JP2014504270A - 改変ノッチンペプチドを含む融合タンパク質及びその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2010年11月8日に出願された米国仮特許出願第61/411,350号に基づく優先権を主張し、参照することにより前記仮特許出願の全体が本明細書に含まれるものとする。
本発明は、国立衛生研究所により授与された契約CA151706の下で政府支援によってなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
本国際出願は、EFS−WebによりASCII形式で提出している配列を含み、参照することによりその全体が本明細書に含まれるものとする。この配列表は、2011年11月7日に作成され、61,440バイトの大きさを有し、“381593pct.txt”と名付けられている。
発明の詳細な説明において言及される技術的特徴に関し得るため、本発明の特定態様に関する背景情報を下に示すが、詳細に説明する必要はない。つまり、本発明で使用される個別の部分又は方法は、下記で論じる材料において更に詳細に説明でき、これら材料は、当業者に対し、特許請求の範囲に記載された本発明の特定態様を創出する又は使用するための更なる案内を提供し得る。下記の論述は、本願のあらゆる請求項又は記載される材料の先行技術的効果に対する情報の関係性についての同意として解釈されるべきでない。
ノッチンは、様々なノッチンペプチドの配列及び構造を提供するノッチンデータベースhttp://knottin.cbs.cnrs.fr/Knottins.phpに記載されている。
本発明は、異なる結合機能を提供する第二の異なるペプチド又はタンパク質と融合した操作したノッチンペプチドを含む新規な融合タンパク質の創出を含む。第二ポリペプチドは、受容体又は受容体リガンドである。好ましくは、ノッチンペプチドの一部分が、インテグリンに結合するように作成された配列で置き換えられている。加えて、融合タンパク質は、ノッチンの適切な発現及び折り畳みを促す別のタンパク質に融合したノッチンペプチドを含み得る。
特定の態様において、本発明は、治療効果の増加のために2個以上の受容体若しくは受容体リガンドに結合する及び/又はそれらを阻害することができるという点で二重特異的又は多重特異的である融合タンパク質を含む。これら融合体は、一例として、インテグリン結合部分を含有するように操作されたN末端又はC末端ノッチンを含み得る。インテグリン結合ノッチンは、Cochranらによる“改変インテグリン結合ペプチド”と題された米国出願公開第2009/0257952号明細書に記載されている。フィブロネクチン(α5β1インテグリン)又はビトロネクチン(αvβ3インテグリン及びαvβ5インテグリン)に高い親和性(低い平衡解離常数(KD))で結合する改変ペプチドが開示される。新規な結合特性を有するノッチンは、融合して、ヘテロオリゴマー二重特異性タンパク質を生成することができる。この手法は、最終段落に記載されている通り、参照により本明細書に含まれるものとし、インテグリン結合ノッチンの説明のため更に閲覧され得る。ここで用いる具体的なインテグリン結合パートナーは、αインテグリン鎖とβインテグリン鎖の両方に特異的であっても、又はβ鎖のみに特異的であってもよい。後者の場合、様々なα−βインテグリンの組み合わせが存在するであろうことから、インテグリン結合は多重特異的であろう。
本明細書に記載する融合タンパク質の別の例(実施例12を参照)は、インテグリン結合性ノッチンとマウス抗体のFc部分との間の融合体である。抗体のFc部分は、免疫グロブリン分子を作り上げている2個の重鎖の2個のカルボキシ末端ドメインによって形成される。IgG分子は、2個の重鎖(それぞれ約50kDa)及び2個の軽鎖(それぞれ約25kDa)を含有する。全ての抗体の全体構造は非常に類似しており、タンパク質の先端の小さな領域が極めて可変性であり、僅かに異なる先端構造を有する何百万の抗体が存在することを可能にする。この領域は超可変領域(Fab)として知られている。他の断片は、抗原結合活性を持たないが、元々は容易に結晶化することが観察され、この理由のため、結晶可能な断片にちなんで、Fc断片と名付けられた。この断片は、対になったCH2及びCH3ドメインに相当し、エフェクター分子及び細胞と相互作用する抗体分子の一部である。重鎖アイソタイプ間の機能的相違は、主にFc断片にある。抗体分子のFc部分とFab部分とを結合するヒンジ領域は、堅固な蝶番ではなく、実際には、2個のFabアームの独立な動きを可能にする柔軟なつなぎなわである。このことは、ハプテンに結合した抗体の電子顕微鏡検査によって実証されている。従って、本発明の融合タンパク質は、抗体断片の各アーム上に1個が存在する2個のノッチンペプチドを含有するように作成することができる。
本発明の本態様において、ランダム化ループを有し受容体に融合したノッチンのライブラリーをスクリーニングして、改善されたリガンド結合を創出するプラットフォームとして用いる。一例として、EETIライブラリーをAxlに融合させて、このライブラリーをスクリーニングして、Gas6リガンドに対する増加した親和性を有するEETI−Axl結合体を単離した。このように、ノッチンは、リガンド−受容体相互作用の親和性を増加させるための一般的なプラットフォームとして既存のリガンド(又は受容体)と融合させることができる。
ノッチンペプチドは、適切に折り畳まれた形態で得ることが困難な場合がある。ペプチドの化学合成及び再折り畳みを行うことはできるが、広範囲にわたる最適化を必要とする、この問題は、ノッチンをタンパク質に融合することによって軽減され得る。例えば、EETI−II2.5D(下記で説明する)は酵母で可溶型として発現できなかった。しかしながら、Axlに融合した場合、高収率の折り畳まれた機能性ノッチン−Axl融合体が得られた。融合パートナーを切り離すためにプロテアーゼ切断部位をEETI−II2.5DとAxlとの間に導入した。これは、いずれかの融合パートナーを発現のために用いる場合の一般的なストラテジーであり得るか、又は、上述のような二重特異性タンパク質の作成の一環とし得る。
特に定義のない限り、本明細書中で用いる技術的及び科学的用語は全て、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で記載されたものと類似する又は同等な方法及び材料は、本発明の実施又は試験において用いることができるが、好ましい方法及び材料を記載する。一般に、細胞及び分子生物学及び化学に関連して用いられる学術用語並びに細胞及び分子生物学及び化学の技術は、本技術分野で周知であり、通常用いられるものである。具体的に規定しないが、ある種の実験手法は、一般に、本技術分野で周知の通常の方法に従って、また本明細書の全体を通して引用され論じられる様々な一般的及びより詳細な参考文献に記載されたように、行われる。明確さの目的で、次の用語を下記で定義する。
を有する。全長EETI−IIは、最終プロリンが位置30に位置する30アミノ酸配列を有する:
配列中、下線を引いた“A”は、予想される二量体形成シスチンを排除するアミノ酸置換を表す。(本明細書で、シスチンは1個のアミノ酸を指し;システインは二量体を指す。)ループ4由来の太字で下線を引いた部分は、下に記載するRGD配列によって置き換えられる。
[ノッチンペプチドの操作]
本発明の融合タンパク質の重要な特徴は、所定のリガンドへの特異的結合にノッチン部分を用いることである。ノッチン結合は、好ましくは、天然の溶媒露出ループを所定のリガンドへの結合用に選択した短い(例えば、5〜12アミノ酸)配列で置き換えることによって操作される。溶媒露出(すなわち、表面上の)ループは、一般に、ジスルフィド結合したシステイン残基によって固定されている。新しい、すなわち置換アミノ酸配列は、好ましくは、ループ部分のコドンをランダム化し、改変ペプチドを発現させ、所定のリガンドに対して最大の結合を有する変異体を選択することによって得られる。先の工程から最も強力な結合性タンパク質を採用し、ループを再ランダム化して、この選択工程を複数回繰り返してもよい。
改変ノッチンを別のタンパク質に融合させる。このタンパク質は、本明細書の記載に従って改変ノッチンの設計にある程度入るであろう。つまり、融合パートナー及びノッチン結合パートナーは、それらが同じ生物学的経路に存在する点で論理的関係を有し、これらは、結合されて治療結果等を改善する標的を対象とする。
下記の実施例で、エクバリウム・エラテリウムのトリプシン阻害剤II(EETI−II)は合成結合ドメインとして働き、その融合パートナーの結合を増大させる。EETI−IIは、優れた安定性特性を提供する特徴的な織り合わされたジスルフィド結合骨格を含むノッチンペプチドファミリーのメンバーである(図1B)。EETI−IIの溶媒露出ループは、突然変異誘発に対して寛容性であり、新規な認識特性について既に個別に操作されてきた。しかしながら、本研究では、EETI−II中の構造的に隣接する2個のループを同時にランダム化して、生じたEETI−II変異体のライブラリーを野生型Axl Ig1に融合させた。Axl配列は、Entrez GeneのGeneID558で与えられる。次に、このライブラリーをスクリーニングして、増大したGas6結合親和性を有する新規なEETI−Axl融合体を同定した。つまり、結合は、Axl受容体を介して、また改変ループを介して起こるであろう。1ラウンドのみの指向進化に続いてナノモル以下の親和性を有する変異体を同定し、その変異体では、EETI−II変異体の改変ループの両方とも、新規な結合面の創出によってGas6に対する親和性の増大に貢献した。この研究は、ドメインの付加及び進化がタンパク質機能を増強することを裏付け、足場としてのEETI−IIノッチンが新規な認識特性を操作することも裏付ける。
AxlのIg1ドメインはGas6に対する優位な結合部位を含むことから、Gas6/Axl相互作用の親和性を増大させるために、EETI−IIノッチンペプチドのループライブラリーをAxl Ig1に融合させた。Gas6/Axl複合体ではAxl Ig1のN末端がそのC末端よりもGas6の近くにあり、従って、EETI−II変異体のGas6との相互作用をより可能にしやすそうであるため(図1C)、AxlのN末端への融合を選択した。EETI−II及びAxlの構造の解析は、AxlのN末端へのEETI−IIの融合が2個のタンパク質の三次構造の間におよそ11アミノ酸の間隔を与えるであろうことを示す。従って、更なるリンカー残基を含めることなく、EETI−IIループライブラリーをAxlのN末端に直接融合させることを選択した。 EETI−II中の最終Pro30残基及びAxl Ig1のPro20を排除して、結合の柔軟性を向上させ、EETI−IIのSer29をAxlのArg21に直接融合させた。構造的に隣接しており(図1B)、EETI−IIノッチン状に連続的な結合面の形成を可能にするであろうことから、ランダム化についてRRTI−IIループ1及びループ3を選択した。野生型のループ1及びループ3を、NNSコドンを用いて、それぞれ7〜10アミノ酸及び6〜8アミノ酸のランダム化配列で同時に置き換えた(図1D)。NNSコドンストラテジーは、1個の停止コドンのみをコードすることによって停止コドンの頻度を制限しながら、20個のアミノ酸全てを改変ループに含めることを可能にする。他の縮重ライブライリーストラテジーを用いてもよい。他の例示的ストラテジーについては、Kleebらの論文(“Metabolic engineering of a genetic selection system with tunable stringency,” Proc. Nat. Acad. Sci. 104: 13907-13912 (2007))を参照されたい。
E−Axlライブラリーの発現及びそのGas6に対する結合を、それぞれ、酵母提示構築物上のcmycエピトープタグ及び可溶性Gas6上のヘキサヒスチジンタグ(配列番号77)(図2A)の免疫蛍光標識によって評価した。図2Aは、酵母表面ディスプレイにおいて知られているように、アガトキシン構成要素Aga 1p及びAga 2pがこの順番で酵母細胞壁から伸びていることを示す。Hylite448 22でタグを付けた抗his抗体をGas6上のhisタグ32に結合させる;mycタグ26をチキン抗myc抗体28に結合させ、今度はAlexa555,30で標識した抗チキン抗体により結合される。融合体にヘマグルチニンタグも含める。これにAxl−Ig1を融合させて、Gas6リガンドのAxlに対する結合が実行される。酵母細胞表面上に発現した出発ライブラリーの全メンバーは、野生型Axl Ig1と同じレベルでGas6に結合した(図2B)。これは、AxlのN末端へのEETI−IIループライブラリーの直接結合が天然のGas6−Axl相互作用を乱さないことを実証する。結果的に、これは、稀な改良クローンを分離しなければならない数千万の野生型の一桁台のナノモルの結合体のバックグラウンドも生じる。
実施例8に、αvβ3インテグリンに結合するように操作したノッチン(AgRP)と、HGFのN末端及び第1クリングルドメインを含む断片(NK1と呼ばれる)との間の融合体の調製を記載する。HGF(肝細胞増殖因子)のこの部分は、Met受容体に結合する。c−Met(MET又はMNNG HOS形質転換遺伝子)は、肝細胞増殖因子受容体(HGFR)として知られるタンパク質をコードするがん原遺伝子である。この肝細胞増殖因子受容体タンパク質は、チロシンキナーゼ活性を持つ。一次一本鎖前駆体タンパク質は、翻訳後切断されて、ジスルフィド結合されて成熟受容体を形成するαサブユニット及びβサブユニットを生成する。
本発明の融合タンパク質は、様々な受容体型チロシンキナーゼを含み得る。これらタンパク質は、それらの細胞外及びリガンド結合モチーフに関して良く特徴付けられている。これらは、RTKクラスI(EGF受容体ファミリー)(FrbBファミリー);RTKクラスII(インスリン受容体ファミリー);RTKクラスIII(RDGF受容体ファミリー);RTKクラスIV(FGF受容体ファミリー);RTKクラスV(VEGE受容体ファミリー);RTKクラスVI(HGF受容体ファミリー);RTKクラスVII(Trk受容体ファミリー);RTKクラスVIII(Eph受容体ファミリー);RTKクラスIX(AXL受容体ファミリー);RTKクラスX(LTK受容体ファミリー);RTKクラスXI(TIE受容体ファミリー);RTKクラスXII(ROR受容体ファミリー);RTKクラスXIII(DDR受容体ファミリー);RTKクラスXIV(RET受容体ファミリー);RTKクラスXV(KLG受容体ファミリー);RTKクラスXVI(RYK受容体ファミリー);及びRTKクラスXVII(MuSK受容体ファミリー)を含む。好ましくは、これら受容体を有する融合タンパク質の調製において、受容体の一部のみを含む、すなわち、細胞外N末端領域を含み、免疫グロブリン(Ig)様又は上皮増殖因子(EGF)様ドメイン、フィブロネクチンII型リピート、又はRTKの各サブファミリーに特徴的な高システイン領域を含む様々な保存要素を示すポリペプチドを調製する;これらドメインは、主として、細胞外リガンド、例えば特定の増殖因子又はホルモンに結合するリガンド結合部位を含む。細胞内C末端領域は、最も高い保存レベルを示し、これら受容体のキナーゼ活性を担当する触媒ドメインを含み、RTK基質の受容体自己リン酸化及びチロシンリン酸化を触媒する。
ここで、特定の受容体リガンドである肝細胞増殖因子及び抗体Fc断片を例示する。肝細胞増殖因子(c−metとも呼ばれる)を断片化して、met受容体に結合することが知られている部分を得た。このHGF断片はNK1断片としても知られている。例示配列を配列番号66で与える。この配列は、PAN_Appleスーパーファミリーの配列の一部及びKRスーパーファミリーの配列の一部を含む。従って、本教示で与えられる本明細書で例示する組成は、肝細胞増殖因子様タンパク質;プラスミノーゲンドメイン含有タンパク質;マクロファージ刺激因子1;及び、RON(“recepteur d’origine Nantais”)のような他のプラスミノーゲン関連増殖因子を含むように拡張することができる。Maestriniらの論文(“A family of transmembrane proteins with homology to the MET−hepatocyte growth factor receptor,“ PNAS January 23, 1996 vol. 93 no. 2 674−678)を参照されたい。哺乳動物においても、肝細胞増殖因子はセリンプロテアーゼの相同体であるが、そのタンパク質分解活性を失っていた。
本発明の融合タンパク質は、細胞培養研究におけるような試験管内で、すなわち、移植用の細胞に投与してもよいが、生体内に投与してもよい。治療用タンパク質について使用される様々な処方及び投与計画を用いることができる。医薬組成物は、CFPに加えて、動物への投与に適し(例えば、生理食塩水)ひいては活性な融合タンパク質の医薬上使用することが出来る調剤薬への加工を促す助剤(賦形剤、安定剤又は希釈剤のような)を含む、適切な、医薬として許容される担体、生物学的に適合性のビヒクル及び添加剤を含むことができる。このような組成物は、最終的に、本発明のキメラタンパク質と相乗的に又は協調的に作用する別の治療用組成物と併用することができる。あるいは、他の医薬組成物は、特定の疾患に対して治療効果があることが知られている融合タンパク質(例えば、乳癌に対するハーセプチン)を用いて基礎とすることができる。あるいは、可溶性のものを含む医薬組成物を組み合わせて、様々な治療計画で使用するための“カクテル”とすることができる。
SD−CAA培地は、20g/Lのグルコース、6.7g/Lの酵母窒素原基礎培地(アミノ酸を含まない)、5.4g/LのNa2HPO4、8.6g/LのNaH2PO4・H2O、及び5g/Lのバクトカザミノ酸を含有した;SG−CAA培地は、グルコースを20g/Lのガラクトースで置き換えたことを除いて、同一であった。pH4.5のSD−CAA培地は、リン酸塩を13.7g/Lのクエン酸ナトリウム二水和物及び8.4g/Lのクエン酸無水物で置き換えて、pH4.5に調整したことを除いて、SD−CAAと同一であった。Gas6タンパク質及びAxl−Fcタンパク質は、R&Dシステムズ社から購入し、チキン抗cmyc抗体及びヤギ抗チキンAlexa555抗体はインビトロジェン社から購入し、マウス抗His Hilyte Fluor488モノクローナル抗体は、Anaspec社から購入した。リン酸緩衝生理食塩水(PBS)は、11.9mMのリン酸ナトリウムpH7.4、137mMの塩化ナトリウム、2.7mMの塩化カリウムからなる。PBS/BSAは、1mg/mLのウシ血清アルブミンを含むPBSからなった。
EETI−IIループ1を置き換える、7、8、9又は10個の縮重NNSコドンを有する4種のフォワードアッセンブリープライマーと、EETI−IIループ3を置き換える、6、7又は8この縮重NNSコドンを有する3種のリバースアッセンブリープライマーとを用いて、EETI−IIループライブラリーを構築した。(EETI−IIアミノ酸配列は、Genbankアクセッション番号P12071であり;DBNA配列は、2009年4月3日に出願された同時係属米国出願第12/418,376号で与えられ、参照により本明細書にも含まれる。DNA配列は、与えられたアミノ酸配列の逆翻訳によって所望の通りに設計できる。)プライマー配列は、ループに隣接する領域に相補性であった。EETI−II、ランダム化ループ1及びループ3並びにAxl中のランダム化ループのアミノ酸配列を、図1Dに示す。1×KODポリメラーゼバッファー、0.2mMのdNTP,1.5mMのMgCl2、1Mのベタイン、及び2.5ユニットのKODポリメラーゼ(Novagen社)と共に、4種のフォワードプライマーをプールしてそれぞれ1μMで用い、3種のリバースプライマーのそれぞれをプールして、それぞれ1.33μMで用いた。熱サイクルパラメーターは次の通りであった。ステップ1:95℃で2分;ステップ2:95℃で30秒、55℃で30秒、72℃で1分(30サイクル);ステップ3:72℃で10分。構築したDNA(0.6μL)を、2μMのフォワード及びリバース増幅プライマー、1×Pfx50バッファー、0.2mMのdNTP及び5ユニットのPFx50DNAポリメラーゼ(インビトロジェン社)を用いて増幅させた。フォワード増幅プライマーはpCT骨格に対して50bpの相同性を有し、一方、リバース増幅プライマーはAxl Ig1のN末端に対して50bpの相同性を持ち、EETI−IIのC末端(Ser29)とAxl Ig1のN末端(Arg21)との適切なSer−Arg結合を確実にするように設計した。プラスミド骨格の調製について、NheI制限部位及びBamHI制限部位を用いて、Ig1ドメインを含むAxlアミノ酸(22〜132;Genbankアクセッション番号P30530)を、酵母提示pCTプラスミド(Boder及びWittrup,1997)にクローン化した。Axl配列の5’に直接AvrII制限部位を含めた。これを、NheI部位の下流に、制限消化を促す14bpの“ジャンクDNA”のスペーサーとともに配置した。このプラスミドをpCT Avr−Axlと名付けた。ライブラリー合成用のプラスミド骨格は、pCT Avr−AxlをNheI制限酵素及びAvrII制限酵素で消化することによって作成した。合計で約50μgのcDNA挿入物と約25μgの制限消化pCT Avr−Axl骨格とを電気穿孔法によってEBY100に形質転換し、相同組み換えによって生体内で構築を行った。連続希釈プレーティング及びコロニー計数によって見積もったように、1.2×108個の形質転換体のライブラリーが得られた。無作為に選択したクローンの配列解析で、EETI−II変異体においてEETI−IIとAxl Ig1との適切な融合及び所望のループ長分布を確かめた。
下記配列において、プラスミド骨格に対する相同性のために用いるヌクレオチドを5’末端から最初の斜線までで示す。プライマーの最初の斜線から二重斜線までの部分及びプライマーの三重斜線から3’末端までの部分は、EETI−IIの残基と一致する。Nはいずれかのヌクレオチドを表わし、SはG及びCの入り交りである。プライマーの二重斜線から三重斜線までの部分は、EETI−IIループ1又はループ3のランダム化残基を生成するために用いるヌクレオチドである。
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Ggttctgctagc/ggttgt//nnsnnsnnsnnsnnsnnsnns///
tgtaaacaagattctgattgtttggctggttgtgtt (配列番号:67)
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Ggttctgctagc/ggttgt//nnsnnsnnsnnsnnsnnsnnsnns///
tgtaaacaagattctgattgtttggctggttgtgtt (配列番号:68)
L1_9X_fwd:
Ggttctgctagc/ggttgt//nnsnnsnnsnnsnnsnnsnnsnnsnns///
tgtaaacaagattctgattgtttggctggttgtgtt (配列番号:69)
L1_10X_fwd:
Ggttctgctagc/ggttgt//nnsnnsnnsnnsnnsnnsnnsnnsnnsnns///
tgtaaacaagattctgattgtttggctggttgtgtt (配列番号:70)
L3_6X_rev:
Cgtgcccct/gagaccaca//snnsnnsnnsnnsnnsnn///
acaaacacaaccagccaaacaatcag (配列番号71)
L3_7X_rev:
Cgtgcccct/gagaccaca//snnsnnsnnsnnsnnsnnsnn///
acaaacacaaccagccaaacaatcag (配列番号72)
L3_8X_rev:
Cgtgcccct/gagaccaca//snnsnnsnnsnnsnnsnnsnnsnn///
acaaacacaaccagccaaacaatcag (配列番号73)
Library_amplification_reverse:
Ttccctgggttgcccacgaagggactttcttcagcctgcgtgcccct/gctaccaca (配列番号74)
Library_amplification_forward: (プラスミド骨格に対する相同性は斜線の5’側)
Ggtggttctggtggtggtggttctggtggtggtggttctgctagc/ggttgt (配列番号75)
様々な濃度のGas6を酵母提示ライブラリーとともにPBS/BSA中で室温にて約2〜3時間インキュベートした。最後の1時間は、チキン抗cmyc抗体を1:250の最終希釈物に加えた。遠心分離によって細胞をペレット化して、1mLの氷冷PBS/BSAで洗滌し、ヤギ抗チキンA555の1:100希釈物及びマウス抗His488抗体の1:100希釈物を含有するPBS/BSA中に再懸濁させ、2分間氷冷した。細胞をペレット化し、1mLの氷冷PBS/BSAで洗滌して、Vantage SEフローサイトメーター(スタンフォードFACS)で蛍光活性化セルソーティング(FACS)により分取した。収集した細胞をpH4.5のSD−CAA培地中で増幅し、FACSの更なるラウンドのためにSG−CAA培地中で30℃にて発現を誘導して、変異体に富むプールを得た。FACSによる分取の最初のラウンドは、合計およそ8×107個の分取細胞に対する3つの別個の分取からなり、その後の分取ラウンドは、先のラウンドで収集した酵母の数の少なくとも10×で解析して、残りのライブラリー変種の充分な試料採取を確実にした。Gas6の濃度を低減することにより、分取のストリンジェンシーを増加させた。後の分取ラウンドでは、Gas6とのインキュベーションに続いて、細胞をペレット化し、洗滌し、“解離速度”分取のために発現競合者(Axl−Fcの約50倍のモル過剰)の存在下でインキュベートした。非結合段階の最後の1時間では、チキン抗cmycを1:250の最終希釈物に加えた。細胞をペレット化し、洗滌し、上述のように二次抗体で染色した。Zymoprepキット(Zymo・Research社)を用いて酵母培養物からプラスミドDNAを回収し、プラスミドミニプレップのためにXL−1 Blue supercompetent E.coli細胞(ストラタジーン社)へ形質転換させた。MC Lab(South San Francisco社、カリフォルニア)によってDNA配列決定を行った。
リガンド枯渇を回避して結合平衡に達するように実験的に決定した容積、細胞数及びインキュベーション時間を用いて、Gas(0.05〜400nM)を、室温でPBS/BSA中で対象のタンパク質を提示している5×104個の酵母細胞に加えた。細胞をペレット化して、氷冷PBS/BSAで洗滌し、チキン抗cmycの1:250希釈物を含有するPBS/BSA中に再懸濁させ、氷上で40分間インキュベートした。細胞をペレット化して、洗滌し、ヤギ抗チキン及びマウス抗His二次抗体の1:100希釈物を含有するPBS/BSA中に氷上で20分間再懸濁させた。細胞を洗滌し、FACS Caliburフローサイトメーター(ベクトン・ディッキンソン社)及びFlowJoソフトウエア(Treestar社)を用いて解析した。結合滴定を、カレイダグラフソフトウエアを用いて4パラメータシグモイド曲線にあてはめて、平衡結合常数(KD)を決定した。動力学的非結合試験のため、細胞を結合平衡が達成されるまで2nMのGas6と共にインキュベートし、ついで洗滌し、ペレット化して、解離速度分取のために0、1、4、9.25、23又は46時間、上述のように50倍モル過剰のAxl−Fcの存在下でインキュベートした。フローサイトメトリーによって持続結合を解析し、カレイドグラフソフトウエアを用いて、未結合のものを単一又は二重指数関数デコイ曲線に適切にあてはめた。野生型EAループ変異型への復帰のための持続的結合を、非結合段階を0〜9.25時間行ったことを除いて、動力学的結合試験と同じく行った。
酵母ディスプレイを用いてGasと改変EA変異体との間の結合相互作用を特徴付ける目的で、最初に、酵母ディスプレイがGas6−Axl相互作用の正確な親和性測定を可能にすることを確かめることを試みた。酵母提示されたAxlを用いて、既に報告されている表面プラズモン共鳴及び固相結合により測定されたAxl変異体の結合親和性を再現することができた(表4)。これは、酵母提示されたAxlが受容体の組み換え異形と同様であることを立証する。
下記の実施例は、インテグリンに結合するように操作した変異EETI−IIノッチンに融合させたAxl Ig1受容体断片、つまりノッチン2.5D及び2.5Fの調製を開示する。2.5D及び2.5Fは、両方ともエクバリウム・エラテリウムのトリプシン阻害剤II(EETI−II)ノッチンの変異型である。これらはノッチンをそれぞれ、αvβ3インテグリン及びαvβ5インテグリン、並びにαvβ3インテグリン、αvβ5インテグリン、α5β1インテグリンに特異的に結合するように操作した。これを達成するため、EETI−IIのループ1を、インテグリン認識トリペプチドモチーフであるRGDを含むランダム化配列と置き換えた。ついで、酵母表面提示及び蛍光活性化セルソーティング(FACS)を用いて、所望の結合特性を有するクローンを選択した。これらインテグリンは臨床上重要な癌標的であり、Axlは同様に癌の治療用の新興の標的である受容体型チロシンキナーゼである。Axlの過剰発現は様々な癌の侵襲性及び転移性表現型と関連付けられており、Axlとその天然のリン癌度であるGas6との間の相互作用に拮抗することは治療上価値があり得ることが示唆される。
野生型EETI−II、2.5D及び2.5Fのアミノ酸配列を下に示す。下に示すように1アミノ酸変異及び欠失をAxl Ig1受容体断片に導入した。角括弧付き[AP]は、表3で示すEA融合体で除外した。
標準的なクローニング技術を用いて、EETI−II変異体をコードする遺伝子とAxl Ig1をコードする遺伝子とを、融合タンパク質をコードする1個の遺伝子構築物へと組み立てた。EETI−IIドメインをAxl Ig1のN末端に融合させ、N末端ノッチンドメインに続くAxl Ig1ドメインからなる融合タンパク質を得た。融合体の全体の柔軟性を改善するため、EETI−IIの最後のプロリンとAxlの最初のアラニン及びプロリンとを除去した。次いで融合タンパク質をコードするDNAを発現プラスミドと選択プラスミドの両方に連結した。この融合タンパク質を酵母の表面上で発現させて、可溶性に産生されることに加えて、結合研究を可能にしている。
簡単に言うと、2.5D−Axlを提示した酵母を用いて、この融合体が機能的であるかを試験した。融合体の可溶性αvβ3インテグリン及びGas6に結合する能力を測定して、2.4単独及びAxl単独で示される結合レベルと比較した。融合体は、2.5のもとの一致したαvβ3結合親和性を示し、同時に野生型AxlのGas6に対する親和性を維持し、融合構築物を有効であると確認した。加えて、各可溶性標的の結合を飽和量の第二標的の存在下で試験して、融合体のαvβ3インテグリンとGas6の両方に同時に結合する能力を試験した。これら結合レベルは、それらを個別に測定した場合と同じであり、融合体が実際にその標的両方に同時に結合できることを示唆した。最後に、融合体が安定であることを確認するため、融合体を酵母ピキア・パストリス(Pichia pastoris)中で可溶性に生産させた。精製組み換え体の収量は1リットルあたり50〜75mg程度であった。これらタンパク質を、αvβ3インテグリンを過剰発現するように形質転換した細胞に対して結合する能力について試験した。それらは、2.5Dについて先に測定したのと一致する平衡結合を示し、更に、2個のタンパク質ドメインを融合させることは結合特性に負の影響を及ぼさなかったことを立証した。
このノッチン−Axl融合体は、インテグリン結合と天然のGas6/Axl相互作用の両方に同時に拮抗することができる多重特異性分子として機能するであろう。Gas6が可溶性リガンドである一方でインテグリン類は細胞表面受容体であり、両方の標的は同時に結合されることを可能にする。Gas6の結合は、可溶性リガンドを捕捉し、可溶性リガンドが細胞外Axl受容体に結合して活性化するのを妨げるであろう。インテグリン受容体に対する結合は、細胞外基質タンパク質と結合するのを妨げるであろう。
上述のように、ノッチン類は、組み換え的に産生することが困難であり得る。それらをよく発現しているタンパク質に融合させることによって、それらを高収率で発現させることができる。ノッチンの切断は、タンパク質ドメイン間にプロテアーゼ部位を挿入することにより達成することができる。
標準的なクローニング技術を用いて、EETI−II変異体をコードする遺伝子とAxl Ig1をコードする遺伝子とを、融合タンパク質をコードする1個の遺伝子構築物へと組み立てた。ノッチン融合体のN末端とC末端の両方を、タバコエッチ病ウイルス(TEV)認識部位であるENLYFQG(配列番号80)を有し、タンパク質ドメイン間に挿入されるように作成した。次いで、遺伝子を酵母発現プラスミドに連結し、酵母ピキア・パストリスを形質転換した。
Aras4と名付けられた最も強力な結合性NK1断片の1つでAgRP変異体7Aを連結することによって、二重特異性融合タンパク質を構築した。Aras4はAgRP7AのC末端で連結され、2つのドメイン間にアミノ酸リンカーは存在しない。
上記タンパク質(配列番号66)の詳細を下に示す。
例6で記載したように、EETIノッチン/インテグリン結合ペプチドのAxl膜結合型キナーゼ受容体との直接結合体を調製した。Axl Ig1ドメインのアミノ酸21〜132を用いた。EETI2.5DをAxl Ig1に融合させることによって、αvβ3/αvβ5インテグリン及びGas6を結合できる多重特異性分子を形成した。
次いで、EETI2.5D−Axl融合タンパク質をpPic9K酵母分泌ベクターにクローン化し、メーカーのマニュアル(インビトロジェン社)に従って酵母株P.パストリスで可溶性タンパク質を組み換え的に生産した。ニッケル親和性クロマトグラフィーを用いて培養上清からタンパク質を精製し、タンパク質をエンドグリコシダーゼ(endoH)で処理することによって、異種酵母糖鎖付加を切断した。単量体のEETI2.5D−Axlタンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて更に精製した。最終産物の純度をSDS−PAGE及び分析的サイズ排除クロマトグラf−を用いて分析した。高度に純粋な単量体EETI2.5D−Axl融合タンパク質を1リットル当たりおよそ35ミリグラムの収率で得た。
幾つかのノッチンは、適切に折り畳まれたモノマーよりも高次オリゴマーを生成するため、組み換え的に生産することが困難である。例えば、我々は、固相ペプチド合成を用いたEETI2.5Dの化学合成及び試験管内折り畳みの確固たる方法を立証しているが、このノッチンを酵母に基づく発現系で組み換え的に発現させることはできていない。適切に折り畳まれたEETI2.5D−Axl融合体を高い組み換え体収率で生産できるという知見は、ノッチンを組み換え的に生産する手法としての自己切断TEV−2.5D構築物の開発につながった。
この例では、マウス抗体のFc部分をインテグリン結合ノッチンであるEETIに上述するように融合させる。ノッチン−Fc融合体を分子クローニング及び哺乳動物細胞発現によって創出した。これら修飾したノッチンタンパク質は、数分程度の半減期を有する未修飾ノッチンと比較して、長い循環時間(数日)を有するであろう。この系を用いて、EETIをベースとするノッチンペプチド2.5D及び2.5F並びに野生型EETI−IIをマウスIg2aのFcドメイン(配列番号83)に融合させて哺乳動物ヒト胎児腎臓(HEK)細胞でノッチン−Fc融合タンパク質を発現できることを示した。Fcドメインは既知の配列であり、mRNA配列については例えばアクセッション番号NM_010184.2を参照されたい。ノッチンペプチドを生成してNuPAGE4〜12%ビス−トリスゲル上で泳動させた。結果は、予期したサイズの非還元型(NR)及び還元型(R)ノッチン22.5D−Fcを示した。次いで、これらノッチンタンパク質をゲル濾過クロマトグラフィーによって分析して、純粋なノッチン−Fc2は凝集の傾向を示さなかった。
上記具体的な記載は、発明を例示する及び説明することを意図しており、添付された請求の文字通りの等価な範囲によって定義される発明の範囲を限定するものとみなされるべきでない。本明細書中で言及するあらゆる特許又は刊行物も、明確に提示されていないことがあり得るがこの分野の研究者によって理解されるであろう本発明の特定の態様を実施するのに有用な方法及び材料の詳細を伝えることを意図する。このような特許又は刊行物は、必要に応じ、参照される方法又は材料を説明する及び使用可能にする目的で、各々が具体的及び個別に参照により援用された及び本明細書に含まれた場合と同じ程度まで、参照により本明細書に含まれるものとする。
Claims (27)
- (a)第一の標的に結合するための結合ループを中に有するノッチンポリペプチドと、
(b)第二の標的に結合するための配列を中に有する第二ポリペプチドであって、(i)該第二の標的に結合する細胞表面受容体か又は(ii)該第二の標的に結合する細胞表面受容体リガンドである第二ポリペプチドと、
を含む、融合タンパク質。 - 前記ノッチンポリペプチドが、EETI−II、AgRP又はアガトキシンのいずれか1つである、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 前記ノッチンポリペプチドがω−コノトキシンである、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 前記ノッチンポリペプチドが、その結合ループ中に非天然配列を含有する、請求項1、2又は3に記載の融合タンパク質。
- 前記非天然配列が、細胞とそれを取り囲む組織との間の接着を媒介する、請求項4に記載の融合タンパク質。
- 前記ノッチンポリペプチドが、(a)αvβ3インテグリン、(b)αvβ5インテグリン、及び(c)α5β1インテグリンのうちの1又は2以上との結合を媒介する配列を含有する、請求項5に記載の融合タンパク質。
- 前記第二ポリペプチドが、受容体型チロシンキナーゼの細胞外ドメインである、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 前記第二ポリペプチドが、受容体型チロシンキナーゼのIg1ドメインである、請求項7に記載の融合タンパク質。
- 前記Ig1ドメインが、Axl受容体、MuSK受容体、又はFGF受容体に由来する、請求項7に記載の融合タンパク質。
- 前記受容体型チロシンキナーゼがAxl受容体である、請求項8に記載の融合タンパク質。
- 前記ノッチンポリペプチドが、EETI−II、AgRP及びアガトキシンからなる群より選択される、請求項9に記載の融合タンパク質。
- 前記結合ループが、(a)αvβ3インテグリン、(b)αvβ5インテグリン、及び(c)α5β1インテグリンのうちの1又は2以上と結合するように操作されている、請求項11に記載の融合タンパク質。
- (a)インテグリンに対して高い親和性を有する結合ループを含む、EETI−II又はAgRPノッチンポリペプチドと、
(b)(i)Axl細胞外ドメイン、及び(ii)肝細胞増殖因子のNK1断片からなる群より選択されるポリペプチドと、
を含む、請求項1に記載の融合タンパク質。 - (a)DNA構築物内に前記融合タンパク質と多数のランダム化DNA配列とをコードする多数のDNA構築物を有するライブラリーを調製する工程と、
(b)該ライブラリーの該DNA構築物を酵母で発現させ、発現したDNA構築物が該酵母表面上にランダム化配列を有するポリペプチドとして提示される工程と、
(c)クローンを標的と接触させることによって、該発現したDNA構築物と第一の標的又は第二の標的との結合について該クローンをスクリーニングする工程と、
(d)該標的と高い親和性で結合する翻訳DNA構築物を発現するクローンを選択する工程と、
(e)該選択されたクローンのコード配列を得ることによって、前記融合タンパク質を調製することができる工程と、
を具える、請求項1に記載の融合タンパク質を調製する方法。 - 前記ノッチンが、EETI−II、AgRP、アガトキシン又はコノトキシンのうちの1つである、請求項14に記載の方法。
- 前記第二ポリペプチドが、リガンド結合部位を含む受容体断片と、リガンドの受容体に結合する部位を含むリガンド断片とからなる群より選択される、請求項14又は15に記載の方法。
- 前記第二ポリペプチドが、チロシンキナーゼ受容体断片である、請求項14又は15に記載の方法。
- 前記第二ポリペプチドが、増殖因子断片である、請求項16に記載の方法。
- 前記第二ポリペプチドが、Axl、c−Met、HGF、VEGF、VEGF受容体、及びGas6からなる群より選択されるポリペプチドを含む、請求項16に記載の方法。
- 前記ノッチンポリペプチドがEETI−IIである、請求項16に記載の方法。
- 前記ノッチンが、インテグリンに結合するように操作されている、請求項15に記載の方法。
- 前記インテグリンが、(a)αvβ3インテグリン、(b)αvβ5インテグリン、及び(c)α5β1インテグリンのうちの少なくとも1つである、請求項21に記載の方法、
- 前記ノッチンが、ループ1及びループ3が操作されたEETI−IIである、請求項15に記載の方法。
- (a)(i)阻害される受容体の細胞外ドメインをコードするポリペプチドと、(ii)阻害される受容体でない細胞表面受容体に結合するように操作されたループドメインを有するノッチンポリペプチドと、を含む一定量の可溶性融合タンパク質を投与する工程を具える、受容体に対するリガンドの結合を阻害する方法。
- 前記細胞表面受容体がインテグリンである、請求項22に記載の方法。
- 前記阻害される受容体が受容体型チロシンキナーゼである、請求項21又は22に記載の方法。
- 前記チロシンキナーゼがTAM受容体型チロシンキナーゼである、請求項25に記載の方法。
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