JPH0434559B2 - - Google Patents

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JPH0434559B2
JPH0434559B2 JP58047803A JP4780383A JPH0434559B2 JP H0434559 B2 JPH0434559 B2 JP H0434559B2 JP 58047803 A JP58047803 A JP 58047803A JP 4780383 A JP4780383 A JP 4780383A JP H0434559 B2 JPH0434559 B2 JP H0434559B2
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/12—Growth hormone, growth factor other than t-cell or b-cell growth factor, and growth hormone releasing factor; related peptides

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  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
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  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】
本発明はヒトの成長ホルモンの変異蛋白質の発
見に基づくものであり、組替えDNA技術による
そのDNA配列およびそのDNA由来のアミノ酸配
列の決定に関するものである。本発明は更に、宿
主微生物または細胞培養中でDNAを発現させる
ことにより、有用な量のこの変異蛋白質を生産す
るための手段および方法を提供するものである。 ヒト成長ホルモンを含む多数のポリペプチドを
微生物により生産する手段および方法は、
Goeddelら（U.S.S.N.55126、1979年７月５日出
願）により開示されている。この米国特許の対応
出願である英国特許出願公告第2055382号および
欧州特許出願公開第22242号が既に公開されてい
る。 微生物宿主から各種の異種ポリペプチド類を生
産する方法では、その特定の所望の生成物を暗号
化しているDNA配列を同定することが必要であ
つた。それがわかると、合成的にあるいは組織由
来のcDNAからその配列を形成することができ、
これを発現ベクターに作動し得る様に挿入し、こ
れを使つて宿主生物を形質転換し、そのポリペプ
チドを生産することができる。過去に於いて、比
較的小さな蛋白質は、その全遺伝子を合成するこ
とにより、それを生産することができた。この最
初の実例はヒトインシユリンであつた（英国特許
出願公告第2007676号参照）。全て合成による遺伝
子を使用し、微生物学的発現によつて生産するに
は大き過ぎるポリペプチドについては、組織由来
のmRNA転写によつてcDNAを得ていた。 いずれの場合に於いても、正しい順序で合成を
行なうため、あるいは適切なmRNA配列を単離
するための正しい同種配列プローブを使用し得る
様に、そのアミノ酸配列を知ることが必要であ
る。 ポリペプチド配列がわからず、そのポリペプチ
ドの出所（source）に、配列を決めるに十分なだ
けのものを抽出し得るほどの量のポリペプチドが
含まれていない場合には問題である。従つて、遺
伝子の発現される組織がわからない場合、遺伝子
の発現量が検出できる程でない場合、組織のごく
僅かの細胞中で発現される場合には、微少の
mRNAの単離に関する現在の技術水準から来る
その他の種々の制限により、従来用いられて来た
方法は成功しない。 この様な状況下、組換えDNA技術に於ける改
良精製法が、所望の異種蛋白質を得るのに有用で
あると考えられている。 本発明は、そのままの状態では遺伝子の生産物
が検出可能な程、あるいは有意に単離し得る程に
は生産されない場合に、配列を決めるに十分量の
遺伝子の単離を有利にするのに組換えDNA技術
を使用することができることを見い出したことに
基づくものである。 本発明は、ゲノムDNA由来のそのままの（自
生の）遺伝子バンクをプローブし、所望の遺伝子
およびそれに付随する天然のイントロン配列を含
有しているゲノム部分（section）を得る方法を
提供するものである。この断片を宿主細胞に導入
すると、転写によつて忠実に相当するmRNA転
写体が生産される。この様な転写体は、もとの遺
伝子には存在したであろうイントロン配列に相当
する配列を持つていない。というのは、それは後
転写過程の一部として切り取られてしまう（スプ
ライシング）からである。このmRNAから
cDNAバンクが調製され、そこから所望の蛋白質
生成物を暗号化している。cDNAを単離し、次い
で自体既知の方法で、これを発現ベクターに、作
動し得る様に挿入する。DNA配列に対する知識
を後知恵的に利用することなく、全ゲノムDNA
から、所望のmRNAを、次いでそれから、発現
ベクターに使用するためのcDNAを生産する方法
は独特のものである。 この方法は、ヒト、哺乳動物またはその他の真
核性生物の遺伝子を含む染色体DNAの一部から、
mRNAおよびそれからcDNAを得ることができ
る一般的なものである。この方法は、遺伝子は単
離できるが、この遺伝子から導かれるmRNAは
単離することができない場合に有用である。これ
は、先に述べた理由で遺伝子発現の生産物が検出
できない時に起る。所望の遺伝子を持つた染色体
DNAの小さな断片は、適当なDNA雑種形成プロ
ーブによつてゲノムライブラリーから単離するこ
とができる。このDNAを、その遺伝子の効率的
な発現を保証する数多くの現在利用し得る技術の
１つで、適当な組織培養細胞の核に導入する。こ
の遺伝子は転写され、一次転写生成物は加工され
てイントロン配列が除去され、キヤツピング
（capping）とポリアデニル化が起り、最終転写
生成物たるmRNAが蛋白質合成のための型板と
して細胞質中に現れる。従つて、この様な細胞か
らのポリアデニル化されたmRNAから誘導され
る。cDNAバンクは、所望の遺伝子から導かれる
クローンされたcDNAを含んでおり、このcDNA
を標準的な方法で、微生物学的発現用に加工する
ことができる。 細胞の核に外来遺伝子を挿入する方法は既にい
くつか知られている（マイクロ注射、遺伝子マー
カーおよび動物ウイルスのゲノムから導かれる真
核性ベクターを使つた同時形質転換）。導入され
た遺伝子の効率的な発現がみられたのは極く僅か
である。この様な性質を持つた１つの系は、細胞
中に導入されたSV40複製起源を含有している
DNAが高いコピー数で複製する様に、その染色
体中にSV40T抗原遺伝子を持つているCOS細胞
である。この起源に物理的に結合したDNAの効
率的な発現は、SV40遅発（late）プロモーター
機能を利用することによつて可能である。 本発明のこの様子は、以下のチヤートによつて
示すことができる。
【表】 ↓特異プローブ

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 以下に示すアミノ酸配列を持つたヒト成長ホ
    ルモン変異蛋白質。 phe pro thr ile pro leu ser arg leu phe
    asp asn ala met leu arg ala arg arg leu tyr
    gln leu ala tyr asp thr tyr gln glu phe glu
    glu ala tyr ile leu lys glu gln lys tyr ser
    phe leu gln asn pro gln thr ser leu cys phe
    ser glu ser ile pro thr pro ser asn arg val
    lys thr gln gln lys ser asn leu glu leu leu
    arg ile ser leu leu leu ile gln ser trp leu glu
    pro val gln leu leu arg ser val phe ala asn
    ser leu val tyr gly ala ser asp ser asn val
    tyr arg his leu lys asp leu glu glu gly ile
    gln thr leu met trp arg leu glu asp gly ser
    pro arg thr gly gln ile phe asn−グリコシル
    化部位 gln ser tyr ser lys phe asp thr lys ser his
    asn asp asp ala leu leu lys asn tyr gly leu
    leu tyr cys phe arg lys asp met asp lys val
    glu thr phe leu arg ile val gln cys arg ser
    val glu gly ser cys gly phe. ２ 以下に示すアミノ末端前配列を含む第１項に
    記載のヒト成長ホルモン変異蛋白質。 met ala ala gly ser arg thr ser leu leu leu
    ala phe gly leu leu cys leu ser trp leu gln
    glu gly ser ala.
JP58047803A 1982-03-22 1983-03-22 ヒト成長ホルモン変異体 Granted JPS591428A (ja)

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