JPS6030687A - Ｄνａ遺伝子，その製造法およびそれを含むプラスミド - Google Patents
Ｄνａ遺伝子，その製造法およびそれを含むプラスミドInfo
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- JPS6030687A JPS6030687A JP58140748A JP14074883A JPS6030687A JP S6030687 A JPS6030687 A JP S6030687A JP 58140748 A JP58140748 A JP 58140748A JP 14074883 A JP14074883 A JP 14074883A JP S6030687 A JPS6030687 A JP S6030687A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
- C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
発明の背景
技術分野
本発明は、外来性遺伝子産物の分泌に関与するＤＮＡ遺
伝子の利用に関する。さらに具体的には、本発明は、宿
主菌体内で産生されたタンパク質を膜外へ分泌させるた
めのペプチド（以下、シグナル・ペプチドという）の遺
伝子の直後に外来性遺伝子の結合を可能としたＤＮＡ遺
伝子に関する。
伝子の利用に関する。さらに具体的には、本発明は、宿
主菌体内で産生されたタンパク質を膜外へ分泌させるた
めのペプチド（以下、シグナル・ペプチドという）の遺
伝子の直後に外来性遺伝子の結合を可能としたＤＮＡ遺
伝子に関する。
また、本発明は該ＤＮＡ遺伝子の製造方法に４１ｊｊ該
ＤＮＡ遺伝子部分を含むプラスミドにも、関するＯ 先行技術 組換えＤＮＡ技術を用いて所望の遺伝子産物を大量に産
生させる技術が確立されつつあることは、多数の雑文中
公開特許公報等によって認められるところである。これ
らの技術の確立に伴なって遺伝学的解析も行なわれてお
シ、シグナル・ペプチドとＬｎ５１３〜３０個のアミノ
酸残基からなる一連のペプチドが発現蛋白の宿主細胞外
への分泌に関与しているという知見もその中から見出さ
れたものである。
ＤＮＡ遺伝子部分を含むプラスミドにも、関するＯ 先行技術 組換えＤＮＡ技術を用いて所望の遺伝子産物を大量に産
生させる技術が確立されつつあることは、多数の雑文中
公開特許公報等によって認められるところである。これ
らの技術の確立に伴なって遺伝学的解析も行なわれてお
シ、シグナル・ペプチドとＬｎ５１３〜３０個のアミノ
酸残基からなる一連のペプチドが発現蛋白の宿主細胞外
への分泌に関与しているという知見もその中から見出さ
れたものである。
発現タンパク質の細胞外への分泌に関するこの知見は「
シグナル仮説Ｊ （Ｊ、 Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌ、 、６
７゜１３！ （／り７ｊ））といわれ、この説を支持す
る実験結果も蓄積されつつある（ Ｂｅｅｒａｔｏｒｙ
Ｍｅｅｈａｎｌｓｍｓ、 Ｌ、 Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ
ＵｎＩｖｅｒｓ＋Ｉｔｙ ＰｒｅｓｓＣａｍｂｒｉｄｇ
ｅ （／り７り）、生化、８、／ＩＩ／ （／り１ｒｏ
）等）。シグナル・ペプチドの概要および機能にっｂて
はたとえば特開昭５ｔｙ−ｔりｇり７号公報等に説明さ
れておシ、シグナル・ペプチドは蛋白の膜通過に関与す
るものとして認識されている。
シグナル仮説Ｊ （Ｊ、 Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌ、 、６
７゜１３！ （／り７ｊ））といわれ、この説を支持す
る実験結果も蓄積されつつある（ Ｂｅｅｒａｔｏｒｙ
Ｍｅｅｈａｎｌｓｍｓ、 Ｌ、 Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ
ＵｎＩｖｅｒｓ＋Ｉｔｙ ＰｒｅｓｓＣａｍｂｒｉｄｇ
ｅ （／り７り）、生化、８、／ＩＩ／ （／り１ｒｏ
）等）。シグナル・ペプチドの概要および機能にっｂて
はたとえば特開昭５ｔｙ−ｔりｇり７号公報等に説明さ
れておシ、シグナル・ペプチドは蛋白の膜通過に関与す
るものとして認識されている。
現在、シグナル・ペプチドを利用した発明は、特許公開
または公告公報等で種々開示されている（特開昭５ｓ−
ｉり０９．２号、同３！；−１７１３り５号、同！；Ａ
−／３７ｇ２６号、同！；Ａ−／１Ａｊ２２／号、同５
６−７タ弘タタタ号各公報等）。これら公報記載の方法
では、込ずれも、宿主菌の分泌すべき蛋白をコードする
構為遺伝子を適当な制限酵素認識部位で切断し、そこへ
フレームを合わせるためのリンカ−を介して外来性遺伝
子を接続して込る。
または公告公報等で種々開示されている（特開昭５ｓ−
ｉり０９．２号、同３！；−１７１３り５号、同！；Ａ
−／３７ｇ２６号、同！；Ａ−／１Ａｊ２２／号、同５
６−７タ弘タタタ号各公報等）。これら公報記載の方法
では、込ずれも、宿主菌の分泌すべき蛋白をコードする
構為遺伝子を適当な制限酵素認識部位で切断し、そこへ
フレームを合わせるためのリンカ−を介して外来性遺伝
子を接続して込る。
その結果、このような融合遺伝子から発現してくる外来
性蛋白のＮ末端側には余分なペプチドが付着しているこ
とになる。従って、この余分なペプチドが分泌を阻害し
たシ、外来性蛋白の生物活性に悪影響を与えたシする可
能性も考えられる。
性蛋白のＮ末端側には余分なペプチドが付着しているこ
とになる。従って、この余分なペプチドが分泌を阻害し
たシ、外来性蛋白の生物活性に悪影響を与えたシする可
能性も考えられる。
このように、シグナル・ペプチドを利用した従来の技術
は種々の問題点をかかえているというべく、従ってこれ
らの改善が望まれているところである。
は種々の問題点をかかえているというべく、従ってこれ
らの改善が望まれているところである。
発明の概要
要旨
本発明は上記の点に解決を与えることを目的とし、シグ
ナル・ペプチドをコードする遺伝子の直後に外来性蛋白
をコードする遺伝子の結合を可能としたＤＮＡ遺伝子を
設計し、これを利用することによってこの目的を達成し
ようとするものである０ 従って、本発明によるシグナル・ペプチドをコードする
遺伝子に対応するＤＮＡ部分を含むＤＮＡ遺伝子は、シ
グナル・ペプチドをコードする遺伝子に対応するＤＮＡ
部分を含み、このＤＮＡが゛その塩基対の少なくとも一
つを構成員の少なくとも一部として人工的に創出された
制限酵素認識部位を７個所有するものであること、を特
徴とするものである。
ナル・ペプチドをコードする遺伝子の直後に外来性蛋白
をコードする遺伝子の結合を可能としたＤＮＡ遺伝子を
設計し、これを利用することによってこの目的を達成し
ようとするものである０ 従って、本発明によるシグナル・ペプチドをコードする
遺伝子に対応するＤＮＡ部分を含むＤＮＡ遺伝子は、シ
グナル・ペプチドをコードする遺伝子に対応するＤＮＡ
部分を含み、このＤＮＡが゛その塩基対の少なくとも一
つを構成員の少なくとも一部として人工的に創出された
制限酵素認識部位を７個所有するものであること、を特
徴とするものである。
本発明によるシグナル・ペプチドをコードする遺伝子に
対応するＤＮＡ部分を含むＤＮＡ遺伝子の製造法は、下
記の工程からなること、を特徴とするものである。
対応するＤＮＡ部分を含むＤＮＡ遺伝子の製造法は、下
記の工程からなること、を特徴とするものである。
（ａ） シグナル・ペプチドをコードする遺伝子に対応
するＤＮＡ部分を含むＤＮＡ遺伝子を用意すること。
するＤＮＡ部分を含むＤＮＡ遺伝子を用意すること。
（ｂ） このＤＮＡ部分の塩基配列を、この塩基配列に
対応するアミノ酸配列を変化させずに改変して、シグナ
ル１ペプチドをコードする遺伝子に対応するＤＮＡの塩
基対の少なくとも一つを構成員の少なくとも一部とする
制限酵素認識部位を創出すること。
対応するアミノ酸配列を変化させずに改変して、シグナ
ル１ペプチドをコードする遺伝子に対応するＤＮＡの塩
基対の少なくとも一つを構成員の少なくとも一部とする
制限酵素認識部位を創出すること。
本発明によるもう一つのシグナル９ペプチドをコードす
る遺伝子に対応するＤＮＡ部分を含むＤＮＡ遺伝子の製
造法は、下記の工福からなること、を特徴とするもので
ある。
る遺伝子に対応するＤＮＡ部分を含むＤＮＡ遺伝子の製
造法は、下記の工福からなること、を特徴とするもので
ある。
（ａ） シグナル・ペプチドをコードする遺伝子に対応
するＤＮＡ部分を含むＤＮＡ遺伝子を用意すること、 （ｂ） このＤＮＡ部分の塩基配列を、この塩基配列に
対応するアミノ酸配列を変化させずに改変して、シグナ
ル・ペプチドをコードする遺伝子に対応するＤＮＡの塩
基対の少なくとも一つを構成員の少なくとも一部とする
制限酵素認識部位を創出すること、 （、） 創出された制限酵素認識部位内の制限酵素切断
部位を該制限酵素で切断して、シグナル・ペプチドをコ
ードする遺伝子に対応するＤＮＡの該切断部位よυ上流
側の部分からなυ、かつ下流側に該制限酵素切断端を有
するＤＮＡ断片をつくること、 （ｄ） シグナル・ペプチドをコードする遺伝子に対応
するＤＮＡ部分の制限酵素切断部位の下流側に存在して
いることあるべきＤＮＡと該存在していることあるべき
ＤＮＡの下流側直後に存在する外来性蛋白をコードする
遺伝子に対応するＤＮＡとからなシ、上流側および下流
側末端に前記制限酵素切断端を有するＤＮＡ断片を用意
すること、 （ｅ） 前記（ｃ）によるＤＮＡ断片と前記（ｄ）によ
るＤＮＡ断片とを制限酵素切断端で結合させて、シグナ
ル・ペプチドをコードする遺伝子に対応するＤＮＡ部分
とその下流側に直結した外来性蛋白をコードする遺伝子
に対応するＤＮＡ部分とを含むＤＮＡ遺伝子を得ること
。
するＤＮＡ部分を含むＤＮＡ遺伝子を用意すること、 （ｂ） このＤＮＡ部分の塩基配列を、この塩基配列に
対応するアミノ酸配列を変化させずに改変して、シグナ
ル・ペプチドをコードする遺伝子に対応するＤＮＡの塩
基対の少なくとも一つを構成員の少なくとも一部とする
制限酵素認識部位を創出すること、 （、） 創出された制限酵素認識部位内の制限酵素切断
部位を該制限酵素で切断して、シグナル・ペプチドをコ
ードする遺伝子に対応するＤＮＡの該切断部位よυ上流
側の部分からなυ、かつ下流側に該制限酵素切断端を有
するＤＮＡ断片をつくること、 （ｄ） シグナル・ペプチドをコードする遺伝子に対応
するＤＮＡ部分の制限酵素切断部位の下流側に存在して
いることあるべきＤＮＡと該存在していることあるべき
ＤＮＡの下流側直後に存在する外来性蛋白をコードする
遺伝子に対応するＤＮＡとからなシ、上流側および下流
側末端に前記制限酵素切断端を有するＤＮＡ断片を用意
すること、 （ｅ） 前記（ｃ）によるＤＮＡ断片と前記（ｄ）によ
るＤＮＡ断片とを制限酵素切断端で結合させて、シグナ
ル・ペプチドをコードする遺伝子に対応するＤＮＡ部分
とその下流側に直結した外来性蛋白をコードする遺伝子
に対応するＤＮＡ部分とを含むＤＮＡ遺伝子を得ること
。
本発明によるブラスミドヂ↓４ｉは、アルカリ性フォス
ファターゼ由来の制御領域に対応するＤＮＡ部分とこの
領域の制御下にあるアルカリ性フォスファターゼ由来の
シグナル１ペプチドをコードする遺伝子に対応するＤＮ
Ａ部分とを含み、このシグナル・ペプチドをコードする
遺伝子に対応するＤＮＡ部分が下記によって定義される
ものであること、を特徴とするものである。
ファターゼ由来の制御領域に対応するＤＮＡ部分とこの
領域の制御下にあるアルカリ性フォスファターゼ由来の
シグナル１ペプチドをコードする遺伝子に対応するＤＮ
Ａ部分とを含み、このシグナル・ペプチドをコードする
遺伝子に対応するＤＮＡ部分が下記によって定義される
ものであること、を特徴とするものである。
（イ） このＤＮＡ部分には、その塩基対の少なくとも
一つを構成員の少なくとも一部と°する制限酵素切断部
位が人工的に創出されていること。
一つを構成員の少なくとも一部と°する制限酵素切断部
位が人工的に創出されていること。
（ロ） この制限酵素認識部位内の制限酵素切断部位が
シグナル・ペプチドをコードする遺伝子に対応するＤＮ
Ａ部分とその直後に結合されていることあるべきＤＮＡ
部分との境界に存在すること。
シグナル・ペプチドをコードする遺伝子に対応するＤＮ
Ａ部分とその直後に結合されていることあるべきＤＮＡ
部分との境界に存在すること。
効果
このように、本発明は、シグナル・ペプチドによる外来
性遺伝子由来蛋白の細胞外分泌を行なわせるすく、シグ
ナル・ペプチド遺伝子にそこへの外来性遺伝子の組込み
を容易にするための制限酵素認識／切断部位を創出する
という点に特徴を有するものであシ、この部位を創出す
るに当ってＤＮＡ塩基対からなるコドンには縮重がある
ということを巧みに利用したものである。
性遺伝子由来蛋白の細胞外分泌を行なわせるすく、シグ
ナル・ペプチド遺伝子にそこへの外来性遺伝子の組込み
を容易にするための制限酵素認識／切断部位を創出する
という点に特徴を有するものであシ、この部位を創出す
るに当ってＤＮＡ塩基対からなるコドンには縮重がある
ということを巧みに利用したものである。
創出された制限酵素認識／切断部位を該制限酵素で切断
すれば、その切断部位がシグナル・ペプチド遺伝子ＤＮ
Ａの下流側末端に接して存在する場合は該制限酵素切断
端と相補性の端部を上流側に形成させた外来性遺伝子を
用意してこれを上記切断端においてシグナル・ペプチド
遺伝子と結合させることによってシグナル会ペプチド遺
伝子の下流側に外来性遺伝子を直結させることができる
。
すれば、その切断部位がシグナル・ペプチド遺伝子ＤＮ
Ａの下流側末端に接して存在する場合は該制限酵素切断
端と相補性の端部を上流側に形成させた外来性遺伝子を
用意してこれを上記切断端においてシグナル・ペプチド
遺伝子と結合させることによってシグナル会ペプチド遺
伝子の下流側に外来性遺伝子を直結させることができる
。
シグナル・ペプチド遺伝子の切断部位が該遺伝子の下流
側末端よシ上流側に存在する場合は、該遺伝子の該切断
部位よυ下流側の部分を合成して外来性遺伝子の上流側
に結合した断片を用意して上記と同じに結合を行なえば
、一旦切断されたシグナル噛ペプチド遺伝子がＤＮＡの
測鎖について復元されると共にその下流側に外来性遺伝
子が直結された構造が実現される。
側末端よシ上流側に存在する場合は、該遺伝子の該切断
部位よυ下流側の部分を合成して外来性遺伝子の上流側
に結合した断片を用意して上記と同じに結合を行なえば
、一旦切断されたシグナル噛ペプチド遺伝子がＤＮＡの
測鎖について復元されると共にその下流側に外来性遺伝
子が直結された構造が実現される。
本発明者によるＤＮＡ遺伝子は、適当なプラスミドやフ
ァージに組み込んでベクターとして利用することによっ
て前記の問題点を回避することができ、宿主菌に組み込
んで所望の蛋白質を産生させるに際して下記のような利
点を有するものであるＯ （イ）産生物質の精製が簡単である。従来は、宿主菌の
生育を行なって、適当な時期に宿主全体をつぶして菌が
本来持つ雑多な物質め中から目的とする有用物質を抽出
精製していたため、多大な労力が必要であるうえ、物質
によりては精製困難なことがあった。本発明のＤＮＡ遺
伝子を利用したベクターを用いれば、産生される蛋白は
菌体外に分泌され、菌の生育培地はその構成成分が判っ
ているのであるから、培地からの目的物質分泌の確認、
回収が容易となるであろう。
ァージに組み込んでベクターとして利用することによっ
て前記の問題点を回避することができ、宿主菌に組み込
んで所望の蛋白質を産生させるに際して下記のような利
点を有するものであるＯ （イ）産生物質の精製が簡単である。従来は、宿主菌の
生育を行なって、適当な時期に宿主全体をつぶして菌が
本来持つ雑多な物質め中から目的とする有用物質を抽出
精製していたため、多大な労力が必要であるうえ、物質
によりては精製困難なことがあった。本発明のＤＮＡ遺
伝子を利用したベクターを用いれば、産生される蛋白は
菌体外に分泌され、菌の生育培地はその構成成分が判っ
ているのであるから、培地からの目的物質分泌の確認、
回収が容易となるであろう。
（ロ）産生物質がペプチダーゼによる分解から保護され
る。すなわち、菌体内には多くのペプチダーゼ（プロテ
アーゼ）が存在するので不必要な蛋白は速やかに水解さ
れてゆくが、本発明によって目的の有用蛋白質を菌体内
に留めることなく直ちに菌体外へ分泌させれば、この目
的蛋白は上記の水解ｆ？−素から保護されることになる
であφう。
る。すなわち、菌体内には多くのペプチダーゼ（プロテ
アーゼ）が存在するので不必要な蛋白は速やかに水解さ
れてゆくが、本発明によって目的の有用蛋白質を菌体内
に留めることなく直ちに菌体外へ分泌させれば、この目
的蛋白は上記の水解ｆ？−素から保護されることになる
であφう。
（ハ）如何なる外来性蛋白でも発現可能である。すなわ
ち、従来の雑種蛋白法では、目的とする蛋白を純粋に得
るためにたとえばメチオニンに特異的な臭化シアン処理
（５ｃｉｅｎｃｅ 、 ／Ｐｌ！’ 、 １０！＆（／
り７７））によって余分な蛋白を切断したり、リジンや
アルギニンに特異的なトリプシン消化（Ｎａｔｕｒｅ
、 ２ｒ！；、ｔＡｊＡ（／９ざ０））を行なう場合に
は、目的とする蛋白のアミノ酸組成中にこれらのアミノ
酸が含まれているときはそこでも切断が生じるため完全
な形で所望の蛋白を得ることができず、一方直接発現法
（Ｎａｔｕｒｅ Ｘ２１１、ｊｕ弘（ｌり７り））によ
って蛋白を産生させる場合には、遺伝子Ｎ末端には開始
コドン（メチオニン）が必要であって産生蛋白もＮ末端
にメチオニンが付いたものとして得られるものもあり（
特開昭３６−１．１３ワタ号公報参照）、このような末
端のメチオニンは臭化シアン処理によシ分解除去するこ
とが技術的ＶＣ難しいので、結局産生させた蛋白は天然
のものとは異質のものとなる。これに対して、本発明に
よるＤＮＡ遺伝子をベクターとして外来性遺伝子を宿主
菌内で発現させると、いったんシグナル・ペプチドとの
融合ないし雑種蛋白として産生された蛋白は宿主菌内の
シグナル・ペプチダーゼによって特異的にシグナル・ペ
プチダーゼ部分が切断されて、所望組成の成熟蛋白とな
って宿主菌細胞外へ分泌されることになるであろう。
ち、従来の雑種蛋白法では、目的とする蛋白を純粋に得
るためにたとえばメチオニンに特異的な臭化シアン処理
（５ｃｉｅｎｃｅ 、 ／Ｐｌ！’ 、 １０！＆（／
り７７））によって余分な蛋白を切断したり、リジンや
アルギニンに特異的なトリプシン消化（Ｎａｔｕｒｅ
、 ２ｒ！；、ｔＡｊＡ（／９ざ０））を行なう場合に
は、目的とする蛋白のアミノ酸組成中にこれらのアミノ
酸が含まれているときはそこでも切断が生じるため完全
な形で所望の蛋白を得ることができず、一方直接発現法
（Ｎａｔｕｒｅ Ｘ２１１、ｊｕ弘（ｌり７り））によ
って蛋白を産生させる場合には、遺伝子Ｎ末端には開始
コドン（メチオニン）が必要であって産生蛋白もＮ末端
にメチオニンが付いたものとして得られるものもあり（
特開昭３６−１．１３ワタ号公報参照）、このような末
端のメチオニンは臭化シアン処理によシ分解除去するこ
とが技術的ＶＣ難しいので、結局産生させた蛋白は天然
のものとは異質のものとなる。これに対して、本発明に
よるＤＮＡ遺伝子をベクターとして外来性遺伝子を宿主
菌内で発現させると、いったんシグナル・ペプチドとの
融合ないし雑種蛋白として産生された蛋白は宿主菌内の
シグナル・ペプチダーゼによって特異的にシグナル・ペ
プチダーゼ部分が切断されて、所望組成の成熟蛋白とな
って宿主菌細胞外へ分泌されることになるであろう。
３、発明の詳細な説明
ＤＮＡ遺伝子
本発明によるシグナル響ペプチドをコードする遺伝子に
対応するＤＮＡ部分を含む遺伝子（本明細書、特に以下
の説明において、［シグナル・ペプチドをコードする遺
伝子に対応するＤＮＡＪを、［シグナル・ペプチド遺伝
子ＤＮＡＪと込５）は、前記のように、このＤＮＡに人
工的に創出された制限酵素認識部位を７個所有するもの
である。そして、この制限酵素認識部位は、このＤＮＡ
の塩基対の少なくとも一つを構成員の少なくとも一部と
するものである。
対応するＤＮＡ部分を含む遺伝子（本明細書、特に以下
の説明において、［シグナル・ペプチドをコードする遺
伝子に対応するＤＮＡＪを、［シグナル・ペプチド遺伝
子ＤＮＡＪと込５）は、前記のように、このＤＮＡに人
工的に創出された制限酵素認識部位を７個所有するもの
である。そして、この制限酵素認識部位は、このＤＮＡ
の塩基対の少なくとも一つを構成員の少なくとも一部と
するものである。
このように定義される本発明によるＤＮＡ遺伝子の一具
体例は、第１図に示した通υである。この具体例は、シ
グナル０ペプチド遺伝子ＤＮＡ部分（１１とその下流側
に結合されたＤＮＡ部分（２）とからなっているが、本
発明でいう「シグナル・ぺ、ブチドをコードする遺伝子
に対応するＤＮＡ部分を含むＤＮＡ遺伝子」は、このＤ
ＮＡ部分子ｉｌから少なくともなっていればよい。なお
、本発明におしてＤＮＡに関して「下流側」というとき
は、！′→３′鎖（ｅ鎖）を上に３′←ｊ′鎚（θ鎖）
を下に表示したときの右側を意味する。
体例は、第１図に示した通υである。この具体例は、シ
グナル０ペプチド遺伝子ＤＮＡ部分（１１とその下流側
に結合されたＤＮＡ部分（２）とからなっているが、本
発明でいう「シグナル・ぺ、ブチドをコードする遺伝子
に対応するＤＮＡ部分を含むＤＮＡ遺伝子」は、このＤ
ＮＡ部分子ｉｌから少なくともなっていればよい。なお
、本発明におしてＤＮＡに関して「下流側」というとき
は、！′→３′鎖（ｅ鎖）を上に３′←ｊ′鎚（θ鎖）
を下に表示したときの右側を意味する。
第１図は、二本鎖ＤＮＡからなるＤＮＡ遺伝子の一部を
示すものであって、Ａ；Ｇ；ＣおよびＴはそれぞれアデ
ニン、グアニン、シト７ンおよびチミンを示し、Ｌ）’
ｓ 、 ＡｌａおよびＴｒｐはそれぞれリジン、アラニ
ンおよびトリプトファンを示す。
示すものであって、Ａ；Ｇ；ＣおよびＴはそれぞれアデ
ニン、グアニン、シト７ンおよびチミンを示し、Ｌ）’
ｓ 、 ＡｌａおよびＴｒｐはそれぞれリジン、アラニ
ンおよびトリプトファンを示す。
この二本鎖ＤＮＡの区域（１１はシグナル−ペプチド遺
伝子ＤＮＡ部分であシ、区域（３）は制限酵素Ｈｉ ｎ
ｄ■の認識部位であり、破線はＨ１ｎｄｍ切断部位であ
る。区域（２）は、シグナル・ペプチド遺伝子ＤＮＡの
下流側の直後に結合されたＤＮＡ部分である。
伝子ＤＮＡ部分であシ、区域（３）は制限酵素Ｈｉ ｎ
ｄ■の認識部位であり、破線はＨ１ｎｄｍ切断部位であ
る。区域（２）は、シグナル・ペプチド遺伝子ＤＮＡの
下流側の直後に結合されたＤＮＡ部分である。
本発明の好ましい具体例は、シグナル・ペプチド遺伝子
ＤＮＡがアルカリ性フォスファターゼ由来であるもので
ある。このＤＮＡは、下流側末端のアラニンのコドンが
ＧＣＣである。
ＤＮＡがアルカリ性フォスファターゼ由来であるもので
ある。このＤＮＡは、下流側末端のアラニンのコドンが
ＧＣＣである。
第１図のＤＮＡ遺伝子は、従っプ１アルカリ性フォスフ
ァターゼ由来の遺伝子ＤＮＡの部分＋１１の下流側末端
のアラニンのコドンＧＣＣをＧＣＴに、さらに続く塩基
ＣをＴに改変したものに相当する。
ァターゼ由来の遺伝子ＤＮＡの部分＋１１の下流側末端
のアラニンのコドンＧＣＣをＧＣＴに、さらに続く塩基
ＣをＴに改変したものに相当する。
アラニンのコドンには縮重があるから、改変後のＧＣＴ
もアラニンのコドンであり、従って第１図のＤＮＡ部分
＋１１は依然としてアルカリフォスファターゼ由来のシ
グナル・ペプチドをコードする遺伝子に対応するＤＮＡ
である。
もアラニンのコドンであり、従って第１図のＤＮＡ部分
＋１１は依然としてアルカリフォスファターゼ由来のシ
グナル・ペプチドをコードする遺伝子に対応するＤＮＡ
である。
ところで、アルカリフォスファターゼ由来のシグナル・
ペプチド遺伝子ＤＮＡは、その下流側末端のアラニンの
コドンの上流側にリジンのコドンＡＡＡおよび下流側に
アルギニンのコドンＣＧＧを有する。
ペプチド遺伝子ＤＮＡは、その下流側末端のアラニンの
コドンの上流側にリジンのコドンＡＡＡおよび下流側に
アルギニンのコドンＣＧＧを有する。
従って、アルカリフォスファターゼ由来のシグナル・ペ
プチド遺伝子ＤＮＡが本来有していた下流側末端のアラ
ニンのコドンＧＣＣをＧＣＴに改変し、さらにアラニン
に続く塩基ＣをＴに改変したことによって、この末端の
塩基対と、上流側の弘塩基対および下流側のｌ塩基対と
で制限酵素Ｈ１ｎｄｍの認識部位１３１ Ａ Ａ Ｇ
ＣＴ Ｔが現出している。
プチド遺伝子ＤＮＡが本来有していた下流側末端のアラ
ニンのコドンＧＣＣをＧＣＴに改変し、さらにアラニン
に続く塩基ＣをＴに改変したことによって、この末端の
塩基対と、上流側の弘塩基対および下流側のｌ塩基対と
で制限酵素Ｈ１ｎｄｍの認識部位１３１ Ａ Ａ Ｇ
ＣＴ Ｔが現出している。
すなわち、シグナル−ペプチド遺伝子ＤＮＡには、又少
なくとも該末端の塩基対を構成員の少なくとも一部とす
る制限酵素認識部位が創口されている訳である。
なくとも該末端の塩基対を構成員の少なくとも一部とす
る制限酵素認識部位が創口されている訳である。
第１図の具体例では、Ｈｉｎｄｍの認識部位（３）内の
切断部位は破線で示した通υであって、その位置はシグ
ナル・ペプチド遺伝子ＤＮＡとその下流側直後に結合さ
れていることあるべきＤＮＡ部分（第１図では、既に結
合されている区域（２））との間に存在している（切断
部位の位置は、二本鎖ＤＮＡの下流側のそれを意味する
）。制限酵素切断部位がこのような位置に存在すること
は、本発明において最も好ましいことである。何故なら
ば、この切断部位はそれを利用して外来遺伝子（に対応
するＤＮＡ ）をこのシグナル響ペプチドをコードする
遺伝子（に対応するＤＮＡ）に直結するためのものであ
シ、一方この雑種遺伝子が発現して生じる雑種な込し融
合蛋白はシグナル・ペプチドとそれに続く蛋白との間で
シグナル・ペプチダーゼによって切断されるのであるか
ら、制限酵素切断部位とシグナル・ペプチダーゼ切断位
置とがこのよりに一致していれば、第１図の例でいえば
外来遺伝子（この例では、ＴｒｐのコドンＴＧＧで始ま
っている）の■鎖の！′−側にＡＧＣＴを補なっておく
だけで、ＨＩｎｄ ｍ消化後のシグナル−ペプチド遺伝
子の粘着末端との間の結合が可能だからである。なお、
外来性遺伝子のｅ鎖の３′−側にも塩基を補な５ことを
厭わなければ、制限酵素切断部位が上流側に存在しても
よいことはいうまでもなく、そのような切断部位の存在
もまた本発明の範囲内である。
切断部位は破線で示した通υであって、その位置はシグ
ナル・ペプチド遺伝子ＤＮＡとその下流側直後に結合さ
れていることあるべきＤＮＡ部分（第１図では、既に結
合されている区域（２））との間に存在している（切断
部位の位置は、二本鎖ＤＮＡの下流側のそれを意味する
）。制限酵素切断部位がこのような位置に存在すること
は、本発明において最も好ましいことである。何故なら
ば、この切断部位はそれを利用して外来遺伝子（に対応
するＤＮＡ ）をこのシグナル響ペプチドをコードする
遺伝子（に対応するＤＮＡ）に直結するためのものであ
シ、一方この雑種遺伝子が発現して生じる雑種な込し融
合蛋白はシグナル・ペプチドとそれに続く蛋白との間で
シグナル・ペプチダーゼによって切断されるのであるか
ら、制限酵素切断部位とシグナル・ペプチダーゼ切断位
置とがこのよりに一致していれば、第１図の例でいえば
外来遺伝子（この例では、ＴｒｐのコドンＴＧＧで始ま
っている）の■鎖の！′−側にＡＧＣＴを補なっておく
だけで、ＨＩｎｄ ｍ消化後のシグナル−ペプチド遺伝
子の粘着末端との間の結合が可能だからである。なお、
外来性遺伝子のｅ鎖の３′−側にも塩基を補な５ことを
厭わなければ、制限酵素切断部位が上流側に存在しても
よいことはいうまでもなく、そのような切断部位の存在
もまた本発明の範囲内である。
本発明のＤＮＡ遺伝子での重要な成分である［シグナル
響ペプチドをコードする遺伝子に対応するＤＮＡＪは、
シグナル・ペプチドの種類に応じて各種の塩基配列のも
のがあシうる。シグナル・ペプチドの具体例をいくつか
挙げれば、β−ラクタマーゼのもの（Ｐｒｏｃ、 Ｎ５
ｔｌ、 Ａｃａｄ、Ｓｅｌ、 Ｕ、 Ｓ。
響ペプチドをコードする遺伝子に対応するＤＮＡＪは、
シグナル・ペプチドの種類に応じて各種の塩基配列のも
のがあシうる。シグナル・ペプチドの具体例をいくつか
挙げれば、β−ラクタマーゼのもの（Ｐｒｏｃ、 Ｎ５
ｔｌ、 Ａｃａｄ、Ｓｅｌ、 Ｕ、 Ｓ。
Ａｏ、互、３ｙ３ｙ （／り７ｒ））、リボ蛋白のもの
（ｉｂｉｄ Ｘ芒、１００≠（ｌり７７））、アルカリ
性フォスファターゼのもの（Ｅｕｒ、 Ｊ、Ｂｉｏｃｂ
ｅｍ、、径、４′９（／り７り））等力する。シグナル
・ペプチドについては、「蛋白質・核酸・酵素」臨時増
刊号（「遺伝子操作」）、第３巻、第グ号、第３♂／、
−３２を頁、を参照することができる。本発明では、こ
れらの天然物由来のものならびｋその塩基配列に従って
合成したＤＮＡのいずれをも使用することができる（前
者が好ましい）。
（ｉｂｉｄ Ｘ芒、１００≠（ｌり７７））、アルカリ
性フォスファターゼのもの（Ｅｕｒ、 Ｊ、Ｂｉｏｃｂ
ｅｍ、、径、４′９（／り７り））等力する。シグナル
・ペプチドについては、「蛋白質・核酸・酵素」臨時増
刊号（「遺伝子操作」）、第３巻、第グ号、第３♂／、
−３２を頁、を参照することができる。本発明では、こ
れらの天然物由来のものならびｋその塩基配列に従って
合成したＤＮＡのいずれをも使用することができる（前
者が好ましい）。
本発明で使用するのに好ましいシグナル・ペプチド遺伝
子ＤＮＡは、アルカリ性フオスファ！−ゼの塩基配列の
もの、特にアルカリ性フォスファターゼ由来のもの、で
ある。第１図について前記したような利点が得られるか
らである。
子ＤＮＡは、アルカリ性フオスファ！−ゼの塩基配列の
もの、特にアルカリ性フォスファターゼ由来のもの、で
ある。第１図について前記したような利点が得られるか
らである。
第１図に示した本発明ＤＮＡ遺伝子の一具体例は、アル
カリ性フォスファターゼ由来のＤＮＡを改変して（詳細
後記）つくったものであるから、シグナルペプチド遺伝
子ＤＮＡの部分＋１１の下流側末端直後にアルカリ性フ
ォスファターゼ由来のＤＮＡ部分（２）が結合している
。本発明によるＤＮＡ遺伝子の他の具体例は、このＤＮ
Ａ部分（２）が外来性蛋白をコードする遺伝子に対則す
るＤＮＡ部分であるものである。制限酵素切断部位を導
入した目的からいって、ＤＮＡ部分（２）が外来性遺伝
子由来のものである具体例の方が本発明の趣旨に沿った
具体例であるということができる。
カリ性フォスファターゼ由来のＤＮＡを改変して（詳細
後記）つくったものであるから、シグナルペプチド遺伝
子ＤＮＡの部分＋１１の下流側末端直後にアルカリ性フ
ォスファターゼ由来のＤＮＡ部分（２）が結合している
。本発明によるＤＮＡ遺伝子の他の具体例は、このＤＮ
Ａ部分（２）が外来性蛋白をコードする遺伝子に対則す
るＤＮＡ部分であるものである。制限酵素切断部位を導
入した目的からいって、ＤＮＡ部分（２）が外来性遺伝
子由来のものである具体例の方が本発明の趣旨に沿った
具体例であるということができる。
この後者の具体例の範曙に属する本発明ＤＮＡ遺伝子の
一例は、シグナル・ペプチド遺伝子ＤＮＡ部分が天然物
由来の部分と合成された部分とからなるものである。す
なわち、制限酵素切断部位より上流側が天然物由来の部
分であり、下流側が合成されたものである。この場合の
下流側の合成された部分は第１図に示したような切断部
位の位置の場合には■鎖の≠塩基（ＡＧＣＴ ）である
が、切断位置がこれより上流側に存在すればｅ鎖にも合
成部分が必要となることはいうまでもな−。
一例は、シグナル・ペプチド遺伝子ＤＮＡ部分が天然物
由来の部分と合成された部分とからなるものである。す
なわち、制限酵素切断部位より上流側が天然物由来の部
分であり、下流側が合成されたものである。この場合の
下流側の合成された部分は第１図に示したような切断部
位の位置の場合には■鎖の≠塩基（ＡＧＣＴ ）である
が、切断位置がこれより上流側に存在すればｅ鎖にも合
成部分が必要となることはいうまでもな−。
ＤＮＡ遺伝子の製造
本発明によるシグナル・ペプチド遺伝子ＤＮＡを含むＤ
ＮＡ遺伝子の製造法は、下記の工程からなる。
ＮＡ遺伝子の製造法は、下記の工程からなる。
（ａ） シグナル・ペプチドをコードする遺伝子に対応
するＤＮＡ部分を含むＤＮＡ遺伝子を用意すること。
するＤＮＡ部分を含むＤＮＡ遺伝子を用意すること。
（ｂ） このＤＮＡ’部分の塩基配列を、この塩基配列
に対応するアミノ酸配列を変化させずに改変して、シグ
ナル・ペプチドをコードする遺伝子に対応するＤＮＡの
塩基対の少なくとも一つを構成員の少なくとも一部とす
る制限酵素認識部位を創出すること。
に対応するアミノ酸配列を変化させずに改変して、シグ
ナル・ペプチドをコードする遺伝子に対応するＤＮＡの
塩基対の少なくとも一つを構成員の少なくとも一部とす
る制限酵素認識部位を創出すること。
すなわち、本発明によるＤＮＡ遺伝子の製造法は所与の
ＤＮＡ遺伝子の改変法として捉えることもできる。
ＤＮＡ遺伝子の改変法として捉えることもできる。
前記のように、本発明の趣旨に沿ったＤＮＡ遺伝子は、
シグナルペプチド遺伝子の下流側直後に外来性遺伝子由
来のＤＮＡ部分を有するものである。
シグナルペプチド遺伝子の下流側直後に外来性遺伝子由
来のＤＮＡ部分を有するものである。
このようなりＮＡ遺伝子は、上記のようにして製造され
るＤＮＡ遺伝子に対してさらに下記の工程（Ｃ１〜ｔｅ
ｌを実施することによって製造することができる。
るＤＮＡ遺伝子に対してさらに下記の工程（Ｃ１〜ｔｅ
ｌを実施することによって製造することができる。
（Ｃ１・’ＢＩＪ出された制限酵素認識部位内の制限酵
素切断部位を該制限酵素で切断して、シグナル・ペプチ
ドをコードする遺伝子に対応するＤＮＡの該切断部より
上流側の部分からなり、かつ下流側に該制限酵素切断端
を有するＤＮＡ断片をつくること、 Ｔｄｌ シグナル・ペプチドをコードする遺伝子に対応
するＤＮＡ部分の制限酵素切断部位の下流側に存在して
いることあるべきＤＮＡと該存在していることあるべき
ＤＮＡ、の下流側直後に存在する外来性蛋白をコードす
る遺伝子に対応するＤＮＡとからなり、上流側および下
流側に前記制限酵素切断端を有するＤＮＡ断片を用意す
ること、（ｅｌ 前記（Ｃ１によるＤＮＡ断片と前記（
ｄｌによるＤＮＡ断片とを制限酵素切断端で結合させて
、シグナルペプチドをコードする遺伝子に対応するＤＮ
Ａ部分とその下流側に直結した外来性蛋白をコードする
遺伝子に対応するＤＮＡ部分とを含むＤＮＡ遺伝子を得
ること。
素切断部位を該制限酵素で切断して、シグナル・ペプチ
ドをコードする遺伝子に対応するＤＮＡの該切断部より
上流側の部分からなり、かつ下流側に該制限酵素切断端
を有するＤＮＡ断片をつくること、 Ｔｄｌ シグナル・ペプチドをコードする遺伝子に対応
するＤＮＡ部分の制限酵素切断部位の下流側に存在して
いることあるべきＤＮＡと該存在していることあるべき
ＤＮＡ、の下流側直後に存在する外来性蛋白をコードす
る遺伝子に対応するＤＮＡとからなり、上流側および下
流側に前記制限酵素切断端を有するＤＮＡ断片を用意す
ること、（ｅｌ 前記（Ｃ１によるＤＮＡ断片と前記（
ｄｌによるＤＮＡ断片とを制限酵素切断端で結合させて
、シグナルペプチドをコードする遺伝子に対応するＤＮ
Ａ部分とその下流側に直結した外来性蛋白をコードする
遺伝子に対応するＤＮＡ部分とを含むＤＮＡ遺伝子を得
ること。
、 ゛ →Ｆト七（→し←る÷
本発明に従ってシグナル・ペプチド遺伝子ＤＮＡの、ま
た必要に応じてシグナル・ペプチドよシ下流の遺伝子Ｄ
ＮＡの、塩基対を少なくとも一つ改変してその上流およ
び（または）下流側の塩基対と共に制限酵素認識部位を
創出するには、合目的的な任意の方法によることができ
る。
た必要に応じてシグナル・ペプチドよシ下流の遺伝子Ｄ
ＮＡの、塩基対を少なくとも一つ改変してその上流およ
び（または）下流側の塩基対と共に制限酵素認識部位を
創出するには、合目的的な任意の方法によることができ
る。
塩基配列の改変方法としては、合成フラグメントな用い
た点突然変異法、突然変異訪起剤（Ｘ線、Ｍ外紳、Ｎ−
ｉチル−Ｎ’−二トローＮ−ニトロソグアニジン等）を
用いる方法、亜硫酸イオンまたは亜硝酸イオンを用いて
突然変異を起させる方法および任意に合成した遺伝子と
の置換による方法等が考えられるが、所望のＤＮＡ遺伝
子を得るに際し操作が簡単でかつ確実な方法としては合
成フラグメントな用いた点突然変異法（５ｃｉｅｎｃｅ
Ｘ２９．１９、Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ （／りｒｅ））
が好ましい。
た点突然変異法、突然変異訪起剤（Ｘ線、Ｍ外紳、Ｎ−
ｉチル−Ｎ’−二トローＮ−ニトロソグアニジン等）を
用いる方法、亜硫酸イオンまたは亜硝酸イオンを用いて
突然変異を起させる方法および任意に合成した遺伝子と
の置換による方法等が考えられるが、所望のＤＮＡ遺伝
子を得るに際し操作が簡単でかつ確実な方法としては合
成フラグメントな用いた点突然変異法（５ｃｉｅｎｃｅ
Ｘ２９．１９、Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ （／りｒｅ））
が好ましい。
塩基配列の改変の要点は、既存のシグナル・ペプチド内
のアミノ酸配列を変えることなく制限酵素認識部位を創
出することである。制限酵素切断部位の下流側のものは
シグナル・ペプチドをコードする遺伝子内にあυかつで
きるだけシグナル・ペプチドのシグナル・ペプチダーゼ
による切断点に近いことが好ましく、さらに好ましいの
はその解裂部位がシグナル・ペプチドの切断点と一致す
ることであることは前記したところである。最も好まし
い一実施態様は、第１図に示すように、アルカリ性フォ
スファターゼのシグナル・ペプチドをコードする塩基配
列＋１１の下流側末端コドンＧＣＣをＧＣＴに（ともに
アラニンをコードする塩基配列なのでこの配列の改変に
よってはシグナル・ペプチドのアミノ酸配列は変化しな
い）改変し、さらに、シグナル・ペプチドの遺伝子（１
）の１個下流側の塩基ＣをＴに改変することにより制限
酵素Ｈ１ｎｄＩＩＩ認識部位を創出することである。こ
の場合は、シグナル・ペプチドの切断点（矢印（４））
と制限酵素切断部位と（破線）が一致する。従って、シ
グナル・ペプチドの直後に構造遺伝子の結合が可能とな
る。この場合は制限酵素解裂部位は粘着末端となるが、
所望の外来性遺伝子にＡＧＣＴという粘着末端を持たせ
ればシグナル・ペプチド°と外来性蛋白質が直結した融
合蛋白となシ上記の目的を達成することができることは
前記したところである。
のアミノ酸配列を変えることなく制限酵素認識部位を創
出することである。制限酵素切断部位の下流側のものは
シグナル・ペプチドをコードする遺伝子内にあυかつで
きるだけシグナル・ペプチドのシグナル・ペプチダーゼ
による切断点に近いことが好ましく、さらに好ましいの
はその解裂部位がシグナル・ペプチドの切断点と一致す
ることであることは前記したところである。最も好まし
い一実施態様は、第１図に示すように、アルカリ性フォ
スファターゼのシグナル・ペプチドをコードする塩基配
列＋１１の下流側末端コドンＧＣＣをＧＣＴに（ともに
アラニンをコードする塩基配列なのでこの配列の改変に
よってはシグナル・ペプチドのアミノ酸配列は変化しな
い）改変し、さらに、シグナル・ペプチドの遺伝子（１
）の１個下流側の塩基ＣをＴに改変することにより制限
酵素Ｈ１ｎｄＩＩＩ認識部位を創出することである。こ
の場合は、シグナル・ペプチドの切断点（矢印（４））
と制限酵素切断部位と（破線）が一致する。従って、シ
グナル・ペプチドの直後に構造遺伝子の結合が可能とな
る。この場合は制限酵素解裂部位は粘着末端となるが、
所望の外来性遺伝子にＡＧＣＴという粘着末端を持たせ
ればシグナル・ペプチド°と外来性蛋白質が直結した融
合蛋白となシ上記の目的を達成することができることは
前記したところである。
ＤＮＡ遺伝子の利用
本発明のＤＮＡ遺伝子は、所望の外来性の構造遺伝子を
結合させた形で、必要な場合にはプロモーターの下流の
適当な位置でプラスミドまたはファージに挿入して、ベ
クターとして利用することができる。このようなベクタ
ーに組込んだ外来性遺伝子を宿主菌たとえば大腸菌に導
入して、宿主菌を培養すれば、外来性遺伝子の発現によ
って生じた蛋白はシグナルのペプチドの作用によって菌
体外に分泌されるであろう。本発明による遺伝子ＤＮＡ
のこのような利用は、組換ＤＮＡ技術に関する底置や文
献をか照して適当に行なうことができることはいう壕で
もない。
結合させた形で、必要な場合にはプロモーターの下流の
適当な位置でプラスミドまたはファージに挿入して、ベ
クターとして利用することができる。このようなベクタ
ーに組込んだ外来性遺伝子を宿主菌たとえば大腸菌に導
入して、宿主菌を培養すれば、外来性遺伝子の発現によ
って生じた蛋白はシグナルのペプチドの作用によって菌
体外に分泌されるであろう。本発明による遺伝子ＤＮＡ
のこのような利用は、組換ＤＮＡ技術に関する底置や文
献をか照して適当に行なうことができることはいう壕で
もない。
本発明によるＤＮＡ遺伝子の具体的な利用態様の一つは
、ベクターとして使５べきプラスミドとしてのそれであ
る。このプラスミドは、アルカリ性フォスファターゼ由
来の制御領域に対応するＤＮＡ部分とこの領域の制御下
にあるアルカリ性フォスファターゼ由来のシグナル・ペ
プチド遺伝子ＤＮＡ部分とを含むものであシ、このシグ
ナルΦペプチド遺伝子ＤＮＡ部分が下記によって定義さ
れるものである。
、ベクターとして使５べきプラスミドとしてのそれであ
る。このプラスミドは、アルカリ性フォスファターゼ由
来の制御領域に対応するＤＮＡ部分とこの領域の制御下
にあるアルカリ性フォスファターゼ由来のシグナル・ペ
プチド遺伝子ＤＮＡ部分とを含むものであシ、このシグ
ナルΦペプチド遺伝子ＤＮＡ部分が下記によって定義さ
れるものである。
（イ） このＤＮＡ部分には、その塩基対の少なくとも
一つを構成員の少なくとも一部とする制限酵素解裂部位
が人工的に創出されていること０←） この制限酵素認
識部位内の制限酵素切断部位がシグナル・ペプチドをコ
ードする遺伝子に対応するＤＮＡ部分とその直後に結合
されて−ることあるべきＤＮＡ部分との境界に存在する
こと。
一つを構成員の少なくとも一部とする制限酵素解裂部位
が人工的に創出されていること０←） この制限酵素認
識部位内の制限酵素切断部位がシグナル・ペプチドをコ
ードする遺伝子に対応するＤＮＡ部分とその直後に結合
されて−ることあるべきＤＮＡ部分との境界に存在する
こと。
すなわち、このプラスミドは、前記の本発明の好ましい
ＤＮＡ遺伝子をアルカリ性フォスファターゼの制御領域
を有するプラスミドに組込み、該遺伝子を該領域の制御
下にあるようにして宿主菌と共に増殖しうるようにした
ものである。
ＤＮＡ遺伝子をアルカリ性フォスファターゼの制御領域
を有するプラスミドに組込み、該遺伝子を該領域の制御
下にあるようにして宿主菌と共に増殖しうるようにした
ものである。
このプラスミドの具体例は、プラスミドｐＹＫ２♂３〔
このプラスミドは、これを含んだ大腸菌Ｋ１１ｃＡＯθ
、すなわちＥ、 ｃｏｌｔ Ｋ／、２ ｃ ＡＯＯ（ｐ
ＹＫ２１３ ） 、として微工研に寄託されている（微
工研菌寄第７０７２号）〕のシグナルｅペプチドをコー
ドする遺伝子に対応するＤＮＡ部分の下流側末端コドン
およびその下流側に直結したＤＮＡ’ＩＩＳ分の最初の
コドンが第７図に示した通電のものであるものである。
このプラスミドは、これを含んだ大腸菌Ｋ１１ｃＡＯθ
、すなわちＥ、 ｃｏｌｔ Ｋ／、２ ｃ ＡＯＯ（ｐ
ＹＫ２１３ ） 、として微工研に寄託されている（微
工研菌寄第７０７２号）〕のシグナルｅペプチドをコー
ドする遺伝子に対応するＤＮＡ部分の下流側末端コドン
およびその下流側に直結したＤＮＡ’ＩＩＳ分の最初の
コドンが第７図に示した通電のものであるものである。
なお、Ｅ、 ｃａｌｆ Ｋ／、２ ｃ Ａｏｏ （ｐＹ
Ｋ２と３）の菌学的性質はｐＹＫ２１３に由来するもの
を除けば宿主菌Ｅ、 ｃｏｉｌ Ｋ／ｊ ｃ ６００の
それと同じであり、またその具体的性質のいくつかは徴
工研寄託菌に添付された文書に記載されている。
Ｋ２と３）の菌学的性質はｐＹＫ２１３に由来するもの
を除けば宿主菌Ｅ、 ｃｏｉｌ Ｋ／ｊ ｃ ６００の
それと同じであり、またその具体的性質のいくつかは徴
工研寄託菌に添付された文書に記載されている。
プラスミドｐＴＡ ！；２りは、第２図に示した方法に
よってつくることができる。なお、第２図以外の方法も
ありうるし、またｐＴＡ夕λり以外の本発明ＤＮＡ遺伝
子組込みプラスミドと同様につ〈シラることもい５まで
もない。さて、第２図において、プラスミドｐＹＫ 、
２ｒ３（■）をエチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ ）存
在下で制限酵素ＥａｏＲＩ 処理に附してニックＤＮＡ
（■のよ５に二本鎖環状ＤＮＡで一部が解裂している
もの）とし、これにエキソヌクレアーゼ■処理を行なっ
て一本ｌＤＮＡとする（■）。次に、この一本領ＤＮＡ
に対し、あらかじめ合成しておいた点突然変異を誘発さ
せるための合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして
用い（■）、ＤＮＡポリメラーゼＩを作用させて二本鎖
ＤＮＡとし、さらにＤＮＡリガーゼ（Ｔ≠ＤＮＡリガー
ゼ）を作用させてヘテロジューブレックスＤＮＡ （■
）を得る。次に、このヘテロシー−プレ／ジスＤＮＡを
クシーナーの方法（Ｇｅｎｅｎｔｌｃ Ｅｎｇｌｎｅｅ
ｒｌｎｇ 、 ７９７ｇ−１／７（／７７ｇ） ）に従
って大腸菌に／ユｃ ４００に導入して宿主の形質転換
を行ない、アンピシリン耐性となった株を得る（■）。
よってつくることができる。なお、第２図以外の方法も
ありうるし、またｐＴＡ夕λり以外の本発明ＤＮＡ遺伝
子組込みプラスミドと同様につ〈シラることもい５まで
もない。さて、第２図において、プラスミドｐＹＫ 、
２ｒ３（■）をエチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ ）存
在下で制限酵素ＥａｏＲＩ 処理に附してニックＤＮＡ
（■のよ５に二本鎖環状ＤＮＡで一部が解裂している
もの）とし、これにエキソヌクレアーゼ■処理を行なっ
て一本ｌＤＮＡとする（■）。次に、この一本領ＤＮＡ
に対し、あらかじめ合成しておいた点突然変異を誘発さ
せるための合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして
用い（■）、ＤＮＡポリメラーゼＩを作用させて二本鎖
ＤＮＡとし、さらにＤＮＡリガーゼ（Ｔ≠ＤＮＡリガー
ゼ）を作用させてヘテロジューブレックスＤＮＡ （■
）を得る。次に、このヘテロシー−プレ／ジスＤＮＡを
クシーナーの方法（Ｇｅｎｅｎｔｌｃ Ｅｎｇｌｎｅｅ
ｒｌｎｇ 、 ７９７ｇ−１／７（／７７ｇ） ）に従
って大腸菌に／ユｃ ４００に導入して宿主の形質転換
を行ない、アンピシリン耐性となった株を得る（■）。
コノ株のうちから、コロニーノーイプリダイゼーシ画ン
（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 、
Ａｌｌ、３７り（Ａｃａｄｅｍｔｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎ
ｃ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （／り７り）））を行なって、
目的とする変異株を得る。最後に、この株からプラスミ
ドを抽出し、目的とする配列になったかどうかをマキサ
ムーギルノ（−ト法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｌｎ Ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ Ｘ Ｖｏｌｊｊ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
１ｄＰａｒｔＩ、４’タタ〜り乙θ （ｌり１０ ）Ａ
ｃａｄ＠ｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ刊）でｓｇすることより、
プラスミドｐＴＡ ！；２りを得る。
（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 、
Ａｌｌ、３７り（Ａｃａｄｅｍｔｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎ
ｃ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （／り７り）））を行なって、
目的とする変異株を得る。最後に、この株からプラスミ
ドを抽出し、目的とする配列になったかどうかをマキサ
ムーギルノ（−ト法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｌｎ Ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ Ｘ Ｖｏｌｊｊ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
１ｄＰａｒｔＩ、４’タタ〜り乙θ （ｌり１０ ）Ａ
ｃａｄ＠ｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ刊）でｓｇすることより、
プラスミドｐＴＡ ！；２りを得る。
なお、プラスミド作製の詳細は後記実験例を参照された
い。前記のプライマーとしてのオリゴヌクレオチドの合
成法としてはジエステル法（Ｓｃｉｅｎｃｅ 、 ２０
３、ｔｉｌｌ （／り７り））、トリエステル法（Ｎｕ
ｃｌｅｌｃ Ａｃ１ｄ Ｒｅａｅａｒｃｈ Ｘｒ 、
２３３／ （／りｇｏ）、同ｇ、ｒｔり３ （１９ざＯ
）、同Ｌ１ 夕≠り／ （１９ど０））、あるいは固相
法（Ｎａｔｕｒｅ Ｘ２１／、１８（／り７り）、Ｂｉ
ｏｃｈｅｍＬｓｔｒｙ ／’？ＩＯ、ＡＯり７（／りざ
Ｏ））、液相法あるいは酵素を用いる方法（Ｎｕｃｌｅ
ｌｃ Ａｃ１ｄＲｅｓｅａｒｃｈ 、 ！ 、 １７１
３ （／りｔｏ））等があり、これらを参考に行なえば
よい。本発明の場合は固相法が好筐しい。
い。前記のプライマーとしてのオリゴヌクレオチドの合
成法としてはジエステル法（Ｓｃｉｅｎｃｅ 、 ２０
３、ｔｉｌｌ （／り７り））、トリエステル法（Ｎｕ
ｃｌｅｌｃ Ａｃ１ｄ Ｒｅａｅａｒｃｈ Ｘｒ 、
２３３／ （／りｇｏ）、同ｇ、ｒｔり３ （１９ざＯ
）、同Ｌ１ 夕≠り／ （１９ど０））、あるいは固相
法（Ｎａｔｕｒｅ Ｘ２１／、１８（／り７り）、Ｂｉ
ｏｃｈｅｍＬｓｔｒｙ ／’？ＩＯ、ＡＯり７（／りざ
Ｏ））、液相法あるいは酵素を用いる方法（Ｎｕｃｌｅ
ｌｃ Ａｃ１ｄＲｅｓｅａｒｃｈ 、 ！ 、 １７１
３ （／りｔｏ））等があり、これらを参考に行なえば
よい。本発明の場合は固相法が好筐しい。
実験例
（１） オリゴヌクレオチドの合成
点突然変異を誘発させるためのオリゴヌクレオチドとし
て下記の塩基配列を有するフラグメントを合成した。
て下記の塩基配列を有するフラグメントを合成した。
ＧＡ−ＣＡ −ＡＡＡ−ＧＣ−ＴＴ−ＧＧ −ＧＧ−Ａ
Ａ−ＴＴ−Ｃ〜Ｏ シトシンの結合した／ｑｌＩのポリスチレンｉＱＪ Ｉ
」ｉｊ３θ叩と３′−末端ジエステル型のヌクレオチド
（モノマー、！ｏグ、ダイマー３グ、トリマー３Ｓグ）
および縮合剤メシチレンスルホニルトリアゾリド（以下
ＭＳＮＴ）Ｊ、Ｏツを用いて、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１
ｄＲｅｓｅａｒｃｈ Ｉ 、 ｊグ２／（／りｔｏ）の
方法に従って順次縮合を繰り返して目的の鎖長とした。
Ａ−ＴＴ−Ｃ〜Ｏ シトシンの結合した／ｑｌＩのポリスチレンｉＱＪ Ｉ
」ｉｊ３θ叩と３′−末端ジエステル型のヌクレオチド
（モノマー、！ｏグ、ダイマー３グ、トリマー３Ｓグ）
および縮合剤メシチレンスルホニルトリアゾリド（以下
ＭＳＮＴ）Ｊ、Ｏツを用いて、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１
ｄＲｅｓｅａｒｃｈ Ｉ 、 ｊグ２／（／りｔｏ）の
方法に従って順次縮合を繰り返して目的の鎖長とした。
なお通算縮合収率は３ｓ％であった。最後の縮合の終了
後、樹脂を乾燥し、０．３Ｍピコリンアルドキシム−テ
トラメチルグアニジンのピリジン−水（り：／）溶液、
３００μｌを加えて、３７℃で一夜放置した。次に、濃
アンモニア水（ｌＩｒｎｌ）を加え、５．５℃で一夜放
置後、ｅ過を行なって４☆ｌ脂を除去し、沢液を水に溶
解し、エーテルで抽出を行なった（脱保護）。次に、セ
ファデックス０Ｇ−５０を用いてゲルｆ過（溶出液は５
（１）ｍＭ ）リエチルアンモニウムバイカーボネート
、ｐＨ７，ｊ）を行なった。この際、各７ラクシヨンの
２６０ｎｍの吸収を測定し、最初に溶出したピークを集
めて高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を行ない
、ついでざチ酢酸Ｊｄ中で室温ｌＯ分間反応させてｊ′
−水酸基体として目的とする合成フラグメントを分取し
た。なお、カラムはμＢｏｎｄａ−ｐａｋ−Ｃ１ｇ （
逆相）を用いた。合成したオリゴヌクレオチドの塩基配
列の確認は、マキサム・ギルバート法によシ行なった。
後、樹脂を乾燥し、０．３Ｍピコリンアルドキシム−テ
トラメチルグアニジンのピリジン−水（り：／）溶液、
３００μｌを加えて、３７℃で一夜放置した。次に、濃
アンモニア水（ｌＩｒｎｌ）を加え、５．５℃で一夜放
置後、ｅ過を行なって４☆ｌ脂を除去し、沢液を水に溶
解し、エーテルで抽出を行なった（脱保護）。次に、セ
ファデックス０Ｇ−５０を用いてゲルｆ過（溶出液は５
（１）ｍＭ ）リエチルアンモニウムバイカーボネート
、ｐＨ７，ｊ）を行なった。この際、各７ラクシヨンの
２６０ｎｍの吸収を測定し、最初に溶出したピークを集
めて高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を行ない
、ついでざチ酢酸Ｊｄ中で室温ｌＯ分間反応させてｊ′
−水酸基体として目的とする合成フラグメントを分取し
た。なお、カラムはμＢｏｎｄａ−ｐａｋ−Ｃ１ｇ （
逆相）を用いた。合成したオリゴヌクレオチドの塩基配
列の確認は、マキサム・ギルバート法によシ行なった。
次に合成したフラグメン） ３００ｐ ｍｏｌを凍結乾
燥したのち、ｊＯｍＭ）Ｊス塩酸緩衝液（ｐＨ７、ｔ）
、＃７ｍＭ塩化マグネシウム、ｊｍＭＤＴＴ（ジチオス
ライトール） ／、ＪｊｒｎＭ ＡＴＰの溶液２０μｌ
中でポリヌクレオチドキナーゼ／、 ｊ ｌ１ｌ（／、
５ユニツト）と３７℃で２時間反応させ（リン酸化）、
その後９０℃で２分間煮沸してリン酸化反応を停止した
。次いで、この反応混合液をセファデックス■Ｑ４０で
脱塩して、目的物のオリゴマーを得た。
燥したのち、ｊＯｍＭ）Ｊス塩酸緩衝液（ｐＨ７、ｔ）
、＃７ｍＭ塩化マグネシウム、ｊｍＭＤＴＴ（ジチオス
ライトール） ／、ＪｊｒｎＭ ＡＴＰの溶液２０μｌ
中でポリヌクレオチドキナーゼ／、 ｊ ｌ１ｌ（／、
５ユニツト）と３７℃で２時間反応させ（リン酸化）、
その後９０℃で２分間煮沸してリン酸化反応を停止した
。次いで、この反応混合液をセファデックス■Ｑ４０で
脱塩して、目的物のオリゴマーを得た。
（２）点突然変異の誘発
ｐＹＫ、２♂３（プラスミド） ｉｏμＩを７００ｍＭ
）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７３） 、７ｒｎＭ塩化マグネ
シウム、３０ｍＭ塩化ナトリウム、７ｒｎＭメルカプト
エタノール、／ＪθμＩ／ｄエチジウムグロマイト−０
，０７％ノ二ゲット（登録商標）ｐ−ｔｉｏの溶液７０
０μｌに溶かし、Ｅｃｏ ＲＩ （１０，０ＯＯＵ／／
、６７ ｍｌ）２８ｇを加えて３７℃で７時間反応させ
、フェノール−クロロホルム（／ ：／）を添加して蛋
白を除いたの１つ、エタノール沈殿を行なった。沈殿物
をｌｏｍＭ ）リス塩酸緩衝液（ｐＨｚｊ ） 、７ｍ
Ｍ塩化マグネシウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、７ｒ
ｎＩＶｉメルカプトエタノールの溶液ｊＯμｌに溶かし
、エキソヌクレアーゼＢｌ （ｚｏｏｏｕ／１０７ｔＪ
）／、 ｊ ｔｔｌを加えて３７℃で１時間反応させた
。反応終了後、この溶液にＨｌｎｆ Ｉ （ｊ０００Ｕ
／１１３ ｔｔｌ）１、！μ１１バクチリアル・アルカ
リ性ホス７７ターゼ（ＢＡＰ ）（１０，ｏｏｏｕ７３
りμｍ３）／ｌｉｅを加えて１時間反応させ、フェノー
ル−クロロホルム（／ニア）を添加して蛋白を除いたの
ちエタノール沈殿を行なった。この沈殿物に ３１−末
端をポリヌクレオチドキナーゼ（，２ｏｏＶ２ｏμｍｌ
りコμｌでリン酸化した上記の合成オリゴヌクレオチド
１０ ｐ ｍｏｌ、−０ｍＭ）リス塩α２緩衝液（ｐＨ
／ｍＭＡＴＰの混合溶液中／ ００ ｔｉｅで、大腸菌
ＤＮＡポリメラーゼＩラージ・フラグメント（，２００
Ｕ／１３ＩＩｔＪｌ）３μｌおよびＴ＋ ＤＮＡリガー
ゼ（コｏ。
）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７３） 、７ｒｎＭ塩化マグネ
シウム、３０ｍＭ塩化ナトリウム、７ｒｎＭメルカプト
エタノール、／ＪθμＩ／ｄエチジウムグロマイト−０
，０７％ノ二ゲット（登録商標）ｐ−ｔｉｏの溶液７０
０μｌに溶かし、Ｅｃｏ ＲＩ （１０，０ＯＯＵ／／
、６７ ｍｌ）２８ｇを加えて３７℃で７時間反応させ
、フェノール−クロロホルム（／ ：／）を添加して蛋
白を除いたの１つ、エタノール沈殿を行なった。沈殿物
をｌｏｍＭ ）リス塩酸緩衝液（ｐＨｚｊ ） 、７ｍ
Ｍ塩化マグネシウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、７ｒ
ｎＩＶｉメルカプトエタノールの溶液ｊＯμｌに溶かし
、エキソヌクレアーゼＢｌ （ｚｏｏｏｕ／１０７ｔＪ
）／、 ｊ ｔｔｌを加えて３７℃で１時間反応させた
。反応終了後、この溶液にＨｌｎｆ Ｉ （ｊ０００Ｕ
／１１３ ｔｔｌ）１、！μ１１バクチリアル・アルカ
リ性ホス７７ターゼ（ＢＡＰ ）（１０，ｏｏｏｕ７３
りμｍ３）／ｌｉｅを加えて１時間反応させ、フェノー
ル−クロロホルム（／ニア）を添加して蛋白を除いたの
ちエタノール沈殿を行なった。この沈殿物に ３１−末
端をポリヌクレオチドキナーゼ（，２ｏｏＶ２ｏμｍｌ
りコμｌでリン酸化した上記の合成オリゴヌクレオチド
１０ ｐ ｍｏｌ、−０ｍＭ）リス塩α２緩衝液（ｐＨ
／ｍＭＡＴＰの混合溶液中／ ００ ｔｉｅで、大腸菌
ＤＮＡポリメラーゼＩラージ・フラグメント（，２００
Ｕ／１３ＩＩｔＪｌ）３μｌおよびＴ＋ ＤＮＡリガー
ゼ（コｏ。
Ｕ／ｌ ｏ ｔｔｌ ） ３μｌを加えて／４”Ｃで一
夜反応させ、フェノール−クロロホルム（／：／）を添
加して蛋白を除込たのち、エタノール沈殿を行なって、
閉環環状ＤＮＡを得る。
夜反応させ、フェノール−クロロホルム（／：／）を添
加して蛋白を除込たのち、エタノール沈殿を行なって、
閉環環状ＤＮＡを得る。
（３）形質転換
ｐＹＫ２ざ３のＤＮＡ量にして約２Ｒの上記のＤＮＡを
用い、クシュナーの方法に従って大腸菌Ｋ１．２ｃ６０
０の形質転換を行なった。すなわち、大腸菌に／、２ａ
ＡＯＯ株をＬ−培地、２ｒｒｉｌ中で０．３〜０．ＩＩ
０１）／ｊｊＯｎｍ ｔで培養したのち集菌を行ない
、これを氷冷下／ ＯｒｎＭ ＭＯＰＳ （３−（Ｎ−
モルホリノ〕フロパンスルホン（ｍ ） （ｐＨ７，０
）＋１０ｍＭ 塩化ルビジウムの溶液／ｍｌに踊１濁さ
せ、直ちに集菌する。続いて、１００ｍＭ ＭＯＰＳ
（ｐＨ、＜、ｊ）、１０ｍＭ塩化ルビジウム、３０ｍＭ
塩化カルシウムの溶液／ｍ１Ｆｃ懸濁させて水浴中で３
０分放置する。
用い、クシュナーの方法に従って大腸菌Ｋ１．２ｃ６０
０の形質転換を行なった。すなわち、大腸菌に／、２ａ
ＡＯＯ株をＬ−培地、２ｒｒｉｌ中で０．３〜０．ＩＩ
０１）／ｊｊＯｎｍ ｔで培養したのち集菌を行ない
、これを氷冷下／ ＯｒｎＭ ＭＯＰＳ （３−（Ｎ−
モルホリノ〕フロパンスルホン（ｍ ） （ｐＨ７，０
）＋１０ｍＭ 塩化ルビジウムの溶液／ｍｌに踊１濁さ
せ、直ちに集菌する。続いて、１００ｍＭ ＭＯＰＳ
（ｐＨ、＜、ｊ）、１０ｍＭ塩化ルビジウム、３０ｍＭ
塩化カルシウムの溶液／ｍ１Ｆｃ懸濁させて水浴中で３
０分放置する。
再び集菌Ｖｔ、１１００ｒｎ ＭＯＰＳ （ｐｉ（ｌ、
ｊ ）、１０ｍＭ塩化ルビジウム、３０ｍＭ塩化カルシ
ウムの溶液ｏ、 ２．ｍｅ Ｋ 懸濁させ、ＤＭＳＯ（
ジメチルスルホキシド）３μａ、ＤＮＡ（点突然変異を
誘発させた反応混合物をエタノール沈殿させ回収したも
の）を加え水浴中でさらに３０分放置する。ついで、桔
℃、１分間加熱したのちＬ−培地を一一加え室温で７時
間放置したのちアンピシリン（：ｕｓＥ／ｒｎｌ ）を
含有するＬ−プレー１− （／ ％トリプトン、０３％
イースト抽出物、０３％塩化ナトリウム、／、１％アガ
ー）上でアンピシリン耐性となる株１２ｏＯ株を得た。
ｊ ）、１０ｍＭ塩化ルビジウム、３０ｍＭ塩化カルシ
ウムの溶液ｏ、 ２．ｍｅ Ｋ 懸濁させ、ＤＭＳＯ（
ジメチルスルホキシド）３μａ、ＤＮＡ（点突然変異を
誘発させた反応混合物をエタノール沈殿させ回収したも
の）を加え水浴中でさらに３０分放置する。ついで、桔
℃、１分間加熱したのちＬ−培地を一一加え室温で７時
間放置したのちアンピシリン（：ｕｓＥ／ｒｎｌ ）を
含有するＬ−プレー１− （／ ％トリプトン、０３％
イースト抽出物、０３％塩化ナトリウム、／、１％アガ
ー）上でアンピシリン耐性となる株１２ｏＯ株を得た。
（４）突然変異株の検索
検索はコロニーハイプリダイゼーシ画ンで行なった。す
なわち、上記のアンピシリン耐性株７．２ｏｏ株ノ５
チｚｒｏ株をニトロセルロースフィルターに移し、Ｌ−
プレート上で／晩培養後、スペクチノマイシン（３ＯＯ
μｐ／ｍｌ ）を含むＬ−プレートに移してさらにｌ晩
培養した。このフィルターを／！；分間Ｏ０夕Ｎ水酸化
ヂトリウムに浸したのち、０，１Ｍトリス塩酸緩衝液（
ｐＨ７０，ｔ）、／、ｊ′Ｍ塩化ナトリウムで２回洗浄
した。ついで、０．０３Ｍナトリウム−クエン酸、０．
３Ｍ塩化ナトリウムで洗浄し、１０℃で１時間乾燥し、
さらに真空オープン中でざ０℃で２時間乾燥を行なった
。
なわち、上記のアンピシリン耐性株７．２ｏｏ株ノ５
チｚｒｏ株をニトロセルロースフィルターに移し、Ｌ−
プレート上で／晩培養後、スペクチノマイシン（３ＯＯ
μｐ／ｍｌ ）を含むＬ−プレートに移してさらにｌ晩
培養した。このフィルターを／！；分間Ｏ０夕Ｎ水酸化
ヂトリウムに浸したのち、０，１Ｍトリス塩酸緩衝液（
ｐＨ７０，ｔ）、／、ｊ′Ｍ塩化ナトリウムで２回洗浄
した。ついで、０．０３Ｍナトリウム−クエン酸、０．
３Ｍ塩化ナトリウムで洗浄し、１０℃で１時間乾燥し、
さらに真空オープン中でざ０℃で２時間乾燥を行なった
。
このフィルターな００２Ｍ塩化ナトリウム、ｏ、ＯりＭ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，夕） 、０．００４ Ｍ
ＥＤＴＡ （エチレンジアミン弘酢酸塩）、’、ｌｔｓ
ファイコール（Ｆｌｅｏｌｌ ） 、０． ／％ポリビ
ニルピロリドン（ＰＶＰ）、Ｑ、７％牛血清アルブミン
（ＢＳＡ）、Ｏ，タチ５ＤＳ１１Ｏｑ６デキストラン硫
酸塩、１００μｇ／ｍｌ大腸菌ＤＮＡの溶液（４ｉＪ）
に、？７℃でｌ晩浸漬した。
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，夕） 、０．００４ Ｍ
ＥＤＴＡ （エチレンジアミン弘酢酸塩）、’、ｌｔｓ
ファイコール（Ｆｌｅｏｌｌ ） 、０． ／％ポリビ
ニルピロリドン（ＰＶＰ）、Ｑ、７％牛血清アルブミン
（ＢＳＡ）、Ｏ，タチ５ＤＳ１１Ｏｑ６デキストラン硫
酸塩、１００μｇ／ｍｌ大腸菌ＤＮＡの溶液（４ｉＪ）
に、？７℃でｌ晩浸漬した。
先に合成したオリゴヌクレオチド／３ ｐｍｏｌを（７
−、？、２Ｐ）ＡＴＰを用いてラベルしたものを２１０
万ｃｐｍ／ｍＡ！加えてさらに、？７℃で２日間放置し
た。次に、このフィルターな０． Ｌ？Ｍナトリウム−
クエン酸、ＯｌりＭ塩化ナトリウムで弘２℃で３分間ず
つ３回洗浄後、乾燥を行ない、オートラジオグラフィー
を行なって、ポジティブな反応を示した株を３株得た。
−、？、２Ｐ）ＡＴＰを用いてラベルしたものを２１０
万ｃｐｍ／ｍＡ！加えてさらに、？７℃で２日間放置し
た。次に、このフィルターな０． Ｌ？Ｍナトリウム−
クエン酸、ＯｌりＭ塩化ナトリウムで弘２℃で３分間ず
つ３回洗浄後、乾燥を行ない、オートラジオグラフィー
を行なって、ポジティブな反応を示した株を３株得た。
そのときのオートラジオグラフィーの結果を第３図Ａ、
Ｈに示す。
Ｈに示す。
Ａはそのときの全体の結果であり、Ｂはその一部を拡大
したものである。図中の濃い黒丸が変異株である。
したものである。図中の濃い黒丸が変異株である。
（５）確認
得られた３株からプラスミドを抽出し、制限酵素Ｈ１ｎ
ｄｍで水解して、制限酵素認識部位が創出されているか
どうかの確認を行なった。プラスミドの調製は、形質転
換株を２３μ９７ｍ１のアンピシリン存在下、Ｌ−培地
ｊｄ中でＯ２≠ＯＤ／！１０ ｎｙｎまで培養し、最終
濃度３００７１９７ａｔとなるようにスペクチノマイシ
ンを加えて一夜放置する。そのうちコ一を集菌し１．２
ｒｖ／１ｎｌリゾチーム、！；ＯｍＭグルコース、１０
ｍＭ ＣＤＴＡ （／。
ｄｍで水解して、制限酵素認識部位が創出されているか
どうかの確認を行なった。プラスミドの調製は、形質転
換株を２３μ９７ｍ１のアンピシリン存在下、Ｌ−培地
ｊｄ中でＯ２≠ＯＤ／！１０ ｎｙｎまで培養し、最終
濃度３００７１９７ａｔとなるようにスペクチノマイシ
ンを加えて一夜放置する。そのうちコ一を集菌し１．２
ｒｖ／１ｎｌリゾチーム、！；ＯｍＭグルコース、１０
ｍＭ ＣＤＴＡ （／。
λ−ジアミノシクロヘキサンーＮ、 Ｎ、 Ｎ’、 Ｎ
’−テトラ酢酸） 、３．３ｍＭ ）リス塩酸緩衝液ｐ
Ｈざ、０の溶液ｉｏｏμｊを加えて懸濁させて、水冷下
で３０分放置する。これに０．２Ｎ水酸化ナトリウム、
／％ＳＤＳ溶液２００μＩ！ｍｌ加えて水冷下で１０分
放置する。次に、遠心（／２０００ｆｌで５分）後上清
ヲクロロホルムーフェノール（／：／）で抽出したのち
、水層にエタノール／ｍｌを加え、−７０℃で５分間放
置後、さらに遠心（１ｓｏｏｏ 、９で５分）する。制
限酵素認識部位創出の確認は、得られた沈殿物について
エタノール沈殿をさらに２回くり返し、Ｈｌｎｄ■で氷
解したのち、７％アガロースゲル電気泳動で行なった。
’−テトラ酢酸） 、３．３ｍＭ ）リス塩酸緩衝液ｐ
Ｈざ、０の溶液ｉｏｏμｊを加えて懸濁させて、水冷下
で３０分放置する。これに０．２Ｎ水酸化ナトリウム、
／％ＳＤＳ溶液２００μＩ！ｍｌ加えて水冷下で１０分
放置する。次に、遠心（／２０００ｆｌで５分）後上清
ヲクロロホルムーフェノール（／：／）で抽出したのち
、水層にエタノール／ｍｌを加え、−７０℃で５分間放
置後、さらに遠心（１ｓｏｏｏ 、９で５分）する。制
限酵素認識部位創出の確認は、得られた沈殿物について
エタノール沈殿をさらに２回くり返し、Ｈｌｎｄ■で氷
解したのち、７％アガロースゲル電気泳動で行なった。
そのときの電気泳動の結果を第φ図に示す。図中圧より
ＡｌＢはプラスミドｐＹＫ 、２１３のもので、ＡはＨ
ｌｎｄ ｍを作用させたもの、Ｂは対照である。Ｃ１Ｄ
およびＥは本発明のプラスミドのもので、ＣはＥｃｏＲ
Ｉを、ＤはＨｌｎｄ ｍを作用させたものであり、Ｅは
対照である。
ＡｌＢはプラスミドｐＹＫ 、２１３のもので、ＡはＨ
ｌｎｄ ｍを作用させたもの、Ｂは対照である。Ｃ１Ｄ
およびＥは本発明のプラスミドのもので、ＣはＥｃｏＲ
Ｉを、ＤはＨｌｎｄ ｍを作用させたものであり、Ｅは
対照である。
一般にゲル電気泳動上でのＤＮＡの挙動としてはＸａｃ
ｅ Ｄ Ｎ Ａ （ｃｏｖａｌｅｎｔ ｃｌｏｇｅｄ
ｃｉｒｃｕｌａｒＤＮＡ）を制限酵素で処理すると直鎖
状ＤＮＡとなって、移動度が小さくなる。第弘図におり
て、ＡＸＢをみるとｐＹＫ ２１３を制限酵素Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ処理してもバンドの位置に変化がなく 、Ｈｌｎ
ｄ ＩＩＩ切断点がないことがわかる。一方、Ｃ（Ｅｃ
ｏＲＩ処理）、Ｄ（ＨｉｎｄｎＩ処理）、Ｅ（対照）を
みると、制限酵素処理したもの（Ｃ％Ｄ）は移動度が大
きくなり、バンドは対照のもの（Ｅ）よりθ側に現われ
る。従って、新たに制限酵素Ｈ１ｎｄ■認識部位が創出
されたことがわかる。また、このプラスミドのＨｌｎｄ
ｍ認識部位近傍の塩基配列をマキサム・ギルバート法
により確認した（第５図参照）。図中の４〜口の間の塩
基配列はＧＡＡＴＴＣＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＴＧＴＣＡ
である。なお、図中矢印（←）は改変された塩基配列を
示している。従って、第２図中の■において二つのプラ
スミド（ｐＴＡｊ、２りとｐＹＫ ２１３）で示されて
いるように、第２図中矢印（↑）で示される部分のみが
変化し、その結果制限酵素Ｈｉｎｄ ｍ認識部位（破線
で囲んだ部分）が新たに創出されていることがわかる。
ｅ Ｄ Ｎ Ａ （ｃｏｖａｌｅｎｔ ｃｌｏｇｅｄ
ｃｉｒｃｕｌａｒＤＮＡ）を制限酵素で処理すると直鎖
状ＤＮＡとなって、移動度が小さくなる。第弘図におり
て、ＡＸＢをみるとｐＹＫ ２１３を制限酵素Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ処理してもバンドの位置に変化がなく 、Ｈｌｎ
ｄ ＩＩＩ切断点がないことがわかる。一方、Ｃ（Ｅｃ
ｏＲＩ処理）、Ｄ（ＨｉｎｄｎＩ処理）、Ｅ（対照）を
みると、制限酵素処理したもの（Ｃ％Ｄ）は移動度が大
きくなり、バンドは対照のもの（Ｅ）よりθ側に現われ
る。従って、新たに制限酵素Ｈ１ｎｄ■認識部位が創出
されたことがわかる。また、このプラスミドのＨｌｎｄ
ｍ認識部位近傍の塩基配列をマキサム・ギルバート法
により確認した（第５図参照）。図中の４〜口の間の塩
基配列はＧＡＡＴＴＣＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＴＧＴＣＡ
である。なお、図中矢印（←）は改変された塩基配列を
示している。従って、第２図中の■において二つのプラ
スミド（ｐＴＡｊ、２りとｐＹＫ ２１３）で示されて
いるように、第２図中矢印（↑）で示される部分のみが
変化し、その結果制限酵素Ｈｉｎｄ ｍ認識部位（破線
で囲んだ部分）が新たに創出されていることがわかる。
第１図はシグナル−ペプチド＋１１と構造遺伝子（３）
との結合部位付近を示し、制限酵素認識部位（２）、制
限酵素切断部位（破線）およびシグナル・ペプチド切断
点（４）を示す。 第２図は本発明のプラスミドｐＴＡ １２り製造のフロ
ーチャートである。 第３図はコロニーハイプリダイゼーシ冒ンを行なった際
のオートラジオダラムを模写したものである。 第グ図はアガロースゲル電気泳動の結果である。 第５図はマキザム・ギルバート法によって塩基配列決定
を行った際のオートラジオダラムを模写したものである
。 出願人代理人 猪 股 清 第３図 Ａ 第５図
との結合部位付近を示し、制限酵素認識部位（２）、制
限酵素切断部位（破線）およびシグナル・ペプチド切断
点（４）を示す。 第２図は本発明のプラスミドｐＴＡ １２り製造のフロ
ーチャートである。 第３図はコロニーハイプリダイゼーシ冒ンを行なった際
のオートラジオダラムを模写したものである。 第グ図はアガロースゲル電気泳動の結果である。 第５図はマキザム・ギルバート法によって塩基配列決定
を行った際のオートラジオダラムを模写したものである
。 出願人代理人 猪 股 清 第３図 Ａ 第５図
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 ｌ シグナル拳ペプチドをコードする遺伝子に対応する
ＤＮＡ部分を含み、このＤＮＡがその塩基対の少なくと
も一つを構成員の少なくとも一部として人工的に創出さ
れた制限酵素認識部位を１個所有するものであることを
特徴とする、シグナル・ペプチドをコードする遺伝子に
対応するＤＮＡ部分を含むＤＮＡ遺伝子。 Ｊ 制限酵素認識部位内の制限酵素切断部位が、シグナ
ル・ペプチドをコードする遺伝子に対応するＤＮＡ部分
とその下流側直後に結合されていることあるべきＤＮＡ
部分との境界よシ下流側にはない、特許請求の範囲第１
項に記載のＤＮＡ遺伝子。 ３ 制限酵素切断部位が、シグナル・ペプチドをコード
する遺伝子に対応するＤＮＡ部分とその直後に結合され
ていることあるべきＤＮＡ部分との境界に存在する、特
許請求の範囲第２項に記載のＤＮＡ遺伝子。 仏 シグナル−ペプチドをコードする遺伝子に対応する
ＤＮＡが天然物由来のものである、特許請求の範囲第１
〜３項のいずれかに記載のＤＮＡ遺伝子。 ｊ： （１１シグナル・ペプチドをコードする遺伝子に
対応するＤＮＡ部分が、人工的に創出された制限酵素認
識部位内の制限酵素切断部位より上流側の部分は天然物
由来のものであり、この制限酵素切断部位よシ下流側に
あるべき部分は合成されたものであシ、かつ（２）この
シグナル・ペプチドをコードする遺伝子に対応するＤＮ
Ａ部分の下流側末端直後に外来性蛋白をコードする遺伝
子に対応するＤＮＡ部分を含む、特許請求の範囲第１〜
３項のいずれか７項に記載のＤＮＡ遺伝子。 ６、 シグナル・ペプチドをコードする遺伝子に対応す
るＤＮＡがアルカリ性フォスファターゼ由来のものであ
り、制限酵素認識部位がＨｔｎｄｍ認識部位であり、制
限酵素切断部位がシグナル・ペプチドをコードする遺伝
子に対応するＤＮＡ部分とその下流側直後に結合されて
込ることあるべきＤＮＡ部分との境界にある、特許請求
の範囲第１〜ｊ項のいずれか１項に記載のＤＮＡ遺伝子
。 γ 下記の工程からなることを特徴とする、シグナル・
ペプチドをコードする遺伝子に対応するＤＮＡ部分を含
むＤＮＡ遺伝子の製造法。 （１１） シグナル・ペプチドをコードする遺伝子に対
応するＤＮＡ部分を含むＤＮ’Ａ遺伝子を用意すること
。 （ｂ） このＤＮＡ部分の塩基配列を、この塩基配列に
対応するアミノ酸配列を変化させずに改変して、シグナ
ル・ペプチドをコードする遺伝子に対応するＤＮＡの塩
基対の少なくとも一つを構成員の少なくとも一部とする
制限酵素認識部位を創出すること。 ｒ、塩基配列の改変を、合成フラグメントを周込た点突
然変異によって行なう、特許請求の範囲第７項に記載の
方法。 タ シグナル・ペプチドをコードする遺伝子に対応する
ＤＮＡ部分を含むＤＮＡ遺伝子が、天然物由来のもので
ある、特許請求の範囲第７〜ｇ項のいずれかに記載の方
法。 ｉｏ、下記の工程からなることを特徴とする、シグナル
・ペプチドをコードする遺伝子に対応するＤＮＡ部分を
含むＤＮＡ遺伝子の製造法。 （ａ） シグナル・ペプチドをコードする遺伝子に対応
するＤＮＡ部分を含むＤＮＡ遺伝子を用意すること、 （ｂ） このＤＮＡ部分の塩基配列を、この塩基配列に
対応するアミノ酸配列を変化させずに改変して、シグナ
ル・ペプチドをコードする遺伝子に対応するＤＮＡの塩
基対の少なくとも一つを構成員の少なくとも一部とする
制限酵素認識部位を創出すること、 （、） 創出された制限酵素認識部位内の制限酵素切断
部位を該制限酵素で切断して、シグナル・ペプチドをコ
ードする遺伝子に対応するＤＮＡの該切断部位より上流
側の部分からな択かつ下流側に該制限酵素切断端を有す
るＤＮＡ断片をつくること、 （ｄ） シグナル・ペプチドをコードする遺伝子に対応
するＤＮＡ部分の制限酵素切断部位の下流側に存在して
いることあるべきＤＮＡと該存在していることあるべき
ＤＮＡの下流側直後に存在する外来性蛋白をコードする
遺伝子に対応するＤＮＡとからなシ、上流側および下流
側末端に前記制限酵素切断端を有するＤＮＡ断片を用意
すること、 （ｅ） 前記（ｅ）によるＤＮＡ断片と前記（ｄ）によ
るＤＮＡ断片とを制限酵素切断端で結合させて、シグナ
ルψペプチドをコードする遺伝子に対応するＤＮＡ部分
とその下流側に直結した外来性蛋白をコードする遺伝子
に対応するＤＮＡ部分とを含むＤＮＡ遺伝子を得ること
。 ／ｌ 塩基配列の改変を、合成フラグメントな用いた点
突然変異によって行なう、特許請求の範囲第１Ｏ項に記
載の方法。 １．２． シグナル・ペプチドをコードする遺伝子に対
応するＤＮＡ部分を含むＤＮＡ遺伝子が、天然物由来の
ものである、特許請求の範囲第１０〜／／項のいずれか
に記載の方法。 ／３． アルカリ性フォスファターゼ由来の制御領域に
対応するＤＮＡ部分とこの領域の制御下にあるアルカリ
性フォスファターゼ由来のシグナル・分とを含み、この
シグナル・ペプチドをコードする遺伝子に対応するＤＮ
Ａ部分が下記によって定義されるものであることを巷徴
とする、プラスミド。 （イ） このＤＮＡ部分には、その塩基対の少なくとも
一つを構成員の少なくとも一部とする制限酵素切断部位
が人工的に創出されてｂること。 （ロ） この制限酵素認識部位内の制限酵素切断部位が
シグナル・ペプチドをコードする遺伝子に対応するＤＮ
Ａ部分とその直後に結合されて込ることあるべきＤＮＡ
部分との境界に存在すること。 ／４４ プラスミドｐＹＫ 、２１３のシグナルｅペプ
チドをコードする遺伝子に対応するＤＮＡ部分の下流側
末端コドンおよびその下流側に直結したＤＮＡ部分の最
初のコドンが第１図に示した通電のものである、特許請
求の範囲第１２項に記載のプラスミドであるｐＴＡ ｊ
λり。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58140748A JPS6030687A (ja) | 1983-08-01 | 1983-08-01 | Ｄνａ遺伝子，その製造法およびそれを含むプラスミド |
| EP19840109016 EP0133321B1 (en) | 1983-08-01 | 1984-07-30 | Dna gene, process for production thereof and plasmid containing the same |
| DE19843485923 DE3485923T2 (de) | 1983-08-01 | 1984-07-30 | Dna-gen, verfahren zu seiner herstellung und dieses gen enthaltendes plasmid. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58140748A JPS6030687A (ja) | 1983-08-01 | 1983-08-01 | Ｄνａ遺伝子，その製造法およびそれを含むプラスミド |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6030687A true JPS6030687A (ja) | 1985-02-16 |
Family
ID=15275812
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58140748A Pending JPS6030687A (ja) | 1983-08-01 | 1983-08-01 | Ｄνａ遺伝子，その製造法およびそれを含むプラスミド |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0133321B1 (ja) |
| JP (1) | JPS6030687A (ja) |
| DE (1) | DE3485923T2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61265092A (ja) * | 1985-05-18 | 1986-11-22 | Mitsubishi Chem Ind Ltd | 発現用ベクタ−、これを用いる蛋白の産生方法及び該ベクタ−で形質転換された宿主 |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0170266B1 (en) * | 1984-07-30 | 1993-03-24 | Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha | Process for producing protein, and vector, recombinant dna and transformant used therefor |
| DE3436818A1 (de) * | 1984-10-06 | 1986-04-10 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Synthetische signalsequenz zum transport von proteinen in expressionssystemen |
| JP2549504B2 (ja) * | 1984-12-21 | 1996-10-30 | ア−ス製薬株式会社 | Ｄｎａ塩基配列、ポリペプチド分泌発現ベクター及び形質転換微生物 |
| US5618920A (en) | 1985-11-01 | 1997-04-08 | Xoma Corporation | Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use |
| US5576195A (en) * | 1985-11-01 | 1996-11-19 | Xoma Corporation | Vectors with pectate lyase signal sequence |
| JP2980626B2 (ja) * | 1988-01-11 | 1999-11-22 | ゾーマ・コーポレーション | ペクチン酸リアーゼのシグナル配列を含む新規プラスミドベクター |
| DE3901681A1 (de) * | 1989-01-21 | 1990-07-26 | Behringwerke Ag | Signalpeptid fuer die sekretion von peptiden in escherichia coli, verfahren zu seiner gewinnung und seine verwendung |
| CA2067249A1 (en) * | 1990-08-28 | 1992-03-01 | Vasantha Nagarajan | Method for rapid selection of efficient secretion vectors |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS56137896A (en) * | 1980-03-10 | 1981-10-28 | Cetus Corp | Genetic recombination gram positive bacteria , production thereof and protein for mammal produced by said gram positive bacteria |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4338397A (en) * | 1980-04-11 | 1982-07-06 | President And Fellows Of Harvard College | Mature protein synthesis |
-
1983
- 1983-08-01 JP JP58140748A patent/JPS6030687A/ja active Pending
-
1984
- 1984-07-30 DE DE19843485923 patent/DE3485923T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1984-07-30 EP EP19840109016 patent/EP0133321B1/en not_active Expired
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS56137896A (en) * | 1980-03-10 | 1981-10-28 | Cetus Corp | Genetic recombination gram positive bacteria , production thereof and protein for mammal produced by said gram positive bacteria |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61265092A (ja) * | 1985-05-18 | 1986-11-22 | Mitsubishi Chem Ind Ltd | 発現用ベクタ−、これを用いる蛋白の産生方法及び該ベクタ−で形質転換された宿主 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3485923D1 (de) | 1992-10-22 |
| EP0133321B1 (en) | 1992-09-16 |
| EP0133321A1 (en) | 1985-02-20 |
| DE3485923T2 (de) | 1993-03-04 |
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