WO1984002129A1 - Human immune interferon protein and process for its preparation - Google Patents

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WO1984002129A1
WO1984002129A1 PCT/JP1982/000445 JP8200445W WO8402129A1 WO 1984002129 A1 WO1984002129 A1 WO 1984002129A1 JP 8200445 W JP8200445 W JP 8200445W WO 8402129 A1 WO8402129 A1 WO 8402129A1
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Masakazu Kikuchi
Kyozo Tsukamoto
Tsutomu Kurokawa
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Takeda Chemical Industries Ltd
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Definitions

  • the present invention relates to human immunogenic white matter and a method for producing it by gene engineering techniques.
  • Interferon (sometimes referred to as “1F”) is a protein produced when the box 88 of higher animals is released from H and nucleus by stimulation of nucleus or thrombus. , And has a rogue effect.
  • IF-a type I F
  • IP- / 3 ⁇ type I P
  • Proteins are obtained in large quantities as proteins [Qoeddel, DV et al., Nature, 287, 411 (1980), ⁇ » ⁇ et al., Nucleic Acids” Rea,, 9, 73 1 (1981), Goeddel ⁇ DY et al., Nucleic Acids Res “8, 4057 (1980), Hitzeman ⁇ R. Et al., Nature, 29, 717 (1981)].
  • mass production for application to Si floors has been attempted.
  • r-type IF (hereinafter sometimes abbreviated as IF- r : :) is a blast of lymphocyte
  • I-interfet (hereinafter sometimes referred to as I-If) because it is caused by the royal tendon in charge under the condition that metamorphosis and lymphokine occur.
  • I-I IF Compared to * and IP-9, it is said to have higher anti-cell proliferation activity and anti-fecal activity, and is expected from the viewpoint of floor application.
  • a new member sphere is required for its production: 4 Because there are several plays, the efficient squid breeding system has so far been divided. Also, in a different * actual cost system, hey * is a different molecular species. There is much uncertainty about its structure and properties.
  • IF has high species specificity, so that human-derived IF must be used for human applications.
  • mass production of immunized interferon is inconvenient, so it is not possible to use it for guilty song at the moment.]
  • the present inventors have used human gene manipulation technology to clone the human I-I ?? gene and transfer the resulting recombinant D ⁇ ? Molecule into a host to obtain the human I-I ??
  • the present invention has been completed by a fin fruit that has been subjected to a new project of technology for expressing a gene and obtaining a desired I-I-P protein.
  • the present invention relates to a human immunity transformant obtained by culturing a transgenic transformant substantially containing a human isolated S interferon protein and a DNA having a basic SB sequence encoding human immunity interferon.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing the S white matter, in which a liquid containing an interferon protein is purified by using an anti-immune interface.
  • the present inventors have established a substantially pure human immunological interface and a method for producing the same and completed the present invention.
  • the DNA encoding the human IF used in the present invention is, for example, a compound represented by the general formula
  • DMA (I) is preferably linked to the bottom of the protein.
  • These promoters include tributophan (trp), *, and knotose (lac) *, protein chain elongation factor Tu. (tuiB)
  • trp tributophan
  • lac knotose
  • Tu protein chain elongation factor
  • TAA is preferred.
  • R H A V nucleic acid
  • a s n As Lagin
  • 0iTB —Hydroxy-5-bonone-2,3-dica boxy
  • HOB t —Hydroxybenzotriazole
  • cells that secrete human I-IF are secreted, for example, by culturing cells that secrete human I-IF, and human messenger (m) RNA encoding human A-IF is isolated from the culture solution.
  • m human messenger
  • -Synthesis of single-chain complementary (C) MA using 'X' element lead to double-stranded DNA, and introduce into plasmid to transform E. coli
  • the human peripheral lymphocytes used here may be buried, continually cultivated, or sensitized.
  • the I-IFII gene used in the present invention may be any one that causes the production of I-IF in human lymphocytes.
  • phytohemagin (PflA) concanapalin A (GonA)
  • SEA sta fc ⁇ upka-enterotokin A
  • NAGO neura mudase galactosidase
  • 12- 0—Tet Decanoy Hobo 1: I3-Acetate *, etc.
  • I-IP can be performed by culturing the cells in a medium known per se, such as RPMI-1640 or MSM medium, but 1-1640 medium containing fetal calf fetal is preferred.
  • the cultivation is performed at a temperature of 35 to 3913, preferably 36 to 38 U, for a culture time of 12 to 72 hours, preferably 22 to 26 ⁇ .
  • the bran cells are collected by a method known per se, and guanidinethioanide, pentonite, heparin, ribu stonic acid, ninto-tribonic acid, panadime complex, jetibiloca carbonate are used as RNaae inhibitors.
  • the extract containing RHA is mixed with phenol, phenol and a form of phenol, and the extract is subjected to an extraction operation. Then, the RHA is collected by ethanol precipitation.
  • the antiviral effect of the resulting 7t protein can be assayed to obtain a fraction of 12 to 16S, ie, I-IF ⁇ RHA.
  • aRHA can also be purified by agarose gel electrophoresis using agarose gel electrophoresis and agarose gel electrophoresis.
  • aRNA as a collar, for example, using a transcriptase, it is complementary by a method known per se! ) Synthesize MA (cDNA) protein and convert c DHA to double-stranded! Convert to H k [Maniatia ⁇ T. et al., Cell, 8, 163 (1976)] ⁇ This! ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ for example, d Q-d C or d A-d T * ⁇ ⁇ Rimmer Spear Association 3 ⁇ 4 Nelson ⁇ T.
  • an oligonucleotide having 83 columns which is considered to correspond to the amino acid SB sequence of I- 1 I ⁇ 1 lepteptide, is chemically synthesized, and this is rapped at 32 p to obtain a probe, for example, ⁇ t Cyto and cyclin resistance already obtained by the colony hybridization method known per se (Grunatein, U. and Hogness ⁇ a S. ⁇ Froc. Hatl. Ao & d. Sci. USA 72, 3961 (1975)).
  • a secondary screening is performed on the clone to be sought from ambilin-resistant to homformants.
  • the promoter examples include the above-mentioned promoters, and the preferred host is Escherichia coli (294, W3110, C600, etc.), particularly 294 ( where 294 is a known bacterium [8 (310) ⁇ 11... , 1 ) 1 " ⁇ (. & 1: 1.03 ⁇ 41.
  • Transformation of a host with the DNA of the present invention can be performed by, for example, a known method.
  • the host thus obtained is cultured in a medium known per se.
  • Examples of the medium include glucose and casamino acid.
  • Medium Miller J, Experiments in Molecular Genetics,
  • Cultivation is usually carried out third to two 4 hours at 1 5-4 3, if necessary, may be aerated or ⁇ .
  • the cells are collected by a known method, suspended in a buffer, for example, disrupted by sonication, lysozyme and / or freeze-thawing, and the D supernatant is obtained by centrifugation.
  • a buffer for example, disrupted by sonication, lysozyme and / or freeze-thawing, and the D supernatant is obtained by centrifugation.
  • the human I-IF in the supernatant is H-Lys-Arg-Lys-Arg-Ser-Gin-et-Le-Phe-Arg-Gly-Arg- which was invented by some of the present inventors. Off-line indicated by Arg-Ala-Ser-Gln-OH. Purification can be advantageously performed by using a monoclonal antibody against tide. The monoclonal antibody can be advantageously used as an antibody column.
  • the antibody column can be prepared, for example, by coupling the above-mentioned monoclonal antibody purified from ascites fluid inoculated with a hybridoma with a suitable carrier]) and the following method.
  • Carrier used is, I 5 1 after Capri ring - the protein as an example primary Amin - adsorbed well r is specifically efficient, then it may be any Samal so long appropriate Ru elution ones possible, Activated agarose genole beads, such as Abugel-10, are preferably used to facilitate binding in the manner described below.
  • the reaction between Affigenore-10 and the antibody is carried out in a buffer such as 0.001 to 1 M, preferably 0.1 M bicarbonate.
  • the reaction conditions may be 0 ° to 20 ° C., 10 minutes to 24 hours, and various pH values, but preferably, 4 to 4 hours, pH 3 to 10 are used.
  • the amount ratio of Abuigenola 10 and antibody to be mixed can be any amount within this range, since the more the amount of antibody per Abugel 1W, the more the amount of antibody up to about 50 ⁇ , the more antibody will be attached. Thus, antibodies less than 30 ⁇ are conveniently used.
  • the antibody-carrier conjugate thus obtained is washed well with the buffer solution used for the reaction, and then left for several days or replaced with a final concentration of 0.05 0. After blocking the remaining unreacted active groups by a method such as adding hydrochloric acid and adding hydrochloric acid and reacting at 4'C for 1 hour, it can be used as an antibody column by packing in an appropriate column. .
  • a sample containing a human immunointerferon-feron protein is dissolved in a buffer solution near neutrality, for example, phosphate buffer solution or hydrochloric acid buffer solution, and adsorbed on the antibody column. Let it. Next, the column is washed with the same buffer, and IF- r is eluted.
  • a weakly acidic solution such as an acetic acid solution, a solution containing polyethylene dalicol, a solution containing a peptide that is more easily bound by the antibody than the sample, a high-concentration salt solution, and a combination thereof are used.
  • a weakly acidic solution such as an acetic acid solution, a solution containing polyethylene dalicol, a solution containing a peptide that is more easily bound by the antibody than the sample, a high-concentration salt solution, and a combination thereof are used.
  • those which do not promote the degradation of human I-IF are preferred.
  • the column eluate is neutralized with a buffer according to a conventional method. If necessary]? The purification operation using the above antibody column can be performed again.
  • the human I-F protein solution obtained here is subjected to dialysis, and if necessary, this can be made into a powder by freeze-drying.
  • stabilizers such as sonorebitone, mannitol, dextroth, mannoleth, ku, and lysethone can be added.
  • human immune Inta ferro down proteins show a 1 0 7 ⁇ / ⁇ more specific activity in Uinoresu activity measurement by cytopathic effect deter test vesicular stomatitis virus (VSV) on human amnion-derived w E SH cells It is.
  • VSV vesicular stomatitis virus
  • the human immunointerferon protein of the present invention preferably has the general formula ( ⁇ ) ⁇ - ⁇ Tyr Z 2 Gin Asp Pro Tyr Val Lys Glu
  • Y represents a Met or a bond
  • Zi, Z 2 is showing a Cys or 1 ⁇ 2 Cy s respectively] containing Ruru Poribe peptide from Amino acid sequence of.
  • the polypeptide contains at least 90% of the polypeptide on a dry product basis)).
  • the human immune interferon protein Jffit according to the present invention has the following 1 ⁇ .
  • Gly-Arg-Arg-Ala-Ser-Gln-Ofl binds to the noclonal antibody.
  • the human immune interpelon protein according to the present invention can be used by the same method for the same purpose as I-IP obtained by the conventional method. Since it has a small amount of pyrogen, it can be used safely as an injection drug substance.
  • the human I-IF protein of the present invention exhibits anti-wisdom, anti-cancer, cell proliferation inhibitory and immunopotentiating effects.
  • the human I-I ** protein of the present invention can be mixed with sterile water, human serum albumin (fiS A), physiological saline, or a physiologically acceptable carrier known to be saturated, and can be non-orally administered. Or it can be given topically. For example, from 100,000 to 1 parent, preferably 50 to 60 million loops per day per normal person can be administered intravenously or intramuscularly.
  • the preparation containing the t-I-IP protein of the present invention may be used for other physiologically acceptable activities such as soil, diluents, adjuvants, other carriers, pap-fers, surfactants, surfactants and preservatives. Components may also be included.
  • Formulations for non-peritoneal administration may be sterile aqueous solutions or suspensions in physiologically acceptable solvents, or sterile powders (usually I-IF ⁇ is obtained as a) Ambrose solution was lyophilized to
  • the preparation containing the human immune interferon protein of the present invention may contain 1 to 99% of the active ingredient such as IJ *-or IF-9 or nmphokine such as interleukin 2 relative to the substance of the present invention. It may be contained.
  • Figure 1 shows the restriction enzyme replacement of the brassmid PHIT3709 obtained in the implementation ⁇ 1 (Vi i).
  • Fig. 2 shows the secondary structure (base sequence) of the pHIT3709 plasmid obtained in Example 2 (Vii)
  • Fig. 3 shows ptrp701 and ptrp77l of Example 2 ( ⁇ ) ( ⁇ )
  • Fig. 4 shows the example.
  • FIG. 5 shows a construction diagram of pHITtrpllOl of 2 (iil)
  • FIG. 5 shows a construction diagram of pHITtrp2101 of Example 2 (iV).
  • FIG. 6 shows the results of the electrophoresis of Example 6 (i)
  • FIG. 7 shows the results of the molecular weight measurement of Example 6 (i).
  • the adjusted ball spheres are 1 2—0—Tet, Decanoy Hobo 13—13-acetate (TP l) (15 ng i) and Concanapalin A (40 « ⁇ ) RPMI—containing 37I * in 1640 medium (containing 10 * fetal calf blood) to induce I-IP.
  • TP l Decanoy Hobo 13—13-acetate
  • RPMI Concanapalin A
  • RNA precipitate was precipitated with (25 * 1 ⁇ —Rodium zacosinate sodium lysate) and precipitated with ethanol, to obtain & 3 W RW.
  • This RN k! Solution C 0.5 M MaCl ( 1 0 atf Trie -HCl H 7-6, single M BDTA, OL 3 3 ⁇ 4 SDS] in Oligo (dT) cellose
  • This mHUA is further precipitated with ethanol, dissolved in a solution of £ 12 "(10 mM ris 5 ⁇ HG 1; ⁇ 7.6, 2 mM; E: DTA, CL5 SDS) and treated with a 5 for 2 minutes. 1 Q to 55 sucrose density gradient centrifugation (difficulty in centrifugation at 25,000 ri> mT! For 21 hours using a Beckman S7 mouthpiece at 20). A part of EN A for each of these divisions
  • Figure 1 shows a restriction map of this plasmid. ' ⁇
  • Plasmid PBR322 is restricted to EcoRI and Ava
  • ptrp701 was partially digested with Clal to obtain a fragment in which only one of the two Clal cleavage sites was S-cut. Was. The part that has occurred is a DNA. After filling with remerase I large fragment, it was religated with T4DNA ligase to obtain ptrp771 (Fig. 3).
  • a fragment obtained by cleaving Ptrp771 with the restriction enzyme Pstl and the restriction enzyme ClaI from the IF-r gene to which the above-mentioned adapter is bound is inserted into the downstream of the tributary amplifier motor to obtain T4 DNA ligase.
  • the expression plasmid pHITtrpllOl was constructed using the DNA fragment (Fig. 4).
  • pHITtrpllOl was further improved to construct the following]] pHITtrp2101.
  • ptrp601 was treated with restriction enzyme C1al and restriction enzyme HpaH to obtain 0.33 Kb of a Clal-HpaE fragment containing the trp promoter. This fragment was ligated to pHITtrpllO1 which had been cleaved with Clal and treated with lipase phosphatase using T4DNA ligase to obtain pHITtrp2101 containing two trp promoters in series (FIG. 5).
  • Escherichia coli 294 was transformed with rasmid ⁇ ⁇ trp2101 according to the method of Cohen et al., Supra, to obtain a strain containing this plasmid, E. coli294ZpHIT-trp2101.
  • Example 3 1.2 ⁇ of the culture solution obtained in Example 3 was centrifuged to collect the cells, and the cells were suspended in 0.05 M-Tris-HC1 pH 7.6 containing 10% sucrose of 60. ⁇ . . To this cell suspension was added 0.2 M phenylene-sulfo-nofluoride, (PMSF) 0.3, 5 M NaCl 2.4 ⁇ 0.2 M ethylenediamine acetate acetate (EDTA) 2.4, 1 ⁇ Spermidine 2.4 W, 5 / Lysozyme 2. "was added, left at 0 t for 1 hour, treated at 37'C for 5 minutes, and further treated with an ARTEK (US) ultrasonic crusher. C 30 seconds processed.
  • PMSF phenylene-sulfo-nofluoride
  • EDTA ethylenediamine acetate acetate
  • This solution was centrifuged at 105,000 x 1 hour to collect the supernatant 66.
  • Example 10 After diluting 60 W of the supernatant obtained in Example 4 to 150 W with 20 mM Tris-HC1, pH 7.6 (TEN) containing 1 mM EDTA and 0.15 M NaCl, Reference Example 10 The antibody was applied to an anti-IF- r antibody column (9 l) prepared by the method described above. After thoroughly washing with TEN, the plate was further washed with TEN containing 0.1 M NaCl, 0.05% Nonidet P—40 (manufactured by Shell). Then: F-r was eluted with 0.1 M severe acid containing 0.25 M NaCl] and the eluate was immediately neutralized with 1 M Tris HC1 pH 7.6. The resulting solution was dialyzed against distilled water at 4 ° C for 16 hours, frozen with aceton-dry ice, and freeze-dried to obtain a powder.
  • the protein was confirmed as a single band by DS-polyacrylamide amide (17.5 ⁇ ⁇ ) electrophoresis (15, 6 hours) and staining with Coomassie Blue (Fig. 6). ⁇ ⁇
  • the molecular weight of the protein was estimated to be 17,0005 ⁇ 1,000 from the relationship between the migration distance of the molecular weight marker and the migration distance of the protein, which were simultaneously electrophoresed (Fig. 7).
  • another band was detected at a molecular weight of 33,000 ⁇ 2,000 for proteins not treated with 2-mercaptoethanol. This value 5 1 I - since it corresponds to about 2 times the molecular weight 17,000 ⁇ 1,000 for r, the bands are IF - considered you from dimer r.
  • Example 5 Put the protein obtained in Example 5 in a glass hydrolysis test tube], add 5 times, 200 volumes () of constant boiling constant hydrochloric acid containing 4% thioglycolic acid, and seal the tube under reduced pressure. Hydrolysis was performed at 110 for 24, 48 and 72 hours. After hydrolysis, open the tube, remove hydrochloric acid under reduced pressure, dissolve the residue in 0.02 N hydrochloric acid, and use Hitachi 835 high-speed amino acid analyzer!
  • the protein obtained from the real male ⁇ 5 was subjected to formic acid oxidation by the method of Sire [Methode Enayao Ln, 197 (1967)], and then a modified version of Edman degradation method by tC for a long time (Eur. J. Bioohea.
  • the black was reduced as a catalyst in a stream of hydrogen.
  • the catalyst was removed by filtration and the solvent was distilled off.
  • the product was dissolved in DMF250 * together with Z-Ser-OH T.59, ⁇ 0 ⁇ 6.8 ⁇ and cooled on ice. Add Dc 7.15 under ice-cooling, and incubate at room temperature for 4 hours at room temperature.
  • Z-Gly-OBu 13.0 was dissolved in MeOH 500 0 f and mixed with hydrogen in a stream of hydrogen using black as a catalyst. The catalyst was separated off, the filtrate was clarified under reduced pressure, and the residue was dissolved in DMF 200. Add Z-Arg (Pme) - ⁇ • CHA 20, 0]? Prepared Z—Arg (Pme) —OH, HOBt 5.4, cool with ice, add DCC 8.2, 48 hours Stirred. After refining Oahu, it was converted to AcOEt 50.
  • Z-ArgC Pme) -Gly-0 ⁇ ⁇ ⁇ .0 was brought into contact with S in 50 MeOH of MeOH and then dissolved in 300 W of DMF.
  • Z-Ser-NHITH-Boc 3.9 was catalytically reduced in MeOE 300 W and then transferred to DMI 15 .
  • Add Z-Arg (Pme) -0B CHA Q, 29 yo]? Prepared 2-3 £ (1 > 11 ⁇ )-03, HOBt 1.5 and cool forever.
  • Z-Arg (Pm e)-S er-HH2iH-B oc & 9 was converted to DliF 50 "after catalytic reduction with lieOH 300W ⁇ .
  • Z-I rsOi seven r)- OH ⁇ DCH 1 3 ⁇ 4 prepared Z—: Lys (Mtr) — OH, HOBt
  • mice 6S 7 to 8 female ALB / C female mice 6S each were used as antigens in Example 2 and 40 ⁇ as the protein amount of S-white complex ⁇ was mixed well with Proindocomp 9 adjuvant and subcutaneously inoculated (primary immunization) ).
  • primary immunization Proindocomp 9 adjuvant and subcutaneously inoculated
  • secondary immunization Two times after the first immunization, the antigen of the KOKI was well combined with the phloem in-incomplete conjugate and inoculated subcutaneously. Two immunizations were performed in the same manner as the second immunization.
  • the mucus was partially shaken from the mouse, and the morphology in the middle was determined using the SIA method described in Reference ⁇ . Among them, one mouse showing high antibody ⁇ 2 mice * C, and 120 ⁇ , of the sewage was dissolved in the food water of asw and inoculated into the vein. Line one. The physical body
  • Immunization was performed by the method described in Reference Example 5, and 3 days after the final immunization, the spleen was removed from the ⁇ 2 mouse, squeezed and passed through a stainless mesh, and used for eags, minimum, and essencia medium ( ⁇ ⁇ ⁇ ). ) To obtain a cell suspension.
  • BALBZC mouse-derived myeloma cells P 3 -63.Ag 8. ⁇ (P3u1) were used (power-recent topix in microbiology and imaging).
  • EAT hippo xanthine 1 X 1 0 one 4 M, Aminoputeri down 4 x 1 0 '7 M, thymidine 1.6 xl 5 "5 M) containing PBMI 1 640 - 1 0 FCS medium (HAT medium) 1 ⁇ E skilled] MW by HAT selective culture was started.
  • the HAT selective culture was started by discarding 1 a of the old solution 3 days, 5 days, and 7 days after the start of the culture, and then adding the HA ⁇ medium.
  • the hybridomas proliferated after cell fusion 0 to 14 It recognized, when the culture broth turned yellow (about 1 X
  • thymocytes of BALB / C mouse were added as veider cells so as to reach 5 ⁇ 10 5 cells / equivalent.
  • cell proliferation was observed so that the supernatant was collected, and the presence or absence of the antibody was examined by the EIA method described in Reference Example 4.
  • the antibody activity was 8 clones out of 13 clones in T2-111, 3 clones out of 54 clones in r2-62, and 47 clones out of 7 clones in 7 * 2-100. Admitted.
  • Salting out was performed for 0 min while stirring with 4 and then centrifuged (1 (3,0 G0 rotation, 15 min)) to obtain a precipitate.
  • the precipitate contained 50 mM liaCl.
  • the cells were dissolved in 20 mM Tris buffer (H7.9) and analyzed with respect to the same solution 2. Two hours later, the cells were replaced with 2 fresh permeates and dialyzed for another 15 hours. After dialysis, 1 (3, (300 rotations) to remove sediment
  • the value of the supernatant A 280 is adjusted such that the 20-30 ⁇ .
  • the sampnole was prepared with a sufficient amount of 50 m 2 £-Tris buffer containing iTaCl).
  • Motodori fraction purified in the manner of Example 9 monochrome - having conducted an over ⁇ dialyzed monoclonal antibody 2 5 W (6 5.3 3 ⁇ 4) against 0.1 M NaHC0 3, pH 8.3 solution.
  • Abigel-10 (Bio-Rad) 25 was thoroughly washed with water using a glass finolator, then floated in a 0.1 M NaHCO 3 pH 8.3 solution, mixed with the antibody, and mixed for 4 t. For 4 hours with stirring. Thereafter, 4 'after leaving C De ⁇ and washed well with 0.1 M NaHC0 3 pH 8.3 solution using a glass Fuinoreta.
  • a substantially pure human immunointerfering protein can be produced, and the protein is useful as an antiviral agent and an antitumor agent.

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Description

明 湖 善
免疫ィン ープェロン肇白質およびその製造法 技 術 分 野
本発明は、 ヒト免瘐ィンタープェ-ン 白質 よび遣伝子工学手法に よるそれの製造法に闋する。
背 景 技 術
イ ンターフェロン（¾下1 Fと璐称することがある。 ）は、高等動物 の箱 88がウイ スや核鑀¾どの刺激によって H発されて韁生する蛋白質 であ]?、抗ウイ ス作用、抗扈 作用などを有する。
ヒトの I pには、現在 β型、 9型および r型の 3種の性状の異¾るタ イブが存在することが知られてお 、 a型および 型はウイ スゃ核畿 で、 r型はマイ ト一ジェンまどで誘発される。
*型 I F (以下 I F— aと略称する）、 ^型 I P ( 下 I P— /3と咯 称する）に関する研突は比 «的す、んで 、その産生機構もか ^解 明されてきて る。 さら ic¾伝子操作技術の進歩 よって、現在は I F 一《と I p—/ が大腸菌を《ΙΗ^ることによ i?、 I Ρ - «1 が酵母を 墙養することによ]?、 ぞれ生物学的に活性 *蛋白質として、大量に 得られるように ¾つた〔 Qoeddel, D. V.ら、 Nature、 287、 411 ( 1 980 )、 ΓβΙνθΓΐοα» Ε·ら、 Nucleic Acids "Rea、 , 9、 73 1 ( 1 98 1 )、 Goeddel^ D. Y.ら、 Nucleic Acids Res" 8、 40 5 7 ( 1 9 80 )、 Hitzeman^ R.ら、 Nature、 2 9 、 71 7 ( 1981 )〕。 さらに Si床へ応用するための大量生産が試みら れるようになってきた。
r型 I F (以下 I F— rと略称することがある。 ：)はリ ンパ球の芽球
0MPI
、， 、 W1PO 差換え ^ ^- 化やリ ンホカイン¾ ^が起るよう ¾状«下で、免 担当飆腱から さ れるため、免 ¾ィンターフェ口ン（以下 I— I f と することがあ ） とも呼ばれて る。 I一 I Fは I ？一 *や I P— 9と比 «して、抗細胞 增殖活性や抗腿瘡活性が高 と われてお D、 «床的応用面からよ 期 待されている。 しかし、その ¾生に新鲜¾リ ンバ球 要であること： 4 どの劇約があるため、 これまで効率のよい耋生系は孃立されて ¾い。 また、異 *る実費系では、奚*る麴飽種が異なる分子種の I一 I？を魔 生する可能性も示浚されてお]?、その構造や性質に関しても不明な点が 多く残されて る。
—方、 I Fには高 種特異性があるため、 ヒ トへの応用にはヒ ト由来 の I Fが使用されなけ なら い。 しかしながら、 ト免疫イ ンター フエロンは量産が困慮であるために、現時点では癘宋への 用が不可能 であ])、箱度の高 ヒ ト I一 I i*を容易によ 1>安葡に大量生産できる技 術の開発が望まれて る β
本発明者らは、遗伝子操作技術を利用してヒトの I一 I ? «伝子をク ローニングし、 得られ 組み換え D Ν Α分子を宿主に移入してヒ ト I一 I？遺伝子を 現させ、 目的とする I一 I P蛋白質を得ることのできる 技術の閼発新突を行った鰭果、 本発明を完成するに たった。
発 明 の 開 示
本発明は、実質的に麴粋 ヒ ト免 Sインターフェロン蛋白質、 らび にヒト免疫インタ一フエロンをコードする璨基 SB列を有する D N Aを含 有する港質転換体を培養し、得られるヒト免疫ィンターフェロン蛋白質 含有液を抗 ト免疫インターフエ σンモノク》—ナ 坑体を用 て精製 する当該 S白質の製造法を提供するものである。
Gray らは、 ヒ トの I一 I P遺伝子のひとつをク ー-ングしたと考 差換え え、 それから推定されるポリペプチドのアミノ酸配列を報告した
C Nature, 295， 503 ( 1982 ) 〕。 その後も、 Devosら〔Nucleic Acids Research, 10， 2487 ( 1982 ) 〕および Derynck ら 〔同 誌， 10， 3605 ( 1982 )〕によ i9類似する発表が行るわれている。 し かし、 これまでは抗ウィルス作用を有することによ I F様物質の存在 力推定 れていたのみで、現実に、 実質的に純粋なヒ ト免疫ィ ンタ—フ ェロ ン蛋白質を取得したとの報告はない。
本発明者らは、 実質的に純粋 ¾ヒ ト免疫ィ ンターフェ口 ンおよびその 製造法を確立し本発明を完成した。
本発明で用いられるヒトェ— I Fをコードする D N Aは、 例えば一般 式
(^) TGT TAC TGC CAG GAC CCA TAT GTA AAA GAA GCA GAA AAC CTT AAG AAA TAT T ΑΑΤ GCA GGT CAT TCA GAT GTA GCG -GAT AAT GGA ACT CTT TTC TTA GGC ATT TTG AAG AAT TGG AAA GAG GAG AGT GAC AGA AAA ATA ATG CAG AGC CAA ATT GTC TCC TTT TAC TTC AAA CTT TTT AAA AAC TTT AAA GAT GAC CAG AGC ATC CAA AAG AGT GTG GAG ACC ATC AAG GAA GAC ATG AAT GTC AAG TTT TTC AAT AGC AAC AAA AAG AAA CGA GAT GAC TTC GAA AAG CTG ACT AAT TAT TCG GTA ACT GAC TTG AAT G C CAA CGC AAA GCA ATA CAT GAA CTC ATC CAA GTG ATG GCT GAA CTG TCG CCA GCA GCT AAA ACA GGG AAG CGA AAA AGG AGT CAG ATG CTG T 'T CGA GGT CGA AGA GCA TCC CAG - X (3
〔式中、 Xは TAA, TGAまたは TAGを示す〕で表わされる塩基配列を含
Rど
Ο ΡΪ
差換え 有する D M A ( I )である。
上記 D li A ( I )は、そ ©5 端に
A G AAA ΤλΤ ACA AST TAT ATC TTQ QCT TTT CkQ CTC TGC ATC GTT TTG GGT TCT CTT QGC ( I ) または ATd ( Ϊ )を有していてもよ 。
D M A ( I )はプロ 一ターの下涞に連糖されて ることが好ましく、 これらプ モーターとしてトリブトフアン（ trp )ブ口 *一ター、 ， クトース（lac) ブロ *一ター、蛋白質鎖伸長因子 Tu(tuiB) ブロ モーターが られ、 と わけ trp プロ *一ターが好適である。
一被式（ I )中、 Xで示されるオリゴヌクレオチドのうちでも TAA が好まし 。
本願明細害図面 よび請求の »囲で用いる 13号の意義は第 1表に示す と:^])である。
第 1 表
D N A： デォキ リボ核饞
A ： アデ =ン
T ： チミン
G ： グァ-ン
C 卜 ン
R H A： Vボ核酸
d AT P ： デォキ アデノ ン三リ ン酸
d T T P ： デォキシチミジン三 ン酸
d Q T P ： デォキ グアノ ン三 9ン穀
d C Τ Ρ ： デォキ チジン三 9ン酸
A T P ： アデノシン三リ ン酸 差換え -S* -
E D T A '· エチレンジァ ミ ン四酷酸
. S D S ドデシル硫酸ナ ト リ ウム
G.17： グリ シン
Ala '. - ァラニン
Va 1 ： ノ リ ン
Le : ロイ シン ·
li e イ ソ ロイ シン
S e r : セ リ ン
T l r ; ス レ才ニン
Cys ： システィ ン
Me t ; メチ才ニン
G lu ; ク"ノレタ ミ ン酸
As p : ァス / ラギン酸
Ly s · リ ジン
Ar g； アルギニン
Hi s ヒ スチジン
P ii θ ·. フェニールァラニン
T y r： チロシン
T r p ト リ フ。ト フア ン
Pro : フ βπリ ン
A s n： ァス ラギン
G 1 n v グルタ ミ ン
Ζ ：カルボペンゾキシ
Bo c ： i;—ブトキ^カルボ-ル
litr : 4ーメ トキシー ク ， 3 ， 6 - ト リメチ ベンゼンス ホ-ル -s- ； Pme：ペンタメチ ベンゼンス ホニ^
OB ： "b—ブチ エステ ^
0iTB : —ヒドロキシー 5ーノ ボ ネン- 2， 3一ジカ ボキシィ
ミ ドエステ t
： DC C： U . ϊ —ジシクロへキシ カ ボジイミ ド
DCU： ίΓ , ージシクロへキシ ゥレア
ΗθίΓΒ： ίτーヒ ドロキシー 5ーノ ボ ネン— 2， 3 -ジカ ボキシィ
HOB t： —ヒ ドロキシベンゾト リアゾー
CH ：シクロへキシ ァミ ン
DCHA:ジシク口へキシルァミ ン
TEA： ト リェチ ァミ ン
TFA： ト リ フ ォロ齚駿
MS A：メタンス ホン酸
TEF :テトラヒ ドロフラン
DMF：ジメチルホ ムアミ ド
MeOH:メタノ一
AcOBt ：醉漦ェチ〃
本癸明においては、 例えぱヒト末 if血リンパ球るどヒト I一 IF を分泌 する細胞を培養し、 培養液からヒトエー IFをコードする伝令（m) RNA を分離し、 たとえば逆.'転-写'薛'素を用いて単鎖の相補（C)MA を合成 し、 二重鎖 DNAに導き、 プラスミドに導入して、 例えば大腸菌を形質
-転換させ、 これよ ]) CDNA含有プラスミ ドを単離することによ ヒトェ ーェ Fをコードする^重鎖 DNAを製造することができる。
OMPI ここで用 られるヒト末销處リンパ球は葬 «作續胸、感作練飽の ず れでもよい。
本発明に使用される I一 I F II起 ¾«は、 ヒトリンパ球麵跑に I一 I F の産生を ϋ起させるものであれば か るものであってもよ 。 例えば、 フィ トへマグ チ-ン（PflA ) 、 コ ンカナパリ ン A ( GonA )、 スタ fc σ ュプカ ェンテロトキ ン A ( SEA) 、 ノィラ ミュダーゼーガラク 一ス羧化酵素（N AGO )、 1 2— 0—テト，デカノィ ホ ボー 一： I 3 ーァセチイト *どが挙げられ、 これらを単独またはこれらを組 合せて使用することができる。
I— I Pの H起は細胞を RPMI-1640¾地や MSM 培地： ¾どそれ自体 公知の培地で培養して行うことができるが牛胎児虚淸を含む 1—1 6 40 培地が好まし 。培養は、温度 35〜39 13、望ましくは 3 6〜3 8 U で、培養時間は 1 2〜7 2時間、望ましくは 2 2〜2 6 ^間行われる。糠 胞はそれ自体公知の方法で集め、 これに RNaae 害剤としてグァ -ジ ンチオ^アナイド、ペントナイト、 へパリ ン、 リビュ St酸、 才ー 9 ントリカ ボン酸、パナジゥム複合体、 ジェチ ビロカ ボネィ ト （ D P C )、 ドデ ^ 夔酸ナトリウム （ S D S ) どを加えたのち、 Kーラ ゥリ ザ コ ン、 プィーン 80、 ノ-デプト P— 40 どを加えて細胸 を溶解させて H H Aを抽出する。必要によ^、 この R H Aを含む抽出液 にフエノー 、 フエノー〃一クロ口ホルム どを加えて抽出搡作をく ¾したのち、ヱタノ一 沈«で R H Aを集める。 其核細胞の釉胞質 I存 在する aRI の多くは、その^末端にボリ A S列をもつことが知られて いるので、つぎにオリゴ（dT )セ ース、 ポ （ϋ>*プアロースなど を用いて リ (A+) R Η Αを集め、 これを 3糖密度勾 S速心法で分画 し、 この闞分の一部をァフ ！；カプメガエ （ enopas L&evia ) の卵 差換え 母繊 I 注入して鼸訳させる〔 Gurdoi J. B.ら、 233、 177( 1971 )〕 。生じ 7t蛋白質の抗ウイ ス作用を検定し、 I一 I Fの鼉 RHA む 1 2〜1 6 Sの画分を得る とができる。 aRHAはホ ムアミ ドーポリアクリ 1アミ ドゲ 気泳動ゃグ 9ォキサー を用 たァガロースゲ «気泳動を用 ても精製することがで食る。
得られた aRNAを鍔型として、たとえば、 写酵素を用 自体公知 の方法で相補的！） M A (cDNA)鎮を合成し、 c D H Aの二本鎖!） H kへ の変換を行う〔 Maniatia^ T.ら、 Cell, 8， 163( 1976 )〕β この！） Η Αを例えば d Q - d Cある は d A - d T*¾^リマー鎗会 ¾ Nelson^ T. Methods in Enayaology^ 68- 41(1979) Aoadeaic Press Ino, New Yorl〕で、たとえばブラスミ ド pBR322 ©Pst Iある は Sphl制限ェンドヌクレア一ゼ切断都位に 組み込ませる。 これを例えば大腸菌 1 776株に導入して形 «転換さ せ、 チ ト，サイク， ン瞧ある はアンビ リン! ^でトランスホーマ ントを遷ぶ とができる。別に I一 I ί1 リベプチドのァミノ酸 SB列に 対応すると考えられる ¾基83列をもったォリゴヌクレオタィドを化学合 成したのち、 これを 32 pでラペ してプローブと したとえば ^ t自 体公知のコロニーハイブリダィゼー ^ョン法〔 Grunatein、 U. and Hogness^ a S. ^ Froc. Hatl. Ao&d. Sci. USA 72、 3961 (1975 )〕によって、すでに得たチト，サイクリン耐性あるいはアン ビ リ ン耐性のト ,ンスホーマントの中から求めるクローンを二次スク 一二ングする。
このコ —ハイブリダィゼー 3ンによって 性を示したクローン の 錢列を、 とえば Maaca雇一 Gilbert法〔 Maxa«, A. M. & Gilbert^ W. Proc. Natl. Ac ad. Soi. USA, 74- 560 (1977)〕 あるいはフ ァージ M i 3を用いたジヌク レオチド合成鎖停止の方法〔
Messing,:!".ら Nucleic Acids Res^丄、 50?(1981)〕 の方法 によって決定し、エー IF遺伝子の存在を確認す ¾ 次に、 得られたクロ ー ンからエー IF遺伝子の全部あるいは一部をきり出し、 適当るプロモ 一ター、 S D (シャイン アンド ダ ガーノ ）配列の下流につ いで、 これを適当 宿主に導入することもできる。
プロモーターとしては、 前記のプロモーターが挙げられ、 宿主として は、大腸菌（ 294,W3110，C600 ¾ど）、 と わけ 2 9 4が好ましい ( お、 294は公知の菌〔8 (310]^11. .ら,1)1"〇( . &1：1. 0¾1.
SGi.USA. 73, 4174( 1 ?76)〕で財団法人「発酵研究所 （iTLStit ute For Fermentation .Osaka) l/C 1 ? 8 2年 3月 23日付で ェ FO— \ ^ΙΠ I として寄託もされている。
本発明の DN Aによる宿主の形質転換は、 例えば公知の方法
〔Cohen,S.N.ら， Proc.Natl.AGad.Sci.US 69 , 21 1 0
( 1 ？ 72 ) により行う。
このようにして得られた宿主をそれ自体公知の培地で培養する。
培地としては、 例えばグルコース、 カザミノ酸を含む M？培地〔 Miller J , Experiments in Molecular Genetics ,
431— 433 (Cold Sprin Horbor LalDoratcry, New York 1 ?72)〕カ挙げられる。 ここに、 必要によりプロモーターを効率よく 働かせるために、 たとえば 3 /5—イ ン ド リ アタリノレ酸のよう ¾薬剤 を加えることができる。
培養は通常 1 5〜4 3 でで 3〜2 4時間行ない、 必要により、通気 や攪判を加えることもできる。
OMPI
差換 ^k^^WIPO" 培養後、 公知の方法で菌体を集め、 例えば、 緩衝液に懸濁させた後、 たとえば超音波処理， リゾチームおよび または凍結融解によって菌体 を破壊し、遠心分離によ D上澄みを得る。 菌体の破壊に関しては、凍結 ffi^後リゾチーム処理を行るうことが好まし 。
上記上澄み中のヒト I - I Fは、 本願の発明者の一部の者が発明した H— Lys— Arg— Lys— Arg— S e r— Gin— e t— L e — Phe— Arg— Gly— Arg-Arg-Ala-Ser-Gln-OH で示されるぺフ。チドに対するモノ ク ローナル抗体を用いることによ 有利に精製することができる。 該モノ クロ一ナル抗体は、 抗体カラムとして有利に使用できる。
抗体カラムの作製は、 例えばハイプリ ドーマを接種した腹水等から純 すいに精製した上記モノ クローナル抗体を適切な担体とカプリ ングさせ ることによ])、 以下の様な方法でできる。
用いる担体は、 カプリ ングの後に I 51 - rが特異的に効率よく吸着さ れ、 その後適切る溶出が可能なものであればどの様るものでもよいが、 —例として蛋白の一級ァミンが結合し易い様に活性化されたァガロース ゲノレビーズ、 例えばアブイゲル - 1 0などが以下に述べる様な方法で好 都合に用いられる。 ァフィゲノレ - 1 0と抗体との反応は、 0. 001〜1 M、 好ましくは 0. 1 Mのバイカーボネート等の緩衝液中で反応を行な う。 反応条仵は 0°〜2 0 'C ， 1 0分〜 2 4時間、 毽々の pHが可能であ るが、好ましくは、 4 ， 4時間， pH 3〜1 0の条件が用いられる。 混合するアブイゲノレー 1 0と抗体の量比は、 アブイゲル 1 Wに対し抗体 量が約 5 0^位迄は多ければ多い程多くの抗体がつくので、 この範囲内 でいくらでもよいが、結合効率を考慮して 3 0^以下の抗体が好都合に 用いられる。 この様にしてできた抗体-担体結合物は、反応に用いた緩 衝液でよく洗った後、数日放置するか、 もしくは最終濃度 0. 05 Μのェ 差換え タノ一ノレア ミ ン .塩酸を加え 4 'Cで 1時間反応させる等の方法によ 、 残存する未反応の活性基をブロックした後、 適切 ¾力ラムにつめること によ 、抗体カラムとして使用できる。
上記した抗体力ラムで精製するに際しては、 たとえばヒ ト免疫ィンタ 一フエロン蛋白質含有試料を中性附近の緩衝液、 たとえばリン酸緩衝液 ゃト リ ス .塩酸緩衝液に溶解して抗体カラムに吸着させる。 次にカラム を同じ緩衝液で洗浄したのち、 I F - rを溶出する。 溶出液としては、 弱酸性溶液たとえば酢酸溶液，ポリエチレンダリコールを含む溶液，試 料にくらべ抗体 によ 結合し易いペプチドを含む溶液，高濃度 塩溶液 ¾どおよびこれらの組み合せた溶液 ¾どが用いられ、 ヒ ト I - I Fの分解をあま i?促進しないものが好ましい。
カ ラム溶出液は、 常法によ 緩衝液で中和する。 必要によ]?再度上記 の抗体カラムによる精製操作を行 うことができる。
ここで得られるヒ ト I -ェ F蛋白質溶液は透析に付し、必要によ こ れを凍結乾燥によ j?粉末とすることができる。 凍結乾燥に際しては、 ソ ノレビトーノレ ， マ ンニ ト 一ノレ ，デキス 卜 ロース ， マノレ 卜 一ス ， ク、 ' リ セ 口一 ノレ どの安定剤を加えることができる。
かくして得られるヒト免疫ィンター フェロ ン蛋白質はヒト羊膜由来 w ェ S H細胞に対する水泡性口内炎ウィルス （ V S V )の細胞変性効果阻 止試験によるウイノレス活性測定において 1 07 ϋ/^以上の比活性を示す ものである。
おここで I Fの活性としての (ュニッ ト )の出し方は 下の様に行った。 ュニッ トの確定した国際標準ェ F - aと白血球由来の 粗 I F - rをヒ ト羊膜由来 F L細胞株に対する V S Vの細胞変性効果阻 止試験を用いて測定し、 その力価の比較から白血球由来粗 I F - rの力 価を決定し I F1 - rの標準品とした。 目的とする資料中の I F - rの力 価算定のためには、常にこの標準 I F - rを並べて前述の W ISH-VS Vの系でァッセィを行い、その比率から力 ^を算出した。
本発明のヒ ト免疫ィ ンターフェロン蛋白質は、 好ましくは一般式 (Ν)Η-Υ Ζχ Tyr Z2 Gin Asp Pro Tyr Val Lys Glu
Ala Glu As n Leu Lys Lys Tyr Phe Asn Ala Gl His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly lie Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys lie Met Gin Ser Gin lie Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gin Ser lie Gin Lys Ser Val Glu Thr lie Lys Glu Asp Met Asn Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gin Arg Lys Ala lie His Glu Leu lie Gin Tal Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys Ar Lys Arg Ser Gin Met Leu Phe Arg Gly Ar Arg Ala Ser Gln-OH(C ) ( IV )
〔式中、 Yは Metまたは結合手を示し、 Zi， Z2はそれぞれ Cysまたは ½ Cy sを示す〕のァミノ酸配列からるるポリべプチドを含有するもので ある。 当該ポリペプチドを乾燥品基準で 90 %以上と])わけ 9 5 %以上 含有するものが好ましい。
本発明によ Jffitされるヒト免疫インターフェロン蛋白質は下記の 1 ^を有する。
1) S D S一ポリアクリルアミ ドゲル（ 17. 596 )電気泳動による分子 量測定で 17， 000±1，000 を示す。
く η -7シスチン
2) ァ ミノ末端アミノ酸としてシスティ ン たはメチォニンを有する。 差換え 3) H— Lye— Arg— Lys—Arg— Ser— Gin— Met— Leu— Phe— Arg—
Gly-Arg-Arg-Ala-Ser-Gln-Ofl に对する ノクローナ 抗 体と結^^る。
本発明によ ^典遗されるヒト免疫インタープェロン蛋白質は従来の方 法で得られる I一 I Pと同様の目的に同棣の用法によ ϊ>使用できるが、 従来品に比し、 夾雑 白質，発熱物質が少 * ので、注射剤原体等とし てよ 安全に使用される。
本発明のヒト I一 I F蛋白質は抗ウィ ス，抗扈癌，細胞增殖抑制 よび免疫增強作用を示す。 本発明のヒト I一 I Ϊ*蛋白質は滅菌水， ヒト 血清ア ブミン （fiS A ),生理食¾水その飽公知の生理学的に許容される 担体と混合することができ、非 ¾口的に又は局所に ¾与することができ る。 例えば、正常人 1日当 1 0万〜 1僮ュ-ヅト、好ましくは 5000万 - 6000万ュ-プトを静注又は筋注 ¾どによ 投与することができる。 本発明の tト I一 I P蛋白質を含有する製剤は、壤，希釈剤，アジュ バント ，他の担体，パプファー，綰合剤，界面活性剤，保存剤のよう 生理的に許容される他の活性成分も含有していてもよい。 非搔ロ的投与 用製剤は、 滅菌水溶液又は生理学的に許容される溶媒との懸濁液アンプ 、 または生理学的に許容される希釈液で用事希釈して使用しうる滅菌 粉末（通常 I一 I F溶液を凍結乾燥して得られる）アンブ として される β
さらに本発明のヒ ト免疫インターフェロン蛋白 «を含有する製剤は、 I J*一《または I F— 9またはィンターロイキン 2などの ンホカインのよ う 他の活性成分を本発明物資に対し 1〜 9 9 ½含有していてもよい。
図面の簡単 説明
第 1図は実施^ 1 ( Vi i ) で得られたブラスミド PHIT3709の制限酵 差換え 素地図を表わし、 ¾E部分はシグナノレぺプチドと考えられるべプチドを コ一ドする部分を示し、;^:は I - I Fホ°リペプチドをコードする部分 を示す。 第 2図は実施例 2 (Vii)で得られだ pHIT3709プラスミドの —次構造（塩基配列）を、 第 3図は実施例 2(ί)(Η)の ptrp701および ptrp77l、 第 4図は実施例 2(iil)の pHITtrpllOl、 第 5図は実施例 2 (iV)の p H I T t rp 2101の構築図をそれぞれ表わす。 第 6図は実施例 6 ( i )の電気泳動の結果を、 第 7図は実施例 6 ( i )における分子量測定の結果 を示す。
発明を実雄するための最良の形鑲
実龜例 1
(I) ト I一 I Fをコードする aRHAの分離
ト末禳虚よ])調勰したリ ンバ球を 1 2— 0—テト，デカノィ ホ ボー 一 1 3—ァセテ一ト （ T P l ) ( 1 5 ng i)とコンカナパリ ン A ( 40 « ^)を含む RPMI— 1640培地（ 1 0 *の牛胎児血淸を 含む）で 3 7ゎ*養し、 I一 I Pを誘導させ 。 24時钃後、 の绣導 した 1 X 1 010 個のヒ ト リ ンバ球をチオダァ-ジン変性溶液（ 5 Mグ ァ-ジンチオシァネー ト、 5 *メ カブトヱタノ一 、 50 a Trie- flCl ρΗ7.6 , 1 0薦 Μ Ε D Τ A )中でチプ σンホ ¾ゲナイザーによつ て破壊変性した後 If 一，ゥロイリ ザ コシン酸ナト ウムを 4 *に * るように加え、均質化した潙合物を & 7 M植化セ ウム溶液〔 7 M¾ 化セシゥム、 αΐ Μエチレンジアミ ン四薪黢（ E D T A ) 〕 6 W上に重 雇し、ペックマン S TT 27のローターを用 て 1 5 で24000で1>鵰 30時間遠心処理を行 、 R N A沈殿を得た。
この R N A沈濺を (Χ25*1ί—ヲゥロイ ザ コシン酸ナトリゥム溶欲 にとかした ¾、 エタノー で沈 ¾させ、 &3 Wの R W Αを得た。 この R N kを！ ¾¾溶液 C 0.5 M MaCl ( 1 0 atf Trie -HCl H 7- 6 , 1 重 M BDTA , OL 3 ¾ SDS 〕中でォリゴ（dT)セ ロース力 ムに吸着させ、
差換え 1 ポリ （A)を含む mRN Aを低塩溶液（ 1 amii Trii -Ξ01·ρΗ 7. ό .
1 mM EDTA^O.3 % SD S )で溶出させることによ]?、 ポリ （A ) ¾ ^む mRNA 70 OAgを分取した。
この mHUAを更にエタノールで沈殿させ、 £12 "の溶液（ 1 0 mM ris 5 · HG 1;ρΗ7.6 , 2mM;E:D TA , CL5 S DS )に溶 し、 る 5 でで 2 分間処理して 1 Q〜 55 庶糖密度勾配遠心処理（ベックマン S 7 の口一ターを用いて 20で ， 25000ri>m-T!21時間遠心分難）するこ とによ]?分画化して 2 2分画を得た。 この各分面につき EN Aの一部
、 ずつを、 ァフリカツメガエルの卵 胞に注入し、合成 れる蛋白質 10 中のィンターフェ口ン活性〔 ヒト羊膜由来 U S H細胞に対する水泡 性口内炎ウィルス （ の細胞変性効果阻止試験を用 て測定し t ウイノレス活性 ( Stewart , W. E . Tlae interferon..System . (
Springer Berlinl 975» ) を測定 L 分画 12 (沈降定数 S値は 1 2—1 Sを示した）に 1 ?5ュ-フ ト ZagEN A の活性を検出し 15 た。 このようにして得た分画 1 2の mRNAは約 20 であった。
' · (31) 単鎖 D N Aの合成
上記で得た mRN Aおよび逆転写酵素を用い、 1 (3 (3 ^の反応液（ 5^gOmEN Ax 50 gオリ ゴ（ T ) , 1 0 0ュニッ トの逆転写酵 0 素、 1 mMずつの ATP ,(iCTP , GTPおよび TTP , 8 mM Mg Cl2, 5 0 mMKC 1, 10 ジチ才スレイ ト一ル、 5 Q mM Trisー玨 CI5玨 8.5 )中で 42 1時間ィンキュベ一トした後に、 フエノールで除蛋 白し、 0· 1 Nの OHで 7 (3で,20分処理して R N Aを分解除去した。
(Hi) 二重鎖 DN Aの合成 '
25 ここで合成された単鎖の相捕 DNAを 50 ^の反応液（mHNAとォリ ゴ d Tを含ま 以外は上 ¾と同じ反応欲）中で 42 2時間反応させ る とによ 二重钃 D S Αを合成した。
(IT) d C尹ィ の付加
2：の二重鎖 D N Aにヌクレアーゼ S 1を 50 の反応液（二重鎖]) MA α 1 Μ«ί銕ナトリゥム pS 4.5 , a25M aCl, 霣 M ZnSO .60 ュ-プトの S 1ヌクレアーゼ）中で室潘 30分 ¾作用させ、 フエノー で除蛋白し、エタノー で D N Aを沈 18させた後、 これにターミナ ト ランスフエ 7—ゼを 50 /< の反応欲（二重禳 D K A , Oi l 4 Mカコヅ 酸カ ，（ 3MTria( 基） pfl7.6 , 2aM ジチオスレィトー ， 1 C0C12, (XI 5颺 M dCTP, 30ュ -プトターミナ ト，ンスフヱ， ーゼ）中で 3分閣 3 7Cで作用させ二重鎖 D N▲の に約 20儒の デォキシ yチジン鎮を伸長させた。 れらの一連の反応で約 300 ngO デォキシシチジン鎖をもつた二重鎖 D N Aを得た。
(V) 大腸菌ブラスミ ドの開裂ならびに d (5ティ の付: ¾
一方、 1 0 - の大腸菌ブラスミド pBR322DIiAに制限酵素 Pstl を 50 ξ OS.SSMC 10A«?DMA , 50aUKaClt 6 m Tris -HCl (pH 7.4 ) , 6重 MMgC:L2, 6 aM 2—メ カブトヱタノ一 ， ΙΟΟβΨ H 涛ア ブミン， 20ュ-プトの Pat I〕中で 3時間 37わで作 用させて PBR322DHA中に 1ケ所#¾する Ps tl認識部位を切断し、 プエノー tj^蛋白した後、 ターミナ トランスフエ，ーゼを 50 の反応液〔 D H A 1 0 、 （ 14M力 3ジ !酿カ 9、 a3MTris(¾ 基） pfi Z6 , 2 m ヅチオスレィトー 、 1重 M C0Cla, ai5aM dQTP , 30ュ-プトターミナ トランスプヱヲーゼ〕中で 3分間 37 tで作用させ上記ブラスミド pBR322D!TAの 雨續に約 8 fflの *キ シグァ -ン鎖を 長させた。 差換え (Vi) の会合 ¾らびに大腸菌の形質変換 ' 、 このようにして得られた合成二重鎖: DN A 0·1 と上記プラスミド pBH 322 0·5 gを 0·1 MlTaCl , 5 OmSfTri a -HCl Η 7.6 ' 1B¾EDTAよ]) るる溶液中で ό 5で 2分間、 45で 2時間加熱しその後除冷して会合させ Eneaらの方法〔； Γ * Mol. Biol. 6， 495 ( 1 ？ 75 )〕に従って： ^菌 •X 1.77 όを形質転換さ^t。 '
( S.) GUN A含有プラスミ ドの単離
こうして約 8500のテ トラサイクリン耐性株が単離され、 これら^ の： D N Aを-トロセルロースフ ィノレターの上に固定した。 -( G Γ3ΐ.¾βίθίη M.ana Hogness^D.S. Proc.Nar^-Acad.Sci.USA72.3？ ό 1 (1975)
—方、 D.Y.Go-eddelらの報告〔Natur&2丄 5.503 ( 1982)〕のエーェ: P のアミノ酸配歹 ljをもとにしてァミノ酸 NOJ— 5 C Gya-Tyr-C S'&ln- Asp)及びァミノ酸 NO*77— 82 ( Lys ·'0·1η 'Asp* ΜΘΤ Asn'Val)よ！） 推測できる塩基 IB歹 lj (それぞれ 5' T C C TG&CA^TA よび 5'
Figure imgf000020_0001
；)をト リエステノレ法〔 Crea* ら， Proc-
Na-ci.Acad.Sci.US .75 , 57 ό 5 ( 1978 )を用いて ί匕学合成した。
'このォリ ゴヌク レオチドに対して Τ 4ホ。リヌクレオチドカイネ一スを用 て 50 の反応液 Cォリゴヌクレオチド O^^g ' 5 OmMTria-HCl H o , 1 amHMgC 2, 1 QmM^ノレ力フ。トエタノール、 50 ^CiT -^32p ATP.3ュ-ッ ト T 4ポリヌク レオチドカイネ一ス ）中で 1時間 37でで 反応させ、 末端を 32 Pで標識した。 この標識されたオリ ゴヌクレオ チドをプローブとして Lawnらの方法〔 Nucleic Acids R es .. £ .
61 133 ( 1 ? 81 )〕に従って上記の二 トロセルロースフ ィルター上に 固定した DN Aに会合させ、 オートラジォグラフィ一によつて上記二種 類のォリゴヌク レオチドプローブに反応する菌株を 4個単難した。
OMP! これらの菌;^の各々の 体からプラスミ ド DN Aをアルカ リ法 CBirntoim H.C.&Doly,:r.Nuclsic Acid sRes'乙.1513(1 ?7? 」によ
つて単離した。 次にプラスミ ド Aの揷入部を制限酵素: Psまェによ]) 切 出し、 分離したプラスミドのうちでその揷入部の長さの最も長 断 片を含むものをえらび、 このプラス ミ ドを pHIT 370？と名ずけた。
このプラス ミ ドの制限酵素地図を第 1図に示す。 '·
次にこの PHIT 37 (3？ プラスミ ドに揷入された mRN A配列の一次構造 (塩基配列）をジヌク レオチド合成鎖停止法と Maxam-Gil ertの方 法によって決定した。 その一次構造は第 2図の通]?であつ-た。
実施例 2
(i) 発現プラスミ ドとして大腸菌のト リ プト ファ ン合成のプロモータ一 部分〔 プロモータ—、 オペレーターを含む D N A断片、 2 7 6塩基対、 Bennett, G. N.ら， J". Mol. Biol.， 121， 113( 1978)〕を含むプラス ミ ド ptrp601 (ベクタ一は pBR 322 )を構築した。
一方、 プラスミ ド PBR322 を制限酵素 EcoRIおよび制限酵素 Ava
Iで切断し、得られたテトラサイ ク リ ン耐性遺伝子を含む EcoRI- Ava I断片のの しろ部分を D N Aポリメ ラ一ゼ Iラージフラグメン トでう めた。 この断片を T 4 D N Aリガーゼを用いて ptrp601の Pvullの切 断部位に結合させ ptrp701を構築した（第 3図）。
(ii) 次に ptrp701に 2ケ所存在する制限酵素 Clal切断部位の一つを 消去するため、 ptrp701を Clalで部分分解して二つの Clal切断部 位のうち一方のみ力 S切断されたものを得た。 生じたの しろ部分を D N Aホ。リメ ラーゼ Iラージフラグメ ン トでうめたのち、 T 4 D N A リガー ゼで再度結合させて ptrp771を得た（第 3図）。
(iii) 11ェ13709を制限酵素1531：1で切断して1 F一 rの構造遺伝子を
"·· 恙捭 し - 0MPI 含む Pstl断片を得た。 この断片を制限酵素 BstNI で部分分解し、 I F一 r構造遺伝子内にある BstNI 部位の切断された BstNI -: Pstl断 片を得た。 BstNI 切断部位のの しろ部分を D N Aポリメラ一ゼ Iラ ージフラグメ ントでうめたのち、 前述したトリエステル法によって化学 合成した蛋白合成開始コドン A T Gを含むォリゴヌク レオチドアダプタ 一 CGATAATGTGTTACTGCC
TATT AC AC AATGACGG
, を Τ 4 D Ν Αリガーゼで結合させた。
—方、上記アダプタ—を結合させた I F― r遺伝子を Ptrp771を制 限酵素 Pstlと制限酵素 C la Iで切断して得た断片のトリブト フアンプ 口モーターの下流に揷入して T 4 D N Aリガーゼを用いて結合させ、 ェ F— Γ発現プラスミ ド pHITtrpllOlを構築した（第 4図）。
(iv) pHITtrpllOl をさらに改良して次の通]? pHITtrp2101 を構 築した。
まず ptrp601を制限酵素 C 1 alおよび制限酵素 HpaHで処理して trpプロモータ一を含む Clal - HpaE断片 0.3 3 Kb を得た。 この断 片を、 Clalで切断しァノレ力 リホスファターゼ処理した pHITtrpllO 1に T 4 D N Aリガーゼを用いて結合させ trpプロモータ—が二つ直列 に入った pHITtrp2101を得た（第 5図）。
このフ。ラスミ ド ρΗΙΤ· trp2101 を用いて Cohen らの方法〔前出〕 に従って、大腸菌 2 9 4を形質転換させ、 このプラスミドを含む菌株 E. coli294ZpHIT- trp2101を得た。
実施例 3
E. ooli294/pHITtrp2101¾ 8 ii9/nl<D于 ト ラサイクリン， 0.4 % カザミノ酸， 1 グノレコースを含む M 9培地 2 0 を分注した 1 差換え マイ " —中で 3 7 'Cで培養し、生育が K U 2 2 0に達しえ時に 3 β ― イ ンドリールァクリル酸（ I A A )を 3 0 9/ るように加えて更 に 4時間培養した。
実施例 4 ,
実施例 3で得られた培養液 1. 2 Ά を遠心分離して菌体を集め、 これ を 6 0. ικίの 1 0 %シュクロースを含む 0.0 5 M-Tris -HC1 pH 7.6 に懸濁した。 この菌体懸濁液に 0.2 Mフエ二ルーメ チノレ-スルフォ-ノレ フルォライ ト、、（ P M S F ) 0. 3 , 5 M NaCl 2.4 Λ 0.2 Mェチ レンジア ミ ンテ ト ラアセテー ト （ E D T A ) 2.4 ， 1 Μスペルミ ジ ン 2.4 W， 5 / リゾチーム 2. " を加え 0 tで 1時間放置した のち、 3 7 'Cで 5分処理し、 これを更に ARTEK社（米国）製超音波破 砕器で 0 'C 3 0秒処理した。
この溶 液を 105，000x で 1時間遠心分離して上清 6 6 を集 めた。
実施例 5
実施例 4で得た上清 6 0 Wを 1 mMEDT A , 0.1 5 M NaClを含む 2 0 mM Tris -HC1 , pH 7. 6 ( T E N ) で 1 5 0 Wに稀釈したのち、 参考例 1 0の方法で調製した抗 I F - r抗体カラム （ 9 l )にかけ た。 T E Nで十分洗净したのち、 さらに 0.0 1 %ノニデット P — 4 0 ( Shell社製） 0. 5 M NaClを含む T E Nで洗浄した。 次に 0.2 5 M NaClを含む 0.1 M酷酸で]: F - rを溶出し、溶出液はただちに 1 Mト リ ス HC 1 pH 7. 6で中和した。 得られた溶液を蒸留水に対し 4 °C， 1 6時間透析し、 これをァセト ン - ドライアイスで凍結後凍結乾燥に付 し粉末とした。
結果は以下の通 であった。
OMPI i 蛋白質 ¾ 全活性（ひ） 比活性^) 回収率 ) 溶菌液上清 250.8 4 X 108 1.6 106 - 抗体カラム処理 2.0 1.5 108 7.5 X 107 37.5 ここで得られた最終のヒ ト免疫ィ ンターフェ口 ン蛋白質の比活性（ W 5 I S Η細胞に対する V S Vの細胞変性効果阻止試験によるウィルス活性 測定による（前出） )は 7.5xl07lh/ であった。 この蛋白質を以下の 実験に供した。
実施例 6 ヒ ト免疫ィ ンターフェ口 ン蛋白質の性状
(i) 分子量
0 実施例 5で得られた蛋白質を 2—メノレカプトェタノールで処理して S
D S -ポリアク リノレアミドゲノレ（ 1 7.5 ¾ )電気泳動（ 1 5 ， 6 時間）にかけ、 クマジーブルーで染色したところ、 蛋白質は単一のバン ドとして確認できた（第 6図）。 ¾お同時に泳動させた分子量マーカー の泳動距離と蛋白質の泳動距離との関係から蛋白質の分子量は 17,0005 ±1,000 と推定された（第 7図）。 一方、 2—メルカプトエタノーノレ で処理しなかった蛋白質は分子量 33，000±2，000 の位置にもう一本 のパンドが検出された。 この値は I 51— rの分子量 17，000±1，000 の約 2倍に相当することから、 このバン ドは I F - rの二量体に由来す ると考えられる。
(ii) アミノ酸分析
実施例 5で得られた蛋白質をガラス製加水分解用試験管にと ]5、 200 倍量（ )の 4 %チォグリコール酸を含む定沸定塩酸を加えて、減 圧下に封管したのち、 1 1 0 で24 , 48 , 7 2時間加水分解した。 加水分解後、 開管し、 塩酸を滅圧下で除去し、残渣を 0.0 2 N塩酸に溶 解して日立製 8 35型高速アミノ酸分析計によ！)ァミノ酸分析を実施し ^スチンおよび スティンは、 Hi r鼹の方法〔 Methods BnaywJiL ϋ , 1 97 ( 1967 )〕に従 、上 ¾S白質を遏ギ酸酸化したのち、上記 と同様に 2 4時間加水分解して、 ァミノ酸分析 ft*にょ ス尹イン酸と して定量した。 ァミノ黢分析 は、 2 4 , 4 8 よび 7 2時間の ΛΙ水分 解で得られえ鑲を平均して求めた。但し、セ 9 ン ， スレオ-ン ，チ ジ ンおよびトリブトプアンの儎は加水分) ^間を 0時間に外禪して求めた β その結果を第 2表に示す。 第 2 表 検出アミノ駿 ： i 検出アミノ酸
；!
ァスパラギン酸 13. 4 ；: メチ才ニン 2· 9
ϋ
スレ才ユン 3. 6 1 イソロイ ン 4. 8 セリ ン 7· 4 ΐ ロイ ^ン 6. 8 グ タミン酸 12. 5 1 チ σジン 3. 4 ブロリ ン 1· 4 i ！ フエ- ァヲ ン 6. 7 グリ シン 3. 8 リ ジン 13. 5 ァラニン 5. 3 ： ヒスチジン 1. 5
スチイン酸 1. 3 i ア ギ= V 5. 4 バリ ン 7 .； ト リブトファン 0. 9 (i) アミノ^ iァミノ 分 if
実雄^ 5で得られ 蛋白質を Sireの方法〔 Methode EnayaoL n, 197(1967)〕に つて遏ギ酸酸化し のち、エドマン分解法の 永 ら tCよる変法 (： Eur. J. Bioohea.8 ,189(1969) 〕によ そのアミ ノ末爆アミノ酸分析を実雄した。生成し フエ- チオヒダントイン一 アミノ酸 —アミノ酸）はタ トラスフェアー 0 D Sカラム〔ァ チプタス U. S, A. ) , 46 250鷀，粒子逢 5 邐 〕を用い, Aroher <OWk〔 Altex Chroaatograa ,3,8 (1980) 〕によ l パリアン製高速液体クロマトグラフ 5040¾( ϋ. S. Α. )で同定，定 量した。その結果、 ： Ρ Τ Η—メチォ -ンス ホンおよび P T S— ^スチ ィン黢が検出された。 上記実維例よ！?明らか *ように本発明によれば、 7.5 X 107 ϋ/^ teLhの比活性を有する実質的に穗粋 ¾ ト免疫ィンターフェロン躉白質 を製造することができる β
差換え ^下の実施例に て、薄層クロマトグラフィーは、 メ ク社製シリ
カゲ; I /プレー ト 60 F2S4; 又は、 ブナコ、ン薬品社製セ 口 -スプレー
ト ，アビセ/ US i*を用 、 下記の展開溶媒を用 た。
Ef1： クロ口ホ ム ： メタノ一〃：酢酸 = 9 ： 1 ： 0.5
Ef2：酢酸ェチ ： ビリジン：酢酸：水- 30 ： 1 0 : 3 : 5
Bf*3：ク口口ホ ム ： メタノー ：水- 7 : 3 : 0.5
B 4： n -プタノ一 ： ピリジン：酢酸：水- 30 ： 2 Q ： 6 ： 24
Bf5：醉酸ェチ ： nーブタノ - ：酷酸：水- 1 ： 1 ： 1 ： 1
参考例 1
( i ) Z - Ser - Gin - OBu七 の製造
Z-Gln-OB^ 1 0.1 をメタノーノレ 5 Q 0 に溶解し、パラジウム
黒を触媒に水素気流中で還元した。 触媒をろ去し、 溶媒を留去した残留
物を Z-Ser— OH T.59 , Ε 0ΉΒ 6.8 ^とともに D M F 250 *に溶 解し、 氷冷した。 氷冷下に D c c 7.1 5 を加え、 0てで 4時間室温で
1 2時間擾拌した。 折出した D c ϋをろ去し、 溶媒を留去ののち残留物
を AcOEt 3 0 0 Wに抽出し、 4 % iTaHC03水， 0,2 if塩酸，水で洗い、 無水硫酸ナト リ ウムで乾燥した。 溶媒を留去し、 析出した結晶をエ-テ
でろ取し、 乾燥ののち c¾3 Cir よ])再結晶した。 収量 6.5 ，収率
OMPI
差換え 51.2 * , Ri1 αβ 重 ρ· 97一 10 OC ,〔 β〕¾5— 2 1。
( o - α4 o ,メタノー ）
元素分析 C20fl2907M3 として
計算観： C, 56^ 72; H.6, 90? M,9.92
実驗值： C, 56· 21; H, 6.72； N,9.76
(匿） Z— Ala— Ser~(31n— OBu の製造
Z-Ser-Gln~OBu* 23 fをメタノー 30 溶解し、パ ヲヅゥム黑を爐《 C水素気流中で ¾元した。 敏媒をろ去し、溶锞を ar去 した残留物 rZ— — OH 2.349 , ΗΟΪΤΒ 2^27 -とともに、 AcOSt 20 とジォキサン 20 ， D 1£ I» 100 の混合溶 *に 溶解し、氷冷した。 冷却下に D C C 2.38 fを加え で 4時 W、室 で 12時 ««拌ののち、 D C ϋをろ去し、溶蝶を留去した。 残留物に Cfl3CH とエーチ を加え結 ¾としろ取、乾燥ののち CS3CH よ 再結 し 。収量 3·72， ，収率 75·3*， Rf1 αβ 0 , ap. 165— 170 t , C « ¾5-4 L2e ( c - (X50 ,メタノー ）
元素分析 c23a3408i として
ft iS: C.55. 86； Η,β. 93； N, 11. 33
実驗貧 ··（3,55· 58; H.6. 74； Ν,ΙΙ. 12
(薦） Ζ— Arg (？重 β)— Al»— Ser~01n— OBu* の製遣
Z-Ala-Ser-Qln-OB * 3·46 »をメタノー 30 0»^に溶解 し、パラジウム黒を触媒に水素気流中で遣元した，敏 をろ去し、溶煤 を窗去した残 物を、 Z-Arg(P«e)-Ofl.CHA 454 *から調製しえ Z— Arg(P重 β)— 0fl， HOBt fとともに D 15 溶解し 永冷した。 ^下に D C C -を加え、 0わで 4時嗎、室墨で 15時 閼攪拌した β D CUをろ去し、溶媒を β去し残 «物に AcOSt を加えゲ ル伏の沈澱を得、 ろ取した。 乾燥後、 メタノ -ルと AcOEt よ J)再沈澱 した。 収量 4.55 ^ ,収率 75.556 , Bf 1 0.5 7 ， mp . 1 30 - 1 3 Ό , 〔 - 24. Γ ( c = 0.2 S ，メタノー〃）
元素分析 C^ EsoOu s S v - H20として
計算値： c, 55.22; ΗΛ7.07; Η, 12.88; S.3.69
実験値： c,55.23; Η,6.93ί H, 12.54；' s,3.48
( IV ) Z~Arg(Pme)-Arg(Pme )-Ala-Ser-Gln-OBu"t <D
Z-ArgCPmeD-Ala-Ser-Gln-OBu"1 4.3 ^をメタノー 40 0 Wに溶解し、 パラジウム黒を «に水素気流中で した。 をろ去 し、溶媒を留去した残留 を、 Z-JLrg(Pme)-OH*CHA 3, 24 よ]) 調製した Z— Arg(Pme)— OH, HOB七 L 42 とともに: D M F 200 に溶解し永冷した。 冷却下に D C C 1.4 1 を加え 0 で 4時間、 室温 で 20時間攮拌した。 D C ϋをろ去し、'溶媒を留去した残留 liCAcOE七 を加え沈殺を得、 ろ取した。 乾燥後、 メタノ- と AcOEt よ]?、再沈 澱した。 ¾¾14,4ダ ，収率了 ！ · 7 % , Bf1 0.6 3 , nip. 1 25 -
1 3 0で， 〔 " 〕 - 〗 8, o ( c = 0.40 ， メタノー ）
元素分析 C57 H860i4 iTi2 S2 · Η2 0として
計算値： C, 54.96; Η,7.12; if, 13.50 ;S , 5.15
実験値： c，54.66; H,6.92; 13.32 ; S， 5.34
( V ) Z-Arg ( Pme ) -Glj-OBut の製造
Z-Gly-OBu 1 3.0 を MeOH 50 0 «fにとかし、 黒を触媒 として、 水素気流中、 接 M元した。 触媒を泸別し、 泸液を減圧澄縮し、 残留物を D M F 2 0 0 にとかした。 とれに、 Z-Arg ( Pme )-ΟΗ· •CHA 20, 0 よ]?調製した Z— Arg(Pme)— OH, HOBt 5.4 を加 えて氷冷し、 D C C 8,2タを加えて 48時間かき混ぜた。
Figure imgf000029_0001
を泸別し、澳縮後、 AcOEt 50 にとかした。 AcOEi: 層を 456 aHC03 水， 1 0 %クェン酸水で洗淨後、 2Ja2S04 で乾燥した o¾縮 後、 石油ベンジンを加えて沈殿として泸取した。 収量 1 9.8 f (96. 8 )。 mp. 71 — 73で ， 〔な ：^3 + 0-2° ( c * 0.9 , D M P ) , Bf1 0.62
元素分析 C21H4507 H5 S として
計算値： c,58.33; H,7.18; ΪΓ, 11.09; S,5.08
実験饞： C,53-42; H,7.58; HQ.95; S,4.84
( VI ) Z~Plie-Arg(Pme)-Gl7-0But の製造
Z- Arg C Pme ) -Gly-0 Έν ί θ.0 を MeOH 50 Q W中、 接 S 元したのち、 ： DM F 300 Wに転溶した。 とれに Z-Phe-OH Α.Ί 29,
HOBt 2.35 を加えて永冷し、 D C C &59 を加えて、 1 5 時間 かきまぜた。 折出した D C ϋを泸別し、'泸液を瀵縮後、残留 を AcOEt 40 G Wにとかした。 AcOEt 層は、 4 ^iaHCC^ 水， ！ （3 ίクェン 酸: で洗浄し、 ITa2 S04 で乾燥した。 濩縮後、 ヱ一テ^を加えて結晶 として泸取し、 MeOH -エーテルよ]?再結晶した。 収量 1 0.5
( 85.3 )。 mp . 1 0 1 - 1 03°C , C « 0.9 ,
Figure imgf000030_0001
D M F ) , Sf1 0.64
元素分析 c40 H54 oa ir6 s として
計算値： C，61.S7; Η,6.99; Ν J0.79; s,4. 2
実験値： c, 61.66; H,6.56; H310.93; s，4.14
( Vfi ) Z-Leu-Phe-Arg(Pme)-Gl7-0B t の製造
Z-Pixe-ArgCPme)-Gl7-0But 5.5 を] ieOH 300 中、接 蝕還元したのち、 300"に転溶した。 これに、 Z - Leu - 0H DCHA 3.3 1 ょ 1?調製した Z—: eu— 0H， HONB 1. 79 冷し、 ： D C C 1, S 3 を加えて 48時間かきまぜた。 析出した DC ϋを 泸別し、濃縮後、 Ac OEt 3 0 0 Wにとかした o cOEi; 層は、 456 liaHCOg 水， 1 クェン酸水で洗净し、 a2S04で乾燥した。 濃 縮後、 エーテ を加えて粉末として炉取した。 収量 6.2 （ 98.3^) mp, 1 了 1一 1 了 3で， 〔 a 0.9 , D M F ) ,
Figure imgf000031_0001
Bf1 0. δ 4
元素分折 C46 Ηβ509 S
計箕値： C, 61.93; H,7.34; 10.99; S,3.59
実験値： c，62.02; 2,7.37; .08? s,3.59
( Vffl ) Boe - Me七 -: Leu -： Plie - Arg(Pme ) - Gly - OBu七 の製造
Z— jQeu— Pile— Arg (； Pme)— G1ァー OBu七 6.0タを MeOH 00 W中、 接蝕還元したのち、 D M F 1 5 に転溶した。 これに、 B0C— lie七
-OH-DCHA 3·0 よ]?調製した Boc— Met— OH, ΗΟίΤΒ J.3 9 を 加えて氷冷し、 ： D c c 1.5 9 f を加えて 1 5時間かきまぜた： > 折出 し た: D C ϋを泸別し、 瀵縮後、 n— BLLQH— AcOEtにとかし、 1 0 $ ク
ェン酸水で洗浄し、 Na2 S04 で乾燥した。 濃縮後、 エ-テ を加えて 結晶として炉取した。 収量 6.2 （ 3 3.1 % )。 mp. 1 92 - 1 95 ， C « - 1 9.7° ( c = 1.0 , D F ) 5 Ef1 0.64
元素分折 C48H76010 N8 S2 として
計算値： c，58.27; H，7.74; N, Π .33; s56.48
実験値： C, 58.48; H，7.79 ; N， 1〗 .34; S，5.98
( iX ) Boc-Gln-Met-Leu-Phe-ArgC me )-Gl7-OH の製造
B o c -Me t-Leu-Phe-Arg ( Pme ) -Qlj-OBv^ 5.5 に！ F A
を加え、 室温で 1 0分間振]?まぜたのち濃縮し、 ヱ-テルを加え て庐取し乾燥した。 これを、 D M F 5 にとかして氷冷し、 T E A — f „ 一 OMPI— 1.8 Wを加えた。 これに: Bo c - (Jin - OH IS 59 t HO 1.49 , D C C 1.90 ょ D調製した Boc-Gln-OiTB を加え、 1 5時^き ま《)t。濃缩後、 cOHを加え、 AcOEt を加えて沈嚴として^取し Tto 収量 5.3 （ 8 ^8 )。 2ΐρ· 1 81 - 1 83 （分解） · 〔《:^Η - 1 9.6 ( c 1.0 , D MF ) , 丄 0.30
元素分折 C49 H76012 Hio S2 として
計算値： c,55.45; H,了.22; 5,13.20; S,6.04
実験値： C，55.39; H，了 ·1了； K,13.34; S，6.20
( X ) Z-Ser-iTHNH-Boc の製造
Z-Ser-OH 1 0.0 ^ , t一ブチ 力 バゼー ト S.2 を D 34 i1
1 5 にとかして氷冷し、 HOI 8.0 f , n c c 9.3 を加えて t 5時間かきまぜた。 折出した D C Uを炉別し、潘缩後、 AcOE に転 溶した。 AcOEt曆は、 4 H ifaHCOs 水， 1 056クェン酸水で洗浄し、 Ha2 SO 4 で乾燥した。 濃縮後、 エーテ を加えて結晶として泸取し 7to MZZ f ( 50.4% ) mp. 95 - 98 , C «
Figure imgf000032_0001
2 ( c = 0.8 i D MF ) , Ef1 0.62
元素分析 C16H230s ίΓ3 として
計算値： c，54.38; Η,6.56; Ν,Π.89
実験値： C, 54.77; Η，6·88;
( Χί ) Z-Arg ( me ) -Ser-HHNH-Boc の製造
Z-Ser-NHITH-Boc 3.9 を MeOE 300 W中接触還元-したのち、 D M I1 5 に転溶した。 これに、 Z-Arg ( Pme )-0B CHA Q, 29 ょ]?調製した2— 3£(1>11^)-03， HOBt 1.5 を加えて永冷し、
D σ σ 2.39を加えて 1 5時間かきまぜた 3 折出した D c ϋを泸別し、 瀵縮後、 AcOEt にとかした。 AcOEt 層は、 4 % aHC03 水 多クェン酸水で珠净し、: cr so4で乾燥した。 濃縮後エ-テ を加えて、 沈澱として泸取する。 収量 7.45 （ 9 3.7 ）。 nip. 100— 10 〔a〕D - 0.9°( c = 1.2 , DM F ) , Bf 1 0.5 ί
元素分析 C33 H490 s. S として
計算値： C，55.G6; H, 6.865 if, 13.62; S,4.46
実験値： 55.49; H,6.94; IT, 13.14； S,3.86
( Xfi ) Z-L7 s ( M t r ) - Arg ( Pme ) -S e r-JTHiTH-B o c の製造
Z-Arg ( Pm e ) - S e r-HH2iH-B o c &9 を lieOH 30 0W{ ^かし、 接触還元したのち、 DliF 50"に転溶した。 これに、 Z - I rsOi七 r) -OH · D C H 1 3·4 ょ 調製した Z—： Lys(Mtr)— OH, HOBt
0.8 8ダを加えて氷冷し、 D C C !, 34 を加えて 20時間かきまぜ た。 析出した D C ϋを炉別し、 瀵縮後、 cOEt を加えて粉末として泸 取し、 MeOH-AcOEtよ ]?再結晶した。 収量 5.1 ^ ( 9 3.4 ¾ ) mp.. 1 0 3— 1 0 5 ， 〔 a - 1.1。 ( c = 0.8 , D M P ) , Bf1 0.57
元素分析 C49H73013 iTg S2 として
算値： c，55.50; H,6.94; ir,H .89; s,6.05
実験値： c，55.7Q; H，了.15; ίΓ, 11.60; S，5.63
(Xil'O Z— Arg (； Pme )— Lys (Mtr)— Arg(Pme )— Ser— ΙΤΗίΓΗ—; Bocの製 造
Z-Lya (Mtr)—A;rg(;Pme)""Ser—irH:iTH—:Boc 4.8 を MeOH
3 0 0 Wにとかし、 接触還元したのち、 D M F 7 に転溶した。 こ れに、 Z-Arg(Pme)-OH'CHA 2.8 よ]?調製した Z-Arg (： Pme )—OH， HOBt 0.74 を加えて氷冷し、 D C C 1. 1 2 を加えて 1 5. 時間かきまぜ 。 析出した ID C ϋを庐別し濃縮後、 AcOEtにと 差換え AcOEt 層を 4 $ lTaHC03 水， 1 0 %クェン酸水で洗净し、 IfasSC^ で乾燥した。 濃縮後、 エーテ を加えて沈嚴として泸取し、 MeOE-ェ 一テ よ]?再沈嚴した。 収量 5.8 f ( 89«8 ）。 mp.136— 13了 ， « 6.6C( c = 1.0 , D M F ) , Ef1 0.58
D
元素分折 C 66 H99 OJ^^J^ S3 として
計算値： C, 55,56; Η,Β.99; ，12.了 6; S，6.了 4 実験値： c，55.34; H，7.07; IT, 12.50; S,6.59
( XiV ) Z-L73 (Mtr) -Ar ( Pme )一 1ァ s ( M七 r ) -Ar (Pme)-Ser- ΙίΗΙΓΗ - Boc の製造 Z— Arg(Piae)—:Lys(lii;r)—Arg(i)iiie)—Ser-irHirH—Boc 3, Q を lieOH 1 50"にとかし、 接敏^%したのち、 ： DM!" 60"に 転溶した。 これに、 Z-LysCMtr)-OH.DCHA !, 54 よ]?調製した Z— I rs(l£七 r)一 OH， HOB七 0.3 1 加えて永冷し、 D C C 0, 57 を加えて 1 5時間かきまぜた。 析出した D c uを^別し、澳縮後、 AcOEt にとかし、 AcOEt層を 4 ITaHCO,水， 1 0 クェン駿水で 洗浄し、 ： ffa2S0 で乾燥した。 ¾縮後、 エ-テ を加えて結晶として泸 取レ、 AcOE よ]?再結晶した。 収量 2.70 ^ C 72.8 ^ )
mp. 1 23— 1 25 :， 〔な 6 - 5.9° ( c = 1.1 , D li F ) , Ef1 0.57 元素分析 C82¾30202iri5 S4 として
計算値： 55.73; H,7.02; 11.89; S，了.26 実験値： C，55.89; Η,7.30; ίΓ，11.72; s，了.08
(XV)Bo c-Gln-Met-Leu-Phe-Ar ( me ) -G-lj-Arg ( Pme )一 Arg ( Pme ) -Ala-Ser-Gln-OBut の製造 Z-Arg(Pme )-Arg(Pme )-Ala-Ser-Q-ln-QBut 1. 0 を え MeOH 1 0 0 にとかし、接触還元したのち D M i1 20 に転溶し 7to これに、 Boc-Gln- et-Leu-Plie-Arg(Pme)-Gl7-0H 0.85 , HOB 1 35^を加えて氷冷し、 D c C 2 1 029を加え て 20時間かきまぜた。 析出した！) C ϋを庐別し、瀵縮後、 MeOHを 加えて沈殿として泸取した。 収量 1, 50 （ 87· 4 % )。
mp. 2 1 & - 2 1 了 （分解） ， 〔な 6 - 1 1.8° ( c - 1.0 , D li F ) Λ Ef 1 0.43
元素分折 Cg8 i54 023if22S4 として
計算値： c, 55.09; H,了.27; ir, 14.42; ε,δ,ΟΟ
実験値： C, 54.81 ; H,7.33; IT, 14.23; s.5.79
( X Vi ) H— Iiy s— A;rg— s— Arg— S e r— Gin— Me七一 e ti— Pii e— Ar g— Gly-Arg-Arg-Ala-Ser-Gln-OHの製造
Boc— Gin— Me t— Leu-— he— Ar C me ) -Gly-Ar ( Pme )— Arg (Pme)-Ala-Ser-Gln-OBut ]. Q 9 Κ Έ A 1 0 を加え、 室 温で 50分間振 混ぜたのち、 瀵縮し、 エ-テ を加えて沈谡として泸 取し、 乾燥した。
—方、 -L s ( tr)-Arg(Pme )-Ljs (Mtr)-Arg(Pme)-Ser 一 iTHITH - Boc 0.83 ^に T F A 1 0 «Jを加えて室温で 1 0分間振 混ぜたのち、 濃縮し、 エ -テ を加えて沈澱として泸取し乾燥した。 これを: D M F 1 0»にとかし、 ドライアイス -アセ トンで冷却後、
6.2 if HCi /AoOEt 0.2 3 ,亜硝駿 /(ソァミル（ 0.0 75 «f )を 加え、 - 25°~- 20 °Cで 20分間保った（ ヒ ドラジンテス ト ：陰性）。 これを再びドライアイス -アセ ト ンで冷却し、 T E A 0,25 Wを加え て中和した。 ァ ン成分を M F 40 *にとかし、 氷冷し τ E A Ο.ί 6 βを加えたのち、 先に調製したアジド溶液を加えて、 4 で 7
¾ きまぜた。反応液を、希静酸水にそそぎ、 析出したゲノレを炉取し、含水
CH3 ciTで洗净した。 i{¾ 1.40 （ 8 5 $ ) , 1 0.09。 この うち 400^を 0.1 5 M S A¾r^ T i1 A -チオア: =y -； u—メチ ス プィド（ 8 ： 1 ： 1 ) 60 Wにとかし、 室温で 2時間振]?まぜた のち、 AcOirH4 400^を加えて濃縮し、 エーテ を加えて沈 ¾とし て泸取し、乾燥した。 これを少量の 1 H AoOHにとかしセフアデック ス&ー 25のカラム（ 2x 1 2 Qos)に付した。 1 B" AcOH で溶 出し！ の分画を集めて凍結乾燥し、 つ でアンパーラ ィト IB A - 4 0 (靡謹）のカラムを通し、凍結乾燥した。 れを さらに： E S S:—！《s -41 0のカラム （ 2J 4 7.5 «+ 2.14x30 ί»)を用いる H P L Cで精製し、 目的翁を得た。 収量
〔 a - 45· 3 ( c = 0.7 , 0.1 K AcOH)
Ef ^ (cellulose) 0.20 '
アミノ酸分折： I rs 1 ,71, Arg 4.71 , Ser 1.69 , Gin 2.12, Gly .00, Ala 1.03, Met 0.32, Leu 1.30, PiLe 1.08 (平均回収率 77% )
参考例 2
キヤリヤー蛋白とホリペプチド複合体の合成
参考例 1 (XVI) で得たホ。リぺプチドとサイログ口プリ ン（以下 G ) との結合を、 ダットフレンドらの方法に準じて行るつた（サイエンス ，
1 44卷， 1 3 3 4頁， 1 9 S 4年）。 即ち、 当該ポリペプチド 2.5 ^ を T (J 3.75 Ψと混合し、 2 の 5 G miiのフォスフェートバッファー を加え、永水中でよく攮拌した。 これにカルポジィミド塩酸 30.4^ を蒸留水 200 < " に溶かしたものを 1滴ずつゆつく]?と加えた後、 3 時間氷水中で捷拌し がら反応させた 3 反応後、
Figure imgf000036_0001
行 *い、凍錶乾像を行なって蛋白複合体 47 Wを得た 0 抗体検出の めの E I A用抗原の鬭製
S I A用抗原の钃製は北川らの方法（ジャーナ 才ブ バイオケミ ストリー，第 79卷， 23 3頁， 1 976年）の方法に準じて行つ 。
(i) リペプチドへのマレイミド基の導入
参考例 1 (XVI)で得た リペプチド（ 3 50 naolee)を の
1 0 0透 IIフォスフェートパプファー pS &8に溶解し、 1ί一（ 4一力 ボキシシタ口へキ メチ )マレイミ ドの Η— tドロキ サク = ミドエスチ 5 S 5 9 ( L 75 Maolea )と 70 ^ gの If , If ージメ チ クロマミド港液に加え混合し、 30 tで 30分攪拌して反 iS後、セ フアデヅクス G— 25カラムで分圉を行 いマレイミ ド基の導入された リぺブチド分闺 1 85 n moles を得た。
(画） マレイ ミド基導入ポリペプチドと 9一 Dガラクト ダーゼとの糖合 参考例 3(»)で得たマレイミド基導入ボリペプチド 1 &5 naoles と 3—！）一ガラク トシダーゼ a3 naoles を混合し、 4わで 1 8時間反 応後、 4 1 5 naolee の ーメ； t 力ブトエタノー で反応を停止さ /J一 D—ガラクト ダーゼと裙合した リペプチドは、セファロ ース 6 B力ヲムで分國を行 い、以下の実験に使用した。
^m 4
E I A¾
参考例 2で得た蛋白複合体で免疫したマゥス A淸ぁるいはハイブリド 一マ上淸中の Λ体活性の検出は S I A法を用いて行 ¾つた（ィムノプア 一マコロジ一，第 1卷， 3頁 ， 1 978年）。す わち、 愈淸あるいは ハイブリ ドーマ上淸をパッファー A ( 20 a M !T»2fii»04， 100重 H 差換え ii*Cl, α ΐ* »*夏3, 1麓 M MgCl2, pS7-0 )で希釈し、 この
100 をと 、実擔《3で得たポ 9ぺブチド籌導体 1 00- とよ く S会し、 2411で24時瞰反¾；さ4^。反 »、 タサギ扰マタス IgQ を »合し セ β—ス 1 0 Oi を加えて 24 C , 4時 W反 させ ita反応後、セ -ースを 0ι5 *プィーン 20を含んだパププア一 Aで よく 滲し、 4ーメチレンぺ プェ 9 一 3— !）ーガ，ク ト ド 20 9 を 500 ¾ぇ、 37 tで 2時間反応後、 1 00扈 M ーボ ネートパププア一（ pH 1 as )を 3 ««0えて反 iSを停止し、上清中の 光強度を 計 Τ«定した (ェキサイ f一 3ン 365 η蘿 ，エミプ ^3ン 450η驚 ) ο
参考例 5
免疫
7〜8通 A L B/C雌マウス 6S各 に抗原として 例 2で 得 S白複^の、 タンパク量として、 40 ^ をプロインドコンプ 9 ート アジュパントとよく混合し、皮下に接種した（初回免疫）。初回 免疫の 2通後、 鬨置の抗原をフ口インドインコンプリー ト ァ ^ュバン トとよく S合し、皮下に接種した（二次免疫）。 さらに、その 2通後、 二次免疫と同様の方法で三次免 ¾を行 った。 三次免 ¾の 6日後、マウ スから愈液を部分振取し、 清中の扰体儀を参考^ 記載の S I A法で »定し 。 このうち、高い抗体俩を示した Γ一 2マウス *C对して 120 β,の拭屎を as wの食壎水に溶解さ ものを黪脈内に接種すること によ 1>最終免疫を行 つ 。各マタスの扰体優は第 3表 示し Λ:·
差換え 第 3 表
免疫したマゥスの抗ぺブチド抗体価
Figure imgf000039_0001
Figure imgf000039_0002
1 ) 血清の希釈は 1 Z 1 000
2) 血清の希釈は！ /6300
3) 血清の希釈は 1 Ζ7800
4) 一 ：検出不可能
5) Ηϋ:検索^ *
ΒΧτ ： (結合し 酵素活性 Ζ加えた全酵素活性） X 1 00 参考例 6
細胞融合
参考例 5記載の方法で免疫を行 い、 最終免疫の 3日後の^ 2マウス から脾藏を摘出し、 ステンレスメッシュで圧迫，泸過し、 イ ーグ ズ · ミニマム ·ェッセンシャ メディゥム （ Μ Ε Μ )に浮遊させ、 脬藏細胞 浮遊液を得た。 钿跑融合に用いる細胞として、 ： BALBZCマウス由来 ミエローマ細胞 P 3 - 63 . Ag 8. ΐ (P3u1 ) を用 た（力レ ント ト ピックス イン マイクロバイオロジー アンド ィム
差換え - ,第 8 1巻， 1頁， 1 978年）。 細胞齄合は、 原法（ネイチヤー ， 25 δ'卷， 435頁， 1 975年）に準じて行なった。 即ち、陴藏細胞 および: Ρ 3ひ 1をそれぞれ血清を含有しる ME Mで 3度洗浄し、胖¾ 飆胞と]? 3ひ〗数の比率を 5 ： 1に ¾るよう混合して、 800回 で 1 5分簡遠心を行 ¾つて細胞を沈殿させた 上清を充分に除去した後、 沈殿を整くほぐし、 45%ポリエチレングリコ - （ P E G ) 6Q00_ (コッホライト钍製）を 0.3 W加え、 37で温水槽中で 7分間静置して 融合を行るつた。融合後細胞に敏 2*の割合で] ί Ε Μを添加し、合計 1 2 Wの ME Mを加えた後 600回転 1 5分間遠心して-上清を除去し 7¾« この細胞沈稷 を ί 0 牛胎¾血清を含有する Ε Ρ Μ Ι 1 640メディ ゥム （ S PM I 1 640— I fl F C S )に P 3ひ 1が 1 W当]? 2 X 1(3 個にるるよう浮遊し、 24穴マ チデイシュ（ リ ンブロ社製）に ίゥェ ル1 ずつ！ 44ゥエルに播種した。 *種後、細胞を 37 で 5 %m ガスフラン器中培養した。 24時間後、 ： E A T ( ヒポキサンチン 1 X 1 0一4 M ,ァミノプテリ ン 4 x 1 0'7 M ，チミジン 1.6 x l 5"5 M) を含んだ P B M I 1 640 - 1 0 F C S培地（ H A T培地）を 1ゥェ 当] M Wずつ添加することによ])、 H A T選択培養を開始した。 H A T 選択培養は、培養開始 3 , 5 , 7日後に旧液を 1 a捨てたあと、 ί の H A Τ培地を添加することによ 雜続した。 ハイブリ ド-マの増殖は、 細跑融合後〗 0 ~ 1 4日で認められ、培養液が黄変したとき（約 1 X
！ 06 Ζ ） 、上清を採取し、 Ε I Α法で、 抗体の有無を検索した。 このようにして、 ハイプリドーマの増殖が認められた 1 41ゥエ の上 清を調べたところ、 2ゥェ （ 7* 2- 1 r 2 - 1 00 )に強 抗体 活性， 2ゥェ （ r 2 - 62 , r 2 - 70 )に弱 活性を認めた 3 参考例 7
差換え ク T3—=ング
抗体活性が陽铨を示した 3ゥェ （ァ 2 - 1 1 ， 62 , 1 00 )の各 ハイプリドーマを、限界希釈法によってク - -ングを行 つた。 即ち ハイブリドーマが 2個 に るよう Β !ΡΜΙ 1 640 - 20 :F C Sに 浮遊させ、 96穴マイク プレート （ヌンク社製）に 1ゥェ 当 0.t
分注した。 分注する際、 ブイ-ダ—細胞と'して B ALB/Cマウ スの胸腺細胞をゥェ 当 5 X 1 05 個に るよう加えた。 このように して、約 2週間後には細胞の増殖が認められるようにな 、上清を採取 して、抗体の有無を参考例 4記載の E I A法で調べた。その結果、 T 2 - 1 1では 1 3クローン中 8クロ -ン， r 2一 62では 54クローン中 3クローン ， 7*2 - 1 00では 47ク P -ン中 5ク -ンに抗体活拴を 認めた。
参考例 8
モノクロ ナ 抗体産生ハイブリ ド -マの腹水化
I F N -ァに対して結合能を示す抗体を産生する 7· 2 - 1 1 . 1クロ
--ン 細胞 1 X 10S 個を、 あらかじめ 0.5 Wのミ.ネラルオイ を腹腔内 に投与して いた B A LBZCマウスの腹腔内に接種することによ])腹
水化を行った。 ハイブリ ド—マを腹腔に投与して 1 0日後、 腹水を採取
して抗体価を E I A法で測定したところ、 〗 07 倍希釈まで抗体活拴を
示した。 ¾お、 当該クロ-ン細胞の培養上清中の抗体活性は、 1 04倍
希釈まで認められて るが、 腹水化することによ]?約 1 000倍程度抗
体活性が上昇し 。
0MPI 差換え WIP0
、 WAT10 参考例 9
モノク 一ナ！抗详の精製
参考例.8で得られた腹水 4 Wを出発お料として、 ステーリンら（ジャ ーナ〃 才ブ バイオ ジカ^ケミストリー ， 25 6巻， 3了 5 G頁， 1 9 8 ί年）の方法に準じてモノクロ-ナ A^t佯を缄 した。まず腹水 からフィプリン様^質を^するため 0 , 000回転 1 5分閬遠心し た後、 リン酸谖衝液-: ¾¾水（ P B S ： 8· ί m l£-^aH2P04 , 1.5mJi ΚΗ2Ρ04 2.7Βΐ2ί EG1, 137mM ffaCl, pH7 ·2)で 280 n mの 紫 都扱収 C A 280 ) が〗 2~ t を示す濃度に希釈した。
サンブ に飽和硫酸アン 二ゥム溶液を 47 の濩度に ¾るように加え、
4てで攪拌しながら S 0分閬塩析を行 ¾ 、その後遠心（ 1 (3，0 G 0回 転， 1 5分間）を行 ¾つて沈殿 を得た。 沈藏物を 50 mM liaCl含有
20 mMトリス緩 液（ H 7.9 )に溶遊し、 同溶液 2 に対して透 析を行 ¾つた。 2時間後、 2 の新しい同じ透折液に換 、 さらに 1 5 時間透析を行るつた。 透析後、 沈豭を除去するため 1 (3 ， （3 0 0回転
1 5分間遠心を行 、上清を A280 の値が 20 ~ 30の瀵度に る ように調整し 。 とのサンプノレを充分量の 50 m 2£ - iTaCl含有トリス 緩 ¾^液で)リ賈化した の； D E AEセノレ口 -スカラム （ ワッ トマン
D 50)にかけ、 5 O mM aCl含有トリス緩衝溶液を用 て！.5 分の流出速度で分画を行るつた。 この条件下では、 抗体活拴は主として 素通]?分画に認められた。
差換; L 参考例 10
参考例 9の要領で精製された素通 分画のモノクロ—ナル抗体 2 5 W ( 6 5.3 ¾ ）を 0.1 M NaHC03 , pH 8.3 溶液に対してー晚透析を行つ た。 一方、 アブイゲル一 1 0 (バイオ ' ラ ド社） 2 5 をグラス フイノレ ターを用いて充分水洗を行った後、 0.1 M NaHCO3 p H 8.3溶液に浮 遊させ前記抗体とを混合し、 4 tで 4時間、 ゆつく J攪拌し ¾がら反応 させた。 その後、 4 'Cでー晚放置した後、 グラス フイノレターを用いて 0.1 M NaHC03 pH 8.3溶液でよく洗浄した。 反応させたゲノレに 0.1 Mエタノールァ ミ ン ， 0.1 5 M NaClを含む溶液（ p H' 8· 0 )を 2 5 « 加え、 4 °C ， 1時間振とう し、 残存するかも知れない未反応の活性基を ブロックした。 その後ゲノレを P B Sでよく洗浄し、 0.1 % NaN3を含む に懸濁し、 4 tで保存した。 加えた抗体量と回収された泸 液中の抗体量から、 ゲル 当 D 2.3 5^の抗体が結合していることが 判明した。 この様にして得た反応物をカラ ムに充め、 抗体力ラムとして 使用した。 - 産業上の利用可能性
本発明によ 、 実質的に純粋るヒ ト免疫ィンタ ーフェ口ン蛋白質を製 造することができ、 該蛋白質は抗ウィルス剤ゃ抗腫瘍剤るどとして有用 てある。
差換え

Claims

請 求 の 範 囲
l. l o7
Figure imgf000044_0001
以上の比活性を有する実質的に純粋 ¾ヒト免疫ィンタ
一フエロ ン蛋白質。
2. 凍結乾燥品の状態にある請求の範囲第 1項記載の蛋白質。
3. ヒト免疫ィンターフヱロ ンをコ—ドする塩基配列を有する D N Aを 含有する形質転換体を培養し、培養物中にヒト免疫ィンターフェロ ン 蛋白質を生成蓄積せしめ、 菌体を破壊し、得られるヒ ト免疫ィ ンタ— フエ口ン含有液を抗ヒト免疫ィンタ一フエロ ンモノクローナル抗体を 用いて精製することを特徴とする請求の範囲第 1項または第 2項記載 の蛋白質の製造法。
4. ヒ ト免疫ィ ンターフェロ ンをコ—ドする塩基配列が一般式
(50 TGT TAC TGC CAG GAC CCA TAT GTA AAA GAA
GCA GAA AAC CTT AAG AAA TAT TTT A AT GCA GGT
CAT TCA GAT GTA GCG GAT AAT GGA ACT CTT TTC TTA GGC AT TTG AAG AAT TGG AAA GAG GAG AGT
GAC AGA AAA ATA ATG CAG AGC CAA ATT GTC TCG
TTT TAC TTC AAA CTT TTT AAA AAC T T AAA GAT
GAC CAG AGC ATC CAA AAG AGT G G GAG ACC ATC
AAG GAA GAC ATG AAT GTC AAG TTT TTC AAT AGC AAC AAA AAG AAA CGA GAT GAG TTC GAA AAG GTG
AC AAT TAT TCG GTA ACT GAC TTG AAT GTC CAA
CGC AAA GCA ATA CAT GAA CTC ATC CAA GTG ATG
GC GAA CTG TCG CCA GGA GCT AAA AGA GGG AAG
CGA AAA AGG AGT CAG ATG CTG TTT CGA GGT CGA
, AGA GCA TCC CAG -X ( 3
ΟΜΡΓ ！ 〔式中、 Xは T A A , T G Aまたは T A Gを示す〕で表わされる塩基 配列である請求の範囲第 3項記載の蛋'白質の製造法。
OMPI
差換え W1PO
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