JPH07507449A - バチルススブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）からのストレプトアビジンの産生 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 バチルススブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｔｌｉｓ）がらのストレプト アビジンの産生 発明の分野 本発明は、Ｂ、スブチリス（Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ）内へのストレプトアビジン 遺伝子のクローニングおよび成長培地内への四量体の生物学ストレプトアビジン はアクチッパクチリア属のストレプトミセス　アビジニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ ｃｅｓ　ａｂｖｉｄｉｎｉ　ｉ）から単離された四量体蛋白質であり、そして飛 び抜けて高い親和性で最高４分子までのｄ−ビオチンの分子を結合させる能力の ために際立った存在となっている（１）。ストレプトアビジンは各々が１５．０ ００ダルトンの分子量を有する４つの相同なサブユニットからなる、はぼ中性の ６０．０００ダルトンの蛋白質である（２）。ストレプトアビジンにはビオチン の誘導化形態を結合中せるという能力があるため、ストレプトアビジンは高親和 性蛋白質−リガント相互作用が重要となる診断用アッセイにおいて広（用いられ ている。最近の応用法の幾つかには薬剤の移送のために用いられるストレプトア ビジンでコートしたリポソーム、ならびにアルカリ性フォスファターゼもしくは 西洋ダイコンのパーオキシダーゼのような酵素に対して連結させであるストレプ トミセスを使用するヒト抗体もしくは病原体を検出するための診断用検査がある 。ストレプトアビジンは現在ではＳ、アビジニイ（Ｓ、ａｖｉｄｉｎｉｉ）によ り商業的な量で産生されている。Ｓ、アビジニイは自然の状態では成長培地中に べの産生に限られていて、そして一般的には不溶性形態として産生される。スト レプトアビジンは種々の製造業者から市販品として取得することができるが、市 販品の試薬は供給元どうしの間および同一の供給元からのロット間において分子 量に著しい変化を示す。そのうえこの試薬は高価であり、そしてその価格がため により広い範囲における適用が阻まれている。

現在産生されるストレプトアビジンにおける均質性の欠如に関する主な原因はそ の蛋白質内にビオチン結合性ドメインの外側に存在するプロテアーゼ感受性部位 が存在するということである。ストレプトアビジンの純度を下げることに寄与す る他の因子は、ストレプトアビジンを精製してくる成長培地中の微量なビオチン の存在である。このことによりビオチンに結合したストレプトアビジンが生じ、 そしてこれが先に記載した分子ｌの変化に寄与するのである。

ＡｒｇａｒａｎａおよびＭｅ　ａ　ｄ　ｅ、（２）および（３）は、ストレプト ミセス　アビジニイのゲノムライブラリーからのストレプトアビジン遺伝子のク ローニング、ならびにこの遺伝子のコーディング領域のＤＮＡ配列を記載および 開示している。

Ｍｅａｄａはまた、Ｓ２　リビダンス（Ｓ、　Ｉ　１ｖｉｄａｎｓ）からの２５ ０ｍｇ／リットルのストレプトアビジンの分泌を報告している。

発酵期間のみで４日から７日かかるため、この方法は時間の浪費になる。

Ｃａｎｔｏｒ（４）は、シグナルペプチドをコード化する領域を含みストレプト ミセス　アビジニイからのストレプトアビジンをコード化するＤＮＡの単離、な らびにその後の細菌性宿主、典型的には大腸菌内へのそのＤＮＡのクローニング を開示している。そのうえＣａｎｔｏｒは、ストレプトアビジンをコード化する ＤＮＡ断片に融合させた、目的の標的蛋白質（具体的にはヒトＬＤＬレセプター ）をコード化する第−ＤＮＡ断片を含んでなる融合遺伝子の作製、および後続す る細菌内での発現を開示している。

５ａｎｏ　および　Ｃａｎｔｏｒ　（５）は、大腸菌内におけるクローン化スト レプトアビジン遺伝子を発現させるための系の作製法を記載しており、その系に おいていはストレプトアビジンが総細胞蛋白質の３０％を上回るまでに蓄積した 。５ａｎｏはさらに、大腸菌内において発現させることもできるストレプトアビ ジン含有性キメラ蛋白質のための発現ベクターの作製についても記載している（ ６）。Ｍａｅｄａはストレプトアビジンが大腸菌の周辺細胞質内に存在すること を見いだしている。

しかしながら、５ａｎｏ　および　Ｃａｎｔｏｒの研究によりストレプトアビジ ンのシグナルペプチドは大腸菌内においては機能しないことが示された。

５ａｎｏ　および　Ｃａｎｔｏｒの方法は有用であり、そしてストレプトミセス 　アビジニイからのストレプトアビジンの産生に対する別の方法を提供する。し かしながら、大腸菌からのストレプトアビジンの産生に関する重要な問題は、そ の蛋白質が細胞内において発現され、そして不溶性形態において発現されてしま うことである。この系からの有用な蛋白質の回収には、一般的に不活性のストレ プトアビジンの単離、およびその後の精製、およびその蛋白質の活性形態への再 生のための方法を必要とする。これらの方法は時間の浪費であり、そしてその蛋 白質の再生の効率が良くないため市販品としての産物のためには簡単に適用する ことができない。

グラム陽性細菌であるＢ、スブチリス（Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ）は商業的に重 要な蛋白質を産生ずるという重大な可能性を秘めているが、その理由はその細菌 を遺伝子的に処理することができ、そして増殖についての多様な栄養条件および 物理的条件に対して適応させることができるためであり、そしてその細菌がヒト に対する病原体もしくは毒物でないためである。適切な条件下においてはＢ、ス ブチリスは汚染種を比較的含まない特定の蛋白質を合成および分泌し、その蛋白 質を容易に精製できることが知られている。

ＣｈａｎｇＳＮａｇａｒａｊａｎ　および　Ｋｏｒａｃｅｖｉｃ（７）、（８） 、および（９）は、細菌の成長培地中に分泌可能な蛋白質をコードする異種遺伝 子を含みＢ、ズブチリス内での複製が可能なりローニングベクターを別々に開示 している。これらの系により分泌させることができる蛋白質には、プロテアーゼ 、プロティンＡ１プロレニン、インシュリン、ヒトの成長ホルモン、インターフ ェロン、およびウロキナーゼがある。

細菌壁を通過する分泌蛋白質の輸送にはシグナルペプチドが必要であることが一 般的に理解されている。蛋白質分泌におけるシグナルペプチドの役割を理解する ことを趣旨とする数々の研究が行われているものの、このような輸送のメカニズ ム、ならびにシグナルペプチドがシグナルペプチド−成熟蛋白質複合体からのシ グナルペプチドの輸送および除去に影響を与えて、分泌成熟蛋白質を産生ずる厳 密な様式は完全には理解されていない。

Ｂ、スブチリスによる多様で異なる異種蛋白質の分泌を可能にするベクターが（ ８）、（９）、および（１０）において開示されている。これらのベクターには 、アミラーゼ、プロテアーゼ、レバンスクラーゼ、およびβ−ラクタマーゼのよ うな細菌性エキソ酵素のための遺伝子を基とするベクターが含まれる。

Ｐａ１ｖａは、大腸菌のβ−ラクタマーゼとヒト白血球インターフェロンのため のそれぞれの遺伝子がバチルス　アミロリクエファキエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ 　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）からのα−アミラーゼ遺伝子のプロモ ーター、リポソーム結合部位、およびシグナル配列と操作可能に連結させである ベクターを用いる細菌の形質転換による、大腸菌の異種蛋白質β−ラクタマーゼ （１２）およびヒト白血球インターフェロン（１３）の、Ｂ、スブチリスによる 分泌を例証している。彼らは、少量のインターフェロンのみが分泌されているこ とを見いだしているにすぎない。

レバンスクラーゼに基づく分泌ベクターはＤｉｏｎ（１４）により報告されてい る。Ｄｉｏｎはレバンスクラーゼと比較して低いレベルであるマウスインターフ ェロンを取得した。この著者は、インターフェロンの収率が低いのはＢ、スブチ リスのレバンスクラーゼ遺伝子のシグナル配列とマウスインターフェロンのα２ 遺伝子との間に存在する、良くは理解されていない不和合性に起因することを示 唆している。

Ｎａｇａｒａｊａｎ　（１５）は、Ｂ、スブチリスを初めとする細菌内における 異種蛋白質の分泌のためのベクターの設計のための方法を開示している。この方 法は、効率の良いシグナルペプチドを介する輸送が行われるようにプロモーター 、リポソーム結合配列、およびシグナルペプチドと、希望する異種蛋白質からの 配列とを組み合わせることを可能にするための方法として示されている。しかし ながらＢ、スブチリスによるストレプトアビジン分泌の場合には、開示される方 法が確かに商業的に実行可能な分泌処理法であるというわけではないであろう。

例えばストレプトアビジン蛋白質の四量体形態は有効なビオチン結合のために必 要であるということが知られており、そして本発明以前にはＢ、スブチリスが四 量体蛋白質を効率良（分泌および蓄積することができるということは立証されて いなかった。今日までに効率良く分泌されてきているほとんどの蛋白質は単量体 蛋白質であり、例外は二量体である大腸菌のアルカリ性フォスファターゼである 。また、Ｂ、スブチリスの成長培地中における生物学的に活性なストレプトアビ ジンの産生には同時にそして効率良く行われる数々の処理過捏が必要である。こ れらのものには膜を通しての成熟蛋白質の効率の良い輸送、および前駆体蛋白質 からのシグナルペプチドの除去が含まれる。膜からの成熟蛋白質の放出、ならび に培地内へと通過して行（四量体蛋白質を産生ずるための単量体のオリゴマー形 成がその後に続くことが必要である。現在の知見からでは、Ｂ。

スブチリスにおけるオリゴマー形成が細胞膜と細胞壁との間の空間において生じ るのか否か、あるいはこのオリゴマー形成は成長培地内で生じるものかどうかは 明らかにされていない。さらに、ストレプトミセス属のゲノムは少なくとも７０ ％の高いＧＣ塩基対含有量を示す一方で、Ｂ。

スブチリスにおけるＧＣ含有量は４２％程度ものであることが知られている。こ のことはストレプトミセス属の遺伝子内における不釣り合いな数のＧＣコドンの ためにＢ、スブチリスによるストレプトミセス属の遺伝子の翻訳が可能でない場 合があることを示しているであろう。そのうえＢ、スブチリスは全（役に立たな い幾つかの蛋白質を分泌することが良く知られており、ストレプトアビジンの場 合には細胞に対してそれが致命的であることがわかるであろう。

したがって追加的な可溶化および精製についての必要性を排除する、商業的に有 用な量の活性な可溶性蛋白質としてストレプトアビジン蛋白質の発現および分泌 を可能にする発現系についての必要性が残されている。本発明はビオチンおよび 池の混入物をほとんど含まない、Ｂ、スブチリスからの可溶性活性ストレプトア ビジンを大量に効率良（発現および分泌させるための方法を提供する。

発明の要約 本発明は、以下に示す ａ、シグナルペプチドをコード化する配列および発現因子に対して操作可能に連 結させであるストレプトアビジンをコード化する配列を含んでなり、シグナルペ プチドをコード化する当該配列が細菌のエキソ蛋白質をコードするＤＮＡから単 離され、そして当該発現因子がグラム陽性細菌の蛋白質をコードするＤＮＡから 単離されている、遺伝子構築物でバチルス　スブチリスを形質転換させる段階、 ｂ、　形質転換させたバチルス　スブチリスを適切な成長培地中において生育さ せ、そのことによりストレプトアビジンを成長培地中に分泌させる段階、および Ｃ９その成長培地からストレプトアビジンを精製する段階、を含んでなる、バチ ルス　スブチリスからの分泌により四量体の生物学的に活性なストレプトアビジ ンを産生させるための方法を提供する。

本発明はさらに、先の（ａ）において記載されているように形質転換させたバチ ルス　ズブチリスバクテリア属を提供する。

本発明はまた、以下に示す、 ａ、　第二所望の蛋白質をコード化する配列に対して融合されたストレプトアビ ジンをコード化する配列を含んでなり、かつ当該融合された配列がシグナルペプ チドをコードする配列および発現因子に対して操作可能に連結されており、シグ ナルペプチドをコード化する当該配列が細菌のエキソ蛋白質をコード化するＤＮ Ａから単離され、そして当該発現因子がグラム陽性細菌の蛋白質をコード化する ＤＮＡから単離されている、融合遺伝子構築物を用いてバチルス　スブチリスを 形質転換させる段階、 ｂ、　形質転換させたバチルス　スブチリスを適切な成長培地中において生育さ せ、融合させであるストレプトアビジンと所望の蛋白質とをそのことにより成長 培地中に分泌させる段階、およびＣ１その成長培地からストレプトアビジンおよ び所望の蛋白質を精製する段階、 を含んでなる、バチルス　スブチリスからの分泌により第二の所望の蛋白質に対 して融合された四量体の生物学的に活性なストレプトアビジンを含む融合遺伝子 産物を産生させるための方法を提供する。

本発明はさらに、先の（ａ）において記載されているような融合遺伝子構築物を 使用して形質転換させたバチルス　ズブチリスバクテリア属、ならびに先に記載 したような融合遺伝子産物をも提供する。

また、プラスミドｐＢＥ６５９、ｐＢＥ６６０ＳｐＢＥ６６１、ｐＢＥ６６２、 ｐＢＥ６６３、ｐＢＥ６７３、およびｐＢＥ６５５も提供する。

図面の簡単な説明 図１ａは、ｎｐ工発現因子に対して融合させたＳａヱ遺伝子ならびにプラスミド ｐＢＥ６５１　（ｓ見ヱ）およびｐＢＥ８３　（ユ且ニー±ヱ亙）からのシグナ ルペプチドを含んでなるハイブリッド遺伝子融合構築物を含むプラスミドｐＢＥ ６５９の作製法を記載しである。Ａ）ｐＢＥ８３中のｎｐｒシグナルペプチド開 裂部位にまたがるＤＮＡ配列を配列番号１０として表示しである。Ｂ）ｐＢＥ６ ５１内のＳａＶ成熟成熟蛋白列配列たがるＤＮＡ配列を配列番号１１として表示 しである。Ｃ）ｐＢＥ６５９内のｎｐｒ−ｓａヱ融合接合部にまたがるＤＮＡ配 列を配列番号１２として表示しである。

図１ｂは、ストレプトアビジン遺伝子のＤＮＡ配列を示している。このＤＮＡ配 列は配列番号１３として表示されている。アミノ酸配列は配列番号１４として表 示されている。

図２は、各々プラスミドｐＢＥ３０　（ａｐｒ−ｐｈｏＡ）　、ｐＢＥ９０（ユ 且ニー出Ａ）　、ｐＢＥ９１　（立見ニー且九旦Ａ）、およびｐＢＥ５９７　（ 上ヱ互−出Ａ）からの遺伝子融合構築物ｐＢＥ６６０（ａｐｒ−１見ｖ）　、ｐ ＢＥ６６１　（ユ■ニーｌ且ヱ）　、ｐＢＥ　（立見ニーー糺１Ｍ）、およびｐ ＢＥ６６３　（±ヱ互−５ａｖ）を含む各プラスミドの作製法を、それぞれ記載 しである。　図３は、各々Ｂ、スブチリス、ｐＢＥ２０、およびｐＢＥ６５９の 培養上演のウェスタンプロット分析である。番号は時間単位で示す培養期間を表 す。

図４ａは、Ｂ、スブチリスの成長培地の硫酸アンモニア分画をかけたイムノビオ チンアガロースカラムから溶出された分画のＵ、　Ｖ、吸収スペクトルを示す。

図４ｂは、イムノビオチンカラムからのストレプトアビジン含有性分画をかけた セフ７クリル５２００　（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　３２００）カラムから溶出され た分画のＵ、　Ｖ、吸収スペクトルを示す。

図４ｃは、イムノビオチンおよび３２００カラムの両方からの分画のウェスタン プロット分析を示す。

図５ａは、制限酵素消化によるプラスミドｐＢＥ５９２　（エエ互一旦ｈｏＡ） からのプラスミドｐＢＥ９３　（ユ且ニー且九旦Ａ）の作製、ならびにｐＢＥ９ ３からのｎｐｒ発現因子ＤＮＡとＮｈｅｌ−Ｐｓｔｌ消作製される。

図５ｂは、ｐＢＥ６５９　（１−１５９）およびｐＢＥ６７３　（１５−１５９ ）を含むＢ、スブチリスのウェスタンプツトを表す。

図６は、Ｎｐｒｗ＋　５ａＶ１５−１３３　ＰｈｏＡＳＮｐｒ、＋　５ａｖ１５ −１、ｓ　ＰｈｏＡ、Ｎｐｒ、、Ｓａｖ＋ａ−＋ｎｓ　ＰｈｏＡ、およびＮ　ｐ 　ｒ　ｔｏ−ｓａｖ１５−＋５９　ＰｈｏＡというストレプトアビジン−異種遺 伝子（ＰｈｏＡ）融合構造を説明する。

図７は、遺伝子融合構造±ｖｓ−ｓａｖ−１ｖｓ−を含むプラスミドｐＢＥ６５ ５を産生するためのＥｃｏＲＶ消化ならびにｐＢＥ３１１がらのＩｖｓ発現因子 と成熟上ヱ互遺伝子の、ｐＢＥ６５３　（ｓａｖ）の成熟ＳａＶ遺伝子との連結 反応を説明する。

発明の詳細な記述 本発明の開示を支援するという点において、以下に示す用語は以下に示す意味を 表すことを意図している。

「成熟蛋白質」は、シグナルペプチドが結合していない最終蛋白質産物である。

「所望の蛋白質」は、遺伝子工学的に作製した細菌から得られる貴重な産物であ るとみなされる任意の蛋白質である。用語「所望の蛋白質」もしくは「第二の所 望の蛋白質」は、本明細書においては本発明の融合遺伝子産物内においてストレ プトアビジンに対して融合させである蛋白質を記載するために使用される。また 記載がない限り出願者は、本発明に従ってストレプトアビジンを第二の所望の蛋 白質のＣ−末端もしくはＮ−末端のいずれかに対して融合させるように融合遺伝 子構築物を作製することができることを意図する。

「シグナルペプチド」は、分泌された成熟蛋白質の前についているアミノ末端ポ リペプチドである。このシグナルペプチドは成熟蛋白質から開裂され、そしてそ のため成熟蛋白質内には存在しない。シグナルペプチドは細胞膜を通過する細胞 外蛋白質を指定および輸送することにより機能する。シグナルペプチドはまたジ グチル蛋白質としても引用される。

「適合性制限部位」は、任意の追加的な改変を行わずに連結させることができる ヌクレオチド末端を開裂する際に生じる異なる制限部位である。

ｒａｐｒＪおよびｒＡｐｒＪは、各々アルカリ性プロテアーゼ遺伝子および蛋白 質を意味する。

ｒｂａｒＪおよび［ＢａｒＪは、各々リボヌクレアーゼ遺伝子および蛋白質を意 味する。

ｒｌｖｓＪおよびｒＬｖｓＪは、各々レバンスクラーゼ遺伝子および蛋白質を意 味する。

ｒｎｐｒＪおよびｒＮｐｒＪは、各々中性プロテアーゼ遺伝子および蛋白質を意 味する。

ｒｐｈｏＡＪおよびｒＰｈｏＡＪは、各々大腸菌のアルカリ性フォスファターゼ 遺伝子および蛋白質を意味する。

ｒｓａｖＪおよびｒｓａｖＪは、各ストレプトアビジン遺伝子および蛋白質を意 味する。

用語「ストレプトアビジン」は、実施例１および図１ｂにおいて記載されるよう にストレプトミセス　アビジニイから単離されたアミノ酸残基１−１５９の２ｋ ｂのＢａｍＨＩ断片を含んでなる蛋白質、あるいはビオチンを結合させる能力を 保持しているそのアミノ酸残基の任意の遂次サブセット、あるいはその変位体も しくは誘導体を意味する。

用語「ビオチン」は、ストレプトアビジンを結合することができるビオチン、ビ オチン誘導体、およびビオチンアナログを意味する。

ｒＡ　ｐ−Ｊは、アンンピシリンを意味する。

ｒＫａｎ−Ｊは、カナマイシンを意味する。

ｒＣｍ−Ｊは、クロラムフェニコールを意味する。

本明細書において用いられる「シャトルファゲミド」は、通常は二本鎖であり、 そして大腸菌およびＢ、スブチリスのための両方の複製起点、ならびに−木端Ｄ ＮＡの調製のためのＦ１遺伝子内領域も含むベクターである。

用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「蛋白質」は、互換的に用いられ ている。

用語「制限エンドヌクレアーゼ開裂部位」および「制限部位」は、互換的に用い られている。

用語「発現因子」は、本明細書においては、例えばプロモーター配列およびリポ ソーム結合部位配列を初めとする、Ｂ、スブチリスにおける転写および翻訳開始 のために必要な情報を含むＤＮＡ断片を意味する。

用語「細菌のエキソ蛋白質」は、細胞質細菌膜を通過することができ、そして細 菌の成長培地中に自然の状態で産生されることが知られている、細菌により産生 される蛋白質を記載するのに用いられる。

用語［グラム陽性細菌蛋白質」は、グラム陽性細菌により自然の状態で合成され ることが知られている蛋白質を意味する。

本明細書において使用される用語「生物学的に活性な」は、ビオチン、ビオチン アナログ、もしくは誘導化させたビオチンに対して結合することができる可溶性 ストレプトアビジン蛋白質分子を意味する。

本明細書において利用される遺伝子工学の適切な方法は、引用文献（１６）、（ １７）、および（１８）、ならびに市販品として入手することができる遺伝子工 学的作製法のためのキットに添付される説明書において記載されている。本発明 を実施するのに必要な細菌培養物およびプラスミドは市販品として入手すること ができ、そして以下に示す本文および実施例内においてそれらの源と一緒に同定 しである。

本明細書中において記載される細菌株、遺伝子、および多様なベクターの源は当 業者には簡単に入手することができる。Ｂ、アミロリクエファチド配列が（２） 、（１９）、（２０）、（２１）、および（２２）において発表されている。そ れに加えこれらの配列はシーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）においてＬｏｓ　Ａｌ ｍｏｓ、Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ、からのＮｕｃｕｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｄａｔａ 　ｂａｓｅから入手することができる。

細菌株Ｂ、スブチリス、大腸菌およびＳ、アビジニイ、ならびにプラスミドｐＢ Ｅ３２２、ｐＴＺ１８Ｒ，ｐＳＫ、ｐｃ１９４、ｐＵＩ３１１０、およびファー ジＭ１３ＫＯ７は多様な源から簡単に入手することができる。例えばこれらはＡ ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＳＲｏｃｋｖ ｉｌｌｅ、ＭＤｌもしくはＢａｃｉｌｌｕｓ　５ｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ、０ｈ ｉｏ、から取得することができ、そしてまた池の商業的な供給元からも入手する ことができる。

新規に作製された制限部位の位置および突然変異原性オリゴヌクレオチドは図も しくは実施例において示されており、そして当業者はこれらの構築物を当該技術 分野において入手することができる情報を用いて簡単に調製することができる。

抗−ストレプトアビジン抗体は様々な製造業者から購入することができる。本研 究においてはこれをＳｉｇｍａ社、Ｓｔ、Ｌｏｕ　ｉ　ｓ、ＭＯ。

から購入した。標準物質として使用したストレプトアビジンは、　Ｂｅｔｈｅｓ ｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、ＭＤ。

から取得した。プラスミドおよび細菌株の作製のために使用した多様な技術は標 準的方法であり、そして関連する変法が必要に応じて本文中に示されている。こ れらの方法は引用文献（１１）、（１６）、（１７）、および（１８）において 見いだすことができる。

本発明は、ストレプトアビジンをコード化する単離された２ｋｂのＤＮＡ断片を 利用する（図１ｂ）。このＤＮＡは公開されているＤＮＡ配列（２，３）に基づ き、当該技術分野において良く知られている技術に従い単離した。この２ｋｂ断 片は、アミノ酸配列１−１５９を含んでなりシグナルペプチドおよび成熟蛋白質 をコード化する完全なＳａＶ読み取り枠、ならびにそのコーディング領域の３゛ および５′端に天然に存在するフランク領域ＤＮＡを含む。

ストレプトアビジン発現のための適切な発現因子をコード化するＤＮＡおよびス トレプトアビジン蛋白質をコード化するＤＮＡ断片を含んでなる組換えクローニ ング伝達体を開示するが、当該クローニング伝達体はさらに第一および第二制限 酵素部位が存在することを特徴とし、ストレプトアビジンをコード化するＤＮＡ 断片は当該部位内に挿入されている。

本発明は、転写を調節するプロモーター配列および翻訳を調節するリポソーム結 合部位を初めとする発現因子、ならびに細胞膜を通過する蛋白質の翻訳および成 熟蛋白質からのシグナルペプチドの開裂を可能にするシグナルペプチドのための 配列を含んでなるベクターの開発を伴う。

適切なベクターは、利用するバクテリア属に適合するものであろう。例えばＢ　 スブチリスに関しては、そのような適切なベクターには、適合性調節配列および 複製起点を有する大腸菌−Ｂ、スブチリスシャトルベクターがある。これらは多 重コピーのものであり、そして例えば抗生物質耐性をコードする遺伝子のような 選択的標識遺伝子を有することが好ましいであろう。例えば、ｐＴＺ１８ＲはＰ ｈａｒｍａｃｉａ社、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ　０８８５４、から入手する ことができるが、これは大腸菌内においてアンピリジンに対する耐性を付与し、 そしてＢＧＳＣ社からのりＣ１９４は大腸菌およびＢ、ズブチリス内におけるク ロラムフェニコール（ｃｍ’）に対する耐性を付与する。

プロモーターおよびリポソーム結合部位をコード化するＤＮＡ配列を含む発現因 子は任意のグラム陽性細菌蛋白質からのものであることができ、そしてシグナル ペプチドは分泌産物をコード化する任意の単一な細菌性遺伝子からのものである ことができる。プロモーターおよびリポソーム結合部位をコード化するＤＮＡ配 列も、シグナルペプチドをコード化するものとは異なる遺伝子からのものである こともできる。プロモーター、リポソーム結合部位、およびシグナルペプチドを コード化するこれらのＤＮＡ配列は当業者に良く知られている手段により単離す ることができ、そして説明的な実施例が文献（２３）において示されている。

このＤＮＡ配列内におけるプロモーターは構成性のものであるかあるいは誘導可 能なものであるかのいずれかであることができる。適切なシグナルペプチドおよ び発現因子を、例えばａｐ工、ｎｐｒ、１ｖｓ−１およびｂａｒを含んでなる群 より選択することができる。

シグナルペプチドをコード化するＤＮＡの３゛端に対する制限エンドヌクレアー ゼ開裂部位の添加も当業者に良く知られている手法により簡単に行う（１６）。

シグナルペプチドをコード化するＤＮＡの３゛末端に対して制限エンドヌクレア ーゼ開裂部位を添加するのには数々の方法を利用することができる。このような 方法のあるものは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を取り入れることができる であろう。本発明において用いられる方法は部位特異的突然変異誘発であり、こ の方法が最も好ましく、そしてこの方法はミュータジエン（突然変異原）（Ｍｕ ｔａｇｅｎｅ）の使用説明書（Ｂｉｏｒａｄ社、１４１４　１１ａｒｂｏｕｒＷ ａｙ　５ｏｕｔｈ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ　９６８０４）において記載されて いる。所望の蛋白質をコード化するＤＮＡ配列を単離するための手段ならびに成 熟コーディング配列の５゛末端上における制限部位の添加も当業者には良く知ら れている（１６）。任意の制限エンドヌクレアーゼ部位を使用することができる が、ただし標的ベクターに対して特有の制限部位の利用が望ましい。シグナルペ プチドをコード化するＤＮＡ配列の３′末端上の制限エンドヌクレアーゼ部位と 所望の成熟蛋白質をコード化するＤＮＡ配列の５°末端上のものは適合性のもの である必要がある。適切な適合性制限部位は当該技術分野において良く知られて いる。例えば引用することにより本明細書に組み入れられるｔｈｅＲｅｓｔｒｉ ｃｔｉｏｎ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ　Ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ　Ｔａｂｌｅ　ｏ ｆ　ｔｈｅ　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　１９８８−１９８９　 Ｃａｔａｌｏｇ、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ、社、Ｂｅ ｖｅｒｌｙ、ＭＡ　０１９１５（１９８８）を参照せよ。本発明における利用に 好ましいものはＥｃ。

ＲＶもしくはＮｈｅｌである。３′末端に制限部位を有し、プロモーター、リポ ソーム結合部位、およびシグナルペプチドをコード化する組合せＤＮＡと、５° 末端に制限部位を有し、成熟ポリペプチドもしくは蛋白質をコード化するＤＮＡ 配列とを常法の技術（１６）および（１７）により操作可能に統合させることが できる。

本発明の組換えクローニングベヒクルは細菌性宿主細胞内に取り込ませである。

適切な宿主細胞はバチルス属から得られるであろうが、最も好ましい宿主細胞は ズブチリス種のものであろう。Ｂ、スブチリス細菌を形質転換させるための一つ の方法がＶａｓａｎｔｈａ　ｅｔ　ａｌ。

（９）により記載されている。当業者に良く知られている標準的な微生物学的方 法を、細菌培養物の生育および維持のために使用することができる。本発明の組 換えクローニングベヒクルを含む遺伝子工学的に作製したＢ、ズブチリス宿主細 胞の数々のものは、株ＢＥ１５００もしくはその誘導体（１５１０）をプラスミ ドｐＢＥ６５９Ａ、ｐＢＥ６６０、ｐＢＥ６６１、ｐＢＥ６６２、ＰＢＥ６６３ 、ｐＩ３Ｅ６７３、ｐＢＥ６５９、およびｐＢＥ６５５で形質転換させることに より作製した。ＢＥ１５００は遺伝子型ｔｒｐｃ２、ｍｅｔＢｌｏ、Ｉｙｓ３、 Δ−ａｐｒＥ６６、Δ−ｎｐｒ８２、Δ−５ａｃＢ＋　：　ｅｒｍＣ（２４）を 有する。

ストレプトアビジンを産生ずる方法は、ストレプトアビジン遺伝子の発現を可能 にさせる適切な条件下において遺伝子工学的に作製した本発明の宿主細胞を培養 すること、ならびに成長培地からそのように産生されたストレプトアビジンを回 収することを含んでなる。

本発明はまた、目的の標的蛋白質をコード化する第二ＤＮＡ断片に対して融合さ せてありストレプトアビジンをコード化する第−ＤＮＡ断片を含んでなる融合遺 伝子であって、その融合遺伝子が、その遺伝子を宿主細胞内に挿入した際にイン ビボにおいて融合蛋白質を発現することができる、上記融合遺伝子をも提供する 。

本発明の一つの態様においては、第二ＤＮＡ断片１１Ｂ、アミロ１ノクエフアキ エンスのレバンスクラーゼ（Ｌｖｓ）をコード化する遺伝子である。このような 融合遺伝子はこの融合遺伝子を適切な発現ベクター白書こ挿入しそして適切な宿 主細胞内に組入れた際に、その融合蛋白質のＮ−末端領域に存在するストレプト アビジンおよびその融合蛋白質のＣ−末端領域に存在するレバンスクラーゼとか らなる蛋白質を発現する。この融合遺伝子を細菌性発現ベクター内に知−ン化さ せることカベでき、そしてこれを使用して融合遺伝子での細菌性宿主細胞のトラ ンスフエフシンを行うことができる。好ましい細菌性宿主細胞ζマＢ、スブチ１ ノー　ちる。

本発明はまた、分泌ベクターであって、当該ベクター力（適切な宿主細胞内に組 入れられた際に、本発明の融合遺伝子を発現および分泌することができる上記分 泌ベクターをも提供する。このベクター１ｔ、第一遺伝子のプロモーター、リポ ソーム結合部位、およびシグナル配夕１１をコード化するＤＮＡ、およびその後 に続く、第二遺伝子の成熟蛋白質をフード化するＤＮＡに対して融合させである 第一遺伝子の成熟蛋白質をコード化するＤＮＡを含んでなる。

また、本発明の融合遺伝子によりコード化される融合蛋白質も提供するが、この 場合に目的とする所望の蛋白質がストレプトアビジン番二対して融合させである 。本発明のある態様におＬＮで（ま所望の蛋白質１１Ｂ、アミロリクエファキエ ンスのレノくンスクラーゼである。

ストレプトアビジン蛋白質産物の精製のために１まストレプトアビジンを分泌す る細菌を８７培地のような標準的な成長培地中で生育させ、そしてその細菌を遠 心処理により成長培地から分離する。成長培地中の蛋白質は膜濾過技術もしくは 硫酸アンモニア沈殿のいずれかあるいはその両方により濃縮することができるが 、ただし７０％硫酸アンモニウム沈殿が最も好ましい。この濃縮蛋白質をイムノ ビオチン親和性…脂に対する結合に適合する適切な緩衝液内において再構成させ る。蛋白質の再構成およびイムノビオチン親和性樹脂の平衡化のための緩衝液は 約ｐＨ８゜５からｐＨ１１，０であることが好ましいが、ただし約ｐＨ１１，０ であることが最も好ましい。濃縮蛋白質分画をストレプトアビジンが結合するイ ムノビオチン親和性樹脂にかける。このカラムを平衡化用緩衝液で洗浄し、そし てストレプトアビジンを酢酸アンモニウム緩衝液で溶出させるが、最も好ましい のは約ｐＨ４，０における５０ｍＭの酢酸アンモニウムである。ストレプトアビ ジン分画はＵ、　Ｖ、検出により同定し、そしてさらに脱塩を行い、そして標準 的なゲル濾過クロマトグラフィーにより精製する。数々のゲル濾過樹脂を使用す ることができるが、セファクリル２００　（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　２００）が好 ましい。純粋なストレプトアビジンの存在の最終的な決定は、例えばウェスタン プロット分析を初めとする数々の方法により行うことができる。

実施例はストレプトアビジン遺伝子の単離、ならびに操作可能な発現因子および ストレプトアビジンをコード化する連結ＤＮＡを含む適切なりローニングベクタ ーの作製法を説明する。実施例はまた、ストレプトアビジン蛋白質を発現および 分泌することができるバチルス宿主細胞の形質転換、ならびに当該ストレプトア ビジンを精製することができる方法を記載する。

Ｂ、ズブチリス内でのｎｐｒ　ｓａｖハイブリッド遺伝子融合物の作製標準的な 方法によりストレプトミセス　アビジニイから２ｋｂのＢａｍＨＩ断片としてＳ ａＶ遺伝子を単離し、そしてプラスミドｐｓＫ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、１１ ０９９　Ｎｏｒｔｈ　Ｔｏｒｒｅｙ　Ｐｉｎｅｓ　Ｒｏａｄ、Ｌａ　Ｊｏｌｌａ ＳＣＡ　９２０３７）内にクロー子を含むプラスミドをｐＢＥ６５１と表示した 。プラスミドｐＢＥ６５１の制限地図および成熟コーディング領域に関連するＥ ｃｏＲＶ部位の位置を図１ａにおいて示す。プラスミドｐＢＥ８３　（２４）は 、成熟ＬＶＳに対して融合させであるｎｐｒ発現因子およびシグナルペプチドを 含む大腸菌−Ｂ、ズブチリスファゲミドベクターである。ｐＢＥ８３を含むＢ、 ズブチリス株はＬｖｓを分泌する。アガロース中に含まれるショ糖の存在下にお いてレバンが生ずるが、このレバンの形成のためにコロニーをアガロースプレー ト上において簡単に可視化させることができる。

プラスミドｐＢＥ８３をＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩで消化させ、そしてＥｃｏ ＲＶ−ＢａｍＨＩ消化させたｐＢＥ６５１に連結させる。Ｂ。

ズブチリス株ＢＥ１５１０をこの連結ＤＮＡで形質転換させ、そしてＬＢアガロ ース＋５％シヨ糖＋クロラムフェニコール（５μｇ／ｍｌ）上でプレート培養し た。総計で約８００の形質転換体を取得し、そしてレバンスクラーゼを産生しな い１２８のＢ、スブチリスクローンを同定し、そしてこれらを市販品として購入 した抗−ストレプトアビジン抗血清を使用するコロニー免疫アッセイによりスク リーニングした。４つの独立した陽性コロニーが取得され、そしてｐＢＥ６５９ Ａ、ＤＢＥ６５９Ｂ。

ｐＢＥ６５９Ｃ，およびｐＢＥ６５９Ｄとして表示した。プラスミドｐＢＥ６５ ９Ａを使用してさらに詳しい特徴決定をすべて行ったが、このプラスミドはｐＢ Ｅ６５９として引用することができるであろう。このプラスミドをＡｍｅｒｉｃ ａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　ＣｏＣｏ１１ｅｃｔｉｏｎＳＲｏｃｋｖｉｌ ｌｅＳ、２０８５２、の永久培養物収蔵機関に委託し、そして指定の受託番号Ａ ＴＣＣ６８９７７と表示されている。この委託は３７Ｃ，Ｆ、Ｒ，１，１４およ び３５Ｕ、Ｓ、Ｃ。

１２２において示されている利用規定条項に関する特許申請手続きの目的のため の、ブダペスト条約の要件に従って行った。

してこれらをそのｖｉＢ、ズブチリス内に転移させた。プラスミドｐＢＥ３０、 ｐＢＥＤ９０、ｐＢＥ９１、およびｐＢＥ５９７はすべて、各々ａｐｒ、ｎｐ工 、旦見工、および上叉互発現因子に対して融合させたｐｈｏＡの成熟配列を含む 。これらはｐ　ＢＲ３２２、ｐＵＢｌｌｏ、およびＭ１３ＫＯ７の複製起点を含 むシャトルファゲミドである（２４）。

ｐＢＥ３０、ｐＢＥ９０、ｐＢＥ９１、およびｐＢＥ５９７を含む大腸菌株は大 腸菌内においてＰｈｏＡを分泌する。ＰｈｏＡは５−ブロモ−４−クロロ−３− インドリルリン酸（Ｓ　ｉ　ｇｍａ社、Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）と反応して 標識用プレート上で青色を呈する（２３）。プラスミドｐＢＥ３０、ｐＢＥ９０ 、ｐＢＥ９１、ｐＢＥ５９７、およびｐＢＥ６５１をＥｃｏＲＶおよびＰｓｔｌ で消化させ、モして１−２％の低溶解性アガロース上における分離を行った。ｐ ＢＥ３０、ｐＢＥ９０、ｐＢＥ９１、ｐＢＥ５９７からの大きな断片、およびｐ ＢＥ６５１からの小さい断片を切り出し、モしてゲネクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅ ａｎ）（Ｐ、Ｏ，Ｂｏｘ　２２８４、Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、ＣＡ　９２０３８）を 使用して精製した。小さなＳａＶ断片を大きな断片の各々に対して連結させ、そ して大腸菌株ＸＬＩ　（２４）を形質転換させた。白色の形質転換体を抗−一と 見工抗血消を使用するコロニー免疫アッセイによりスクリーニングした（１８） 。これらのプラスミドを単離し、当業者に良（知られている方法により検証し、 モしてｐＢＥ６６０　（Ａｐｒ　５ａｖ）　、ｐＢＥ６６１　ＣＮｐｒ−３ａｖ ）　、ｐＢＥ６６２　（Ｂａ　ｒ−５ａｖ）、およびｐＢＥ６６３　（Ｌｖｓ− ３ａｖ）として表示した。Ｂ。

ズブチリス株ＢＥ１５００をｐＢＥ６６０、ｐＢＥ６６１．ＢＥ６６２、および ｐＢＥ６６３で形質転換させ、モしてＫａｎ’形質転換体を取得した。コロニー 免疫アッセイによりすべての形質転換体がＳａｖを分泌することが示された。（ ウェスタンプロット分析により、ｐＢＥ６６０、ｐＢＥ６６１、ｐＢＥ６６２、 およびｐＢＥ６６３を含む株は成長培地中にストレプトアビジンを分泌すること が示された。）４）を含むＢ、ズブチリス株を培地Ｂ＋クロラムフェニコール（ ５μｇ／ｍ１）中で生育させ、そしてこの培地のサンプル（１ｍｌ）を培養開始 ４．６．８．１０．１２、および２４時間後に回収した（２０）。各サンプルを ２ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）の存在下において５分間 遠心処理し、モして上清を再遠心し、そしてウェスタン分析のための処理を施し た。ｐＢＥ６５９　（ｎ且ニー−±）ベクターからのサンプルおよび市販品とし て購入したストレプトアビジンを１０から２０％の５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｄａ ｉｉｃｈ　ｍｉｎ　ｇｅｌ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　５ｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｓ ｙｓｔｅｍｓ社、ＭＡ　０１１３６）上において分離し、その後にニトロセルロ ースフィルターへの蛋白質エレクトロブロッティングを行い、そしてこれを抗− ストレプトアビジン抗体（Ｓ　ｉ　ｇｍａ社、Ｓ　ｔ、　Ｌｏｕ　ｉ　ｓ、ＭＯ ）ｙ）内において４時間目に存在しており、これは時間を経るにつれて強度が強 くなり、そして２４時間１麦においてさえも存在することが証明された（図３） 。このバンドはｐＢＥ２０ベクターのみを含む株においては存在していなかった 。従って、Ｂ、スブチリスは成長培地中に可溶性Ｓａｖを分泌することができる ということが証明された。この事例においては細胞外ストレプトアビジンは約１ ２時間ｉ＆には約２０から３０ｍｇ／リットル蓄積することを見いだした。

ストレプトアビジンの精製の方法は引用文献（２５）、（２６）、および（２７ ）において記載の既に公開されている方法に基づくものであった。プラスミドｐ ＢＥ６５９を含むＢ、ズブチリス株ＢＥ１５１０を２５０ｍ１の以下に示す培地 、つまり１×力ステンホルツ（Ｃａｓｔｅｎｈｏｌｚ）培地中の０．６％のカザ アミノ酸＋１％のグリセロール＋０゜０１％のイーストエキストラクト＋２５ｍ Ｍのリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７，０、ｍ１当たり５０ｇｇのトリプトファン、 メチオニン、およびリシン、ならびにＣｍ　（５μｇ／ｍｌ）という培地中にお いて３７℃下で８時間生育させた［１０Ｘカステンホルツのもともとの保存液は 以下に記載のものを蒸留水のリットル当たりに含み、それは、酢酸ニトリルＩｇ 、ＣａＳＯ４”２ＨｔＯＯ，６ｇ１Ｍｇ５Ｏ＜”７ＨｚＯ１，Ｏｇ−ＮａＣＩ　 ０．８ｇ、ＫＮＯｓ　１．０３ｇ、ＮａＮＯｓ　６．８９ｇ。

Ｎａ２ＨＰＯ＊　１．、ｌ１ｇ、ＦｅＣｌ５の０．２８ｇ／リットルの溶液１０ ｍ１、ニッチ（Ｎｉｔｓｃｈ’　ｓ）の微量要素　１０ｍ１（エッチの微量要素 溶液は蒸留水のリットル当たりＨｚＳＯｉ　０．５ｍｌ、Ｍｎ５Ｏ４・Ｈｉｏ　 ２．２ｇ−ＺｎＳＯ４”７ＨｚＯｏ、５ｇ、ＨｓＢＯｓｏ、５ｇ、Ｃｕ５Ｏｎ　 ０．０１６ｇ、ＮａｔＭＯＯ４’２ＨｘＯｏ。

２５ｇ１およびＣｏＣＩｚ・６Ｈｚ０　０．０４６ｇを含む）である］。

培地のｐＨを検査し、そして水酸化ナトリウムの添加によりおおよそｐ）１７． ０に維持した。この細菌を８時間後に収集し、そして成長培地を、プロテアーゼ インヒビター（２ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル）の存在下における４ ℃下での６，０００ｇにおける２０分間の遠心処理によりその細菌から分離した 。硫酸アンモニウムを７０％になるまでその上演に添加し、そして４℃下におい て一晩攪拌させたままにした。部分的に精製されたストレプトアビジンを含む硫 酸アンモニウム沈殿物を６．０００ｇにおける３０分間の遠心処理により回収し 、そして７ｍｌの０．０５Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液ｐｌｉｌｌ＋０．５ＭのＮ ａＣ１中に溶解させ、そしてイムノビオチンアガロースカラム（５ｍｌ）にかけ た。イムノビオチンアガロース（Ｓｉｇｍａ社）はサンプルをかける前に０．０ ５Ｍの重炭酸ナトリウム緩衝液ｐＨ１１＋０．５ＭのＮａＣ１での洗浄により調 製した。サンプルをかけた後にカラムを１０ｍ１の０．０５Ｍ重炭酸ナトリウム 緩衝液ｐｌ（１１＋０．５ＭのＮａＣ１で洗浄し、モして各分画を回収した。そ の後このカラムを４ｍｌの０゜０５Ｍの酢酸アンモニウム溶出緩衝液ｐＦＩ４． ０で溶出させ、モして各分画を回収した。図４において示すように、多様な分画 について２８０ｎｍにおける吸光度を測定した。イムノビオチンカラム上でのｐ ＦＩを変化さぜた後のピーク分画をセファクリル２００カラムにおけるゲル濾過 に供した。溶出曲線は約６０ｋｄの見かけ上の分子量と一致し、このことにより ストレプトアビジンの四量体形態が精製されたことが示唆される。図４において 示されるように、幾つかの分画からのサンプルをウェスタンプロット分析により 分析した。ウェスタンプロットにおいて得ら第１た結果は四量体Ｓａｖの特性、 つまりイムノビオチンカラムからのｐＨ変化＋１の溶出および約６０ｋｄの分子 量という特性に一致した。

ｐＢＥ６５９を含むＢ、ズブチリス株ＢＥ１５１０を合成Ｓ７培地中で生育させ 、そしてＳａｖを先の方法もしくはバッチ法を使用して単離したが、このバッチ 法においてはイムノビオチンアガロースを硫酸アンモニウム分画に対して添加し 、その後にカラムにかけた。したがって、下流のプロセシングのためにその範囲 を広げることができるであろう方法を使用して異なる培地からＳａｖを単離する ことができるであろう。

実施例４ ストレプトアビジンの分泌におけるＮ−末端残基１がら１４までの役割成熟スト レプトアビジンの１５番目のコドンに対して融合させであるｎｐｒシグナルペプ チドコーディング領域からなる遺伝子融合物の作成法を記載する。この遺伝子融 合物の作成法においては以下に記載する、ａ）　Ｂ、アミロリクエファキエンス のｎｐｒ分泌ベクターを作製する段階、ｂ）Σａｖ成熟配列を作製する段階、お よびＣ）改変させである旦且ベクターに対する改変させてあるＳａＶ配列の融合 の段階、を必要領域を、製造元の説明書に従うＰＣＲ法を使用して（Ｐｅｒｋｉ ｎ　ＥＩｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ社、７６１　Ｍａｉｎ　Ａｖｅ、、Ｎｏｒｗａｌｋ 、ＣＴ　０６８５９、Ｇｅｎｅ　Ａｍｐ　ＰＣＲキット）、プライマ［１６５審 −ｘ？ＧＣＡ？ＧＧＴＡＣＣＧＡ？Ｃ？ＪＬＭＪ’！？ｆｆＣＣＣＣ−３’（配 列番号１）および ＶＮ４７　５ｌ−ＱＡＣＧＴＡＴＡＴＧＡａ？ＣＣＧＣＧＣＴＡＧＣＡ（：ＣＣ ＧＧＣＡＧＡＣＴＧＡＴ−３’（配列番号２）を使用して、プラスミドｐＢＥ８ ０　（２４）から増幅させた。増幅させた断片をフレノウ断片で処理して切れ切 れになっている末端をいずれも充填し、そしてＫｐｎおよびＥｃｏＲＶで消化さ せ、そしてこれをゲネクリーン（Ｇｅｎｅｃ　Ｉ　ｅａｎ）キット（Ｐ、　Ｏ， Ｂ。

ｘ　２２８４、Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、ＣＡ　９２０３８）を使用して精製した。プ ラスミドｐＢＥ５９２は大腸菌のアルカリ性フォスファターゼを含むベクターの 源であり、これはシグナルペプチド中において７つのアミノ酸欠損を含むこと以 外はプラスミドｐＢＥ５６７　（２４）　にｒ似している。大腸菌のアルカリ性 フォスファターゼ活性はこの蛋白質の輸出の表示物となるものであり、そしてフ ォスファターゼを分泌するコロニーは表示用プレート上では青色に見える（ＬＢ アガロース＋５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸’）（２３）。フ ォスファターゼが産生されないがために、プラスミドｐＢＥ５９２を含む大腸菌 株はＬＢアガロース＋５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸上におい ては白色となる。ＰＣＲ増幅させたｐＢＥ８０断片（Ｋｐｎ−Ｅｃ。

ＲＶ）をＫｐｎ−ＥｃｏＲＶで消化させたｐＢＥ５９２に連結させ、そしてこの 連結ＤＮＡで大腸菌を形質転換させ、そしてＬＢアガロース＋１００μｇ／ｍｌ のアンピシリン＋５０μｇ／ｍｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリ ン酸（Ｓ　ｉ　ｇｍａ社）上でプレート培養した。

青色のコロニーを単離し、制限分析により検証し、そしてそのようなプラスミド の一つをｐＢＥ９３と表示した。

（ｂ）ｓａｖ遺伝子の作製 ｐＢＥ６５１から一本鎖のＤＮＡを単離し、そして部位特異的突然変異誘発を２ つのオリゴヌクレオチドＶＮ４４とＶＮ５１を使用して行った。オリゴヌクレオ チドＶＮ４４ （ＧＴＣＴＣＧ　ＧＣＣＧＣＣＧＡＧ　にＣＴ　ムＧＣＧＣＣＧＣＣＧＧＣＡＴ ＣＡＣＣＧＧＤＩ（配列番号３）はＳａｖのコドン１５の前にあるＮｈｅ１部位 をコードしている。ＶＮ５１ （ＧＡＣＡＣＣＴｒＣＡＣＣＡＡＧ　ＧＴＧ　エムΩΩ工；　ΩΔ：　ＡＡＣＣ ＣＧ　丁ＣＣＧＣＣ）（配列番号４）は成熟ＳａＶのコドン１３３の下流にある 翻訳ターミネータ−および５ａ１１部位をコードしている。これらの形質転換体 を最初にＮｈｅ１部位の存在についてスクリーニングし、その後に５ａ１１部位 についてスクリーニングした。ｐＢＥ６７０は新規に作製されたＮｈｅ１部位を 含んでいたが、しかしながら５ａｌｌ消化は部分的消化を生じ、これによりそれ らの形質転換体はその細胞中に親ベクター（Ｓａ１１部位を持たない）と変位体 プラスミドとの両方を有することが示唆プラスミドｐＢＥ９３をＮｈｅおよびＰ ｓｔで消化させ、そしてＮｈｅｌ−Ｐｓｔで消化させたｐＢＥ６７０に対して連 結させ、そしてその後大腸菌を形質転換させ、そしてコロニー免疫アッセイによ りストレプトアビジン産生についてのスクリーニングを行った。陽性クローンの 内の一つをプラスミドｐＢＥ６７３として表示した。ｐＢＥ６７３の制限分析に よりこのプラスミドは３°末端上にＳａ１部位を含まず、そしてそのため残基１ ５から１５９までからなるＳａｖ蛋白質をコード化していることが明らかになう た。Ｂ、スブチリスのＢＥ１５００をｐＢＥ５７３で形質転換させ、モしてＫａ ｎｌｌ形質転換体をストレプトアビジン産生についてコロニー免疫アッセイによ りスクリーニングした。Ｂ、スフチリス株ＢＥ１５００　（ｐＢＥ６７３）およ びＢＥ１５１０　（ｐＢＥ６５９）を培地Ａ十カナマシンン（１０μｇ／ｍｌ） もしくはクロラムフェニコール（５μｇ／ｍｌ）中で生育させた。細胞外ストレ プトアビジンをウェスタンプロット分析により分析した（図５）。ｐＢＳＥ６７ ３により産生されるストレプトアビジンの移動度はｐＢＥ６５９のものよりもよ り早（、それは成熟ストレプトアビジンの残基１がら１４までの欠損のためであ る。ｐＢＥ６７３を含むＢ、ズブチリス株は成長培地中に効率よくストレプトア ビジンを分泌することができ、このことはストレプトアビジンの第１５番目の残 基に対して融合させたｎｐｒシグナルペプチドのハイブリッド融合接合点がＢ、 スブチリスにより効率よく認識されていることを示唆している。

ｐＢＥ６７３中の融合接合点にまたがるＤＮＡ配列を以下に示す。

ｎｐｒ−ｓａｖ　（１５１５９） ｓａｖのＮ−末端の配列 ／グナル（ｎｐｒ）　Ｎｈｅ　Ｉ　４１５（ｓａｖ）ＡＴＣＡＧＴ　ＣＴＧ　Ｃ ＣＧ　ＧＧＴ　ＧＣＴ　ＡＧＣＧＣＣＧＣＣＧＧＣＡＴＣ（配列番号５） 実施例５ Ｃ−末端融合物を作製するためのベクターこの実施例は多様なＣ−末端融合物を 作製するために使用することができる一連のベクターの作製法を説明する。これ らのベクターの作製法についての理論的解釈は少なくとも２つの要素からなる。

まず第一に、成長培地中のストレプトアビジンのオリゴマー形成におけるＣ−末 端テイルの役割を研究することができる。第二に、Ｓａｖのビオチン結合特性と 、レバノスクラーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−ラクタマーゼ、プロティ ンＡ、およびルシフェラーゼのような追加的酵素活性の両方を維持することがで きる最も安定な二官能性分子を同定することができる。融合蛋白質は通常ではＢ 、スブチリスの成長培地中において融合接合点で簡単に分断することができ、そ してそのため異なる融合接合点を作製することにより最も安定な蛋白質を同定す ることができる。

作製された制限酵素部位はＭｓｃｌであり、その理由はそのことにより平滑末端 が作製され、そしてその部位はこのベクター中において非反復であるためである 。Ｍｓｃ１部位は部位特異的突然変異誘発により、成熟−５ａｖのコドン１３２ と１３３．１３８と１３９，１４５と１４６、および１５９とターミネータ−コ ドンとの間に６塩基（ＴＧＧ　ＣＣＡ）を挿入することにより作製した。新規に 作製されたＭｓｃ１部位を使用して任意の異種蛋白質に対する翻訳融合物を作製 することができる。

コドン１３３と１３４との間のＭｓｃ１部位を作製するためのＶＮ５５゜ＡＣＣ ττＣＡＣＣＡＡＧ　ＧＴＧ　）ΩΩ−：：Δ　ＡＡＧ　ＣＣＧ　ＴＣＣＧＣＣ （配列番号６） コドン１３８ト１３９との間のＭｓｃ１部位を作製するためのＶＮ６７゜ＣＣＧ 　ＴＣＣＧＣＣＧＣＣｆｉ　ＴＣＣλ丁ＣＱλＣＧＣＧ　ＧＣＧ（配列番号７） コドン１４５と１４６よの間のＭｓｃ１部位を作製するためのＶＮ６８゜ＧＡＣ ＧＣＧ　ＧＣＧ　ＡＡＡ　ＡＡＧ　ｕ　ＧＣＣＧＧＣＧＴＣＡＡＣＡＡＣ（配列 番号８） ＳａＶの末端（１５９）におけるＭｓｃ１部位を作製するためのＶＮ６２゜ Ｍｓｃ１部位を有するプラスミドを制限分析により同定し、そして各々ｐＢＥ６ ２６　（ＶＮ６２）　、ｐＢＥ６２７　（ＶＮ６６）　、ｐＢＥ６２８（ＶＮ６ ７）、およびｐＢＥ６２９　（ＶＮ６８）とシテ表示シタ。ｐＢＥ６２６、ｐＢ Ｅ６２７、ｐＢＥ６２８、およびｐＢＥ６２９を含む大腸菌株はコロニー免疫ア ッセイにより決定した際、ストレプトアビジン産生について陽性を示した。これ らのベクターを使用して任意のレポーター蛋白１１（レバンスクラーゼ、β−ラ クタマーゼ、Ｐ　ｈ　ｏ　Ａ　ｓプロティンＡ、もしくはルシフェラーゼ）を融 合させることができる。したがってビオチン結合活性とレポーター蛋白質との両 方を有する最も安定な蛋白質を取得することができる。それぞれに対応するハイ ブリッド融合体の図式表示を図６において示す。

この実施例は、異なるシグナルペプチドを用いての、ストレプトアビジンとレバ ンスクラーゼとを含むハイブリッド融合蛋白質の作製法を説明する。プラスミド ｐＢＥ６５１　（図１ａ）からの−木端ＤＮＡを使用して、ＳａＶのコドン１５ ９と翻訳ターミネータ−との間にＥｃｏＲＶ部位を作製してプラスミドｐＢＥ６ ５３を取得した。したがってプラスミドｐＢＥ６５３からＳａＶ遺伝子をＥｃｏ ＲＶ断片として同定することができる。プラスミドｐＢＥ３１１はレバンスクラ ーゼをコードしており、そして成熟レバンスクラーゼの第二および第三コドンの 間にＥｃｏＲＶ部位を含んでいる（２４）、プラスミドｐＢＥ３１１をＥｃｏＲ Ｖで消化させ、モしてＥｃｏＲＶで消化させであるｐＢＥ６５３に対して連結さ せた。融合蛋白質をコードしているコロニーを同定する目的で、Ｂ、スブチリス 形質転換体を抗−ストレプトアビジン抗血清を使用するコロニー免疫アッセイに よりスクリーニングした。ｐＢＥ６５３はＳａヱ遺伝子を含むがＳａＶは発現さ れない。ｐＢＥ３１１はＳａＶ遺伝子を含まず、そしてそのため組換え体のみが 融合蛋白質を発現するであろう。レバンスクラーゼに対して融合させであるＳａ Ｖ断片を含むプラスミドをｐＢＥ６５５として表示した。ｐＢＥ６５５を含むＢ 、ズブチリス株を生育させ、そして３ｓＳ−メチオニンでラベル化し、そしてそ の培地をストレプトアビジンおよびレバンスクラーゼの存在についてゲル電気泳 動により分析した。分析に際し、融合蛋白質（Ｓａｖ−Ｌｖｓ）および成熟レバ ンスクラーゼ（Ｌｖｓ）に相当する蛋白質がその成長培地中に存在することを見 いだした。Ｂ、ズブチリス株ｐＢＥ６５５およびｐＢＥ３１１を培地Ａ（１８） 中で生育させ、そして細胞外レバンスクラーゼ活性を測定した（２０）。ｐＢＥ ６５５ＡとｐＢＥ６５５Ｂからの２つの独立した形質転換体中のレバンスクラー ゼ活性はｐＢＥ３１１のものよりも各々３９％および８６％高いことを見いだし た。

引用文献 Ｊ、　Ｊ、、　ａｎｄ　Ｓａｌｅｍｍｅ、　Ｆ、　Ｒ，、（１９８９）　５ｃｉ ｅｎｃｅ　２４３：８５−８８゜２、Ａｒｇａｒａｎａ、　Ｃ，Ｅ、、　Ｋｕｎ ｔｚ、　１．　Ｄ、、　Ｂｉｒｋｅｎ、　Ｓ、。

Ａｘｅｌ　Ｒ，、ａｎｄ　Ｃａｎｔｏｒ、Ｃ，Ｒ，、（１９８６）Ｎｕｃｌｅｉ ｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ　１４：１８７１−１８８２゜４°　Ｃａｎｔ ｏｒ　Ｃ，、ｋｘｅｌ、　Ｒ，、ａｎｄ　ｋｑａｒａｎａ、　Ｃ，、（１９８９ ）Ｕ、Ｓ、　Ｐａｔｅｎｔ　４，８３９，２９３．　Ｃ１社ｒｎｓ　１−２５　 ｗｉｔｈｄｒａｗｎ　ｄｕｅ　ｔ。

工ｎｔｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｄｅｃｉｓｉｏｎ　Ｎｏ、　１０２，４７７゜５、　 ５ａｎｏ、　Ｔ、、　ａｎｄ　Ｃａｎｔｏｒ、　Ｃ，Ｒ，、（１９９０）　Ｐｒ ｐｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ、　Ｓｃｉ、　８７：１４２−１４６゜６、　５ａｎｏ、 　？、、　ａｎｄ　Ｃａｎｔｏｒ、　Ｃ，Ｒ，、（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉ ｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｅａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｏ＋ｔｎｕｎ ｉｃａｔｉｏｎｓ１７６（２１：５７１−５７７゜ ’７．　Ｃｈａｎｇ、　Ｓ、、（１９８７１Ｕ、Ｓ、　Ｐａｔｅｎｔ　４，７１ １Ｊ４３゜８、Ｎａｇａｒａｊａｎ、　Ｖ、、　Ｒｈｏｄｅｓ、　Ｃ，Ｓ、、　 ａｎｄＢａｎｎｅｒ、　Ｃ，Ｄ、　Ｂ、、　（１９８９）　Ｕ、Ｓ、　Ｐａｔｅ ｎｔ　４，８０１，５３７゜９、Ｋｏｖａｃｅｖｉｃ、　Ｓ、、　Ｍｉｌｌｅｒ 、　Ｊ、　Ｒ，、ａｎｄｌｌ、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｈａｎｄｂｏｏ ｋ　２．　Ｂａｃｉｌｌｕｓ。

Ｃ，Ｒ−１（ａｒｄｗｏｏｄ、　Ｅｃｆ、、　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎ ｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９Ｂ９１　。

１３、Ｐａ１ｖａ　ｅｔ　ａｌ、、　（１９８３）、　Ｇｅｎｅ　２２．２２９ −２３５゜１４、　Ｄｉｏｎ　ｅｔ　ａユ、、（１９８９）、Ｂｉｏｃｈｉｍｅ 、７１．　７４７−７５５５゜１７、Ｇｏｅｄｄｅｌ、　Ｄ、　Ｖ−１（１９９ ０）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１８５；　Ｇａｎｅ　Ｅｘ ｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ａｃａｄａｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　 ＮｅｗＹｏｒｋ、　− １Ｂ、　Ｎａｇａｒａｊａｎ、Ｖ、、（１９９０１Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎ ｚｙｍｏｌｏｇｙユ８５　２：Ｌ４−２２３ゆ １９、　Ｖａｓａｎｔｈａ、Ｎ、、丁ｈｏｍｐｓｏｎ、Ｌ、Ｄ、、Ｒｈｏｄｅｓ 、Ｃ，。

Ｂａｎｎｅｒ、　Ｃ，、Ｎａｇｌｅ、　Ｊ、、　ａｎｄ　ｒｉｌｐｕｌａ、　Ｄ 、、（１９８４）　Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１５９　ａｌｌ−１８９，−１２０，７ＩＬｎｇ、　ｍａ ｒ　＋ｊ　シｍ５ｔｒａ、　λ、　Ｂｏｒｃｈｅし、　Ｔ−Ｖ−ｙ　紅ｄＮａｇ ａｒａｊａｎ、Ｖ、、　（１９９０）　Ｇａｎｅ　９６：８９−９３゜２１、Ｃ ｈａｎｇ、　Ｃ，Ｎ、、　Ｋｕａｎｑ、　Ｗ、　Ｊ、、　Ｃｈｅｎ、　Ｅ、　Ｙ 、。

（１９８６）Ｇｅｎｅ　４４，１２１（２６゜２２、Ｐａｄｄｏｎ、　Ｃ，Ｊ、 　ａｎｄ　１ｉａｒｔｌｅｙ、　Ｒ，Ｗ、、（１９８５）Ｇｅｎｅ　４０；２３ １−２３９゜ ２３、Ｈａｒｗｏｏｄ、Ｃ，Ｒ，、ａｎｄ　Ｃｕｔｔｉｎｇ、Ｓ、Ｎ、、（１９ ９Ｑ）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　 Ｂａｃｉｌｌｕｓ、　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙａｎｄ　５ｏｎｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒ ｋ。

２４、Ｎａｇａｒａｊａｎ、　Ｖ、、　Ａｌｂｅｒｔｓｏｎ、　Ｈ，、Ｃｈｅｎ 、　Ｎ、、　ａｎｄＰ、１ｂｂｅ、　Ｊ、、＋１９９２）　Ｍｏｄｕｌａｒ　Ｅ ｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　５ｅｃｒｅｔｉｏｎＶｅｃｔｏｒｓ　ｆｏｒ　Ｂ ａｃｉｌＴｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ、Ｇｅｎｅ、土ｎ　ｐｒｅｓｓ。

２５、　）ｉｏｆｍａｎｎ、Ｋ、、Ｗｏｏｄ、Ｓ、Ｗ、、Ｂｒ土ｎｔｏｎ、ｃ、 ｃ、。

ＭＯｎｔｉｂｅｌｌｅｒ、Ｊ、　Ａ、、ａｎｄ　ｒｉｎｎ、　Ｆ、　Ｍ、、（１ ９８０）　ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｃ、Ｓｃｉ、７７＋８１４６６６−４６６８゜２６、Ｈｅｎｅｙ、　Ｇ、 、　ａｎｄ　Ｏｒｒ、　Ｇ、　ｈ、ｔ　（１９８１）　ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢ ｉＯｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１１４：９２−９６゜２７、　Ｃｕａｔ二ｅｃ！−５ ａｓ、Ｐ、、ａｎｄ　Ｗｉｌｃｈｅｋ、Ｍ−ｔ　（１９６８ＬＢｉｏｃｈａｍｉ ｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｅａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉ ｃａｔ土ｏｎｓ３３Ｆ２＋２３５−２３９゜ 配列表 （１）一般情報 （ｉ）　出願者：ＮＡＧＡＲＡＪＡＮＳＶＡＳＡＮＴＨＡ（ｉｌ、発明の名称： 　バチルス　スブチリスからのストレプトアビジンの産生 （ｉ　ｉ　ｉ）配列数＝１４ （ｉｖ）通信先住所： （Ａ）住所：ＤＵ　ＰＯＮＴ　ＣＯＭＰＡＮＹ（Ｂ）街路名：　ＢＡＲＬＥＹ　 ＭＩＬＬ　ＰＬＡＺＡ　３６（Ｃ）市：ＷＩＬＭＩＮＧＴＯＮ （Ｄ）州：ＤＥＬＡＷＡＲＥ （Ｅ）国：米国 （Ｆ）ＺＩＰ：　１９８８０−００３６（ｖ）コンピューター解読可能形態： （Ａ）メディウムの穫類：フロッピーディスク（Ｂ）コンピューター＋ＩＢＭ　 ＰＣｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ（Ｃ）操作システム：　ＰＣ−ＤＯ３／ＭＳ−ＤＵ３ （Ｄ）ソフトウェアー：Ｐａｔｅｎｉｎ　Ｒｅ１ｅａｓｅ　＃１゜０、Ｖｅｒｓ ｉｏｎ　１１．２５ （■１）現在の出願者のデータ （Ａ）出願番号・ （Ｂ）提出日： （Ｃ）分類： （ｖ　ｉ　ｉ　ｉ）弁護士／代理人の情報（Ａ）氏名：ＧＥＩＧＥＲ，ＫＡＴｌ （ＬＥＥＮ　Ｗ（Ｃ）参照／整理番号：ＣＲ９０２９ （ｉｘ）通信情報： （Ａ）電話番号：　３０２−８９２−２１１８（Ｂ）テレファックス：　３０２ −８９２−７９４９（２）配列番号１についての情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：２９ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｘ　ｉ）配列：配列番号１； λ？ＧＣＡ？ｅＧ’ＴＡ　ＣＣαＬｒＣ？Ｗ　ムＴｒ門にΣＣＣ・　２５（２） 配列番号２についての情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ＝３９ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）配列の種類：ＤＮＡＣゲノム）（ｘｉ）配列：配列番号２： ＧｋＣＣ；’！λ丁ｋ”ｒＧ　ＡＴ＆？ＣＣＧＣＧＣＴｇ＾ｃｃＣＧＧ　ｃ＾α λＣ？α八Ｔ　へ　３９（２）配列番号３についての情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ、３９ （Ｂ）配列の型；核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー；直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｘ　ｉ）配列：配列番号３： ＧフＣＴＣＧＧＣＣＧ　ＣＣ（ａ入ＧＧＣ丁入Ｇ　ＣＧＣＣＧＣＣＧＧＣ＾丁Ｃ 入ＣＣＧＧＣ３Ｇ（２）配列番号４についての情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ・３９ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）蛸の数・−重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （爾）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （ｘｌ）配列　配列番号４゜ ＧＡＣＡＣＣ’ｒ？ＣＡ　ＣＣＡＡＧＧ？Ｇ’ＴＡ　ＧＧＴ工心初心Ｍｄ　３！ １（２）配列番号５についての情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：３３ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｉ）配列：配列番号５： λ丁ＣｋＧＴＣテＧＣＣＧＩＡＴＧＣＴＮ５　ＣＧｅＣＧＣＣＧＧＣＡ〒Ｃ３３ （２）配列番号６についての情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ、３３ （Ｂ）配列の型・核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎮 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類＝ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｉ）配列：配列番号６： ＡＣＣ？ＴＣＡＣＣＡ　ＡＧＧ？ＧＴＧＧＣｅ　大入ＡＧＣＣＧテＣＣＧＣＣ３ ３（２）配列番号７についての情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：３３ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロンー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｉン配列、配列番号７： ｃｃｃ’ｔｃｃｃｃｃＧ■コ力αスにロ二工猷頂工Ｃｄ’ｓ　３３（２）配列番 号８についての情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ＝３６ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｌ）配列；配列番号８； Ｇ入ＣＧＣＧＧＣＧＡ　轟入入入Ｇ丁ＧＧＣＣ＾ｃｅｃＧｅｃａ丁ＣムＡＣ入＾ Ｃ３Ｇ（２）配列番号９についての情報 （ｉ）配列の特徴 （Δ）配列の長さ：３６ （Ｂ）配列の型・核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｌ）配列：配列番号９： ＧＡ：ＧＣＣＧＴ？ＣＡＧＣＡＧ丁ＧＧ：ＣＡ？ＡＧ？ＣＧＣＧＴ　ＣＣＣＧＧ Ｃ３６（２）配列番号１０についての情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：２１ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｉ）配列：配列番号１０： Ｇ’Ｔ？ＣＡＧＩｌｓｌ：ＣＧ　Ｃ？ＧＡＧＧＡＴＡ？　Ｃ２゜（２）配列番号 １１についての情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ＝１８ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｉ）配列：配列番号１１： ＧＣ？？ＣＣ〈ｋニーＧ入丁Ａ？Ｃ？ＣＣ１゜（２）配列番号１２についての情 報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：２４ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｘ　ｉ）配列：配列番号１２： ＣτテＣＡＧＧＣＣＧ　Ｃ丁ＧＡＧＣ入丁入丁　Ｃ？Ｃ：Ｃ２４（２）配列番号 １３についての情報 （ｉ）配列の特徴 （Δ）配列の長さ：５５２ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー・直鎖状 （薗）配列の種類・ＤＮＡ　（ゲノム）（ｘｉ）配列、配列番号１３： （２）配列番号１４についての情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：１８３ （Ｂ）配列の型・アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：不明 （Ｄ）トポロジー二不明 （ｉ　ｉ）配列の種類：蛋白質 （ｘ　ｉ）配列：配列番号１４： Ｍ１人ｘｇＬｙｓエエ＠ＶａｌＶａｌＡよａ１＾」、１工１ｅムよ―ｖａλ５ｉ ｒＬ・ｕ丁ｈｒテｈｒＶａユニ５１Ｏ１５ Ｓｅｘ　Ｘｉｓ　ｔｈｘ　ｋＬａ　ＳａｇλＬａ　Ｓｅｔ　Ａｉａ　Ａａｐ　Ｐ ｒｏ　Ｓａｔ　ｌ＋％　ＡＪｐ　Ｂａｒ　Ｌｙｅ入１Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｓ＠ｘ　 ムユ龜　ムｉａ　Ｇｌｕ　Ｊｕａ　Ｇｌｙ　Ｘｉｓ　テｂｘ　Ｇｌｙ　ｔｂｘ　 テＫｐ　テｙｒ　ムｓｎ　Ｇ１ｎＸＡｕ　Ｇｌｙ　Ｓｅｘ　丁ｈｒ　Ｐｂ＊　Ｘ ｉｓ　Ｖａｌ　ｔｈｘ　ムｉａ　Ｇｌｙ　Ａユ１　為ａｐＧ工ｙｈニー　シｍｕ 　丁ｔ＋ｒｓｏ　ｓｓ　ｇ。

Ｇｌｙテｈｒ？ｙｒＧｌｕＳｅｘＡユａＶａｌＧｌｙｋｓｏ＾ユ＆ＧｌｕＳａＫ 五１コンＴｉｔＶａＬ！ａｕ６５　７０　７５　口０ テｈｒ　Ｇｌｙ　＾ｒマ　Ｔｙｒ　ＡＪｐ　８＠ｒ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　 テｈｒ　ＡＪＰ　Ｇユｙｓ・ｒ　Ｇｌｙ　テｈｒ、＾コ、−８５ＪＯ９５ ＸＡｕ　Ｇｌｙ　テｆ　テｈｒ　Ｖａｌ　ム１−　テｒｐ　ｚｙｓ　＾１ｎ　為 １ｎ　テｙｘ　ムｘ９　為１ｎ　Ａｉａ　ｍｉｍ　＄＠ｌ！ユｏｏ　ｚｏｓ　ｘ ｚ。

Ａｌａ　Ｔｂｔ　ｔｈｘ　２ｒｐ　Ｓ＠ｒ　Ｇｌｙ　ＧＬ！ｌ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ Ｇｌｙ　Ｇｈｙ　ｈｌａ　Ｇｌｕ　Ｊｕａ　ＪＬｒｇ　ＸＬ| １１５ｉ２０　１２５ ｋｓｎ　丁ｈｒ　Ｇｉｎ　？ｒｐ　Ｌ＠ｕ　シ・ｕ　丁ｈｘ　Ｂａｒ　Ｇｌｙ　 テｈｒ　テｈｒ　Ｇｌｕ　入ユａ　Ａｓｎ　Ａｌａ　テｒＰＬｙｓ　Ｓｅｒ　テ ｈｒ　Ｌｓｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　）ｌｉｓ　ｋｓｐ　丁ｈｒ　ｔｈｅ　テｈｒ　 Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｌｙｅ　Ｐｒｏ　Ｓｅ■ ユ４５　１５０　１５５　１６０ λユａ　ｋｉａ　Ｓａｔ　Ｘ工・　＾ｓｐ　入ユａ　入ｉｌｌ　Ｌｙａ　Ｌｙｓ 　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｖａｎ　Ａｓｎ　Ａａｎ　Ｇｌｙ　＾１■ ユ８０ 〕 ＦＩＧ、３ ＦＩＧ、４ａ 分画番号 ＦＩＧ、４Ｂ 分画番号 ＦＩＧ、５ａ ＦＩＧ、７ 補正書の写しく翻訳文）提出書　（特許法第１８４条の８）平成６年１１月２４ 日

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．ａ．シグナルペプチドをコード化する配列および発現因子に対して操作可能 に連結させてあるストレプトアビジンをコード化する配列を含んでなり、かつシ グナルペプチドをコード化する当該配列が細菌のエキソ蛋白質をコードするＤＮ Ａから単離され、そして当該発現因子がグラム陽性細菌の蛋白質をコード化する ＤＮＡから単離されている、遺伝子構築物でバチルススブチリスを形質転換させ る段階、ｂ．形質転換させたバチルススブチリスを適切な成長培地中において生 育させ、そのことによりストレブトアビジンを成長培地中に分泌させる段階、お よび ｃ．その成長培地からストレブトアビジンを精製する段階、を含んでなる、バチ ルススブチリスからの分泌により四量体の生物学的に活性なストレブトアビジン を産生するための方法。
2. ２．シグナルペプチドをコード化する当該配列および当該発現因子が、バチルス アミロリクエファキエンスからなる群より各々独立して得られるａｐｒ、ｎｐｒ 、ｌｖｓ、およびｂａｒから選択される、請求の範囲１の方法。
3. ３．シグナルペプチドをコード化する当該配列および当該発現因子がバチルスア ミロリクエファキエンスからのｎｐｒから得られる、請求の範囲１の方法。
4. ４．シグナルペプチドをコード化する当該配列および当該発現因子がバチルスア ミロリクエファキエンスからのｌｖＳから得られる、請求の範囲１の方法。
5. ５．当該発現因子がプロモーター配列とリボソームの結合部位配列からなる、請 求の範囲１の方法。
6. ６．当該プロモーター配列が誘導可能である、請求の範囲５の方法。
7. ７．シグナルペプチドをコード化する配列および発現因子に対して操作可能に連 結させてありストレブトアビジンをコード化する配列を含んでなり、かつシグナ ルペプチドをコード化する当該配列が細菌のエキソ蛋白質をコード化するＤＮＡ から単離され、そして当該発現因子がグラム陽性細菌蛋白質をコード化するＤＮ Ａから単離される、遺伝子構築物を有する、四量体の生物学的に活性なストレブ トアビジンを分泌することができる形質転換させたバチルススブチリスバクテリ ウム。
8. ８．シグナルペプチドをコード化する当該配列および当該発現因子が、バチルス アミロリクエファキエンスから得られるａｐｒ、ｎｐｒ、ｌｖｓ、およびｂａｒ 遺伝子からなる群より各々独立して選択される、請求の範囲７のバクテリウム。
9. ９．ａ．第二の所望の蛋白質をコード化する配列に対して融合されたストレブト アビジンをコード化する配列を含んでなり、かつ当該融合化配列がシグナルペプ チドをコードする配列および発現因子に対して操作可能に連結されており、シグ ナルペプチドをコード化する当該配列が細菌のエキソ蛋白質をコード化するＤＮ Ａから単離され、そして当該発現因子がグラム陽性細菌の蛋白質をコード化する ＤＮＡから単離されている融合遺伝子構築物を用いてバチルススブチリスを形質 転換させる段階、 ｂ．形質転換させたバチルススブチリスを適切な成長培地中において生育させ、 融合されたストレブトアビジンと所望の蛋白質とをそのことにより成長培地中に 分泌させる段階、およびｃ．その成長培地から融合させてあるストレブトアビジ ンと所望の蛋白質とを精製する段階、 を含んでなる、バチルススブチリスからの分泌により、第二の所望の蛋白質に対 して融合された四量体の生物学的に活性なストレブトアビジンを含んでなる融合 遺伝子産物を産生させるための方法。
10. １０．シグナルペプチドをコード化する当該配列および当該発現因子が、バチル スアミロリクェファキェンスからのａｐｒ、ｎｐｒ、ｌｖｓ、およびｂａｒ遺伝 子からなる群より各々独立して選択される、請求の範囲９の方法。
11. １１．当該融合された遺伝子産物が、第二の所望の蛋白質のＣ−末端に対して融 合させてある四量体の生物学的に活性なストレブトアビジンを含んでなる、請求 の範囲９の方法。
12. １２．当該融合された遺伝子産物が、第二の所望の蛋白質のＮ−末端に対して融 合させてある四量体の生物学的に活性なストレブトアビジンを含んでなる、請求 の範囲９の方法。
13. １３．当該第二の目的蛋白質が、レバンスクラーゼ、アルカリ性フォスファター ゼ、β−ラクタマ−ゼ、ルシフェラーゼ、およびプロテインＡからなる群より選 択される、請求の範囲９の方法。
14. １４．融合された遺伝子産物がその融合蛋白質のＮ−末端上のストレブトアビジ ンおよびその融合蛋白質のＣ−末端上のレバンスクラーゼからなり、そして当該 融合遺伝子構築物がバチルスアミロリクエファキエンスのレバンスクラーゼ遺伝 子から単離された発現因子ならびにシグナルペプチドをコード化する配列を含ん でなり、この配列は成熟ストレブトアビジンをコード化する配列に対して融合さ れており、この配列はバチルスアミロリクエファキエンスからの成熟レバンスク ラーゼをコード化する配列に対して融合されている、請求の範囲１２の方法。
15. １５．請求の範囲１１もしくは１２の方法により産生される融合遺伝子産物。
16. １６．第二の所望の蛋白質に対して融合された四量体の生物学的に活性なストレ プトアビジンを分泌することができる形質転換されたバチルススブチリスバクテ リウムであって、第二の所望の蛋白質をコード化する配列に対して融合されたス トレブトアビジンをコード化する配列を含んでなり、かつ当該融合配列がシグナ ルペプチドをコード化する配列および発現因子に対して操作可能に連結されてお り、そしてシグナルペプチドをコード化する当該配列が細菌のエキソ蛋白質をコ ード化するＤＮＡから単離され、そして当該発現因子がグラム陽性細菌蛋白質を コード化するＤＮＡから単離された融合遺伝子構築物を有する、上記バクテリウ ム。
17. １７．当該融合蛋白質が、第二の所望の蛋白質のＣ−末端に対して融合された四 量体の生物学的に活性なストレブトアビジンを含んでなる、請求の範囲１５のバ クテリウム。
18. １８．当該融合蛋白質が、第二の所望の蛋白質のＮ−末端に対して融合させてあ る四量体の生物学的に活性なストレブトアビジンを含んでなる、請求の範囲１５ のバクテリウム。
19. １９．シグナルペプチドをコード化する当該配列および当該発現因子が、バチル スアミロリクエファキエンスからのａｐｒ、ｎｐｒ、ｌｖｓ、およびｂａｒ遺伝 子からなる群より各々独立して選択される、請求の範囲１６のバクテリウム。
20. ２０．当該第二の目的蛋白質が、レバンスクラーゼ、アルカリ性フォスファター ゼ、β−ラクタマ−ゼ、ルシフェラーゼ、およびプロテインＡからなる群より選 択される、請求の範囲１６のバクテリウム。
21. ２１．プラスミドｐＢＥ６５９、ｐＢＥ６６０、ｐＢＥ６６１、ｐＢＥ６６２、 ｐＢＥ６６３、ｐＢＥ６７３、およびｐＢＥ６５５。