の純度の確認にはラエム
リらの方法〔ネイチヤー，２２７，６８０−６８５（１
９７０）〕に準じてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動を用いた。すなわち、硫安塩析し、ＤＥＡＥセル
ロースカラムで素通りした分画を、２−メルカプトエタ
ノールで還元し、アクリルアミド濃度１０％のゲルを用
いて１８０ボルトで２．５時間泳動を行なった。その結
果、分子量５２Ｋ前後にＨ鎖，２８Ｋ前後にＬ鎖の２つ
のバンドが認められた（第３図）。

(ii)モノクローナル抗体のＩＦＮ−γに対する結合能お
よび中和能 ＷＮγ３−２９．３３モノクローナル抗体のＩＦＮ−γ
に対する結合能，および中和能を、γ２−１１．１モノ
クローナル抗体，ＷＮγ２−７６．５３モノクローナル
抗体と比較検討した。結合能：ウサギ抗マウスＩｇＧ抗
体を結合させた３％セルロース溶液５００μｌにそれぞ
れ精製したモノクローナル抗体を５００μｌ（約２５μ
ｇの抗体含有）加え、４℃で２４時間反応させた。反応
後セルロースを生理食塩水でよく洗浄し、５５０Ｕ／ml
のｒＩＦＮ−γを加え、４℃で２４時間反応させ、上清
中のＩＦＮ活性を実施例１(iv)記載のＣＰＥリーテイン
グ法で測定した。ＩＦＮ−γサンプルとして、ポリペプ
チド（II）およびヒト末梢血リンパ球をコンカナバリン
Ａ４０μg/mlと１２−Ｏ−テトラデカノイル−ホルボー
ル−１３−アセテート１５ng/mlで刺激して７２時間後
採取した上清（ｎＩＦＮ−γ）を用いた。また対照とし
て５００μｌのＩＦＮ−α（ナマルバ細胞をセンダイウ
イルス１０ＨＡユニツトで刺激して４８時間後の培養上
清で５５０Ｕ／mlのＩＦＮ−αを含む），５００μｌの
ＩＦＮ−β（リー・バイオモレキユラー・リサーチラボ
ラトリーズ社から購入したもの５５０Ｕ／mlのＩＦＮ−
βを含む）を用いた。その結果、ＷＮγ３−２９．３３
モノクローナル抗体は、これまでに得られていたモノク
ローナル抗体よりＩＦＮ−γに対して強い結合性を示し
こと、およびＩＦＮ−α，ＩＦＮ−βには全く結合性を
示さないこと等が分かった（第３表）。中和能：上記の
２種のＩＦＮ−γ（ｎＩＦＮ−γ，ポリペプチド（I
I）），ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−β（力価は何れも上
記と同じ）それぞれ５００μｌに、精製した抗体５００
μｌ（約２５μｇの抗体含有）を加え、４℃で２４時間
反応させた。反応後反応液中のＩＦＮ活性をＣＰＥリー
デイング法で測定した。その結果、ＷＮγ３−２９．３
３モノクローナル抗体は、ｎＩＦＮ−γ，ポリペプチド
（II）の抗ウイルス活性をほゞ完全に中和し、ＷＮγ２
−７６．５３抗体より強い中和能を示したが、ＩＦＮ−
α，βに対しては中和活性を持たないことが分かった
（第４表）。

(iii)モノクローナル抗体のポリペプチド（Ｖ）に対す
る中和能 参考例の方法で得たポリペプチド（Ｖ）に対してＷＮγ
３−２９．３３モノクローナル抗体が反応するかどうか
を実施例２(ii)記載の中和法で検討した。すなわち、１
３７０Ｕ／mlの抗ウイルス活性を示すポリペプチド
（Ｖ）含有上清５００μｌと等量の精製した抗体（約２
５μｇの抗体含有）を加え２４℃で２４時間反応させ、
残存するＩＦＮ活性をＣＰＥリーデイング法で測定し
た。その結果、ＷＮγ３−２９．３３モノクローナル抗
体は、ポリペプチド（Ｖ）の抗ウイルス活性をほぼ完全
に中和することが分かった（第５表）。本実験の結果お
よび，実施例２(ii)の結果から、該モノクローナル抗体
は、第１図における２２番目から１３０番目までのアミ
ノ酸配列の何れかのエピトープを認識するものであるこ
とが判明した。

(iv)モノクローナル抗体のサブクラス ハイブリドーマＷＮγ３−２９．３３培養上清中のモノ
クローナル抗体とウサギ抗マウスＩｇＧ１，Ｇ２ａ，Ｇ
２ｂ，Ｇ３抗体（マイルス社）との寒天内沈降反応（イ
ムノロジカルメソツド ゲル デイフユージヨンテクニ
ツク ブラツクウエルオツクスフオード １９６４年）
により抗体のサブクラスを検討した。結果は、モノクロ
ーナル抗体とウサギ抗マウスＩｇＧ１抗体との間に著明
は１つのバンドが認められ、他の抗マウスＩｇＧ抗体と
の間には、バンドの形成はみられなかった（第６表）。
従って当モノクローナル抗体は、ＩｇＧ１サブクラスに
属するものであることが判明した。

実施例３ 本発明のモノクローナル抗体とＩＦＮ−γＣ
末部に対するモノクローナル抗体γ３−１１．１（ＥＰ
Ｃ公開第０１０３８９８号公報参照）を用いたサンドイ
ツチ法によるＩＦＮ−γの定量法 (i)ＷＮγ３−２９．３３結合固相およびγ３−１１．
１酵素標識体を用いるサンドイツチＥＩＡ (1)γ３−１１．１酵素標識体の作製 γ３−１１．１モノクローナル抗体（ＥＰＣ公開第０１
０３３９８号公報参照）を５mg含む０．１Ｍリン酸緩衝
液（pH６．５）１．４mlに０．４１５mgのＳ−アセチル
メルカプトサクシニツクアンハイドライドを含むジメチ
ルホルムアミド５０μｌを加え、室温で４０分間反応さ
せた。反応液に１３０μｌの０．２Ｍトリス塩酸緩衝液
（pH７．０），１３μｌの０．２ＭＥＤＴＡ溶液および
１３０μｌのヒドロキシルアミン溶液を加え、室温で５
分間反応させたのち、セフアデツクスＧ−２５のカラム
クロマトグラフイーで分離し、チオール基が導入された
抗体画分を得た。

一方、ホースラデイツシユ ペルオキシダーゼ（ＨＲ
Ｐ）１０mgを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（pH６．８）
１．４mlに４．２mgのＮ−（４−カルボキシシクロヘキ
シルメチル）マレイミドのＮ−ヒドロキシサクシニミド
エステルを含むジメチルホルムアミド溶液１００μｌを
加え、室温で６０分間反応させた。反応液をセフアデツ
クスＧ−２５のカラムクロマトフラフイーで分離し、マ
レイミド基を導入した酵素画分を得た。このようにして
得たＳＨ基を導入した抗体画分と、マレイミド基を導入
した酵素画分とをコロジオンバツクを用いて４℃で一晩
反応させた。反応液をウルトロゲルＡｃＡ３４のカラム
クロマトグラフイーで分離し、抗体（γ３−１１．１）
−酵素標識体を製造した。

(2)ＷＮγ３−２９．３３結合固相の作製 ９６ウエルのマイクロテスト用プレート（ヌンクーイム
プレートＩ：ヌンク社（デンマーク）製）の各ウエルに
ＷＮγ３−２９．３３モノクローナル抗体溶液（３０μ
g/ml，０．１Ｍ炭酸緩衝液（pH９．６）１５０μｌを注
入し、４℃で一晩放置した。ＰＢＳ（０．１５Ｍ NaCl
を含むpH７．４の０．０１Ｍリン酸緩衝液）３００μｌ
で洗浄後、１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．
００５％チメロサールを含む０．０２Ｍリン酸緩衝液
（pH７．０）３００μｌを注入し、４℃で保存した。

(3)操作方法 上記(2)で製造したプレートをＰＢＳで洗浄後、各ウエ
ルに緩衝液Ｂ（１０％仔牛血清，および０．００５％チ
メロサールを含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（pH６．
５））５０μｌおよび緩衝液Ｂで希釈した標準ｒＩＦＮ
−γ（ポリペプチド（II））１００μｌを加え、室温で
一晩放置した。ＰＢＳで洗浄後、緩衝液Ｂで酵素濃度と
して５００ng/mlに希釈したγ３−１１．１酸素標識体
１５０μｌ加え、室温で４時間反応させた。各ウエルを
ＰＢＳで洗浄後、基質液として０．２％Ｏ−フエニレン
ジアミンおよび０．０２％過酸化水素を含む０．１Ｍク
エン酸緩衝液（pH５．５）１００μｌを加え、室温で２
０分間反応させた。２Ｍ硫酸１００μｌを加えて酵素反
応を停止させたのち、各ウエルの４９２ｎｍの吸光度を
タイターテツク・マルチスキヤン（フロー社 米国）で
測定した。

第４図に得られたｒＩＦＮ−γの標準曲線を示した。

(ii)γ３−１１．１結合固相およびＷＮγ３−２９．３
３酵素標識体を用いるサンドイツチＥＩＡ (1)ＷＮγ３−２９．３３酵素標識体の作製 ＷＮγ３−２９．３３モノクローナル抗体を５mg含む
０．１Ｍリン酸緩衝液（pH６．５）１．４mlに０．４１
５mgのＳ−アセチルメルカプトサクシニツクアンハイド
ライドを含むジメチルホルムアミド５０μｌを加え、室
温で４０分間反応させた。反応液に１３０μｌの０．２
Ｍトリス塩酸緩衝液（pH７．０），１３μｌの０．２Ｍ
ＥＤＴＡ溶液および１３０μｌのヒドロキシルアミン溶
液を加え、室温で５分間反応させたのち、セフアデツク
スＧ−２５のカラムクロマトグラフイーで分離し、チオ
ール基が導入された抗体画分を得た。

一方、ＨＲＰ１０mgを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（pH
６．８）１．４mlに４．２mgのＮ−（４−カルボキシシ
クロヘキシルメチル）マレイミドのＮ−ヒドロキシサク
シニミドエステルを含むジメチルホルムアミド溶液１０
０μｌを加え、室温で６０分間反応させた。反応液をセ
フアデツクスＧ−２５のカラムクロマトグラフイーで分
離し、マレイミド基を導入した酵素画分を得た。このよ
うにして得たＳＨ基を導入した抗体画分と、マレイミド
基を導入した酵素画分とをコロジオンバツグを用いて４
℃で一晩反応させた。反応液をウルトロゲルＡｃＡ３４
のカラムクロマトグラフイーで分離し、抗体（ＷＮγ３
−２９．３３）−酵素標識体を作製した。

(2)γ３−１１．１結合固相の作製 ９６ウエルのマイクロテスト用プレート（ヌンク−イム
ノプレートＩ：ヌンク社（デンマーク）製）の各ウエル
にγ３−１１．１溶液（３０μg/ml，０．１Ｍ炭酸緩衝
液pH９．６）１５０μｌを注入し、４℃で一晩放置し
た。ＰＢＳ（０．１５Ｍ NaClを含むpH７．４の０．０
１Ｍリン酸緩衝液）３００μｌで洗浄後、１％ＢＳＡお
よび０．００５％チメロサールを含む０．０２Ｍリン酸
緩衝液（pH７．０）３００μｌを注入し、４℃で保存し
た。

(3)操作方法 上記(2)で作製したプレートをＰＢＳで洗浄後、各ウエ
ルに緩衝液Ｂ（１０％仔牛血清，および０．００５％チ
メロサールを含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（pH６．
５））５０μｌおよび緩衝液Ｂで希釈した標準ｒＩＦＮ
−γ１００μｌを加え、室温で一晩放置した。ＰＢＳで
洗浄後、緩衝液Ｂで酵素濃度として５００ng/mlに希釈
したＷＮγ３−２９．３３酵素標識体１５０μｌ加え、
室温で４時間反応させた。各ウエルをＰＢＳで洗浄後、
基質液として０．２％Ｏ−フエニレンジアミンおよび
０．０２％過酸化水素を含む０．１Ｍクエン酸緩衝液
（pH５．５）１００μｌを加え、室温で２０分間反応さ
せた。２Ｍ硫酸１００μｌを加えて酵素反応を停止させ
たのち、各ウエルの４９２ｎｍの吸光度をタイターテツ
ク・マルチスキヤン（フロー社米国）で測定した。

第５図に得られたｒＩＦＮ−γ（ポリペプチド（II））
の標準曲線を示した。

実施例４ 本発明のモノクローナル抗体を用いたＩＦＮ
−γの精製 (i)抗体カラムの製造 実施例２(i)の方法で精製されたＷＮγ３−２９．３３
モノクローナル抗体７６ml（４４mg）に等量の飽和硫酸
アンモニウム溶液を加え（硫酸アンモニウム最終濃度５
０％飽和）、４℃で１時間攪拌したのち１０，０００×
ｇで１５分間遠心分離を行なって沈殿物を得た。この沈
殿物を０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ炭酸水
素ナトリウム緩衝液（pH７．９）に溶解し同一溶液２
に対して４℃で２時間透析を行ない、透析外液を新しい
溶液２に置換してさらに１５時間透析を行なった。一
方、アフイゲル−１０（バイオ・ラド社製）１４mlをグ
ラスフイルターを用いて蒸留水で充分洗浄した。このア
フイゲル−１０と透析後の上記抗体溶液とを混合して４
℃で５時間ゆっくり攪拌しながら反応させ、グラスフイ
ルターを用いて０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１
Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（pH７．９）でよく洗浄し
た。ついで、残存する未反応の活性基をブロツクするた
めに、反応させたゲルを０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含
む０．１Ｍエタノールアミン溶液（pH８．０）１４mlに
懸濁して４℃で１時間攪拌した。その後ゲルをＰＢＳで
よく洗浄し０．１％NaN₃を含むＰＢＳ２０mlに懸濁して
４℃で保存した。反応させた抗体量と洗浄液中に回収さ
れた未反応の抗体量とから、ゲル１mlあたり２．９mgの
抗体が結合したと算出された。このようにして調製した
ゲルをカラムに充填して抗体カラムとして使用した。

(ii)ｒＩＦＮ−γの精製E.coli ＲＲ１（pRK２４８cIts，pRC２３１／ＩＦＩ−
９００）〔特開昭５８−１８９１９７号公報参照〕の凍
結保存菌体１ｇを７Ｍ塩酸グアニジンを含む５０ｍＭホ
ウ酸緩衝液（pH７．２）３mlに懸濁し、４℃で１時間攪
拌したのち１０，０００×ｇで３０分間遠心分離にかけ
て上清３mlを得た。この上清３mlにＰＢＳ２０７mlを加
えて希釈し、１０，０００×ｇで１０分間遠心分離にか
けて不溶物を除いたのち実施例４(i)で得た抗体カラム
（ＷＮγ３−２９．３３，カラム容量１０ml）にかけ
た。０．５Ｍ塩酸グアニジンを含む２０ｍＭリン酸ナト
リウム緩衝液（pH７．０）３０mlでカラムを洗浄し、つ
いで２．０Ｍ塩酸グアニジンを含む２０ｍＭリン酸ナト
リウム緩衝液（pH７．０）２２mlで溶出してｒＩＦＮ−
γ（ポリペプチド（II））を含む溶出液９mlを得た。こ
の溶出液を還元条件下にＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動にかけた結果、１８キロダルトンを示す位置
に蛋白のバンドが検出された。

参考例 ポリペプチド（Ｖ）含有上清の製造 (i)ポリペプチド（II）をコードするＤＮＡを含むプラ
スミドpHＩＴ３７０９（ＥＰＣ公開第０１３８９８号公
報参考例１(vii)）の挿入部を制限酵素BstNIで部分分解
してBstNI-PatIフラグメントを得た。このBstNI切断部
位に、化学合成した蛋白合成開始コドンＡＴＧを含むオ
リゴヌクレオチドアダプター AATTCATGTGTTATTGTC GTACACAATAACAGT をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いてщ孝させた。

一方、EcoRI,PstIで処理したプラスミドptrp７８１に、
上述のアダプターを結合させたポリペプチド（II）をコ
ードするＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合さ
せ、発現プラスミドpHITtrp１２０１を構築した（第６
図）。

このＤＮＡのAvaII切断部分をＤＮＡポリメラーゼエラ
ージフラグメントで修復したのち、トリエステル法で合
成した蛋白質合成開始コドンを含むオリゴヌクレオチド
アダプター（CATCGATG）をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて
上記修復部に結合させた。

プラスミドptrp７７１〔上記公開公報参考例２(ii)参
照〕を制限酵素ClaI,PstIで切断して得たＤＮＡ断片のt
rpプロモーターの下流に、上記アダプターを結合させた
ポリペプチド（Ｖ）をコードするＤＮＡを挿入して、ポ
リペプチド（Ｖ）をコードする発現プラスミドpHITtrp
１２０１−ｄ４を構築した（第６図）。

このプラスミドpHITtrp１２０１−ｄ４を用いてCohenら
の方法〔プロシージング オブ ナシヨナル アカデミ
ー オブ サイエンスＵＳＡ，７３，４１７４（１９７
６）〕に従って大腸菌２９４を形質転換し、このプラス
ミドを含む形質転換体エシエリヒア コリ（Escherichi
a coli＝E.coli）２９４／pHITtrp１２０１−ｄ４を得
た。

(ii)上記で構築したプラスミドを含む菌株E.coli294/pH
ITtrp１２０１−ｄ４を８μg/mlのテトラサイクリン，
０．４％カザミノ酸，１％グルコースを含むＭ９培地を
用いて３７℃で培養し、生育がＫＵ２２０に達した時に
３βインドリルアクリル酸（ＩＡＡ）を２５μg/mlにな
るように加えて更に４時間培養した。培養後、遠心分離
して菌体を集め、これを1/10量の１０％蔗糖を含む０．
０５ＭTris-HCl pHに７．６に懸濁した。この懸濁液に
フエニルメチルスルフオニルフルオライド，NaCl，エチ
レンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ），スペルジ
ミン，リゾチームをそれぞれ１ｍＭ，０．２Ｍ，１０ｍ
Ｍ，４０ｍＭおよび２００μg/mlとなるように加えて、
０℃で１時間放置したのち、３７℃で３分処理して溶菌
液を得た。

この溶菌液を４℃，２００００ｒｐｍ（サーバル遠心機
ＳＳ−３４ローター）で３０分間遠心分離して、ポリペ
プチド（Ｖ）を含む上清を得た。この上清の抗ウイルス
活性を測定すると、２．５×１０^５Ｕ／培養液であっ
た。

発明の効果 本発明のモノクローナル抗体は天然のあるいは遺伝子工
学的に製造されたＩＦＮ−γに対し強力な結合能を有
し、これらの検出や精製に有利に使用することができ
る。とりわけ本発明のモノクローナル抗体は、ＩＦＮ−
γの中心部を認識するため、ＩＦＮ−γの各種フラグメ
ント、例えば第１図における１番目から４番目までのい
ずれかのアミノ酸残基もしくはペプチドを欠除したもの
または１３２番目以降のいずれかの部分で切断されたも
のなど、の検出や精製においても有利に使用することが
できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明におけるｒＩＦＮ−γの一例としての
ポリペプチド（II）のアミノ酸配列を示す。第２図は実
施例１(v)に記載したハイブリドーマ上清の抗体活性を
測定した結果を、第３図は実施例２(i)で得られた精製
モノクローナル抗体ＷＮγ３−２９．３３のＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す。第４図お
よび第５図はそれぞれ実施例３(i)および(ii)で得た本
発明のモノクローナル抗体を用いるサンドイツチ法によ
るＩＦＮ−γ定量の結果を示す。第６図は参考例に開示
したプラスミドpHITtrp１２０１−ｄ４の構築図を示
す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｐ 8310−2Ｊ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】遺伝子組み換え技術で製造されたインター
   フェロン−γ蛋白質で免疫したマウスの脾臓細胞由来の
   リンパ球とマウスミエローマ細胞株とからなる、インタ
   ーフェロン−γと結合し、ペプチドPyrro Glu-Asp-Pro-
   Tyr-Val-Lys-Glu-Ala-Glu-Asn-Leu-Lys-Lys-Tyr-Phe-As
   n-Ala-GlyおよびペプチドLys-Arg-Lys-Arg-Ser-Gln-Met
   -Leu-Phe-Arg-Gly-Arg-Arg-Ala-Ser-Glnのいずれとも結
   合しないモノクローナル抗体ＷＮγ３−２９．３３を産
   生するクローン化されたハイブリドーマＷＮγ３−２
   ９．３３株。
2. 【請求項２】遺伝子組み換え技術で製造されたインター
   フェロン−γ蛋白質で免疫したマウスの脾臓細胞由来の
   リンパ球とマウスミエローマ細胞株とを細胞融合し、得
   られる融合細胞から、インターフェロン−γと結合し、
   ペプチドPyrro Glu-Asp-Pro-Tyr-Val-Lys-Glu-Ala-Glu-
   Asn-Leu-Lys-Lys-Tyr-Phe-Asn-Ala-GlyおよびペプチドL
   ys-Arg-Lys-Arg-Ser-Gln-Met-Leu-Phe-Arg-Gly-Arg-Arg
   -Ala-Ser-Glnのいずれとも結合しないモノクローナル抗
   体ＷＮγ３−２９．３３を産生するハイブリドーマを選
   択し、これをクローン化することを特徴とするクローン
   化されたハイブリドーマＷＮγ３−２９．３３株の製造
   法。