WO2022092056A1 - 改変シグナルペプチド - Google Patents

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WO2022092056A1
WO2022092056A1 PCT/JP2021/039410 JP2021039410W WO2022092056A1 WO 2022092056 A1 WO2022092056 A1 WO 2022092056A1 JP 2021039410 W JP2021039410 W JP 2021039410W WO 2022092056 A1 WO2022092056 A1 WO 2022092056A1
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WO
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signal peptide
amino acid
nucleic acid
terminal
modified signal
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PCT/JP2021/039410
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English (en)
French (fr)
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大貴 西口
彰人 川原
Original Assignee
花王株式会社
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Publication date
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®

Definitions

  • the present invention relates to a modified signal peptide.
  • Bacillus spp. Such as Bacillus subtilis, have a function of secreting and producing proteins such as protease, and are therefore suitable as a host for microbiological production of the target substance.
  • the secretory protein in Bacillus spp. Is expressed as a preproprotein having a signal peptide, and is secreted extracellularly by the action of the signal peptide.
  • the preproprotein is secreted extracellularly after cleavage of the signal peptide by a signal peptidase, and finally becomes a mature protein.
  • a technique is used in which a signal peptide derived from Bacillus is ligated to a target protein and secreted and produced extracellularly.
  • the signal peptide of cellulase derived from the Bacillus sp. KSM-S237 strain is a signal peptide suitable for efficient secretory production of the target protein.
  • the signal peptide generally consists of a positively charged N-terminal region, a hydrophobic transmembrane domain (H region) forming an ⁇ -helix, and a C-terminal region having a sheet-like structure. Peptides in the C-terminal region are mainly cleaved by signal peptidase. It has been reported that modification of a signal peptide may affect protein productivity (for example, Non-Patent Document 1).
  • Typical low molecular weight antibodies include Fab, single chain antibody (scFv), diabody, heavy chain variable domain (variable domain of heavy chain of heavy chain antibody, VHH) and the like. ..
  • Escherichia coli has been mainly used for the microbiological production of antibodies.
  • Non-Patent Document 2 describes that scFv, Fab, and VHH could be produced by the Brevibacillus expression system.
  • Non-Patent Document 3 reports that VHH was produced using Aspergillus awamori.
  • Non-Patent Document 4 describes that a bacillus strain in which intracellular and extracellular molecular chaperons are co-expressed and cell wall-bound protease WprA is inactivated secreted and produced scFv derived from a fibrin-specific monoclonal antibody. ing.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-21801 (Non-Patent Document 1) Protein Sci, 2012, 21 (1): 13-25 (Non-Patent Document 2) Biotechnology, 2017, 95 (11): 649-651 (Non-Patent Document 3) Appl Microbiol Biotechnol, 2005, 66 (4): 384-392 (Non-Patent Document 3) Appl Environ Microbiol, 2002, p.3261-3269
  • the invention comprises a polynucleotide encoding a protein of interest and a polynucleotide encoding a modified signal peptide linked upstream of the polynucleotide.
  • the amino acid residue at the 1st to 6th positions from the C-terminal is X 1 X 2 X 3 X 4 X 5 X 6 , where X 1 is G, P or A and X 2 is. G, S or A, where X 3 is P, S or A, where X 1 X 2 X 3 is not GGP, X 4 is A, X 5 is S, H or F, and X 6 is A and is located at the C-terminus of the modified signal peptide.
  • a nucleic acid construct for expression and extracellular secretion of a protein of interest is provided.
  • the invention provides an expression vector comprising said nucleic acid construct.
  • the invention provides a recombinant Bacillus bacterium containing the nucleic acid construct.
  • the invention comprises culturing the recombinant Bacillus spp. To recover the target protein secreted extracellularly, To provide a method for producing a protein of interest, including.
  • the invention comprises a modified signal peptide of the invention and a polypeptide encoding an antibody-related molecule linked to its C-terminal side.
  • the amino acid residue at the 1st to 6th positions from the C-terminal is X 1 X 2 X 3 X 4 X 5 X 6 , where X 1 is G, P or A and X 2 is.
  • the amino acid sequence from the N-terminal to the C-terminal to the 7th amino acid sequence of the modified signal peptide comprises any of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 7 to 12, or an amino acid sequence that is at least 90% identical thereto.
  • a preproprotein which is an antibody-related molecule.
  • antibody-related molecule refers to a protein containing an immunoglobulin or a molecular species consisting of a single domain selected from domains constituting the immunoglobulin or a combination of two or more domains. Domains constituting the immunoglobulin include VH, CH1, CH2 and CH3, which are the domains of the immunoglobulin heavy chain, and VL and CL, which are the domains of the immunoglobulin light chain.
  • the antibody-related molecule may be a monomeric protein or a multimeric protein. When the antibody-related molecule is a multimeric protein, it may be a homomultimer consisting of a single type of subunit or a heteromultimer consisting of two or more types of subunits.
  • the antibody-related molecule is a molecule containing an antigen recognition domain of immunoglobulin and capable of specifically binding to a target such as a protein.
  • antibody-related molecules include immunoglobulins such as IgG, as well as Fab, F (ab') 2 , single chain antibody (scFv), diabody, and variable domain of heavy chain antibody.
  • immunoglobulins such as IgG, as well as Fab, F (ab') 2 , single chain antibody (scFv), diabody, and variable domain of heavy chain antibody.
  • scFv single chain antibody
  • VHH variable domain of heavy chain antibody
  • VHH means a heavy chain variable domain (variable domain of heavy chain of heavy chain antibody) of a heavy chain antibody. Heavy chain antibodies have been found in camelids, cartilaginous fish such as sharks, and the like. Cartilaginous fish such as sharks are also called VNAR (single variable new antigen receptor domain antibody).
  • VHH in the present specification is derived from, for example, a camelid or a shark, preferably from a camelid.
  • VHH is a molecule capable of recognizing an antigen in a single domain, and is the smallest unit of antibody molecules found so far.
  • the VHH produced in the present invention can contain one or more heavy chain variable domains derived from heavy chain antibodies, and the number of heavy chain variable domains contained in the VHH is not limited.
  • the heavy chain variable domain contained in VHH produced in the present invention may be a heavy chain variable domain derived from a natural heavy chain antibody or a variant thereof.
  • the VHH produced in the present invention is used for fragments other than the heavy chain variable domain derived from the immunoglobulin heavy chain (for example, a fragment of a constant region of a heavy chain antibody, a human-derived fragment, a linker sequence, etc.) and for stabilization. It may contain amino acid mutations and the like.
  • examples of the camelid include Bactrian camel, Dromedary camel, Llama, Alpaca, Vicuna, Guanaco and the like, and alpaca is preferable.
  • nucleotide and amino acid sequences are calculated by the Lipman-Pearson method (Science, 1985, 227: 1435-1441). Specifically, it is calculated by performing an analysis with Unit size to homology (ktup) set to 2 using a homology analysis (Search homology) program of the genetic information processing software Genetyx-Win.
  • amino acid sequence or nucleotide sequence means 90% or more, preferably 95% or more identity.
  • the term "1 or several" used with respect to the deletion, substitution, addition or insertion of an amino acid residue in an amino acid sequence is preferably 1-5, more preferably 1-. It can mean three, more preferably one or two. Also, unless otherwise defined herein, the term “1 or several" used for deletions, substitutions, additions or insertions of nucleotides in a nucleotide sequence is preferably 1 to 15, more preferably 1 to 9. Can mean, more preferably 1-6. As used herein, "addition" of an amino acid residue or nucleotide includes addition of the amino acid residue or nucleotide to one end and both ends of the sequence.
  • the "corresponding position" or “corresponding region” on an amino acid sequence or nucleotide sequence provides maximum homology between the target sequence and the reference sequence (eg, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1). It can be determined by aligning with. Alignment of amino acid sequences or nucleotide sequences can be performed using known algorithms, the procedure of which is known to those of skill in the art. For example, alignment can be performed by using the Clustal W multiple alignment program (Nucleic Acids Res, 1994, 22: 4673-4680) with default settings. Crystal W is, for example, the European Bioinformatics Institute (EBI [www.ebi.ac.uk/index.html]) and the DNA Data Bank of Japan (DDBJ [www.
  • the position of the target sequence aligned to any position in the reference sequence by the above alignment is considered to be the "corresponding position" to that arbitrary position. Further, the area sandwiched by the corresponding positions or the area consisting of the corresponding motifs is regarded as the corresponding area.
  • amino acid sequence identity or similarity is the ratio (%) of the number of positions where the same or similar amino acid residues are present in both sequences when two amino acid sequences are aligned to the total number of amino acid residues.
  • the similar amino acid residue means an amino acid residue that has properties similar to each other in terms of polarity and charge among the 20 kinds of amino acids constituting the protein and causes so-called conservative substitution.
  • Groups of such similar amino acid residues are well known to those of skill in the art, including, for example, arginine and lysine; glutamic acid and aspartic acid; serine and threonine; glutamine and asparagine; leucine and isoleucine, respectively. , Not limited to these.
  • amino acid residue refers to 20 kinds of amino acid residues constituting a protein, alanine (Ala or A), arginine (Arg or R), asparagine (Asn or N), aspartic acid (Asp or). D), cysteine (Cys or C), glutamine (Gln or Q), glutamine (Glu or E), glycine (Gly or G), histidine (His or H), isoleucine (Ile or I), leucine (Leu or L).
  • the term "expression cassette” refers to a nucleic acid construct for controlling the expression of a target gene contained therein.
  • the expression cassette of the present invention is a DNA construct.
  • the expression cassette contains a coding region of a gene of interest to be expressed and a control region for controlling its expression, for example, a promoter.
  • Much of the regulatory region is located upstream of the coding region of the gene of interest and is operably linked to it.
  • the promoter is located upstream of the region encoding the signal peptide and operably linked to the polynucleotide encoding the preproprotein.
  • the expression cassette may contain a 3'untranslated region or a 5'untranslated region of the target gene.
  • the expression cassette has, at its end, a restriction enzyme recognition site to allow insertion and / or excision of the expression cassette into the vector or genomic DNA.
  • the expression cassette can be used for constructing an expression vector or introducing a foreign gene into genomic DNA.
  • the "regulatory region” is a region having a function of controlling the expression of a gene (for example, a region encoding a protein or peptide) located downstream thereof. More specifically, a “regulatory region” can be defined as a region that resides upstream of the coding region of a gene and has the ability to interact with RNA polymerase to control transcription of that coding region.
  • the control region includes a transcription start control region and / or a translation start control region, or a region from the transcription start control region to the translation start control region.
  • the transcription initiation control region is a region containing a promoter and a transcription initiation site, and the translation initiation control region is a site corresponding to the Shine-Dalgarno (SD) sequence forming a ribosome binding site together with the start codon (Proc Natl Acad Sci USA, 1974, 71: 1342-1346).
  • SD Shine-Dalgarno
  • operable linkage between a control region and a polynucleotide of a gene (eg, a polynucleotide encoding a protein) means that the gene and the control region are controlled by the gene under the control of the control region. It means that they are linked so that they can be expressed. Procedures for "operable linkage" between genes and regulatory regions are well known to those of skill in the art.
  • upstream and downstream with respect to a gene or its nucleic acid sequence refer to upstream and downstream in the transcription direction of the gene.
  • gene located downstream of the promoter means that the gene is present on the 3'side of the promoter in the DNA sense strand, and upstream of the gene means 5'of the gene in the DNA sense strand. Means the area on the side.
  • the "signal peptide” has the function of secreting the target protein operably linked to it to the outside of the cell.
  • a target protein is first expressed as a preproprotein having a signal peptide, and is secreted extracellularly through the action of the signal peptide.
  • the preproprotein is secreted extracellularly after cleavage of the signal peptide by a signal peptidase, and finally becomes a mature protein.
  • the signal peptide generally consists of a positively charged N-terminal region, a hydrophobic transmembrane domain (H region) forming an ⁇ -helix, and a C-terminal region having a sheet-like structure (Protein Science, 2012, 12). 21: 13-25). Peptides in the C-terminal region are mainly cleaved by signal peptidase.
  • the "operable linkage" between the amino acid sequence of the target protein and the signal peptide is the signal peptide so that the amino acid sequence of the target protein can be secreted extracellularly under the control of the signal peptide. It means that it is connected to.
  • the procedure of "operable ligation" is well known to those skilled in the art, and usually, the amino acid sequence of the target protein is ligated to the C-terminal side of the signal peptide.
  • Other sequences eg, amino acid sequences that are not secreted extracellularly by processing
  • the term "original” used for a cell function, property, or trait is used to indicate that the function, property, or trait originally exists in the cell.
  • the term “foreign” is used to describe a function, property, or trait that is not originally present in the cell but is introduced from the outside.
  • a “foreign" gene or polynucleotide is a gene or polynucleotide introduced externally into a cell.
  • the foreign gene or polynucleotide may be of the same species as the cell into which it was introduced or of a heterologous organism (ie, a heterologous gene or polynucleotide).
  • a secreted protein has the correct N-terminus" is defined as at least 50%, 55%, 60%, 65% of proteins secreted extracellularly via a preproprotein containing a signal peptide. , 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, or 100% (all w / w%) are amino acid residues (eg, residual) that the protein does not originally have at the N-terminus. It means that it does not have a residue of the signal peptide).
  • Bacillus bacterium refers to a bacterium belonging to the genus Bacillus of the family Bacillaceae.
  • Bacillus spp. Examples include Bacillus subtilis (Bacillus subtilis), Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus megaterium, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus pumilus, Bacillus liqueniformis, and variants thereof.
  • Bacillus Paenibacillus and the genus Brevibacillus belonging to the family Paenibacillaceae are not included in the genus Bacillus in the present specification.
  • Bacillus subtilis gene described in this specification is published on the Internet at JAFAN: Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis (BSORF DB) ([bacillus.genome.ad.jp/], updated January 18, 2006). It is described based on the Bacillus subtilis genomic data.
  • the gene number of Bacillus subtilis described in the present specification represents the gene number registered in the BSORF DB.
  • the present invention relates to a modified signal peptide and secretory production of a target protein using the modified signal peptide.
  • the present invention provides a modified signal peptide.
  • the modified signal peptide provided by the present invention is useful for secretory production of the protein of interest.
  • the modified signal peptide efficiently secretes a target protein such as an antibody-related molecule extracellularly, enabling high-yield production.
  • the antibody-related molecule secreted using the modified signal peptide is highly valuable as a raw material for various medicines and reagents because almost no unnecessary residue such as a signal peptide residue remains at the N-terminal.
  • the modified signal peptide of the present invention can be produced by modifying the C-terminal region of the parent signal peptide.
  • the parent signal peptide include a signal peptide that functions in Bacillus spp.
  • preferred examples include a signal peptide derived from Bacillus spp.
  • Preferred examples of the signal peptide derived from Bacillus sp. are the signal peptide of Bacillus Bacillus YoaW, lipA, pelB, and YncM (SEQ ID NOs: 1 to 4), and the signal peptide of Cellulase derived from Bacillus sp.
  • KSM-S237 strain SEQ ID NO: 5
  • SEQ ID NO: 6 a signal peptide derived from the amylase of Bacillus amyloliquefaciens
  • Another preferred example of the parent signal peptide is a signal peptide having an amino acid sequence that is at least 90% identical to any of SEQ ID NOs: 1-6.
  • a signal peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or 5, or an amino acid sequence that is at least 90% identical to the amino acid sequence thereof is preferable as the parent signal peptide.
  • the three-dimensional structure prediction by CRNPRED [pdbj.org/crnpred]
  • a region existing at the C-terminal of the signal peptide that is presumed not to have an ⁇ -helix structure can be estimated as a C-terminal region.
  • the C-terminal region of the parent signal peptide is the 17th to 24th residues in SEQ ID NO: 1, the 27th to 32nd residues in SEQ ID NO: 2, the 19th to 24th residues in SEQ ID NO: 3, and the C-terminal region of SEQ ID NO: 4. It corresponds to the 35th to 42nd residues, the 24th to 29th residues in SEQ ID NO: 5, and the 25th to 31st residues in SEQ ID NO: 6.
  • the modified signal peptide of the present invention is composed of a sequence consisting of 6 amino acid residues including the modified amino acid residue in its C-terminal region. More specifically, in the modified signal peptide, the amino acid residue at the 1st to 6th positions from the C-terminal is X 1 X 2 X 3 X 4 X 5 X 6 , where X 6 is C of the modified signal peptide. It is a residue located at the terminal, and X 1 is the residue located at the 6th position from the C terminal.
  • X 1 to X 6 are: X 1 : preferably G, P or A; X 2 : preferably G, S or A, more preferably G; X 3 : preferably P, S or A, more preferably P or S; X 4 : preferably A; X 5 : preferably S, H or F, more preferably S or H; X 6 : Preferably A.
  • X 1 X 2 X 3 is not a GGP.
  • Preferred examples of the sequence of X 1 X 2 X 3 X 4 X 5 X 6 include the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 13 to 30, and more preferable example is any of SEQ ID NOs: 14 to 30. Amino acid sequences are mentioned, and more preferred examples are the amino acid sequences of any of SEQ ID NOs: 15, 25-28.
  • the region other than the C-terminal region of the modified signal peptide of the present invention may consist of the same amino acid sequence as the parent signal peptide.
  • the portion other than the C-terminal region of the modified signal peptide is deleted, substituted, added, or deleted with one or several amino acid residues to the amino acid sequence of the parent signal peptide. It may consist of an inserted amino acid sequence.
  • the modified signal peptide of the present invention has an amino acid sequence in which the N-terminal to the 7th region from the C-terminal to the 7th region other than the C-terminal region of the signal peptide of Bacillus spp. Consists of.
  • the modified signal peptide of the present invention comprises the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 7 to 12, or at least 90% identical to the amino acid sequence from the N-terminal to the C-terminal to the 7th region. More preferably, the modified signal peptide of the present invention comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 or 11 or at least 90% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 or 11 in the N-terminal to C-terminal to 7th regions.
  • the modified signal peptide of the present invention comprises a region consisting of the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 7 to 12, or an amino acid sequence at least 90% identical thereto, and X 1 adjacent to the C-terminal side thereof. It consists of an area consisting of X 2 X 3 X 4 X 5 X 6 .
  • the modified signal peptide of the invention comprises any of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 31-35.
  • the modified signal peptide of the present invention can be produced by modifying the C-terminal region of the parent signal peptide according to a genetic engineering technique known in the art. For example, individual amino acid residues in the C-terminal region of the parent signal peptide may be mutated (deleted, substituted, added or inserted) to construct X 1 X 2 X 3 X 4 X 5 X 6 . Alternatively, the C-terminal region of the parent signal peptide may be replaced with the amino acid sequence of X 1 X 2 X 3 X 4 X 5 X 6 .
  • the region from the N-terminal to the C-terminal of the parent signal peptide to the 7th region may be bound to X 1 X 2 X 3 X 4 X 5 X 6 .
  • the amino acid residues in the region from the N-terminal to the C-terminal to the 7th terminal of the parent signal peptide may be mutated.
  • the modified signal peptide can be obtained by preparing a polynucleotide encoding the modified signal peptide of the present invention and expressing it.
  • the polynucleotide encoding the modified signal peptide can be prepared, for example, by mutating the polynucleotide encoding the parent signal peptide (hereinafter referred to as the parent gene) so as to encode the modified signal peptide.
  • the nucleotide sequence encoding the modified signal peptide can be chemically synthesized.
  • genomic DNA is extracted by a conventional method from a strain producing a parent signal peptide (for example, Bacillus sp. KSM-S237 strain), or RNA is extracted and cDNA is synthesized by reverse transcription. Can be prepared by.
  • mutation-introducing techniques known in the art, such as ultraviolet irradiation, site-specific mutation introduction, SOE (splicing by overflow extension) -PCR (Gene, 1989, 77 (1): p61-68), homologous recombination method, etc. can be mentioned.
  • a commercially available site-directed mutagentage kit for example, a QuickChange II Site-Directed Mutagenesis Kit from Stratagene, a QuickChange Multi Site-Directed Mutagesis Kit, etc. can also be used.
  • polynucleotide encoding the modified signal peptide of the present invention examples include the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 36 to 41 or at least 90% identical nucleotide sequences thereof, and X 1 X 2 X 3 X 4 X linked downstream thereof. Included are polynucleotides consisting of a nucleotide sequence encoding 5 x 6 . Preferred examples include a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 36 to 41 or a nucleotide sequence at least 90% identical thereto, and a nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 42 to 59 linked downstream thereof.
  • More preferable examples include a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 39 or 40 or a nucleotide sequence at least 90% identical thereto, and a nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 42 to 59 linked downstream thereof. Further preferred examples include polynucleotides consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 60-64.
  • the modified signal peptide of the present invention can be used for extracellular secretion of the target protein.
  • the polynucleotide encoding the modified signal peptide and the polynucleotide encoding the target protein are operably linked to express the preproprotein of the target protein having the signal peptide.
  • the target protein is secreted extracellularly through the action of the modified signal peptide in the preproprotein.
  • the present invention provides a nucleic acid construct comprising a polynucleotide encoding a protein of interest and a polynucleotide encoding a modified signal peptide of the present invention linked upstream of the polynucleotide.
  • the nucleic acid construct of the present invention is a nucleic acid construct for the expression and extracellular secretion of the target protein in the host cell.
  • the nucleic acid construct of the invention is an expression cassette and comprises a control region for controlling the expression of the polynucleotide encoding the protein of interest and the polynucleotide encoding the modified signal peptide.
  • the polynucleotide encoding the protein of interest and the polynucleotide encoding the modified signal peptide are operably linked to the control region.
  • the expression cassette comprises a promoter linked upstream of the polynucleotide encoding the modified signal peptide.
  • control region examples include a control region that functions in Staphylococcus spp., For example, an ⁇ -amylase gene, a protease gene, an aprE gene or a spoVG gene control region derived from a Staphylococcus spp., And a Bacillus sp. KSM-S237 strain.
  • the control region of the cellulase gene Patent Document 3
  • the control region of the cellulase gene of the Bacillus sp. KSM-64 strain Japanese Patent Laid-Open No. 2011-10387
  • canamycin resistance gene derived from Staphylococcus aureus.
  • control region of the chloramphenicol resistance gene (see JP-A-2009-089708), and the like can be mentioned, but the present invention is not particularly limited.
  • a promoter derived from Bacillus spp. For example, a promoter of the cellulase gene of Bacillus sp. KSM-S237 strain (SEQ ID NO: 65), a promoter of the cellulase gene of Bacillus sp. KSM-64 strain (sequence). No. 66), the promoter of the Bacillus spoVG gene (SEQ ID NO: 67), and the like.
  • preferred control regions include promoters consisting of nucleotide sequences having at least 90% identity with any of SEQ ID NOs: 65-67.
  • the nucleic acid construct of the present invention may contain a polynucleotide encoding the target protein and the modified signal peptide, and a nucleic acid sequence other than the control region, for example, a sequence of a 3'untranslated region or a 5'untranslated region. ..
  • the nucleic acid construct can have restriction enzyme recognition sites at one end or both ends.
  • the restriction enzyme recognition site can be used to introduce the nucleic acid construct of the present invention into a vector.
  • the nucleic acid construct can be introduced into the vector by cleaving the vector with a restriction enzyme and adding the nucleic acid construct of the present invention having a restriction enzyme recognition site at the end thereof.
  • the type of target protein encoded by the nucleic acid construct of the present invention is not particularly limited.
  • the target protein may be a protein that can be originally expressed by the host cell, a heterologous protein, or an externally introduced allogeneic protein.
  • Examples of the target protein include enzymes involved in the synthesis of any protein or target substance, such as antibody-related molecules, cytokines, hormones, other physiologically active peptides, transporters, proteases and other industrial enzymes, and metabolism-related enzymes. And so on.
  • the target protein is preferably an antibody-related molecule, and more preferably a small molecule antibody such as Fab, ScFv, or VHH. More preferably, the target protein is selected from the group consisting of Fab, ScFv and VHH, and even more preferably VHH. Examples of Fabs, ScFvs and VHHs include, but are not limited to, those listed in Table 1 below.
  • the polynucleotide encoding the target protein contained in the nucleic acid construct of the present invention may be codon-optimized according to the species of the host into which the nucleic acid construct is incorporated. Information on codons used by various organisms can be obtained from Codon Usage Database ([www.kazusa.or.jp/codon/]).
  • the nucleic acid construct of the present invention can be introduced into a host cell and used for secretory production of a target protein.
  • the nucleic acid construct may be integrated directly into the genomic DNA of the host cell, or may be integrated into a vector and introduced into the host cell.
  • the type of the vector is not particularly limited, and may be any vector such as a plasmid, a phage, a phagemid, a cosmid, a virus, a YAC vector, and a shuttle vector.
  • the vector may be a vector introduced into the genomic DNA of a host cell or a vector retained outside the genomic DNA. Vectors that can replicate in host cells are preferred.
  • the vector into which the nucleic acid construct is to be incorporated can be an expression vector, whereas if the nucleic acid construct to be incorporated is an expression cassette, it does not have to be an expression vector.
  • the nucleic acid construct of the present invention is an expression cassette containing a control region and is incorporated into an arbitrary vector to construct an expression vector. In another embodiment, by incorporating the nucleic acid construct of the present invention into an expression vector containing a control region, an expression cassette of the present invention is constructed on the expression vector.
  • Examples of preferred vectors are, but are not limited to, pHA3040SP64, pHSP64R or pASP64 (Patent No. 34929935), pHY300PLK (expression vector capable of transforming both Escherichia coli and Bacillus subtilis; Jpn J Genet, 1985, 60: 235-. 243), shuttle vectors such as pAC3 (E. coli Acids Res, 1988, 16:8732); pUB110 (J Bacteria, 1978, 134: 318-329), pTA10607 (Plasmid, 1987, 18: 8-15); pHY-S237. (Japanese Patent Laid-Open No.
  • plasmids that can be used for transformation of a bacterium belonging to the genus Bacillus, and the like can be mentioned.
  • plasmids derived from Escherichia coli for example, pET22b (+), pBR322, pBR325, pUC57, pUC118, pUC119, pUC18, pUC19, pBluescript, etc. can also be used.
  • the type of host cell is not limited as long as the signal peptide of the present invention functions to secrete the target protein in the cell.
  • Preferred hosts include Bacillus spp., More preferably Bacillus or a mutant strain thereof.
  • Preferred examples of the Bacillus subtilis mutant used as a host include extracellular protease-deficient Bacillus subtilis strain Dpr9 (see Patent No. 4485341).
  • the Bacillus subtilis mutant used as a host has been subjected to deletion of sigma factor such as sigF (see Patent No. 4336082), deletion of recA involved in homologous recombination activity (see Patent No. 6088282), and the like. May be.
  • a Bacillus subtilis mutant strain in which one or both deletions of sigF and recA are added to the Dpr9 strain can also be used.
  • the nucleic acid construct of the present invention or a vector containing it can be introduced into a host cell according to a conventional method.
  • known transformation techniques such as competent cell method, electroporation method, protoplast method, packet gun method, and PEG method can be applied to the introduction of the nucleic acid construct or the vector into a host cell.
  • the obtained recombinant cell containing the nucleic acid construct of the present invention can be used for secretory production of the target protein.
  • the target protein can be produced by culturing recombinant cells containing the nucleic acid construct of the present invention.
  • the recombinant cells may be cultured according to a general culture method for the host cells.
  • a medium for culturing Bacillus bacterium contains a carbon source and a nitrogen source necessary for the growth of the bacterium. If necessary, the medium may contain other nutrients such as inorganic salts, vitamins, antibiotics and the like.
  • the culture conditions for example, temperature, aeration and stirring conditions, medium pH, culture time, and the like can be appropriately selected depending on the bacterial species, trait, culture scale, and the like.
  • the target protein, preproprotein By culturing the recombinant cells, the target protein, preproprotein, is expressed intracellularly.
  • the preproprotein includes the modified signal peptide of the present invention and a polypeptide encoding the target protein linked to the C-terminal side thereof.
  • the modified signal peptide of the present invention is operably linked to the target protein, and the target protein is secreted extracellularly through the action of the modified signal peptide. Therefore, in the production of the target protein according to the present invention, it is not necessary to destroy the cells, and the target protein secreted extracellularly may be recovered.
  • the recovered target protein can be further obtained by using general methods used for protein purification, for example, centrifugation, ammonium sulfate precipitation, gel chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography and the like alone or in combination as appropriate. Can be purified.
  • the target protein secreted extracellularly using the modified signal peptide of the present invention has a correct N-terminal, that is, there is almost no residual unnecessary residue such as a signal peptide residue at the N-terminal. Therefore, the target protein produced by the present invention has little change in structure and properties due to the unnecessary residue, and can well retain the functions expected of the target protein. This is very advantageous for proteins where slight structural differences affect activity, such as antibody-related molecules. For example, the antibody-related molecule produced by the present invention has no variation in activity and is highly valuable as a raw material for various medicines and reagents.
  • the present invention also includes the following substances, manufacturing methods, uses, methods, etc. as exemplary embodiments. However, the present invention is not limited to these embodiments.
  • the amino acid residue at the 1st to 6th positions from the C-terminal is X 1 X 2 X 3 X 4 X 5 X 6 , where X 1 is G, P or A and X 2 is.
  • X 4 is A
  • X 5 is S, H or F
  • X 6 is A and is located at the C-terminus of the modified signal peptide.
  • Nucleic acid construct for expression of protein of interest and extracellular secretion [2] Preferably, X 1 is G, P or A, X 2 is G, X 3 is P or S, X 4 is A, X 5 is S or H, and X. 6 is A, More preferably, X 1 X 2 X 3 X 4 X 5 X 6 consists of any of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 13-30. More preferably, X 1 X 2 X 3 X 4 X 5 X 6 consists of any of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 15, 25-28. [1] The nucleic acid construct according to the above.
  • the region from the N-terminal to the C-terminal to the 7th region of the modified signal peptide is Preferably, it comprises an amino acid sequence of a region other than the C-terminal region of the signal peptide of Bacillus spp., Or an amino acid sequence that is at least 90% identical thereto. More preferably, it comprises any of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 7-12, or at least 90% identical amino acid sequences thereof. More preferably, it consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 or 11, or an amino acid sequence that is at least 90% identical thereto.
  • the nucleic acid construct according to [1], wherein the modified signal peptide preferably comprises the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 31 to 35.
  • the antibody-related molecule is It is preferably selected from the group consisting of Fab, ScFv and VHH. More preferably VHH,
  • the promoter Preferably, it is a promoter derived from Bacillus spp. More preferably, it consists of any of SEQ ID NOs: 65-67, or a nucleotide sequence having at least 90% identity with it.
  • a method for producing a protein of interest including. [13] The method according to [12], wherein the target protein is preferably an antibody-related molecule. [14] The antibody-related molecule is It is preferably selected from the group consisting of Fab, ScFv and VHH. More preferably VHH, [13] The method according to the description.
  • the 1st to 6th amino acid residues from the C-terminal are X 1 X 2 X 3 X 4 X 5 X 6 where X 1 is G, P or A and X 2 is G, S. Or A, where X 3 is P, S or A, where X 1 X 2 X 3 is not GGP, X 4 is A, X 5 is S, H or F, and X 6 is.
  • a modified signal peptide that is A and is located at the C-terminus of the modified signal peptide.
  • X 1 is G, P or A
  • X 2 is G
  • X 3 is P or S
  • X 4 is A
  • X 5 is S or H
  • X is X 1st to 6th amino acid residues from the C-terminal
  • X 1 X 2 X 3 X 4 X 5 X 6 consists of any of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 13-30. More preferably, X 1 X 2 X 3 X 4 X 5 X 6 consists of any of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 15, 25-28.
  • the modified signal peptide according to the above. is Preferably, it comprises an amino acid sequence of a region other than the C-terminal region of the signal peptide of Bacillus spp., Or an amino acid sequence that is at least 90% identical thereto.
  • the modified signal peptide according to [16] comprises any of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 31 to 35.
  • a preproprotein comprising the modified signal peptide according to any one of [15] to [19] and a polypeptide encoding the target protein linked to the C-terminal side thereof.
  • the preproprotein according to [20] wherein the target protein is preferably an antibody-related molecule.
  • the antibody-related molecule is It is preferably selected from the group consisting of Fab, ScFv and VHH. More preferably VHH, [21] The preproprotein according to the above.
  • nucleic acid constructs for the expression and extracellular secretion of the protein of interest.
  • the nucleic acid construct comprises a polynucleotide encoding a protein of interest and a polynucleotide encoding a modified signal peptide linked upstream of the polynucleotide.
  • the amino acid residue at the 1st to 6th positions from the C-terminal is X 1 X 2 X 3 X 4 X 5 X 6 , where X 1 is G, P or A and X 2 is.
  • X 1 is G, P or A
  • X 2 is G
  • X 3 is P or S
  • X 4 is A
  • X 5 is S
  • H or F is located at the C-terminus of the modified signal peptide.
  • X 1 is G, P or A
  • X 2 is G
  • X 3 is P or S
  • X 4 is A
  • X 5 is S or H
  • X. 6 is A
  • More preferably, X 1 X 2 X 3 X 4 X 5 X 6 consists of any of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 13-30.
  • X 1 X 2 X 3 X 4 X 5 X 6 consists of any of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 15, 25-28. [23] The use described. [25] The region from the N-terminal to the C-terminal to the 7th region of the modified signal peptide is Preferably, it comprises an amino acid sequence of a region other than the C-terminal region of the signal peptide of Bacillus spp., Or an amino acid sequence that is at least 90% identical thereto. More preferably, it comprises any of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 7-12, or at least 90% identical amino acid sequences thereof.
  • the modified signal peptide preferably comprises the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 31-35.
  • the antibody-related molecule is It is preferably selected from the group consisting of Fab, ScFv and VHH. More preferably VHH, [27] Use according to the description.
  • nucleic acid construct further comprises a promoter linked upstream of the polynucleotide encoding the modified signal peptide.
  • the promoter Preferably, it is a promoter derived from Bacillus spp. More preferably, it consists of any of SEQ ID NOs: 65-67, or a nucleotide sequence having at least 90% identity with it.
  • nucleic acid construct is preferably used for expression of a target protein and extracellular secretion in Bacillus cells.
  • a derivative strain of Bacillus subtilis 168 strain was used as the host Bacillus subtilis. From extracellular protease-deficient bacillus strain Dpr9 (see Patent No. 4485341, deficient in extracellular proteases epr, wprA, mpr, nprB, bpr, nprE, vpr, aprE and aprX) according to the method described in Patent No. 4336082.
  • a sigF gene-deficient strain (Dpr9 ⁇ sigF) was prepared, and a recA gene-deficient strain (Dpr9 ⁇ recA) was prepared according to the method described in Japanese Patent No. 6088282. Furthermore, a strain (Dpr9 ⁇ sigF ⁇ recA) in which sigF and recA were doubly deleted from Dpr9 was prepared.
  • L-mal medium 1% Bacto TM Tryptone, 0.5% Bacto TM Yeast Extract, 0.5% sodium chloride, 3.75% maltose monohydrate, 3.75 ppm manganese sulfate, 15 ppm tetracycline.
  • 2 x L-mal medium 2% Bacto TM Tryptone, 1% Bacto TM Yeast Extract, 1% sodium chloride, 7.5% maltose monohydrate, 7.5 ppm manganese sulfate, 15 ppm tetracycline.
  • Reagents Reagents used were manufactured by Wako unless otherwise specified.
  • Example 1 Construction of a plasmid containing a modified signal peptide (1) Artificial synthesis of genes The genes of VHH (1ZVY and 5IMM, SEQ ID NOs: 68 and 69, respectively) were artificially synthesized by Thermo Fisher. To the artificially synthesized gene, the scaffold sequence GCAGCCTTGCAGCA (SEQ ID NO: 70) for inserting the gene into the plasmid vector was added to each 5'end, and TCTATTAAACTAGTT (SEQ ID NO: 71) was added to each 3'end.
  • VHH 1ZVY and 5IMM, SEQ ID NOs: 68 and 69, respectively
  • the artificially synthesized gene of 5IMM was incorporated into pHY-S237 by the same procedure as above.
  • the plasmid fragment was amplified by PCR using the primer sets of SEQ ID NOs: 74 and 75 and PrimeSTAR Max DNA polymerase (TaKaRa).
  • the DNA of the promoter (p_spoVG) derived from the spoVG gene was amplified by PCR using the primer sets of SEQ ID NOs: 76 and 77.
  • DNA of p_spoVG was incorporated into the amplified plasmid fragment by In-Fusion HD Cloning Kit (Takara).
  • the plasmid sequence was amplified by PCR using the primer sets of SEQ ID NOs: 78 and 79 and PrimeSTAR Max DNA polymerase (TaKaRa).
  • B. Using the genome of the subtilis 168 strain as a template, the DNA of the yncM signal peptide was amplified by PCR using the primer sets of SEQ ID NOs: 80 and 81.
  • the DNA of the yncM signal peptide was incorporated into the amplified plasmid sequence by the In-Fusion HD Cloning Kit (Takara) to construct a 5IMM expression plasmid containing the yncM signal peptide.
  • Table 2 shows a list of primers used for plasmid construction.
  • Example 2 Construction of recombinant Bacillus subtilis
  • the plasmid was introduced into the host Bacillus subtilis by the protoplast method shown below.
  • Host Bacillus subtilis stocked with glycerol was inoculated into 1 mL of LB liquid medium and cultured at 30 ° C. and 210 rpm with shaking overnight. The next day, 10 ⁇ L of this culture solution was inoculated into a new 1 mL LB liquid medium and shake-cultured at 30 ° C. and 210 rpm for about 2 hours.
  • This culture was collected in a 1.5 mL tube, centrifuged at 12,000 rpm for 5 minutes, and the pellet from which the supernatant was removed was SMMP (0.5 M shoe cloth, 20 mM disodium maleate) containing Lysozyme (SIGMA) 4 mg / mL. , 20 mM magnesium chloride hexahydrate, 35% (w / v) Antibiotic medium 3 (Difco)) suspended in 500 ⁇ L and incubated at 37 ° C. for 1 hour. Then, the pellet was centrifuged at 3,500 rpm for 10 minutes, and the pellet from which the supernatant had been removed was suspended in 400 ⁇ L of SMMP.
  • SMMP 0.5 M shoe cloth, 20 mM disodium maleate
  • SIGMA Lysozyme
  • SIGMA Lysozyme
  • 20 mM magnesium chloride hexahydrate 35% (w / v) Antibiotic medium 3 (Difco)
  • the Dpr9 ⁇ sigF strain into which the plasmid was introduced did not produce VHH, so the Dpr9 ⁇ sigF ⁇ recA strain was used as a host to improve productivity.
  • Test Example 1 Secretory production of VHH using the modified S237 signal peptide
  • VHH production amount 1ZVY-expressing recombinant Bacillus subtilis (ID: 1 to 21) having the modified S237 signal peptide prepared in Example 2 was cultured on a 96-well plate. bottom. The protein in the culture supernatant was recovered and the amount of protein was quantified by SDS-PAGE. Detailed procedures for plate culture and protein quantification will be described later.
  • Cnt-2 was cultured in a flask, 5 IMM was purified by His-tag from the culture supernatant, and the N-terminal amino acid sequence of the obtained 5 IMM was analyzed.
  • the N-terminal amino acid sequence of 5IMM secreted in the culture supernatant is TAXLF, and the third residue X from the N-terminal is Q for candidate residue 1, D for candidate residue 2, and V for candidate residue 3. Met.
  • Test Examples 1 and 2 Culture of recombinant Bacillus subtilis (96-well plate culture) The recombinant Bacillus subtilis prepared in Example 2 was inoculated into 300 ⁇ L of LB medium containing 50 ppm tetracycline and shaken overnight at 30 ° C. to prepare a preculture solution. 1% of the preculture was inoculated into 200 ⁇ L of L-mal medium in a 96-well plate and shake-cultured at 30 ° C. for 72 hours. After culturing, 150 ⁇ L of the culture broth was centrifuged at 4 ° C. and 3,000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was collected.
  • the recombinant Bacillus subtilis prepared in Example 2 was inoculated into 1 mL of LB medium containing 50 ppm tetracycline and shaken back and forth at 30 ° C. overnight to prepare a preculture solution.
  • 1% of the preculture solution was inoculated into 20 mL of 2 ⁇ L-mal medium in a pleated Erlenmeyer flask, and the cells were shake-cultured at 30 ° C. for 72 hours. After culturing, 1 mL of the culture solution was centrifuged in a microtube at 4 ° C. and 15,000 rpm for 5 minutes, and the supernatant was collected.
  • the background was faded with a 50% methanol solution, the PVDF membrane was washed well with water, and then a band consistent with the molecular weight of VHH was excised. Using the excised band as a sample, the amino acid sequence of 5 residues from the N-terminal of VHH was analyzed. The analysis of the amino acid sequence was outsourced to the Japan Institute of Leather Research, Inc.

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Abstract

目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び該ポリヌクレオチドの上流に連結された改変シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、該改変シグナルペプチドは、Ｃ末端から１～６番目のアミノ酸残基がＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6であり、ここで、Ｘ1がＧ、Ｐ又はＡであり、Ｘ2がＧ、Ｓ又はＡであり、Ｘ3がＰ、Ｓ又はＡであり、ただしＸ1Ｘ2Ｘ3はＧＧＰではなく、Ｘ4がＡであり、Ｘ5がＳ、Ｈ又はＦであり、かつＸ6がＡであって該改変シグナルペプチドのＣ末端に位置する、核酸コンストラクト。

Description

改変シグナルペプチド
　本発明は、改変シグナルペプチドに関する。
　枯草菌等のバチルス属菌は、プロテアーゼなどのタンパク質を分泌生産する機能を有することから、目的物質の微生物学的生産のための宿主として好適である。バチルス属菌における分泌性タンパク質は、シグナルペプチドを有するプレプロタンパク質として発現され、該シグナルペプチドの働きにより細胞外に分泌される。プレプロタンパク質は、シグナルペプチダーゼによるシグナルペプチドの切断を経て細胞外に分泌され、最終的に成熟タンパク質となる。目的タンパク質にバチルス属菌由来シグナルペプチドを連結し、細胞外に分泌生産させる技術が利用されている。例えば、バチルス・エスピーＫＳＭ－Ｓ２３７株由来のセルラーゼのシグナルペプチド（特許文献１）は、目的タンパク質の効率よい分泌生産のために好適なシグナルペプチドである。
　シグナルペプチドは一般的には、正電荷を持つＮ末端領域と、αヘリックスを形成する疎水性膜貫通領域（Ｈ領域）と、シート状の構造を有するＣ末端領域からなる。主にＣ末端領域のペプチドがシグナルペプチダーゼにより切断される。シグナルペプチドの改変がタンパク質生産性に影響することがあることが報告されている（例えば、非特許文献１）。
　低分子抗体は、製造効率、創薬デザインの容易さ、組織浸透性などの利点を有することから、抗体医薬や試薬の材料として注目されている。代表的な低分子抗体としては、Ｆａｂ、一本鎖抗体（single chain antibody；ｓｃＦｖ）、ｄｉａｂｏｄｙ、重鎖抗体の重鎖可変ドメイン（variable domain of heavy chain of heavy chain antibody、ＶＨＨ）などが挙げられる。従来、抗体の微生物学的生産には主に大腸菌が用いられている。一方、非特許文献２には、ブレビバチルス発現システムにより、scFvやFab、ＶＨＨを生産できたことが記載されている。非特許文献３には、Aspergillus awamoriを用いてＶＨＨを製造したことが報告されている。非特許文献４には、細胞内及び細胞外分子シャペロンを共発現し且つ細胞壁結合型プロテアーゼＷｐｒＡが不活性化された枯草菌株が、フィブリン特異的モノクローナル抗体由来のscFvを分泌生産したことが記載されている。
（特許文献１）特開２０００－２１００８１号公報
（非特許文献１）Protein Sci, 2012, 21(1):13-25
（非特許文献２）生物工学, 2017, 95(11):649-651
（非特許文献３）Appl Microbiol Biotechnol, 2005, 66(4):384-392
（非特許文献３）Appl Environ Microbiol, 2002, p.3261-3269
　一態様において、本発明は、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び該ポリヌクレオチドの上流に連結された改変シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、
　該改変シグナルペプチドは、Ｃ末端から１～６番目のアミノ酸残基がＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6であり、ここで、Ｘ1がＧ、Ｐ又はＡであり、Ｘ2がＧ、Ｓ又はＡであり、Ｘ3がＰ、Ｓ又はＡであり、ただしＸ1Ｘ2Ｘ3はＧＧＰではなく、Ｘ4がＡであり、Ｘ5がＳ、Ｈ又はＦであり、かつＸ6がＡであって該改変シグナルペプチドのＣ末端に位置する、
目的タンパク質の発現及び細胞外への分泌のための核酸コンストラクト、を提供する。
　別の一態様において、本発明は、前記核酸コンストラクトを含む発現ベクターを提供する。
　別の一態様において、本発明は、前記核酸コンストラクトを含む組換えバチルス属菌を提供する。
　さらなる一態様において、本発明は、前記組換えバチルス属菌を培養すること、及び、
　細胞外に分泌された目的タンパク質を回収すること、
を含む、目的タンパク質の製造方法を提供する。
　さらなる一態様において、本発明は、本発明の改変シグナルペプチドと、そのＣ末端側に連結された抗体関連分子をコードするポリペプチドとを含み、
　該改変シグナルペプチドは、Ｃ末端から１～６番目のアミノ酸残基がＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6であり、ここで、Ｘ1がＧ、Ｐ又はＡであり、Ｘ2がＧ、Ｓ又はＡであり、Ｘ3がＰ、Ｓ又はＡであり、ただしＸ1Ｘ2Ｘ3はＧＧＰではなく、Ｘ4がＡであり、Ｘ5がＳ、Ｈ又はＦであり、かつＸ6がＡであって該改変シグナルペプチドのＣ末端に位置し、かつ、
　該改変シグナルペプチドのＮ末端～Ｃ末端から７番目までのアミノ酸配列が、配列番号７～１２のいずれかのアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％同一なアミノ酸配列からなる、
抗体関連分子のプレプロタンパク質、を提供する。
発明の詳細な説明
　本明細書において、「抗体関連分子」とは、イムノグロブリン、又はイムノグロブリンを構成するドメインから選択される単一のドメインもしくは２以上のドメインの組合せからなる分子種を含むタンパク質をいう。イムノグロブリンを構成するドメインとしては、イムノグロブリン重鎖のドメインであるＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３、ならびにイムノグロブリン軽鎖のドメインであるＶＬ及びＣＬが挙げられる。抗体関連分子は、単量体タンパク質であってもよく、又は多量体タンパク質であってもよい。抗体関連分子が多量体タンパク質である場合には、単一の種類のサブユニットからなるホモ多量体であってもよく、又は２種類以上のサブユニットからなるヘテロ多量体であってもよい。好ましくは、抗体関連分子は、イムノグロブリンの抗原認識ドメインを含みタンパク質等の標的に特異的に結合可能な分子である。抗体関連分子の例としては、ＩｇＧなどのイムノグロブリン、ならびにＦａｂ、Ｆ（ａｂ'）2、一本鎖抗体（single chain antibody、ｓｃＦｖ）、ｄｉａｂｏｄｙ、重鎖抗体の重鎖可変ドメイン（variable domain of heavy chain of heavy chain antibody、ＶＨＨ）、などの低分子抗体が挙げられる。
　本明細書において、「ＶＨＨ」とは、重鎖抗体の重鎖可変ドメイン（variable domain of heavy chain of heavy chain antibody）をいう。重鎖抗体はラクダ科動物、サメ等の軟骨魚類などから見出されている。なお、サメ等の軟骨魚類由来のものは、ＶＮＡＲ（single variable new antigen receptor domain antibody）とも呼ばれる。本明細書におけるＶＨＨは、例えばラクダ科動物又はサメ由来であり、好ましくはラクダ科動物由来である。ＶＨＨは、単ドメインで抗原を認識できる分子であり、現在までに見つかっている抗体分子の中では最小の単位である。本発明で製造されるＶＨＨは、重鎖抗体由来の重鎖可変ドメインを１つ以上含むことができ、該ＶＨＨに含まれる重鎖可変ドメインの数は限定されない。本発明で製造されるＶＨＨに含まれる該重鎖可変ドメインは、天然の重鎖抗体由来の重鎖可変ドメインであっても、その改変体であってもよい。また本発明で製造されるＶＨＨは、該イムノグロブリン重鎖由来の重鎖可変ドメイン以外のフラグメント（例えば重鎖抗体の定常領域のフラグメント、又はヒト由来フラグメント、リンカー配列など）や、安定化のためのアミノ酸変異などを含んでいてもよい。
　本明細書において、ラクダ科動物としては、フタコブラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ、アルパカ、ビクーニャ、グアナコなどが挙げられ、好ましくはアルパカが挙げられる。
　本明細書において、ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の同一性は、Ｌｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５－１４４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ－Ｗｉｎのホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ　ｓｉｚｅ　ｔｏ　ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
　本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列に関する「少なくとも９０％の同一性」とは、９０％以上、好ましくは９５％以上の同一性をいう。
　本明細書において、別途定義されない限り、アミノ酸配列におけるアミノ酸残基の欠失、置換、付加又は挿入に関して使用される「１又は数個」とは、好ましくは１～５個、より好ましくは１～３個、さらに好ましくは１～２個を意味し得る。また本明細書において、別途定義されない限り、ヌクレオチド配列におけるヌクレオチドの欠失、置換、付加又は挿入に関して使用される「１又は数個」とは、好ましくは１～１５個、より好ましくは１～９個、さらに好ましくは１～６個を意味し得る。本明細書において、アミノ酸残基又はヌクレオチドの「付加」には、配列の一末端及び両末端へのアミノ酸残基又はヌクレオチドの付加が含まれる。
　本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列上の「相当する位置」又は「相当する領域」は、目的配列と参照配列（例えば、配列番号１のアミノ酸配列）とを、最大の相同性を与えるように整列（アラインメント）させることにより決定することができる。アミノ酸配列又はヌクレオチド配列のアラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｗマルチプルアラインメントプログラム（Nucleic Acids Res, 1994, 22:4673-4680）をデフォルト設定で用いることにより、行うことができる。Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｗは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＥＢＩ [www.ebi.ac.uk/index.html]）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ [www.ddbj.nig.ac.jp/searches-j.html]）のウェブサイト上で利用することができる。上述のアラインメントにより参照配列の任意の位置にアラインされた目的配列の位置は、当該任意の位置に「相当する位置」とみなされる。また、相当する位置により挟まれた領域、又は相当するモチーフからなる領域は、相当する領域とみなされる。
　当業者であれば、上記で得られたアミノ酸配列のアラインメントを、最適化するようにさらに微調整することができる。そのような最適アラインメントは、アミノ酸配列の同一性又は類似性や挿入されるギャップの頻度等を考慮して決定するのが好ましい。ここでアミノ酸配列の同一性又は類似性とは、２つのアミノ酸配列をアラインメントしたときにその両方の配列に同一又は類似のアミノ酸残基が存在する位置の数の全長アミノ酸残基数に対する割合（％）をいう。類似のアミノ酸残基とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸のうち、極性や電荷の点で互いに類似した性質を有しており、いわゆる保存的置換を生じるようなアミノ酸残基を意味する。そのような類似のアミノ酸残基からなるグループは当業者にはよく知られており、例えば、アルギニンとリシン；グルタミン酸とアスパラギン酸；セリンとトレオニン；グルタミンとアスパラギン；ロイシンとイソロイシン等がそれぞれ挙げられるが、これらに限定されない。
　本明細書において、「アミノ酸残基」とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸残基、アラニン（Ａｌａ又はＡ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、リシン（Ｌｙｓ又はＫ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、スレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）及びバリン（Ｖａｌ又はＶ）を意味する。
　本明細書において、「発現カセット」とは、これに含まれる目的遺伝子の発現を制御するための核酸コンストラクトをいう。好ましくは、本発明の発現カセットはＤＮＡコンストラクトである。通常、発現カセットは、発現させるべき目的遺伝子のコード領域と、その発現を制御するための制御領域、例えばプロモーターを含有する。制御領域の多くの部分は、目的遺伝子のコーディング領域の上流に位置し、それに作動可能に連結されている。例えば、該目的遺伝子が、シグナルペプチドを含むプレプロタンパク質をコードするポリヌクレオチドである場合、プロモーターは、シグナルペプチドをコードする領域の上流に位置し、該プレプロタンパク質をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結され、該プレプロタンパク質の発現を制御する。また、発現カセットは、目的遺伝子の３'非翻訳領域や５'非翻訳領域を含有してもよい。好ましくは、発現カセットは、その端部に、ベクター又はゲノムＤＮＡへの発現カセットの挿入及び／又は切除を可能にするための制限酵素認識部位を有する。発現カセットは、発現ベクターの構築又はゲノムＤＮＡへの外来遺伝子導入に使用できる。
　本明細書において、「制御領域」とは、その下流に配置された遺伝子（例えばタンパク質又はペプチドをコードする領域）の発現を制御する機能を有する領域である。より具体的には、「制御領域」とは、遺伝子のコーディング領域の上流に存在し、ＲＮＡポリメラーゼと相互作用して該コーディング領域の転写を制御する機能を有する領域として定義され得る。制御領域は、転写開始制御領域及び／又は翻訳開始制御領域、あるいは転写開始制御領域から翻訳開始制御領域に至るまでの領域を含む。転写開始制御領域はプロモーター及び転写開始点を含む領域であり、翻訳開始制御領域は開始コドンと共にリボソーム結合部位を形成するＳｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列に相当する部位である（Proc Natl Acad Sci USA, 1974, 71:1342-1346）。
　本明細書において、制御領域と遺伝子のポリヌクレオチド（例えばタンパク質をコードするポリヌクレオチド）との「作動可能な連結」とは、遺伝子と制御領域とが、該遺伝子が該制御領域の制御の下で発現し得るように連結されていることをいう。遺伝子と制御領域との「作動可能な連結」の手順は当業者に周知である。
　本明細書において、遺伝子又はその核酸配列に関する「上流」及び「下流」とは、該遺伝子の転写方向の上流及び下流をいう。例えば、「プロモーターの下流に配置された遺伝子」とは、ＤＮＡセンス鎖においてプロモーターの３'側に該遺伝子が存在することを意味し、遺伝子の上流とは、ＤＮＡセンス鎖における該遺伝子の５'側の領域を意味する。
　「シグナルペプチド」は、これと作動可能に連結した目的タンパク質を細胞外へと分泌させる機能を有する。そのような目的タンパク質は、最初にシグナルペプチドを有するプレプロタンパク質として発現され、該シグナルペプチドの働きを介して細胞外に分泌される。プレプロタンパク質は、シグナルペプチダーゼによるシグナルペプチドの切断を経て細胞外に分泌され、最終的に成熟タンパク質となる。シグナルペプチドは一般的には、正電荷を持つＮ末端領域と、αヘリックスを形成する疎水性膜貫通領域（Ｈ領域）と、シート状の構造を有するＣ末端領域からなる（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１２，２１：１３－２５）。主にＣ末端領域のペプチドがシグナルペプチダーゼにより切断される。
　本明細書において、目的タンパク質のアミノ酸配列とシグナルペプチドとの「作動可能な連結」とは、目的タンパク質のアミノ酸配列が、シグナルペプチドの制御の下で細胞外に分泌され得るように、該シグナルペプチドに連結されていることをいう。「作動可能な連結」の手順は当業者に周知であり、通常は、シグナルペプチドのＣ末端側に目的タンパク質のアミノ酸配列が連結される。作動可能に連結されている目的タンパク質のアミノ酸配列とシグナルペプチドとの間には、他の配列（例えばプロセシングにより細胞外に分泌されないアミノ酸配列）が含まれていてもよい。
　本明細書において、細胞の機能や性状、形質に対して使用する用語「本来」とは、当該機能や性状、形質が当該細胞に元から存在していることを表すために使用される。対照的に、用語「外来」とは、当該細胞に元から存在するのではなく、外部から導入された機能や性状、形質を表すために使用される。例えば、「外来」遺伝子又はポリヌクレオチドとは、細胞に外部から導入された遺伝子又はポリヌクレオチドである。外来遺伝子又はポリヌクレオチドは、それが導入された細胞と同種の生物由来であっても、異種の生物由来（すなわち異種遺伝子又はポリヌクレオチド）であってもよい。
　本明細書において、分泌されたタンパク質が「正しいＮ末端を有する」とは、シグナルペプチドを含むプレプロタンパク質を経て細胞外に分泌されたタンパク質において、その少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は１００％（全てｗ／ｗ％）が、Ｎ末端に該タンパク質が本来有さないアミノ酸残基（例えば残存するシグナルペプチドの残基）を有していないことをいう。
　本明細書において、「バチルス属菌」とは、バチルス科（Bacillaceae）バチルス属（Bacillus）の菌をいう。バチルス属菌の例としては、Bacillus subtilis（枯草菌）、Bacillus cereus、Bacillus thuringiensis、Bacillus megaterium、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus pumilus、Bacillus liqueniformis、及びそれらの変異株などが挙げられる。なお、パエニバチルス科（Paenibacillaceae）に属するパエニバチルス属（Paenibacillus）やブレビバチルス属（Brevibacillus）の菌は、本明細書におけるバチルス属菌には含まれない。
　本明細書に記載の枯草菌の遺伝子の名称は、ＪＡＦＡＮ：Ｊａｐａｎ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｎｅｔｗｏｒｋ　ｆｏｒ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＢＳＯＲＦ　ＤＢ）でインターネット公開（[bacillus.genome.ad.jp/]、２００６年１月１８日更新）された枯草菌ゲノムデータに基づいて記載されている。本明細書に記載される枯草菌の遺伝子番号は、ＢＳＯＲＦ　ＤＢに登録されている遺伝子番号を表す。
　本明細書に記載される抗体関連分子の遺伝子又はタンパク質の名称は、別途規定しない場合、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）（［www.rcsb.org/］）の登録情報に従う。
　本発明は、改変シグナルペプチド、及びそれを用いた目的タンパク質の分泌生産に関する。
　本発明は、改変シグナルペプチドを提供する。本発明により提供される改変シグナルペプチドは、目的タンパク質の分泌生産に有用である。該改変シグナルペプチドは、抗体関連分子などの目的タンパク質を効率よく細胞外に分泌させ、高収量で生産することを可能にする。また該改変シグナルペプチドを用いて分泌された抗体関連分子は、Ｎ末端にシグナルペプチドの残基などの不要な残基が残存することがほとんどないので、各種医薬や試薬の原料として価値が高い。
　本発明の改変シグナルペプチドは、親シグナルペプチドのＣ末端領域を改変することによって製造され得る。該親シグナルペプチドの例としては、バチルス属菌で機能するシグナルペプチドが挙げられ、好ましい例としては、バチルス属菌由来のシグナルペプチドが挙げられる。バチルス属菌由来のシグナルペプチドの好ましい例としては、枯草菌ＹｏａＷ、ｌｉｐＡ、ｐｅｌＢ、及びＹｎｃＭのシグナルペプチド（配列番号１～４）、Bacillus sp. ＫＳＭ－Ｓ２３７株由来のセルラーゼのシグナルペプチド（配列番号５）、Bacillus amyloliquefaciensのアミラーゼ由来のシグナルペプチド（配列番号６）、などが挙げられる。該親シグナルペプチドの別の好ましい例としては、配列番号１～６のいずれかと少なくとも９０％同一なアミノ酸配列からなるシグナルペプチドが挙げられる。このうち、配列番号４もしくは５のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％同一なアミノ酸配列からなるシグナルペプチドが、親シグナルペプチドとして好ましい。
　シグナルペプチドのＣ末端領域の推定には、ＣＲＮＰＲＥＤ（[pdbj.org/crnpred]）による立体構造予測を利用することができる。シグナルペプチドのＣ末端に存在するαヘリックス構造を取らないと推定される領域を、Ｃ末端領域として推定することができる。例えば、上記の親シグナルペプチドのＣ末端領域は、配列番号１では１７～２４残基目、配列番号２では２７～３２残基目、配列番号３では１９～２４残基目、配列番号４では３５～４２残基目、配列番号５では２４～２９残基目、配列番号６では２５～３１残基目に相当する。
　好ましくは、本発明の改変シグナルペプチドは、そのＣ末端領域が、改変されたアミノ酸残基を含む６アミノ酸残基からなる配列で構成されている。より詳細には、該改変シグナルペプチドは、Ｃ末端から１～６番目のアミノ酸残基がＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6であり、ここで、Ｘ6が該改変シグナルペプチドのＣ末端に位置する残基であり、Ｘ1がＣ末端から６番目に位置する残基である。Ｘ1～Ｘ6の残基は以下のとおりである：
　Ｘ1：好ましくはＧ、Ｐ又はＡ；
　Ｘ2：好ましくはＧ、Ｓ又はＡ、より好ましくはＧ；
　Ｘ3：好ましくはＰ、Ｓ又はＡ、より好ましくはＰ又はＳ；
　Ｘ4：好ましくはＡ；
　Ｘ5：好ましくはＳ、Ｈ又はＦ、より好ましくはＳ又はＨ；
　Ｘ6：好ましくはＡ。
　好ましくは、Ｘ1Ｘ2Ｘ3はＧＧＰではない。Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6の配列の好ましい例としては、配列番号１３～３０のいずれかのアミノ酸配列が挙げられ、より好ましい例としては、配列番号１４～３０のいずれかのアミノ酸配列が挙げられ、さらに好ましい例としては、配列番号１５、２５～２８のいずれかのアミノ酸配列が挙げられる。
　本発明の改変シグナルペプチドのＣ末端領域以外の領域は、親シグナルペプチドと同じアミノ酸配列からなるものであり得る。あるいは、シグナルペプチドとしての機能が失われない限り、改変シグナルペプチドのＣ末端領域以外の部分は、親シグナルペプチドのアミノ酸配列に対して１又は数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなるものであってもよい。
　好ましくは、本発明の改変シグナルペプチドは、Ｎ末端～Ｃ末端から７番目までの領域が、バチルス属菌のシグナルペプチドのＣ末端領域以外の領域のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％同一なアミノ酸配列からなる。より好ましくは、本発明の改変シグナルペプチドは、Ｎ末端～Ｃ末端から７番目までの領域が、配列番号７～１２のいずれかのアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％同一なアミノ酸配列からなる。さらに好ましくは、本発明の改変シグナルペプチドは、Ｎ末端～Ｃ末端から７番目までの領域が、配列番号１０もしくは１１のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％同一なアミノ酸配列からなる。
　したがって、好ましい実施形態において、本発明の改変シグナルペプチドは、配列番号７～１２のいずれかのアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％同一なアミノ酸配列からなる領域と、そのＣ末端側に隣接するＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6からなる領域とからなる。より好ましい実施形態において、本発明の改変シグナルペプチドは、配列番号３１～３５のいずれかのアミノ酸配列からなる。
　本発明の改変シグナルペプチドは、当該分野で公知の遺伝子工学的な手法に従って親シグナルペプチドのＣ末端領域を改変することで、製造することができる。例えば、親シグナルペプチドのＣ末端領域の個々のアミノ酸残基に変異（欠失、置換、付加又は挿入）を施してＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6が構築されるようにすることができ、又は、親シグナルペプチドのＣ末端領域をＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6のアミノ酸配列に置換すればよい。あるいは、親シグナルペプチドのＮ末端～Ｃ末端から７番目までの領域とＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6とを結合させればよい。その際、シグナルペプチドとしての機能が失われない限り、親シグナルペプチドのＮ末端～Ｃ末端から７番目までの領域のアミノ酸残基に変異を施してもよい。
　好適には、本発明の改変シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを調製し、それを発現させることで、該改変シグナルペプチドを得ることができる。改変シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えば、親シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド（以下、親遺伝子という）を、改変シグナルペプチドをコードするように変異させることで調製することができる。あるいは、改変シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を化学合成することができる。
　親遺伝子のポリヌクレオチドは、親シグナルペプチドを産生する株（例えばバチルス・エスピーＫＳＭ－Ｓ２３７株）などから、常法によりゲノムＤＮＡを抽出するか、又はＲＮＡを抽出し逆転写によりｃＤＮＡを合成することによって、調製することができる。
　親遺伝子を変異させる手段としては、当技術分野で公知の各種変異導入技術、例えば、紫外線照射、部位特異的変異導入、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ　ｂｙ　ｏｖｅｒｌａｐ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）－ＰＣＲ（Gene, 1989, 77(1):p61-68）、相同組換え法、などが挙げられる。市販の部位特異的変異導入用キット（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ　ＩＩ　Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔや、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ　Ｍｕｌｔｉ　Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ等）を使用することもできる。
　本発明の改変シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドの例としては、配列番号３６～４１のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９０％同一なヌクレオチド配列と、その下流に連結されたＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6をコードするヌクレオチド配列とからなるポリヌクレオチドが挙げられる。好ましい例としては、配列番号３６～４１のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９０％同一なヌクレオチド配列と、その下流に連結された配列番号４２～５９のヌクレオチド配列とからなるポリヌクレオチドが挙げられる。より好ましい例としては、配列番号３９もしくは４０のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９０％同一なヌクレオチド配列と、その下流に連結された配列番号４２～５９のヌクレオチド配列とからなるポリヌクレオチドが挙げられる。さらに好ましい例としては、配列番号６０～６４のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。
　本発明の改変シグナルペプチドは、目的タンパク質の細胞外への分泌のために用いることができる。例えば、改変シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドと目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドとを作動可能に連結し、シグナルペプチドを有する目的タンパク質のプレプロタンパク質を発現させる。該プレプロタンパク質中の改変シグナルペプチドの働きを介して、目的タンパク質が細胞外へ分泌される。
　したがって、本発明は、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び該ポリヌクレオチドの上流に連結された本発明の改変シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、核酸コンストラクトを提供する。
　好ましくは、本発明の核酸コンストラクトは、宿主細胞における目的タンパク質の発現と細胞外への分泌のための核酸コンストラクトである。好ましくは、本発明の核酸コンストラクトは発現カセットであり、該目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド及び改変シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を制御するための制御領域を含む。該発現カセットにおいて、該目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド及び改変シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドは、該制御領域と作動可能に連結されている。好ましくは、該発現カセットは、該改変シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドの上流に連結されたプロモーターを含む。
　当該制御領域の好ましい例としては、バチルス属菌で機能する制御領域、例えば、バチルス属細菌由来のα－アミラーゼ遺伝子、プロテアーゼ遺伝子、ａｐｒＥ遺伝子又はｓｐｏＶＧ遺伝子の制御領域、バチルス・エスピーＫＳＭ－Ｓ２３７株のセルラーゼ遺伝子（特許文献３）の制御領域、バチルス・エスピーＫＳＭ－６４株のセルラーゼ遺伝子（特開２０１１－１０３８７号公報）の制御領域、ならびに、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）由来のカナマイシン耐性遺伝子又はクロラムフェニコール耐性遺伝子の制御領域（いずれも、特開２００９－０８９７０８号公報を参照）、などが挙げられるが、特に限定されない。該制御領域のより好ましい例として、バチルス属菌由来のプロモーター、例えば、バチルス・エスピーＫＳＭ－Ｓ２３７株のセルラーゼ遺伝子のプロモーター（配列番号６５）、バチルス・エスピーＫＳＭ－６４株のセルラーゼ遺伝子のプロモーター（配列番号６６）、枯草菌ｓｐｏＶＧ遺伝子のプロモーター（配列番号６７）、が挙げられる。また、好ましい制御領域としては、配列番号６５～６７のいずれかと少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるプロモーターが挙げられる。
　本発明の核酸コンストラクトは、該目的タンパク質及び改変シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに該制御領域以外の核酸配列、例えば、３'非翻訳領域や５'非翻訳領域の配列を含んでいてもよい。また、該核酸コンストラクトは、一端又は両端に、制限酵素認識部位を有することができる。該制限酵素認識部位を使用して、本発明の核酸コンストラクトをベクターに導入することができる。例えば、ベクターを制限酵素で切断し、そこに、制限酵素認識部位を端部に有する本発明の核酸コンストラクトを添加することによって、該核酸コンストラクトをベクターに導入することができる。
　本発明の核酸コンストラクト中にコードされる目的タンパク質の種類は、特に限定されない。目的タンパク質は、宿主細胞が本来発現することができるタンパク質であっても、異種タンパク質であっても、外部から導入された同種由来のタンパク質であってもよい。目的タンパク質の例としては、任意のタンパク質又は目的物質の合成に関わる酵素が挙げられ、例えば、抗体関連分子、サイトカイン、ホルモン、その他生理活性ペプチド、トランスポーター、プロテアーゼなどの産業用酵素、代謝関連酵素などが挙げられる。
　好ましくは、目的タンパク質は抗体関連分子であり、より好ましくはＦａｂ、ＳｃＦｖ、ＶＨＨなどの低分子抗体である。さらに好ましくは、目的タンパク質はＦａｂ、ＳｃＦｖ及びＶＨＨからなる群より選択され、さらに好ましくはＶＨＨである。Ｆａｂ、ＳｃＦｖ及びＶＨＨの例としては、限定ではないが、下記表１に記載されるものが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　必要に応じて、本発明の核酸コンストラクトに含まれる該目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、該核酸コンストラクトが組み込まれる宿主の種にあわせて、コドン至適化されてもよい。各種生物が使用するコドンの情報は、Ｃｏｄｏｎ　Ｕｓａｇｅ　Ｄａｔａｂａｓｅ（[www.kazusa.or.jp/codon/]）から入手可能である。
　本発明の核酸コンストラクトを宿主細胞に導入して、目的タンパク質の分泌生産のために用いることができる。該核酸コンストラクトは、宿主細胞のゲノムＤＮＡに直接組み込まれてもよいが、ベクターに組み込まれて宿主細胞に導入されてもよい。該ベクターの種類は特に限定されず、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、ウイルス、ＹＡＣベクター、シャトルベクター等の任意のベクターであってよい。該ベクターは、宿主細胞のゲノムＤＮＡに導入されるベクターであっても、ゲノムＤＮＡの外に保持されるベクターであってもよい。宿主細胞内で複製可能なベクターが好ましい。一実施形態において、該核酸コンストラクトを組み込むべきベクターは発現ベクターであり得るが、一方、組み込まれる核酸コンストラクトが発現カセットである場合は、発現ベクターである必要はない。一実施形態においては、本発明の核酸コンストラクトは制御領域を含む発現カセットであり、任意のベクターに組み込まれて発現ベクターを構築する。別の一実施形態においては、制御領域を含む発現ベクターに本発明の核酸コンストラクトを組み込むことで、該発現ベクター上に本発明の発現カセットが構築される。
　好ましいベクターの例としては、限定ではないが、ｐＨＡ３０４０ＳＰ６４、ｐＨＳＰ６４Ｒ又はｐＡＳＰ６４（特許第３４９２９３５号）、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（大腸菌と枯草菌の両方を形質転換可能な発現ベクター；Ｊｐｎ　Ｊ　Ｇｅｎｅｔ，１９８５，６０：２３５－２４３）、ｐＡＣ３（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ，１９８８，１６：８７３２）等のシャトルベクター；ｐＵＢ１１０（Ｊ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９７８，１３４：３１８－３２９）、ｐＴＡ１０６０７（Ｐｌａｓｍｉｄ，１９８７，１８：８－１５）；ｐＨＹ－Ｓ２３７（特開２０１４－１５８４３０号公報）、等のバチルス属細菌の形質転換に利用可能なプラスミド、などが挙げられる。また大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＥＴ２２ｂ（＋）、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ５７、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等）を用いることもできる。
　宿主細胞としては、その細胞内で本発明のシグナルペプチドが目的タンパク質を分泌させるように機能する限り、その種類は限定されない。好ましい宿主としては、バチルス属菌が挙げられ、より好ましくは枯草菌又はその変異株が挙げられる。宿主として用いられる枯草菌変異株の好ましい例としては、細胞外プロテアーゼ欠損枯草菌株Ｄｐｒ９（特許第４４８５３４１号参照）が挙げられる。また、宿主として用いられる枯草菌変異株は、ｓｉｇＦ等のシグマ因子の欠失（特許第４３３６０８２号参照）、相同組み換え活性に関与するｒｅｃＡの欠失（特許第６０８８２８２号参照）などを施されていてもよい。Ｄｐｒ９株に、ｓｉｇＦ及びｒｅｃＡの一方又は両方の欠失を加えた枯草菌変異株も使用できる。
　宿主細胞への本発明の核酸コンストラクト又はそれを含むベクターの導入は、定法に従って行うことができる。例えば、宿主細胞への該核酸コンストラクト又は該ベクターの導入には、コンピテントセル法、エレクトロポレーション法、プロトプラスト法、パーテイクルガン法、ＰＥＧ法などの公知の形質転換技術を適用することができる。得られた本発明の核酸コンストラクトを含む組換え細胞は、目的タンパク質の分泌生産に用いることができる。
　本発明の核酸コンストラクトを含む組換え細胞を培養することで、目的タンパク質を製造することができる。該組換え細胞は、その宿主細胞の一般的な培養方法に従って培養すればよい。例えば、バチルス属菌の培養のための培地は、菌の生育に必要な炭素源及び窒素源を含む。必要に応じて、該培地は、他の栄養素、例えば無機塩、ビタミン類、抗生物質などを含んでいてもよい。培養条件、例えば温度、通気撹拌条件、培地のｐＨ及び培養時間等は、菌種や形質、培養スケール等に応じて適宜選択され得る。
　当該組換え細胞の培養により、目的タンパク質のプレプロタンパク質が細胞内に発現する。該プレプロタンパク質は、本発明の改変シグナルペプチドと、そのＣ末端側に連結された目的タンパク質をコードするポリペプチドとを含む。該プレプロタンパク質において、本発明の改変シグナルペプチドは目的タンパク質と作動可能に連結されており、該改変シグナルペプチドの働きを介して、目的タンパク質が細胞外に分泌される。したがって、本発明による目的タンパク質の製造においては、細胞を破壊する必要はなく、細胞外に分泌された目的タンパク質を回収すればよい。回収された目的タンパク質は、タンパク質精製に用いられる一般的な方法、例えば、遠心分離、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、さらに精製することができる。
　本発明の改変シグナルペプチドを用いて細胞外に分泌された目的タンパク質は、正しいＮ末端を有する、すなわち、Ｎ末端にシグナルペプチドの残基などの不要な残基が残存することがほとんどない。したがって、本発明により製造された目的タンパク質は、該不要な残基に起因する構造や性質の変動が少なく、該目的タンパク質に期待される機能をよく保持することができる。このことは、わずかな構造の違いが活性に影響するタンパク質、例えば抗体関連分子において非常に有利である。例えば、本発明により製造された抗体関連分子は、活性にばらつきがなく、各種医薬や試薬の原料として価値が高い。
　本発明はまた、例示的実施形態として以下の物質、製造方法、用途、方法等を包含する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
〔１〕目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び該ポリヌクレオチドの上流に連結された改変シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、
　該改変シグナルペプチドは、Ｃ末端から１～６番目のアミノ酸残基がＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6であり、ここで、Ｘ1がＧ、Ｐ又はＡであり、Ｘ2がＧ、Ｓ又はＡであり、Ｘ3がＰ、Ｓ又はＡであり、ただしＸ1Ｘ2Ｘ3はＧＧＰではなく、Ｘ4がＡであり、Ｘ5がＳ、Ｈ又はＦであり、かつＸ6がＡであって該改変シグナルペプチドのＣ末端に位置する、
目的タンパク質の発現及び細胞外への分泌のための核酸コンストラクト。
〔２〕好ましくは、Ｘ1がＧ、Ｐ又はＡであり、Ｘ2がＧであり、Ｘ3がＰ又はＳであり、Ｘ4がＡであり、Ｘ5がＳ又はＨであり、Ｘ6がＡであり、
　より好ましくは、Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6が配列番号１３～３０のいずれかのアミノ酸配列からなり、
　さらに好ましくは、Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6が配列番号１５、２５～２８のいずれかのアミノ酸配列からなる、
〔１〕記載の核酸コンストラクト。
〔３〕前記改変シグナルペプチドのＮ末端～Ｃ末端から７番目までの領域が、
　好ましくは、バチルス属菌のシグナルペプチドのＣ末端領域以外の領域のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％同一なアミノ酸配列からなり、
　より好ましくは、配列番号７～１２のいずれかのアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％同一なアミノ酸配列からなり、
　さらに好ましくは、配列番号１０もしくは１１のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％同一なアミノ酸配列からなる、
〔１〕又は〔２〕記載の核酸コンストラクト。
〔４〕好ましくは、前記改変シグナルペプチドが配列番号３１～３５のいずれかのアミノ酸配列からなる、〔１〕記載の核酸コンストラクト。
〔５〕好ましくは、前記目的タンパク質が抗体関連分子である、〔１〕～〔４〕のいずれか１項記載の核酸コンストラクト。
〔６〕前記抗体関連分子が、
　好ましくはＦａｂ、ＳｃＦｖ及びＶＨＨからなる群より選択され、
　より好ましくはＶＨＨである、
〔５〕記載の核酸コンストラクト。
〔７〕好ましくは、さらに前記改変シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドの上流に連結されたプロモーターを含む、〔１〕～〔６〕のいずれか１項記載の核酸コンストラクト。
〔８〕前記プロモーターが、
　好ましくは、バチルス属菌由来のプロモーターであり、
　より好ましくは、配列番号６５～６７のいずれか、又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる、
〔７〕記載の核酸コンストラクト。
〔９〕好ましくは、バチルス属菌細胞における目的タンパク質の発現及び細胞外への分泌のための核酸コンストラクトである、〔１〕～〔８〕のいずれか１項記載の核酸コンストラクト。
〔１０〕〔１〕～〔９〕のいずれか１項記載の核酸コンストラクトを含む、発現ベクター。
〔１１〕〔１〕～〔９〕のいずれか１項記載の核酸コンストラクトを含む、組換えバチルス属菌。
〔１２〕〔１１〕記載の組換えバチルス属菌を培養すること、及び、
　細胞外に分泌された目的タンパク質を回収すること、
を含む、目的タンパク質の製造方法。
〔１３〕好ましくは、前記目的タンパク質が抗体関連分子である、〔１２〕記載の方法。
〔１４〕前記抗体関連分子が、
　好ましくはＦａｂ、ＳｃＦｖ及びＶＨＨからなる群より選択され、
　より好ましくはＶＨＨである、
〔１３〕記載の方法。
〔１５〕Ｃ末端から１～６番目のアミノ酸残基がＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6であり、ここで、Ｘ1がＧ、Ｐ又はＡであり、Ｘ2がＧ、Ｓ又はＡであり、Ｘ3がＰ、Ｓ又はＡであり、ただしＸ1Ｘ2Ｘ3はＧＧＰではなく、Ｘ4がＡであり、Ｘ5がＳ、Ｈ又はＦであり、かつＸ6がＡであって該改変シグナルペプチドのＣ末端に位置する、改変シグナルペプチド。
〔１６〕好ましくは、Ｘ1がＧ、Ｐ又はＡであり、Ｘ2がＧであり、Ｘ3がＰ又はＳであり、Ｘ4がＡであり、Ｘ5がＳ又はＨであり、Ｘ6がＡであり、
　より好ましくは、Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6が配列番号１３～３０のいずれかのアミノ酸配列からなり、
　さらに好ましくは、Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6が配列番号１５、２５～２８のいずれかのアミノ酸配列からなる、
〔１５〕記載の改変シグナルペプチド。
〔１７〕Ｎ末端～Ｃ末端から７番目までの領域が、
　好ましくは、バチルス属菌のシグナルペプチドのＣ末端領域以外の領域のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％同一なアミノ酸配列からなり、
　より好ましくは、配列番号７～１２のいずれかのアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％同一なアミノ酸配列からなり、
　さらに好ましくは、配列番号１０もしくは１１のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％同一なアミノ酸配列からなる、
〔１５〕又は〔１６〕記載の改変シグナルペプチド。
〔１８〕好ましくは配列番号３１～３５のいずれかのアミノ酸配列からなる、〔１５〕記載の改変シグナルペプチド。
〔１９〕好ましくはバチルス属菌で機能する、〔１５〕～〔１８〕のいずれか１項記載の改変シグナルペプチド。
〔２０〕〔１５〕～〔１９〕のいずれか１項記載の改変シグナルペプチドと、そのＣ末端側に連結された目的タンパク質をコードするポリペプチドとを含むプレプロタンパク質。
〔２１〕好ましくは、前記目的タンパク質が抗体関連分子である、〔２０〕記載のプレプロタンパク質。
〔２２〕前記抗体関連分子が、
　好ましくはＦａｂ、ＳｃＦｖ及びＶＨＨからなる群より選択され、
　より好ましくはＶＨＨである、
〔２１〕記載のプレプロタンパク質。
〔２３〕目的タンパク質の発現及び細胞外への分泌のための核酸コンストラクトの使用であって、
　該核酸コンストラクトが、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び該ポリヌクレオチドの上流に連結された改変シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、
　該改変シグナルペプチドは、Ｃ末端から１～６番目のアミノ酸残基がＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6であり、ここで、Ｘ1がＧ、Ｐ又はＡであり、Ｘ2がＧ、Ｓ又はＡであり、Ｘ3がＰ、Ｓ又はＡであり、ただしＸ1Ｘ2Ｘ3はＧＧＰではなく、Ｘ4がＡであり、Ｘ5がＳ、Ｈ又はＦであり、かつＸ6がＡであって該改変シグナルペプチドのＣ末端に位置する、
使用。
〔２４〕好ましくは、Ｘ1がＧ、Ｐ又はＡであり、Ｘ2がＧであり、Ｘ3がＰ又はＳであり、Ｘ4がＡであり、Ｘ5がＳ又はＨであり、Ｘ6がＡであり、
　より好ましくは、Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6が配列番号１３～３０のいずれかのアミノ酸配列からなり、
　さらに好ましくは、Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6が配列番号１５、２５～２８のいずれかのアミノ酸配列からなる、
〔２３〕記載の使用。
〔２５〕前記改変シグナルペプチドのＮ末端～Ｃ末端から７番目までの領域が、
　好ましくは、バチルス属菌のシグナルペプチドのＣ末端領域以外の領域のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％同一なアミノ酸配列からなり、
　より好ましくは、配列番号７～１２のいずれかのアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％同一なアミノ酸配列からなり、
　さらに好ましくは、配列番号１０もしくは１１のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％同一なアミノ酸配列からなる、
〔２３〕又は〔２４〕記載の使用。
〔２６〕好ましくは、前記改変シグナルペプチドが配列番号３１～３５のいずれかのアミノ酸配列からなる、〔２３〕記載の使用。
〔２７〕好ましくは、前記目的タンパク質が抗体関連分子である、〔２３〕～〔２６〕のいずれか１項記載の使用。
〔２８〕前記抗体関連分子が、
　好ましくはＦａｂ、ＳｃＦｖ及びＶＨＨからなる群より選択され、
　より好ましくはＶＨＨである、
〔２７〕記載の使用。
〔２９〕好ましくは、前記核酸コンストラクトが、さらに前記改変シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドの上流に連結されたプロモーターを含む、〔２３〕～〔２８〕のいずれか１項記載の使用。
〔３０〕前記プロモーターが、
　好ましくは、バチルス属菌由来のプロモーターであり、
　より好ましくは、配列番号６５～６７のいずれか、又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる、
〔２９〕記載の使用。
〔３１〕好ましくは、前記核酸コンストラクトが、バチルス属菌細胞における目的タンパク質の発現及び細胞外への分泌のために使用される、〔１〕～〔８〕のいずれか１項記載の使用。
　以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
材料及び方法
（１）宿主菌株
　宿主枯草菌には、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　１６８株の派生株を用いた。細胞外プロテアーゼ欠損枯草菌株Ｄｐｒ９（特許第４４８５３４１号参照、細胞外プロテアーゼｅｐｒ、ｗｐｒＡ、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｂｐｒ、ｎｐｒＥ、ｖｐｒ、ａｐｒＥ及びａｐｒＸが欠損）から、特許第４３３６０８２号に記載されている方法に従ってｓｉｇＦ遺伝子欠損株（Ｄｐｒ９ΔｓｉｇＦ）を、また、特許第６０８８２８２号に記載されている方法に従ってｒｅｃＡ遺伝子欠損株（Ｄｐｒ９ΔｒｅｃＡ）を作製した。さらに、Ｄｐｒ９に対してｓｉｇＦ及びｒｅｃＡを二重に欠損させた株（Ｄｐｒ９ΔｓｉｇＦΔｒｅｃＡ）を作製した。
（２）培地
・ＬＢ培地：１％ＢａｃｔｏTM Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．５％ＢａｃｔｏTM Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ、１％塩化ナトリウム。平板培地には１．５％の寒天を加えた。必要に応じてテトラサイクリン（５０ｐｐｍ）を加えた。
・ＤＭ３培地：１％ＣＭＣ（関東化学）、０．５％ＢａｃｔｏTM Ｃａｓａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄｓ、０．５％ＢａｃｔｏTM Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ、８．１％コハク酸二ナトリウム・６Ｈ2Ｏ、０．３５％リン酸水素二カリウム、０．１５％リン酸二水素カリウム、０．５％グルコース、２０ｍＭ塩化マグネシウム、０．０１％ＢＳＡ、５０ｐｐｍテトラサイクリン。平板培地には１％の寒天を加えた。
・Ｌ－ｍａｌ培地：１％ＢａｃｔｏTM Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．５％ＢａｃｔｏTM Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ、０．５％塩化ナトリウム、３．７５％マルトース一水和物、３．７５ｐｐｍ硫酸マンガン、１５ｐｐｍテトラサイクリン。
・２×Ｌ－ｍａｌ培地：２％ＢａｃｔｏTM Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、１％ＢａｃｔｏTM Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ、１％塩化ナトリウム、７．５％マルトース一水和物、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン、１５ｐｐｍテトラサイクリン。
（３）試薬
　試薬は、特に記述が無い場合はＷａｋｏ社製を用いた。
実施例１　改変シグナルペプチドを含むプラスミドの構築
（１）遺伝子の人工合成
　ＶＨＨ（１ＺＶＹ及び５ＩＭＭ、それぞれ配列番号６８及び６９）の遺伝子は、サーモフィッシャー社で人工合成された。人工合成遺伝子には、該遺伝子をプラスミドベクターに挿入するための足場配列ＧＣＡＧＣＴＣＴＴＧＣＡＧＣＡ（配列番号７０）がそれぞれの５'末端に、ＴＣＴＡＴＴＡＡＡＣＴＡＧＴＴ（配列番号７１）がそれぞれの３'末端に付加された。
（２）抗体関連分子発現用プラスミドの構築
（Ｓ２３７シグナルペプチド－１ＺＶＹ発現用プラスミド）
　プラスミドｐＨＹ－Ｓ２３７（特開２０１４－１５８４３０号公報）を鋳型とし、配列番号７２及び７３のプライマーセットとＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｍａｘ　ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）を用いたＰＣＲによりプラスミド配列を増幅した。得られたＰＣＲ断片に、（１）に示す１ＺＶＹの人工合成遺伝子を含むＤＮＡをＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いて組み込み、Ｓ２３７シグナルペプチドを含む１ＺＶＹ発現用プラスミドを構築した。
（ｙｎｃＭシグナルペプチド－５ＩＭＭ発現用プラスミド）
　上記と同様の手順で、５ＩＭＭの人工合成遺伝子をｐＨＹ－Ｓ２３７に組み込んだ。得られたプラスミドを鋳型とし、配列番号７４及び７５のプライマーセットとＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｍａｘ　ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）を用いたＰＣＲによりプラスミド断片を増幅した。また、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ　１６８株のゲノムを鋳型とし、配列番号７６及び７７のプライマーセットを用いたＰＣＲによりｓｐｏＶＧ遺伝子由来のプロモーター（ｐ＿ｓｐｏＶＧ）のＤＮＡを増幅した。増幅したプラスミド断片にｐ＿ｓｐｏＶＧのＤＮＡをＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）によって組み込んだ。
　得られたプラスミドを鋳型とし、配列番号７８及び７９のプライマーセットとＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｍａｘ　ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）を用いたＰＣＲによりプラスミド配列を増幅した。また、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ　１６８株のゲノムを鋳型とし、配列番号８０及び８１のプライマーセットを用いたＰＣＲによりｙｎｃＭシグナルペプチドのＤＮＡを増幅した。増幅したプラスミド配列にｙｎｃＭシグナルペプチドのＤＮＡをＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）によって組み込み、ｙｎｃＭシグナルペプチドを含む５ＩＭＭ発現用プラスミドを構築した。
　プラスミド構築に用いたプライマーの一覧を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（３）シグナルペプチドＣ末端領域の改変
　ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｂａｓａｌ　Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いてマニュアルに従って、（２）で構築したプラスミド上のシグナルペプチドのＣ末端領域を改変した。得られた改変シグナルペプチドは、下記表３に示すように、Ｃ末端領域が配列番号１３～３０、８２～８４のいずれかの配列からなる。改変後のプラスミド断片は、ＤｐｎＩで処理した後、精製した。
実施例２　組換え枯草菌の構築
　宿主枯草菌へのプラスミド導入は以下に示すプロトプラスト法によって行った。１ｍＬのＬＢ液体培地にグリセロールストックした宿主枯草菌を植菌し、３０℃、２１０ｒｐｍで一晩振とう培養した。翌日、新たな１ｍＬのＬＢ液体培地にこの培養液を１０μＬ植菌し、３０℃、２１０ｒｐｍで約２時間振とう培養した。この培養液を１．５ｍＬチューブに回収し、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を除去したペレットをＬｙｓｏｚｙｍｅ（ＳＩＧＭＡ）４ｍｇ／ｍＬを含むＳＭＭＰ（０．５Ｍシュークロース、２０ｍＭマレイン酸二ナトリウム、２０ｍＭ塩化マグネシウム６水塩、３５％（ｗ／ｖ）Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｍｅｄｉｕｍ ３（Ｄｉｆｃｏ））５００μＬに懸濁し、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、３，５００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を除去したペレットをＳＭＭＰ４００μＬに懸濁した。この懸濁液３３μＬを実施例１で構築したプラスミド断片６μＬと混合し、さらに４０％ＰＥＧを１００μＬ添加してボルテックスした。この液にＳＭＭＰを３５０μＬ加えて転倒混和し、３０℃、２１０ｒｐｍで１時間振とうした後、ＤＭ３寒天培地プレートに全量塗布し、３０℃で２～３日間インキュベートした。作製した組換え枯草菌の宿主と、導入したプラスミドにコードされる抗体関連分子（ＶＨＨ）及びシグナルペプチドを表３に示す。なお、未改変Ｓ２３７シグナルペプチドを含むプラスミドについては、これを導入したＤｐｒ９ΔｓｉｇＦ株がＶＨＨを生産しなかったため、生産性向上のために宿主としてＤｐｒ９ΔｓｉｇＦΔｒｅｃＡ株を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
試験例１　改変Ｓ２３７シグナルペプチドを用いたＶＨＨの分泌生産
（１）ＶＨＨ生産量
　実施例２で作製した改変Ｓ２３７シグナルペプチドを有する１ＺＶＹ発現組換え枯草菌（ＩＤ：１～２１）を９６穴プレート培養した。培養上清中のタンパク質を回収し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによりタンパク質量を定量した。プレート培養及びタンパク質定量の詳細な手順は後述する。各組換え枯草菌についての培養上清中のタンパク質量の平均値（Ｎ＝３）を表４に示す。改変Ｓ２３７シグナルペプチド２１種のうち１８種で組換え枯草菌からのＶＨＨの分泌に成功した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
（２）ＶＨＨのＮ末端アミノ酸の解析
　実施例２で作製した改変Ｓ２３７シグナルペプチドを有する１ＺＶＹ発現組換え枯草菌（ＩＤ：１３～１６）をフラスコ培養した。培養上清から１ＺＶＹをＨｉｓ－ｔａｇ精製し、得られた１ＺＶＹのＮ末端アミノ酸配列を解析した。フラスコ培養、Ｈｉｓ－ｔａｇ精製、及びＮ末端アミノ酸配列の解析の詳細な手順は後述する。培養上清中に分泌された１ＺＶＹのＮ末端アミノ酸配列はいずれもＤＶＱＬＶであり、導入した１ＺＶＹのＮ末端と完全に一致していた。
（３）未改変Ｓ２３７シグナルペプチドを用いて生産したＶＨＨのＮ末端アミノ酸解析
　（２）と同様の手順で、実施例２で作製した未改変Ｓ２３７シグナルペプチドを有する１ＺＶＹ発現組換え枯草菌（ＩＤ：Ｃｎｔ－１）をフラスコ培養し、培養上清から１ＺＶＹをＨｉｓ－ｔａｇ精製し、得られた１ＺＶＹのＮ末端アミノ酸配列を解析した。培養上清中に分泌された１ＺＶＹのＮ末端アミノ酸配列はＡＤＶＱＬであったことから、分泌された１ＺＶＹのＮ末端にシグナルペプチド由来の不要なＡが残存していることが確認された。
試験例２　改変ｙｎｃＭシグナルペプチドを用いたＶＨＨの分泌生産
（１）ＶＨＨ生産量
　実施例２で作製した改変ｙｎｃＭシグナルペプチドを有する５ＩＭＭ発現組換え枯草菌（ＩＤ：２２～２７）を９６穴プレート培養した。培養上清中のタンパク質を回収し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによりタンパク質量を定量した。プレート培養及びタンパク質定量の詳細な手順は後述する。各組換え枯草菌についての培養上清中のタンパク質量の平均値（Ｎ＝３）を表５に示す。改変ｙｎｃＭシグナルペプチド６種全てで組換え枯草菌からのＶＨＨの分泌に成功した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
（２）ＶＨＨのＮ末端アミノ酸の解析
　実施例２で作製した改変ｙｎｃＭシグナルペプチドを有する５ＩＭＭ発現組換え枯草菌（ＩＤ：２３）をフラスコ培養した。培養上清から５ＩＭＭをＨｉｓ－ｔａｇ精製し、得られた５ＩＭＭのＮ末端アミノ酸配列を解析した。フラスコ培養、Ｈｉｓ－ｔａｇ精製、及びＮ末端アミノ酸配列の解析の詳細な手順は後述する。培養上清中に分泌された５ＩＭＭのＮ末端アミノ酸配列はいずれもＱＶＱＬＶであり、導入した５ＩＭＭのＮ末端と完全に一致していた。
（３）未改変ｙｎｃＭシグナルペプチドを用いて生産したＶＨＨのＮ末端アミノ酸解析
　（２）と同様の手順で、実施例２で作製した未改変ｙｎｃＭシグナルペプチドを有する５ＩＭＭ発現組換え枯草菌（ＩＤ：Ｃｎｔ－２）をフラスコ培養し、培養上清から５ＩＭＭをＨｉｓ－ｔａｇ精製し、得られた５ＩＭＭのＮ末端アミノ酸配列を解析した。培養上清中に分泌された５ＩＭＭのＮ末端アミノ酸配列はＴＡＸＬＦであり、Ｎ末端から３番目の残基Ｘは、候補残基１がＱ、候補残基２がＤ、候補残基３がＶであった。ＸがＶである場合、未改変ｙｎｃＭシグナルペプチドの２３～２７残基目ＴＡＶＬＦと一致することから、分泌された５ＩＭＭのＮ末端にシグナルペプチド由来の不要なアミノ酸配列が残存してることが確認された。
参考　試験例１、２で用いた方法
（１）組換え枯草菌の培養
（９６穴プレート培養）
　実施例２で作製した組換え枯草菌を、５０ｐｐｍテトラサイクリンを含む３００μＬのＬＢ培地に植菌し、３０℃で一晩振とう培養して前培養液を調製した。前培養液を、９６穴プレートに入れた２００μＬのＬ－ｍａｌ培地に１％接種し、３０℃で７２時間振とう培養した。培養後に１５０μＬの培養液を４℃、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を回収した。
（フラスコ培養）
　実施例２で作製した組換え枯草菌を、５０ｐｐｍテトラサイクリンを含む１ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３０℃で一晩往復振とうして前培養液を調製した。前培養液を、ひだ付き三角フラスコに入れた２０ｍＬの２×Ｌ－ｍａｌ培地に１％接種し、３０℃で７２時間振とう培養した。培養後に１ｍＬの培養液をマイクロチューブにて４℃、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を回収した。
（２）ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
　（１）で回収した培養上清とＬａｅｍｍｌｉ　Ｓａｍｐｌｅ　Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を等量混和後、９９℃で５分間熱処理してサンプルを調製した。ゲルはＭｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＩＮ　ＴＧＸ　Ｓｔａｉｎ－Ｆｒｅｅ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を用いた。各ウェルに５μＬのサンプルをアプライし、２１０Ｖで２５分間泳動した。分子量マーカーにはＰｒｅｃｉｓｉｏｎ　Ｐｌｕｓ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ　ｓｔａｎｄａｒｄ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を用いた。ＣｈｅｍｉＤｏｃ　ＭＰ　Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍでタンパク質のバンドを検出した。リゾチーム標品（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）をもとに作成した検量線によって検出したタンパク質を定量した。
（３）Ｈｉｓ－ｔａｇ精製
　（１）で回収した培養上清１ｍＬに５０μＬのＮｉ－ＮＴＡ　Ａｇａｒｏｓｅ（Ｗａｋｏ）を添加し、ローテーターにて４℃で３０分間転倒混和した。５００ｇで５分間遠心後、上清を除去した。残った沈殿物に、Ｗａｓｈ　Ｂｕｆｆｅｒ（３０ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０）を５００μＬ添加し、ボルテックスで懸濁した後、５００ｇで５分間遠心し、上清を除去した。この操作を計２回繰り返した。残った沈殿物にＥｌｕｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ（５００ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５）を５０μＬ添加し、ローテーターにて４℃で３０分間転倒混和した。５００ｇで５分間遠心後、上清を新しいチューブに移し、Ｈｉｓ－Ｔａｇ精製サンプルとした。
（４）Ｎ末端アミノ酸解析
　（３）で得た精製サンプルをＬａｅｍｍｌｉ　Ｓａｍｐｌｅ　Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）と等量混和後、９９℃で５分間熱処理した。ゲルはＭｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＩＮ　ＴＧＸ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を用いた。各ウェルに１０μＬのサンプルをアプライし、２１０Ｖで２５分間泳動した。Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ　Ｔｕｒｂｏ　Ｍｉｎｉ　ＰＶＤＦ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｐａｃｋｓ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）及びＴｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ　Ｔｕｒｂｏ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を用いてタンパク質をＰＶＤＦ膜へ転写し、Ｂｉｏ－Ｓａｆｅ　ＣＢＢ　Ｇ－２５０ステイン（ＢＩＯ－ＲＡＤ）で３０分間染色した。５０％メタノール溶液を用いてバックグラウンドを退色し、ＰＶＤＦ膜を水でよく洗浄した後、ＶＨＨの分子量と一致したバンドを切り出した。切り出したバンドを検体として、ＶＨＨのＮ末端から５残基のアミノ酸配列を解析した。アミノ酸配列の解析は、株式会社一般財団法人日本皮革研究所へ委託した。
　以上、本発明の実施形態を説明したが、これらが、本発明を、説明した特定の実施形態に限定することを意図するものではないことを理解すべきである。本発明の範囲内にある様々な他の変更及び修正は当業者には明白である。本明細書に引用されている文献及び特許出願は、あたかもそれが本明細書に完全に記載されているかのように参考として援用される。

Claims (17)

  1. 　目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び該ポリヌクレオチドの上流に連結された改変シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、
    　該改変シグナルペプチドは、Ｃ末端から１～６番目のアミノ酸残基がＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6であり、ここで、Ｘ1がＧ、Ｐ又はＡであり、Ｘ2がＧ、Ｓ又はＡであり、Ｘ3がＰ、Ｓ又はＡであり、ただしＸ1Ｘ2Ｘ3はＧＧＰではなく、Ｘ4がＡであり、Ｘ5がＳ、Ｈ又はＦであり、かつＸ6がＡであって該改変シグナルペプチドのＣ末端に位置する、
    目的タンパク質の発現及び細胞外への分泌のための核酸コンストラクト。
  2. 　Ｘ1がＧ、Ｐ又はＡであり、Ｘ2がＧであり、Ｘ3がＰ又はＳであり、Ｘ4がＡであり、Ｘ5がＳ又はＨであり、Ｘ6がＡである、請求項１記載の核酸コンストラクト。
  3. 　Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6が、配列番号１３～３０のいずれかのアミノ酸配列からなる、請求項１記載の核酸コンストラクト。
  4. 　Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6が、配列番号１５、２５～２８のいずれかのアミノ酸配列からなる、請求項１記載の核酸コンストラクト。
  5. 　前記改変シグナルペプチドのＮ末端～Ｃ末端から７番目までの領域が、配列番号７～１２のいずれかのアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％同一なアミノ酸配列からなる、請求項１～４のいずれか１項記載の核酸コンストラクト。
  6. 　前記改変シグナルペプチドのＮ末端～Ｃ末端から７番目までの領域が、配列番号１０もしくは１１のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％同一なアミノ酸配列からなる、請求項５記載の核酸コンストラクト。
  7. 　前記改変シグナルペプチドが配列番号３１～３５のいずれかのアミノ酸配列からなる、請求項１記載の核酸コンストラクト。
  8. 　前記目的タンパク質が抗体関連分子である、請求項１～７のいずれか１項記載の核酸コンストラクト。
  9. 　前記抗体関連分子がＦａｂ、ＳｃＦｖ及びＶＨＨからなる群より選択される、請求項８記載の核酸コンストラクト。
  10. 　前記抗体関連分子がＶＨＨである、請求項８記載の核酸コンストラクト。
  11. 　さらに前記改変シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドの上流に連結されたプロモーターを含む、請求項１～１０のいずれか１項記載の核酸コンストラクト。
  12. 　前記プロモーターが、配列番号６５～６７のいずれか、又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる、請求項１１記載の核酸コンストラクト。
  13. 　請求項１～１２のいずれか１項記載の核酸コンストラクトを含む、発現ベクター。
  14. 　請求項１～１２のいずれか１項記載の核酸コンストラクトを含む、組換えバチルス属菌。
  15. 　請求項１４記載の組換えバチルス属菌を培養すること、及び、
    　細胞外に分泌された目的タンパク質を回収すること、
    を含む、目的タンパク質の製造方法。
  16. 　改変シグナルペプチドと、そのＣ末端側に連結された抗体関連分子をコードするポリペプチドとを含み、
    　該改変シグナルペプチドは、Ｃ末端から１～６番目のアミノ酸残基がＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6であり、ここで、Ｘ1がＧ、Ｐ又はＡであり、Ｘ2がＧ、Ｓ又はＡであり、Ｘ3がＰ、Ｓ又はＡであり、ただしＸ1Ｘ2Ｘ3はＧＧＰではなく、Ｘ4がＡであり、Ｘ5がＳ、Ｈ又はＦであり、かつＸ6がＡであって該改変シグナルペプチドのＣ末端に位置し、かつ、
    　該改変シグナルペプチドのＮ末端～Ｃ末端から７番目までのアミノ酸配列が、配列番号７～１２のいずれかのアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％同一なアミノ酸配列からなる、
    抗体関連分子のプレプロタンパク質。
  17. 　目的タンパク質の発現及び細胞外への分泌のための核酸コンストラクトの使用であって、
    　該核酸コンストラクトが、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び該ポリヌクレオチドの上流に連結された改変シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、
    　該改変シグナルペプチドは、Ｃ末端から１～６番目のアミノ酸残基がＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6であり、ここで、Ｘ1がＧ、Ｐ又はＡであり、Ｘ2がＧ、Ｓ又はＡであり、Ｘ3がＰ、Ｓ又はＡであり、ただしＸ1Ｘ2Ｘ3はＧＧＰではなく、Ｘ4がＡであり、Ｘ5がＳ、Ｈ又はＦであり、かつＸ6がＡであって該改変シグナルペプチドのＣ末端に位置する、
    使用。
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