JPS6047682A - 新規なプラスミドベクタ− - Google Patents
新規なプラスミドベクタ−Info
- Publication number
- JPS6047682A JPS6047682A JP58153467A JP15346783A JPS6047682A JP S6047682 A JPS6047682 A JP S6047682A JP 58153467 A JP58153467 A JP 58153467A JP 15346783 A JP15346783 A JP 15346783A JP S6047682 A JPS6047682 A JP S6047682A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- fragment
- plasmid
- dna
- restriction enzyme
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- C07K14/245—Escherichia (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/665—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans derived from pro-opiomelanocortin, pro-enkephalin or pro-dynorphin
- C07K14/67—Lipotropins, e.g. beta, gamma lipotropin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/665—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans derived from pro-opiomelanocortin, pro-enkephalin or pro-dynorphin
- C07K14/675—Beta-endorphins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は新規なグラスミドベクターに関する。
さらに詳しくは微生物中においてタンノくりの発現に好
適に使用されるプラスミドベクターに関する。
適に使用されるプラスミドベクターに関する。
大腸菌の外膜を構成するタンパク質のひとつである０Ｋ
１１ｐＦタンパク質は、大＋１＆菌が最も多量に生産す
るタンパク質のひとつである。その遺伝子ｏｍｐ Ｆ’
のプロモーターやリポソーム結合領域は牲わめて効率よ
く機能しているものと考えられる。ｏｍｐ Ｆ遺伝子の
発現は複雑な制御を受けるが、そのひとつとしてｏｍｐ
’ｉｒ遺伝子発現の正の制御遺伝子Ｏｍｐ Ｂ遺伝子
が知ら第１ており、巴叩−Ｂ欠損変異株では圧吠Ｆ遺伝
子は発現しない。また培地の浸透圧によっても制御フ受
け。
１１ｐＦタンパク質は、大＋１＆菌が最も多量に生産す
るタンパク質のひとつである。その遺伝子ｏｍｐ Ｆ’
のプロモーターやリポソーム結合領域は牲わめて効率よ
く機能しているものと考えられる。ｏｍｐ Ｆ遺伝子の
発現は複雑な制御を受けるが、そのひとつとしてｏｍｐ
’ｉｒ遺伝子発現の正の制御遺伝子Ｏｍｐ Ｂ遺伝子
が知ら第１ており、巴叩−Ｂ欠損変異株では圧吠Ｆ遺伝
子は発現しない。また培地の浸透圧によっても制御フ受
け。
高浸透圧培地中では五Ｆ遺伝子の発現は抑制される。
シラーＦ遺伝子の全塩基配列は本発明者らによって決定
されたが、それによればＯｍｐ Ｆタンパク質はまずア
ミノ末端に２λ個のアミノ酸よりなるシグナル・ペプチ
ドを有する前駆体として合成される。このシグナル・ペ
プチドはＯｍｐ Ｆり／バク質の細胞質膜からの分泌に
必須の役割を果たしているものと考えられる。さらにＯ
ｍｐＦタンパク質は外膜中で細胞壁を構成するペプチド
グリカンと強い親和性をもった非常に安定な形で多量に
存在しており、この性質を利用して菌体から容易に精製
することのできるタンパク質でもある。
されたが、それによればＯｍｐ Ｆタンパク質はまずア
ミノ末端に２λ個のアミノ酸よりなるシグナル・ペプチ
ドを有する前駆体として合成される。このシグナル・ペ
プチドはＯｍｐ Ｆり／バク質の細胞質膜からの分泌に
必須の役割を果たしているものと考えられる。さらにＯ
ｍｐＦタンパク質は外膜中で細胞壁を構成するペプチド
グリカンと強い親和性をもった非常に安定な形で多量に
存在しており、この性質を利用して菌体から容易に精製
することのできるタンパク質でもある。
本発明は、上記のような性質ｌ有する大腸菌ｔはじめと
するグラム陰性菌の外膜タンパク質をコードするＯｍｐ
Ｆ遺伝子に関する研究の一環として、このＯｍｐＦ遺伝
子な含むプラスミドについて種々検討を行ない、本発明
に到達した。
するグラム陰性菌の外膜タンパク質をコードするＯｍｐ
Ｆ遺伝子に関する研究の一環として、このＯｍｐＦ遺伝
子な含むプラスミドについて種々検討を行ない、本発明
に到達した。
すなわち、本発明の要旨は、大腸菌由来リラックス捜プ
ラスミドにグラム陰性菌ｏｍｐＦプロモーター欠含むｐ
二Ｉフラグメント、±■−四ｘ１４１フラグノントまた
はＶ匹■−ジ＋ｔ１．（部分消化〕フラグメントを・挿
入して得られるプラスミドベクターに存する。
ラスミドにグラム陰性菌ｏｍｐＦプロモーター欠含むｐ
二Ｉフラグメント、±■−四ｘ１４１フラグノントまた
はＶ匹■−ジ＋ｔ１．（部分消化〕フラグメントを・挿
入して得られるプラスミドベクターに存する。
以下、本発明の詳細な説明する。
まず１本発明において原料プラスミドとして用いられる
のは、大腸菌由来で細胞当り多数コピーとして存在する
プラスミド、すなわちいわゆる大腸菌由来リラックス型
プラスミドである。
のは、大腸菌由来で細胞当り多数コピーとして存在する
プラスミド、すなわちいわゆる大腸菌由来リラックス型
プラスミドである。
このようなプラスミドとしては、特に制限されないが、
たとえばｐＢＲ３２コ、ｐＢＲ３２！；、ｐＡＯＹｏ／
ｇｌ１等が挙げられるが、ｐＢＲ３コニが最も好ましい
。
たとえばｐＢＲ３２コ、ｐＢＲ３２！；、ｐＡＯＹｏ／
ｇｌ１等が挙げられるが、ｐＢＲ３コニが最も好ましい
。
本発明のプラスミドベクターは、この原料プラスミドに
上記したＯｍｐＦプロモーターを含む特定のＤＮＡフラ
グメントを導入して造成される。このＤＮＡフラグメン
トは、ａｍｐ Ｆプロモーターを含む下記フラグメンｌ
−（ＩＪ、（ＩＩ） ｉたは（■）である。
上記したＯｍｐＦプロモーターを含む特定のＤＮＡフラ
グメントを導入して造成される。このＤＮＡフラグメン
トは、ａｍｐ Ｆプロモーターを含む下記フラグメンｌ
−（ＩＪ、（ＩＩ） ｉたは（■）である。
（Ｉ） ムリ、■フラグメント
（ｎＪ Ａ’］ヱ■−シ１■フラグメント（［［） Ａ
’ｌｕ Ｉ −Ｐｅｔ Ｉ （部分消化）フラグメント
このＤ Ｎ Ａフラグメント（・マたとえば、次のよう
にして得られる。
’ｌｕ Ｉ −Ｐｅｔ Ｉ （部分消化）フラグメント
このＤ Ｎ Ａフラグメント（・マたとえば、次のよう
にして得られる。
すなわち、大腸菌に一／コの±Ｐ゛形質導入ファージで
あるλｏｍｐ Ｆ ／ （Ｊｏ＋１ｒｎａ１． ｏｆＢ
ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、 ７ダ！ｒ、１０ｇｋ−１０
９０Ｃ／９ｇ０）参照）を、それぞれ制限酵素（ｉＪ
Ａｌｕ ｉ、（１１）ジヱＩとシ陰■または（ｉｌ）Δ
把」どヱＩ（部分消化）を用いて切断して単離すること
【より上記ＣＩ）、（ＩＩＪまたは（■〕で示されるＤ
ＮＡフラグメントが得られる。
あるλｏｍｐ Ｆ ／ （Ｊｏ＋１ｒｎａ１． ｏｆＢ
ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、 ７ダ！ｒ、１０ｇｋ−１０
９０Ｃ／９ｇ０）参照）を、それぞれ制限酵素（ｉＪ
Ａｌｕ ｉ、（１１）ジヱＩとシ陰■または（ｉｌ）Δ
把」どヱＩ（部分消化）を用いて切断して単離すること
【より上記ＣＩ）、（ＩＩＪまたは（■〕で示されるＤ
ＮＡフラグメントが得られる。
このようにして得られた上記フラグメントｖ大腸菌由来
リラックス型プラスミドに挿入する方法としては、（１
）同プラスミドを上記フラグメントを得るに使用したの
と同じ制限酵素で切断して得られろＤＮＡフラグメント
と上記フラグメントと７％ Ｄ Ｎ Ａリガーゼで連結
して環化させる方法（ただし、ａｌｕ ■フラグメント
は平滑末端を有づ゛るので、同プラスミドを線状化して
平滑末端としたＤＮＡフラグメントとＡｌｔｏ Ｉフラ
グメントとを連結して環化させることもできる。〕、（
２）いわゆるホモポリマー・テーリング法により、大腸
自由米リラックス型プラスミドの適当な制限酵素切断部
位（Ｉ）ＢＲ，？コΩの場合、好ましくはＰｓｔ■部位
）に上記フラグメン）Ｙ挿入する方法、および（３）７
以上の制限酵素認識部位を有する合成リンカー分子を上
記フラグメントの両末端に連結させて後、リンカ−分子
中に含まれる上記制限酵素認識部位な切断する制限酵素
で切断し、得られるＤ １（Ａフラグメントを大腸菌由
来リラックス型プラスミドの同制限酵素切断部位に挿入
する方法があげられる。
リラックス型プラスミドに挿入する方法としては、（１
）同プラスミドを上記フラグメントを得るに使用したの
と同じ制限酵素で切断して得られろＤＮＡフラグメント
と上記フラグメントと７％ Ｄ Ｎ Ａリガーゼで連結
して環化させる方法（ただし、ａｌｕ ■フラグメント
は平滑末端を有づ゛るので、同プラスミドを線状化して
平滑末端としたＤＮＡフラグメントとＡｌｔｏ Ｉフラ
グメントとを連結して環化させることもできる。〕、（
２）いわゆるホモポリマー・テーリング法により、大腸
自由米リラックス型プラスミドの適当な制限酵素切断部
位（Ｉ）ＢＲ，？コΩの場合、好ましくはＰｓｔ■部位
）に上記フラグメン）Ｙ挿入する方法、および（３）７
以上の制限酵素認識部位を有する合成リンカー分子を上
記フラグメントの両末端に連結させて後、リンカ−分子
中に含まれる上記制限酵素認識部位な切断する制限酵素
で切断し、得られるＤ １（Ａフラグメントを大腸菌由
来リラックス型プラスミドの同制限酵素切断部位に挿入
する方法があげられる。
以下上記した（３）の方法について詳しく述べろ。
合成リンカ−分子としては、μユＲ工、旦シリ、■、シ
ＬｎｌＨ１，Ｓａ’ｌＪ制限酵素認識部位を有するもの
が好ましいが、特に旦ユＲニリンカーが好適である。
ＬｎｌＨ１，Ｓａ’ｌＪ制限酵素認識部位を有するもの
が好ましいが、特に旦ユＲニリンカーが好適である。
１００ Ｒニリンカーを使用して」二記したＯｍｐＦブ
ローモーターな含ｔｒＤＮＡフラグメントにＦｉｃｏ、
Ｒ工末端を形成させるには、たとえば以下のような方法
が採用される。
ローモーターな含ｔｒＤＮＡフラグメントにＦｉｃｏ、
Ｒ工末端を形成させるには、たとえば以下のような方法
が採用される。
１）皇Ｉフラグメントの場合
ム把、■フラグメント（ｊ、Ｚ＆ｂｐ）とＥｅＯＲＩリ
ンカーン連結させ、ついではＨａ Ｒ工で消化する。
ンカーン連結させ、ついではＨａ Ｒ工で消化する。
ｉｌＪ Ａｌｕ Ｉ −ＢｇＩ ＴＩ ７ ラグメント
ノ場合Ａ１ｕＩ −ＢｇｌｌＩ ７ ラグメ７トｃ左／
、Ｚｂｐ）をＤＮＡポリメラーゼｌのＫｌｅｎｏｗ フ
ラグメントによりＢｇｌ ’５１末Ｑヶ平滑末端どし、
ついでＫＣＯＲＩＩＪンカーと混合し、結合させた後、
岬Ｒ工で消化する。
ノ場合Ａ１ｕＩ −ＢｇｌｌＩ ７ ラグメ７トｃ左／
、Ｚｂｐ）をＤＮＡポリメラーゼｌのＫｌｅｎｏｗ フ
ラグメントによりＢｇｌ ’５１末Ｑヶ平滑末端どし、
ついでＫＣＯＲＩＩＪンカーと混合し、結合させた後、
岬Ｒ工で消化する。
ｍ）ａｘｕ ｒ −ｐｓｔ Ｉ （部分消化ラフラダメ
ントの場合 源ユＩ−シ髪Ｉ（部分消化）フラグメント（＋ｆ、２１
）Ｉ））’ｋｓ／ヌクレアーゼ処理してＰｅｔ ■消化
で得られた一本鎖部分を切除して平滑末端とし、ついで
ＥａＯＲニリンカーと混合し、連結した後、シ五Ｒ工で
消化ずろ。
ントの場合 源ユＩ−シ髪Ｉ（部分消化）フラグメント（＋ｆ、２１
）Ｉ））’ｋｓ／ヌクレアーゼ処理してＰｅｔ ■消化
で得られた一本鎖部分を切除して平滑末端とし、ついで
ＥａＯＲニリンカーと混合し、連結した後、シ五Ｒ工で
消化ずろ。
このようにしてル碧Ｒ工等の特定の制限酵素消化により
粘着末端あるいは平滑末端を形成させたフラグメントは
、ついで大腸菌白米リラックス型プラスミドを上記した
と同じ制限’Ｉｎ素で切断した部位に挿入される。
粘着末端あるいは平滑末端を形成させたフラグメントは
、ついで大腸菌白米リラックス型プラスミドを上記した
と同じ制限’Ｉｎ素で切断した部位に挿入される。
本発明のプラスミドベクターは、上記したように細胞当
り多数コピーとして存在するりラックス２辺プラスミド
にｏｍｐ Ｆプロモータを含む特定のフラグメントヲ挿
入して得られるものであり、同グロモータ近辺の下流に
伴在する適当な制限酵素切断部位に生理活性を有する有
用なタンパクンコードする異種遺伝子を挿入し、発現ベ
クターとして使用される。このような制限酵素切断部位
としては、上記した。ｍｐ Ｆプロモータを含む特定の
フラグメントの３′禾端の制限酵素切断部位（シ巨−■
部位等）、合成リンカ−を使用した場合には、合成リン
カ−中の制限酵素切断部位（シ圧Ｒ工部位等〕あるいけ
、上記した特定のフラグメント近辺の下流に存在するリ
ラックス型プラスミド中の適当な制限酵素切断部位が使
用さねる。
り多数コピーとして存在するりラックス２辺プラスミド
にｏｍｐ Ｆプロモータを含む特定のフラグメントヲ挿
入して得られるものであり、同グロモータ近辺の下流に
伴在する適当な制限酵素切断部位に生理活性を有する有
用なタンパクンコードする異種遺伝子を挿入し、発現ベ
クターとして使用される。このような制限酵素切断部位
としては、上記した。ｍｐ Ｆプロモータを含む特定の
フラグメントの３′禾端の制限酵素切断部位（シ巨−■
部位等）、合成リンカ−を使用した場合には、合成リン
カ−中の制限酵素切断部位（シ圧Ｒ工部位等〕あるいけ
、上記した特定のフラグメント近辺の下流に存在するリ
ラックス型プラスミド中の適当な制限酵素切断部位が使
用さねる。
なお、異種遺伝子の発現を確実なものとするには、異種
遺伝子の転写・翻訳がＯｍｐＦ７’Ｏモータのコントロ
ール下ＫＤ、ることはもちろん、ホモポリマー・テーリ
ング法７使用した場合を除き、常法により二Ｇ−ＣＪｇ
基対あるいは／１Ｇ−Ｃ塩基対をｏｍｐ Ｆプロモータ
を含むフラグメントに付加する等の方法により異種遺伝
子を正しい解読枠に置く必要のある場合が力・る。
遺伝子の転写・翻訳がＯｍｐＦ７’Ｏモータのコントロ
ール下ＫＤ、ることはもちろん、ホモポリマー・テーリ
ング法７使用した場合を除き、常法により二Ｇ−ＣＪｇ
基対あるいは／１Ｇ−Ｃ塩基対をｏｍｐ Ｆプロモータ
を含むフラグメントに付加する等の方法により異種遺伝
子を正しい解読枠に置く必要のある場合が力・る。
また異種遺伝子？正しい方向性をもって挿入す４）ため
に異種遺伝子のｓ′末☆；驕および３′末端の制限酵素
認識部位を異なったものとすることができる。
に異種遺伝子のｓ′末☆；驕および３′末端の制限酵素
認識部位を異なったものとすることができる。
このようにして得られた発現ベクターで大腸菌（ＨＢ１
０／、λｌ７７６等）を形質転換させ、有用なタンパク
を発現させる。なお、ｏｍｐ Ｆプロモータを含む上記
した７ラグメントはシＦプロモータの下流にＯｍｐ Ｆ
タンパクのシグナルヘフチド乞コードする遺伝子および
Ｏｍｐ ＦタンパクのｕＪ ｍ ｌ＆伝子の一部を含む
ので、目的とするタンパクはＮ末端にＯｍｐ Ｆり／バ
クの一部を含む安定な１１マ合タンパクとして得られる
。
０／、λｌ７７６等）を形質転換させ、有用なタンパク
を発現させる。なお、ｏｍｐ Ｆプロモータを含む上記
した７ラグメントはシＦプロモータの下流にＯｍｐ Ｆ
タンパクのシグナルヘフチド乞コードする遺伝子および
Ｏｍｐ ＦタンパクのｕＪ ｍ ｌ＆伝子の一部を含む
ので、目的とするタンパクはＮ末端にＯｍｐ Ｆり／バ
クの一部を含む安定な１１マ合タンパクとして得られる
。
ヨシＦプロモータは強いプロモータであり、目的とする
タンパクをコードする遺伝子は効率よく転写および翻訳
される。さらにＯｍｐ ？タンパクのシグナルベゾチド
は、発現したタンパクの細胞質１１１Ｘ外への分泌を促
進するので発現したタンパクの分離、精製が容易である
。
タンパクをコードする遺伝子は効率よく転写および翻訳
される。さらにＯｍｐ ？タンパクのシグナルベゾチド
は、発現したタンパクの細胞質１１１Ｘ外への分泌を促
進するので発現したタンパクの分離、精製が容易である
。
り下り災′ｊＪｊａ例により、本発明をさらに詳細に説
明するが、本発明はその要旨を超えない限り、以下の実
施例により限定されるものではない。
明するが、本発明はその要旨を超えない限り、以下の実
施例により限定されるものではない。
実施例１
大腸菌ｘ７コのゼ上Ｆ形質導入ファージである２０ｍ１
） Ｆ／ ＤＮＡ （Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌｏｇｙｉｔｔｓ、ｉｏ３ｚ−ｉｏｑｏ（ｉｙ
ｇｏ））ｙ、６用いてｏｍｐＦ遺伝子を含むＤＮＡフラ
グメントを単離した。
） Ｆ／ ＤＮＡ （Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌｏｇｙｉｔｔｓ、ｉｏ３ｚ−ｉｏｑｏ（ｉｙ
ｇｏ））ｙ、６用いてｏｍｐＦ遺伝子を含むＤＮＡフラ
グメントを単離した。
λＯｍｐＦ／ の増殖は８ｃｂｒｅｎｋとＷｅｉｓｂｅ
ｒｇの方法（Ｍ（＋１ｅｃｕｌａｒ ｈ Ｑｅｎｅｒａ
ｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｅ 、 ／ Ｊ ７ 。
ｒｇの方法（Ｍ（＋１ｅｃｕｌａｒ ｈ Ｑｅｎｅｒａ
ｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｅ 、 ／ Ｊ ７ 。
１０１−．１０’））に従った（Ｌ培地、３０℃）。
λｏｍｐＦ／のＤＮＡｙ常法に従いフェノール抽出によ
って得た後、エタノール沈澱によって回収した。
って得た後、エタノール沈澱によって回収した。
このλ叩１ヱ・／ ＤＮＡを制限酵素源ユ■で完全切断
し、アガロース電気泳動にかり−た。ｏｍｐＦ フロー
モータ一部分を含むμｍｕ Ｉフラグメント（５２ｇ
ｂｐ ）を切り出しく図、２）、Ｄ Ｎ Ａフラグメン
トリ溶出精製を行なった一方１図１に示すようにプラス
ミドｐＢＲ３，２コをＨｌｔｕｌｌｌｌで３７℃、１時
間、完全消化し、ついＵＳ／ヌクレアーゼで処理（２０
℃、１時間〕シ、−不備部分を除去した。さらに、ＥＣ
０ＲＩＩＪンカー存在下に、９℃、７２時間、ＴｌｌＤ
ＮＡ リガーゼでし、形質転換株よりｐＫＪＩＩｉＮｏ
ｏ ｓ Ｙ 得り。
し、アガロース電気泳動にかり−た。ｏｍｐＦ フロー
モータ一部分を含むμｍｕ Ｉフラグメント（５２ｇ
ｂｐ ）を切り出しく図、２）、Ｄ Ｎ Ａフラグメン
トリ溶出精製を行なった一方１図１に示すようにプラス
ミドｐＢＲ３，２コをＨｌｔｕｌｌｌｌで３７℃、１時
間、完全消化し、ついＵＳ／ヌクレアーゼで処理（２０
℃、１時間〕シ、−不備部分を除去した。さらに、ＥＣ
０ＲＩＩＪンカー存在下に、９℃、７２時間、ＴｌｌＤ
ＮＡ リガーゼでし、形質転換株よりｐＫＪＩＩｉＮｏ
ｏ ｓ Ｙ 得り。
ライで、このｐＫＪＩＣＮＯＯ！；’ＩｇＦＬＱｏ Ｒ
工でＪ７℃、／時間消化した。一方、上記Ｖ匹よりＢＩ
ＡフラグメントとＦｉｃＯＲニリンカーを混合（モル比
ｌ：１０）し、ＴグＤＮＡリガーゼで９℃、１２時間処
理し、さらにＥｃＯＲ工で消化し、入し、ｐ１１１Ｊ７
０’／を得た。
工でＪ７℃、／時間消化した。一方、上記Ｖ匹よりＢＩ
ＡフラグメントとＦｉｃＯＲニリンカーを混合（モル比
ｌ：１０）し、ＴグＤＮＡリガーゼで９℃、１２時間処
理し、さらにＥｃＯＲ工で消化し、入し、ｐ１１１Ｊ７
０’／を得た。
また、ｐコＫＮθｏｓンＬ亘Ｒ工で消化し、Ｓ／ヌクレ
アーゼ処理した後、Ａ’ｌｕ Ｉフラグメントと混合し
、ＴグＤＮＡリガーゼにより平滑末端リゲーションさせ
（ダ℃、７２時間）、形質転ｙＡ沫よりｐＨＦｏｏコ′
？：得た。
アーゼ処理した後、Ａ’ｌｕ Ｉフラグメントと混合し
、ＴグＤＮＡリガーゼにより平滑末端リゲーションさせ
（ダ℃、７２時間）、形質転ｙＡ沫よりｐＨＦｏｏコ′
？：得た。
このｐＨＴ！００ニア制限酵素シ区■およびシｙＩで消
化して得られる大きいフラグメントと、ｐＨＦＯＯ／を
シ巨■および上止■で消化して得られる小さいフラグメ
ントを混合して、ＴｐＤＮＡリガーゼで連結しく７℃、
７２時間）、大腸菌ＨＢ ／ ０ ／を形質転換させ、
形質転換株よりｐ ＨＦ ００ ｂ乞得た。
化して得られる大きいフラグメントと、ｐＨＦＯＯ／を
シ巨■および上止■で消化して得られる小さいフラグメ
ントを混合して、ＴｐＤＮＡリガーゼで連結しく７℃、
７２時間）、大腸菌ＨＢ ／ ０ ／を形質転換させ、
形質転換株よりｐ ＨＦ ００ ｂ乞得た。
上記のようにして、目的とするプラスミドｐＨＦ（７０
／、ｐＨＸＰＯＯ２およびｐＨＦθθ６を荀だ。
／、ｐＨＸＰＯＯ２およびｐＨＦθθ６を荀だ。
参考例１ リポタンパク（ｌｐｐ）ｍタンパクの産生
大腸菌１ｐｐ遺伝子を含むプラスミドｐＫＥＮ／ ／
／ （／ ：１． ：ｔ Ｋ ｂ ） （Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｂａｃｔ、ｅｒｉｏ’ｌｏｇｙ。
／ （／ ：１． ：ｔ Ｋ ｂ ） （Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｂａｃｔ、ｅｒｉｏ’ｌｏｇｙ。
るフラグメント（約１１００ｂＸ））’を得た（図３）
。
。
ｐＨＦＯ（７−のシュＨ工および一旦政λ■消化フラグ
メントと上記５ａｕｊＡフラグメントとを混合し、Ｔヶ
ＤＮＡ リガーゼで連結させ（ｌＩ℃、７２時間）だ後
、大腸菌ＨＢ ／ ０ ／を形質転換さぜ、形質転換株
よりｐＨＦ１００乞得た。ついで、リポタンパク質を欠
失している犬Ｉｓ 菌Ｋ −／ ２株Ｊ Ｅ ！ｒ ！
； ／ ３ （Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏ
ｌ、ｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ、；ｌ！；！；、
ｔ 、３り０ｆ−３７／コ、（／９１０））にｐＨＦｌ
ｏｏを形質転換し、得られたアンピシリン耐性コロニー
のうち、ｐＨＦｌｏｏを保持している株について、以下
の解析を行なった。
メントと上記５ａｕｊＡフラグメントとを混合し、Ｔヶ
ＤＮＡ リガーゼで連結させ（ｌＩ℃、７２時間）だ後
、大腸菌ＨＢ ／ ０ ／を形質転換さぜ、形質転換株
よりｐＨＦ１００乞得た。ついで、リポタンパク質を欠
失している犬Ｉｓ 菌Ｋ −／ ２株Ｊ Ｅ ！ｒ ！
； ／ ３ （Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏ
ｌ、ｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ、；ｌ！；！；、
ｔ 、３り０ｆ−３７／コ、（／９１０））にｐＨＦｌ
ｏｏを形質転換し、得られたアンピシリン耐性コロニー
のうち、ｐＨＦｌｏｏを保持している株について、以下
の解析を行なった。
沈澱画分ηｊｓＤＥＩ−ポリアクリルアミドゲル電久勿
動し、フルオログラフィーにとった（１ｐｐ＋とじて、
大腸菌に一／、２株−ｒＫｊ５／Ｊ（ＴｈｅＪｏｕｒｎ
ａｌ ｏｆ ］ｉｏｌｏｇｉｃａ’ｌ Ｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ、２ｒ！、ｇ。
動し、フルオログラフィーにとった（１ｐｐ＋とじて、
大腸菌に一／、２株−ｒＫｊ５／Ｊ（ＴｈｅＪｏｕｒｎ
ａｌ ｏｆ ］ｉｏｌｏｇｉｃａ’ｌ Ｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ、２ｒ！、ｇ。
３７０７−３７／コ、（／りｇｏ））を用いた）。
その結果、ｐ ＨＦ ／θ０を保持しているＪＦｉ！；
３１３株は、リポタンパク質の抗体と反応し、完全なり
ボタンバク質とほぼ同一の分子量を有するタンパクｆ！
を産生していることがわかった。
３１３株は、リポタンパク質の抗体と反応し、完全なり
ボタンバク質とほぼ同一の分子量を有するタンパクｆ！
を産生していることがわかった。
すなわち、リポタンパク質の抗体と反応するタンパク質
が膜画分中に存在していた。
が膜画分中に存在していた。
参考例λ β−エンドルフィン様ペプチドの産生
■ ヒトβ−エンドルフィンをコードする遺伝子ビ含む
ＤＮＡフラグメントの調製 ＣＡ） 原料プラスミドｐＡ、２．２の調製ニゲラスミ
ドＰＡ、２コは％ＯｙＷｅｉｓｓｍａｎｎらが構築した
ものであり、アンププロモータ・オペレータ領域と開始
コドンＡＴＧのＬＴ［にＥｃＯＲ工部位を有する環状プ
ラスミドである。
ＤＮＡフラグメントの調製 ＣＡ） 原料プラスミドｐＡ、２．２の調製ニゲラスミ
ドＰＡ、２コは％ＯｙＷｅｉｓｓｍａｎｎらが構築した
ものであり、アンププロモータ・オペレータ領域と開始
コドンＡＴＧのＬＴ［にＥｃＯＲ工部位を有する環状プ
ラスミドである。
ｐＢＲ３２２を制限酵素竺四■で３７℃、１時間、部分
的に消化し、次いで、Ｓ／ヌクレアーゼで３７℃、ｌＳ
分間処理する。
的に消化し、次いで、Ｓ／ヌクレアーゼで３７℃、ｌＳ
分間処理する。
次いでＰｅｔ ｉ ＩＪンカーで／、５−℃、１０時間
反応させ、連結させる。Ｐｓｔ Ｉで３ｆ℃、１時間消
化後、ＴダＤＮＡリガーゼで／、ｌｔ℃、７７時間反応
させて連結し、湿状化づ−る。ざらにＥｃＯＲ工で３７
℃、７時間消化し、Ｓ／ヌクレアーゼで処理する。Ｔｌ
／−ＤＮＡリガーゼで／、ｔ℃、／４１時間反応後μ＋
ｔＪで３７℃、１時間消化させ、Ｆｌ／ヌクレアーゼで
３７℃、／、１分間処理する。
反応させ、連結させる。Ｐｓｔ Ｉで３ｆ℃、１時間消
化後、ＴダＤＮＡリガーゼで／、ｌｔ℃、７７時間反応
させて連結し、湿状化づ−る。ざらにＥｃＯＲ工で３７
℃、７時間消化し、Ｓ／ヌクレアーゼで処理する。Ｔｌ
／−ＤＮＡリガーゼで／、ｔ℃、／４１時間反応後μ＋
ｔＪで３７℃、１時間消化させ、Ｆｌ／ヌクレアーゼで
３７℃、／、１分間処理する。
ｌｅａ Ｒニリンカーで処理後、Ｔ４７ＤＮＡリカーセ
で／、ｔ’Ｃ１／１１時間反応させ、ついでＥｃｏ Ｒ
工で３７℃７時間消化−４−る。さらにＴ４！ ＤＮＡ
リガーゼでｌ！ｒ℃、／り時間処理して環状化し、目的
物ｗイ÷ｔだ。
で／、ｔ’Ｃ１／１１時間反応させ、ついでＥｃｏ Ｒ
工で３７℃７時間消化−４−る。さらにＴ４！ ＤＮＡ
リガーゼでｌ！ｒ℃、／り時間処理して環状化し、目的
物ｗイ÷ｔだ。
次に、これを大腸菌ＨＢ１０／に形質転換し、イ＋）ら
れた形質転換株より、ヘレンスキーの方法（Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉθｔｒｙ、 ２２． ｌｌｌｌ２ｇ −ダク’１
０．／９７０）によりプラスミドＤＮＡを調製した。こ
のＤＮＡの塩基配列をマキサム−ギルバートの方法によ
り、解析し、目的とするＤＮＡ″′Ｃ−あることが確認
された。
れた形質転換株より、ヘレンスキーの方法（Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉθｔｒｙ、 ２２． ｌｌｌｌ２ｇ −ダク’１
０．／９７０）によりプラスミドＤＮＡを調製した。こ
のＤＮＡの塩基配列をマキサム−ギルバートの方法によ
り、解析し、目的とするＤＮＡ″′Ｃ−あることが確認
された。
ＣＢ） ヒトコルテコトロピン−β−リボトロピン（Ａ
ＯＴＨ−β−ＬＰＨ）前駆体遺伝子由来のＤ Ｎ Ａフ
ラグメントの調製： まず約／／、ｊＫ１）１．１の前駆体遺伝子が原料とし
て使用される。この前駆体は、ユ６７のアミノ酸残基を
有すると考えられ、たとえば、中面らの方法（Ｎａｔｕ
ｒθ土ゴ、ｌＩ２３−１１．２７． ／タフ９）によっ
て、一般的に入手しうるヒト胎盤等由来のＤＮＡより得
られる。
ＯＴＨ−β−ＬＰＨ）前駆体遺伝子由来のＤ Ｎ Ａフ
ラグメントの調製： まず約／／、ｊＫ１）１．１の前駆体遺伝子が原料とし
て使用される。この前駆体は、ユ６７のアミノ酸残基を
有すると考えられ、たとえば、中面らの方法（Ｎａｔｕ
ｒθ土ゴ、ｌＩ２３−１１．２７． ／タフ９）によっ
て、一般的に入手しうるヒト胎盤等由来のＤＮＡより得
られる。
この／ ／、、ｔ ＫｔｌｐのＡＯＴＨ−β−ＬＰＨ前
１駆体フラグメントと、ＥｃｏＲ工で３７℃、１時間消
化されたｐＢＲ，７コλとンｉｎ ｖｉｔｒ。
１駆体フラグメントと、ＥｃｏＲ工で３７℃、１時間消
化されたｐＢＲ，７コλとンｉｎ ｖｉｔｒ。
で１５℃、７２時間、ＴダＤＮＡリガーゼで処理し、連
結する。
結する。
次いで、これを用いて大腸菌χ／ ？ ？ Ａ ｒ、（
形質転換し、Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ −Ｈｏｇｎｅ８ｓ
のコロニー・ハイブリダイゼーション法（Ｐｒ０ｃ。
形質転換し、Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ −Ｈｏｇｎｅ８ｓ
のコロニー・ハイブリダイゼーション法（Ｐｒ０ｃ。
Ｎａｔｌ、Ａｃａａ、Ｓｃｉ、ＴＪ、Ｂ、Ａ、ム、）、
、３９４／−３ワｉ。
、３９４／−３ワｉ。
／９７！；）により形質転換株を得、これよりプラスミ
ドｐＨＬＡ−／を得た。このｐ ＨＴＪ Ａ −／Ｚち
四Ｒ工で、７７℃、７時間、四巨Ｊｌで３７℃、７時間
消化し、ｇ％ポリアクリＡ・アミドゲルより２．’ＯＫ
ｂｌ）のフラグメントを単離する。次いでこのフラグメ
ントｑ ｐ Ｂ Ｒ３コニのｌ菖ＲＩ一旦劉Ｈ工 Ｊ
７ ！； ｂｐフラグメントの代わりに導入する。土Ｅ
Ｃと回置にして形質転換株を得、これよりプラスミドｐ
ＹＴ／乞得ろ。次いで、Ｘｍａ Ｊで３７℃、１時間消
化し、５％ポリアクリルアミドゲルよｔ） ／、 ｉ
Ｋｂｐフラグメント−＆ Ａ’Ｌ 煎する。
ドｐＨＬＡ−／を得た。このｐ ＨＴＪ Ａ −／Ｚち
四Ｒ工で、７７℃、７時間、四巨Ｊｌで３７℃、７時間
消化し、ｇ％ポリアクリＡ・アミドゲルより２．’ＯＫ
ｂｌ）のフラグメントを単離する。次いでこのフラグメ
ントｑ ｐ Ｂ Ｒ３コニのｌ菖ＲＩ一旦劉Ｈ工 Ｊ
７ ！； ｂｐフラグメントの代わりに導入する。土Ｅ
Ｃと回置にして形質転換株を得、これよりプラスミドｐ
ＹＴ／乞得ろ。次いで、Ｘｍａ Ｊで３７℃、１時間消
化し、５％ポリアクリルアミドゲルよｔ） ／、 ｉ
Ｋｂｐフラグメント−＆ Ａ’Ｌ 煎する。
ＡＯＴＨ−β−ＬＰＨ前駆体遺伝子の大部分？含むこの
１．７ Ｋｂｐフラグメント’４ＴダＤＮＡポリメラー
ゼで平滑末端としブこのち（３７℃、３０分ン、工虱二
旦Ｒ工り７力一に７ｓ℃、／Ｆ待時間連結し、のりしろ
付のＡＣＴＨ−β−ＬＰＨ前駆体由来のＤ Ｎ Ａフラ
グメントを得た。
１．７ Ｋｂｐフラグメント’４ＴダＤＮＡポリメラー
ゼで平滑末端としブこのち（３７℃、３０分ン、工虱二
旦Ｒ工り７力一に７ｓ℃、／Ｆ待時間連結し、のりしろ
付のＡＣＴＨ−β−ＬＰＨ前駆体由来のＤ Ｎ Ａフラ
グメントを得た。
（Ｃ〕 プラスミドｐＹＴ ３の調製：上記プラスミド
ｐＡ、２ＪおよびＡ ＯＴ Ｈ−β−ＬＰＩ（由来フラ
グメントラぞれぞれ３７℃、１時間、勲二Ｒ工で消化し
た。次に、この両者ＹＴダＤＮＡリガーゼで１５’Ｑ、
１０時間反応させ、結合し、プラスミドｐＹＴ ３７得
た。
ｐＡ、２ＪおよびＡ ＯＴ Ｈ−β−ＬＰＩ（由来フラ
グメントラぞれぞれ３７℃、１時間、勲二Ｒ工で消化し
た。次に、この両者ＹＴダＤＮＡリガーゼで１５’Ｑ、
１０時間反応させ、結合し、プラスミドｐＹＴ ３７得
た。
（Ｄ）ｅトβ−エンドルフィンをコードｊ る遺伝子を
含むＤＮＡフラグメントの調製 上記プラスミドｙＨａｅｌｌＪを用いて３７℃で消化し
目的とするフラグメント（ｌ乙Ｏｂｐ ）χ得た。
含むＤＮＡフラグメントの調製 上記プラスミドｙＨａｅｌｌＪを用いて３７℃で消化し
目的とするフラグメント（ｌ乙Ｏｂｐ ）χ得た。
■ ブラスミ）”ｐＢＲ３；１２ ｔｒｐ Ｅ の調製
プラスミドＲ８Ｆ ２／ ２’１−ｔｒｐ （Ｇｏｎｅ
、 ／（／９’／’ｌ）、／ダ／−１５コ）を制限酵素
Ｂｇｌ ＴＩで３７℃、７時間消化し、７％アガロース
電気泳動により２．３ＫｂのＢｇｌ ■フラグメントを
得り。−万、ファージＭ ｉ ３ｍｐ ？ （７２３ｇ
ｂｐ ） （Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ 。
プラスミドＲ８Ｆ ２／ ２’１−ｔｒｐ （Ｇｏｎｅ
、 ／（／９’／’ｌ）、／ダ／−１５コ）を制限酵素
Ｂｇｌ ＴＩで３７℃、７時間消化し、７％アガロース
電気泳動により２．３ＫｂのＢｇｌ ■フラグメントを
得り。−万、ファージＭ ｉ ３ｍｐ ？ （７２３ｇ
ｂｐ ） （Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ 。
工ｎｃ、 （米国）より入手）ケ制限酵’ＪＢＦＩＩＩ
で３７℃、７時間消化し、こ七と上記Ｂｇｌ ＪＴフラ
グメントｆｆ：Ｔｌ１ＤＮＡリガーゼを用いて１５℃、
／４’時間処理して、結合させた。ついでこれを用いて
大腸菌ＪＭ／（７，？ （上記Ｂｅｔｈｅｓａａ Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ製〕を形質転換し、Ｘｇａｌの色（青から
白への変化）を指標として、形質転換株′Ｊｆ得、これ
よりＲＦ％−とり、ついでこれを制限酵素シュＲＩで３
７℃、ｌ［晴間消化し、ルヨＲエフラグメントを得た。
で３７℃、７時間消化し、こ七と上記Ｂｇｌ ＪＴフラ
グメントｆｆ：Ｔｌ１ＤＮＡリガーゼを用いて１５℃、
／４’時間処理して、結合させた。ついでこれを用いて
大腸菌ＪＭ／（７，？ （上記Ｂｅｔｈｅｓａａ Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ製〕を形質転換し、Ｘｇａｌの色（青から
白への変化）を指標として、形質転換株′Ｊｆ得、これ
よりＲＦ％−とり、ついでこれを制限酵素シュＲＩで３
７℃、ｌ［晴間消化し、ルヨＲエフラグメントを得た。
すなわち、このフラグメントは、ブロモ−ター、オペレ
ーターおよびリーダー領域とｔｒｐ Ｅの一部とを含有
し、末端は尉ユＲＩ部位乞形成してなる。
ーターおよびリーダー領域とｔｒｐ Ｅの一部とを含有
し、末端は尉ユＲＩ部位乞形成してなる。
つぎに、プラスミドｐＢＲ３，２−を制限酵素Ｆｉｃｏ
ＩＲ工で３７℃、？時間消化し、これと」二記Ｅｉｃ
ＯＲ工７ラグメントをＴ９ＤＮＡリガーゼを用いてｉｓ
℃、／り時間処理して、；請合させた。ついでこれ７大
腸１ＨＢ１０／に形質転換し、形質転換株から、プロモ
ータの上流及び下流にＥｃｏ Ｒ工部位を有するプラス
ミドを得た。さらにこのプラスミドをルユＲ工で３７℃
で部分消雷し、ＴグＤＮＡポリメラーゼで３７℃、３θ
分間処理し、ついでＴ４（ＤＮＡリガーゼで７Ｓ℃、ｌ
弘時間処理して結合させた。ついで大腸菌Ｈｂｉｏｉに
形質転換し、形質転換株より目的とするプラスミドｐＢ
Ｒ、？、２．２℃ｒｐ Ｂ、ｑ得た（ｔ、Ａｋｂ）。
ＩＲ工で３７℃、？時間消化し、これと」二記Ｅｉｃ
ＯＲ工７ラグメントをＴ９ＤＮＡリガーゼを用いてｉｓ
℃、／り時間処理して、；請合させた。ついでこれ７大
腸１ＨＢ１０／に形質転換し、形質転換株から、プロモ
ータの上流及び下流にＥｃｏ Ｒ工部位を有するプラス
ミドを得た。さらにこのプラスミドをルユＲ工で３７℃
で部分消雷し、ＴグＤＮＡポリメラーゼで３７℃、３θ
分間処理し、ついでＴ４（ＤＮＡリガーゼで７Ｓ℃、ｌ
弘時間処理して結合させた。ついで大腸菌Ｈｂｉｏｉに
形質転換し、形質転換株より目的とするプラスミドｐＢ
Ｒ、？、２．２℃ｒｐ Ｂ、ｑ得た（ｔ、Ａｋｂ）。
ｊｆｆｌ プラスミド１）ＢＲ３２２ｔｒｐ ＥβＥの
調英ファージＭ／（Ｉｍｐ７を−Ｉ（ｉｎｏ ＩＩで３
７℃、７時間消化して得られるフラグメントと上記Ｉ
ＣＤ）で得られたβ−エンドルフィンをコードする遺伝
子７含む旦ａｅｍフラグメント（／６０ｂｐ）と７Ｔダ
ＤＮＡリガーゼで３７℃、／Ｆ時間処理して連結し、つ
いで大腸菌ＪＭ１０３乞形質転換し、得られたＲＦをさ
らにＥｃＯＲ工で３７℃、１時間消化しＳ％ポリアクリ
ルアミドケ゛ル電気泳動により、β−エンドルフィンを
コードする遺伝−Ｆを含むＦｉｃｏＦ、Ｉフラグメント
（／ワ０ｂｐ）を得た。
調英ファージＭ／（Ｉｍｐ７を−Ｉ（ｉｎｏ ＩＩで３
７℃、７時間消化して得られるフラグメントと上記Ｉ
ＣＤ）で得られたβ−エンドルフィンをコードする遺伝
子７含む旦ａｅｍフラグメント（／６０ｂｐ）と７Ｔダ
ＤＮＡリガーゼで３７℃、／Ｆ時間処理して連結し、つ
いで大腸菌ＪＭ１０３乞形質転換し、得られたＲＦをさ
らにＥｃＯＲ工で３７℃、１時間消化しＳ％ポリアクリ
ルアミドケ゛ル電気泳動により、β−エンドルフィンを
コードする遺伝−Ｆを含むＦｉｃｏＦ、Ｉフラグメント
（／ワ０ｂｐ）を得た。
次に、上記プラスミドｐＢＲ３２２ｔｒｐ Ｋ ’ｆｙ
Ｋｃｏ ＲＩで３；７℃、１時間消化し、これと上記Ｅ
ｃＯＲエフラグメント’１Ｔ４１ＤＮＡリガーゼで７３
℃、／り時間処理して結合させ、ついで大腸菌ＨＢｌＯ
７を形質転−換し、ミニスクリーニングによる解析によ
り形質転換株から１自りとするフ′ラスミドｐＢＲ３２
，２ｔｒｐ ｍβＥ′？：得た。
Ｋｃｏ ＲＩで３；７℃、１時間消化し、これと上記Ｅ
ｃＯＲエフラグメント’１Ｔ４１ＤＮＡリガーゼで７３
℃、／り時間処理して結合させ、ついで大腸菌ＨＢｌＯ
７を形質転−換し、ミニスクリーニングによる解析によ
り形質転換株から１自りとするフ′ラスミドｐＢＲ３２
，２ｔｒｐ ｍβＥ′？：得た。
■ プラスミドｐＢＲ３２２ｔｒｐ ＫβＥΔλｐｐｏ
）調製 上記プラスミ）”Ｉ）ＢＲ３２，２ｔｒｐ ＥβＩ！ｉ
’ｉＴ ＋！ｔＮｐ、ポリメラーゼとともに制限酵素Ｈ
ｐａ ■で３７℃、１時間消化し、ついで制限酵素Ｓａ
’ｌ ■で３７℃、７時間消化して７％アガロース亀気
気泳動より小さい方のフラグメントを得た。一方、プラ
スミドｐＢＲＪ、ｌコを二Ｒ工で３７℃、１時間消化し
、さらにＴ４＜ＤＮＡポリメラーゼで３７℃、３０分間
処理して、平ｒ７末輸を形成させたのち、シュＩで３７
℃、７時間消化して／循アガロース電気泳Ｑ＋ｌにより
大きい方のフラグメントを得る。ついで、この二つのフ
ラグメン）ＹＴ ９Ｄ Ｎ Ａ １．１ガーゼで１３℃
、７９時間処理して連結させ、ついで大腸菌ＨＢＩＯｌ
ン形質転換し、得られる形質転換株より、プラスミドｐ
ＢＲ３２，２，ｔｒｐ ＥβＥΔλＰ Ｌ Ｙ得た。
）調製 上記プラスミ）”Ｉ）ＢＲ３２，２ｔｒｐ ＥβＩ！ｉ
’ｉＴ ＋！ｔＮｐ、ポリメラーゼとともに制限酵素Ｈ
ｐａ ■で３７℃、１時間消化し、ついで制限酵素Ｓａ
’ｌ ■で３７℃、７時間消化して７％アガロース亀気
気泳動より小さい方のフラグメントを得た。一方、プラ
スミドｐＢＲＪ、ｌコを二Ｒ工で３７℃、１時間消化し
、さらにＴ４＜ＤＮＡポリメラーゼで３７℃、３０分間
処理して、平ｒ７末輸を形成させたのち、シュＩで３７
℃、７時間消化して／循アガロース電気泳Ｑ＋ｌにより
大きい方のフラグメントを得る。ついで、この二つのフ
ラグメン）ＹＴ ９Ｄ Ｎ Ａ １．１ガーゼで１３℃
、７９時間処理して連結させ、ついで大腸菌ＨＢＩＯｌ
ン形質転換し、得られる形質転換株より、プラスミドｐ
ＢＲ３２，２，ｔｒｐ ＥβＥΔλＰ Ｌ Ｙ得た。
ついで、このプラスミドＺ制限Ｃ４ｆｉ Ｘ≦、ｍ Ｈ
Ｉで消化（３７℃、ｌｉ庁間）して、シ、ｍＨＩフラグ
メントＣｉｑ／ｂｐ）を得た。
Ｉで消化（３７℃、ｌｉ庁間）して、シ、ｍＨＩフラグ
メントＣｉｑ／ｂｐ）を得た。
プラスミドｐｔ］Ｏｇ （Ｇｏｎｅ、 ／ ９．２６；
デー２／、ｇ（／ワｇユ））ｑＢａｍＨ工で柄化し、得
られる大ぎい方のＢａｍＨエフラグメントと上記／ ７
／ ｂｐの一助、ｍＨエフラグメントと￥ＴｌｌＤＮ
Ａリガーゼで連結（４ｔ℃、７２時間）した後、大腸菌
ＨＢ１０／ケ形質転換し、ｐＵ。
デー２／、ｇ（／ワｇユ））ｑＢａｍＨ工で柄化し、得
られる大ぎい方のＢａｍＨエフラグメントと上記／ ７
／ ｂｐの一助、ｍＨエフラグメントと￥ＴｌｌＤＮ
Ａリガーゼで連結（４ｔ℃、７２時間）した後、大腸菌
ＨＢ１０／ケ形質転換し、ｐＵ。
ｇβＥを得た。これを制限酵素見ユＲ工およびＰ咀■で
消化（３７℃、／時間〕し、ｌ蛭Ｒエージ＞）■フラグ
メント（ｌざ７ｔ）ｐ）を得た。
消化（３７℃、／時間〕し、ｌ蛭Ｒエージ＞）■フラグ
メント（ｌざ７ｔ）ｐ）を得た。
一方、プラス５ドｐＨＦＯＯ／；を制限酵塁シ＞ＯＲ工
および５ａｌＩで消化（３７℃、１時間〕して、大きい
方のフラグメントビ得、これと上記ＫｃｏＲＩ−シリ■
フラグメント不・Ｔｌｌ−ＤＮＡリガーゼによって連結
（ｌ１℃、／ス時間〕シ、犬大腸ＨＢ／θｌを形質転換
し、形質転換株よりｐＨＦＯＯＡβｐｖ得た。これ９
Ｍ−９培地（Ｆｉｘｐｅｒｉｍｅｎｔθｉｎ ＭＯｌｅ
ｃｕｌ、ａｒＧｅｎｅｔｉｃｅ 、 １％ Ｊ ／頁、
Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ，ａｒｂｏｒとり、常法
により細胞の各成分の分画１付テなった（膜成分の分画
については５．Ｔｏｕ、ｒｎａｌ ｏｆＢａｃｔｅｒｉ
ｏｌｏｑｙ ／ＩＩ！；、 ２．１０１！−１０９０゜
（／９ｇ／）に記載された方法によった。）。
および５ａｌＩで消化（３７℃、１時間〕して、大きい
方のフラグメントビ得、これと上記ＫｃｏＲＩ−シリ■
フラグメント不・Ｔｌｌ−ＤＮＡリガーゼによって連結
（ｌ１℃、／ス時間〕シ、犬大腸ＨＢ／θｌを形質転換
し、形質転換株よりｐＨＦＯＯＡβｐｖ得た。これ９
Ｍ−９培地（Ｆｉｘｐｅｒｉｍｅｎｔθｉｎ ＭＯｌｅ
ｃｕｌ、ａｒＧｅｎｅｔｉｃｅ 、 １％ Ｊ ／頁、
Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ，ａｒｂｏｒとり、常法
により細胞の各成分の分画１付テなった（膜成分の分画
については５．Ｔｏｕ、ｒｎａｌ ｏｆＢａｃｔｅｒｉ
ｏｌｏｑｙ ／ＩＩ！；、 ２．１０１！−１０９０゜
（／９ｇ／）に記載された方法によった。）。
各画分および培地について、β−エンドルフィンＣ”
Ｉ ） Ｙ標識としてラジオイムノアセイして、産生量
ｔしらべた。結果？以下に示す。
Ｉ ） Ｙ標識としてラジオイムノアセイして、産生量
ｔしらべた。結果？以下に示す。
（μｇ／、／ｌ）
第１図は、本発明に係るプラスミドの製造工程例の概略
７示し、第ユおよび３図は、それぞれａｍｐ Ｆブロモ
−ターン含むＮヱＩフラグメントおよび旦ａｕＪＡ−追
］フラグメントの制限酵素切１所部位を示す。 出願人 三菱化成工業株式会社 代理人 弁理士 長谷用 − ほか／名
７示し、第ユおよび３図は、それぞれａｍｐ Ｆブロモ
−ターン含むＮヱＩフラグメントおよび旦ａｕＪＡ−追
］フラグメントの制限酵素切１所部位を示す。 出願人 三菱化成工業株式会社 代理人 弁理士 長谷用 − ほか／名
Claims (1)
- （１） 大腸菌由来リラックス−型プラスミドにグラム
陰性菌！アブロモータを含むＡ’ｌｕ ｌ ７ラグメン
ト、Ａｌｕｉ−ＢＢＩ■フラグメントまたハＡｌｕ Ｉ
−Ｐｓｔ ■（部分消化〕フラグメントを挿入して得ら
れるプラスミドベクター
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58153467A JPS6047682A (ja) | 1983-08-23 | 1983-08-23 | 新規なプラスミドベクタ− |
| DE8484401709T DE3484950D1 (de) | 1983-08-23 | 1984-08-23 | Plasmidvektoren. |
| EP84401709A EP0138644B1 (en) | 1983-08-23 | 1984-08-23 | Novel plasmid vectors |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58153467A JPS6047682A (ja) | 1983-08-23 | 1983-08-23 | 新規なプラスミドベクタ− |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6047682A true JPS6047682A (ja) | 1985-03-15 |
Family
ID=15563198
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58153467A Pending JPS6047682A (ja) | 1983-08-23 | 1983-08-23 | 新規なプラスミドベクタ− |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6047682A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61265092A (ja) * | 1985-05-18 | 1986-11-22 | Mitsubishi Chem Ind Ltd | 発現用ベクタ−、これを用いる蛋白の産生方法及び該ベクタ−で形質転換された宿主 |
-
1983
- 1983-08-23 JP JP58153467A patent/JPS6047682A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61265092A (ja) * | 1985-05-18 | 1986-11-22 | Mitsubishi Chem Ind Ltd | 発現用ベクタ−、これを用いる蛋白の産生方法及び該ベクタ−で形質転換された宿主 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH0434559B2 (ja) | ||
| CZ264496A3 (en) | Increase of polypeptide secretion | |
| EP0229046A1 (fr) | Procede d'obtention d'adn, arn, peptides, polypeptides ou proteines, par une technique de recombinaison d'adn. | |
| JPH0673096A (ja) | 成長ホルモン前駆体 | |
| EP2075336B1 (en) | Purification of recombinant proteins fused to multiple epitopes | |
| CN113564171B (zh) | 一种提高多肽可溶性表达产量的方法 | |
| JPH01502638A (ja) | グラム陽性及びグラム陰性菌に対する活性を有するポリペプチド類 | |
| US6664386B1 (en) | System for efficient secretion of recombinant proteins | |
| CN107759702B (zh) | 一种抗稻褐飞虱的杀虫蛋白HY131c及其编码基因与应用 | |
| JPH03503596A (ja) | 蛋白質若しくはポリペプチドの調製方法、該ポリペプチドをコードするｄｎａ配列、該ｄｎａ配列およびポリペプチドを有する微生物および該ポリペプチドの薬学的製剤としての利用 | |
| JPH03501801A (ja) | クローン化プロテインｇ変異体遺伝子及びそれから発現されたプロテインｇ変異体 | |
| AU698656B2 (en) | Promoters for gene expression | |
| EP0138644B1 (en) | Novel plasmid vectors | |
| JPS6047682A (ja) | 新規なプラスミドベクタ− | |
| WO2007112676A1 (fr) | Protéine hybride de l'hormone parathyroïde humaine 1-34 et vecteurs d'expression correspondants | |
| KR20130096111A (ko) | 대장균 포스포글리세르산 인산화효소 유전자를 융합 파트너로서 포함하는 발현벡터 | |
| Jing et al. | Development of a method for simultaneous generation of multiple genetic modification in Salmonella enterica Serovar Typhimurium | |
| CN113564145B (zh) | 用于胞嘧啶碱基编辑的融合蛋白及其应用 | |
| KR102142255B1 (ko) | Crm197 단백질 발현 방법 | |
| EP3904520A1 (en) | Gene expression cassette for expressing n-terminal methionine-truncated protein of interest and method for producing n-terminal methionine-truncated protein of interest by using same | |
| JPH01503514A (ja) | 免疫原性ポリペプチドとその精製法 | |
| JP7507292B2 (ja) | Ｃｒｍ１９７タンパク質発現方法 | |
| WO2024119434A1 (zh) | 一种提高重组蛋白表达效率的酸性表面助溶短肽标签 | |
| JPS60207596A (ja) | 蛋白の産生方法 | |
| JPS6091984A (ja) | 新規プラスミドベクタ− |