JPS61265092A - 発現用ベクタ−、これを用いる蛋白の産生方法及び該ベクタ−で形質転換された宿主 - Google Patents
発現用ベクタ−、これを用いる蛋白の産生方法及び該ベクタ−で形質転換された宿主Info
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- JPS61265092A JPS61265092A JP60106659A JP10665985A JPS61265092A JP S61265092 A JPS61265092 A JP S61265092A JP 60106659 A JP60106659 A JP 60106659A JP 10665985 A JP10665985 A JP 10665985A JP S61265092 A JPS61265092 A JP S61265092A
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- C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
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- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、分泌ベクターとして成熟蛋白の産生に応用可
能な発現用ベクター、これを用いる蛋白の産生方法及び
該ベクターで形質転換された宿主に関する。
能な発現用ベクター、これを用いる蛋白の産生方法及び
該ベクターで形質転換された宿主に関する。
従来の技術
大腸菌の外膜を構成する蛋白質のひとつであるＯｍｐ
（ｏｕｔｅｒｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ）
Ｆ蛋白質は、大腸菌が最も多量に生産する蛋白質のひと
つである。その遺伝子ＯｍｐＦのプロモータやリポソー
ム結合領域はきわめて効率よく機能しているものと考え
られる。Ｏｍｐ Ｆ遺伝子の発現は複雑な制御を受ける
が、そのひとつとしてＱｍｐＦ遺伝子発現の正の制御遺
伝子Ｏｍｐ Ｂ遺伝子が知られており、Ｏｍｐ Ｂ欠損
変異株ではＯｍｐＦ遺伝子は発現しない。丑た培地の浸
透圧によっても制御を受け、高浸透圧培地中ではＯｍｐ
Ｆ遺伝子の発現は抑制される。
（ｏｕｔｅｒｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ）
Ｆ蛋白質は、大腸菌が最も多量に生産する蛋白質のひと
つである。その遺伝子ＯｍｐＦのプロモータやリポソー
ム結合領域はきわめて効率よく機能しているものと考え
られる。Ｏｍｐ Ｆ遺伝子の発現は複雑な制御を受ける
が、そのひとつとしてＱｍｐＦ遺伝子発現の正の制御遺
伝子Ｏｍｐ Ｂ遺伝子が知られており、Ｏｍｐ Ｂ欠損
変異株ではＯｍｐＦ遺伝子は発現しない。丑た培地の浸
透圧によっても制御を受け、高浸透圧培地中ではＯｍｐ
Ｆ遺伝子の発現は抑制される。
ＯｍｐＦ遺伝子の全塩基配列は本発明者らによって決定
されたが、それによればＯｍｐ ？蛋白質はまずアミン
末端に一一個のアミノ酸よシなるシグナル・ペプチドを
有する前駆体として合成される。このシグナル・ペプチ
ドはＯｍｐＦ蛋白質の細胞質膜からの分泌に必須の役割
を果たしているものと考えられる。さらにｏ＝ｐ Ｆ蛋
白質は外膜中で細胞壁を構成するペプチドグリカンと強
い親和性をもった非常に安定な形で多量に存在しており
、この性質を利用して菌体から容易に精製することので
きる蛋白質でもある。
されたが、それによればＯｍｐ ？蛋白質はまずアミン
末端に一一個のアミノ酸よシなるシグナル・ペプチドを
有する前駆体として合成される。このシグナル・ペプチ
ドはＯｍｐＦ蛋白質の細胞質膜からの分泌に必須の役割
を果たしているものと考えられる。さらにｏ＝ｐ Ｆ蛋
白質は外膜中で細胞壁を構成するペプチドグリカンと強
い親和性をもった非常に安定な形で多量に存在しており
、この性質を利用して菌体から容易に精製することので
きる蛋白質でもある。
〈発明が解決しようとする問題点〉
組換えＤＮＡ技術によシ大腸菌中に産生させた蛋白は１
分解されやすくまたその蓄積は大腸菌にとって負荷とな
るので、産生蛋白を細胞外に分易可能な分泌ベクターの
開発が望まれている。
分解されやすくまたその蓄積は大腸菌にとって負荷とな
るので、産生蛋白を細胞外に分易可能な分泌ベクターの
開発が望まれている。
また、所望の蛋白を融合蛋白としてでなく、成熟蛋白と
して細胞外に分泌できれば、融合蛋白を分解する工程が
省かれ、蛋白の精製上からも好ましい。
して細胞外に分泌できれば、融合蛋白を分解する工程が
省かれ、蛋白の精製上からも好ましい。
く問題点を解決するための手段〉
プロモータの下流にＯｍｐＦシグナルペプチド００末端
アミノ酸と所望の蛋白のＮ末端アミノ酸とが直接結合し
た前駆体蛋白をコードする遺伝子が挿入されてなる発現
用ベクターを宿主に導入し、該発現用ベクターで形質転
換された宿主を培養すると、該前駆体蛋白又は所望の蛋
白が得られることを見い出し１本発明を完成するに至っ
た。
アミノ酸と所望の蛋白のＮ末端アミノ酸とが直接結合し
た前駆体蛋白をコードする遺伝子が挿入されてなる発現
用ベクターを宿主に導入し、該発現用ベクターで形質転
換された宿主を培養すると、該前駆体蛋白又は所望の蛋
白が得られることを見い出し１本発明を完成するに至っ
た。
本発明によれば、シグナルペプチドによって前駆体蛋白
は細胞質膜を通過し、その後シグナルペプチダーゼによ
ってシグナルペプチドの０末端アミノ酸と所望の蛋白の
Ｎ末端アミノ酸との間が切断されて、所望の蛋白は成熟
蛋白として得られる。
は細胞質膜を通過し、その後シグナルペプチダーゼによ
ってシグナルペプチドの０末端アミノ酸と所望の蛋白の
Ｎ末端アミノ酸との間が切断されて、所望の蛋白は成熟
蛋白として得られる。
本発明の詳細な説明すると、本発明のベクターは、通常
プラスミドベクターである。
プラスミドベクターである。
本発明のベクターは、プロモータの下流にＯｍｐＦシグ
ナルペプチド００末端と所望の蛋白のＮ末端が直接結合
した前駆体蛋白をコードする遺伝子な含有するが、宿主
中で複製するためには、同ベクターは複製起点を有しな
ければならない。
ナルペプチド００末端と所望の蛋白のＮ末端が直接結合
した前駆体蛋白をコードする遺伝子な含有するが、宿主
中で複製するためには、同ベクターは複製起点を有しな
ければならない。
複製起点としては、大腸菌プラスミドｐＢＲ３，２２の
複製起点、酵母のコμ７７ｔ ＤＮＡの複製起点、酵母
染色体Ｄ Ｎ Ａの複製起点を含むａｒｓ、 ＢＶ’Ｉ
Ｏウィルスの複製起点、パピローマウィルスの複製起点
等が挙げられる。
複製起点、酵母のコμ７７ｔ ＤＮＡの複製起点、酵母
染色体Ｄ Ｎ Ａの複製起点を含むａｒｓ、 ＢＶ’Ｉ
Ｏウィルスの複製起点、パピローマウィルスの複製起点
等が挙げられる。
本発明のベクターで形質転換された宿主を選択するだめ
には、同ベクターは選択マーカを有しなければならず、
このような選択マーカとしては、アンピンリン耐性遺伝
子、テトラサイクリン耐性遺伝子、クロラムフエニコー
＃耐性ｆｆｉ伝子、カナマイシン耐性遺伝子等の抗生物
質耐性遺伝子、ｆｉｌｌ 、？ 、 −ＴＪぼ／１討
旦λ、 ＵＲＡＪ遺伝子等の大腸菌の変異を相補できる
遺伝子、Ｈ８Ｖｔｋ遺伝子、ａｐｒｔ遺伝子等が挙げら
れる。
には、同ベクターは選択マーカを有しなければならず、
このような選択マーカとしては、アンピンリン耐性遺伝
子、テトラサイクリン耐性遺伝子、クロラムフエニコー
＃耐性ｆｆｉ伝子、カナマイシン耐性遺伝子等の抗生物
質耐性遺伝子、ｆｉｌｌ 、？ 、 −ＴＪぼ／１討
旦λ、 ＵＲＡＪ遺伝子等の大腸菌の変異を相補できる
遺伝子、Ｈ８Ｖｔｋ遺伝子、ａｐｒｔ遺伝子等が挙げら
れる。
また、本発明のベクターに挿入された前駆体蛋白をコー
ドする遺伝子が発現するためには、プロモータと同遺伝
子の転写方向及び翻訳フレームを常法によシ一致させる
必要がある。
ドする遺伝子が発現するためには、プロモータと同遺伝
子の転写方向及び翻訳フレームを常法によシ一致させる
必要がある。
本発明のベクターに含まれるプロモータとしてはＯｍｐ
Ｆプロモータ、リニプロモータ、 ｔｒｐプロモータ、
−シヒープロモータ、二プロモータ、酸性ホスファター
ゼ遺伝子ＰＨＯ！； （７）プｌ：Ｉ モー タ、ＧＡ
Ｌ ／あるいはＧＡＬ＃７遺伝子のプロモータ、Ｈ工Ｓ
ＩＩ遺伝子のプロモータ、ＯＹＯ／遺伝子のプロモータ
、ＡＤＨ，２遺伝子のプロモータ、Ｓ Ｖ’ＩＯ初期プ
ロモータ等が挙げられる。なお、Ｓ Ｖ’ＩＯ初期プロ
モータを挿入すれば、 ５ｖａｏウイルスの複製起点、
パピローマウィルスの複製起点をも含む本発明の発現用
ベクターは、ａＯＳ細胞、ＯＨＯ細胞、マウスＬｔｋ−
細胞、ＶθｒＯ細胞等の動物細胞を宿主としうる。
Ｆプロモータ、リニプロモータ、 ｔｒｐプロモータ、
−シヒープロモータ、二プロモータ、酸性ホスファター
ゼ遺伝子ＰＨＯ！； （７）プｌ：Ｉ モー タ、ＧＡ
Ｌ ／あるいはＧＡＬ＃７遺伝子のプロモータ、Ｈ工Ｓ
ＩＩ遺伝子のプロモータ、ＯＹＯ／遺伝子のプロモータ
、ＡＤＨ，２遺伝子のプロモータ、Ｓ Ｖ’ＩＯ初期プ
ロモータ等が挙げられる。なお、Ｓ Ｖ’ＩＯ初期プロ
モータを挿入すれば、 ５ｖａｏウイルスの複製起点、
パピローマウィルスの複製起点をも含む本発明の発現用
ベクターは、ａＯＳ細胞、ＯＨＯ細胞、マウスＬｔｋ−
細胞、ＶθｒＯ細胞等の動物細胞を宿主としうる。
本発明のベクター中に含まれる所望の蛋白をコードする
遺伝子としては、生理活性を有する有用な蛋白をコード
する遺伝子であれば特釦制限されないが、本発明のベク
ターは、β−エンドルフィン、カルデイオナトリン、工
ＦＮ。
遺伝子としては、生理活性を有する有用な蛋白をコード
する遺伝子であれば特釦制限されないが、本発明のベク
ターは、β−エンドルフィン、カルデイオナトリン、工
ＦＮ。
Ｈ８Ａ、工Ｌ−２、アポリポプロティン等の表現に有利
に使用される。
に使用される。
次に、本発明のベクターを造成する方法について説明す
る。
る。
ＯｍｐＦシグナルペプチドのＯ末端部分は以下のシグナ
ルペプチダーゼは、Ｏ末端のアラニンと所望の蛋白のＮ
末端アミノ酸との間を切断する。
ルペプチダーゼは、Ｏ末端のアラニンと所望の蛋白のＮ
末端アミノ酸との間を切断する。
上記したアミノ酸配列を有する前駆体蛋白をコードする
遺伝子は、 ＯｍｐＦシグナルペプチド及びＯｍｐ ？
蛋白のＮ末端をコードする遺伝子中に存在するＰｓｔ工
部位を利用して構築できる。
遺伝子は、 ＯｍｐＦシグナルペプチド及びＯｍｐ ？
蛋白のＮ末端をコードする遺伝子中に存在するＰｓｔ工
部位を利用して構築できる。
すなわち、Ｏｍｐ Ｆシグナルペプチド及びＣ）ｍｐ？
蛋白のＮ末端をコードする遺伝子をｌ工で消化すると以
下のとおりの塩基配列をもったＤＮＡ断片が得られる。
蛋白のＮ末端をコードする遺伝子をｌ工で消化すると以
下のとおりの塩基配列をもったＤＮＡ断片が得られる。
ｍ＝ −／十７
このＤＮＡ２片に３′→Ｓ′エキソヌクレアーゼ活性を
有するＴ＋ＤＮＡボリメ２−ゼを作用させると１本鎖部
分が除去されて以下のＤＮＡ断片が得られる。
有するＴ＋ＤＮＡボリメ２−ゼを作用させると１本鎖部
分が除去されて以下のＤＮＡ断片が得られる。
ｍ＝ −／
−Ａｓｎ Ａｌａ
ＡＡＯＧ。
−ＴＴＧ ＯＧ
ところで、アラニンをコードするコドンはＧＯＴ、Ｇｏ
ｏ、ＧＯＡ％ａａａのグっであるから、上記したアラニ
ンのコドンな完成させるためには、所望の蛋白をコード
する遺伝子のＳ′末端にさらにＴ、Ｏ，Ａ又はＧのいず
れかとそれに相補性の塩基を有するヌクレオチドを付加
したＤＮＡ断片を上記ＤＮＡ断片と連結させれば上記前
駆体蛋白をコードする遺伝子が得られる。
ｏ、ＧＯＡ％ａａａのグっであるから、上記したアラニ
ンのコドンな完成させるためには、所望の蛋白をコード
する遺伝子のＳ′末端にさらにＴ、Ｏ，Ａ又はＧのいず
れかとそれに相補性の塩基を有するヌクレオチドを付加
したＤＮＡ断片を上記ＤＮＡ断片と連結させれば上記前
駆体蛋白をコードする遺伝子が得られる。
さらに、上記したＴ４／ＤＮＡポリメラーゼを作用させ
て得られるＤＮＡ断片にも」ニリンカーを付加させると
以下のとおシの３′末端部分のＤＮＡ断片が得られる。
て得られるＤＮＡ断片にも」ニリンカーを付加させると
以下のとおシの３′末端部分のＤＮＡ断片が得られる。
−Ａｓｎ Ａｌａ
ＡＡＯＧＯＧ ＴＴＡ ）、０− ＴＴＧ
ＯＧＯＡＡＴ ＴＧ上記ＤＮＡ断片を１工で
消化すると以下のＤＮＡ断片が得られる。
ＯＧＯＡＡＴ ＴＧ上記ＤＮＡ断片を１工で
消化すると以下のＤＮＡ断片が得られる。
−Ａ５ｎ Ａｌａ
上記ＤＮＡ断片の一本鎖部分を埋めて（ｆｌｌｘ−ｔｎ
）−ドするＤＮＡ断片と上記ＤＮＡ断片とを合成リンカ
−を介して連結することによシ、上記前駆体蛋白をコー
ドするＤＮＡ断片が得られる。
）−ドするＤＮＡ断片と上記ＤＮＡ断片とを合成リンカ
−を介して連結することによシ、上記前駆体蛋白をコー
ドするＤＮＡ断片が得られる。
〈実施例〉
以下、実施例によシ本発明をさらに詳細に説明するが１
本発明はその要旨を越えない限り以下の実施例によって
限定されるものではない。
本発明はその要旨を越えない限り以下の実施例によって
限定されるものではない。
なお、実施例において、制限酵素、修飾酵素等の処理は
、これらの試薬の製造・販売者銘（宝酒造株式会社、Ｎ
ｅｗ Ｅｎｇｌａｈｄ Ｂ１０１ａｂ８ ）の指示書に
従って行なった。たとえば、制限酵素Ｂａｍｆ［、ＩＩ
ｌ、ＥｉｃｏＲｌ、Ｂｍａ ｌ、５ａｌＩ、畢、？Ａ、
Ｐｖｕｌ による消化は次の酵素反応液で行なった。
、これらの試薬の製造・販売者銘（宝酒造株式会社、Ｎ
ｅｗ Ｅｎｇｌａｈｄ Ｂ１０１ａｂ８ ）の指示書に
従って行なった。たとえば、制限酵素Ｂａｍｆ［、ＩＩ
ｌ、ＥｉｃｏＲｌ、Ｂｍａ ｌ、５ａｌＩ、畢、？Ａ、
Ｐｖｕｌ による消化は次の酵素反応液で行なった。
ＢａｍＨｌ ： ７０ｍＭ Ｔｒｉｓ−・−ＨｏＩ、
ｐＨｇ、’ ０７ｍＭ ＭｇＯ１ｔ １００ｍＭ Ｎａ１１ −ｍＭ ２−メツｎブトエタノール０１）１％ ウ
シ崩清アルプ゛ミン ＢＢ４） ： １０ｍＭ Ｔｒｉｓ”ＨＯｌ、ｐ
Ｈ７，！ｒりｍＭ ＭｇＯ１ｔ １００ｍＭ Ｍａｉｌ ７ｍＭ コーメルカブトエタノール １ｌ− ＢａｏＲｌ ： ！ｒＯｍＭ ＴｒｉＰＨｏｌ、
ｐＨ７４７ｍＭ ＭｇＯ１゜ １００ｍＭ Ｎａ１１ ７ｍＭ ２−メルカプトエタノール ０．０／チ ウシ血清アルブ１ミン Ｓｍａ ｌ ： １０ｒｎＭ ＴｒｉｓＨＯｌ、
ｐＨｇ、０７ｍＭ Ｍｇ０１１ ２０ｍＭ Ｍｏ１ ７ｍＭ λ−メルカプトエタノール ー ０．０ ／チ ウシ血清アルプ１ミンシュｌ ：
１０ｒｎＭ Ｔｒｉｓ −Ｈｏｌ、 ｐＨ７４７
ｍＭ ＭｇＯ１゜ ／り！；ｒｎＭ Ｎａ１ｌ Ｏ，：１ｍＭ １ｉｉＤＴＡ ７ｍＭ コーメルカブトエタノール０．０ ／チ
ウシ血清アルズミン １２一 旦ａｕ、？Ａ ： １０ｒｎＭ ＴｒｉｓＩＨＯ
ｌ、ｐＨ７，ｒ７ｍＭ ＭｇＯ１゜ ７００ｍＭ Ｍａｉｌ Ｐｖｕ ｌ ： １０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓＩＨＯｌ、 ｐＨざ６θ７ｍＭ Ｍｇ０１ｔ １！ｒＯｍＭ Ｍｏ１ ７ｍＭ コーメルカブトエタノール θ、θ砿 ウシ血清アルノ゛ミン また、ＴＱ−ＤＮＡポリメラーゼ、アルカリホスフオタ
ーゼ、又はＴ！ＤＮＡリガーゼによる処理は、次の酵素
反応溶液を用いて行なった。
ｐＨｇ、’ ０７ｍＭ ＭｇＯ１ｔ １００ｍＭ Ｎａ１１ −ｍＭ ２−メツｎブトエタノール０１）１％ ウ
シ崩清アルプ゛ミン ＢＢ４） ： １０ｍＭ Ｔｒｉｓ”ＨＯｌ、ｐ
Ｈ７，！ｒりｍＭ ＭｇＯ１ｔ １００ｍＭ Ｍａｉｌ ７ｍＭ コーメルカブトエタノール １ｌ− ＢａｏＲｌ ： ！ｒＯｍＭ ＴｒｉＰＨｏｌ、
ｐＨ７４７ｍＭ ＭｇＯ１゜ １００ｍＭ Ｎａ１１ ７ｍＭ ２−メルカプトエタノール ０．０／チ ウシ血清アルブ１ミン Ｓｍａ ｌ ： １０ｒｎＭ ＴｒｉｓＨＯｌ、
ｐＨｇ、０７ｍＭ Ｍｇ０１１ ２０ｍＭ Ｍｏ１ ７ｍＭ λ−メルカプトエタノール ー ０．０ ／チ ウシ血清アルプ１ミンシュｌ ：
１０ｒｎＭ Ｔｒｉｓ −Ｈｏｌ、 ｐＨ７４７
ｍＭ ＭｇＯ１゜ ／り！；ｒｎＭ Ｎａ１ｌ Ｏ，：１ｍＭ １ｉｉＤＴＡ ７ｍＭ コーメルカブトエタノール０．０ ／チ
ウシ血清アルズミン １２一 旦ａｕ、？Ａ ： １０ｒｎＭ ＴｒｉｓＩＨＯ
ｌ、ｐＨ７，ｒ７ｍＭ ＭｇＯ１゜ ７００ｍＭ Ｍａｉｌ Ｐｖｕ ｌ ： １０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓＩＨＯｌ、 ｐＨざ６θ７ｍＭ Ｍｇ０１ｔ １！ｒＯｍＭ Ｍｏ１ ７ｍＭ コーメルカブトエタノール θ、θ砿 ウシ血清アルノ゛ミン また、ＴＱ−ＤＮＡポリメラーゼ、アルカリホスフオタ
ーゼ、又はＴ！ＤＮＡリガーゼによる処理は、次の酵素
反応溶液を用いて行なった。
ＴグＤＮＡポリメラーゼ：
４７ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＯｌ 、 ’７７ｍＭ Ｍｇ
０１ｍ、 １０ｍＭ−一メ＃トエタノール、 Ａ、
７ｔｔＭ ＦｉＤＴＡ、 ／Ａ、ＡｍＭ（Ｎ４Ｌ
）＊ＳＯａ 、 ０．０／ｌ−クチウシ血清アルブミ
ン。
０１ｍ、 １０ｍＭ−一メ＃トエタノール、 Ａ、
７ｔｔＭ ＦｉＤＴＡ、 ／Ａ、ＡｍＭ（Ｎ４Ｌ
）＊ＳＯａ 、 ０．０／ｌ−クチウシ血清アルブミ
ン。
アルカリホスフオターゼ：
／Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＯｌ、／ｍＭ ｐ−ニドｏフェニ
ルホスフェート、ｐＨＬＯ溶液 Ｔ４’ＤＮＡリガーゼ： Ａｌ、ｒｎＭ Ｔｒｉｓ・ＨＯｌ、 Ａ、ＡｍＭ Ｍｇ
Ｏ１，、＃）ｍＭＤＴＴＯ，／−／、ＯｍＭ ＡＴＰ、
ｐＨ７，１，溶液なお、大腸菌の形質転換は、’ Ｍ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃ！ｌｏｎｉｎｇ’第５ＳＯ頁、
ｃｏｍａ日ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ（１９ｇ２）記載の方法に準じて行なった。
ルホスフェート、ｐＨＬＯ溶液 Ｔ４’ＤＮＡリガーゼ： Ａｌ、ｒｎＭ Ｔｒｉｓ・ＨＯｌ、 Ａ、ＡｍＭ Ｍｇ
Ｏ１，、＃）ｍＭＤＴＴＯ，／−／、ＯｍＭ ＡＴＰ、
ｐＨ７，１，溶液なお、大腸菌の形質転換は、’ Ｍ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃ！ｌｏｎｉｎｇ’第５ＳＯ頁、
ｃｏｍａ日ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ（１９ｇ２）記載の方法に準じて行なった。
実施例／
（β−エンドルフィン直接発現用ベクターの構築）（第
１．．２図参照。） プラスミドｐＨＦＯＯＡ（％開昭６θ−グア６ｇ−一方
、プラスミドｐｓＰ ４４’ ［ＮｕＣｌｅｉｃ Ａｃ
１ｄＲｅｓ、／Ｊ、り０封（／９１１１−）］乞Ｐｓｔ
ｌで消化し、両者なＴ＜ｚＤＮＡＩＪガーゼによシ連
絡した。ついで大腸菌Ｒに１株への形質転換によυ大腸
菌内に導入し、 ＯｍｐＦプロモータがｐｓＰＡ＋に
対して正方向に挿入されたプラスミドＰＦ３Ｐ Ａ ４
） ノＯｍｐｒ４を得た。
１．．２図参照。） プラスミドｐＨＦＯＯＡ（％開昭６θ−グア６ｇ−一方
、プラスミドｐｓＰ ４４’ ［ＮｕＣｌｅｉｃ Ａｃ
１ｄＲｅｓ、／Ｊ、り０封（／９１１１−）］乞Ｐｓｔ
ｌで消化し、両者なＴ＜ｚＤＮＡＩＪガーゼによシ連
絡した。ついで大腸菌Ｒに１株への形質転換によυ大腸
菌内に導入し、 ＯｍｐＦプロモータがｐｓＰＡ＋に
対して正方向に挿入されたプラスミドＰＦ３Ｐ Ａ ４
） ノＯｍｐｒ４を得た。
つぎにプラスミドｒｓＰ ６’Ｉ ＯｍｐＦのＯｍｐ
Ｆプロモーター上流に位置するＰｓｔ ｌ切断部位を除
去するため、 Ｐｓｐ ６’Ｉ ＯｍｐＦをａｔｎａ
ｌで消化後、Ｂａｌ ３ ／を作用させ近接するＰｓｔ
（部位を除去し、Ｔ＆ＤＮＡポリメラーゼで断片末端
を平滑末端にした後、Ｈ１ｎ４）１ ！Ｊンカー存在下
でＴ４’ＤＮＡリガーゼと反応させ、得られたＤＮＡサ
ンプルによシ大腸菌ＲＲＩ株の形質転換を行なった。
Ｆプロモーター上流に位置するＰｓｔ ｌ切断部位を除
去するため、 Ｐｓｐ ６’Ｉ ＯｍｐＦをａｔｎａ
ｌで消化後、Ｂａｌ ３ ／を作用させ近接するＰｓｔ
（部位を除去し、Ｔ＆ＤＮＡポリメラーゼで断片末端
を平滑末端にした後、Ｈ１ｎ４）１ ！Ｊンカー存在下
でＴ４’ＤＮＡリガーゼと反応させ、得られたＤＮＡサ
ンプルによシ大腸菌ＲＲＩ株の形質転換を行なった。
ミニスクリーニングによシ上流のＰｓｔ １部位のない
プラスミドを形質転換株から単離し、グプロモータ上流
のＰｓｔ １部位を欠失したＰ：Ｂ：Ｐｌ、ｌＩＯｍｐ
Ｆ扁コ／を得た。
プラスミドを形質転換株から単離し、グプロモータ上流
のＰｓｔ １部位を欠失したＰ：Ｂ：Ｐｌ、ｌＩＯｍｐ
Ｆ扁コ／を得た。
め、まず、プラスミドＰＳＰ ６グＯｍｐＦ Ａ 、２
／をｐｓｔ Ｉで消化し、ＴＦＤＮＡポリメラーゼに
より３’−／重鎖ＤＮＡ末端の除去及びμすＩ消化によ
り平滑末端−８ａｌ ｌ末端からなるベクター断号公報
参照〕をＨｈａ ｌ、で消化し、’１４’ＤＮＡポリメ
ラーゼによる。？’ −／重鎖ＤＮＡ末端の除去、つい
で伽よＩで消化し／３ざｂｐの平滑末端−Ｅｉａｐ ｌ
末端ＤＮＡ断１片を得た。
／をｐｓｔ Ｉで消化し、ＴＦＤＮＡポリメラーゼに
より３’−／重鎖ＤＮＡ末端の除去及びμすＩ消化によ
り平滑末端−８ａｌ ｌ末端からなるベクター断号公報
参照〕をＨｈａ ｌ、で消化し、’１４’ＤＮＡポリメ
ラーゼによる。？’ −／重鎖ＤＮＡ末端の除去、つい
で伽よＩで消化し／３ざｂｐの平滑末端−Ｅｉａｐ ｌ
末端ＤＮＡ断１片を得た。
このベクター断片と／３ざｂｐＤＮＡ断片をＴｌＩＤ
Ｎ Ａ ＩＪガーゼで連結し、大腸菌ＲＲ工株への形質
転換によ如プラスミドｐＮＭコ００を得た。
Ｎ Ａ ＩＪガーゼで連結し、大腸菌ＲＲ工株への形質
転換によ如プラスミドｐＮＭコ００を得た。
Ｏｍｐシグナルペグチド遺伝子とβ−エンドルフＧ１１
ｂｅｒｔ法で行ない、予想された塩基配列であることを
確認した。
ｂｅｒｔ法で行ない、予想された塩基配列であることを
確認した。
参考例／
実施例１で得られたプラスミドＨ・ＮｉＭ ２００にて
形質転換された大腸菌Ｎ？ｆを、Ｍ−９培地（’Ｆ＋ｘ
ｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｇｅ
ｎｅｔｉｃｓ 、 ’Ｉ ３ ／頁、 ０ｏ１４
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ’ｒｂｏｒ Ｌａｂｏ’ｒａｔ
ｏｒｙ （／デクコ）〕を用いて培養した。後期対数
増殖期において集菌し、常法によシ、細胞の各成分の分
画を行なった〔分画はＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌｏｇｙ ／ ＩＩ ！； 。
形質転換された大腸菌Ｎ？ｆを、Ｍ−９培地（’Ｆ＋ｘ
ｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｇｅ
ｎｅｔｉｃｓ 、 ’Ｉ ３ ／頁、 ０ｏ１４
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ’ｒｂｏｒ Ｌａｂｏ’ｒａｔ
ｏｒｙ （／デクコ）〕を用いて培養した。後期対数
増殖期において集菌し、常法によシ、細胞の各成分の分
画を行なった〔分画はＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌｏｇｙ ／ ＩＩ ！； 。
コ、１０１！；−１（１５）０（／９ざＯ）に記載され
た方法ン〔…工〕を標識として、ラジオイムノアッセイ
によりβ−エンドルフィンの産生量を調べた。
た方法ン〔…工〕を標識として、ラジオイムノアッセイ
によりβ−エンドルフィンの産生量を調べた。
結果は、培地中にλ、ｆｆ〜／１３．ペリプラズム中に
？ＡμＩ／１１で１１、大部分が菌体外に分泌産生され
たことがわかる。
？ＡμＩ／１１で１１、大部分が菌体外に分泌産生され
たことがわかる。
参考例コ
（プラスミドｐＲＬＫ ／ ｌＩの構築）（第３≠坤榊
回参照吠） （１） プラスミドｐＰＬｃ、２．７６（Ｇｅｎｅ
／ｊ、 ｇ ／−９３１？ざｌ参照）を、担ＲＩ、力凹
Ｉで処理（３７℃、グ時間）し、／ ／ ００ ｂｐの
ＤＮＡ断片を得た。ついで、Ｓａｕ、？Ａで消化（３７
（ＩＩ） プラスミドｐＲＫ ｌの作成プラスミドｐ
ＢＲ３２：１をＯｌａ ｌ、Ｂａｍ５１テ消化（３７℃
、り時間）し大きい断片を得、一方、′）ＸＤ Ｎ Ａ
をｏｘａ ｉ、Ｍｌで消化（３７℃、グ時間）し、約／
／ ００ ｂｐのＤＮＡ断片を得、ついで両断片をＴ
！ＤＮＡリガーゼで連結した。
回参照吠） （１） プラスミドｐＰＬｃ、２．７６（Ｇｅｎｅ
／ｊ、 ｇ ／−９３１？ざｌ参照）を、担ＲＩ、力凹
Ｉで処理（３７℃、グ時間）し、／ ／ ００ ｂｐの
ＤＮＡ断片を得た。ついで、Ｓａｕ、？Ａで消化（３７
（ＩＩ） プラスミドｐＲＫ ｌの作成プラスミドｐ
ＢＲ３２：１をＯｌａ ｌ、Ｂａｍ５１テ消化（３７℃
、り時間）し大きい断片を得、一方、′）ＸＤ Ｎ Ａ
をｏｘａ ｉ、Ｍｌで消化（３７℃、グ時間）し、約／
／ ００ ｂｐのＤＮＡ断片を得、ついで両断片をＴ
！ＤＮＡリガーゼで連結した。
得られたプラスミドをＥｃｏＲＩで消化した後ＴｌｌＤ
ＮＡポリメラーゼ処理し、完全な二重鎖の平滑末端とし
、さらにリガーゼ処理した。
ＮＡポリメラーゼ処理し、完全な二重鎖の平滑末端とし
、さらにリガーゼ処理した。
つぎに、ｓａｘ Ｉで消化した後、Ｂａ１Ｊ／エキソヌ
クレアーゼで処理して二重鎖ＤＮＡの末端を分解し、リ
ンカ−ｇｉ４ｉ４Ｈｇｇ、３’、を付加し、リガーゼ処
理する。
クレアーゼで処理して二重鎖ＤＮＡの末端を分解し、リ
ンカ−ｇｉ４ｉ４Ｈｇｇ、３’、を付加し、リガーゼ処
理する。
ついでＥｃｏＲｉで消化し、さらにリガーゼ処理し、プ
ラスミドを得る。その中よｆ）、ｓｑ、２ｂｐのＫｃｏ
Ｒｌ −Ｊ（ｉｎｄ ｌ断片を含むプラスミドｐＯＱ、
Ｖ、？を得る。
ラスミドを得る。その中よｆ）、ｓｑ、２ｂｐのＫｃｏ
Ｒｌ −Ｊ（ｉｎｄ ｌ断片を含むプラスミドｐＯＱ、
Ｖ、？を得る。
プラスミドｐＯＱＶ、７をＢｃｏＲ（、Ａｃｅ ｌで消
化し大きい断片を得る。
化し大きい断片を得る。
一方、ブラスミドメ且１ （Ｇｅｎｅ Ａｍｐｌｉｆｉ
ｃａ−ｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｖｏｌ
ｌ 、 Ｊｇ、？（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ社Ｎｏｒｔｈ Ｈ
ｏ１ｌａｎｄ ） （／９１１）参照。） ５ Ｅ、ｃ
ｏＲｌ 。
ｃａ−ｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｖｏｌ
ｌ 、 Ｊｇ、？（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ社Ｎｏｒｔｈ Ｈ
ｏ１ｌａｎｄ ） （／９１１）参照。） ５ Ｅ、ｃ
ｏＲｌ 。
主副１で消化し小さい断片を得る。
この両断片をリガーゼ処理して連結し、プラ上記（＋１
で得た。２３ ／ ｂｐの断片をＤＮＡポリメラーゼで
修復し、平滑末端とし、上記プラスミドｐＲＫ ｌをＳ
ｍａ ｌで消化して得られる大断片とりガーゼにより連
結し、シラスミドｐＲＬＫ ／り（ｊ、、２に１））を
得だ。
で得た。２３ ／ ｂｐの断片をＤＮＡポリメラーゼで
修復し、平滑末端とし、上記プラスミドｐＲＫ ｌをＳ
ｍａ ｌで消化して得られる大断片とりガーゼにより連
結し、シラスミドｐＲＬＫ ／り（ｊ、、２に１））を
得だ。
実施例λ
実施例１で得られたプラスミドｐｓＰ ｔ ４）０ｍｐ
ＦＡ、２／を那Ｉで消化し、ＴりＤＮＡポリメラーゼで
断片末端を平滑化し、町邊Ｉ ！Ｊンカー存在下でＴ４
ＺＤＮＡＩＪガーゼと反応させ、Ｊ（ｐａｌ リンカ−
を付加したプラスミドｐＳＰ ｌ＝ ’１０ｍｐ ＩＪ
’ 、（Ｈｐａ Ｉリンカ−）を得た。ついでこのシラ
スミドをＨ１ｎ４’Ｉｌｌ及び基型Ｉで消化し／ｇＯｂ
ｐのＤＮＡ断片を丁 得、さらにｙｎｘｌで消化し、（唆７遺伝子の雪Ｆシグ
ナル領域を含むＤＮＡ断片を得た。
ＦＡ、２／を那Ｉで消化し、ＴりＤＮＡポリメラーゼで
断片末端を平滑化し、町邊Ｉ ！Ｊンカー存在下でＴ４
ＺＤＮＡＩＪガーゼと反応させ、Ｊ（ｐａｌ リンカ−
を付加したプラスミドｐＳＰ ｌ＝ ’１０ｍｐ ＩＪ
’ 、（Ｈｐａ Ｉリンカ−）を得た。ついでこのシラ
スミドをＨ１ｎ４’Ｉｌｌ及び基型Ｉで消化し／ｇＯｂ
ｐのＤＮＡ断片を丁 得、さらにｙｎｘｌで消化し、（唆７遺伝子の雪Ｆシグ
ナル領域を含むＤＮＡ断片を得た。
一方、参考例コで得られたプラスミドｐＲＬＫ／／Ｉを
Ｎｒｕ ｌ 、 Ｍｌｕ ■で消化し、上記Ｏｍｐ Ｆ
シグナチドをコードするＤＮＡの切断点に唯一の■１部
位を有するプラスミドである（第７図参照）。
Ｎｒｕ ｌ 、 Ｍｌｕ ■で消化し、上記Ｏｍｐ Ｆ
シグナチドをコードするＤＮＡの切断点に唯一の■１部
位を有するプラスミドである（第７図参照）。
参考例３
（プラスミドｐＲＬＫ ／ ４’−ｍの構築）（第ｊ及
び６図参照） ℃、９時間）、ＴｌｌＤＮＡポリメラーゼで処理しく
Ｊ ？ ℃、１時間）、多くの制限酵素認識部位を有す
る＋？ｂｐの断片を得た。
び６図参照） ℃、９時間）、ＴｌｌＤＮＡポリメラーゼで処理しく
Ｊ ？ ℃、１時間）、多くの制限酵素認識部位を有す
る＋？ｂｐの断片を得た。
一方、上記プラスミドｐＲＬＫ ／’Ｉ （！、 ２
Ｋｂ ）ｋ損且■で消化（３７℃、ダ時間）し、さらに
アルカリホスフオターゼ処理（６θ℃、３０分間〕した
後、上記グ９ ｂｐの断片と連結した（／ユ℃、７６時
間）得られたプラスミドｐＲＬＫ／Ｑ−ｍの制限酵素切
断地図を第６図に示す。
Ｋｂ ）ｋ損且■で消化（３７℃、ダ時間）し、さらに
アルカリホスフオターゼ処理（６θ℃、３０分間〕した
後、上記グ９ ｂｐの断片と連結した（／ユ℃、７６時
間）得られたプラスミドｐＲＬＫ／Ｑ−ｍの制限酵素切
断地図を第６図に示す。
ユニーク部位ニジ猛１．坦６ ｆ 、 Ａｖａ Ｉ ｂ
匡すＩ、又眼１．謹■ 実施例３ 実施例／で得られた。Ｈｐａｌ リンカ−付加プラ７
スミド（ｐｓＰ Ａ ’ｉ ０ｍｐ Ｆ （Ｈｐａ Ｉ
リンカ−）を、 Ｈ１ｎｄ■及びｋｌで消化し／１Ｏｂ
ｐのＤＮＡ断片を得、さらに胎旦■で消化し、ざＯｂｐ
のＤＮＡ断片を得だ。
匡すＩ、又眼１．謹■ 実施例３ 実施例／で得られた。Ｈｐａｌ リンカ−付加プラ７
スミド（ｐｓＰ Ａ ’ｉ ０ｍｐ Ｆ （Ｈｐａ Ｉ
リンカ−）を、 Ｈ１ｎｄ■及びｋｌで消化し／１Ｏｂ
ｐのＤＮＡ断片を得、さらに胎旦■で消化し、ざＯｂｐ
のＤＮＡ断片を得だ。
一方、シラスミドｐＵｏ ｔをＭｉｎｅ ｌで消化し、
これを上記ｔＯｂｐ断片とＴ４’ＤＮＡリガーゼによシ
連結した。得られたプラスミド及び参考例３により得ら
れるプラスミドｐＲＩＪ ／ ’ｌ ｍ−／を、それぞ
れＢａｍＨ■及びＭｌｕ ｌ で消化し、ＴＶＤＮＡリ
ガーゼを用いて連結し、目的とするプラスミドｐＲＬＫ
／ ｌＩｍ−ＯｍｐＦｓ有し、慟Ｆシグナルペプチド
の切断点にユニーりな制限酵素部位、Ｍ’ｌｕ １ 部
位を有する。
これを上記ｔＯｂｐ断片とＴ４’ＤＮＡリガーゼによシ
連結した。得られたプラスミド及び参考例３により得ら
れるプラスミドｐＲＩＪ ／ ’ｌ ｍ−／を、それぞ
れＢａｍＨ■及びＭｌｕ ｌ で消化し、ＴＶＤＮＡリ
ガーゼを用いて連結し、目的とするプラスミドｐＲＬＫ
／ ｌＩｍ−ＯｍｐＦｓ有し、慟Ｆシグナルペプチド
の切断点にユニーりな制限酵素部位、Ｍ’ｌｕ １ 部
位を有する。
実施例ｙ
（カルデイオナトリン直接発現用ベクターの構築）（第
ｇ図参照） 実施例コで得たプラスミドｐｓＰ ＡりＯｍｐ Ｆ （
Ｈｐａｌ １．１ンカー）を狽ユＩ及びカ旦Ｈ１で消化
して得られる断片、第２図に示す合成リンカ−並びにプ
ラスミドｐｈＡＮＦ ＩＩ ｇ （Ｎａｔｕｒｅ ＬＵ
２６９９゜ｌ？ｇグ参照）を拒、、？ Ａ ｌで消化し
て得られるカルデイオナトリン（アミノ酸グ〜２ｇ）を
コードする遺伝子を含む／ｑＯｂｐＤＮＡ断片をＴ／ｌ
ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、Ｏｍｐ Ｆシグナルペ
プチドの０末端アミノ酸と成熟カルデイオナトリンのＮ
末端アミノ酸とが直接結合した前躯体蛋白をコードする
遺伝子をＯｍｐＦプロモータの下流に含有するプラスミ
ドｐｓＰＯＦＡを得だ。
ｇ図参照） 実施例コで得たプラスミドｐｓＰ ＡりＯｍｐ Ｆ （
Ｈｐａｌ １．１ンカー）を狽ユＩ及びカ旦Ｈ１で消化
して得られる断片、第２図に示す合成リンカ−並びにプ
ラスミドｐｈＡＮＦ ＩＩ ｇ （Ｎａｔｕｒｅ ＬＵ
２６９９゜ｌ？ｇグ参照）を拒、、？ Ａ ｌで消化し
て得られるカルデイオナトリン（アミノ酸グ〜２ｇ）を
コードする遺伝子を含む／ｑＯｂｐＤＮＡ断片をＴ／ｌ
ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、Ｏｍｐ Ｆシグナルペ
プチドの０末端アミノ酸と成熟カルデイオナトリンのＮ
末端アミノ酸とが直接結合した前躯体蛋白をコードする
遺伝子をＯｍｐＦプロモータの下流に含有するプラスミ
ドｐｓＰＯＦＡを得だ。
プラスミドｐｓＰＯＦＡを用いて常法により大腸菌Ｎり
９を形質転換させ、成熟力ルデイオナトリンの産生量ヲ
ラジオイムノアツセイで測定したととろ、菌体外に７μ
ｍ１／１３のカルデイオナトリンが検出されたが、菌体
内にはカルデイオナ） ＩＪンは検出されなかった。
９を形質転換させ、成熟力ルデイオナトリンの産生量ヲ
ラジオイムノアツセイで測定したととろ、菌体外に７μ
ｍ１／１３のカルデイオナトリンが検出されたが、菌体
内にはカルデイオナ） ＩＪンは検出されなかった。
〈発明の効果〉
本発明のベクターは１分泌ベクターとして成熟蛋白を細
胞外に分泌させることができる。
胞外に分泌させることができる。
第７図及び第２図は成熟β−エンドルフィンを表現させ
るための本発明のプラスミドｐＮＭ、２００の造成を示
す工程図であシ、第３図相脛徊モ抽はプラスミドベクタ
ーｐＲＬＫ ／ダの造成を示す工程図であシ、第ｙ図及
び第３〜７図は。 Ｏｍｐ Ｆ シグナルペプチドをコードするＤＮＡの３
′末端に所望の蛋白をコードするＤＮＡをＭｌｕ ］部
位を利用して挿入可能なベクターの構築を示す図であり
、第２図は成熟カルデイオナトリンを表現させるための
本発明のプラスミドｐｓＰＯＦＡの構築を示す図である
。 出 願 人 三菱化成工業株式会社 代 理 人 弁理士 要否用 − ほか７名 ６ｔ”Ｂ ↓βａ〆３／ ドルカイ；、Ｆ双；屁） ↓リカ”−ｅ １畳１？１ ↓リガーゼ′ 第３図（−仲弓） ＳａｕＥＡ ＆ｏＲＩ ■−・□ ＬばＩ トＦ “″ ｌゆ７ 【１ し３Ａ 囲 ↓ム〜Ａボ°リメラー℃゛ １ リカ゛−セ゛ ＰＶ
るための本発明のプラスミドｐＮＭ、２００の造成を示
す工程図であシ、第３図相脛徊モ抽はプラスミドベクタ
ーｐＲＬＫ ／ダの造成を示す工程図であシ、第ｙ図及
び第３〜７図は。 Ｏｍｐ Ｆ シグナルペプチドをコードするＤＮＡの３
′末端に所望の蛋白をコードするＤＮＡをＭｌｕ ］部
位を利用して挿入可能なベクターの構築を示す図であり
、第２図は成熟カルデイオナトリンを表現させるための
本発明のプラスミドｐｓＰＯＦＡの構築を示す図である
。 出 願 人 三菱化成工業株式会社 代 理 人 弁理士 要否用 − ほか７名 ６ｔ”Ｂ ↓βａ〆３／ ドルカイ；、Ｆ双；屁） ↓リカ”−ｅ １畳１？１ ↓リガーゼ′ 第３図（−仲弓） ＳａｕＥＡ ＆ｏＲＩ ■−・□ ＬばＩ トＦ “″ ｌゆ７ 【１ し３Ａ 囲 ↓ム〜Ａボ°リメラー℃゛ １ リカ゛−セ゛ ＰＶ
Claims (16)
- （１）プロモータの下流にＯｍｐＦシグナルペプチドの
Ｃ末端アミノ酸と所望の蛋白のＮ末端アミノ酸とが直接
結合した前駆体蛋白をコードする遺伝子が挿入されてな
る発現用ベクター。 - （２）所望の蛋白が成熟蛋白であることを特徴とする特
許請求の範囲第１項記載のベクター。 - （３）成熟蛋白がβ−エンドルフィン又はカルデイオナ
トリンであることを特徴とする特許請求の範囲第２項記
載のベクター。 - （４）プラスミドベクターであることを特徴とする特許
請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載のベクター。 - （５）複製起点及び選択マーカを有し、かつプロモータ
と前駆体蛋白をコードする遺伝子の転写方向及び翻訳フ
レームが一致していることを特徴とする特許請求の範囲
第１〜４項のいずれかに記載のベクター。 - （６）複製起点が大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２に由来
することを特徴とする特許請求の範囲第５項記載のベク
ター。 - （７）選択マーカが抗生物質耐性遺伝子であることを特
徴とする特許請求の範囲第５項記載のベクター。 - （８）選択マーカがアンピンリン耐性遺伝子であること
を特徴とする特許請求の範囲第７項記載のベクター。 - （９）プロモータがλファージのＰＲ及びＰＬプロモー
タ又はＯｍｐＦプロモータであることを特徴とする特許
請求の範囲第１〜８項のいずれかに記載のベクター。 - （１０）λファージのＰＲ及びＰＬプロモータが温度感
受性レプレッサーで調節されることを特徴とする特許請
求の範囲第９項記載のベクター。 - （１１）該温度感受性レプレッサーがｃＩ８５７蛋白で
あることを特徴とする特許請求の範囲第１０項記載のベ
クター。 - （１２）プロモータの下流にＯｍｐＦシグナルペプチド
のＣ末端アミノ酸と所望の蛋白のＮ末端アミノ酸とが直
接結合した前駆体蛋白をコードする遺伝子が挿入されて
なる発現用ベクターを宿主に導入し、該発現用ベクター
で形質転換された宿主を培養し、該前駆体蛋白又は所望
の蛋白を取得することを特徴とする蛋白の産生方法。 - （１３）所望の蛋白が成熟蛋白であることを特徴とする
特許請求の範囲第１２項記載の方法。 - （１４）該宿主が大腸菌であることを特徴とする特許請
求の範囲第１２項記載の方法。 - （１５）プロモータの下流にＯｍｐＦシグナルペプチド
のＣ末端アミノ酸と所望の蛋白のＮ末端アミノ酸とが直
接結合した前駆体蛋白をコードする遺伝子が挿入されて
なる発現用ベクターで形質転換された宿主。 - （１６）大腸菌であることを特徴とする特許請求の範囲
第１５項記載の宿主。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60106659A JPS61265092A (ja) | 1985-05-18 | 1985-05-18 | 発現用ベクタ−、これを用いる蛋白の産生方法及び該ベクタ−で形質転換された宿主 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60106659A JPS61265092A (ja) | 1985-05-18 | 1985-05-18 | 発現用ベクタ−、これを用いる蛋白の産生方法及び該ベクタ−で形質転換された宿主 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61265092A true JPS61265092A (ja) | 1986-11-22 |
Family
ID=14439219
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60106659A Pending JPS61265092A (ja) | 1985-05-18 | 1985-05-18 | 発現用ベクタ−、これを用いる蛋白の産生方法及び該ベクタ−で形質転換された宿主 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61265092A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01300893A (ja) * | 1988-05-27 | 1989-12-05 | Shigetada Nakanishi | ヒトカリクレイン様蛋白質の産生方法 |
| WO2003016538A1 (en) * | 2001-08-14 | 2003-02-27 | Korea Advanced Institute Of Science And Technology | A method or extracellular production of target proteins employing ompf in e. coli |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6030687A (ja) * | 1983-08-01 | 1985-02-16 | Wakunaga Seiyaku Kk | Ｄνａ遺伝子，その製造法およびそれを含むプラスミド |
| JPS6047682A (ja) * | 1983-08-23 | 1985-03-15 | Mitsubishi Chem Ind Ltd | 新規なプラスミドベクタ− |
-
1985
- 1985-05-18 JP JP60106659A patent/JPS61265092A/ja active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6030687A (ja) * | 1983-08-01 | 1985-02-16 | Wakunaga Seiyaku Kk | Ｄνａ遺伝子，その製造法およびそれを含むプラスミド |
| JPS6047682A (ja) * | 1983-08-23 | 1985-03-15 | Mitsubishi Chem Ind Ltd | 新規なプラスミドベクタ− |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01300893A (ja) * | 1988-05-27 | 1989-12-05 | Shigetada Nakanishi | ヒトカリクレイン様蛋白質の産生方法 |
| JPH0448432B2 (ja) * | 1988-05-27 | 1992-08-06 | Shigetada Nakanishi | |
| WO2003016538A1 (en) * | 2001-08-14 | 2003-02-27 | Korea Advanced Institute Of Science And Technology | A method or extracellular production of target proteins employing ompf in e. coli |
| KR100447530B1 (ko) * | 2001-08-14 | 2004-09-08 | 한국과학기술원 | ＯｍｐＦ를 이용하여 목적 단백질을 대장균 세포외로분비생산하는 방법 |
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