JP2022527351A - 結合ペプチドを選択し検出するための方法 - Google Patents
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Abstract
標的に結合するペプチドを選択し、検出し、および／または濃縮するための方法が、提供される。【選択図】なし
Description
本発明は、ｍＲＮＡディスプレイ技術の分野のものである。より特定すると、本発明は、細胞発現または可溶性ペプチドに対してペプチドを、そして所望の機能特性を有するペプチドを、選択し、検出し、および／または濃縮するための方法に関する。
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）ディスプレイは、可溶性ペプチドおよび可溶性タンパク質に対する選択技術である。（Ｓｚｏｓｔａｋ Ｒ．ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ－ｐｅｐｔｉｄｅ ｆｕｓｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４，１２２９７－１２３０２（１９９７））。メッセンジャーＲＮＡディスプレイは、天然および非天然アミノ酸を含み得る高度に多様なペプチドライブラリの構築を可能にする。非天然アミノ酸の組み込みは、アンバーコドンのサプレッションおよび修飾ｔＲＮＡの利用（非天然アミノ酸のｔＲＮＡへの化学的コンジュゲーション）を含む様々なアプローチによって、またはフレキシザイムと呼ばれる人工リボザイムで作られた高度に可動性のｔＲＮＡアミノアシル化酵素によって可能になる。（Ｎｉｗａ Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ａ ｆｌｅｘｉｚｙｍｅ ｔｈａｔ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｃｈａｒｇｅｓ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｂｙ ａ ｗａｔｅｒ－ｆｒｉｅｎｄｌｙ ｌｅａｖｉｎｇ ｇｒｏｕｐ．Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ １９（１４），３８９２－３８９４（２００９））。
ｍＲＮＡディスプレイを用いてペプチドを選択するプロセスは、伝統的に、ＤＮＡのバリアントプールからｍＲＮＡを転写すること、その３’末端でピューロマイシンにコンジュゲートされている短いＤＮＡリンカーにｍＲＮＡバリアントをアニールさせることを含む（Ｉｓｈｉｚａｗａ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，ＴＲＡＰ Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ Ｈｉｇｈ－Ｓｐｅｅｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３５（１４），５４３３－５４４０（２０１３））。これにより、ｍＲＮＡ：ＤＮＡリンカー－ピューロマイシンライブラリが作製される。翻訳は、細菌もしくはウサギ網状赤血球溶解物またはＰｕｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）を添加することによって開始される。
翻訳の間、リボソームは、各ｍＲＮＡに沿って移動し、ｍＲＮＡ中に保存されている遺伝学的情報をペプチド配列に翻訳する。リボソームがペプチド配列の終結における操作されたＴＡＧ終止コドンに遭遇すると、それらは終結因子１の非存在下で失速し、ピューロマイシンがリボソーム部位Ａに入ることを可能にする。その結果、ピューロマイシンはポリペプチド成長鎖とｍＲＮＡとの間に共有結合を作る。翻訳は停止し、ピューロマイシンに融合したＤＮＡリンカーにハイブリダイズしたｍＲＮＡはここでペプチドに連結される。次いで、ｍＲＮＡはｃＤＮＡに逆転写されて、ＰＣＲ増幅を可能にし、選択の間の非特異的結合が低減した安定なＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を生成する。ライブラリは目的の標的に対して選択され、非特異的ペプチドは洗い流され、結合体は溶出される。選択効率は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によってモニターされる。次世代シーケンシングが、複数ラウンドのシーケンスの後に濃縮されるペプチド配列を決定するために使用される。
ｍＲＮＡライブラリの選択は、可溶性ペプチドに対する強く特異的な結合体を生成したが、ｍＲＮＡディスプレイは、細胞発現標的に対する選択に適合性でない。したがって、タンパク質またはタンパク質アナログなどの細胞発現標的に対して選択する方法の必要性が依然として存在する。さらに、大部分の従来の方法は、ｑＰＣＲを使用して、効率を決定するためのインプット分子に対するアウトプットの比率（回収割合）を決定する。しかしながら、選択されたペプチドは、特異的および非特異的の両方の結合体を含む。したがって、特異的結合体のみを選択する方法が必要とされている。
したがって、本発明は、細胞発現および可溶性のペプチドまたはペプチドアナログに対してｍＲＮＡディスプレイライブラリを選択する方法を提供する。本発明はまた、効率決定のより正確な尺度となる、各選択ラウンドにおける標的特異的ペプチドの濃縮を定量的にモニターする手段を提供する。加えて、本発明の選択条件は、可溶性および細胞発現標的に対する選択のためにリアルタイムで得られるデータに基づいて変更され得る。さらに、本発明は、細胞発現および組換えタンパク質に対して標的特異的ペプチドを選択するためにＦＡＣＳを組み込むことを可能にし、機能選択（細胞ベースのアッセイにおいて所望の機能を有するペプチドを選択すること）を可能にし、細胞内にインターナライズするペプチドを同定する能力を与える。
ピューロマイシンは、ピューロマイシン－ＤＮＡリンカーを得るために、短いＤＮＡリンカーに結合する。次いで、フルオロフォアは、ピューロマイシン－ＤＮＡリンカーの５’末端に融合され、得られるＤＮＡリンカーは、その３’末端でピューロマイシンに、その５’末端でフルオロフォアに融合される。その結果、ライブラリ中の各ｍＲＮＡ－ＤＮＡ－ペプチド分子は、ＤＮＡリンカーにアニールすると自動的にフルオロフォアでタグ付けされ、これによりＦＡＣＳおよびフローサイトメトリーの、ｍＲＮＡディスプレイプラットフォームとの統合が可能になる。同様のアプローチで、タグに対する特異性を有する蛍光ペプチド、抗体、または他の蛍光分子がｍＲＮＡ－ＤＮＡ－ペプチド分子に結合するように、タグ（ＦＬＡＧ（商標）タグなど）をｍＲＮＡ－ＤＮＡ－ペプチド複合体に組み込んでもよく、これによりＦＡＣＳおよびフローサイトメトリーの統合が可能になる。
ＦＡＣＳおよびフローサイトメトリーのこの統合は、各選択ラウンドにおける標的特異的ペプチドの濃縮を定量的にモニターする手段を提供するが、従来の方法は、インプット分子に対するアウトプットの比率（回収割合）を決定するためにｑＰＣＲを使用する。本発明の方法は、ｑＰＣＲ回収割合決定を上回る利点を提供し、後者ついては、各選択ラウンドの間に、特異的および非特異的の両方の結合体が選択される。したがって、ｑＰＣＲ回収割合決定を使用した結果、各選択ラウンドにおいて特異的および非特異的の両方の結合体が測定される。しかしながら、フローサイトメトリーおよびＦＡＣＳによる濃縮および選択により、大部分が特異的結合体の選択が可能になる。
本発明の方法はまた、リアルタイムで得られるデータに基づいて選択条件を変更することができるので有利である。さらに、このアプローチは、細胞発現および組換えタンパク質に対して標的特異的ペプチドを選択するためにＦＡＣＳを組み込むことを可能にし、機能選択を可能にし、細胞内にインターナライズするペプチドを同定する能力を与える。
したがって、本発明は、標的への結合ペプチドを検出し、または選択するための方法を提供し、ここで、前記方法は、少なくとも１つの検出可能物質に結合したｍＲＮＡ－ＤＮＡ－ペプチド複合体を検出し、または選択することを含む。実施態様では、検出可能物質はフルオロフォアである。特定の実施態様では、フルオロフォアは、有機色素、生物学的フルオロフォア、または量子ドットである。特定の実施態様では、検出可能物質は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒである。いくつかの実施態様では、検出可能物質は、ピューロマイシンリンカーにコンジュゲートされている。
本発明はまた、標的への結合ペプチドを検出し、または選択するための方法を提供し、ここで、前記方法は、少なくとも１つの検出可能物質に結合したｍＲＮＡ－ＤＮＡ－ペプチド複合体を検出し、または選択することを含み、そして、ここで、検出可能物質は、タグである。実施態様では、タグは、天然または非天然のアミノ酸を含む。実施態様では、タグは、ペプチドタグである。特定の実施態様では、ペプチドタグは、ＦＬＡＧ（登録商標）タグである。実施態様では、タグは、蛍光分子によって検出される。特定の実施態様では、タグは、蛍光ペプチドによって検出される。別の特定の実施態様では、タグは、蛍光抗体によって検出される。
実施態様では、本発明の方法は、ソーティングを可能にする材料上に固定化されている標的を含む。特定の実施態様では、ソーティングを可能にする材料は、ビーズである。実施態様では、標的は、ペプチド、タンパク質、核酸、糖、脂質、哺乳動物細胞、または哺乳動物細胞抽出物である。特定の実施態様では、標的は、ペプチドまたはタンパク質である。
実施態様では、本発明の方法は、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む結合ペプチドを含む。
別の実施態様では、本発明の方法の結合ペプチドは、検出可能物質によって検出され、または選択される。いくつかのそのような実施態様では、結合ペプチドは、フローサイトメトリーまたはＦＡＣＳによって検出され、または選択される。他のそのような実施態様では、結合ペプチドは、ＥＬＩＳＡ、分光光度法、蛍光分光法、または顕微鏡法によって検出され、または選択される。好ましい実施態様では、結合ペプチドは、フローサイトメトリーによって検出される。別の好ましい実施態様では、結合ペプチドは、ＦＡＣＳによって選択される。実施態様では、結合ペプチドは、検出され、選択される。いくつかのそのような実施態様では、結合ペプチドは、フローサイトメトリーによって検出され、結合ペプチドは、ＦＡＣＳによって選択される。
実施態様では、本発明の方法は、少なくとも１つの検出可能物質をｍＲＮＡライブラリに組み込んで、ｍＲＮＡ－検出可能物質の複合体を産生することを含む。さらなる実施態様では、本発明の方法は、ｍＲＮＡ－検出可能物質の複合体を翻訳して、ｍＲＮＡ－ペプチド－検出可能物質の複合体を産生することを含む。さらなる実施態様では、本発明の方法は、ｍＲＮＡ－ペプチド－検出可能物質の複合体を逆転写して、ｍＲＮＡ－ＤＮＡ－ペプチド－検出可能物質の複合体を得ることを含む。特定の実施態様では、本発明の方法は、少なくとも１つの検出可能物質をｍＲＮＡライブラリに組み込んで、ｍＲＮＡ－検出可能物質の複合体を産生し、ｍＲＮＡ－検出可能物質の複合体を翻訳して、ｍＲＮＡ－ペプチド－検出可能物質の複合体を産生し、ｍＲＮＡ－ペプチド－検出可能物質の複合体を逆転写して、ｍＲＮＡ－ＤＮＡ－ペプチド－検出可能物質の複合体を得ることを含む。実施態様では、ｍＲＮＡ－ＤＮＡ－ペプチド－検出可能物質の複合体は、フローサイトメトリーによって検出される。別の実施態様では、ｍＲＮＡ－ＤＮＡ－ペプチド－検出可能物質の複合体は、ＦＡＣＳによって選択される。
実施態様では、本発明の方法は、テンプレートＤＮＡライブラリを転写して、ｍＲＮＡライブラリを得ることを含む。
実施態様では、本発明の方法は、標的に結合していないｍＲＮＡ－ＤＮＡ－ペプチド複合体を除去することをさらに含む。
実施態様では、本発明の方法は、標的からｍＲＮＡ－ＤＮＡ－ペプチド複合体を除去することを含む。特定の実施態様では、ｍＲＮＡ－ＤＮＡ－ペプチド複合体は、酸または熱を加えることによって除去される。特定の実施態様では、ｍＲＮＡ－ＤＮＡ－ペプチド複合体は、熱によって除去される。実施態様では、方法は、除去されたｍＲＮＡ－ＤＮＡ－ペプチド複合体のＤＮＡをＰＣＲによって増幅することをさらに含む。実施態様では、方法は、増幅されたＤＮＡを転写して、ｍＲＮＡライブラリを得ることをさらに含む。
実施態様では、本発明の方法は、結合ペプチドのアミノ酸配列を決定することを含む。実施態様では、本発明の方法は、結合ペプチドの核酸配列を決定することをさらに含む。
実施態様では、本発明は、本発明の方法によって検出され、または選択される結合ペプチドを提供する。
本発明はまた、少なくとも１つの検出可能物質に結合したｍＲＮＡ－ＤＮＡ－ペプチド複合体を提供する。実施態様では、本発明は、少なくとも１つの検出可能物質に結合したｍＲＮＡ－ＤＮＡ－ペプチド複合体のライブラリを提供する。実施態様では、検出可能物質は、フルオロフォアである。実施態様では、フルオロフォアは、有機色素、生物学的フルオロフォア、または量子ドットである。特定の実施態様では、検出可能物質は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒである。実施態様では、検出可能物質は、ピューロマイシンリンカーにコンジュゲートされている。別の実施態様では、検出可能物質は、タグである。いくつかのそのような実施態様では、タグは、天然または非天然アミノ酸を含む。実施態様では、タグは、ペプチドタグである。いくつかのそのような実施態様では、タグは、ＦＬＡＧ（登録商標）タグである。実施態様では、タグは、蛍光分子によって検出される。特定の実施態様では、蛍光分子は、フルオロフォアに結合したペプチドまたは抗体である。
「ペプチド」には、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、抗体フラグメント、および抗体融合タンパク質が含まれるが、これらに限定されない。「ペプチド」は、ポリペプチド、タンパク質、抗体、抗体フラグメント、および抗体融合タンパク質と互換的に使用され得る。本明細書で使用される「結合ペプチド」は、標的に結合するペプチド（ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、抗体フラグメント、および抗体融合タンパク質を含む）を指す。
本明細書で使用される「リンカー」は、翻訳産物に結合することができる試薬を指す。リンカーには、アミノ酸、アミノ酸アナログ、ピューロマイシン、およびピューロマイシンアナログが含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、リンカーは、その３’末端でピューロマイシンまたはピューロマイシンアナログなどのアミノヌクレオシドに融合したオリゴヌクレオチドである。
本明細書で使用される「標的」は、翻訳産物と相互作用することができる分子を指す。標的は、結合ペプチドに結合する能力を有するペプチド、タンパク質、核酸（ＤＮＡもしくはＲＮＡ）、糖、脂質、哺乳動物細胞、哺乳動物細胞抽出物、または別の分子であり得る。標的は、精製（部分精製を含む）、細胞膜中への挿入、ファージ上のディスプレイ、酵母上のディスプレイ、バキュロウイルス上のディスプレイ、または細胞上のディスプレイをされ得る。標的はまた、ナノディスク（Ｎａｎｏ ｄｉｓｃ）、アンフィポール（Ａｍｐｈｉｐｏｌ）、またはリポソーム上に提示される哺乳動物細胞発現タンパク質であり得る。ナノディスクおよびアンフィポールは、膜結合タンパク質を安定化するために使用される。
ＤＮＡリンカーに結合した（組み込まれた）フルオロフォア、またはｍＲＮＡ－ＤＮＡ－ペプチド複合体に組み込まれたタグは、各々、ｍＲＮＡ－ＤＮＡ－ペプチド複合体に組み込まれる「検出可能物質」の例である。「結合する」および「組み込む」（およびそれらの派生語）は、検出可能物質を含む分子または他のそのような構造に関係する場合、本明細書で互換的に使用され得る。
当業者は、例えば、ＦＬＡＧ（登録商標）タグが、ペプチド配列ＤＹＫＤＤＤＫによって与えられることを認識することができる。ＦＬＡＧ（登録商標）タグに加えて、本発明の方法において使用され得る他のペプチドタグの例には、ＨＡタグ、Ｈｉｓタグ、ｃ－ｍｙｃタグ、およびＳタグが含まれるが、これらに限定されない。
「翻訳産物」は、ｍＲＮＡ翻訳の産物を指す。好ましくは、翻訳産物は、標的に結合することができるペプチドである。
本明細書で使用される「選択」およびその派生語は、ライブラリ中の他の分子から特定の分子を実質的に単離することを指す。複数の選択ラウンドの後、所望の表現型を有する分子がライブラリにおいて濃縮されることが期待される。
本明細書で使用される「天然アミノ酸」は、標準的な翻訳において使用されるαアミノカルボン酸（または置換αアミノカルボン酸）である２０種類のアミノ酸を指す。これには、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、プラリン（ｐｒａｌｉｎｅ）（Ｐｒｏ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、グリシン（Ｇｌｙ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、チロシン（Ｔｙｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、およびグルタミン酸酸（Ｇｌｕ）が含まれる。
本明細書で使用される「非天然アミノ酸」は、一般に、天然の翻訳の間に使用される２０種類の天然アミノ酸とは構造が異なるアミノ酸を指す。非天然アミノ酸は、修飾官能基を有する天然に生じるアミノ酸を含み得る。これには、Ｄ－アミノ酸、Ｎ－メチルアミノ酸、α－メチルアミノ酸、Ｎ－アシルアミノ酸、Ｂ（ベータ）－アミノ酸、Ｙ（ガンマ）－アミノ酸、およびＯ（デルタ）－アミノ酸を含むがこれらに限定されない、すべての非天然アミノ酸または人工アミノ酸が含まれる。デルタアミノ酸は、その側鎖構造が一部で化学的に変化／修飾されている天然アミノ酸、またはアミノ酸骨格上のアミノ基もしくはカルボキシル基が置換されている構造を有する誘導体である。非天然アミノ酸が導入されている、または本明細書で「非天然ペプチド」というプチドには、これらの種々の非天然アミノ酸を構成要素として有するポリマーが含まれる。非天然ペプチドは、部分的にまたは完全に非天然アミノ酸から構成され得る。したがって、非天然ペプチドは、その構造が標準的なアミド結合と異なる主鎖を有し得る。
本明細書で使用される「ライブラリ」は、複数の核酸、翻訳産物、産物／リンカー／ｍＲＮＡ複合体、および翻訳産物／リンカー／ｍＲＮＡ－ｃＤＮＡ複合体分子などの複数の分子の群を指す。ライブラリの多様性は、異なる遺伝子配列として表され得る。ＤＮＡまたはＲＮＡライブラリは、ペプチドライブラリをコードするＤＮＡライブラリまたはＲＮＡライブラリを指す。
実施例：ｍＲＮＡ－ＤＮＡ－ペプチド複合体の標的への結合の検出
ｍＲＮＡ－ＤＮＡ－ペプチド検出可能複合体においてそのｍＲＮＡに結合したペプチド（本明細書で「ペプチドＡ」という）を使用して、ペプチドのその標的（本明細書で「標的Ａ」という）への結合を検出するためにフローサイトメトリーを利用し得るかどうかを決定する。標的Ａは、ＡＶＩタグ（ビオチンリガーゼ（ＢｉｒＡ）酵素によるインビボでのその部位特異的ビオチン化を促進するために目的のペプチドに組換え的に融合されるタグ）に融合した組換えタンパク質であり得る。
ｍＲＮＡ－ＤＮＡ－ペプチド検出可能複合体においてそのｍＲＮＡに結合したペプチド（本明細書で「ペプチドＡ」という）を使用して、ペプチドのその標的（本明細書で「標的Ａ」という）への結合を検出するためにフローサイトメトリーを利用し得るかどうかを決定する。標的Ａは、ＡＶＩタグ（ビオチンリガーゼ（ＢｉｒＡ）酵素によるインビボでのその部位特異的ビオチン化を促進するために目的のペプチドに組換え的に融合されるタグ）に融合した組換えタンパク質であり得る。
各ペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡを、フルオロフォア（例えば、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）コンジュゲートピューロマイシンリンカーにアニールさせる。次いで、ＰＤＰＳを使用してインビトロ翻訳（ＩＶＴ）を開始し、ｍＲＮＡを逆転写し、ｍＲＮＡ－ＤＮＡ－ペプチドＡ複合体を得る。ｍＲＮＡ－ＤＮＡ－ペプチドＡ複合体を、ビオチン化標的Ａ－Ａｖｉタグに添加して、結合させる。ストレプトアビジンでコーティングされたビーズをＩＶＴミックス（標的Ａ－Ａｖｉタグを含む）に添加し、ｍＲＮＡ－ＤＮＡ－ペプチド複合体に結合したビオチン化標的Ａとのストレプトアビジンでコーティングされたビーズの複合体をプルダウンし、洗浄し、フローサイトメトリーを行う前にＦＡＣＳバッファー中で希釈する。アミノ酸およびアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＡＲＳ）を欠くインビトロ転写翻訳ミックス（ＩＶＴミックス）［ＩＶＴ（－）］と混合したストレプトアビジンビーズを陰性対照として使用して、フローサイトメトリーによって観察される結合が、標的Ａ－Ａｖｉタグ結合ペプチドに特異的であることを確実にする。
本質的に本実施例において上記した手順に従って、その標的（標的Ａ）へのｍＲＮＡ－ＤＮＡ－ペプチド複合体の強い結合が検出されることが予想される。
本質的に本実施例において上記した手順に従って、その標的（標的Ａ）へのｍＲＮＡ－ＤＮＡ－ペプチド複合体の強い結合が検出された。
実施例：ｍＲＮＡライブラリ選択の間の標的特異的濃縮
フローサイトメトリーを、標的特異的ペプチドの濃縮を検出することによる選択をモニターするために使用し得るかどうかを決定するために、ストレプトアビジンビーズにコンジュゲートされた組換え標的Ａ－Ａｖｉに対する選択ラウンドを調べることができる。
フローサイトメトリーを、標的特異的ペプチドの濃縮を検出することによる選択をモニターするために使用し得るかどうかを決定するために、ストレプトアビジンビーズにコンジュゲートされた組換え標的Ａ－Ａｖｉに対する選択ラウンドを調べることができる。
翻訳を開始し、Ｃ末端操作されたシステイン残基との安定なチオエーテル結合を作製するために、クロロアセチルフェニルアラニンを使用する。選択を、ｑＰＣＲによって回収パーセントを決定することによってモニターする。非特異的なストレプトアビジン結合体を排除するために、ストレプトアビジンビーズに対するネガティブ選択を各ラウンドに組み込む。回収パーセントの増加は、後のラウンドにおいて最も顕著になると予想され、同定される標的Ａ結合体の集団における濃縮を示唆する。
次いで、後のラウンドからのペプチド配列を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）次世代シーケンシングを使用して決定する。高頻度の少数のペプチドは、それらの特定のペプチドの濃縮を実証し得る。観察される回収パーセントの増加が非特異的結合体の選択に起因し得るかどうかを決定するために、後のラウンドからのペプチド配列を前のラウンドからのペプチド配列と比較する。非特異的結合体は、ｑＰＣＲ方法を使用して後のラウンドで濃縮されることが予想される。これらの非特異的結合体は、１つまたは２つのアミノ酸で構成される短縮された配列を有するペプチドを含み得る。
本質的に上記の手順に従って、高頻度の少数のペプチドは、それらの特定のペプチドの濃縮を示した。後のラウンドからのペプチド配列の前のラウンドとの比較により、高度に濃縮されたペプチドが、１つまたは２つのアミノ酸で構成される短縮された配列であることが明らかになった。大部分の場合、選択ラウンドが増加するに従って、非特異的結合体が後のラウンドで濃縮される。ｑＰＣＲは、アウトプットＤＮＡ分子の数を無差別に定量し、したがって、この方法を使用して真のペプチドと非特異的ペプチドとを差別化することはできない。したがって、特異的結合体の選択を改善するために、ｑＰＣＲ以外の手段を用いるべきである。
異なる選択ラウンドからの標的Ａ結合ペプチドの濃縮を追跡するために、フローサイトメトリーを使用する。異なるラウンドのアウトプットからのＤＮＡを単離し、ＰＣＲによって増幅して、フルオロフォアコンジュゲートピューロマイシンリンカーを有する各ペプチドプールを再構成し、フローサイトメトリーによる標的Ａ－ＡＶＩへの各プールの結合を評価する。ストレプトアビジン＋ＩＶＴ（－）サンプルを、ゲーティングのためにそして陰性対照として使用する。ｑＰＣＲによる回収パーセントの増加が予想されるにもかかわらず、フローサイトメトリーによる異なるラウンドからの結合の増加は、存在するとしても、最小であると予想される。これは、部分的には、フローサイトメトリーから回収される非特異的結合体の選択の低減に起因し得る。
本質的に上記の手順に従って、ｑＰＣＲによる回収パーセントの増加は、後のラウンドが標的をずっと強く結合するはずであることを示唆する。しかしながら、フローサイトメトリーによる標的へのペプチドプールの特異的結合は観察されなかった。フローサイトメトリーによる標的へのペプチドプールの結合の欠如は、後の選択ラウンドにおける短縮された非特異的ペプチドの濃縮を裏付ける。
実施例：ｍＲＮＡライブラリから標的特異的結合体を単離するためのＦＡＣＳの使用
標的Ａ－ＡＶＩに対してスクリーニングされたライブラリをＦＡＣＳによってソーティングし得るかどうかを決定するために、後のラウンドのアウトプットからのＤＮＡを、Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ６４７などのフルオロフォアに融合したピューロマイシンリンカーを使用して転写および翻訳し、フローサイトメトリーを行って、結合を検出する。ゲーティングは、ストレプトアビジンビーズと複合体形成した標的Ａ－ＡＶＩの周囲であり、低い割合のペプチドが標的Ａに結合することが予想される（ソーティング前プール）。陽性集団をフローサイトメトリーによってソーティングし、ソーティングされたラウンドからのペプチドプールの、ペプチドＡ－ＡＶＩへの結合を、フローサイトメトリーによって評価する。結果が、ソーティング前プールと比較して、ソーティングされたプールの結合の有意な増加を示すことが予想される。結果がまた、ＦＡＣＳによる選択が、伝統的なｍＲＮＡ選択方法の使用と比較して、標的Ａ結合ペプチドのより大きな濃縮をもたらすこと、およびＦＡＣＳによる選択が、バックグラウンド結合体を排除し、特異的ペプチドを単離するための効率的な方法であることを実証することが予想される。
標的Ａ－ＡＶＩに対してスクリーニングされたライブラリをＦＡＣＳによってソーティングし得るかどうかを決定するために、後のラウンドのアウトプットからのＤＮＡを、Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ６４７などのフルオロフォアに融合したピューロマイシンリンカーを使用して転写および翻訳し、フローサイトメトリーを行って、結合を検出する。ゲーティングは、ストレプトアビジンビーズと複合体形成した標的Ａ－ＡＶＩの周囲であり、低い割合のペプチドが標的Ａに結合することが予想される（ソーティング前プール）。陽性集団をフローサイトメトリーによってソーティングし、ソーティングされたラウンドからのペプチドプールの、ペプチドＡ－ＡＶＩへの結合を、フローサイトメトリーによって評価する。結果が、ソーティング前プールと比較して、ソーティングされたプールの結合の有意な増加を示すことが予想される。結果がまた、ＦＡＣＳによる選択が、伝統的なｍＲＮＡ選択方法の使用と比較して、標的Ａ結合ペプチドのより大きな濃縮をもたらすこと、およびＦＡＣＳによる選択が、バックグラウンド結合体を排除し、特異的ペプチドを単離するための効率的な方法であることを実証することが予想される。
本質的に上記の手順に従って、低い割合のペプチドが標的Ａに結合した（ソーティング前プール）。陽性集団をフローサイトメトリーによってソーティングし、ソーティングされたラウンドからのペプチドプールの、標的Ａ－ＡＶＩへの結合を、フローサイトメトリーによって評価した。結果は、ソーティング前プールと比較して、ソーティングされたプールの結合の有意な増加を示した。結果はまた、ＦＡＣＳによる選択が、伝統的な回収パーセント方法の使用と比較して、標的Ａ特異的結合ペプチドのより大きな濃縮をもたらすこと、およびＦＡＣＳによる選択が、バックグラウンド結合体を排除し、特異的ペプチドを単離するための効率的な方法であることを実証した。
回収パーセントによる選択が、特異的および非特異的の両方の結合体の濃縮をもたらし得るかどうかをさらに決定するために、ソーティングされたラウンドのペプチド配列を、対応するソーティングされていないラウンドのペプチド配列と比較する。ソーティングされたラウンドの最高頻度の配列のいくつかは、ソーティングされていないラウンドとは異なることが予想される。加えて、特異的ペプチドの頻度は、ＦＡＣＳによるソーティングの後に増加することが予想される。これは、修飾ピューロマイシンリンカーを使用したＦＡＣＳによるｍＲＮＡディスプレイライブラリの選択が、強い結合親和性および特異性を有するペプチドの高度に効率的な単離をもたらすことを示唆する。
本質的に上記の手順に従って、ソーティングされたラウンドからのペプチドの最高頻度の配列のいくつかは、ソーティングされていないラウンドとは異なる。特異的ペプチドの頻度は、ＦＡＣＳによるソーティングの後に増加した。これは、修飾ピューロマイシンリンカーを使用したＦＡＣＳによるｍＲＮＡディスプレイライブラリの選択が、強い結合親和性および特異性を有するペプチドの高度に効率的な単離をもたらすことを示唆する。
実施例：細胞発現ペプチドの検出および選択
従来のｍＲＮＡディスプレイ選択方法では、システムに固有の高いノイズによって非特異的ペプチドの選択がもたらされるため、細胞発現ペプチドを効率的に検出することはできない。組換えヘテロ二量体細胞発現タンパク質（本明細書で「タンパク質ＩＩ」という；ビオチン化；ストレプトアビジンビーズに結合）に対してＰＤＰＳを使用して４回の選択ラウンドを完了する。ストレプトアビジンビーズを使用して、ペプチドのタンパク質ＩＩとの複合体をプルダウンし、選択を、各ラウンドにおける回収パーセントを決定することによってモニターする。回収パーセントの有意な増加がラウンド４で観察され（表１）、したがって、部分的に、より強い結合体の単離に好都合になるように標的の濃度を低下させることによって、選択の厳密性が増加した。
従来のｍＲＮＡディスプレイ選択方法では、システムに固有の高いノイズによって非特異的ペプチドの選択がもたらされるため、細胞発現ペプチドを効率的に検出することはできない。組換えヘテロ二量体細胞発現タンパク質（本明細書で「タンパク質ＩＩ」という；ビオチン化；ストレプトアビジンビーズに結合）に対してＰＤＰＳを使用して４回の選択ラウンドを完了する。ストレプトアビジンビーズを使用して、ペプチドのタンパク質ＩＩとの複合体をプルダウンし、選択を、各ラウンドにおける回収パーセントを決定することによってモニターする。回収パーセントの有意な増加がラウンド４で観察され（表１）、したがって、部分的に、より強い結合体の単離に好都合になるように標的の濃度を低下させることによって、選択の厳密性が増加した。
細胞発現タンパク質を、本発明の方法による標的として使用し得るかどうかを決定するために、フローサイトメトリーを、組換えまたは細胞発現のいずれかのタンパク質ＩＩに対して使用して、選択の間のタンパク質ＩＩ結合体の濃縮をモニターする。ラウンド２～５のアウトプットからのＤＮＡを転写し、修飾ピューロマイシンリンカーにアニールさせ、翻訳して、各ラウンドについてフルオロフォアライブラリを構成する。各ｍＲＮＡ－ＤＮＡ－ペプチドプールの組換えまたは細胞発現タンパク質ＩＩへの結合を、フローサイトメトリーによって検出する。
本質的に上記の手順に従って、フローサイトメトリーによって検出される、ラウンド２～ラウンド５のアウトプットは、組換えおよび細胞発現の両方のタンパク質ＩＩに強く結合した（表２）。これらのデータは、本発明の方法を、組換えおよび細胞発現の両方のペプチドを選択するために使用することができることを実証する。
次いで、ラウンド２のアウトプットからのＤＮＡを、ＦＡＣＳを使用したタンパク質ＩＩ結合体のソーティングのために使用する。組換え型のタンパク質を最初の選択ラウンドにおいて使用するので、標的の両方の型（組換えまたは細胞発現）に結合する大環状分子を単離するようにＣＨＯ細胞上で発現したタンパク質ＩＩについてソーティングを行う。ＦＡＣＳによるソーティングがタンパク質ＩＩ結合体の濃縮をもたらすかどうかを決定するために、ソーティング前およびソーティング後のペプチドプールのタンパク質ＩＩへの結合を検討する。結果は、ソーティング後にフローサイトメトリーによって決定される特異的結合体の集団の濃縮を示す（ソーティング後の４０％と比較して、ソーティング前の４％の結合体）。タンパク質ＩＩの発現を欠く親ＣＨＯ細胞へのソーティングされたプールの結合は最小であった。ラウンド２（ソーティングされた）ペプチドの次世代シーケンシングにより、ソーティング前および後の選択ラウンド（従来のｍＲＮＡディスプレイ選択方法によって行った）において検出可能なレベルでその配列が存在しなかった、新たなファミリーが出現したことが明らかになった。
ラウンド５と比較して、ラウンド２（ソーティングされた）プールからの最も濃縮されたペプチドの結合および機能活性がどうかを決定するために、ラウンド２（ソーティングされた）プールから同定されたペプチドを化学合成し、細胞ベースの機能アッセイにおいて試験して、タンパク質ＩＩのそのリガンドとの結合が、ソーティングされたペプチドによってブロックされ得るかどうかを決定する。ラウンド２（ソーティングされた）プール中に存在するペプチドが、タンパク質ＩＩのそのリガンドとの相互作用を阻害することを、データが実証することが予想される。これらの結果は、初期の選択ラウンドにおけるＦＡＣＳソーティングが、複数の選択ラウンドを行うことに起因して後のラウンドにおいてライブラリから枯渇させられ得る機能活性を有するペプチドの単離および同定をもたらすことを示す。
本質的に上記の手順に従って、ラウンド２（ソーティングされた）プール中に存在するペプチドは、タンパク質ＩＩのそのリガンドとの相互作用を阻害した。
実施例：フルオロフォアにコンジュゲートされたＤＮＡリンカーの設計および最適化
フルオロフォアを、ピューロマイシンリンカーの５’末端にコンジュゲート（結合）させて、フローサイトメトリーによるｍＲＮＡ－ＤＮＡ－ペプチド複合体の検出を可能にする。ＮＨＳ Ｅｓｔｅｒリンカーを使用して直接、または変動する長さのスペーサーを使用してのいずれかで、フルオロフォアをその５’末端でオリゴにコンジュゲートさせる。結合は、例えば、複数のヘキサエチレングリコールスペーサーを介した短いオリゴリンカーの３’末端へのピューロマイシンの共有結合によって生じ得る。複数回貫通膜タンパク質（ＧＰＣＲおよびイオンチャネル）が標的である場合、またはペプチドがタンパク質の空洞または溝に結合している場合、スペーサーの長さを増加させることが最も有効であると考えられる。例えば、ＨＥＫ細胞の細胞表面上に発現する、複数回貫通細胞発現タンパク質（本明細書で「タンパク質ＩＩＩ」という）複合体へのｍＲＮＡ－ＤＮＡ－ペプチドの結合は、スペーサー長が増加するに従ってフローサイトメトリーによってより良く検出される（表３）。これは、リンカー長の増加に伴うフルオロフォアの接近可能性の増強に起因し得る。しかしながら、表３におけるデータはまた、フローサイトメトリーによる検出のためにスペーサーが必要とされない可能性があることを実証する。
フルオロフォアを、ピューロマイシンリンカーの５’末端にコンジュゲート（結合）させて、フローサイトメトリーによるｍＲＮＡ－ＤＮＡ－ペプチド複合体の検出を可能にする。ＮＨＳ Ｅｓｔｅｒリンカーを使用して直接、または変動する長さのスペーサーを使用してのいずれかで、フルオロフォアをその５’末端でオリゴにコンジュゲートさせる。結合は、例えば、複数のヘキサエチレングリコールスペーサーを介した短いオリゴリンカーの３’末端へのピューロマイシンの共有結合によって生じ得る。複数回貫通膜タンパク質（ＧＰＣＲおよびイオンチャネル）が標的である場合、またはペプチドがタンパク質の空洞または溝に結合している場合、スペーサーの長さを増加させることが最も有効であると考えられる。例えば、ＨＥＫ細胞の細胞表面上に発現する、複数回貫通細胞発現タンパク質（本明細書で「タンパク質ＩＩＩ」という）複合体へのｍＲＮＡ－ＤＮＡ－ペプチドの結合は、スペーサー長が増加するに従ってフローサイトメトリーによってより良く検出される（表３）。これは、リンカー長の増加に伴うフルオロフォアの接近可能性の増強に起因し得る。しかしながら、表３におけるデータはまた、フローサイトメトリーによる検出のためにスペーサーが必要とされない可能性があることを実証する。
Claims (46)
- 標的への結合ペプチドを検出し、または選択するための方法であって、少なくとも１つの検出可能物質に結合したｍＲＮＡ－ＤＮＡ－ペプチド複合体を検出し、または選択することを含む、方法。
- 前記検出可能物質が、フルオロフォアである、請求項１に記載の方法。
- 前記フルオロフォアが、有機色素、生物学的フルオロフォア、または量子ドットである、請求項２に記載の方法。
- 前記検出可能物質が、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記検出可能物質が、ピューロマイシンリンカーにコンジュゲートされている、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記検出可能物質が、タグである、請求項１に記載の方法。
- 前記タグが、ペプチドタグである、請求項６に記載の方法。
- 前記タグが、ＦＬＡＧ（登録商標）タグである、請求項６または７に記載の方法。
- 前記タグが、蛍光分子によって検出される、請求項６～８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記蛍光分子が、蛍光ペプチドである、請求項９に記載の方法。
- 前記蛍光分子が、蛍光抗体である、請求項９または１０に記載の方法。
- 前記標的が、ソーティングを可能にする材料上に固定化されている、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ソーティングを可能にする材料が、ビーズである、請求項１２に記載の方法。
- 前記標的が、ペプチド、タンパク質、核酸、糖、脂質、哺乳動物細胞、または哺乳動物細胞抽出物である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的が、ペプチドまたはタンパク質である、請求項１４に記載の方法。
- 前記結合ペプチドが、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記結合ペプチドが、前記検出可能物質によって検出され、または選択される、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記結合ペプチドが、ＦＡＣＳ、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、分光光度法、蛍光分光法、または顕微鏡法によって検出され、または選択される、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記結合ペプチドが、フローサイトメトリーによって検出される、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記結合ペプチドが、ＦＡＣＳによって選択される、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記結合ペプチドが、検出され、選択される、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記結合ペプチドが、フローサイトメトリーによって検出される、請求項２１に記載の方法。
- 前記結合ペプチドが、ＦＡＣＳによって選択される、請求項２１または２２に記載の方法。
- 前記方法が、
ａ）少なくとも１つの検出可能物質をｍＲＮＡライブラリに組み込んで、ｍＲＮＡ－検出可能物質の複合体を産生し、
ｂ）前記ｍＲＮＡ－検出可能物質の複合体を翻訳して、ｍＲＮＡ－ペプチド－検出可能物質の複合体を産生し、次いで
ｃ）前記ｍＲＮＡ－ペプチド－検出可能物質の複合体を逆転写して、ｍＲＮＡ－ＤＮＡ－ペプチド－検出可能物質の複合体を得ること
を含む、請求項１に記載の方法。 - 前記ｍＲＮＡ－ＤＮＡ－ペプチド－検出可能物質の複合体が、フローサイトメトリーによって検出される、請求項２４に記載の方法。
- 前記ｍＲＮＡ－ＤＮＡ－ペプチド－検出可能物質の複合体が、ＦＡＣＳによって選択される、請求項２４または２５に記載の方法。
- 前記方法が、テンプレートＤＮＡライブラリを転写して、ｍＲＮＡライブラリを得ることをさらに含む、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
- 標的に結合していないｍＲＮＡ－ＤＮＡ－ペプチド複合体を除去することをさらに含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。
- 標的からｍＲＮＡ－ＤＮＡ－ペプチド複合体を除去することをさらに含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ｍＲＮＡ－ＤＮＡ－ペプチド複合体が、熱によって除去される、請求項２９に記載の方法。
- 前記除去されたｍＲＮＡ－ＤＮＡ－ペプチド複合体のＤＮＡをＰＣＲによって増幅することをさらに含む、請求項２９または３０に記載の方法。
- 前記ＤＮＡを転写して、ｍＲＮＡライブラリを得ることをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
- 前記結合ペプチドのアミノ酸配列を決定することをさらに含む、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記結合ペプチドの核酸配列を決定することをさらに含む、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項１～３４のいずれか一項に記載の方法によって検出され、または選択される、結合ペプチド。
- 少なくとも１つの検出可能物質に結合した、ｍＲＮＡ－ＤＮＡ－ペプチド複合体。
- 前記検出可能物質が、フルオロフォアである、請求項３６に記載のｍＲＮＡ－ＤＮＡ－ペプチド複合体。
- 前記フルオロフォアが、有機色素、生物学的フルオロフォア、または量子ドットである、請求項３７に記載のｍＲＮＡ－ＤＮＡ－ペプチド複合体。
- 前記検出可能物質が、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒである、請求項３６～３８のいずれか一項に記載のｍＲＮＡ－ＤＮＡ－ペプチド複合体。
- 前記検出可能物質が、ピューロマイシンリンカーにコンジュゲートされている、請求項３６～３９のいずれか一項に記載のｍＲＮＡ－ＤＮＡ－ペプチド複合体。
- 前記検出可能物質が、タグである、請求項３６に記載のｍＲＮＡ－ＤＮＡ－ペプチド複合体。
- 前記タグが、天然または非天然アミノ酸を含む、請求項４１に記載のｍＲＮＡ－ＤＮＡ－ペプチド複合体。
- 前記タグが、ＦＬＡＧ（商標）タグである、請求項４１または４２に記載のｍＲＮＡ－ＤＮＡ－ペプチド複合体。
- 前記タグが、蛍光分子によって検出される、請求項４１～４３のいずれか一項に記載のｍＲＮＡ－ＤＮＡ－ペプチド複合体。
- 前記蛍光分子が、フルオロフォアに結合したペプチドまたは抗体である、請求項４４に記載のｍＲＮＡ－ＤＮＡ－ペプチド複合体。
- 請求項３６～４５のいずれか一項に記載の１つより多いｍＲＮＡ－ＤＮＡ－ペプチド複合体を含む、ライブラリ。
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