JPH04112791A - トリプスタチン構造遺伝子及びその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 「産業上の利用分野」 本発明はトリプスタチン構造遺伝子及びその用途に関す
る。更に詳細には、トリプスタチンの組換えＤＮＡ技術
による製造に用いるためのトリプスタチン構造遺伝子、
該構造遺伝子を含有する発現ベクター、該発現ベクター
で形質転換された大Ｉ！薗または枯草菌、及び該形質転
換体を用いたトリプスタチンの製造法に関する。

［従来の技術］ トリプスタチンはＫｕｎｉｔｚ型のトリプシンインヒビ
ターの１つであり、ラット肥満細胞より単離され６１個
のアミノ酸からなる単純蛋白質であることが明らかにさ
れている［にｉｄｏ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉ。

Ｃｈｅｗ、２６３．１８１０４　（１９８８）：木戸ら
、細胞工学、７．８５１　（１９８８）：木ｐら、代謝
、Ｖｏｌ、２５、臨時増刊号゛代謝病ハイライト″　１
８７（１９８８）］。

トリプスタチンの生理学的作用としては、ＩＣＩＥ関与
のアレルギー性炎症の病像形成に深く関与していること
が示唆されており［木戸ら、細胞工学、Ｌ、８５１　（
１９８８）：にｉｄｏ　ｅｔ　ａＢｉｏｃｈｅｍ、Ｉｎ
ｔ、、　１０．８６３（１９８５）］　、また血液凝固
系においてプロトロンビンからα−トＯンビンへの変換
を触媒する活性型血液凝固第Ｘ因子の作用を阻止するこ
とが知られている［にｉｄ。

ｅｔ　　ａｌ、、　　Ｂ１０Ｃｈｅ１．　　Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ、　　Ｒｅｄ、　　Ｃ０１０１ｕｎ、、　　　ｉ　
　３２．６１３　（１９８５）；にｉｄｏ　ｅｔ　ａｔ
、、　ＡｒＣｈＢｉｏｃｈｅｉ、　Ｂｉｏｏｈｙｓ、、
　　２３９．４３６　（１９８５）］　。

最近において、トリプスタチンは後天性免疫不全症（八
［ＤＳ）の病原ウィルスであるヒト免疫不全ウィルス（
ＨＩＶ）の感染を強く抑制する作用を有することが明ら
かにされている（特願平２１１２２）。

このようにトリプスタチンは各種の生理学的作用を有す
ることが見出されており、医薬品としての開発がＷＡ持
されている。しかしながら、トリプスタチンのＩ！Ｊ造
法としては生体から串間抽出する方法が知られているの
みであり、医薬品として供給するに十分なけのトリプス
タチンを製造する工業的に有利な方法は未だ開発されて
いない。

［本発明が解決しようとする課題］ しかして本発明の目的は、トリプスタチンの大拳生産を
可能にする組換えＤＮＡ技術による製造法に用いるため
のトリプスタチン構造遺伝子を提供することにある。

本発明の他の目的は、トリプスタチン構造遺伝子を含有
する発現ベクター及び該発現ベクターで形質転換された
大腸菌または枯草菌を提供することにある。

史に本発明の目的は、該大腸菌または枯草菌を用いたト
リブスタヂンの製造法を提供することにある。

［１題を解決するための手段１ 本発明者らは、トリプスタチンの組換えＤＮＡ技術によ
る製造法を開発することを目的として研究を行い、トリ
プスタチンの高レベル発現を０１能にするトリプスタチ
ン構造遺伝子の分子設計に成功した。そしてこのトリプ
スタチン構造遺伝子と、黄色ブドウ球菌由来のスタフィ
ロキナーゼ遺伝子もしくは大腸菌由来のアルカリ性ボス
フ７ターゼ遺伝子のシグナル・ペプチドをコードするＤ
ＮＡ配列とを組合わせた発現ベクターを得、該発現ベク
ターで大腸菌または枯草菌を形質転換し、得られる形質
転換体を培養することによって、トリプスタチンをその
まま形態であるいは他の蛋白質との融合蛋白質の形態で
菌体外またはべりプラズム中に大量に分泌させ、目的と
するトリプスタチンを大量に製造することに成功し本発
明を完成した。

本発明は、 以下に示すＤＮＡ塩基配列を有するトリプスタチンＷ造
遺伝子 （ＤはＡ、Ｔ又はＧ、ＹはＴ又はＣ，ＮはＡｌＴ、Ｇ又
はＣを示す）： 黄色ブドウ球菌由来のスタフィロキナーゼ遺伝子中のも
しくは大腸菌由来のアルカリ性ホスファターゼ遺伝子中
のシグナル・ペプチドをコードするＤＮＡ配列、及び上
記のトリプスタチン構造遺伝子を含有するトリプスタチ
ン発用ベクター：上記発坦ベクターで形質転換された大
腸菌または枯草菌； 及び、形質転換された大腸菌または枯草菌を培養し、ト
リプスタチンをそのままの形態でまたは他の蛋白質との
融合蛋白質として菌体外またはべりブラズム中に介接さ
せ、次いで回収するトリプスタチンの製造法である。

本発明のトリプスタチン構造遺伝子は上記の１文字表記
で示されたＤＮＡ塩基配列を有するものである。尚、そ
の下段には６１個のアミノ酸からなるトリプスタチンの
アミノ酸配列が示されている。上記のＯＮＡＩｍ塞配列
を有するトリプスタチン構造遺伝子は、遺伝子の効率良
い発現を阻害しつる二次構造をとる可能性がなく、トリ
プスタチンの大腸菌または枯草菌での高レベル発現を可
能にする。なかでも特に、以下に示すＤＮＡ塩基配列を
有するトリプスタチン構造遺伝子が上記の点で優れてい
る。

ＡＴＣＧＣＴ　ＧＣＡ　ＴＧＴ　ＡＡＣＣＴＧ　ＣＣＧ
　ＡＴＣＧＴＡ　ＣＡＧ　ＧＧＴ　Ｃ美ＴＧＣ部ＴＧ釘
ｌｉｅ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｐ
ｒｏ　ｌｉｅ　Ｍａｌ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｃｙ
ｓ　Ａｒｇ　ＡｌａＰｈｅ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　
Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇ
ｌｎ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　１ｉｅＣＡＧ　ＴＴＣ
ＡＴＣＴＡＣＧＧＴ　ＧＧＴ　ＴＧＴ　ＡＡＡ　ＧＧＴ
　ＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＡ　ＴｒＣＴＡＣＧｉｎ　Ｐ
ｈｅ　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｌｙ
ｓ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ
　Ｔｙｒトリプスタチン構造遺伝子は化学的に合成する
ことができる。即ち、構造遺伝子を例えば４５程度のＤ
ＮＡ塩基長のブロックに分け、各ブロックに対応する１
本鎖ＤＮＡをＤＮＡ合成機により合成する。次いで合成
した１本鎖ＤＮＡを、互いに隣接した位置にある１本鎖
ＤＮＡ及び相補性を有する１本１１ＤＮＡからなるグル
ープに分け、各グループについて１本鎖ＤＮＡの５′末
端の燐酸化、アニーリング、ライゲージ３ンを行ない、
２本鎖ＤＮＡの部分配列を得る。これらの部分配列をラ
イゲーションに付すことによって目的とＪるトリプスタ
チン構造遺伝子を得ることができる。トリプスタチン構
造遺伝子の合成の際には、該構造遺伝子を用いて発現ベ
クターを構築するのに利用される適当な制限酵素部位、
スタフィロキナーゼなどのセの蛋白質との融合型白質と
してトリプスタチンを発現させる発現ベクターを構築す
る場合に利用される該他の蛋白質をコードする遺伝子に
連結するためのリンカ−ＤＮＡ、ストップコドン、ある
いは転写終結部位などをトリプスタチン構造遺伝子の５
′もしくは３′末端側に設・ブることもできる。

本発明では、トリプスタチン構造遺伝子とともに、黄色
ブドウ球菌由来のスタフィロキナーゼ遺伝子もしくは大
腸菌由来のアルカリ性ホスファターゼ遺伝子のシグナル
・ペプチドを］−ドするＤＮＡ配列を用いる。シグナル
・ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含有する発現ベク
ターで形質転換された大腸菌または枯草菌を培養するこ
とにより、トリプスタチンをそのままの形態であるいは
他の蛋白質との融合蛋白質の形態で菌体外またはペリブ
ラズム中に介接させることができる。

黄色ブドウ球菌由来のスタフイロキナ〜ぜ遺伝子は、ス
タフィロキナーゼ生産能を有する５ｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓの溶原ファージであッテ溶原変
換能を有するＰφ２、Ｐφ１、Ｔφ−４２Ｄ、Ｐφ−４
０ｂなどのファージのＤＮＡから得ることができる［Ｋ
ｏｎｄｏ、　１．’　ａｎｄ　Ｆｕｊｉｓｅ、、に。

Ｉｎｆｅｃｔ、　　ｌｍ５ｕｎ、、　　１８．２６６−
２７２　　（１９７７）］。スタフィロキナーゼ遺伝イ
はそのＤＮＡＪ１基配列が既に決定されており［５ａｋ
ｏ　ｅｔ　ａｌＮｕｃ　ｌ、＾ｃｉｄｓＲｅｓ、、　１
１．７６７９　（１９８３）１、その中に含まれるシグ
ナル・ペプチドをコードするＤＮＡ配列は既知である。

従ってトリプスタチン構造遺伝子の場合と同様にして化
学的に合成することができ、また適当な制限酵素を用い
てシグナル・ペプチドを］−ドするＤＮＡ配列を切り出
すこともできる。

大腸菌、例えばに１２株由来のアルカリ性ホスファター
ゼ遺伝子のＤＮＡ塩基配列も既に決定されており［に１
ｋｕｃｈｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｈｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ
　Ｒｅｓ、。

９．５６７１　（１９８１）］、従ってそのシグナル・
ペプチドをコードする［）ＮＡ配列も同様に化学的に合
成することかできる。またアルカリ性ホスファターゼ遺
伝子を含む既知のプラスミドｐＹＫ３３１（特開昭６０
−９１９８４）　、などから切り出して調製することも
できる。

シグナル・ペプチドをコードするＤＮＡ配ｕＪの直ぐ下
流にトリプスタチン構造遺伝ｆを連結してもよく、ある
いはリンカ−ＤＮＡ、例えばメチオニンを］−ドする〕
トンを介して連結してもよい。

トリプスタチンを他の蛋白質との融合蛋白質として発現
させる場合には、他の蛋白質をコードするＤＮＡ配列を
シグナル・ペプチドをコードするＤＮＡ配列の直ぐＦ流
に連結し、次いでその下流にリンカ−ＤＮＡを介してリ
ーディングフレームを合わせてトリプスタチン構造遺伝
子を連結してもよい。この場合のリンカ−ＤＮＡとして
はメチオニンをコードするコドン、あるいはその３′末
端側にメチオニンをコードするコドンを含むＤＮＡ配列
などがあり、例えば次のｔ）ＮＡ配列が挙げられる。

ＡＴＧ　　ＡＴＣＡＴＧ　　ＡＴＣＣＧＡＧＣＴＡＴＧ
丁ＡＣ１丁ＡＧＴＡＣ，ＴＡＧＧＣＴＣＧＡＴＡＣ。

他の蛋白質をコードするＤＮＡ配列としては、例えばス
タフィロキナーゼ構造遺伝子の５′末端側のＤＮＡ部分
配列などが挙げられる。

シグナル・ペプチドをコードするＤＮＡ配列及びトリプ
スタチン構造遺伝子を含有する発現ベクター中には、更
に発現に必要なプロモーター及びシャイン・ダルガーノ
配列を含有させる。プロモーターとしては、宿主＠胞中
にて作動し得るものであればいずれでもよいが、宿主細
胞として大腸菌を用いる場合には、例えばｔａｃプロモ
ーターｔｒｐプロモーター、ｌ：）　ｈ　ＯＡ　’７０
モーター１ａＣブＯモーターあるいはλファージ由来ｐ
Ｌプロモーターなどが例示される。枯草菌を用いる場合
には、例えばスタフィロキナーゼ遺伝子中のプロモータ
ー（ＳＡＫプロモーター）、あるいはα−アミラーゼ、
中性プロテアーゼ、アルカリ性ブＯテ７−ゼなどの遺伝
子中のプロモーターなどが例示される。シャイン・ダル
ガーノ配列も特に制限されず、公知の任意のシャイン・
ダルガーノ配列を用いることができ、例えばスタフィロ
キナーゼ遺伝子中のシャイン・ダルガーノ配列、公知の
プラスミドｐＫ　Ｋ　２２３−３　［Ｂｒｏｓｉｕｓ　
ｅｔａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｈａ目、＾ｃａｄ、　Ｓｃ
ｉ、、　ｕ、　ｓ、＾、影ユ。

６９２９　（１９８４）］由来のシャイン・ダルガーノ
配列などを例示することができる。シャイン・ダルガー
ノ配列はシグナル・ペプチドをコードするＤＮＡ配列の
上流側に連結し、更にその上流側にプロモーターを連結
する。

各種ＤＮＡ配列の連結は適当な制限酵素切断部位を利用
してＴ４ＤＮＡリガーゼにより行うことができる。ある
いはＤＮＡ配列の末端をＤＮＡポリメラーゼとデオキシ
リボヌクレオチド−３−リン酸によって平滑化した後、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連結することができる。上記
した各種ＤＮＡ配列をトリプスタチンが発現されるよう
にして含有する発現ベクターを構築するには、宿主細胞
として用いる大腸菌または枯草菌において自己複製可能
なプラスミドベクターを利用して行う。

大軛菌用のプラスミドベクターとしては、例えばｐＫＫ
２２３−３、ｐ工ＴＱ　１３　［５ｔａｒｋ、　Ｇｅｎ
ｅ５１．２５５　（１９８７）Ｊ、ＤＰＬ−Ｌａｎ＋ｂ
ｄａ〈ファルマシア社製）などが用いられる。枯草菌用
のプラスミドベクターとしては、例えばｐＵＢｌｌｏ［
にｅｇｇｉｎｓ、　　に　　Ｍ、、　　　Ｌｏｖｅｔｔ
　　　Ｐ、　　Ｓ＆　Ｄｕｖａｌｌ　　Ｅ、　Ｊ、　　
Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ
Ａ７５．１４２３　（１９７８）］、ＤＣ１９４［Ｂｙ
ｅｏｎ、　Ｉｔ４．、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、
　１５８　、５４３５５０　（１９８４）１などが用い
られる。

かくして構築されるトリプスタチン発現ベクターを大腸
菌または枯草菌に導入して形質転換体を得る方法として
は、塩化カルシウム法［■Ｈａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａ
ｌ、、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　ｐ、
　２５　Ｑ（１９８２）１、コンピテントセル法しＪＳ
ｐｉｚｉｚｅｎ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ口、　Ａｃａｄ、
　Ｓｃｉ、　ＵＳ＾、４４゜１０７２　（１９５８）］
などが採用される。

形質転換体を適当な培地中で適当な培養条件下で培養す
ることにより、目的とするトリプスタチンが発現され、
そのままの形態であるいは他の蛋白質との融合蛋白質の
形態で、菌体外あるいはペリブラズム中にトリプスタチ
ンが分泌される。

プロモーターとして例えばｌａｃプロモーター又はｔａ
ｃプロモーターを用いた場合は形質転換された大腸菌の
対数増殖期に適当な濃度の遺伝子発現誘発剤、例えば０
．２１８のイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（
ＩＰＴＧ）を培地に添加し史に数時間から十数時間培養
を継続することにより、トリプスタチンまたはその融合
蛋白質を菌体外またはべりブラズム中に分泌させること
が出来る。菌体外に分泌されたトリプスタチンまたはそ
の融合蛋白質は培地中より回収することができる。ペリ
ブラズム中に分泌されたトリプスタチンまたはその融合
蛋白質は、例えば、菌体をオスモティックショック処理
に付して回収゛するか、あるいは菌体を超音波処理する
ことによって得られる膜画分中から回収することができ
る。

枯草菌を用いた場合には、適当な培地、例えばしＢ培地
で７〜２４時間、好ましくは１４時間３７℃で振盪培養
を継続することにより、トリＩスクチンまたはその融合
蛋白質が培地中に産生きれる。

菌体外またはべりブラズム中に分泌された蛋白質を回収
し、尿素などの変性剤及びジチオスレイトールなどの還
元剤処理を行い、ゲル濾過カラムクロントゲラフイー、
逆相クロマトグラフィー等の操作により更に精製するこ
とが出来る。

トリプスタチンを融合蛋白質として得た場合には、ブロ
ムシアン処理により、トリプスタチンのＮ東側の直ぐ上
流にあるリンカ−ＤＮＡに由来するメチオニン部位で切
断することができ、かくして目的とするトリプスタチン
を得ることができる。

［発明の効果］ 以上に詳述した所から明らかなように、本発明によれば
、遺伝子の効率良い発現を阻害しつる二次構造をとる可
能性がなく、従って高レベル発現を可能にするトリプス
タチン構造遺伝子が提供される。

このトリプスタチン構造遺伝子と、黄色ブドウ球菌由来
のスタフィロキナーゼ遺伝子もしくは大腸菌由来のアル
カリ性ホスファターゼ遺伝ｆ中のシグナル・ペプチドを
コードするＤＮＡ配列とを組合わせたトリブスタヂン発
現ベクターを構築し。

この発現ベクターで大腸菌または枯草菌を形質転換し、
得られる形質転換体を培養することにより、トリプスタ
チンをそのまま形態であるいは他の蛋白質との融合蛋白
質の形態で菌体外またはべりプラズム中に分泌させるこ
とが可能になる。これによって、大量生産が可能なトリ
プスタチンの工業的に有利な製造法が達成される。

［実施例］ 以下に本発明を実施例により更に詳細に説明する。

実施例 （１）トリプスタチン構造遺伝子を構築するためのＤＮ
Ａの合成 トリプスタチンの一次構造から、トリプスタチンをコー
ドするＤＮＡ塩基配列（第１図）を設定した。その際各
アミノ酸に対応する〕トンは宿主として用いる微生物（
大１！薗）中で最も好んで使用されるもの［１ｋｅｍｕ
ｒａ、　Ｊ　　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　１５８゜５７
３　（１９８２）］を選択した。実際に合成したＤＮＡ
は基本的にトリプスタチンを］−卜する配列、翻訳終止
］トン＜　ＦＡＧ）　、Ｈｉ　ｎｃｊｌ切断部位、転写
終止領域などよりなる構造を持っている。即ち、第１図
に示したＤＮＡ塩基配列を元にして、以下に示す３つの
タイプのＤＮＡをデザインし、合成した。

（ａ）トリプスタチンをコードする塩基配ダ１を有し、
ベクターのＨｉ　ｎｄｌｌｌ−Ｂａｍ）−ＩＩ部位に挿
入できるようにしたもの［６Ｆタイプ；第２図（その１
）１； （ｂ）トリプスタチンのＮ末端側にＭｅｔを挿入したペ
プチドに対応する塩基配列を有し、ベクターのＨｉ　ｎ
ｄｌｌｌ−ＢａｍＨＩ部位に挿入できるようにしたちの
［１Ａタイプ；第２図（その２）］：（Ｃ）トリプスタ
チンのＮ末端側にＭｅｔを挿入したペプチドに対応する
塩基配列を有し、ベクターの３μｍＨｉ部位に挿入でき
るようにしたものＥＩＧタイプ；第２図（その３）］。

これらのＤＮＡを約４６塩基長ずつに分けて、第３図に
示した１４種類の一本鎖ＤＮＡをＤＮＡ合成ｖｓ（へＢ
１社製モデル３８０１−３　＞により合成し、ＯＰＣカ
ラム（ＡＳ　１社製〉で精製した。

（２）　　ＤＮＡの５′末端のｔｅ化とアニーリング１
　！ｌ！　Ｌ　ｔｃ−本１１ＤＮＡ各１　μＳＪｆ［Ｌ
ａＬ、第４図及び以下に示した方法で５′末端を燐酸化
し、アニーリング（塩基対の形成）を行ったく第４図の
■及び■）。

方　　　沫 試　　薬 ＴＲＹＰ−２＋ＴＲＹＰ−Ｂ＋ＴＲＹＰ−Ｃあるいは Ｔ　ＲＹ　Ｐ　−３＋　Ｔ　ＲＹ　Ｐ　−４＋Ｔ　ＲＹ
　Ｐ　−Ｄト１０×反応緩衝液（０，５Ｍ　　丁ｒｉｓ
。

ＥｌＣｌ　　（ｐＨ８＞、ｏ、　　１Ｍ　　　ＭｇＣ！
　　、５０１８ＤＴＴ）　　　　　　　　　　　　　　
　２μｌ＋１０ｓＨＡＴＰ　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　２　μ　ｌ＋Ｔ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼ（１０ユニット／μｍ）　　　　　　　　　
　　　　　２μｌ十Ｈ２０（全量を２０μｌにする） 反応スケジュール ３７℃　２Ｍ間 ＋ミネラルオイル１滴： １００℃　５分： 室ａｉｉｔｌｌ置（アニーリング）１時間；６２℃（２
／　（Ｂ＋Ｃ））あるいは５０℃（（３＋４＞／Ｄ）　
　５分次いで急冷。

尚、「／」はＤ′ＮＡ断片同士がアニールしていること
をボす。以下同様である。

試　　薬 ＴＲＹＰ−Ｅ＋ＴＲＹＰ−Ｅ：　２、ＴＲＹＰ−１、Ｔ
ＲＹＰ−６ ＋１０Ｘ反応１１１ｉ液（０，５Ｍ　　Ｔｒｉｓ。

ＨＣオ（ＤＨ８）　、０．１Ｍ　　ＭＱＣＪ　　、５０
＋ｅＨＤＴＴ）　　　　　　　　２μｌ ＋１０５Ｍ　　　ＡＴＰ　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　２　　μ　ｌ＋Ｔ４ポリメクレオチド
キナーぜ（１０ユニツト７′″１　）　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　２μｌ十Ｈ２０（全量を２
０μｌにする） 反応スケジュール ３７℃２時間： １００℃　２分； ＋ＴＲＹＰ−，５（Ｅ＋Ｅ２）あるいは＋１ＲＹＰＧ（
１）あるいは＋ＴＲＹＰ−Ａ＜１＞あるいは＋ＴＲＹＰ
−Ｆ　（６） ＋ミネラルオイル１１； １００℃　５分： 室温放置（７二−リング）　１時間： ４０℃（（Ｅ＋Ｅ２）１５）あるいは５８℃（１／Ｇ、
１／Ａ、６／Ｆ）　　５分次いで急冷。

（３）アニーリングしたＤＮＡの精製とライゲーション 上記（２）でアニーリングしたＤＮＡの精製とライゲー
ション（１）ＮＡＩＩの結合）を以下のスケジュールで
実施した（第４図の■）。

５％ポリアクリルアミド電気泳動； エチジウムブロマイド（０，５μｇ／ｄＨ２０）染色ニ アニールしたＤＮＡを含むゲル断片の切り出しゲルから
ＤＮＡを抽出［ｒ、Ｈａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、；
ｏｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ−５１７ｇ　（１
９８２）　Ｊ　　：ＤＮＡを８μ！（１）Ｈ２Ｏに溶解 ←１０Ｘ反応緩衝液（０，６６Ｍ−ｒｒ　ｉ　ｓ。

ＨＣ！　（ａｌ１７．　６）　　、　５０ｗ＋ＨＭＧＣ
ｊ！　　　　、　５０ｇ＋ＨＤＴＴ、１０ｍＭ　　Ａｒ
Ｐ）　　　　　　　１μ！十丁４リガーゼ（３５０ユニ
ット／μｍ）１μ１ １５℃　２＠間： ６８℃　１０分。

（４）ライゲーションした１）ＮＡ同士のアニーリング 上記（３）でライゲーションしたＤＮＡ同士を以下の方
法で、アニーリングした（第４図の■）。

方　　　法 試　　薬 ＴＲＶＰ−２／ＴＲＶＰ−（Ｂ４Ｃ）＋ＴＲＹＰ−（３
＋４）／ＴＲＹＰ−Ｄ＋ＴＲＹＰ−５／ｒＲＹＰ−（Ｅ
＋Ｅ２）反応スケジュール ７０℃　５分 至腸放置（アニーリング）　１時間： ６０℃　５分： 急冷。

尚、［り）］はく　）内のＤＮＡ断片同士がライゲーシ
ョンしていることを示す。以下同様である。

（５）　　アニーリングしたＤＮＡの［１とライゲージ
ラン 上記（４）でアニーリングしたＤＮＡの精製とライゲー
ジ」ンは、（３）と同様の方法で行なった（第４図の■
） （６）　　ライゲーションしたＤＮＡと丁ＰＹＰ−１／
ＴＲＹＰ−Ａ、丁ＲＹＰ−１／ＴＲＹＰＧあるいはＴＲ
ＹＰ−６／ＴＲＹＰ−Ｆのアニーリング 上記（５）でライゲーションしたＤＮＡと上記（２）で
７ニーリングしたＴ　ＲＹ　Ｉ）　−１／丁ＲＹＰ−Ａ
、ＴＲＹＰ−１／ＴＲＹＰ−Ｇあるいは ＴＲＹＰ−６／ＴＲＹＰ−Ｆを以上の方法でアニーリン
グした（第４図の■） 方　　　　法 試　　薬 ＴＲ’ｌ’Ｐ−（２＋３−４←５）／ＴＲＹＰ−（Ｂ＋
Ｃ＋Ｄ＋Ｅ＋Ｅ２）＋１ＲＹＰ−１／ＴＲＹＰ−Ａある
いは＋ＴＲＹＰ−１／ｒＲＹＰ−Ｇあるいは＋ＴＲＹＰ
−６／ＴＲＶＰ−Ｆ 反応スケジュール ６０℃　５分： 重湯放置（アニーリング）　１＠闇。

（７）　　アニーリングした［）ＮＡの精製とライゲー
ジクン 上記（６）でアニーリングしたＤＮＡの精製とライゲー
ジコンは、（３）と１６１様の方法で行なった（第４図
の■） ＴＲＹＰ−（２＋３＋４＋５）／ＴＲＹＰ−（Ｂ＋Ｃ＋
Ｄ←Ｅ＋Ｅ２＞にｒ　ＲＹ　Ｐ　−１／　１−　ＲＹ　
Ｐ−Ａが結合したものが１Ａタイプ、ＴＲＹＰ−１／　
Ｔ　ＲＹ　Ｐ　−Ｇが結合したものが１Ｇタイプ、ＴＲ
ＹＰ−６／ＴＲＹＰ−Ｆが結合したものが６Ｆタイプの
それぞれトップスタチン遺伝子である。

（８）合成トップスタチン遺伝子の５′末端の燐酸化 合成トップスタチン遺伝子の５′末端を以下の方法でｖ
Ａ酸化した（第４図の■）。

試　　薬 １Ａタイプ、１Ｇタイプあるいは６Ｆタイプのトップス
タチン遺伝子 ＋１０×反応ｌｔｉ液（０，５Ｍ　　Ｔｒｉｓ。

ＨＣｊ！　（ＤＴ８）、０．１Ｍ　　ＭＱＣｊ！　　、
５０１ＭＤＴ　ｒ）　　　　　　　　　　　　　　　　
２μｌ＋１０ｓ＋ＨＡＴＰ　　　　　　　　　　　２μ
！＋Ｔ４ポリヌクレオチドキナ−ぜ（１０ユニット／μ
ｍ）　　　　　　　　　　　　　　２μｌ十Ｈ２０（全
量を２０μオにする） 反応スケジユール ３７℃　２時間： ６８℃　１０分。

以上のようにして得たトップスタチン遺伝子が正しい配
列を持っていることは塩基配列を調べることによって確
認した。

２　合成トリプスタチン遺伝子の発現ベクターへの組み
込み （１）ＳＡＫ遺伝子との融合遺伝子の作製１Ｇタイプの
合成トリプスタチン遺伝子［第２図（その３）］をＳＡ
Ｋ　（黄色ブドウ球菌由来スタフィロキナーゼ）のシグ
ナルペプチドからＮ末端構造ペプチドをコードする遺伝
子と、アミノ酸の翻訳枠が一致するように融合させた［
第５図（その１）］。また１Ａタイプの合成トリプスタ
チン遺伝子［第２図（その２）１の末端を平滑化した後
ＢａｍＨＩリンカ−を結合し、ＢａｍＨＩで切断して、
ＳＡＫのシグナルペプチドからＮ末端構造ペプチドをコ
ードする遺伝子と、アミノ酸の翻訳枠が一致するように
融合させた［第５図（その２）］。従って、１Ｇタイプ
の遺伝子を用いた場合は、ＳＡＫとトリプスタチンがイ
ソロイシン−メチオニン＜ｌｌｅ−Ｍｅｔ）残基を介し
て融合した蛋白が生産され［第５図（その１）１．１Ａ
タイプの遺伝子を用いた場合はＳＡＫとトリプスタチン
がイソロイシンーアルギニンーアフニンーメチオニン（
Ｉｊ！ｅ−Ａｒｑ−ＡＪ！ａ−Ｍｅｔ）残基を介して融
合した蛋白が生産される［第５図（その２）１゜この際
プロモーターとしては、大腸菌を宿主とした場合は大腸
菌において強い誘導プロモーターとして働（ｔａＣプロ
モーター又はλ）７−ジ由来ｐＬプロモーターを、枯草
菌を宿主とした場合はＳＡＫプロモーターを用いた。実
際の組換えＤＮＡは第６図に示すスキームにより、大腸
菌Ｈ）３１０１を宿主としてｐＫＫＳＴ及びｐＴＴＱＳ
Ｔを、大腸菌Ｎ４８３０−１（ファルマシア社製）を宿
［としてｐＰＬＳＴを、又、枯草菌マーバーブ１６８を
宿主とし−ＣｐＵＢＳ［を各々通常の［）ＮＡ組換え法
により作製した。

ｍｌ、ｐＫＫＳＴ、ｐＴ’ｒＱｓ丁の作製「ｔａｃプロ
モーター−８ＡＫ、ＳＤ配列ＳＡＫシグナルペプチド及
びＳＡＫ蛋白のＮ末端側の一部をコードするＤＮＡ　（
ＳＡＫ’　）−ｔ−リブスタチン遺伝子（１Ｇ）Ｊを含
むプラスミドＤＫＫＳ　ｒ、及びＯＴ　Ｔ　Ｑ　Ｓ　’
ｒは次のように作製した。

１）ＵＢｌｌｏにｒｓＡＫブＯモーター−８ＡＫ・ＳＤ
配列−８ＡＫ′−８ＭＣ遺伝子」を組み込んだプラスミ
ドｐＵＳ１６１　＜特願平１−２３４８７４；プラスミ
ドｐＬＩＳ１６１で形質転換された枯草菌は微工研に寄
託されており、受託番号としてＦＥＲＭＰ−１０７４２
が付されている）を制限酵素ＡｊｕＩ、及び３ａｍＨＩ
により切断してｒｓＡＫ、ＳＤ配列−８ＡＫ’　Ｊを含
む断片を精製し、これを３ｍａＩ、ＢａｍＨＩで切断し
たｐＵＣ８［Ｖｉｅｉｒａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ
、　１９．２５９（１９８２）］と混合して、１０倍濃
度のりガーゼ用緩物液を１／１０量加え、さらに１４Ｄ
ＮＡリガーゼを添加して、１５℃で１６時間反応させる
ことによって両ＤＮＡを結合した。このＤＮＡを塩化カ
ルシウム処理した大１！ｌ１ＨＢ１０１に導入し、５０
μｇ／ｄｌのアンピシリンを含有したＬ寒天培地に播種
し、３７℃で培養することによりアンピシリン耐性形質
転換株を得た。得られた形質転換株からプラスミドＤＮ
Ａを抽出して解析することによりｒｓＡＫ、ＳＤ配列−
８ＡＫ’　ｊをもつプラスミドＤＹＩ８６１を得た。

次にｐＹＩ８６１をｔ３ａｍＨＩにより開裂し、合成ト
リプスタチン遺伝子、１Ｇ［第２図（その３）］と混合
し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用い、上に述べた方法と同様
にして両断片を結合し、大腸菌Ｈ８１０１に導入して、
ｒｓＡＫ、ＳＤ配列ＳＡＫ’　−１ＧＪを含むプラスミ
ド ｐＹ　［ＴｒｙｌＧを得た。

ｐＹＩＴｒｙｌＧを更にＥＣ０ＲＩと Ｈｉｎｔｊｍにより切断し、アガロースゲル電気泳動で
、ＩＧのＨｉ　ｎｄｌ［［切断部位までを含み転写終結
部位を欠失したＤＮＡであるｒｓＡＫ、ＳＤ配列−８Ａ
Ｋ’　−１Ｇ’　ｊを含むＤＮＡ１ｉｌ〒を分離した。

これをＥＣ０ＲＩ、ｌ−１ｉｎｄｌｌＬにより切断した
。ＫＫ２２３−３と混合してＴ４ＤＮＡリガーゼを加え
て両断片を結合し、大腸菌Ｈ８１０１に導入して［ｔａ
Ｃプロモーター−３ＡＫ。

ＳＤ配列−８ＡＫ’　−ＩＧ’　　Ｊを含む大腸菌を宿
主とするプラスミドＤ　Ｋ　Ｋ　Ｓ　Ｔを得た。

同様にｐＫＫ２２３−３の代わりに、 ａＣ１ｑ遺伝子を組み込んだベクタープラスミド、ρＴ
ＴＱ１８を用い、大腸菌を宿主とするプラスミドｐＴＴ
ＱｓＴを得た。

（１）−２，Ｄ　Ｐ　Ｌ　８丁の作製 ｐしブロモ−ターの下流にＳＡＫ’　−ＩＧ’　が結合
したプラスミドＤ　Ｐ　Ｌ　Ｓ　Ｔは次のように作製し
た。

ｐＹＩＴｒｙｌＧをＥＣ０ＲＩとＨｉｎｄｌｌにより切
断し、７ガロースゲル電気泳動でｒｓＡＫ。

ＳＤ配列−３ＡＫ’　−ＩＧ’　Ｊを含むＤＮＡＩＩ！
ｉ片を精製し、該断片の両末端をにＩｅｎｏｗ断片によ
り平滑化した。該ＤＮＡｌｔ片とλファージのｐしブロ
モ−ターを持つベクタープラスミド、ｐＰＬ−しａｍｂ
ｄａをＨｐａ　Ｉで開裂したＤＮＡとを混合してＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼで結合し、大ｌｌＩ菌Ｎ４８３０−１に導
入してＩｐＬプロモーターＳＡＫ、ＳＤ配列−８ＡＫ’
　−ＩＧ’　Ｊを含む、大腸菌を宿主とするプラスミド
ｐＰＬｓ丁を得た。

（１）−３，Ｄ　Ｕ　Ｂ　Ｓ　Ｔの作製ｒｓＡＫ’　−
１−リブスタチン遺伝子」を含む、枯草菌を宿主とする
プラスミドｐｔＪＢＳＴは次のように作製した。

１Ａ［第２図（その２）］の両末端をＫｌｅｎｏｗｌｌ
ｉ片で処理することによって平滑化し、 ５’　ＣＧＧＡＴＣＣＧ３’ なる配列を有するリンカ−ＤＮＡを１４ＤＮＡリガーゼ
で結合したのちＢａｍＨＩにより切断した。

次にρＵＳ１６１を［３ａｍ丁により切断し、両ＤＮＡ
をＴ４ＤＮＡリガーゼで結合させ、枯草菌マーバーブ１
６８　［５ｐｉｚｉｚｅｎ、　Ｐｒｏｃ、　Ｈａ口Ａｃ
ａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、、４４．１０７２
　（１９５８）１にブ０ドブラスト法Ｌ　Ｃｈａｎｏ　
ｅｔ　ａｌ、、　Ｈｏｔ。

Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、、１６８．１１１　（１９７９
）　］により導入しカナマイシン耐性形質転換株を得た
。得られたカナマイシン耐性株からｒｓＡＫプロモータ
ー−３ＡＫ、ＳＯ配列−３ＡＫ’　　−リンカー−ＩＡ
Ｊを含む、プラスミドｐＵＢＳＴを得た。

（２）　　アルカリホスファーゼ遺伝ｆとの融合遺伝子
の作製 大腸菌の分泌蛋白質であるアルカリホスファターぜのシ
グナルペプチドをコードする遺伝子と６Ｆタイプの合成
トリプスタチン遺伝子［第２図（その１）］をアミノ酸
の翻訳枠が一致するように融合させた［第７図（その２
）コ。また、アルカリホスファターゼのシグナルペプチ
ドを］−ドする遺伝子と１Ａタイプの合成トリプスタチ
ン遺伝子［第２図（その２）］をアミノ酸の翻訳枠が一
致するように融合させた［第７図（その１）］。

６Ｆタイプを用いた場合はアルカリホスファターゼのシ
グナルペプチドとトリプスタチンが直接融合した蛋白が
合成されるが［第７図（その２）１１Ａタイプを用いた
場合は、アルカリホスファターゼのシグナルペプチドと
トリプスタチンがメチオニン残基（Ｍｅｔ＞を介して融
合した蛋白が合成されるし第７図（その１）］。

宿主としては大腸菌ＨＢ１０１を用い、プＯモ〜ターは
ｔａｃプロモーターを用いた。実際のＤＮＡの組換えは
第８図に示すスキームで行い、プラスミドｐＫＮ１１１
及びｐＫＮ１１３を作製した。

即ち、先ず、大１菌のアルカリホスファターゼ遺伝子（
ＤｈＯＡ＞の１０モーター　ｐｈｏＡ。

ＳＤ配列、ＤｈＯＡ、シグナルペプチド部を持つベクタ
ーＤＮＡ、ＤＹＫ３３１　（特開昭６０−９１９８４＞
をＨｉ　ｎｄｌｌ［、ＢａｍＨＩにより切断し、合成ト
リプスタチン遺伝子ＩＡ［第２図（その２）」、又は６
Ｆ［第２図（その１）］と渥合して、ｒ４ＤＮＡリガー
ゼで両１）ＮＡを結合し、大ｌ！菌ＨＢ１０１に導入し
てｒｐｈｏＡプロモーター−ｐｈＯＡ、ＳＤ配列−ｐｈ
ｏＡシグナルペプチドをコードするＤＮＡ−１Ａ又は−
６ＦＪを含むプラスミドＤＫＮ１１　（ＩＡ）、ｐＫＮ
１６（６ト）を得た。これを鋳型としてＰＣＲ法τ５ａ
ｉｋｉ　ｅｔ　ａｔ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、２３０．　
１３５０　（１９８５）１によりｒｐｈｏＡジグ太ルベ
プチドをコードするＤＮＡ−Ｉ　Ａ又は−６ＦＪを含む
ＤＮＡ断片を増幅した。その際、Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩ切断
部位が付加したＤＮＡをプライマーとして用いた。即ち
、ｒＯｈＯＡシグナルペプチドをコードするＤＮＡ−１
Ａ又は−６１：」を含むＤＮＡの塩基配列、 ５’　ＧＴＧＡＡＡＣＡＡＡＧＣＡＣＴＡＴＴＧ−・・
３’　　ＣＡＣＴ　ｒ　ｒＧ　ｒ　ｒＴｃＧ　ｒＧ△「
ＡへＣ・・・・・・ＣＧＡＣＧＧＴＴＡＣＴＡＧＡＡＧ
ＣＴＴ３’・・・ＧＣＴＧＣＣＡＡＴＧＡ　　Ｉ−Ｃｌ
　　ｒｃＧＡＡ５’という配列に対してこれと相補的で
あり、かつＥＣ０ＲＩ切断部位（Ｆｌ！部分）が付加し
た５’　ＧＧＡＡＴＴＣＧＴＱΔＡＡＣＡＡＡＧＣＡＣ
ＴＡＴＴＧ３’及び ｂ’　ＧＧＡＡＴＴＣＡＡＧＣＴＴＣＴＡＧＴＡＡＣＣ
ＧＴＣＧ３’という配列を持つＤＮＡをブライマーとし
て用い、ＰＣＲ法で当該？ＩＡ域を増幅した。ＰＣＲ法
による増幅反応は９４℃２分→４２℃２分→７２℃５分
、というサイクルを２５１！ｌ！ｉｌｌり返すことによ
って行った。

このようｋして増幅されたＤＮＡをＥＣ０ＲＩ、ト１ｉ
ｎｄｌ［ｌにより切Ｉ！ｉ″ｒＪルコとによって、ＩＡ
。

６ＦのＨｉ　ｒ）ｄ　ｍ切断部位までを含み転写終結部
位を欠失したＤＮＡ断片、１Ａ’　、６Ｆ’を取得した
。これらＤＮＡ断片を、同様にＥＣＯＲＩ、Ｈｉｎｄｌ
［ｌにより切断したｔａｃプロモーターを含むベクター
プラスミド、ｐＫＫ２２３−３と置台してＴ４ＤＮ八リ
ガーゼで結合して大腸菌ＨＢ１０１に導入し、１ｔａｃ
プロモーター−ベクター由来のＳＤ配列−ｐｈＯＡシグ
ナルペプチドをコードするＤＮＡ−１八′又は−６Ｆ′
　１を含むプラスミドｐＫＮ１０２　ＣＩＡ’　）　、
及びｐＫＮ１０４　（６Ｆ’　　）を得た。

両組換えＤＮＡではＳＤ配列とｐ　ｈ　、ｏ　Ａの開始
コドンの間の距離が１０塩基対であるのでこれを以下に
述べる方法で６塩基対に縮めた。即ち、ｐＫＮ１０２　
（１Ａ’　　）及びＤＫＮ　１０４（６Ｆ”）をＥＣ０
ＲＩにより切断しｍｕｎｏ　ｂｅａｎｎｕｃ　ｌ　ｅａ
ｓｅにより両端の一本鎖部分を除去し、「４ＤＮＡリガ
ーゼを加えて再結合し、大腸菌ＨＢ１０１に導入した。

このようにして、ＳＤ配列とｐｈｏＡシグナルペプチド
の翻訳開始部位までの距離を４塩基短かくしたプラスミ
ドＣ）ＫＮｌｌｌ（ＩＡ’　　）、ｐＫＮｌ　１３　（
６Ｆ’　　）を得た。

３　大腸菌による５ＡＫ−トリプスタチン融合伽白質の
生産 （１１ｐＴＴＱｓＴまたはｐＫＫＳＴを用いた５ＡＫ−
ｔ−リプスタチン融合蛋白の生産２−！１）で作製した
ｐＴＴＱＳＴまたはｐＫＫＳＴを、大腸菌ＪＭ１０９株
［Ｃ，Ｙａｎｉｓｃｈ−ｐｃｒｒｏｎｅｔ、　ａｌ、Ｇ
ｅｎｅ、３３．１０３、（１９８５）］に通常の塩化カ
ルシウム法［Ｈａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌＨＯｌｅＣ
ｕｌａｒ　Ｃｌ０ｎｉｎＯ，Ｄ、　　２５０　（１９８
２）　１で導入し、アンピシリン２０μｇ／ｄを含むＬ
Ｂ培地（トリプトン：１０ｇ、酵母エキス＝５９、塩化
ナトリウム：　１０ｓ／１　）寒天プレート上に播き、
アンピシリン耐性株を選択することにより、形質転換株
、ＪＭｌ　０９１０ＴＴＱｓＴまたはＪＭ１０９／ｐＫ
ＫｓＴを得た。これらの形質転換株をＬＢ培地で３７℃
で一晩振盪培養したものを新鮮なし８培地に３％になる
ように接種し、３７℃で４時間振盪培養した後、最終濃
度、０．２５−Ｈになるようにイソプロピル−β−Ｄチ
オガラクトシド（Ｉ　ＰＴＧ）を加えて遺伝子発現を誘
導し、引続き５〜１８時間培養を続けた後、５ＡＫ−ｔ
−リプスタチン融合蛋白質を含有する菌体を遠心（１０
，０００ｇＸｂ分）により集めた。

（２１Ｄ　Ｐ　Ｌ　Ｓ　Ｔを用いた５ＡＫ−トリプスタ
チン融合蛋白の生産 ２−＋１１で取得したＮ４８３０−１１０ＰＬｓ　ｒを
ＬＢ培地で、３０℃で−＠振盪培養したものを新鮮なＬ
Ｂ培地に３％になるように接種し、３０℃で３．５１１
ｉ間娠盪培養した後、あらかじめ５４℃に保温しておい
たＬＢ培地を等犠添加し、４２℃で２時間振盪培養して
遺伝子発現を誘導した。培養液を氷冷した後、５ＡＫ−
ｔ−リブスタチン融合蛋白を含有する菌体を遠心（１０
，０００！ＪＸ５分）により集めた。

上記３．で得た菌体に１１５〜１／１０容壷のＴＥＳ　
［３０醜Ｈトリス塩酸！ＩＩＩ液（ｐＨ８，０）。

５１１８　　ＥＤ’ＴＡ、５０醜Ｈ塩化ナトリウム、１
鴎８ＰＭＳＦ］溶液に懸濁し、ラウリル硫酸ナトリウム
（Ｓｔ）Ｓ）を最終濃度０．５％になるように加え、ル
ンチプレス（アミンコ社製）、又は超音波処理により菌
体を破砕した。未破砕菌体を４℃にて低速遠心（５，０
ＯＣ１ｘ１０分）により除去し、上清をＨＡ遠心（１０
万ＱＸ３０分）にかけ膜画分を得た。次に該膜画分を６
Ｍ塩酸グアニジン−２０ＩＨトリス塩酸！ｌ衝液（ＥＩ
８８．５＞　−１ｍＨＥＤＴＡ−２％２メルカプトエタ
ノール（２ＭＥ）に懸濁し、３７℃にて１時間インキュ
ベージ３ンを行い、次いで超遠心（１０万ａｘ３０分）
上澄を得ることにより、【ＩＴ溶化した５ＡＫ−トリプ
スタチン融合蛋白質の粗標品を得た。該標品を３Ｍ酢酸
で平衡化したセファクリル５２００　（）？シフ９フ社
製）を用いたゲル濾過り０マドグラフイーにより精製し
、５ＡＫ−トリプスタチン融合蛋白質を含む画分を集め
、逆相クロマトグラフィーで更に精製した。カラムはＬ
ｉｃｈｒｏｓｏｒｂ　　ＲＰ〜８（センシュー科学製）
を用い２０〜６０％のアセトニトリル〈０．１％トリフ
ルオロ酢酸含ｈ）の濃度勾配により溶出した。ポリアク
リルアミドゲル電気泳動により５ＡＫ−ｔ−リプスタチ
ン融合蛋白質を含む自分を確認しく第９図参照）、該自
分を集め（凍結乾燥し、約り５％純度の５ＡＫ−ｔ−リ
ブスタチン融合蛋白質を培養液１リットル当り約２ｑ得
ることが出来た。生産量は、 ｐ　ｒ　ｒＱｓＴ、ｐＫＫｓ　ｒ、ｐＰＬＳ　ｒいずれ
のプラスミドを用いてもほぼ同程度であった。

５、枯草菌による５ＡＫ−トリグスタチン融合蛋白賀の
生産 ２−　ｔｌｌで取得した形質転換株、マーバーブ１６８
／Ｉ）ＵＢＳ　ｒを２０ｕｇ／Ｉｄのカナマイシンを含
有するＬＢ培地で３７℃で一晩撮盪培養したものを新鮮
な［Ｂ培地に５％になるように接種し、３７℃で７〜２
４時間、振盪培養を続けた後、遠心（５，ＯＯＯｇｘ１
０分）により国体を除去し、培地中に分泌生産された５
ＡＫ−ｔ−リブスタチン融合蛋白質を６０％飽和の硫安
により塩析した。

遠心（１０，ＯＯＯｇｘｌＯ分）により得た沈澱物をＴ
ＥＳに溶解し、４℃でＴＥＳに対して透析した後、遠心
（１０，０Ｏ０９Ｘ１０分）によって沈澱を得ることに
より５ＡＫ−トリプスタチン融合蛋白質の粗標品を得た
。該標品を６Ｍ＠酸グ酸二ｌニシン−０ｅＨトＩＪ　ス
塩１１１１ｉ１（ｐｔ＋８．５）−１園ＨＥＤＴＡ−２
％２メルカプトエタノール（２ＭＥ）に懸濁し、３７℃
にて１時間インキ１ベージ］ンを行うことによって可溶
化したのち３Ｍ酢酸で平衡化したセファクリル８２００
を用いたゲル濾過クロマトグラフィーによってＶ＃製し
、５ＡＫ−トリプスタチン融合蛋白質を含む自分を集め
、逆相クロントゲラフイーで更に精製した。カラムはＬ
ｉｃｈｒｏｓｏｒｂＲｐ　−８（センシュー科学製）を
用い２０〜６０％のアセトニトリル（０，１％トリフル
オロ酢酸含有）の濃度勾配により溶出した。ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動により５ＡＫ−ｔ−リプスタチン
融合蛋白質を含む画分を＃１認し、該画分を集めて凍結
乾燥し、約り５％純度の５ＡＫ−１−リブスタチン融合
蛋白質を培養液１リットル当り約１０■得ることが出来
た。

５ＡＫ−トリ゛プスタチン融合慢白實からトリプスタチ
ンを単離するために、該融合蛋白質をブロムシアンで処
理した。上記５　により調製した訳融合蛋白賞の凍結乾
燥品を、１００％蟻酸に溶解したのちプロムシアン水溶
液を添加して最終的に蟻酸ｍ度７０％、ブロムシアン濃
ａ４．４η／−１Φ白濃度５１１ｇ／ＩＩＲとなるよう
にした。該溶液を遮光して２４℃で２４ＷＩｆ間インキ
ュベートした後遠心エバポレータ−１久間製・Ｅ０５７
Ｃ）にて乾燥させた。これを６Ｍ塩酸グアニジン−２０
１８トリス塩１ｍ！！１ｌｉＧ’（ＤＨ８，５＞　−１
ｓ１４　　ＥＤＴＡ−２％　２ＭＥに溶解し、上記４．
に示したのと同様の方法で逆相クロマトグラフィーにか
け、トリプスタチンの凍結乾燥標品を取得した。精製度
は約９５％であった。

７、精製トリプスタチンのＮ末端アミノ酸配列のり 上記６　で得られた精製トリ１スタチンを還几ピリジ７
Ｌ／Ｉチル化［Ｆｒｉｅｄｍａｎ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｊ
、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、、２４５．３８６８　（１９７０）Ｉ　した
後、Ｎ末端アミノ酸配列をベブチドシークエンサー・４
７７Ａ（ＡＢ１社製）により決定し、Ｈ２ＮＩｊ！ｅ−
ＡＩａ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ１−ｅｕ−ｐｒｏ−Ｉ
　Ｒｅ−なる配列を得た。この配列はトリプスタチンの
Ｎ末端配列（第１図）と同一であり、５ＡＫ−ｔ−リブ
スタチン融合蛋白質のブロムシアンによる明晰が正しく
行われ、トリプスタチンが単離されたことを確認した。

８、大ＷＡ菌によるトリプスタチンの分泌生産と精！ ２−１２１で作製したプラスミドｐＫＮ１１１゜ＤＫＮ
１１３を大腸菌ＪＭ１０９株に常法により導入し形質転
換株、ＪＭｌ　０９／ｐＫＮ１１１、又はＪＭｌ　０９
／ｐＫＮ　１１３を得た。これら形質転換株をＬＢ培地
で３７℃−晩振盪培養したものを、新鮮なＬＢ培地に３
％になるように接種し、３７℃で４時間蚤盪培養したＩ
Ｉ　ＰＴＧを最終濃度Ｑ、５ｓＨになるように加え、３
７℃で２時間から２０時間培養後、１４．０ＯＯＸ９．
１０分の遠心分間により１分泌生産されたトリプスタチ
ンを含む培養１清を得た。

培養上清に５０％飽和となるように硫安を加えて４℃で
一晩攪拌し、遠心＜１０，００（ｌｘ１０分）により得
た沈澱を、６Ｍ塩酸グアニジン。

２０１ＩＨトリス塩ａｌ！ｌ衝液（ｐＨ８，５）、１＋
ｅＭＥＤＴＡに口■溶化し３Ｍ酢酸で平衡化したセファ
クリル８２００　（ノフルマシア社製）を用いたゲル濾
過クロマトグラフィーにより精製し、トリプスタチンを
含む一分を得た。該自分を星めて凍結乾燥した後、これ
を６ＭｊＷｌｌグアニジン、２０１８トリス塩酸！ｌ衝
液（ｐＨ８，５＞、１醜ＭＥＤＩ−Ａに可溶化し、これ
を逆相り０マドグラフイーで精製シタ。カラムハＬｉｃ
ｈｒｏｓｏｒｂＲｐ　−８（センシュー科学製）を用い
２０〜６０％のアセトニトリル（０，１％トリフルオロ
酢酸含有）の濃度勾配により溶出した。トリプスタチン
を含む自分をポリアクリルアミドゲル電気泳動により確
認しく第１０図澹照）、該−分を集めて凍結乾燥した。

その結果、約り５％純度のトリプスタチンを培養１１リ
ットル当り約２００μ５ｊ得ることが出来た。

【図面の簡単な説明】

第１図は、トリプスタチンをコードするトリプスタチン
構造遺伝子のＤＮＡ塩基配列を示す。 第２図は、トリプスタチンを発現させるベクターを構築
させるために用いた３つのタイプのトリプスタチン遺伝
子を示す。 第３図は、第２図に示した３つのタイプのトリプスタチ
ン遺伝子を合成するために用いた１４種類の１本鎖ＤＮ
Ａを示す。 第４図は、第３図に示した１４種類の１本鎖ＤＮＡを用
いて、第２図に示した３つのタイプのトリプスタチン遺
伝子を合成する合成スキームをホす。 第５図は、スタフィロキナーゼ遺伝子のシグナル・べ１
チドをコードするＤＮＡ配列、スタフィロキナーゼのＮ
末端部分をコードするＤＮＡ配列及びトリプスタチン遺
伝子を含むＤ　Ｎ　Ａ　ｉｋ！　４１をボす。 第６図は、プラスミドｐＵＢｓＴ、 ｐ’ｒＴＱＳＴ、ｐＫＫｓＴ及びｐＰＬｓｒの構築をボ
す。 第７図は、アルカリ性ホスファターゼ遺伝子中のシグナ
ル・ペプチドをコードする１）ＮＡ配列及びトリプスタ
チン遺伝子を含むＤＮＡ配列を示す。 第８図は、プラスミドρＫＮ１１１及びＤＫＮ１１３の
構築を示す。 第９図は、大腸菌により生産された５ＡＫ−トリプスタ
チン融合蛋白質をポリアクリルアミドゲル電気泳動に付
した時の結果を承す写真である。 第１０図は、大腸菌により生産されたトリ１スタチンを
ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した時の結果を示
寸写貞である。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）以下に示すＤＮＡ塩基配列を有するトリプスタチ
   ン構造遺伝子。 【遺伝子配列があります】 （ＤはＡ、Ｔ又はＧ、ＹはＴ又はＣ、ＮはＡ、Ｔ、Ｇ又
   はＣを示す）
2. （２）ＤＮＡ塩基配列が以下に示すものである請求項第
   １項記載のトリプスタチン構造遺伝子。 【遺伝子配列があります】
3. （３）黄色ブドウ球菌由来のスタフィロキナーゼ遺伝子
   中のもしくは大腸菌由来のアルカリ性ホスファターゼ遺
   伝子中のシグナル・ペプチドをコードするＤＮＡ配列、
   及び請求項第１項または第２項記載のトリプスタチン構
   造遺伝子を含有するトリプスタチン発現ベクター。
4. （４）トリプスタチン構造遺伝子が、リンカーＤＮＡを
   介して、黄色ブドウ球菌由来のスタフィロキナーゼ遺伝
   子中のスタフィロキナーゼ構造遺伝子の５′末端側のＤ
   ＮＡ部分配列と結合しており、融合蛋白質としてトリプ
   スタチンを発現するための請求項第３項記載の発現ベク
   ター。
5. （５）ｔａｃプロモーター、ｐＬプロモーターまたはｐ
   ＳＡＫプロモーターを含有する請求項第３項または第４
   項記載の発現ベクター。
6. （６）請求項第３項から第５項のいずれか１項記載の発
   現ベクターで形質転換された大腸菌または枯草菌。
7. （７）請求項第６項記載の形質転換された大腸菌または
   枯草菌を培養し、トリプスタチンをそのままの形態でま
   たは他の蛋白質との融合蛋白質として菌体外またはペリ
   ブラズム中に分泌させ、次いで回収するトリプスタチン
   の製造法。