JPH05509001A - 有効な分泌用ベクター類の迅速選択方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 有効な分泌用ベクター類の迅速選択方法関連出願に対する相互参照 本出願は、１９９０年８月２８日出願した共出願の米国特許出願連続番号０７１ ５７３、７５９の部分的継続である。

発明の分野 本発明は、その蛋白質を生産するように形質転換されたバクテリアによる蛋白質 の分泌を最大限にするベクターの迅速選択方法に関する。

発明の背景 枯草菌（Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ）　、即ちグラム陽性バクテリアは、商業的に 重要な蛋白質を生産するための大きな潜在性を有している、何故ならば、これは 遺伝操作でき、増殖に関する種々の栄養的および物理的条件に適合でき、更にこ れは、ヒトに対して病原性を示さずまた毒性も示さないためである。また、これ らのバクテリアは、適当な条件下、他の蛋白質の含有量を比較的低く抑えながら 、特異的蛋白質の合成、輸送および分泌を行い、その結果これらの蛋白質の精製 を容易にする。

バクテリアの膜を横切る分泌蛋白質の輸送にはシグナルペプチドが必要であると 一般的に理解されている。蛋白質分泌におけるシグナルペプチドの役割を理解す るため、数多くの研究が成されてきたが、上記輸送のメカニズム、並びにシグナ ルペプチドが輸送に与える影響、そして分泌された成熟蛋白質を収穫するためシ グナルペプチド−成熟蛋白質の複合体からそのシグナルペプチドを取り出すこと 、に関する正確な様式は充分には理解されていない。

枯草菌による数多くの異なる非相同性蛋白質の分泌を可能にするベクター類が示 された。Ｎａｇａｒａｊａｎ他の米国特許番号４．８０１．５３７：　５ｔｅｐ ｈｅｎｓ他の米国特許番号４．７６９．３２７および「バイオテクノロジーハン ドブック・２、バチルス属Ｊ　（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｈａｎｄｂｏｏ ｋ　２、Ｂａｃｉｌｌｕｓ）　、Ｃ，Ｒ，Ｈａｒｖｏｏ（Ｉ編集、Ｐｌｅｎｕｍ 　ＰｒｅｓｓＳＮｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８９）参照。これらには、細胞外酵素 、例えばアミラーゼ、プロテアーゼ、レバンスクラーゼおよびβ−ラクタマーセ 類のための遺伝子を基にしたベクター類が含まれる。

Ｐａ１ｖａ他は、枯草菌による大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）の非相同性蛋白質β− ラクタマーゼの分泌（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７ ９．５５８２−５５８６、（１９８２））、並びにベクターを用いた該バクテリ アの形質転換によるヒト白血球インターフェロン［ここで、大腸菌のβ−ラクタ マーゼのための遺伝子とヒト白血球インターフェロンとが、使用可能なように、 プロモーター、リポソーム結合部位、そして澱粉液化バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕ ｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）からのα−アミラーゼ遺伝子のシグ ナル配列、に連結させられティる］の分泌を示した（Ｇｅｎｅ　２２．２２９− ２３５、（１９８３））　、彼らは、少量のみのインターフェロンが分泌される ことを見い出した。

５ｃｈｅｉｎ他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　４．７１９−７２５、（１９８ ６）は、このインターフェロンの収率が何故そのように低いかを示すための研究 を行った。彼らは、Ｐａ１ｖａ他と同様、成熟インターフェロン配列の第一コト ンに該α−アミラーゼシグナル配列を正確に融合させた以外は、本質的に同じベ クターを用いた。分泌されたインターフェロンのレベルは、α−アミラーゼの約 １〜３％のみであった。注意深い分析を行った結果、この低いインターフェロン 収率は、枯草菌中の非相同インターフェロン遺伝子の発現によるものではなく、 有効に該インターフェロン−シグナルペプチドの複合体を輸送する能力、モして ／またはその成熟インターフェロンに切断する枯草菌の能力、が低いことによる ものである、と彼らは結論付けた。

Ｕ１ｍａｎｅｎ他、Ｊ、　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１６２巻、１７６−１ ８２頁、（１９８５）は、Ｐａ１ｖａ他および５ｃｈｅｉｎ他と同様、プラスミ ド中、該プロモーターと澱粉液化バチルスα−アミラーゼ遺伝子のシグナル配列 とを結合させることにより分泌用ベクターを構築した後、このベクターを用いて 彼らは、ＴＥＭ−β−ラクタマーゼおよびセムリキ森林熱ウィルス糖蛋白質Ｅ１ の遺伝情報を指定する非相同遺伝子の発現および分泌を、このようにして創作し たベクターで形質転換した枯草菌中での澱粉液化バチルスα−アミラーゼのそれ と比較した。ＴＥＭ−β−ラクタマーゼに関する培地中の収率（分泌された）は 約１０％であり、モしてＥｌのそれは、α−アミラーゼのそれの約０．０１％で あった。この著者らは、このＴＥＭ−β−ラクタマーゼの低収率は宿主プロテア ーゼ類による劣化のためであるが、Ｅｌの低収率は不充分な分泌によるものであ る、と結論付けた。

レバンスクラーゼを基とした分泌用ベクターは、Ｄｉｏｎ他、Ｂｉｏｃｈｉｍｉ ｅ７１．７４７−７５５、（１９８９）によって報告された。Ｄｉｏ口他は、レ バンスクラーゼに比較して低いレベルのマウスインターフェロンを得た。この低 い収率は、この切断領域の二次構造によるものではなかった。これは、この枯草 菌レバンスクラーゼ遺伝子のシグナル配列とマウスインターフェロンα２遺伝子 との間の、よくは理解されていない塩基不適合性によるものであろう、とこの著 者らは示唆している。

１つはバチルス・！ノケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒ ｍｉｓ）ベニシリナーゼ遺伝子のシグナル配列（ｐｅｎ　Ｐベクター）を有して おり、そしてもう１つは、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕ ｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）　ａ−アミラーゼ遺伝子のシグナ ル配列（ａｌ！ｌｙＴベクター）を有している点で異なるところの、２つの分泌 用ベクタープラスミド類が、Ｉｌｌｉｍｅｎｏ他、ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ ｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　３５．１７−２１、（１９８６）によって構築され た。この実験者らは、次に、これらのベクターの各々に、〕）ペペニシリン１２ ）アミラーゼＴ１および３）ヒト唾液α−アミラーゼ、をコード化するＤＮＡ配 列を使用可能なように結合させた後、これらのベクターの各々で形質転換した枯 草菌によるこれら３種蛋白質の生産そして培地中への分泌を測定した。彼らは、 どちらのベクター中でもヒト唾液α−アミラーゼ遺伝子が発現しないこと：両方 のベクターに組み込んだときペニシリンＰが有効に分泌されること：該ａｍｙＴ ベクターに組み込んだときα−アミラーゼは有効に分泌されるが、該ｐｅｎ　Ｐ ベクターに組み込んだときの有効性は約３％のみであること：を見い出した。シ グナル配列および細胞外酵素の成熟蛋白質は蛋白質分泌にとって重要であるばか りでなく、これらの２つの組み合わせも重要であると、彼らは結論付けた。ペニ シリナーゼおよびα−アミラーゼの分泌メカニズムの間にはい（つかの差異があ り、これらには、シグナルの除去および増殖培地への放出が含まれる。これらの 差異は、Ｌａｍｐｅｎ他、「バチルス属の遺伝学およびバイオ技術Ｊ　（Ｇｅｎ ｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｂａｃｉｌｌｉ）　 １２９−１４０頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８４）　（ここでは 参照にいれられる）の本で考察されている。上記Ｈｉｍｅｎｏ他が示したように 、増殖培地へのベニシリナーゼの分泌には、多重切断と、下記の一連の出来事と が連続して生じる必要がある：ａ）シグナルペプチドの切断、ｂ）膜結合中間体 への修飾、Ｃ）引き続（切断、モしてｄ）増殖培地への放出。逆に、α−アミラ ーゼの分泌には、単一シグナルペプチドの切断そして増殖培地への放出が必要で ある。従って、Ｈｉｍｅｎｏ他によって記述されたベクター類は、枯草菌のため の最も有効な分泌用ベクターを同定することを可能にするものではない、何故な らば、ペニンリナーゼを基としたベクター類は、常に、膜結合中間体を有してお り、そしてこれらは、アミラーゼを基としたベクター類よりも有効ではないから である。

非相同性蛋白質の分泌効率は異なっておりそしてこの観察された差異の理由が理 解されていないことは、今日までに構築された種々の分泌用ベクターから明らか である。従って、シグナルペプチドと成熟蛋白質とから成るいかなる組み合わせ がその成熟蛋白質の有効な分泌をもたらすかは予測できるものではない。従って 、遺伝工学処理された枯草菌で生産することが望まれている全ての蛋白質に対し て、どの分泌用ベクターが有効な分泌を可能にするかを迅速同定するための方法 、に対する必要性が存在している。本発明の方法は、興味の持たれているポリペ プチドもしくは蛋白質をコード化するＤＮＡを有するいくつかの給源からの、プ ロモーター、リポソーム結合配列およびシグナルペプチド、をコード化するＤ　 Ｎ　Ａ配列の簡潔な組み合わせを可能にし、そしてどの組み合わせが成熟ポリペ プチドもしくは蛋白質の最良分泌を与えるかを測定することによって、上記に対 する解決を与えることを意図したものである。

発明の要約 本発明は、 （Ａ）少なくとも２つの異なるベクターにおいて、シグナルペプチド配列をコー ド化するＤＮＡ配列に成熟蛋白質をコード化するＤＮＡ配列を使用可能なように 連結させ、ここで、１）各々のベクターにおいて、上記シグナル蛋白質をコード 化する上記ＤＮＡ配列は、単一遺伝子からのそれに対して相同性を示し、ａ）上 記シグナル蛋白質をコード化する上記ＤＮＡ配列は、プロモーターおよびリポソ ーム結合部位をコード化するＤＮＡ配列に使用可能なように連結させられており ： ２）異なるベクターにおいて、上記シグナル蛋白質をコード化する上記ＤＮＡ配 列は、異なる単一遺伝子のＤＮＡ配列に対して相同性を示し、 ａ）異なるベクターにおいて、上記シグナル蛋白質をコード化する上記ＤＮＡ配 列は、プロモーターおよびリポソーム結合部位をコード化するＤＮＡ配列に使用 可能なように連結させられており：そして ３）各々の成熟蛋白質をコード化する配列の５゛末端は、このシグナル蛋白質を コード化するＤ　Ｎ　Ａ配列の３′末端上の制限エンドヌクレアーゼ部位に対し て適合性を示す制限エンドヌクレアーゼ部位を有しており、 ａ）上記制限エンドヌクレアーゼ部位は、これらの異なるベクターの各々中で適 合性を示し； （Ｂ）（Ａ）のベクター類でバクテリアを形質転換し：（Ｃ）どの形質転換され たバクテリアが最も効率良く前駆蛋白質を成熟蛋白質に変換するかを測定し：そ して（Ｄ）前駆蛋白質を成熟蛋白質に最も効率良く変換するところの、その形質 転換したバクテリアからベクターを選択する：ことから成る、バクテリアによる 成熟蛋白質の分泌を最大限にするベクターの選択方法から成る。

図１は、ａｐｒ遺伝子を基とする分泌用ベクター（ｐＢＥ２６）のプラスミド地 図である。このシグナルペプチド切断領域のＤＮＡ配列そして新しく工学処理さ れたＥｃｏＲＶ部位の位１がボされている。

図２は、ｂａｒ遺伝子を基とする分泌用ベクター（ｐＢＥ３９）のプラスミド地 図である。このシグナルペプチド切断領域のＤＮＡ配列そして新しく工学処理さ れたＥｃｏＲＶ部位の位置が示されている。

図３は、５ａｃＢ　（ｌｖｓ）遺伝子を基とする分泌用ベクター（ｐＢＥ３１１ ）のプラスミド地図である。このシグナルペプチド切断領域のＤＮＡ配列そして 新しく工学処理されたＥｃｏＲＶ部位の位置が示されている。

図４は、ｎｐｒを基とする分泌用ベクターのプラスミド地図である。このシグナ ルペプチド切断領域のＤＮＡ配列モしてＥｃｏＲＶ部位の位置が示されている。

図５は、ａｐｒ、　ｎｐｒ、　ｂａｒおよびｌｖｓ　（ｓａｃＢ）分泌用ベクタ ーの図式的表示である。種々の融合で用いたい（つかの関連制限部位が示されて いる。

これらのシグナルペプチドの主要アミノ酸配列もまた示されている。

図６は、表１に挙げる種々のハイブリッド蛋白質に関する分泌効率分析である。

これらのバクテリアを３Ｈ−ロイシン（１２５ｕＣｉ／ｍＬ）で１分間標識した 後、５０ｕＭのｃｃｃｐ有り無しで０，１および２分間追跡した。Ｐ−は前駆体 を表し、モしてｍ−は成熟蛋白質を表す。

発明の詳細な記述 ここでは下記の定義を用い、そして請求の範囲を解釈するために表す。

「前駆蛋白質」は、シグナルペプチドおよび成熟蛋白質の全てを含む蛋白質生産 物である。

「成熟蛋白質」は、付着したシグナルペプチドのいかなる部分も有していない最 終的蛋白質生産物である。

「所望蛋白質」は、遺伝工学処理したバクテリアから得られる価値有る生産物と 考えられるいずれかの蛋白質である。

「分泌効率」は、前駆蛋白質が成熟蛋白質に変換される度合である。

「シグナルペプチド」は、分泌された成熟蛋白質の前方にあるアミノ末端ポリペ プチドである。このシグナルペプチドは該成熟蛋白質から切断され、従ってその 中には存在していない。シグナルペプチド類は、細胞膜を横切って、分泌蛋白質 を導きそして輸送する働きを有する。シグナルペプチドはまたシグナル蛋白質と も呼ばれる。

「相同性を示す制限部位」は、切断したときいかなる追加的修飾も無しで結合し 得るヌクレオチド末端を生じるところの、異なる制限部位である。

ｒａｐｒＪは、アルカリ性プロテアーゼ遺伝子である。

ｒｂａｒＪは、細胞外リボヌクレアーゼ遺伝子である。

ｒｓａｃＢＪまたはｒｌｖｓＪは、レバンスクラーゼ遺伝子である。

「ｎｐｒＪは、中性プロテアーゼ遺伝子である。

「シャトルファージミド」は、通常二本鎖でありそして大腸菌および枯草菌のた めの複製開始点の両方を有しそしてまた一本鎖ＤＮＡ製造のためのＦ１遺伝子内 領域を有するベクターである。

言葉「ペプチド」、「ポリペプチド」および「蛋白質」は、交換可能様式で用い る。

言葉「制限エンドヌクレアーゼ切断部位」および「制限部位」は、交換可能様式 で用いる。

ここで用いる遺伝工学の適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、「分子クローニン グ：実験室マニュアルＪ　（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、■、２．３巻（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　 Ｈａｒｂｏｒｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ ｏｒ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８９）　（ここでは参照にいれられる）そして遺伝工 学のための市販キットに付随した説明書中に記述されている。本発明を実施する ために必要なバクテリア培養物およびプラスミド類は、商業的に入手可能であり 、そしてそれらの給源と一緒に、下記の本文および実施例中で同定する。

本発明のベクター類のための適切な宿主バクテリアはグラム陽性バクテリアから 成る。好適なものは、バチルス属に属するものである。これらは、Ｂａｃｉｌｌ ｕｓ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　５ｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ　（ＢＧＳＣ）、Ｔｈｅ　 ０ｈｉｏ　５ｔａｔｅ　ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＳＣｏｌｕｍｂｕｓ、　０ｈｉｏ 　４３２１０またはＴｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃ ｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　１２３０１　Ｐａｒｋｌａｖｎ叶、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ ＳＭＤ　２０８５２から入手できる。

特に好適なものは枯草菌である。ここでの使用に適切なバクテリアはまた大腸菌 である。

本発明の方法は、２種以上の分泌用ベクターを、それらが有するいずれかの所望 蛋白質分泌効率に関して比較することを含む。本発明の方法およびベクターによ って分泌され得る興味の持たれている蛋白質には、これに限定されるものではな いが、 ■　好熱菌および中温菌から得られる産業用酵素ｅ）アミラーゼ ｆ）セルラーゼ ｋ）トランスフルクトシラーゼ １）ラクターゼ ｍ）グルコース・イソメラーゼ ｎ）ホスファターゼ Ｉｌ、　ビオチン結合蛋白質 ＩＩｌ、免疫グロビン結合蛋白質 ａ）蛋白質入 ｂ）蛋白質Ｇ Ｃ）蛋白質Ｌ ＩＶ、免疫グロビン類 ■　レセプタ蛋白質 Ｖｌ、構造蛋白質 シルク蛋白質 エラスチン ＶＩｌ、ウィルス蛋白質 ａ）プロテアーゼ ｂ）逆転写酵素 Ｃ）エンベロープ蛋白質 ＶＩ　Ｉ　１．　微生物および原生動物からの抗原。

上記蛋白質の例には、これに限定されるものではないが、ブドウ球菌属の蛋白質 Ａ、レバンスクラーゼ、バルナーゼまたはストレプトアビジンが含まれる。

本発明の分泌用ベクター類は、転写を制御する調節可能プロモーター配列、翻訳 を制御するリポソーム結合部位のための配列、そしてバクテリア膜を通しての該 ペプチドの輸送および成熟蛋白質からのシグナルペプチドの切断を可能にするシ グナルペプチドのための配列、を含んでいる。

この必要な第一構成要素は、異なる遺伝子からの、プロモーター、リポソーム結 合部位およびシグナルペプチド、をコード化するＤＮＡ配列の工学処理を可能に するベクターである。適切なベクター類は、用いるバクテリアに対して適合性を 示すものである。例えば、枯草菌に対して適切な上記ベクター類には、大腸菌− 枯草菌シャトルベクターが含まれろ。これらは、適合性を示す連節配列および複 製開始点を有している。

これらは、好適にはマルチフピーであり、そして選択マーカー遺伝子、例えば抗 生物質耐性の情報を指定する遺伝子、を有する。例えば、ｐＴＺ１８Ｒは、Ｐｈ ａｒｍａｃｉａ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ　０８８５４から入手可能な ファーンミドであり、そしてこれは、大腸菌中でアンピシリンに対する耐性を与 え、そしてＢＧＳＣからのｐＣ１９４は、大腸菌および枯草菌中でクロラムフェ ニコール（ｃｍ’）に対する耐性を与える。

このプロモーター、リポソーム結合部位およびシグナルペプチドをコード化する ＤＮＡ配列は、分泌される生産物をコード化するいずれかの単一遺伝子からのも のであってもよい。このプロモーターおよびリポソーム結合部位をコード化する ＤＮＡ配列はまた、該シグナルペプチドをコード化するＤＮＡ配列とは異なる遺 伝子からのものであってもよい。

このプロモーター、リポソーム結合部位およびシグナルペプチドをコード化する これらのＤＮＡ配列は、本分野の技術者によく知られた手段で単離できそして説 明的例が文献中に示されている。「バイオチク、ノロジ−ハンドブック・２、バ チルス属Ｊ　（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　２、Ｂａｃｉ ｆｌｕｓ）、Ｃ，Ｒ，Ｈａｒｖｏｏｄ編集、Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅ ｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８９）　（ここでは参照にいれられる）参照。このＤＮＡ 配列中のプロモーターは、構成もしくは誘導のどちらかであってもよ（、従って 、得られる分泌用ベクターを別々に調節することも可能である。一度最良のシグ ナルペプチドが選択されると、異なる給源から得られそして異なる種類の制御下 に在るプロモーター類は、個々に、リポソーム結合部位およびシグナル配列と会 合することで、所望蛋白質の最良収率を与える様式の調節を生じさせると考えら れる。

このシグナルペプチドをコード化するＤＮＡの３′末端に制限エンドヌクレアー ゼ切断部位を付加させることもまた、本分野の技術者によく知られた手段で容易 に達成され、そしてこれは上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ他によって記述されている。こ のシグナルペプチドをコード化するＤＮＡの３′末端に該制限エンドヌクレアー ゼ切断部位を付加させるための１つの特別に有益な手段は、Ｖａｓａｎｔｈａ他 、Ｇｅｎｅ、　７６．５３−６０、（１９８９）　（ここでは参照にいれられる ）によって記述された如き通常の部位特異的変異誘発手段によるものである。所 望蛋白質をコード化するＤＮＡ配列を単離するための手段、およびこのＤ　Ｎ　 Ａ配列の５°末端上への制限部位の付加は、本分野の技術者によく知られており 、そしてこれは上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ他１こよって記述されている。いかなる制 限エンドヌクレアーゼ部位も使用できるが、そのベクターにユニークな制限部位 の使用が望ましい。このシグナルペプチドをコード化するＤＮＡ配列の３゛末端 上の制限エンドヌクレアーゼ部位と、この所望蛋白質をコード化するＤＮＡ配列 の５°末端上のそれとは、適合性を示す必要がある。適切な適合性を示す制限部 位は本分野でよく知られている。例えば、［ニューイングラントノ〈イオラポ１ ９８ｇ−１９８９カタログの制限フラグメント適合表Ｊ　（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉ ｏｎ　ＦｒａｇｍｅｎｔＣｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ　Ｔａｂｌｅ　ｏｆ　ｔｈ ｅ　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　１９８ｇ−１９８９Ｃａｔａｌ 。

ｇ）　、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　Ｉｎｅ、、Ｂｅｖｅｒｌｙ 、、Ｍ＾０１９１５　（１９８８）　（ここでは参照にいれられる）参照。ここ での使用に好適なものはＥｅｏＲＶである。

その３′末端に制限部位を有するところの、プロモーター、リポソーム制限部位 およびシグナルペプチドをコード化する組み合わせたＤＮＡ配列と、その５°末 端に適合性を示す制限部位を有するところの、成熟ポリペプチドもしくは蛋白質 をコード化するＤＮＡ配列とを、通常技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、上記；　Ｈａ ｒｖｏｏｄ上記）により使用可能なように一体化させることができる。

各々が異なる遺伝子からの、プロモーター、リポソーム結合部位およびシグナル ペプチド、をコード化するＤＮＡ配列を有しそしてこのシグナルペプチドコード 化配列の３′末端に適合性を示す制限部位を有するいくつかのベクターが利用で き、そしてこれらの各々を、所望蛋白質をコード化するＤＮＡ配列と一緒に組み 合わせた後、これらのベクター類を、適切なバクテリアを形質転換するために用 いる。枯草菌バクテリアを形質転換するための１つの従来方法が、Ｖａｓａｎｔ ｈａ他、Ｊ、ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉ。

１、１５９．８１１−８１９、（１９８４）　（ここでは参照にいれられる）に よって記述されている。本分野の技術者によく知られた標準微生物方法がバクテ リア培養の増殖および維持に使用できる。

この成熟蛋白質が培地に分泌される効率は、Ｎａｇａｒａｊａｎ著、「酵素学の 方法Ｊ　（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）　１８５．２１４− ２２３、（１９９０Ｘここでは参照にいれられる）に記述されているように、こ れらのベクターを有する形質転換バクテリアを放射能標識した後、各々のポリペ プチドに特異的な抗体でクローン化した所望ポリペプチドを免疫沈澱させ、そし てこの放射能活性材料を添加した後、異なる時間で前駆蛋白質と成熟蛋白質との 比率を測定する、ことによって測定される。免疫沈澱した蛋白質を、ポリアクリ ルアミドゲル電気泳動で分離した後、オートラジオグラフィーで可視化する。こ の前駆蛋白質の大きさは常に成熟蛋白質よりも大きい、と言うのは、これはその シグナルペプチドと共に成熟ポリペプチドの全てを有しているからである。

どの形質転換バクテリアが最も効率良（所望蛋白質を分泌するかを測定した後、 このベクターは、Ｖａｓａｎｔｈａ他、Ｊ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１５ ９．８１１−８１９、（１９８４）　（ここでは参照にいれられる）が記述しれ たような、プラスミドを回収するための標準方法によって、回収することができ る。

これらの例から、ポリペプチド類の分泌効率は、該ベクター中のそのシグナルペ プチドと成熟蛋白質との組み合わせに応じて変化することは明らかである。それ らの３′末端に適合性を示す制限部位を有する異なるシグナルペプチドをコード 化するＤＮＡ配列を有するベクター類に対して容易に工学処理できる所望蛋白質 いずれかの分泌効率を比較することにより、成熟所望蛋白質の最良分泌を与える ベクターを選択することが可能になる。

下記の実施例により本発明の詳細な説明するが、いかなる方法でもそれを制限す ることを意図したものではない。４種の分泌用ベクター類を構築し、そして本発 明の方法を示すための下記の実施例中で用いた。下記は、１）澱粉液化バチルス のアルカリ性プロテアーゼ遺伝子、２）澱粉液化バチルスのバルナーゼ遺伝子、 ３）澱粉液化バチルスのレバンスクラーゼ遺伝子、および４）澱粉液化バチルス の中性プロテアーゼ遺伝子、のための、プロモーター、リポソーム結合部位、お よびシグナルペプチド、をコード化する組み合わされたＤＮＡ配列の給源を与え るものＡ）アルカリ性プロテアーゼ遺伝子からのプロモーター、リポソーム結合 部位およびシグナルペプチドのためのＤＮＡ配列を用いたベクター構築 アルカリ性プロテアーゼのための遺伝子を、例えばＶａｓａｎｔｈａ他、Ｊ、　 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　１５９．８１１−８１９、（１９８４）　（ここでは参照 にいれられる）によって以前に記述された通常手段により、澱粉液化バチルスか ら単離した。

これを、ｐＢＥ２０、即ちｐ　Ｔ　Ｚ　１８　Ｒ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ１８００ 　ＣｅｎｔｅｎｎｉａｌＡｗｅＳＰｉｓｃａｔａｖａｙ、　ＮＪ　０８８５４） とｐ　Ｃ１９４（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋＣｅｎｔｅｒ 　（ＢＧＳＣ）、０ｈｉｏ　５ｔａｔｅ　ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＳＣｏｌｕｍｂ ｕｓ、　０ｈｉｏ）とを結合させることによって構築した大腸菌−枯草菌シャト ルファージミド、に挿入した。この得られるベクターはｐＢＥ２５、即ち澱粉液 化バチルスからのアルカリ性プロテアーゼ遺伝子（ａｐｒ）を有する大腸菌−枯 草菌シャトルファージミドベクターである。例えば、Ｖａｓａｎｔｈａ他、Ｇｅ ｎｅ、　７６．５３−６０、（１９８９）　（ここでは参照にいれられる）によ って記述されているように、部位特異的変異誘発に関する通常手段により、この アルカリ性プロテアーゼ遺伝子のシグナルペプチドをコード化するＤＮＡ配列の ３゛末端に、ＥｃｏＲＶ制限部位を工学処理し、その結果ｐＢＥ２６が得られた 。ｐＢＥ２６の制限地図、そして該ＥｃｏＲＶ部位の回りのＤＮＡ配列を図１に 示す。

Ｂ）バルナーゼ遺伝子からのプロモーター、リポソーム結合部位およびシグナル ペプチドのためのＤＮＡ配列を用いたベクター構築ｐＢＥ２２は、澱粉液化バチ ルスからのバルナーゼ（細胞外リボヌクレアーゼ）遺伝子を有する大腸菌−枯草 菌シャトルファージミドベクターである。ｐＢＥ２２は、標準組換えＤＮＡ技術 （ＳａＩＩｂｒｏｏｋ他、上記）で、ｐ　ＭＴ　７１　（Ｒｏｂｅｒｔ　Ｈａｒ ｔｌｅｙ博士、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｔｅ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ 、　Ｂｅｔｈｅｓｄａ、　Ｍａｒｙｌａｎｄから入手）　（Ｐａｄｄｏｎ他、Ｊ 、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１７１．１１８５−１１８７　（１９８９））から のＥｃｏＲ１フラグメントをｐＢＥ２０にサブクローニングすることによって構 築した。ｐＢＥ２０の製造は、以下のＣ）項中に記述されている。部位特異的変 異誘発により、ＥｃｏＲＶ部位をこのバルナーゼシグナルの１コドン下流に工学 処理した（Ｖａｓａｎｔｈａ　＆　Ｆｉｌｐｕｌａ。

上記）。この新規なＥｃｏＲＶ部位の回りのＤＮＡ配列およびｐＢＥ３９の制限 地図を図２に示す。

Ｃ）レバンスクラーゼ遺伝子からのプロモーター、リポソーム結合部位およびシ グナルペプチドのためのＤＮＡ配列を用いたベクター構築１１ｉｎｄＩＩＩ消化 したｐ　Ｔ　Ｚ　１８　Ｒ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　８００　Ｃｅｎｔｅｎｎｉ ａｌ＾ｖｅ０、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ　ＮＪ　０８８５４）　（これは、大腸菌 のための複製開始点、Ｆｌ　ｏｒｉおよび抗生物質耐性マーカーａＩＩｌｐＲを 有する）を、ＨｉｎｄＩＩＩ消化したｐＣ１９４（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｔｏｃ ｋ　Ｃｅｎｔｅｒ、　０ｈｉｏ　５ｔａｔｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、　Ｃｏｌ ｕｍｂｕｓ１０■４３２１０）　、即ち黄色ブドウ球菌のプラスミド（これは、 枯草菌中のマルチコピープラスミドでありそして枯草菌に関する選択のためのク ロラムフエニコル耐性マーカーを有する）に結合させることによって構築した。

ｐＢＥ３０１を下記のようにして製造した。この適当な配列を有するクローンを 同定するための手段としてオリゴヌクレオチドプローブを用いて、該澱粉液化バ チルス染色体のλＺＡＰライブラリーから、レバンスクラーゼ（ｓａｃＢ）の遺 伝情報を指定する澱粉液化バチルスの５ａｃＢ　［ＢａＩＩＩＰ］遺伝子を単離 した。製造業者の説明に従って、市販のＥｃｏＲＩ消化λ−ＺＡＰのＤＮＡおよ びＧｉｇａパックプラス（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　１１０９　Ｎｏｒｔｈ　Ｔ ｏｒｒｅｙ　Ｐｉｎｅｓ　Ｒｄ、、Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ　９２０３７）を 用いて、この澱粉液化バチルスのλライブラリーを構築した。３０個の塩基から 成る２つのオリゴヌクレオチドプローブを各々合成した。プローブ５２１４２− ２ＮＰは配列ＧＡＣＧＴＴＧＧＧＡＣＡＧＣＴＧＧＣＣＡＴＴ／１．ｃＡＡＡＡ ｃを有しており、そしてプローブ５２１４２−３ＮＰは配列ＡＴＧＡＡＣＧＧＣ ＡＡＡＴＧＧＴＡＣＣＴＧＴＴＣＡＣＴＧＡＣを有していた。Ｍａｎｉａｔｉｓ 他、「分子クローニング：実験室マニュアルＪ　（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏ ｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、１２２頁（Ｃｏｌｄ 　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ ｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎ６ｖ　Ｙｏｒｋ、１９８９）　（ここでは参照にい れられる）に記述されているように、各々のプローブの１ミクロリツトル（４０ ０ｎ　ｇ）サンプルを、３２Ｐ２ＡＴＰで５゛末端標識した。これらの２つのプ ローブの同量をプールした後、混合した。（Ｍａｎｉａｔｉｓ他が記述している 全ての方法は本分野で通常である。）宿主細胞として大腸菌株ＢＢ４を用い、そ してこれを、５ミクロリツトルの澱粉液化バチルスλＺＡＰファージで感染させ た。３．０ｍＬのＮ２７Ｍトップ寒天を用いた混釈平板法により、これらの感染 細胞を８枚のＮＺＹＭプレート上に、プレート当たり１０００〜１５００個から 成るプラーク濃度に成るように播いた。プレートを３７℃で一晩培養した。この 得られるプラークからのＤＮＡをニトロセルロースフィルターに転移させた。次 に、放射能標識したオリゴヌクレオチドプローブを用いて、その澱粉液化バチル スｓａｃ　［ＢａｍＰ］の存在に関して、これらのフィルターをスクリーニング した。これらの標識したプローブ（６０ｎ　ｇ）を該ニトロセルロースフィルタ ーに、６ｘ　５ＳＣ１０，５％ＳＤＳ緩衝液中３７℃で１６時時間積形成させた 。これらのニトロセルロースフィルターを６ｘ　５ＳＣ１０，１％ＳＤＳ緩衝液 中で洗浄した。この第一洗浄は室温で行い、そして第二洗浄を３７℃で行った。

これらのフィルターに関する引き続くオートラジオグラフにより、これらのプロ ーブに雑種形成した５個のクローンが見いだされた。これらのフィルターを再び ３７℃で洗浄した。これらのフィルターに関して得られるオートラジオグラフに より、これらのプローブに対して雑種形成したＤＮＡを潜在的に含有している２ つのクローン（２Ａおよび２Ｃと表示）が示された。これらのプローブで雑種形 成したプラークを単離した後、そこにあるファージを、上記Ｍａｎｉａｔｉｓ他 に従って精製した。感染およびスクリーニング操作を繰り返した後（′ｓニスク リーン）、クローン２Ａおよび２Ｃから得られるプラークの約２０％および８０ ％を、それぞれ、これらのプローブに対して雑種形成させた。その後、これらの 第ニスクリーンから得られる陽性プラークを選択し、ファージを調製した後、更 にスクリーニングした。第三スクリーンから得られるオートラジオグラフは、こ れらのプラークの全てがそのオリゴヌクレオチドプローブに雑種形成したことを 示していた。製造業者（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、１１０９Ｎｏｒｔｈ　Ｔｏｒｒ ｅｙ　Ｐｉｎｅｓ　Ｒｄ、、Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ　９２０３７）の説明に 従って、推定５ａｃＢ　［ＢａｍＰ］遺伝子配列を有するλＺＡＰファージクロ ーン２Ａおよび２Ｃをブルースクリプト（Ｂｌｕｅ　５ｃｒｉｐｔ）プラスミド ベクターに変換した。λＺＡＰ　２Ｃクローンから得られるブルースクリプトプ ラスミドをｐＢＥ３０１と表示した。ｐＢＥ３０１から得られる５ａｃＢ　［Ｂ ａｍＰ］フラグメントをＥｃｏＲＶ−ＸｂａＩフラグメントとして単離した後、 ｐＢＥ２０の５ｉａＩ−ＸｂａＩフラグメントに結合させ、その結果として、ｐ ＢＥ５０１を生じさせた。部位特異的変異により、そのシグナルペプチド中に２ つの新規制限部位を加えることにより、ｐＢＥ５０１からｐＢＥ５０４を製造し た。これらの添加部位は、このシグナルペプチドのアミノ酸配列を変化させなか った。

ｐＢＥ５０４において、非相同性遺伝子融合を容易にする目的で、インビトロ変 異誘発キット（ＢｉｏＲａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　１４１４　ｈｒｂ ｏｒ　ｗａｙ　５ｏｕｔｈ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ９４８０４）中、Ｂｉ ｏＲａｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅファージミドを用いることで、そのシグナルペプチ ドのプロセシング部位から２コドン下流にＥｃｏＲＶ部位を創作し、その結果と して、ｐＢＥ３１１を生じさせた。ｐＢＥ３１１のプラスミド地図、そしてこの シグナル配列を横切るＤＮＡ配列を図３に示す。

Ｄ）中性プロテアーゼ遺伝子からのプロモーター、リポソーム結合部位およびシ グナルペプチドのためのＤＮＡ配列を用いたベクター構築Ｖａｓａｎｔｈａ他、 Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１５９．８１１−８１９　（１９８４）に記述さ れているように、この中性プロテアーゼのための遺伝子を澱粉液化バチルスから 単離した後、この結果としてプラスミドｐＢＥ９を生じさせた。ＰｅｒｋｉｎＥ １ｍｅｒサーモサイクラ−を用いたポリメラーゼ鎮反応（ＰＣＲ）により、この ｎｐｒのプロモーター、リポソーム結合部位およびシグナルペプチドのためのＤ ＮＡ配列を単離した。このｎｐｒ遺伝子にアニールした２つのオリゴヌクレオチ ド（５’　ＣＧＧＡＣＧＡＴＡＴＣＣＴＣＡＧＣＧＧＣＣＴＧ３’および５’　 ＡＴＧＣＡＴＧＧＴＡＣＣＧＡＴＣＴＡＡＣＡＴＴＴＴＣＣＣＣ３°）を、この ＰＣＲ反応のため用い、そしてｐＢＥ９を鋳型として用いた。これらのオリゴヌ クレオチドは、このプロモーターの５゛末端にアニールしたオリゴヌクレオチド がＫｐｎＩ部位をコード化するように設計した。このシグナルペプチドコード化 領域の３゛末端にアニールしたオリゴヌクレオチドはＥｃｏＲＶ部位をコード化 した。このＰＣＲ生産物を濃縮した後、クレノーフラグメントで処理して、いか なる不完全な末端も充填した後、ＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＶを用いた消化を行っ た。

製造業者の説明（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ　ｆｉｔ、　Ｐ、Ｏ，Ｂｏｘ　２２８４、 Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ　９２０３８）に従いＧｅｎｅｃｌｅａｎを用いて、 この３４０　ｂｐ　ＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＶフラグメントを精製し、そして非相同 性遺伝子融合のためのｎｐｒプロモーター、リボゾーム結合部位およびシグナル ペプチドが得られた。

実施例２ この実施例は、実施例１に記述した分泌用ベクターを用いて、与えられた成熟非 相同性遺伝子いずれかに対して、いくつかの異なるシグナルペプチドがどのよう に融合できるかを示す。ａｐｒ、　ｎｐｒ、　ｂａｒおよび５ａｃＢベクターの 図式的表示を図５に示す。このシグナルペプチドのプロセシング部位に関するこ のＥｃｏＲＶ部位の位置が示されている。これらのシグナルペプチドの主要アミ ノ酸配列もまた示されている。これらのシグナルペプチドはいかなる主要アミノ 酸相同性も共有していないが、しかし特定の共通する構造的特徴を共有している 。これらのａｐｒＳｎｐｒＳｂａｒおよび５ａｃＢシグナルペプチドは明らかに 類似しており、そして非相同性蛋白質の輸送に関してどのシグナルペプチドが最 も良く機能するかを予測することは不可能である。

ブドウ球菌属の蛋白質Ａ１バルナーゼおよびレバンスクラーゼを非相同性蛋白質 として用いた。バルナーゼおよびレバンスクラーゼにおけるＥｃｏＲＶ部位の創 作は実施例ＩＢおよびＣに記述した。ブドウ球菌属の蛋白質ＡにおけるＥｃｏＲ Ｖ部位は以下に概略を示すようにして創作した。

ブドウ球菌属の蛋白質Ａ遺伝子（ｓｐａ）の給源は、プラスミドｐＲＩＴ５であ り、これはＰｈａｒＩＩｌａｃｉａ、　８００　Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ　Ａｖｅ ｎｕｅＳＰｉｓｃａｔａｗａｙＳＮＪ０８８５４から入手可能であった。ｐＲＩ Ｔ５をＢｃｌ　１で消化した後、この５°突き出し物を充填することで、Ｅｃｏ ＲＶに対して適合性を示す平滑断端を生じさせた後、Ｐｓｔで切断し、そしてＥ ｃｏＲＶおよびＰｓｔで消化したｐＢＥ２６に結合させた。この結合したＤＮＡ を、枯草菌を形質転換するために用い、そして上記Ｎａｇａｒａｊａｎが記述し た如きコロニー免疫分析により、蛋白質Ａの生産に関して形質転換体をスクリー ニングした。蛋白質Ａを生産するコロニーからプラスミドＤＮＡを単離し、これ は、該ＥｃｏＲＶ部位およびＢｃｌ　１部位の両方共失っていた。このＢｃｌ　 １−ＥｃｏＲＶ接合点の部位特異的変異誘発によりＥｃｏＲＶ部位を再創作した 後、この得られるプラスミドをｐＢＥ４５と表示し、これは、ブドウ球菌の蛋白 質Ａに融合したａｐｒプロモーターとシグナルペプチドを有する（ａｐｒ−ｓｐ ａ）。

遺伝子の給源 ハイブリッド遺伝子１　プラスミド　シグナル＊　成熟Ａｐｒ、、−５ｐａ　Ｉ ）ＢＥ３６〜Ｉ）ＢＨ４５１）ＢＨ２６＋）ＲＩＴ５Ａｐｒ、　、−Ｂａｒ　ｐ ＢＥ５６　ｐＢＥ２６　ｐＢＥ３９＾ｐｒ、　、−Ｌｖｓ　ｐＢＥ３３５　ｐＢ Ｅ４５　ｐＢＥ３１１Ｎｐｒ、　、−３ｐａ　ｐＢＥ８０　ｐＢＥ９のＰＣＲ生 産物　ｐＢＥ４５Ｎｐｒ、　、−Ｂａｒ　ｐＢＥ９５　ｐＢＥ８０　ｐＢＥ５６ Ｎｐｒ、　、−Ｌｖｓ　ｐＢＥ８３　ｐＢＥ８０　ｐＢＥ３４２Ｂａｒ、　、− ３ｐａ　ｐＢＥ５８　ｐＢＥ３９　ｐＢＥ４５Ｂａｒ、、−Ｂａｒ　ｐＢＥ３９ 　ｐＢＥ３９　ｐＢＥ３９Ｌｖｓ　、　、−３ｐａ　ｐＢＥ３　］、２　＋）Ｂ Ｈ３１１ｐＢＥ４５Ｌｖｓ、　、−Ｂａｒ　ｐＢＥ３３６　ｐＢＥ３１１　ｐ８ Ｅ５６Ｌｖｓ、　、−Ｌｖｓ　ｐＢＥ３１１　ｐＢＥ３１１　ｐＢＥ３１１１　 これらの融合は、図５中に示したＥｃｏＲＶ部位で行った。このシグナルペプチ ドをコード化するフラグメントはＫｐｎ　−ＥｃｏＲＶフラグメントとして単離 できた。

＊　プロモーター、リポソーム結合部位およびシグナルペプチドのコード化領域 を含む。

下つきのＳＳはシグナル配列を表す。

実施例３ 実施例３は、シグナルペプチドもしくは成熟配列単独のどちらかによるものでな く、このシグナルペプチドと成熟蛋白質の両方により、どのようにして分泌効率 が測定されるかを示す。

合成培地中で枯草菌細胞を増殖させた後、下記の修飾を用いたＢｏｒｃｈｅｒｔ およびＮａｇａｒａｊａｎＳＪ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１７３：２７６−２ ８２　（１９９１）の記述と同様にして、３Ｈ−ロイシンで標識した。Ａｐｒｌ ＢａｒおよびＮｐｒ融合を有する菌株を、この細胞密度がＯ，Ｄ、６００＝０． ５に到達した３０分後、標識した。５ａｃＢ−融合を有する菌株を、この細胞密 度がＯ，Ｄ、６００＝０．５に到達したとき、２％スクロースで誘発させ、３０ 分後に標識した。３Ｈ−ロイシンで６０秒間バクテリアを標識した後、この放射 能活性を示す材料を、添加未標識ロイシンで追跡し、モして０，１および２分後 サンプルを取り出した。追跡時間０時で一定分量を、５０ｕＭのカルボニルシア ナミドｍ−クロロフェニルヒドラジン（ＣＣＣＰ）が入っている試験管に移した 後、２分間培養した。免疫沈澱化のためサンプルを処理した後、分離した。Ｂｏ ｒｃｈｅｒｔおよびＮａｇａｒａｊａｎＳＪ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１７３ ：２７６−２８２　（１９８１）。

この前駆蛋白質（シグナルペプチド＋成熟蛋白質）と成熟蛋白質の移動度は、そ の大きさが異なるため、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル中では異なっている。図 ５に示すように、種々のハイブリッド蛋白質に関して、追跡時間０時の前駆体と 成熟蛋白質との比率は異なっている。

Ａｐｒシグナルペプチドに融合させたとき、レバンスクラーゼ、パルナーゼおよ び蛋白質Ａに関するシグナルペプチドのプロセシング比率は異なっていた。同様 に、Ｎｐｒシグナルベブチドに融合させたとき、レバンスクラーゼ、バルナーゼ および蛋白質Ａに関するシグナルペプチドのプロセシング比率は異なっていた。

この種々の融合に関する相対的分泌効率を表２に表す。

表２ Ａｐｒ、、　Ｌｖｓ＞Ｂａｒ＞５ｐａ Ｎｐｒ　＋　＊　Ｂａｒ　＞　Ｌｖｓ　＞　５ｐａＢａｒ　＋　ｓ　Ｂａｒ　＞ 　５ｐａ Ｌｖｓ　、、　Ｌｖｓ　＞　Ｓｐａ　＞　Ｂａｒこれらの成熟蛋白質の分泌に関 する相対的効率を、瞬間追跡標識実験を基にして測定した。シグナルペプチドの プロセシング比率（これは、分泌効率の指示である）は、この前駆蛋白質を用い て測定し、該シグナルペプチドもしくは成熟蛋白質単独では測定しなかった。

前記説明から、本分野の技術者は、本発明の本貫的特徴を容易に確かめることが でき、そしてその精神および範囲を逸脱しない限り、種々の用途および条件に本 発明を適合させるため本発明に対する種々の変更および修飾を行い得るものとす る。

要約 バクテリアによる成熟非相同性蛋白質の分泌を最大限にするベクターを迅速に選 択するための方法を記述する。この方法は、異なる給源からの、シグナル配列お よび成熟蛋白質配列を有するいくつかの組換えベクター類の構築を含む。このプ ロモーターおよびリポソーム結合部位はまた、このシグナル配列または成熟蛋白 質配列のそれらとは異なる給源から選択され得る。組換えベクターの迅速構築は 、このシグナル配列の３′末端そしてこの成熟蛋白質配列の５′末端上に適合性 を示す制限部位を選択することによって行われ得る。

国際調査報告 国際調査報告 ＬＩＳ　９１０５９０９ ＳＡ　５１２９９

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. １．（Ａ）少なくとも２つの異なるベクターにおいて、シグナル蛋白質をコード 化するＤＮＡ配列に成熟蛋白質をコード化するＤＮＡ配列を使用可能なように連 結させ、ここで、１）各々のベクターにおいて、上記シグナル蛋白質をコード化 する上記ＤＮＡ配列は、単一遺伝子からのそれに対して相同性を示し、 ａ）上記シグナル蛋白質をコード化する上記ＤＮＡ配列は、プロモーターおよび リボソーム結合部位をコード化するＤＮＡ配列に使用可能なように連結させられ ており；２）異なるベクターにおいて、上記シグナル蛋白質をコード化する上記 ＤＮＡ配列は、異なる単一遺伝子のＤＮＡ配列に対して相同性を示し、 ａ）異なるベクターにおいて、上記シグナル蛋白質をコード化する上記ＤＮＡ配 列は、プロモーターおよびリボソーム結合部位をコード化するＤＮＡ配列に使用 可能なように連結させられており；そして ３）各々の成熟蛋白質をコード化するＤＮＡ配列の５′末端は、このシグナル蛋 白質をコード化するＤＮＡ配列の３′末端上の制限エンドヌクレアーゼ部位に対 して適合性を示す制限エンドヌクレアーゼ部位を有しており、 ａ）上記制限エンドヌクレアーゼ部位は、これらの異なるベクターの各々中で適 合性を示し； （Ｂ）（Ａ）のベクター類でバクテリアを形質転換し；（Ｃ）どの形質転換され たバクテリアが最も効率良く前駆蛋白質を成熟蛋白質に変換するかを測定し；そ して（Ｄ）前駆蛋白質を成熟蛋白質に最も効率良く変換するところの、その形質 転換したバクテリアからベクターを選択する；ことから成る、バクテリアによる 成熟蛋白質の分泌を最大限にする遺伝工学処理ベクターの選択方法。
2. ２．該バクテリアがグラム陽性バクテリアから成る請求の範囲１の方法。
3. ３．該バクテリアがバチルス属から成る請求の範囲１の方法。
4. ４．該バクテリアが枯草菌から成る請求の範囲１の方法。
5. ５．該バクテリアが大腸菌から成る請求の範囲１の方法。
6. ６．該シグナル蛋白質をコード化する該ＤＮＡ配列に使用可能なように連結させ た該プロモーターおよびリボソーム結合部位が該シグナル蛋白質と同じ遺伝子か らのものである請求の範囲１の方法。
7. ７．該シグナル蛋白質をコード化する該ＤＮＡ配列に使用可能なように連結させ た該プロモーターおよびリボソーム結合部位が該シグナル蛋白質とは異なる遺伝 子からのものである請求の範囲１の方法。
8. ８．該ベクター類がｐＢＥ２６、ｐＢＥ３９、ｐＢＥ３１１またはｐＢＥ８０か ら成る請求の範囲１の方法。
9. ９．該成熟蛋白質がブドウ球菌属の蛋白質Ａから成る請求の範囲１の方法。
10. １０．該成熟蛋白質がレバンスクラーゼから成る請求の範囲１の方法。
11. １１．該成熟蛋白質がバルナーゼから成る請求の範囲１の方法。
12. １２．該成熟蛋白質がストレプトアビジンから成る請求の範囲１の方法。
13. １３．請求の範囲１の方法で選択されたベクター。
14. １４．該バクテリアがグラム陽性バクテリアから成る請求の範囲１３のベクター 。
15. １５．該バクテリアがバチルス属から成る請求の範囲１３のベクター。
16. １６．該バクテリアが枯草菌から成る請求の範囲１３のベクター。
17. １７．該バクテリアが大腸菌から成る請求の範囲１３のベクター。
18. １８．該シグナル蛋白質をコード化する該ＤＮＡ配列に使用可能なように連結さ せた該プロモーターおよびリボソーム結合部位が該シグナル蛋白質と同じ遺伝子 からのものである請求の範囲１３のベクター。
19. １９．該シグナル蛋白質をコード化する該ＤＮＡ配列に使用可能なように連結さ せた該プロモーターおよびリボソーム結合部位が該シグナル蛋白質とは異なる遺 伝子からのものである請求の範囲１３のベクター。
20. ２０．上記成熟蛋白質がブドウ球菌属の蛋白質Ａから成る請求の範囲１３のベク ター。
21. ２１．該成熟蛋白質がレバンスクラーゼから成る請求の範囲１３のベクター。
22. ２２．該成熟蛋白質がバルナーゼから成る請求の範囲１３のベクター。
23. ２３．該成熟蛋白質がストレプトアビジンから成る請求の範囲１３のベクター。
24. ２４．該成熟蛋白質が、産業用酵素類、ビオチン結合蛋白質類、免疫グロブリン 結合蛋白質類、免疫グロブリン類、レセプタ蛋白質類、ウイルスの蛋白質類、そ して徴生物および原生動物起源を有する抗原類、から成る群から選択される請求 の範囲１３のベクター。
25. ２５．ベクターｐＢＥ２６、ｐＢＥ３９、ｐＢＥ３１１またはｐＢＥ８０。
26. ２６．ｐＢＥ２６、ｐＢＥ３９、ｐＢＥ３１１およびｐＢＥ８０の誘導体。