WO2011078351A1 - 分泌シグナル配列およびこれを利用したタンパク質発現系 - Google Patents

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WO2011078351A1
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WO
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gene
protein
sequence
candida utilis
secretory signal
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PCT/JP2010/073405
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英幸 玉川
茂仁 生嶋
康之 冨田
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キリンホールディングス株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to a novel secretory signal sequence and a protein expression system using the same.
  • E. coli is one of the most widely used hosts.
  • heterologous proteins expressed in E. coli are often insolubilized, and since post-translational modifications are not performed, it is not always easy to reproduce eukaryotic proteins in the same three-dimensional structure as the natural type. Absent.
  • E. coli has a unique endotoxin, which may be mixed as a contaminant in the final product.
  • the method using animal cells, plant cells, and insect cells can expect accurate post-translational modification of eukaryotic proteins, but it is more difficult to handle than microorganisms, costs more to culture, is slow to grow, and has a high production efficiency. It has many problems such as bad and difficult to scale up culture. For this reason, in order to produce proteins at low cost, a host that is easy to handle as in E. coli and that undergoes post-translational modification even when eukaryotic proteins are expressed is promising.
  • yeast which is a unicellular eukaryotic microorganism
  • various modifications occur from the cytoplasm through the endoplasmic reticulum / Golgi apparatus. Therefore, human or animal-derived proteins can be expressed as normal proteins with a relatively high probability.
  • microorganisms such as Escherichia coli
  • it has an advantage that it can be cultured at a lower cost than cultured cells in terms of culture equipment, culture time and culture cost.
  • budding yeast is used in the production of alcoholic beverages such as beer and wine and bread, and its safety has been confirmed.
  • yeasts that have been most well studied to date and have accumulated genetic knowledge, there is a yeast of the genus Saccharomyces, which has been studied as a host for the production of various substances.
  • a yeast other than the genus Saccharomyces methods for transforming many species such as Pichia yeast, Hansenula yeast, Kluyveromyces yeast, Candida yeast have been developed and used as hosts for production of useful substances. It is being considered.
  • Candida yeast has a wide range of carbon utilization and has characteristics that are not found in the genus Saccharomyces, such as a yeast that is negative for the Crabtree effect, and therefore is expected to play a role in producing useful substances.
  • Candida utilis exhibits excellent assimilability to pentoses such as xylose. Unlike Saccharomyces, it does not produce ethanol under aerobic conditions, and thus does not undergo growth inhibition. Therefore, efficient cell production by continuous culture at high density is possible. Moreover, since it is excellent in the assimilation ability of inorganic nitrogen, it has been attracting attention as a protein source, and industrial production of microbial cells containing pentose-rich saccharified liquid of hardwood or sulfite pulp has been carried out. In addition, Candida utilis is certified as an edible yeast by the FDA (Federal Food and Drug Administration) as well as Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces fragilis, and is safe as a food additive.
  • FDA Federal Food and Drug Administration
  • Candida utilis is still produced in various countries around the world, such as Japan, Germany, and the United States, and is used as food.
  • Candida utilis is widely used in the industry as a production strain for pentose assimilating strains, ethyl acetate, L-glutamic acid, glutathione, invertase, etc. I came.
  • Non-Patent Document 1 K Kondo, T Saito, S Kajiwara, M Takagi and N Misawa., A transformation system for the yeast Candida utilis: use of a modified endogenous ribosomal protein gene as a drug-resistant marker and ribosomal DNA as an integration target for vector DNA., J. Bacteriol., 12, 1995, 7171-7177, Vol 177, No.
  • Non-Patent Document 2 Hiroshi Shimada, Keiji Kondo, Paul D.
  • Non-Patent Document 3 Yutaka Miura, Keiji Kondo, Toshiko Saito, Hiroshi Shimada, Paul D. Fraser, and Norihiko Misawa , Production of the Carotenoids Lycopene, ⁇ -Carotene, and Astaxanthin in The Food Yeast Candida utilis., Appl Environ Microbiol, April 1998, p. 1226-1229, Vol.
  • Non-patent literature 4 Keiji Kondo, Yutaka Miura, Hidetaka Sone, Kazuo Kobayashi & Hiroshi lijima., High -level expression of a sweet protein, monellin, in the food yeast Candida utilis., Nature Biotechnology 15, 453-457 (1997);
  • Non-Patent Document 5 Yutaka Miura, Keiji Kondo, Hiroshi Shimada, Toshiko Saito, Katsumi Nakamura, Norihiko Misawa., Production of lycopene by the food yeast, Candida utilis that does not naturally synthesize carotenoid., Biotechnology and Bioengineering Volume 58 Issue 2-3, Pages 306-308;
  • Non-Patent Document 6 Shigehito IKUSHIMA, Toshio FUJII 1) , Osamu KOBAYASHI, Satoshi YOSHIDA and Aruto YOSHIDA., Genetic Engineering of Candida utilis Yeast for Efficient Production of L-Lac
  • Non-Patent Document 8 MICHAEL A. ROMANOS, CAROL A. SCORER AND JEFFREY J. CLARE., Foreign gene expression in yeast: a review., YEAST VOL. 8: 423-488 (1992)).
  • Candida utilis a report that succeeded in increasing the secreted expression level of heterologous protein by inactivating the gene of invertase, which is the main secreted protein, for the purpose of improving the secreted expression level of heterologous protein (Patent Document 1: Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-474716).
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-474716.
  • the secreted expression level of the heterologous protein is low and there is much room for improvement.
  • a signal peptide present at the N-terminus of the protein plays an important role in the recognition of secreted proteins.
  • a general secretion signal structure in yeast has a length of about 20 amino acids, a basic amino acid exists in the vicinity of the N-terminus, and then a hydrophobic amino acid continues. This signal peptide is finally cleaved by a signal peptidase on the endoplasmic reticulum membrane, and an amino acid having a small molecular weight is present at the C-terminus, which is the cleaved site.
  • Transmembranes are performed in conjunction with protein synthesis on ribosomes bound to translocon, and through the translocon with the addition of Sec62 / 63 complex after precursor protein synthesis in the cytoplasm. Examples of passing through a cavity are known. As described above, many proteins are involved in the secretion of one protein, and the influence of the structure of the signal peptide on the secretion efficiency is great even when these secretion pathways are selected. However, in Candida utilis, there has been no detailed study of a signal peptide with excellent secretion efficiency.
  • secreted proteins can be detected by subjecting the culture supernatant or membrane fraction to SDS-PAGE.
  • a partial amino acid sequence can be determined by performing amino acid analysis, mass spectrometry, etc. on the detected protein, and the base of the secreted protein can be obtained by performing PCR or Southern analysis based on the base sequence information predicted from the amino acid sequence. The sequence can be determined.
  • this method makes it difficult to identify multiple specimens, and it is often difficult to identify the protein itself.
  • a signal sequence of a potential secreted protein cannot be obtained.
  • the present inventors decoded the genome of Candida utilis, performed gene search and function prediction with in silico based on the data, and subsequently identified a secretion signal. Furthermore, the present inventors evaluated the ability of the sequence as a secretion signal by fusing the signal sequence with a reporter gene. As a result, many secretion signals were found on the Candida utilis genome. The present invention is based on this finding.
  • an object of the present invention is to provide a novel secretion signal gene, an expression vector and expression vector containing the secretion signal gene, a transformant containing the secretion signal gene, and a method for producing a protein using the secretion signal gene. It is to provide.
  • the secretory signal gene consists of a nucleotide sequence encoding a peptide that can function as a secretory signal in a eukaryotic host derived from the genome of Candida utilis.
  • the expression vector according to the present invention is an expression vector for expressing a protein in a eukaryotic cell host, and comprises the secretion signal gene according to the present invention and the gene of the protein directly downstream of the secretion signal gene. It comprises a gene introduction site for linking.
  • the expression vector according to the present invention is an expression vector for expressing a protein in a eukaryotic cell host, comprising the secretory signal gene according to the present invention and the gene of the protein directly linked to the downstream side of the secretory signal gene. It contains.
  • the transformant according to the present invention comprises a coding sequence comprising a secretory signal gene according to the present invention and a protein gene directly linked downstream of the secretory signal gene, or a true sequence comprising the expression vector according to the present invention. It consists of a nuclear cell host.
  • the method for producing a protein according to the present invention comprises the steps of (a) culturing the transformant according to the present invention, thereby accumulating the protein in the medium, and (b) recovering the protein from the medium.
  • the target protein is produced as a fusion with the secretory signal according to the present invention by culturing the transformant, and the mature protein without the secretory signal is obtained by subsequent processing. Is secreted from the cell. Therefore, according to the present invention, since the target protein can be accumulated in the culture medium, the protein can be easily recovered, and thus the protein can be produced efficiently.
  • FIG. 1 shows the procedure for construction of pVT92.
  • FIG. 2 shows a plot of the number of amino acid residues and relative activity of the signal peptide.
  • FIG. 3 shows the results of motif analysis of the secretory signal sequence.
  • the secretory signal gene consists of a nucleotide sequence encoding a peptide that can function as a secretory signal in a eukaryotic host derived from the genome of Candida utilis.
  • a secretory signal gene preferably consists of a nucleotide sequence encoding a peptide that can function as a secretory signal in Candida utilis.
  • the specific sequence of the secretory signal peptide in the present invention is not particularly limited.
  • Other specific sequences include, for example, SEQ ID NOs: 539-547, 549-558, 561-573, 575-583, 585-592, 594-598, 600-603, 606-614, 616-622, 624.
  • the sequence of the secretory signal peptide is SEQ ID NO: 2-5, 15, 24, 29, 31, 32, 35, 36, 41, 46, 49-51, 55-57, 60. 63, 64, 78, 87, 91, 98, 107, 111, 118, 120, 121, 126, 130, 131, 133, 136, 140, 142, 144, 145, 147 to 149, 152, 154, 156
  • the amino acid sequence is selected from the group consisting of 168, 172, 173, 178, 179, 185, 189, 190, 197, 198, 202, 215, 218, 224, 225 and 232 to 234.
  • the sequence of the secretory signal peptide is an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 29, 35, 36, 107, 111, 144, 154 and 218.
  • examples of other preferable secretory signal peptide sequences include the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 595, 647, 704, and 639. That is, according to a particularly preferred embodiment of the present invention, the sequence of the secretory signal peptide is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 111, 595, 144, 36, 35, 107, 647, 704, 639, 29, 154 and 218. Amino acid sequence.
  • the sequence of the secretory signal peptide in the present invention is a variant of each amino acid sequence, for example, an amino acid in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in each amino acid sequence in place of the above-mentioned specific amino acid sequence.
  • An amino acid sequence that is a sequence and has a secretion signal activity may be used.
  • the number of amino acid residues to be deleted, substituted or added is preferably 1 to 9, more preferably 1 to 5, further preferably 1 to 3, and still more preferably 1.
  • an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted in each of the above amino acid sequences is preferable.
  • a particularly preferred mutation is a single amino acid substitution.
  • this amino acid residue substitution is preferably a substitution between amino acids having similar properties to each other, that is, a conservative substitution.
  • a “conservative substitution” a substitution between Val, Ile, Leu, Ala and Met; a substitution between Asp and Glu; a substitution between Asn and Gln; Ser, Thr, Gly and Substitutions between Ala; substitutions between Lys, Arg and His; and substitutions between Phe, Tyr and Tip, preferably substitutions between Gly and Ala; Val, Ile and Leu Substitution between Asp and Glu; Substitution between Asn and Gln; Substitution between Ser and Thr; Substitution between Lys and Arg; and Substitution between Phe and Tyr Is mentioned.
  • the secretory signal peptide in the present invention is usually composed of 30 or less, preferably 20 or less, more preferably 16 to 18, most preferably 17 or 18 amino acid residues.
  • the secretory signal gene according to the present invention is a gene consisting of a nucleotide sequence encoding the above-mentioned secretory signal peptide.
  • the secretory signal gene according to the present invention is preferably derived from the genome of Candida utilis. Such a gene can be collected from the chromosome of Candida utilis or synthesized.
  • the specific nucleotide sequence of the secretory signal gene is not particularly limited, and examples of the coding sequence corresponding to the above-described amino acid sequence include the nucleotide sequences shown in Table 1 described later.
  • the target protein is expressed in an expression system incorporating the structural gene.
  • the expression system is preferably a eukaryotic cell transformed with an expression vector having a protein structural gene.
  • Candida utilis is particularly preferable.
  • the above-mentioned secretory signal gene is bound to the 5 ′ (upstream) tip of the protein structural gene to produce a fusion protein in which the secretory signal is bound to the N-terminal side of the protein, and then processed in the cell. And the protein is secreted out of the cell.
  • the expression vector according to the present invention is an expression vector for expressing a protein in a eukaryotic host.
  • This expression vector comprises a secretion signal gene according to the present invention and a gene introduction site for directly connecting the protein gene to the downstream side of the secretion signal gene.
  • a protein structural gene is introduced into this gene introduction site to form an expression vector, a secretion signal gene and a protein structural gene are linked, and a protein in which the secretion signal and the protein are linked is produced by the expression.
  • the target protein expressed in a form fused with a secretion signal may be any protein and is not particularly limited.
  • This protein may be one that is originally expressed by the host cell used for expression, but is preferably a protein that is not originally expressed by the host cell, that is, a heterologous protein.
  • An expression vector according to the present invention is an expression vector for expressing a protein in a eukaryotic cell host, and includes the secretion signal gene according to the present invention and the gene of the protein directly linked to the downstream side of the secretion signal gene. It becomes.
  • the expression vector and expression vector according to the present invention may be chromosomally integrated, or may be present stably by increasing the copy number outside the nucleus.
  • the expression vector and expression vector according to the present invention preferably contain a promoter region that controls expression of a secretory signal gene-protein gene.
  • This promoter governs the expression of the secretory signal gene-protein gene introduced downstream thereof.
  • This promoter may be any promoter that can function in a eukaryotic host used for transformation. For example, when Candida utilis is used as a eukaryotic cell host, any substance that can function in Candida utilis may be used.
  • the expression vector and expression vector according to the present invention preferably contain a selectable marker gene that can function in a eukaryotic host used for transformation.
  • This selectable marker gene is, for example, a drug resistance marker gene, and preferably includes a cycloheximide resistant L41 gene, a gene conferring geneticin (G418) resistance, or a gene conferring hygromycin B resistance. Since a gene conferring geneticin (G418) resistance or a gene conferring hygromycin B resistance is a sequence that does not exist in wild yeast, it is incorporated into the target locus when yeast is used as a eukaryotic host. It is thought that there is a high probability.
  • Transformation of a eukaryotic cell host can be performed according to a method known in the art.
  • a method for transforming Candida utilis there is a technique described in JP-A-2003-144185.
  • a sequence homologous to the chromosomal DNA of Candida utilis and a selection marker gene are included, and the heterologous gene can be incorporated into the chromosomal DNA of Candida utilis by homologous recombination.
  • a DNA sequence that can be transformed into Candida utilis, or a DNA sequence having an autonomous replication function in Candida utilis and a selectable marker gene, has been developed.
  • the medium for culturing the transformant can be selected from media known in the art depending on the eukaryotic host used for the production of the transformant.
  • a nutrient medium such as a YPD medium or A minimal medium such as MM medium can be used.
  • the culture temperature can be selected within the range in which the eukaryotic host to be used can grow.
  • the culture temperature can be, for example, about 15 ° C. to 45 ° C., more preferably 25 to 40 ° C., still more preferably 27 to 40 ° C.
  • the pH of the medium during the fermentation process is preferably maintained at 3 to 8, more preferably 4 to 7.
  • the culture time is not particularly limited, and the reaction time is appropriately determined. Those skilled in the art can easily optimize these conditions.
  • Examples of methods for isolating and purifying proteins produced in the medium include differences in solubility such as salting out or solvent precipitation, and differences in molecular weight such as dialysis, ultrafiltration or gel electrophoresis.
  • a method using a difference in charge such as ion exchange chromatography, a method utilizing a specific affinity such as affinity chromatography, a method utilizing a difference in hydrophobicity such as reverse phase high performance liquid chromatography, isoelectric
  • examples thereof include a method using a difference in isoelectric point such as point electrophoresis.
  • Examples of methods for confirming the isolated and purified protein include Western blotting and activity measurement.
  • the structure of the purified protein can be revealed by amino acid analysis, amino-terminal analysis, primary structure analysis, or the like.
  • the peptide can be identified as a secretory signal peptide.
  • the peptide is derived from Candida utilis, and the secretory signal peptide thus identified is a further peptide for testing secretion efficiency. Can be subjected to biological testing.
  • KOD plus manufactured by TOYOBO was used for gene amplification by PCR, and the method followed the attached protocol.
  • PCR amplification reaction was performed at 94 ° C. for 2 minutes, followed by denaturation step: 94 ° C. for 30 seconds, annealing step: 55 ° C. for 30 seconds, extension step: 68 ° C. for X seconds (however, X minutes are expected) 3 steps) was repeated 25 cycles, and the temperature was finally set to 4 ° C.
  • Gene Amp PCR System 9700 PE Applied Biosystems
  • Illustra ⁇ ⁇ GFX PCR Purification Kit manufactured by GE Healthcare was used.
  • Various restriction enzymes were used from TaKaRa, and the method followed the attached protocol.
  • Alkaline Phosphatase (Shrimmp) manufactured by TaKaRa was used, and the method followed the attached protocol.
  • DNA Ligation Kit ⁇ Mighty Mix> manufactured by TaKaRa was used, and the method followed the attached protocol.
  • a DH5 ⁇ competent cell manufactured by TOYOBO was used, and the method followed the attached protocol.
  • coli transformants LB plates containing 100 ⁇ g / mL ampicillin were used.
  • AUTOMATIC DNA AT ISOLATION Y SYSTEM PI-200 manufactured by KURABO was used for recovery of plasmid DNA from Escherichia coli.
  • Yeast transformation was performed by an electric pulse method (electroporation method).
  • yeast transformation by electric pulses was performed by partially modifying the method described in JP-A-2003-144185.
  • the cells are washed once with 100 ml of ice-cooled sterilized water, then once with 40 ml of ice-cold sterilized water, and then once with 40 ml of ice-cooled 1M sorbitol.
  • the cells are suspended in 10 ml of 1M sorbitol, transferred to a sterile polypropylene tube, and collected again by centrifugation at 1,100 ⁇ g for 5 minutes. After removing the supernatant, the suspension is suspended in ice-cooled 1 M sorbitol so that the final cell volume is 2.5 ml.
  • Transformation experiments with electric pulses are performed using a Bio-Rad gene pulser. 50 ⁇ l of the bacterial solution, 5 ⁇ l of DNA sample containing 100 ng to 10 ⁇ g of DNA, and 5 ⁇ l of 2.0 mg / ml salmon testis-derived carrier DNA were mixed, and then placed in a 0.2 cm disposable cuvette. Apply electrical pulses. For example, the electric capacity is 25 ⁇ F, the resistance value is 600 to 1000 ohms, and the voltage is 0.75 to 1.25 KV. After the pulse, 1 ml of ice-cooled YPD medium containing 1M sorbitol is added, transferred to a sterilized polypropylene tube, and cultured with shaking at 30 ° C. for about 6 to 15 hours.
  • the bacterial solution was applied to a YPD selection medium containing an appropriate drug according to the selection marker gene, and then the plate was incubated at 28-30 ° C. for 3-4 days to obtain transformant colonies.
  • a YPD selection medium containing an appropriate drug according to the selection marker gene
  • hygromycin B was added to the YPD medium at a concentration of 600 to 800 ⁇ g / ml.
  • G418 was added to the YPD medium at a concentration of 200 ⁇ g / ml.
  • each medium is referred to as a HygB medium and a G418 medium.
  • the resistance to hygromycin B is expressed as HygBr
  • the sensitivity to hygromycin B is expressed as HygBs
  • the resistance to G418 is expressed as G418r
  • the sensitivity to G418 is expressed as G418s.
  • Example 1 Preparation of genomic DNA of Candida utilis NBRC0988 strain NBRC0988 strain of Candida utilis was inoculated into 200 ml YPD liquid medium (2% glucose, 1% yeast extract, 2% polypeptone) at 30 ° C for 24 hours. After shaking culture, the cells were collected by centrifugation. Yeast genomic DNA was gently extracted by methods known to those skilled in the art, and further, impurities other than DNA were reduced by cesium chloride / ethidium bromide density gradient centrifugation (Molecular Cloning, 3rd Edition). Finally, genomic DNA of Candida utilis over 300 micro-gram was prepared. The size of the DNA was examined by pulse field gel electrophoresis, and it was confirmed that a large amount of DNA exceeding 97 kb was also present.
  • YPD liquid medium 2% glucose, 1% yeast extract, 2% polypeptone
  • Example 2 Preparation of Candida utilis genomic DNA library for sequencing by Sanger method
  • the genomic DNA prepared above was fragmented with Hydroshear Device (Genemachines, San Carlos, CA) and ligated to a vector.
  • Hydroshear Device Genemachines, San Carlos, CA
  • a plasmid library in which a DNA fragment of 3 to 4 kb was cloned and a fosmid library in which a DNA fragment of about 40 kb was linked were constructed.
  • the inserted DNA fragment was sequenced using ABI PRISM 3730xl (Applied Biosystems) using BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems) as a reagent. The sequence was decoded at the paired end.
  • the reaction solution used was a thermal cycler manufactured by Applied Biosystems, and purification was performed using CleanSeq dye-terminator removal kit (Agencourt).
  • those with a PHRED score of more than 20 or 100 bp or more on average typically 500 to 600 bp
  • were treated as valid data (57.9 Mbp from plasmid, from fosmid) 18.5 Mbp).
  • Arachne Whole Genome Assembler (Broad Institute of MIT and Harvard), Agencourt ’s Galaxy LIMS system and Consed (University of Washington), we assembled and monitored the results.
  • the sequence was decoded with Roche 454FLX using Candida utilis genomic DNA. As a result, 211.7 ⁇ Mbp base sequence information was obtained. Hybrid assembly was performed using ArachneNewAssemler for the contig sequence obtained by assembling this with Newbler and the data obtained by the Sanger method. As a result, 1,307 contigs (of which 457 were 2 kb or more) and 975 supercontigs (of which 6 were 1 kb or more and 7 were 40 kb or more and less than 1 Mb) were obtained. The total length of Super Contig was 14.6 Mb.
  • Example 3 GlimmerM [Salzberg SL, Pertea M, Delcher AL, Gardner MJ, Tettelin H. "Interpolated Markov models for eukaryotic gene finding.” Genomics. 1999 Jul 1; 59 (1) : 24-31.] And GeneLook [Nishi T, Ikemura T, Kanaya S. "GeneLook: a novel ab initio gene identification system suitable for automated annotation of prokaryotic sequences.” Gene. 2005 Feb 14: 346: 115-125. Epub 2005 Jan 26.] was used for gene prediction.
  • Saccharomyces cerevisiae S288C was obtained from SGD (www.yeastgenome.org) and used for GlimmerM training.
  • SGD Saccharomyces cerevisiae
  • GlimmerM training As a result of applying the HMM obtained as a result of training to the super-contig sequence, 10,560 genes were predicted.
  • the search target databases were all SGD ORF sequences (6,717), CANDida albicans database CGD (http://www.candidagenome.org/) all ORF sequences (6,107), SwissProt Release 55.6 all sequences (788,247).
  • the annotation procedure is as follows. (1) Perform blast search with evalue cutoff 1e-5 for each predicted ORF sequence. (2) For the hits obtained as a result of the blast search, determine which of the following criteria a) to c) is satisfied: a) (HSP length / query sequence length ⁇ 0.7) and (HSP length / total length of hit sequence ⁇ 0.7) and (HSP identity ⁇ 0.5); b) (HSP length / query sequence length ⁇ 0.5) and (HSP length / total length of hit sequence ⁇ 0.5) and (HSP identity ⁇ 0.3); c) None of the hits satisfies the above a) and b).
  • HSP is an abbreviation for High-scoring Segment Pair, and indicates a pair of partial sequences in which similarity exceeding a threshold is detected.
  • Hit sequence description ...” (the hit sequence description is putative, hypothetical, probable, unknown, unnamed, predicted, etc.); ⁇ If condition c) is met, annotate the following description: “Hypothetical protein”; If conditions a) -c) are not met, ie if the hit is 0, annotate the following description: “Predicted protein”; 4) When annotating under conditions a) or b), if a gene name is defined for the hit sequence, the gene name is also annotated at the same time.
  • annotations were performed using the ones with higher priority in the order of SGD>CGD> SwissProt.
  • Example 4 Extraction of gene region encoding secretory signal peptide
  • DNA encoding the secretory signal peptide according to the present invention can be identified.
  • a transmembrane site prediction program and a secretory signal peptide prediction program PrediSi (PREDiction of Signal peptides) (http: // www .predisi.de /) was used to predict the secretory signal peptide.
  • the signal peptide and cleavage site were estimated using a data set trained for eukaryotes. Furthermore, based on the results obtained by this analysis, a gene region encoding the secretory signal peptide was extracted from the genes for which the secretory signal peptide could be predicted by a plurality of these prediction programs.
  • the amino acid sequence and nucleotide sequence of the secretion signal and the results of the annotation of Example 3 are shown in Table 1.
  • Example 5 Construction of a one-copy-integrated plasmid into the CuURA3 locus Using the genomic DNA of Candida utilis as a template, PCR with a primer set of IM-371 (SEQ ID NO: 513) and IM-372 (SEQ ID NO: 514) By performing an extension reaction (45 seconds), the upstream sequence of the CuURA3 gene was amplified. In addition, by performing PCR (extension reaction 45 seconds) with the primer set of IM-373 (SEQ ID NO: 515) and IM-374 (SEQ ID NO: 516) using the genomic DNA of Candida utilis as a template, the CuURA3 gene The downstream sequence was amplified.
  • the obtained two types of DNA fragments were mixed, and PCR was performed with the primer set of IM-371 and IM-374 (extension reaction 1 minute 30 seconds).
  • the resulting DNA fragment was digested with Bss HII, and inserted into the Bss HII site of pBluescriptIISK (+), the resulting plasmid PCU685 (aka: pURAin) and was named.
  • a Not I recognition sequence, an Xba I recognition sequence, a Bam HI recognition sequence, and a Cla I recognition sequence are present at the linking site between the upstream and downstream sequences of CuURA3 .
  • the inserted DNA fragment side of Bss HII, Bgl II recognition sequence respectively are present. All PCR was performed with KOD plus.
  • PCR was carried out using pCU621 as a template and IM-349 (SEQ ID NO: 517) and IM-350 (SEQ ID NO: 518) as primers (elongation reaction 2.5 minutes).
  • the plasmid pCU621 also known as pNNLHL
  • pNNLHL is a DNA fragment composed of loxP, PGK gene promoter, HPT gene, GAP gene terminator, and loxP in this order cloned into the pCR2.1 vector [Invitrogen: TA cloning kit (pCR2.1vector)].
  • PCR was performed using pPGKPT2 (Japanese Patent Application Laid-Open No.
  • PGK gene terminator The resulting, loxP, PGK gene promoter, HPT gene, GAP gene terminator, a DNA fragment of about 3kbp consisting loxP, PCU685 was digested with Bam HI and Cla I (aka: pURAin) to ligated A new plasmid pCU687 (also known as pURAPGtH) was constructed.
  • Plasmid pCU687 (alias: pURAPGtH) was used as a template, and IM-425 (SEQ ID NO: 521) and IM-426 (SEQ ID NO: 522) were used as primers. Other experimental conditions followed the attached protocol.
  • An expression vector for introducing a plurality of gene expression cassettes into the CuURA3 gene locus encoding Candida utilis orotidine 5 ′ phosphate decarboxylase was constructed.
  • the CuURA3 gene upstream sequence fragment was obtained by performing PCR using pCU699 as a template using a combination of TMP-1 (SEQ ID NO: 523) and TMP-2 (SEQ ID NO: 524) as primers.
  • TMP-1 SEQ ID NO: 523
  • TMP-2 SEQ ID NO: 524
  • GAP glyceraldehyde 3-phosphate dedehydrogenase gene
  • Candida utilis uses a combination of TMP-3 (SEQ ID NO: 525) and TMP-4 (SEQ ID NO: 526) as a primer, and Candida utilis.
  • the obtained CuURA3 gene upstream sequence / GAP gene promoter fusion fragment has a Not I site and a Bgl II site in this order at the 5 ′ end, and further an Xba I site at the 3 ′ end.
  • the Candida utilis phosphoglycerate kinase gene ( CuPGK ) terminator was a combination of TMP-5 (SEQ ID NO: 527) and TMP-6 (SEQ ID NO: 528) as a primer, and the CuURA3 gene downstream sequence fragment was TMP-7 ( Using the combination of SEQ ID NO: 529) and TMP-8 (SEQ ID NO: 530) as primers, PCR was performed using pCU699 of Candida utilis as a template to obtain each gene fragment.
  • the hygromycin phosphotransferase gene ( HPT ; hygromycin resistance gene) expression cassette acting on Candida utilis is prepared using a primer of a combination of TMP-9 (SEQ ID NO: 531) and TMP-10 (SEQ ID NO: 532). It was obtained by performing PCR using pCU699 as a template. Each of the obtained DNA amplification products was subjected to electrophoresis and then extracted from an agarose gel. The recovered products were mixed, and PCR was performed using the combination of TMP-5 and TMP-8 as primers to obtain a DNA fragment in which the CuPGK gene terminator, hygromycin resistance gene, and CuURA3 gene downstream sequence were fused.
  • the DNA fragment BamH I, subjected to Xho I treatment, to construct pVT92 was introduced into the restriction enzyme site of PVT86 ( Figure 1). pVT86 was previously treated with BamH I and Xho I, and after phenol / chloroform precipitation, dephosphorylation was performed.
  • pVT92 the Not I or Bgl II, and Bgl II, when cut with Apa I, Xho I, or Kpn I, CuURA3 gene upstream sequences, PGK gene terminator, loxP, PGK gene promoter, HPT gene, GAP gene terminator from loxP Resulting in a DNA fragment.
  • pVT92 When pVT92 is used to transform Candida utilis, double-stranded recombination occurs at the CuURA3 locus, so that the DNA fragment is integrated into the chromosome, for example, 600 to 800 ⁇ g / ml that cannot grow in a wild strain. It is possible to grow on a medium containing HygB at a concentration of
  • pVT92 was treated with Nhe I and Spe I, and the resulting three DNA fragments were purified.
  • the 7 kbp vector fragment was purified and dephosphorylated.
  • a 1 kbp CuGAP gene promoter and a 0.5 kbp PGK gene terminator were sequentially ligated to the above vector, and the direction of the gene was CuURA3 gene upstream, CuPGK gene terminator, CuGAP gene promoter, loxP, CuPGK gene promoter, HPT Gene, CuGAP gene terminator, loxP, and CuURA3 gene downstream were selected. This was named pVT229.
  • pVT229 can be treated with XbaI and BamHI to introduce a target gene between the CuPGK gene terminator and the CuGAP gene promoter, a foreign gene can be expressed at the CuURA3 locus.
  • pVT92 may be incorporated not only into the CuURA3 locus but also into the CuGAP locus, pVT229 is recombined only in CuURA3 because the gene expression cassette is reversed.
  • Example 6 Cloning of a reporter gene for signal peptide evaluation (beta-glucosidase derived from Aspergillus oryzae RIB40 strain, XP_001820101) aspergillus oryzae RIB40 strain beta-glucosidase, (XP_001820101) gene fragment 33 as F, sequence number H as sequence 40, H Using a combination of CA40R (SEQ ID NO: 534) and a combination of CA40F (SEQ ID NO: 535) and BA40R (SEQ ID NO: 536), PCR was performed using the chromosomal DNA of Aspergillus oryzae RIB40 strain as a template.
  • Each of the obtained DNA amplification products was subjected to electrophoresis and then extracted from an agarose gel.
  • the recovered products were mixed and subjected to PCR using the combination of HA40F and BA40R as primers to obtain the full length beta-glucosidase gene lacking the intron.
  • the obtained DNA fragment was cloned using Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit manufactured by Invitrogen to obtain pVT192.
  • Example 7 Construction of a strain expressing a reporter gene having a signal peptide present in the Candida utilis genome
  • a DNA fragment was prepared by fusing each signal peptide and the reporter gene.
  • the fusion DNA fragment was prepared by using overlap extension PCR. That is, each signal peptide DNA fragment was mixed with a reporter gene DNA fragment lacking the putative signal peptide, and PCR was performed again. This fusion DNA fragment was introduced into pVT229 to construct an expression vector.
  • each gene region was amplified from the genomic DNA of Candida utilis by PCR.
  • An Xba I site is added to the 5 ′ end of each Forward primer used for PCR.
  • the 5 ′ end of the Reverse primer is provided with the base sequence of the 5 ′ end of the putative mature reporter gene.
  • a reporter gene DNA fragment lacking the putative signal sequence was obtained by performing PCR using pVT192 as a template using a combination of NoSPAoBGFw (SEQ ID NO: 537) and BamAAoBG_Rv2 (SEQ ID NO: 538) as primers.
  • Example 8 Reporter assay of a Candida utilis transformed strain into which a reporter gene to which each signal peptide was added was introduced As shown below, the obtained Candida utilis transformant was cultured, and the beta-glucosidase activity of the culture was measured. .
  • Each strain was inoculated into 0.5 ml of YPD medium (2% peptone, 1%, yeast extract, 2% glucose) placed in a 96-well deep bottom plate, and precultured at 30 ° C. for 24 hours. 10 ⁇ l of the preculture was inoculated into the same medium as the preculture, and the main culture was performed under the same conditions.
  • YPD medium 2% peptone, 1%, yeast extract, 2% glucose
  • the obtained transformant culture solution was appropriately diluted with 100 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0), and beta-glucosidase activity was measured.
  • the reaction was carried out at 50 ° C. for 10 minutes in a reaction system of 100 mM sodium acetate buffer (pH 5.0), 5 mM paranitrophenyl glucopyranoside, 5% (v / v) crude enzyme solution.
  • 1M sodium carbonate was added twice as much as the reaction solution to stop the reaction, and the absorbance was measured at a wavelength of 410 nm.
  • the numerical value was displayed as an average value of 4 lots.
  • Table 2 shows the reporter assay results for various signal peptide evaluations. According to the results in Table 2, there were 174 sequences whose secretion efficiency was improved as compared to the original signal peptide of the reporter gene (signal peptide number 0) (multiple of the secretion efficiency with respect to the native signal peptide was 1 or more), of which Twelve were more than 3 times more efficient in secretion, up to 5.6 times.
  • Example 9 Motif analysis For a total of 353 signal peptides with 30 or less residues in the signal peptide, the multiple of secretion efficiency (multiple of secretion efficiency relative to native signal peptide) is 2 times or more, 1 time or more, and less than 1 time The motif analysis was performed in four groups of less than 0.5 times.
  • MAFT Multiple alignment program for amino acid or nucleotide sequence
  • WebLogo was used to visualize the appearance frequency of amino acids at the aligned sites. The results are shown in FIG. In FIG.
  • (A) is a group having a secretion efficiency of 2 times or more
  • (B) is a group having a secretion efficiency of 1 time or more
  • (C) is a group having a secretion efficiency of less than 1 time
  • (D) is a secretion efficiency of 0.5 times.
  • the analysis results of less than groups are shown.
  • a signal peptide with high secretion efficiency was found to be “basic amino acids (K, R) next to M at the N terminus” and “(A or V) -X (any amino acid) -A— There was a tendency to have a structure of “cleavage site (C-terminal side)”.

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Abstract

　キャンディダ・ユティリス（Candida utilis）のゲノムに由来する、真核細胞宿主内で分泌シグナルとして機能しうるペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる、分泌シグナル遺伝子が開示される。この分泌シグナル遺伝子により、タンパク質を効率よく製造することが可能となる。

Description

分泌シグナル配列およびこれを利用したタンパク質発現系 関連出願の参照
　本特許出願は、先に出願された日本国における特許出願である特願２００９－２９５９２７号（出願日：２００９年１２月２５日）に基づく優先権の主張を伴うものである。この先の特許出願における全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。
発明の背景
　技術分野
　本発明は、新規な分泌シグナル配列およびこれを利用したタンパク質発現系に関する。
　背景技術
　これまでに、遺伝子組み換え技術を用いたタンパク質生産には、大腸菌、酵母、枯草菌などの微生物をはじめとして、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞など、様々な宿主が用いられてきた。これらタンパク質生産系において、大腸菌が最も広く用いられている宿主の一つである。しかしながら、大腸菌で発現させた異種タンパク質は不溶化する場合が多く、また、翻訳後の修飾が行われないことから、真核生物由来のタンパク質を天然型と同じ立体構造で再現することは必ずしも容易ではない。また、大腸菌には特有のエンドトキシンが存在し、これが最終製品に夾雑物として混入する可能性がある。一方、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞を用いる方法は、真核生物由来のタンパク質の正確な翻訳後修飾が期待できるが、扱いが微生物より難しい、培養コストがかかる、生育が遅い、生産効率が悪い、培養のスケールアップが困難など、多くの問題点を有する。このため、安価にタンパク質を生産するためには、大腸菌のように取り扱いが容易で、真核生物由来のタンパク質を発現させた場合においても翻訳後修飾が起こる宿主が有望である。
　単細胞真核微生物である酵母でタンパク質を分泌発現させた場合、細胞質から小胞体／ゴルジ体を経由する過程で様々な修飾が起こる。そのため、ヒトや動物由来のタンパク質を比較的高い確率で正常タンパク質として発現することができる。また、大腸菌などの微生物と同様に、培養設備、培養時間および培養コストの面で培養細胞よりも安価に培養することができるという利点を有する。特に出芽酵母は、ビールやワインなどの酒類やパンの製造に用いられており、安全性が確認されている。
　酵母のうち、今日まで最も良く研究されて遺伝学的知見が蓄積している酵母にはサッカロマイセス属酵母があり、これは種々の物質生産の宿主として検討されている。近年、サッカロマイセス属以外の酵母として、ピキア属酵母、ハンセヌラ属酵母、クルイベロマイセス属酵母、カンジダ属酵母などの多くの種について、それらを形質転換する手法が開発され、有用物質生産の宿主として検討されている。特にカンジダ属酵母は、炭素資化領域が広く、Crabtree効果陰性酵母であるなど、サッカロマイセス属にはない特徴を有していることから、有用物質生産とってその役割が期待されている。
　カンジダ属酵母の中でも、キャンディダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａ　ｕｔｉｌｉｓ）は、キシロースなどのペントースに対する優れた資化性を示す。サッカロマイセス属とは異なり、好気的条件下でエタノールを生成せず、それによる増殖阻害も受けないことから、高密度で連続培養による効率的な菌体生成が可能である。また、無機窒素の同化能に優れることから、かつてタンパク質源として注目され、ペントースを多く含む、広葉樹の糖化液や亜硫酸パルプを糖源とした菌体の工業生産が実施されたことがある。また、キャンディダ・ユティリスは、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）やサッカロマイセス・フラジリス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｆｒａｇｉｌｉｓ）と同様に、ＦＤＡ（米国連邦食品医薬品局）によって食用酵母として認定されており、食品添加物として安全に使用できることが認められている。実際に、キャンディダ・ユティリスは、現在でも日本、ドイツ、アメリカなど、世界各国で生産され、食飼料として利用されている。さらに、以上のような微生物タンパク質源としての利用だけでなく、キャンディダ・ユティリスは、ペントースの資化性株、エチルアセテート、L-グルタミン酸、グルタチオン、インベルターゼなどの生産株として広く産業界で利用されてきた。近年、キャンディダ・ユティリスについてもその形質転換法が開発され（非特許文献１：K Kondo, T Saito, S Kajiwara, M Takagi and N Misawa., A transformation system for the yeast Candida utilis: use of a modified endogenous ribosomal protein gene as a drug-resistant marker and ribosomal DNA as an integration target for vector DNA., J. Bacteriol., 12, 1995, 7171-7177, Vol 177, No.）、様々な化合物を代謝工学的に生産する技術が開発されている（非特許文献２：Hiroshi Shimada, Keiji Kondo, Paul D. Fraser, Yutaka Miura, Toshiko Saito, and Norihiko Misawa., Increased Carotenoid Production by the Food Yeast Candida utilis through Metabolic Engineering of the Isoprenoid Pathway., Appl Environ Microbiol, July 1998, p. 2676-2680, Vol. 64, No. 7；非特許文献３：Yutaka Miura, Keiji Kondo, Toshiko Saito, Hiroshi Shimada, Paul D. Fraser, and Norihiko Misawa, Production of the Carotenoids Lycopene, β-Carotene, and Astaxanthin in the Food Yeast Candida utilis., Appl Environ Microbiol, April 1998, p. 1226-1229, Vol. 64, No. 4；非特許文献４：Keiji Kondo, Yutaka Miura, Hidetaka Sone, Kazuo Kobayashi & Hiroshi lijima., High-level expression of a sweet protein, monellin, in the food yeast Candida utilis., Nature Biotechnology 15, 453 - 457 (1997)；非特許文献５：Yutaka Miura, Keiji Kondo, Hiroshi Shimada, Toshiko Saito, Katsumi Nakamura, Norihiko Misawa., Production of lycopene by the food yeast, Candida utilis that does not naturally synthesize carotenoid., Biotechnology and Bioengineering Volume 58 Issue 2-3, Pages 306 - 308；非特許文献６：Shigehito IKUSHIMA, Toshio FUJII1), Osamu KOBAYASHI, Satoshi YOSHIDA and Aruto YOSHIDA., Genetic Engineering of Candida utilis Yeast for Efficient Production of L-Lactic Acid., Bioscience Biotechnology and Biochemistry, Vol. 73 (2009), No. 8, pp.1818-1824；非特許文献７：Yi-Ren Hong, Ya-Lei Chen, Lynn Farh, Wen-Jen Yang, Chen-Hua Liao and David Shiuan., Recombinant Candida utilis for the production of biotin., Applied Microbiology and Biotechnology., Volume 71 (2006), Number 2, 211-221）。また、キャンディダ・ユティリスについて、多くの細胞質タンパク質が容易に生産できるようになり、発現システムとしての有用性が明らかにされている。
　酵母におけるタンパク質生産においてタンパク質を分泌生産させることは、翻訳後に糖鎖などの修飾が付加される点、精製が容易である点、物質の細胞外変換の観点から望ましい方法である。酵母によるタンパク質の分泌発現は種々の利点があることから、これまで、より効率的な分泌生産を目指して数多くの取り組みがなされてきた（非特許文献８：MICHAEL A. ROMANOS, CAROL A. SCORER AND JEFFREY J. CLARE., Foreign gene expression in yeast: a review., YEAST VOL. 8: 423-488 (1992)）。キャンディダ・ユティリスにおいても、異種タンパク質の分泌発現量の向上を目的として、その主要分泌タンパク質であるインベルターゼの遺伝子を不活性化することにより、異種タンパク質の分泌発現量を増大させることに成功した報告がなされている（特許文献１：特開２００３－４７４７１６号公報）。しかしながら、細胞質タンパク質の発現量と比較した場合、異種タンパク質の分泌発現量は低く、改良の余地は大きい。
　タンパク質が細胞外に分泌されるためには、まず、小胞体膜上の膜透過装置（トランスロコン）によって小胞体膜を通過する必要がある。分泌タンパク質の認識にはタンパク質のＮ末端に存在するシグナルペプチドが重要な役割を示す。酵母における一般的な分泌シグナルの構造は、２０アミノ酸前後の長さを持ち、Ｎ末端近傍に塩基性アミノ酸が存在し、その後に疎水性のアミノ酸が連続する構造を有する。最終的にこのシグナルペプチドは小胞体膜上のシグナルペプチダーゼで切断され、切断される部位となるＣ末端には分子量の小さなアミノ酸が存在する。膜通過には、トランスロコンに結合したリボソーム上でのタンパク質の合成と共役して行われるものと、細胞質で前駆体タンパク質合成完了後にSec62/63複合体が加わったトランスロコンを介して小胞体内腔へと通過されていく例が知られている。このように、１つのタンパク質の分泌には数多くのタンパク質が関わっており、それら分泌経路が選択される上でも、シグナルペプチドの構造が分泌効率に与える影響は大きい。しかしながら、キャンディダ・ユティリスにおいて、分泌効率の優れたシグナルペプチドが詳細に検討された例はない。
　分泌されたタンパク質はすでにシグナルペプチドを有していないため、そのアミノ酸配列を決定するためには分泌タンパク質の塩基配列を決定する必要がある。分泌タンパク質は培養上清や膜画分をSDS-PAGEに供することで検出することができる。検出されたタンパク質についてアミノ酸解析や質量分析等を行うことにより部分アミノ酸配列を決定することができ、アミノ酸配列から予測された塩基配列情報を基にしてPCRやサザン解析を行うことによって分泌タンパク質の塩基配列を決定することができる。しかしながら、この方法では多検体の同定は困難であり、タンパク質自体の同定が困難な場合も多い。また、この方法では実際に発現している分泌タンパク質しか同定することができないため、潜在的な分泌タンパク質のシグナル配列を取得することはできない。
　また、全ゲノム配列が明らかとなっている生物であれば、分泌シグナルとして機能しうる候補を効率良く選抜することが可能である。しかし、キャンディダ・ユティリスの全ゲノム配列は、今のところ公開されていない。
K Kondo, T Saito, S Kajiwara, M Takagi and N Misawa., A transformation system for the yeast Candida utilis: use of a modified endogenous ribosomal protein gene as a drug-resistant marker and ribosomal DNA as an integration target for vector DNA., J. Bacteriol., 12, 1995, 7171-7177, Vol 177, No. Hiroshi Shimada, Keiji Kondo, Paul D. Fraser, Yutaka Miura, Toshiko Saito, and Norihiko Misawa., Increased Carotenoid Production by the Food Yeast Candida utilis through Metabolic Engineering of the Isoprenoid Pathway., Appl Environ Microbiol, July 1998, p. 2676-2680, Vol. 64, No. 7 Yutaka Miura, Keiji Kondo, Toshiko Saito, Hiroshi Shimada, Paul D. Fraser, and Norihiko Misawa, Production of the Carotenoids Lycopene, β-Carotene, and Astaxanthin in the Food Yeast Candida utilis., Appl Environ Microbiol, April 1998, p. 1226-1229, Vol. 64, No. 4 Keiji Kondo, Yutaka Miura, Hidetaka Sone, Kazuo Kobayashi & Hiroshi lijima., High-level expression of a sweet protein, monellin, in the food yeast Candida utilis., Nature Biotechnology 15, 453 - 457 (1997) Yutaka Miura, Keiji Kondo, Hiroshi Shimada, Toshiko Saito, Katsumi Nakamura, Norihiko Misawa., Production of lycopene by the food yeast, Candida utilis that does not naturally synthesize carotenoid., Biotechnology and Bioengineering Volume 58 Issue 2-3, Pages 306 - 308 Shigehito IKUSHIMA, Toshio FUJII1), Osamu KOBAYASHI, Satoshi YOSHIDA and Aruto YOSHIDA., Genetic Engineering of Candida utilis Yeast for Efficient Production of L-Lactic Acid., Bioscience Biotechnology and Biochemistry, Vol. 73 (2009), No. 8, pp.1818-1824 Yi-Ren Hong, Ya-Lei Chen, Lynn Farh, Wen-Jen Yang, Chen-Hua Liao and David Shiuan., Recombinant Candida utilis for the production of biotin., Applied Microbiology and Biotechnology., Volume 71 (2006), Number 2, 211-221 MICHAEL A. ROMANOS, CAROL A. SCORER AND JEFFREY J. CLARE., Foreign gene expression in yeast: a review., YEAST VOL. 8: 423-488 (1992) 特開２００３－４７４７１６号公報
　本発明者らは、キャンディダ・ユティリスのゲノムを解読し、そのデータを基にin silicoで遺伝子探索および機能予測を行い、続いて分泌シグナルを同定した。さらに、本発明者らは、そのシグナル配列をレポーターの遺伝子と融合させることにより、その配列の分泌シグナルとしての能力を評価した。その結果、キャンディダ・ユティリスのゲノム上に存在する多くの分泌シグナルが見出された。本発明はこの知見に基づくものである。
　従って、本発明の目的は、新規な分泌シグナル遺伝子、該分泌シグナル遺伝子を含む発現用ベクターおよび発現ベクター、該分泌シグナル遺伝子を含む形質転換体、ならびに該分泌シグナル遺伝子を利用したタンパク質の製造法を提供することにある。
　そして、本発明による分泌シグナル遺伝子は、キャンディダ・ユティリス（Candida utilis）のゲノムに由来する、真核細胞宿主内で分泌シグナルとして機能しうるペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるものである。
　本発明による発現用ベクターは、真核細胞宿主内でタンパク質を発現させるための発現用ベクターであって、本発明による分泌シグナル遺伝子、および該分泌シグナル遺伝子の下流側に直接的に前記タンパク質の遺伝子を連結させるための遺伝子導入部位を含んでなるものである。
　本発明による発現ベクターは、真核細胞宿主内でタンパク質を発現する発現ベクターであって、本発明による分泌シグナル遺伝子、および該分泌シグナル遺伝子の下流側に直接的に連結された前記タンパク質の遺伝子を含んでなるものである。
　本発明による形質転換体は、本発明による分泌シグナル遺伝子と、該分泌シグナル遺伝子の下流側に直接的に連結されたタンパク質の遺伝子とからなるコード配列、または本発明による発現ベクターを含んでなる真核細胞宿主からなるものである。
　本発明によるタンパク質の製造法は、（ａ）本発明による形質転換体を培養し、これにより培地中にタンパク質を蓄積させる工程、および（ｂ）培地からタンパク質を回収する工程を含んでなる。
　本発明による分泌シグナル遺伝子を用いることにより、形質転換体の培養によって目的とするタンパク質が本発明による分泌シグナルとの融合物として生産され、その後のプロセッシングにより、分泌シグナルを有さない成熟型のタンパク質が細胞から分泌される。よって、本発明によれば、目的とするタンパク質を培地中に蓄積させることができるため、タンパク質の回収が容易であり、従って、タンパク質を効率よく製造することが可能となる。
図１は、ｐＶＴ９２の構築の手順を示す。 図２は、シグナルペプチドのアミノ酸残基数と相対活性のプロットを示す。 図３は、分泌シグナル配列のモチーフ解析の結果を示す。
発明の具体的説明
　本発明による分泌シグナル遺伝子は、キャンディダ・ユティリス（Candida utilis）のゲノムに由来する、真核細胞宿主内で分泌シグナルとして機能しうるペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるものである。このような分泌シグナル遺伝子は、好ましくはキャンディダ・ユティリス（Candida utilis）内で分泌シグナルとして機能しうるペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるものとされる。
　本発明における分泌シグナルペプチドの具体的な配列は特に制限されるものではないが、例えば、配列番号２～１７、１９～３２、３４～３９、４１、４３～４６、４９～５１、５４～７２、７４～８５、８７～９４、９６～１２１、１２３～１２８、１３０～１３３、１３５～１５４、１５６～１８１、１８３～２１３および２１５～２５６で表されるアミノ酸配列が挙げられる。他の具体的な配列としては、例えば、配列番号５３９～５４７、５４９～５５８、５６１～５７３、５７５～５８３、５８５～５９２、５９４～５９８、６００～６０３、６０６～６１４、６１６～６２２、６２４～６３０、６３２～６３４、６３６～６４８、６５０～６５２、６５４～６５９、６６１、６６３～６６７、６６９、６７０、６７２～６８２、６８４、６８６、６８８～６９４、６９６～７２６、７２９～７５４、７５６および７５８～７６１で表されるアミノ酸配列が挙げられる。
　本発明の好ましい実施態様によれば、分泌シグナルペプチドの配列は、配列番号２～５、１５、２４、２９、３１、３２、３５、３６、４１、４６、４９～５１、５５～５７、６０、６３、６４、７８、８７、９１、９８、１０７、１１１、１１８、１２０、１２１、１２６、１３０、１３１、１３３、１３６、１４０、１４２、１４４、１４５、１４７～１４９、１５２、１５４、１５６、１６８、１７２、１７３、１７８、１７９、１８５、１８９、１９０、１９７、１９８、２０２、２１５、２１８、２２４、２２５および２３２～２３４からなる群から選択されるアミノ酸配列とされる。他の好ましい分泌シグナルペプチドの配列は、配列番号５４０～５４４、５４６、５４７、５５０、５５４、５５６～５５８、５６１、５６２、５６６～５６９、５７１、５７６、５７９、５８２、５８５～５９２、５９５、５９７、５９８、６０２、６０６、６１０、６１１、６１４、６１８、６１９、６２１、６２２、６２５、６２６、６２８、６２９、６３２、６３４、６３６～６３９、６４２～６４８、６５１、６５２、６５７～６５９、６６１、６６３、６６４、６６９、６７０、６７２、６７７、６７８、６８１、６８４、６８６、６９０、６９１、６９４、６９６、６９７、７００～７０４、７１０、７１１、７１３～７１５、７１７、７１８、７２１～７２４、７２９、７３１～７３４、７３７、７３８、７４２、７４５、７４７、７５０、７５２および７５９からなる群から選択されるアミノ酸配列である。
　本発明のさらに好ましい実施態様によれば、分泌シグナルペプチドの配列は、配列番号２９、３５、３６、１０７、１１１、１４４、１５４および２１８からなる群から選択されるアミノ酸配列とされる。また、これらと同様に好ましい他の分泌シグナルペプチドの配列として、配列番号５９５、６４７、７０４および６３９で表されるアミノ酸配列も挙げられる。すなわち、本発明の特に好ましい実施態様によれば、分泌シグナルペプチドの配列は、配列番号１１１、５９５、１４４、３６、３５、１０７、６４７、７０４、６３９、２９、１５４および２１８からなる群から選択されるアミノ酸配列とされる。
　本発明における分泌シグナルペプチドの配列は、上記の具体的なアミノ酸配列に代えて、各アミノ酸配列の変異体、例えば、各アミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列であり、かつ、分泌シグナル活性を有するアミノ酸配列としてもよい。欠失、置換または付加されるアミノ酸残基の数は、好ましくは１～９個、より好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～３個、さらに好ましくは１個とされる。また、上記の各アミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列であることが好ましい。特に好ましい変異は、一アミノ酸置換である。さらに、このアミノ酸残基の置換は、相互に類似の性質を有するアミノ酸間での置換、すなわち、保存的置換であることが好ましい。ここで、「保存的置換」としては、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＡｌａおよびＭｅｔの間での置換；ＡｓｐおよびＧｌｕの間での置換；ＡｓｎおよびＧｌｎの間での置換；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＧｌｙおよびＡｌａの間での置換；Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓの間での置換；ならびにＰｈｅ、ＴｙｒおよびＴｉｐの間での置換が挙げられ、好ましくはＧｌｙおよびＡｌａの間での置換；Ｖａｌ、ＩｌｅおよびＬｅｕの間での置換；ＡｓｐおよびＧｌｕの間での置換；ＡｓｎおよびＧｌｎの間での置換；ＳｅｒおよびＴｈｒの間での置換；ＬｙｓおよびＡｒｇの間での置換；ならびにＰｈｅおよびＴｙｒの間での置換が挙げられる。さらに、本明細書においては、高い分泌効率を示すシグナルペプチドの構造的な特徴として、(i)Ｎ末のＭｅｔの次に塩基性アミノ酸（例えばＬｙｓまたはＡｒｇ）が存在すること、および(ii)「(ＡｌａまたはＶａｌ)－Ｘ（任意のアミノ酸）－Ａｌａ－切断部位(Ｃ末側)が存在すること、という２つの傾向が示されている。従って、本発明の一つの好ましい実施態様によれば、上記の変異体は、このような構造的特徴を有するものとされる。
　本発明における分泌シグナルペプチドは、通常は３０個以下、好ましくは２０個以下、さらに好ましくは１６～１８個、最も好ましくは１７個または１８個のアミノ酸残基からなるものとされる。
　本発明による分泌シグナル遺伝子は、上述の分泌シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる遺伝子である。本発明による分泌シグナル遺伝子は、好ましくはキャンディダ・ユティリス（Candida utilis）のゲノムに由来するものとされる。このような遺伝子はキャンディダ・ユティリスの染色体から採取することができ、また、合成することもできる。分泌シグナル遺伝子の具体的なヌクレオチド配列は特に制限されるものではないが、例えば、上述のアミノ酸配列に対応するコード配列として、後述する表１に記載のヌクレオチド配列が挙げられる。
　一般に、目的とするタンパク質は、その構造遺伝子を組み込んだ発現系で発現される。発現系としては、タンパク質構造遺伝子を有する発現ベクターで形質転換した真核細胞が好ましい。真核細胞としては、特にキャンディダ・ユティリス（Candida utilis）が好ましい。発現系においてタンパク質構造遺伝子の５’側（上流側）先端に上記した分泌シグナル遺伝子を結合することにより、タンパク質のＮ末端側に分泌シグナルが結合した融合タンパク質が生産され、その後、細胞内でプロセッシングされて、タンパク質が細胞外へ分泌される。
　本発明による発現用ベクターは、真核細胞宿主内でタンパク質を発現させるための発現用ベクターである。この発現用ベクターは、本発明による分泌シグナル遺伝子、および該分泌シグナル遺伝子の下流側に直接的に前記タンパク質の遺伝子を連結させるための遺伝子導入部位を含んでなる。この遺伝子導入部位にタンパク質構造遺伝子を導入して発現ベクターとすると、分泌シグナル遺伝子とタンパク質構造遺伝子が連結され、その発現により分泌シグナルとタンパク質が連結したタンパク質が生産される。
　本明細書において、分泌シグナルと融合した形で発現される目的のタンパク質はいかなるタンパク質であってもよく、特に制限されない。このタンパク質は、発現に用いられる宿主細胞が本来発現するものであってもよいが、好ましくは宿主細胞が本来発現しないもの、すなわち異種タンパク質とされる。
　本発明による発現ベクターは、真核細胞宿主内でタンパク質を発現する発現ベクターであり、本発明による分泌シグナル遺伝子、および該分泌シグナル遺伝子の下流側に直接的に連結された前記タンパク質の遺伝子を含んでなる。
　本発明による発現用ベクターおよび発現ベクターは、染色体組み込み型のものであってもよく、あるいは、核外でコピー数を増やし、安定に存在するものであってもよい。
　本発明による発現用ベクターおよび発現ベクターは、分泌シグナル遺伝子－タンパク質遺伝子の発現を制御するプロモーター領域を含むことが好ましい。このプロモーターは、その下流に導入された分泌シグナル遺伝子－タンパク質遺伝子の発現を支配する。このプロモーターは、形質転換に用いられる真核細胞宿主において機能しうるものであればよい。例えば、真核細胞宿主としてキャンディダ・ユティリス（Candida utilis）を用いる場合には、キャンディダ・ユティリスにおいて機能しうるものであればよい。
　また、本発明による発現用ベクターおよび発現ベクターは、形質転換に用いられる真核細胞宿主において機能しうる選択マーカー遺伝子を含むことが好ましい。この選択マーカー遺伝子は、例えば薬剤耐性マーカー遺伝子とされ、好ましくはシクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子、ジェネティシン（Ｇ４１８）耐性を付与する遺伝子、またはハイグロマイシンＢ耐性を付与する遺伝子などがある。ジェネティシン（Ｇ４１８）耐性を付与する遺伝子、またはハイグロマイシンＢ耐性を付与する遺伝子は、野生の酵母には存在しない配列であるため、真核細胞宿主として酵母を用いる場合には標的の遺伝子座に組込まれる確率が高いと考えられている。
　真核細胞宿主の形質転換は、当技術分野において公知の方法に従って行うことができる。特に、キャンディダ・ユティリスの形質転換法としては、特開２００３－１４４１８５号公報に記載の技術が挙げられる。この文献では、利用可能なベクターとして、キャンディダ・ユティリスの染色体ＤＮＡと相同な配列と、選択マーカー遺伝子とを含んでなり、相同組換えによって異種遺伝子をキャンディダ・ユティリスの染色体ＤＮＡに組み込むことができるもの、あるいは、キャンディダ・ユティリスで自律複製機能を有するＤＮＡ配列と、選択マーカー遺伝子とを含んでなり、高い頻度でキャンディダ・ユティリスを形質転換できるものが開発されている。
　形質転換体を培養するための培地としては、形質転換体の製造に用いた真核細胞宿主に応じて当技術分野で公知の培地から選択することができ、例えば、ＹＰＤ培地等の栄養培地またはＭＭ培地等の最少培地などを用いることができる。
　培養温度は、用いる真核細胞宿主の生育可能な範囲で選択することができる。培養温度は、例えば、約１５℃～４５℃とすることができ、より好ましくは２５～４０℃、さらに好ましくは２７～４０℃とする。また、発酵過程における培地のｐＨは３～８に保持することが好ましく、より好ましくはｐＨ４～７とされる。培養時間は特に限定されず、適宜決定された反応時間で実施される。これらの条件の最適化は、当業者であれば容易に行うことができる。
　培地中に生成したタンパク質の単離・精製法としては、例えば、塩析または溶媒沈澱法等の溶解度の差を利用する方法、透析、限外濾過またはゲル電気泳動法等の分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー等の荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィー等の特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィー等の疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法等の等電点の差を利用する方法などが挙げられる。
　単離・精製されたタンパク質の確認方法としては、例えば、ウエスタンブロッティング法、活性測定法などが挙げられる。また、精製されたタンパク質は、アミノ酸分析、アミノ末端分析、一次構造解析などによりその構造を明らかにすることもできる。
　さらに、本明細書においては、高い分泌効率を示すシグナルペプチドの構造的な特徴として、(i)Ｎ末のＭｅｔの次に塩基性アミノ酸（例えばＬｙｓまたはＡｒｇ）が存在すること、および(ii)「(ＡｌａまたはＶａｌ)－Ｘ（任意のアミノ酸）－Ａｌａ－切断部位(Ｃ末側)が存在すること、という２つの傾向が示されている。従って、本発明の他の態様によれば、これらの構造を有することを指標とする、分泌シグナルペプチドを探索する（スクリーニングする）ための方法が提供される。この方法では、候補となるペプチドが上記の構造(i)および(ii)を有するか否かを調べ、そのペプチドがこれらの構造を有する場合には、そのペプチドを分泌シグナルペプチドとして同定することができる。この方法が適用されるペプチドは、キャンディダ属生物に由来するペプチドであることが好ましく、より好ましくはキャンディダ・ユティリス（Candida utilis）に由来するペプチドとされる。このようにして同定された分泌シグナルペプチドは、分泌効率を試験するためのさらなる生物学的試験に供することができる。
　以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
　以下の実施例において、ＰＣＲによる遺伝子増幅には、特に述べない限りＴＯＹＯＢＯ社製ＫＯＤ　ｐｌｕｓを使用し、方法は添付のプロトコールに従った。ＰＣＲ増幅反応は９４℃で２分間の熱処理を行った後、変性工程：９４℃で３０秒、アニーリング工程：５５℃で３０秒、伸長工程：６８℃でＸ秒（ただし、Ｘ分は予想される増幅遺伝子の大きさから１　ｋｂｐにつき1分として計算）の３工程を２５サイクル繰り返し、最後に４℃とした。ＰＣＲ増幅装置はＧｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００ (ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ)を使用した。アガロースゲルからのＤＮＡの回収およびＰＣＲ産物の精製にはＧＥヘルスケア社製のＩｌｌｕｓｔｒａ ＧＦＸ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いた。各種制限酵素はＴａＫａＲａ社のものを使用し、方法は添付のプロトコールに従った。ＤＮＡの脱リン酸化反応にはＴａＫａＲａ社製Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｓｈｒｉｍｐ）を使用し、方法は添付のプロトコールに従った。ライゲーション反応にはＴａＫａＲａ社製ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＜Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ＞を使用し、方法は添付のプロトコールに従った。大腸菌の形質転換にはTOYOBO社製のＤＨ５αコンピテントセルを使用し、方法は添付のプロトコールに従った。大腸菌の形質転換体の選抜にはアンピシリン１００μｇ／ｍＬを含むLBプレートを用いた。大腸菌からプラスミドＤＮＡの回収にはＫＵＲＡＢＯ社製ＡＵＴＯＭＡＴＩＣ ＤＮＡ ＩＳＯＬＡＴＩＯＮ ＳＹＳＴＥＭ ＰＩ－２００を使用した。酵母の形質転換は電気パルスによる方法（エレクトロポレーション法）で行った。
　具体的には、電気パルスによる酵母の形質転換は、特開２００３－１４４１８５号公報に記載された方法を一部改変して行った。ＹＰＤプレート上のコロニーを、５ｍｌのＹＰＤ液体培地において、３０℃で約８時間振盪培養した後、２００ｍｌのＹＰＤ液体培地にＯＤ６００が０．００２４になるよう植菌して３０℃で振盪培養する。約１６時間後、対数増殖期（ＯＤ６００＝２．５）にまで菌体が増殖した後、１，４００×ｇで５分間の遠心分離により集菌する。菌体は１００ｍｌの氷冷した滅菌水で１回、続いて４０ｍｌの氷冷した滅菌水で１回洗浄した後、氷冷した１Ｍソルビトール４０ｍｌで１回洗浄する。菌体を１０ｍｌの１Ｍソルビトールに懸濁した後、滅菌ポリプロピレンチューブに移し、再度１，１００×ｇで５分間の遠心分離により集菌する。上清を除いた後、最終菌体液量が２．５ｍｌになるよう、氷冷した１Ｍソルビトールに懸濁する。
　電気パルスによる形質転換実験はバイオラッド社のジーンパルサーを用いて行なう。５０μｌの菌液と、１００ｎｇ～１０μｇのＤＮＡを含む５μｌのＤＮＡ試料、および２．０ｍｇ／ｍｌのサケ精巣由来のキャリアーＤＮＡを５μｌ混合した後、０．２ｃｍのディスポーザブルキュベットに入れ、適当な条件の電気パルスを加える。例えば、電気容量が２５μＦ、抵抗値が６００～１０００オーム、電圧が０．７５～１．２５ＫＶの条件とする。パルス後、１ｍｌの氷冷した１Ｍソルビトールを含むＹＰＤ培地を加え、滅菌ポリプロピレンチューブに移した後、３０℃で約６～１５時間振盪培養する。培養後、選択マーカー遺伝子に応じて、菌液を適切な薬剤を含むＹＰＤ選択培地に塗布した後、プレートを２８～３０℃で３～４日保温して、形質転換体コロニーを得た。ＨＰＴ遺伝子を選択マーカー遺伝子とする場合にはハイグロマイシンＢを６００～８００μｇ／ｍｌの濃度で、ＡＰＴ遺伝子を選択マーカー遺伝子とする場合にはＧ４１８を２００μｇ／ｍｌの濃度でＹＰＤ培地に加えた。以下、それぞれの培地をＨｙｇＢ培地およびＧ４１８培地と表記する。また、ハイグロマイシンＢに耐性であることをＨｙｇＢｒ、ハイグロマイシンＢに感受性であることをＨｙｇＢｓ、Ｇ４１８に耐性であることをＧ４１８ｒ、Ｇ４１８に感受性であることをＧ４１８ｓと表記する。
例１：キャンディダ・ユティリス NBRC0988株のゲノムDNAの調製
　キャンディダ・ユティリスのNBRC0988株を200mlのYPD液体培地（2%グルコース、1%酵母エキス、2％ポリペプトン）に接種し、30℃で24時間振とう培養した後、遠心分離によって菌体を回収した。当業者に公知の方法で酵母ゲノムDNAを穏やかに抽出し、さらに塩化セシウム・エチジウムブロミド密度勾配遠心分離法（Molecular Cloning, 3rd Edition）によってDNA以外の不純物を少なくする作業を行った。最終的に300 micro-gram以上のキャンディダ・ユティリスのゲノムDNAを調製した。パルスフィールドゲル電気泳動でDNAのサイズを調べ、97 kbを超えるサイズのDNAも多量に存在することを確認した。
例２：サンガー法によるシークエンスのためのキャンディダ・ユティリスゲノムDNAライブラリーの作製
　上記で調製したゲノムDNAをHydroshear Device（Genemachines, San Carlos, CA）で断片化し、ベクターに連結した。特に3～4 kbのDNA断片をクローン化されたプラスミドライブラリーと、約40 kbのDNA断片が連結されたフォスミドライブラリーを構築した。
　このライブラリーを用いて、BigDye Terminator v3.1（Applied Biosystems）を試薬とし、ABI PRISM 3730xl（Applied Biosystems）を用いて、挿入されたDNA断片のシークエンスを行った。配列はペアーエンドで解読した。なお反応液はApplied Biosystems社製のサーマルサイクラーを利用し、精製はCleanSeq dye-terminator removal kit（Agencourt）を利用した。得られたデータのうち、特にPHREDスコアーが平均20、あるいは100 bp以上より大きく解読できたもの（典型的なものは500～600 bp）を有効なデータとして取り扱った（プラスミドより57.9 Mbp、フォスミドより18.5 Mbp）。そしてArachne Whole Genome Assembler（Broad Institute of MIT and Harvard）とAgencourt’s Galaxy LIMS systemとConsed（University of Washington）を利用してアッセンブルとその結果のモニタリングを行った。
　キャンディダ・ユティリスのゲノムDNAを用いて、Roche社製の454FLXにてシークエンスを解読した。その結果、211.7 Mbpの塩基配列情報を取得した。これをNewblerでアッセンブルして得られたコンティグ配列と、サンガー法で得たデータについて、Arachne Assemlerを利用することによるハイブリッドアセンブリを行った。その結果、1,307個のコンティグ （うち、2 kb以上が457個）、スーパーコンティグが975個 (うち、1 Mb以上のもの6個、40 kb以上1Mb未満のものが7個) 得られた。スーパーコンティグの長さの合計は14.6 Mbであった。
　40 kbより大きい13個のスーパーコンティグを染色体として扱い、それ以外のものはUMとして1本の染色体にまとめた。
例３：遺伝子予測
　スーパーコンティグ975個に対して、GlimmerM［Salzberg SL, Pertea M, Delcher AL, Gardner MJ, Tettelin H. "Interpolated Markov models for eukaryotic gene finding." Genomics. 1999 Jul 1; 59(1):24-31. ］とGeneLook［Nishi T, Ikemura T, Kanaya S. "GeneLook: a novel ab initio gene identification system suitable for automated annotation of prokaryotic sequences." Gene. 2005 Feb 14: 346:115-125. Epub 2005 Jan 26.］を用いて遺伝子予測を行なった。
　SGD （www.yeastgenome.org） よりSaccharomyces cerevisiae S288Cの遺伝子構造データを取得し、GlimmerMのトレーニングに用いた。トレーニングの結果得られたHMMをスーパーコンティグ配列に適用した結果、10,560個の遺伝子が予測された。
　ab initio gene finderであるGeneLookによりORF（Open Reading Frame）スキャンを行ない、8,927個の遺伝子を得た。
　プライマリーアノテーションの実施
　GlimmerMにより予測された10,560個の遺伝子とGeneLookにより予測された8,927個の遺伝子について、gene name、descriptionを定義する目的でプライマリーアノテーションを実施した。具体的には、既知タンパク配列群に対してblastpによる相同性検索を行ない、ヒットしてきたHSPを一定の基準で評価することによりアノテーションを行なった。
　検索対象としたデータベースは、SGDの全ORF配列（6,717件）、Candida albicansデータベースであるCGD（http://www.candidagenome.org/）の全ORF配列（6,107件）、SwissProt Release 55.6の全配列（788,247件）とした。
　アノテーション手順の手順は次の通りである。
（１）予測されたORF配列それぞれについて、evalue cutoff 1e-5でblast検索を実行。
（２）blast検索の結果、得られたヒットについて、下記a)－c）のいずれの基準を満たすかを判定する：
a) （HSP長 / クエリー配列長 ≧ 0.7） かつ （HSP長 / ヒットしてきた配列の全長 ≧ 0.7）　かつ （HSPのidentity ≧ 0.5）；
b) (HSP長 / クエリー配列長 ≧ 0.5) かつ （HSP長 / ヒットしてきた配列の全長 ≧ 0.5） かつ （HSPのidentity ≧ 0.3）；
c) いずれのヒットも上記a)、b）を満たさない。
なお、HSPはHigh-scoring Segment Pairの略であり、閾値を超える類似性が検出された部分配列のペアを示す。
（３）上記（２）の結果、条件a)を満たすヒットが存在する場合、最もスコアの高いヒットを用いて下記のようなdescriptionをアノテーションする：
“conserved protein similar to XXXX(=hit accession). ヒット配列のdescription …”、または
“conserved hypothetical protein similar to XXXX(=hit accession). ヒット配列のdescription …”（ヒット配列のdescriptionに、putative, hypothetical, probable, unknown, unnamed, predictedなどの記述がある場合）；
・条件b)を満たすヒットが存在する場合、最もスコアの高いヒットを用いて下記のようなdescriptionをアノテーションする：
“conserved protein weakly similar to XXXX(=hit accession). ヒット配列のdescription …”、または
“conserved hypothetical protein weakly similar to XXXX(=hit accession). ヒット配列のdescription …”（ヒット配列のdescriptionに、putative, hypothetical, probable, unknown, unnamed, predictedなどの記述がある場合）；
・条件c)を満たす場合、下記のdescriptionをアノテーションする：
“hypothetical protein”；
・条件a)－c)いずれも満たさない場合、すなわちヒットが０の場合、下記のdescriptionをアノテーションする：
“predicted protein”；
４) 条件a)またはb)によりアノテーションを行なう際に、ヒットの配列に遺伝子名が定義されている場合は、遺伝子名も同時にアノテーションする。なお、アノテーションに適用するヒットが複数のDBに存在した場合、SGD＞CGD＞SwissProtの順に、優先度の高いものを用いてアノテーションを行なった。
　GlimmerMとGeneLookにより遺伝子予測を行ない、それぞれ10,560個、8,927個のORFが得られた。そこでさらに、長さ60未満でアノテーションの付かない（= predicted）ORFを除外すると、GlimmerMで得られるORFの数は6,820個になり、GeneLookで得られるORFの数は、8,397個となった。さらに、アノテーションが付かず、塩基配列に連続10個以上のN（ギャップをフィル・インするために用いた）を含むpredicted proteinまたはhypothetical proteinを中心に除外したところ、GlimmerMで得られるORFの数は6,800個になり、GeneLookで得られるORFの数は、8,261個となった。このうち、4,536個の遺伝子が開始位置、終了位置、向きについて両手法で同一の結果が得られていた。この共通遺伝子とは別に、オーバーラップした領域を持つが異なる遺伝子構造が予測されたGlimmerMの1,666個とGeneLookの1,968個については、アノテーション確度（qcr * hcr * identity）を調べ（qcr = hit length / query protein length。hcr = hit length / hit protein length。IdentityではSGD、CGD、SwissProtを利用した）、この数値が高い、つまり、より遺伝子として確からしいGlimmerMの967個、GeneLookの788個を遺伝子として予測した。それらとは別に両手法で独立して予測されたものは、GlimmerMで598個、GeneLookで1,757個であり、これらを遺伝子として予測した。この結果、8,646 (= 598 + 967 + 4,536 + 788 + 1,757) 個の遺伝子が予測された。これとは別に、tRNAとして191、rRNAとして27も予測された。
例４：分泌シグナルペプチドをコードする遺伝子領域の抽出
　Ｃａｎｄｉｄａ　ｕｔｉｌｉｓ由来の分泌シグナルペプチドを含有するタンパク質をコードする遺伝子を同定することで、本発明に係る分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡを同定できる。まず、前項までに予測されたＣａｎｄｉｄａ　ｕｔｉｌｉｓの遺伝子の塩基配列でコードされる各アミノ酸配列から、膜貫通部位予測プログラム及び分泌シグナルペプチド予測プログラムであるＰｒｅｄｉＳｉ（PREDiction of Signal peptides）（http://www.predisi.de/）を用いて分泌シグナルペプチドの予測を行った。なお、真核生物用にトレーニングされたデータセットを用いて、シグナルペプチドと切断部位を推定した。さらに、本解析によって得られた結果に基づき、複数のこれら予測プログラムによって分泌シグナルペプチドを予測できた遺伝子から、分泌シグナルペプチドをコードする遺伝子領域の抽出を行った。その分泌シグナルのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列、ならびに例３のアノテーションの結果を、表１に示す。
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例５：ＣｕＵＲＡ３遺伝子座への1コピー組込み型プラスミドの構築
　キャンディダ・ユティリスのゲノムＤＮＡを鋳型にして、ＩＭ－３７１（配列番号５１３）とＩＭ－３７２（配列番号５１４）のプライマーセットでＰＣＲ（伸長反応４５秒）を行うことにより、ＣｕＵＲＡ３遺伝子の上流側配列を増幅した。また、キャンディダ・ユティリスのゲノムＤＮＡを鋳型にして、ＩＭ－３７３（配列番号５１５）とＩＭ－３７４（配列番号５１６）のプライマーセットでＰＣＲ（伸長反応４５秒）を行うことにより、ＣｕＵＲＡ３遺伝子の下流側配列を増幅した。得られた２種類のＤＮＡ断片を混合し、ＩＭ－３７１とＩＭ－３７４のプライマーセットでＰＣＲを行った（伸長反応１分３０秒）。得られたＤＮＡ断片をＢｓｓＨＩＩで消化し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）のＢｓｓＨＩＩ部位に挿入し、得られたプラスミドをｐＣＵ６８５（別名：ｐＵＲＡｉｎ）と名づけた。ＣｕＵＲＡ３の上流側と下流側の配列の連結部位にはＮｏｔＩ認識配列、ＸｂａＩ認識配列、ＢａｍＨＩ認識配列、ＣｌａＩ認識配列が存在する。また、ＢｓｓＨＩＩの挿入ＤＮＡ断片側には、それぞれＢｇｌＩＩ認識配列が存在する。なお、ＰＣＲは全てＫＯＤ　ｐｌｕｓで行った。
　次いで、次の３種類のＰＣＲを行った。（１）ｐＣＵ６２１を鋳型、ＩＭ－３４９（配列番号５１７）とＩＭ－３５０（配列番号５１８）をプライマーとしてＰＣＲを行った（伸長反応２．５分）。なお、プラスミドｐＣＵ６２１（別名ｐＮＮＬＨＬ）は、順にｌｏｘＰ、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、ＨＰＴ遺伝子、ＧＡＰ遺伝子ターミネーター、ｌｏｘＰからなるＤＮＡ断片が、ｐＣＲ２．１ベクター［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：ＴＡクローニングキット（ｐＣＲ２．１ｖｅｃｔｏｒ）］にクローン化されている。（２）ｐＰＧＫＰＴ２（特開２００３－１４４１８５号公報）を鋳型、ＩＭ－３４７（配列番号５１９）とＩＭ－３４８（配列番号５２０）をプライマーとしてＰＣＲを行い（伸長反応３０秒）、ＰＧＫ遺伝子のターミネーター領域を、ＢｇｌＩＩ認識配列がなくなるように一塩基変異を入れて増幅した。（３）鋳型として（１）および（２）で増幅したＤＮＡ断片、プライマーとしてＩＭ－３４７とＩＭ－３５０を用いてＰＣＲを行った（伸長反応３分）。こうして増幅したＤＮＡ断片をＢａｍＨＩとＣｌａＩで消化した。この結果得られたＰＧＫ遺伝子ターミネーター、ｌｏｘＰ、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、ＨＰＴ遺伝子、ＧＡＰ遺伝子ターミネーター、ｌｏｘＰからなる約３ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ＢａｍＨＩとＣｌａＩで消化したｐＣＵ６８５（別名：ｐＵＲＡｉｎ）に連結させて、新たなプラスミドｐＣＵ６８７（別名：ｐＵＲＡＰＧｔＨ）を構築した。
　ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、ｐＣＵ６８７（別名：ｐＵＲＡＰＧｔＨ）が有するＰＧＫ遺伝子プロモーターとＨＰＴ遺伝子の連結部位にあるＸｂａＩ認識配列を破壊したプラスミドｐＣＵ６９９（別名：ｐＵＲＡＰＧｔｘＨ）を構築した。鋳型にはプラスミドｐＣＵ６８７（別名：ｐＵＲＡＰＧｔＨ）、プライマーにはＩＭ－４２５（配列番号５２１）とＩＭ－４２６（配列番号５２２）を用いた。その他の実験条件は添付のプロトコールに従った。
　キャンディダ・ユティリスのオロチジン５’リン酸デカルボキシラーゼをコードするＣｕＵＲＡ３遺伝子座に複数の遺伝子発現カセットを導入するための発現ベクターを構築した。ＣｕＵＲＡ３遺伝子上流配列断片は、ＴＭＰ－１（配列番号５２３）およびＴＭＰ－２（配列番号５２４）の組み合わせをプライマーとして用い、ｐＣＵ６９９を鋳型としたＰＣＲを行うことによって得た。また、キャンディダ・ユティリスのグリセルアルデヒド３リン酸デデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＧＡＰ）プロモーターは、ＴＭＰ－３（配列番号５２５）およびＴＭＰ－４（配列番号５２６）の組み合わせをプライマーとして用い、キャンディダ・ユティリスの染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行なうことによって得た。得られたそれぞれのＤＮＡ増幅産物は電気泳動を行った後、アガロースゲルから抽出を行った。回収したそれぞれＤＮＡ断片は３’末端および５’末端が互いに対合するように設計されているため、混合してＴＭＰ－１およびＴＭＰ－４の組合せをプライマーとしてＰＣＲを行なうことによってＣｕＵＲＡ３遺伝子上流配列とＧＡＰ遺伝子プロモーターが融合したＤＮＡ断片を得ることができる。得られたＣｕＵＲＡ３遺伝子上流配列／ＧＡＰ遺伝子プロモーター融合断片は５’末端にＮｏｔＩサイト、ＢｇｌＩＩサイトをこの順で持ち、さらに３’末端にはＸｂａＩサイトを持つ。またＣｕＵＲＡ３遺伝子上流配列とＧＡＰ遺伝子プロモーターの間にはＮｈｅＩサイトを有している。このＤＮＡ断片をＮｏｔＩ、ＸｂａＩ処理を行い、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ＋（ストラタジーン社製）の同制限酵素サイトに導入してｐＶＴ８６を構築した（図１）。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ＋は予めＮｏｔＩ、ＸｂａＩ処理を行い、フェノール・クロロホルム沈殿を行った後、脱リン酸化を行った。
　キャンディダ・ユティリスのホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子（ＣｕＰＧＫ）ターミネーターはＴＭＰ－５（配列番号５２７）およびＴＭＰ－６（配列番号５２８）の組み合わせをプライマーとして用いて、ＣｕＵＲＡ３遺伝子下流配列断片はＴＭＰ－７（配列番号５２９）およびＴＭＰ－８（配列番号５３０）の組み合わせをプライマーとして用いて、キャンディダ・ユティリスのｐＣＵ６９９を鋳型としてＰＣＲを行なうことによってそれぞれの遺伝子断片を得た。また、キャンディダ・ユティリスで作用するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＨＰＴ；ハイグロマイシン耐性遺伝子）発現カセットは、ＴＭＰ－９（配列番号５３１）およびＴＭＰ－１０（配列番号５３２）の組み合わせのプライマーを用いてｐＣＵ６９９を鋳型としてＰＣＲを行なうことによって得た。得られたそれぞれのＤＮＡ増幅産物は電気泳動を行った後、アガロースゲルから抽出を行った。回収した産物は混合し、ＴＭＰ－５およびＴＭＰ－８の組合せをプライマーとしてＰＣＲを行なうことによってＣｕＰＧＫ遺伝子ターミネーター、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ＣｕＵＲＡ３遺伝子下流配列が融合したＤＮＡ断片を得た。得られたＣｕＰＧＫ遺伝子ターミネーター／ハイグロマイシン耐性遺伝子／ＣｕＵＲＡ３遺伝子下流配列融合断片は５’末端にＢａｍＨＩサイト、３’末端にはＸｈｏＩサイトを持ち、ＣｕＰＧＫ遺伝子ターミネーターとハイグロマイシン耐性遺伝子間にＳｐｅＩサイトを有している。このＤＮＡ断片をＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ処理を行い、ｐＶＴ８６の同制限酵素サイトに導入してｐＶＴ９２を構築した（図１）。ｐＶＴ８６は予めＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ処理を行い、フェノール・クロロホルム沈殿を行った後、脱リン酸化を行った。
　ｐＶＴ９２をＮｏｔＩあるいはＢｇｌＩＩ、およびＢｇｌＩＩ、ＡｐａＩ、ＸｈｏＩ、あるいはＫｐｎＩで切断すると、ＣｕＵＲＡ３遺伝子上流側配列、ＰＧＫ遺伝子ターミネーター、ｌｏｘＰ、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、ＨＰＴ遺伝子、ＧＡＰ遺伝子ターミネーター、ｌｏｘＰからなるＤＮＡ断片が生じる。ｐＶＴ９２を用いてキャンディダ・ユティリスの形質転換を行うと、ＣｕＵＲＡ３遺伝子座で二重鎖組換えが生じることにより、染色体内に当該ＤＮＡ断片が組込まれ、例えば野生株では生育できない６００～８００μｇ／ｍｌの濃度でＨｙｇＢを含む培地で生育可能となる。
　次いで、ｐＶＴ９２をＮｈｅＩ、ＳｐｅＩで処理し、得られた３つのＤＮＡ断片の精製を行った。７ｋｂｐのベクター断片は精製後、脱リン酸化を行った。また、１ｋｂｐのＣｕＧＡＰ遺伝子プロモーター、０．５ｋｂｐのＰＧＫ遺伝子ターミネーターを上記ベクターに順々にライゲーションしていき、遺伝子の向きがＣｕＵＲＡ３遺伝子上流、ＣｕＰＧＫ遺伝子ターミネーター、ＣｕＧＡＰ遺伝子プロモーター、ｌｏｘＰ、ＣｕＰＧＫ遺伝子プロモーター、ＨＰＴ遺伝子、ＣｕＧＡＰ遺伝子ターミネーター、ｌｏｘＰ、ＣｕＵＲＡ３遺伝子下流となったものを選抜した。これをｐＶＴ２２９と名づけた。
　ｐＶＴ２２９はＢｇｌＩＩで切断すると、ＣｕＵＲＡ３遺伝子上流側配列、ＰＧＫ遺伝子ターミネーター、ＣｕＧＡＰ遺伝子プロモーター、ｌｏｘＰ、ＣｕＰＧＫ遺伝子プロモーター、ＨＰＴ遺伝子、ＧＡＰ遺伝子ターミネーター、ｌｏｘＰからなるＤＮＡ断片が生じる。これを用いてＣａｎｄｉｄａ　ｕｔｉｌｉｓの形質転換を行うと、ＣｕＵＲＡ３遺伝子座で二重鎖組換えが生じることにより、染色体内に当該ＤＮＡ断片が組込まれ、例えば野生株では生育できない６００～８００μｇ／ｍｌの濃度でＨｙｇＢを含む培地で生育可能となる。また、ｐＶＴ２２９はＸｂａＩ、ＢａｍＨＩで処理することでＣｕＰＧＫ遺伝子ターミネーターとＣｕＧＡＰ遺伝子プロモーターの間に目的遺伝子を導入することができるため、外来遺伝子をＣｕＵＲＡ３遺伝子座で発現させることができる。pＶＴ９２はＣｕＵＲＡ３座だけでなく、ＣｕＧＡＰ座にも組み込まれる可能性があるが、ｐＶＴ２２９は遺伝子の発現カセットが逆向きになっているためＣｕＵＲＡ３でしか組み換えが起こらない。
例６：シグナルペプチド評価用レポーター遺伝子（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ　ＲＩＢ４０株由来のｂｅｔａ－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ、ＸＰ＿００１８２０１０１）のクローニング
　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ　ＲＩＢ４０株由来ｂｅｔａ－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ、（ＸＰ＿００１８２０１０１）遺伝子断片は、プライマーとして、ＨＡ４０Ｆ（配列番号５３３）およびＣＡ４０Ｒ（配列番号５３４）の組み合わせ、ならびにＣＡ４０Ｆ（配列番号５３５）およびＢＡ４０Ｒ（配列番号５３６）の組み合わせをそれぞれ用い、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ　ＲＩＢ４０株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行なうことで得た。得られたそれぞれのＤＮＡ増幅産物は電気泳動を行った後、アガロースゲルから抽出を行った。回収した産物は混合し、ＨＡ４０ＦおよびＢＡ４０Ｒの組合せをプライマーとしてＰＣＲを行なうことによって、イントロンを欠失したｂｅｔａ－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ遺伝子全長を得た。得られたＤＮＡ断片をインビトロジェン社製Ｚｅｒｏ　Ｂｌｕｎｔ　ＴＯＰＯ　ＰＣＲ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔを用いてクローニングしてｐＶＴ１９２を得た。
例７：Ｃａｎｄｉｄａ　ｕｔｉｌｉｓゲノムに存在するシグナルペプチドを付与したレポーター遺伝子を発現する株の構築
　Ｃａｎｄｉｄａ　ｕｔｉｌｉｓゲノムに存在するシグナルペプチドを評価するために、各シグナルペプチドとレポーター遺伝子を融合したＤＮＡ断片を調製した。融合ＤＮＡ断片はｏｖｅｒｌａｐ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　ＰＣＲを用いることで調製した。すなわち各シグナルペプチドＤＮＡ断片と推定シグナルペプチドを欠損したレポーター遺伝子ＤＮＡ断片を混合し、再度ＰＣＲを行った。この融合ＤＮＡ断片をｐＶＴ２２９に導入して発現ベクターを構築した。
　まず、例５で作製したＣｕＵＲＡ３組込み型発現ベクターｐＶＴ２２９に上述の分泌シグナルペプチドをコードする遺伝子領域を導入するため、各遺伝子領域をＣａｎｄｉｄａ　ｕｔｉｌｉｓのゲノムＤＮＡからＰＣＲ法によって増幅した。ＰＣＲに用いられた各Ｆｏｒｗａｒｄプライマーの５’末端にはＸｂａＩサイトを付与してある。また、Ｒｅｖｅｒｓｅプライマーの５’末端は推定成熟型レポーター遺伝子の５’末端の塩基配列を付与してある。推定シグナル配列を欠損したレポーター遺伝子ＤＮＡ断片は、プライマーとしてＮｏＳＰＡｏＢＧＦｗ（配列番号５３７）およびＢａｍＡＡｏＢＧ＿Ｒｖ２（配列番号５３８）の組み合わせを用い、ｐＶＴ１９２を鋳型としてＰＣＲを行なうことで得た。各１ｓｔ　ＰＣＲ産物を精製後、これら２種のＤＮＡ断片を混同して２ｎｄ　ＰＣＲを行い、シグナルペプチド評価用のＤＮＡ断片を得た。各２ｎｄ　ＰＣＲ産物を精製後、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで処理し、キットによる精製を行った後、同制限酵素で処理したｐＶＴ２２９にライゲーションして各シグナルペプチドを付与したレポーター遺伝子を発現するベクターを作製した。得られたベクターをＢｇｌＩＩで消化し、エタノール沈殿により濃縮した。このDNA断片によりＣａｎｄｉｄａ　ｕｔｉｌｉｓを形質転換し、６００μｇ／ｍＬハイグロマイシンを含むＹＰＤ培地に塗沫し３０℃で２日間培養した。
例８：各シグナルペプチドを付与したレポーター遺伝子を導入したＣａｎｄｉｄａ　ｕｔｉｌｉｓ形質転換株のレポーターアッセイ
　以下に示すとおり、得られたＣａｎｄｉｄａ　ｕｔｉｌｉｓ形質転換体の培養を行い、培養液のｂｅｔａ－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ活性を測定した。
　９６穴深底プレートに入れた０．５ｍｌのＹＰＤ培地（２％ペプトン、１％、酵母エキス、２％グルコース）に各菌株を接種し、３０℃で２４時間前培養を行った。前培養液１０μｌを前培と同じ培地に接種し、同じ条件で本培養を行った。
　得られた形質転換体培養液を１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で適宜希釈し、ｂｅｔａ－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ活性を測定した。１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）、５ｍＭパラニトロフェニルグルコピラノシド、５％（ｖ／ｖ）粗酵素液の反応系で５０℃、１０分間反応を行った。反応液後、１Ｍ炭酸ナトリウムを反応液の２倍量添加して反応を停止させ、４１０ｎｍの波長で吸光度を測定した。なお、数値は４ロットの平均値として表示した。
　各種シグナルペプチド評価のレポーターアッセイの結果を表２に示す。表２の結果によれば、レポーター遺伝子本来のシグナルペプチド（シグナルペプチド番号０）よりも分泌効率が向上した配列（nativeシグナルペプチドに対する分泌効率の倍数が１以上のもの）は１７４個であり、そのうち分泌効率が３倍以上だったものは１２個、最大で5.6倍だった。
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　シグナルペプチドの長さと相対活性をプロットした結果を図２に示す。図２によればシグナルペプチドの長さが長いほど相対活性が減少する傾向にあり、シグナルペプチドを構成するアミノ酸残基数が17個、もしくは18個のときに最も高い活性を示すことが明らかとなった。これより、人工的にシグナルペプチドを合成するときは17個および18個のアミノ酸残基数が最も好ましいシグナルペプチドの長さであることが示唆された。
例９：モチーフ解析
　シグナルペプチドの残基数が３０個以下の計３５３個のシグナルペプチドについて、分泌効率の倍数（nativeシグナルペプチドに対する分泌効率の倍数）が２倍以上、１倍以上、１倍未満、０．５倍未満の４つのグループに分けてモチーフ解析を行った。アライメントにはＭＡＦＦＴ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ ｏｒ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）を用いた。アライメントされた部位のアミノ酸の出現頻度の可視化には、ＷｅｂＬｏｇｏを用いた。結果を図３に示した。図３において、（Ａ）は分泌効率２倍以上のグループ、（Ｂ）は分泌効率１倍以上のグループ、（Ｃ）は分泌効率１倍未満のグループ、（Ｄ）は分泌効率０．５倍未満のグループの解析結果を示している。図３によりモチーフを比較したところ、分泌効率の高いシグナルペプチドが「Ｎ末のＭの次に塩基性アミノ酸（Ｋ, Ｒ）」および「(Ａ or Ｖ)-Ｘ(任意のアミノ酸)-Ａ-切断部位(Ｃ末側)」の構造を有するという傾向が見られた。

Claims (7)

  1. 　キャンディダ・ユティリス（Candida utilis）のゲノムに由来する、真核細胞宿主内で分泌シグナルとして機能しうるペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる、分泌シグナル遺伝子。
  2. 　キャンディダ・ユティリス（Candida utilis）内で分泌シグナルとして機能しうるペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる、請求項１に記載の分泌シグナル遺伝子。
  3. 　以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）：
    （ａ）配列番号１１１、２～５、１５、２４、２９、３１、３２、３５、３６、４１、４６、４９～５１、５５～５７、６０、６３、６４、７８、８７、９１、９８、１０７、１１８、１２０、１２１、１２６、１３０、１３１、１３３、１３６、１４０、１４２、１４４、１４５、１４７～１４９、１５２、１５４、１５６、１６８、１７２、１７３、１７８、１７９、１８５、１８９、１９０、１９７、１９８、２０２、２１５、２１８、２２４、２２５および２３２～２３４からなる群から選択されるアミノ酸配列；
    （ｂ）配列番号５４０～５４４、５４６、５４７、５５０、５５４、５５６～５５８、５６１、５６２、５６６～５６９、５７１、５７６、５７９、５８２、５８５～５９２、５９５、５９７、５９８、６０２、６０６、６１０、６１１、６１４、６１８、６１９、６２１、６２２、６２５、６２６、６２８、６２９、６３２、６３４、６３６～６３９、６４２～６４８、６５１、６５２、６５７～６５９、６６１、６６３、６６４、６６９、６７０、６７２、６７７、６７８、６８１、６８４、６８６、６９０、６９１、６９４、６９６、６９７、７００～７０４、７１０、７１１、７１３～７１５、７１７、７１８、７２１～７２４、７２９、７３１～７３４、７３７、７３８、７４２、７４５、７４７、７５０、７５２および７５９からなる群から選択されるアミノ酸配列；
    （ｃ）上記（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列であり、かつ、分泌シグナル活性を有するアミノ酸配列
    をコードするヌクレオチド配列からなる、請求項１または２に記載の分泌シグナル遺伝子。
  4. 　真核細胞宿主内でタンパク質を発現させるための発現用ベクターであって、請求項１～３のいずれか一項に記載の分泌シグナル遺伝子、および該分泌シグナル遺伝子の下流側に直接的に前記タンパク質の遺伝子を連結させるための遺伝子導入部位を含んでなる、発現用ベクター。
  5. 　真核細胞宿主内でタンパク質を発現する発現ベクターであって、請求項１～３のいずれか一項に記載の分泌シグナル遺伝子、および該分泌シグナル遺伝子の下流側に直接的に連結された前記タンパク質の遺伝子を含んでなる、発現ベクター。
  6. 　請求項１～３のいずれか一項に記載の分泌シグナル遺伝子と、該分泌シグナル遺伝子の下流側に直接的に連結されたタンパク質の遺伝子とからなるコード配列、または請求項５に記載の発現ベクターを含んでなる真核細胞宿主からなる、形質転換体。
  7. 　タンパク質を製造する方法であって、
    （ａ）請求項６に記載の形質転換体を培養し、これにより培地中にタンパク質を蓄積させる工程、および
    （ｂ）培地からタンパク質を回収する工程
    を含んでなる、方法。
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