JP7308505B2 - 多様性を変化させた足場ドメインを有する結合メンバー - Google Patents

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Description

本発明は、多様性を変化させた足場ドメインを有する結合メンバー、このような結合メンバーのライブラリーの生成ならびにこのようなライブラリーからの結合メンバーの選択およびスクリーニングに関する。
抗体のヒト化は、動物のＣＤＲとヒトフレームワークの結合を必要とする。ＣＤＲグラフト化は、抗体ヒト化のために使われる十分に確立された方法である。動物の免疫化により生成された抗体が配列決定され、ＣＤＲループが特定され、また、動物抗体に由来する１個または複数のＣＤＲを有するヒトフレームワークからなるハイブリッド分子が調製されている１。ＣＤＲグラフト化では、組み込まれるペプチドは、元の結合特異性を維持するために、特定の構造をとることが必要であり、多くの場合、フレームワーク領域内の支持残基を含む付加残基を変更することにより、ヒト化プロセスを微調整することが必要となる。
その他の起源由来の非抗体ペプチドもまた、抗体フレームワーク中に移植されてきた。Ｂａｒｂａｓら（１９９３）は、天然起源のインテグリン結合配列をヒト抗体のＶＨ ＣＤＲ３領域に挿入し２、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋｓｏｎら（２００６）３は、トロンボポエチン（ＴＰＯ）受容体に結合することが知られている、１４マーペプチドを抗破傷風毒素抗体のいくつかのＣＤＲ領域に挿入した。ペプチドのそれぞれの末端の２個のアミノ酸はランダム化され、得られたライブラリーは、ファージディスプレイにより選択された。これと同じ研究は、エリスロポエチン受容体に結合することが知られている１８アミノ酸ペプチド４の挿入と共に、米国特許出願公開第２０１０００４１０１２Ａ１号に記載された。元のエリスロポエチン受容体結合ペプチド配列は、２個のシステインを含んでおり、これは、抗体ジスルフィド結合形成に関して問題になることが予測されたため、除去された。これらの場合には、得られたファージディスプレイライブラリーから最適結合配列を選択するために、挿入ペプチドコード領域とレシピエントフレームワークとの間の接合部で２～３個のコドンがランダム化された。Ｌｉｕらは、ＣＸＣＲ４に対する結合活性を有する１４～１６個のアミノ酸のペプチドを、２つの異なるＣＤＲ（ＶＨ ＣＤＲ３およびＶＨ ＣＤＲ２５）に挿入した。Ｋｏｇｅｌｂｅｒｇは、ヘアピン：アルファヘリックスモチーフをとる、αＶβ６ １７マーペプチドを、マウス抗体のＶＨ ＣＤＲ３に挿入した６。このペプチドは、αＶβ６に直接結合することが知られているコアＲＧＤＬｘｘＬエレメントを含んでいた。この研究は、ＶＨ ＣＤＲ３に焦点を合わせたライブラリーベースの手法に繋がった。この手法は、元のインサートのヘアピン：アルファヘリックス構造７を模倣するために探求されていたものであった。これらの全ての場合で、抗体は、組み込まれるペプチドのための担体として機能し、標的結合には寄与しなかった。
Ｇａｌｌｏらは、多様化のための別の手法を用いて、挿入ペプチドをＶＨ ＣＤＲ３に挿入した。抗体多様化は、Ｂ細胞内で天然に発生しており、米国特許出願公開第８０１２７１４号は、この多様化プロセスを異種哺乳動物細胞内で再現する方法を記載している。成熟Ｂ細胞では、抗体遺伝子は、大きな介在配列セグメントの欠失を生じる「組替え活性化遺伝子」（ＲＡＧ１およびＲＡＧ２）の活性を介して、バラバラになったＶ、ＤおよびＪセグメントの組換えにより構築される。米国特許第８０１２７１４号では、非Ｂ細胞で組換えＶ－Ｄ－Ｊ連結を複製するために、ＲＡＧ１、およびＲＡＧ２が、組換え基質を含むプラスミドと共に、ヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ２９３）に導入された。このＲＡＧ１／２による組換えをベースにした手法は、哺乳動物細胞のＤＮＡ修復および切除機序を利用するが、原核細胞では実証されていない。
同じ哺乳動物細胞ベースのインビトロ系は、Ｄセグメントを用いて、国際公開第２０１３１３４８８１Ａ１号で使用され、その他の２つの結合分子に由来するペプチド断片をコードするＤＮＡで効果的に置換された。ＲＡＧ１／ＲＡＧ２により推進される多様化は、哺乳動物細胞中でのみ起こるので、この系は、ファージディスプレイなどの原核生物での手法として直接使用できない。国際公開第２０１３１３４８８１Ａ１号は、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋｓｏｎ３およびＢｏｗｄｉｓｈ（米国特許出願公開第２０１０００４１０１２Ａ１号）により使用された同じ１４マーのペプチド断片の重鎖ＣＤＲ３への導入を例示している。ＴＰＯ受容体結合構築物をＣＤＲ３の中間に導入し、それにより、ＣＤＲ配列ならびに追加のアミノ酸中のグラフト化を保持し、抗体フレームワークと組み込まれるペプチドとの間に、合計１２個以上のアミノ酸を生成した。国際公開第２０１３１３４８８１Ａ１号はまた、抗体フレームワークと組み込まれるペプチドとの９～１４アミノ酸の範囲の、合わせたリンカー長さで生成される、ｅｘｔｅｎｄｉｎ－４との抗体融合体も例示している。
Ｓａｉｎｉら８，９は、ウシ抗体のＶＨドメイン内の極めて長いシステインリッチなＣＤＲ３の発生を報告した。これらの極めて長い４０～６７アミノ酸の、ウシ抗体応答の９％を構成するＶＨ ＣＤＲは通常、特異的Ｖλ１軽鎖との対形成に限定された。最近、２つのこのようなウシ抗体の構造がＸ線結晶学により決定され１０、上昇および下降β鎖により形成され、システイン対から形成された複数のジスルフィド結合を有するペプチドを含む「ノブ」が先端に付いた、通常とは異なるストーク構造を示した。このストーク：ノブ構造は、ＶＨドメインのＣＤＲ３により形成されるが、ストークは、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ならびにパートナーのＶλ１鎖の全てのＣＤＲとの相互作用により支えられている。したがって、これらの抗体の全体のＣＤＲ多様性は、「ノブ」構造の提示に充当され、それ自体は、支持フレームワークから「ノブ」の第１のシステインまで約３８オングストロームの距離に提示される１１。したがって、その他のＣＤＲがノブにより認識された同じエピトープと相互作用する可能性は、廃棄されるかまたは厳しく制限される。
その後の研究では、「ノブ」が、顆粒球コロニー刺激因子１２およびエリスロポエチン１３などのサイトカインにより置き換えられ、これらは、ＮおよびＣ末端連結部のＧｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号１）配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）によりストークに連結された。その後、剛性βシートストーク構造が剛体の逆平行コイルドコイル構造１１で置き換え可能であることが示された。「得られる抗体の折り畳みおよび安定性を最適化」ために、可撓性Ｇｌｙ４ＳｅｒおよびＧｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ（配列番号２）リンカーがコイルドコイル配列の両末端に再度配置された。この構成はまた、顆粒球コロニー刺激因子の提示も可能にした。Ｌｉｕらは、レプチンと成長ホルモンを、ＶＨ ＣＤＲ３およびＶＨ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３に融合するために、両連結部で可撓性ペプチドと結合した剛性ストーク構造を使った同じ手法を採用した１４。この例では、保持された抗体結合は、起こり得る欠点と見なされ、宿主抗体の結合への寄与を回避するために、「無効力の」抗体パートナー、例えば、抗ＲＳＶ抗体を使うという示唆がなされた。
Ｐｅｎｇら（２０１５）は、「ゲスト」としての２種の天然アゴニスト（レプチンおよび卵胞刺激ホルモン）の、アゴニスト活性を保持したままの、抗体ＶＨ ＣＤＲ３への挿入について報告している１５。５～１５個のアミノ酸の可撓性ペプチドを、各末端のランダムな３個のアミノ酸と共にそれぞれのＮ末端およびＣ末端ドメイン間に挿入した（すなわち、１６～３６個のアミノ酸の合計リンカー長さ）融合体ライブラリーを形成した。１０７個の融合体バリアントのライブラリーを、ＨＥＫ２９３細胞中で発現させ、オートクリンベーススクリーニング手法におけるレポーター遺伝子活性化を介して、「ゲスト」のアゴニスト活性を保持した融合体を特定した。抗体の有益な半減期特性が、組み込まれたゲストにまで及ぶ。
Ｐｅｎｇら（２０１５）の手法は、オートクリンレポーター系を使って哺乳動物細胞で実施され、この場合、細胞は、半固形培地中で増殖され、分泌された抗体融合体は、産生細胞の近傍で保持される。したがって、比較的高濃度の分泌産物が細胞の直近に蓄積され１６、ライブラリー内のクローンを、発現／安定性または結合特性の変化により区別することが困難になる。したがって、Ｐｅｎｇら（２０１５）により記載された系内の厳密性に関しては限界がある。さらに、機能的スクリーニング手法もまた、適切な受容体／レポーター系が利用可能な選別に制限される。成功したクローンの比率は低かった（哺乳動物細胞内の内在性シャペロン支援折り畳みの恩恵にも関わらず）。
抗体はよく使われる結合足場である。別の方法として、非抗体足場をベースにした結合メンバーの生成が実証されている３８，３９。これらの改変タンパク質は、コア足場上の露出表面残基が多様化されたバリアントライブラリーに由来する３８－４０。
Ｂｅｔｔｏｎら（１９９７）１７は、９～１０個のアミノ酸リンカー（ＤＰＧＧ－インサート－ＹＰＧＤＰ（配列番号３、４）およびＰＤＰＧＧ－インサート－ＹＰＧＧＰ（配列番号５、６））を用いた、βラクタマーゼの、マルトース結合タンパク質中のいくつかの収容可能な部位への融合について報告している。Ｃｏｌｌｉｎｅｔ１８は、Ｎ末端挿入位置のアミノ酸残基ＳＧＧまたはＧＧおよびＣ末端挿入位置のＧＡＧを用いた、βラクタマーゼまたはジヒドロ葉酸還元酵素の、ホスホグリセリン酸キナーゼの許容可能部位への挿入を報告している。アンピシリンに対する耐性を付与する酵素β－ラクタマーゼの研究はまた、ペプチド挿入を受け入れ可能な潜在的部位１９も示した。Ｖａｎｄｅｖｅｎｎｅらは、挿入のＮおよびＣ末端のそれぞれに６～７個のアミノ酸を導入した構築物を用いた、ヒトマクロファージキトトリオシダーゼのキチン結合ドメインタンパク質のこれらの部位の１つへの挿入２０を報告している。Ｃｒａｓｓｏｎら２１は、２つのヘリックスを連結するβラクタマーゼの許容可能部位へのナノボディの挿入によるナノボディの機能化を実証した。
本発明者らは、全体結合ドメイン（「ドナー多様性足場ドメイン」）の、第２の結合ドメイン（「レシピエント足場ドメイン」）内への組み込みが、結合メンバー集団の多様性を高め、有利な性質を有する結合メンバーの、これらの集団からの選択と単離を可能とすることを見出した。これは、例えば、従来の抗体を用いて標的化することが困難な、イオンチャネルなどの標的分子に結合する結合メンバーの選択に有用であり得る。
本発明のある態様は、スクリーニング方法を提供し、該方法は、
（ｉ）結合メンバーの親ライブラリー（ｆｏｕｎｄｅｒ ｌｉｂｒａｒｙ）を用意すること、であって、親ライブラリー中のそれぞれの結合メンバーが融合タンパク質および必要に応じて、融合タンパク質と結合したパートナードメインを含み、
融合タンパク質が、レシピエント多様性足場ドメイン中に挿入されたドナー多様性足場ドメインを含み、必要に応じて、ドナー多様性足場ドメインのＮおよびＣ末端が、４個のアミノ酸またはそれ未満のアミノ酸のリンカーを用いて、それぞれレシピエント多様性足場ドメインに連結されており、
ドナー多様性足場ドメインがドナー足場およびドナー相互作用配列を含み、レシピエント多様性足場ドメインがレシピエント足場およびレシピエント相互作用配列を含み、１個または複数のドナー相互作用配列、レシピエント相互作用配列およびリンカーが、前記親ライブラリー中で多様性を有すること、
（ｉｉ）親ライブラリーの結合活性を示す親結合メンバー（ｆｏｕｎｄｅｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｅｍｂｅｒ）をスクリーニングすること、および
（ｉｉｉ）親ライブラリー中の、結合活性を示す１個または複数の親結合メンバーを特定すること、を含む。
いくつかの実施形態では、リンカーは、前記親ライブラリー中で多様性を有する。
方法は下記をさらに含み得る。
（ｉｖ）１個または複数の特定された親結合メンバーのアミノ酸配列中の、１個または複数の位置に多様なアミノ酸残基を導入し、結合メンバーの改変ライブラリーを生成すること、
（ｖ）改変ライブラリーから結合活性を示す改変結合メンバーをスクリーニングすること、および
（ｖｉ）改変ライブラリー中の、結合活性を示す１個または複数の改変結合メンバーを特定すること。
いくつかの実施形態では、多様なアミノ酸残基は、１個または複数の特定された親結合メンバーの、ドナー相互作用配列、レシピエント相互作用配列および／またはパートナードメイン中に導入され得る。
方法は下記をさらに含み得る。
（ｖｉｉ）１個または複数の特定された結合メンバーまたは改変結合メンバー由来の融合タンパク質を、パートナー結合ドメイン（パートナー鎖）の多様性集団と結合させて、結合メンバーのシャッフルライブラリーを生成すること、
（ｖｉｉｉ）シャッフルライブラリーの、結合活性を示すシャッフル結合メンバーをスクリーニングすること、
（ｉｘ）結合活性を示す１個または複数のシャッフル結合メンバーを特定すること。
本発明の別の態様は、結合メンバーのライブラリーの生成方法を提供し、該方法は、
レシピエント多様性足場ドメイン中に挿入されたドナー多様性足場ドメインを含む、融合タンパク質の多様性集団をコードする核酸集団を用意することであって、必要に応じて、ドナー多様性足場ドメインのＮおよびＣ末端が、それぞれの末端の４個のアミノ酸またはそれ未満のアミノ酸のリンカーを用いて、レシピエント多様性足場ドメインに連結されており、
ドナー多様性足場ドメインがドナー足場およびドナー相互作用配列を含み、レシピエント多様性足場ドメインがレシピエント足場およびレシピエント相互作用配列を含み、
１個または複数のドナー相互作用配列、レシピエント相互作用配列およびリンカーが、前記集団中で多様性を有すること、
前記核酸集団を発現して、多様性集団を生成すること、および
必要に応じて、融合タンパク質をパートナードメインの集団と結合させて、それにより、結合メンバーのライブラリーを生成すること、を含む。
本発明の別の態様は、結合メンバーのライブラリーを提供し、該ライブラリーは、
レシピエント多様性足場ドメインに挿入されたドナー多様性足場ドメインを含む融合タンパク質の多様性集団であって、
ドナー多様性足場ドメインがドナー足場およびドナー相互作用配列を含み、レシピエント多様性足場ドメインがレシピエント足場およびレシピエント相互作用配列を含み、必要に応じて、ドナー多様性足場ドメインのＮおよびＣ末端がそれぞれ、４個のアミノ酸またはそれ未満のアミノ酸のリンカーを用いてレシピエント多様性足場ドメインに連結されており、
ドナー多様性足場ドメインがドナー足場およびドナー相互作用配列を含み、レシピエント多様性足場ドメインがレシピエント足場およびレシピエント相互作用配列を含み、
１個または複数のドナー相互作用配列、レシピエント相互作用配列およびリンカーが、前記集団中で多様性を有し、
必要に応じて、融合タンパク質が結合パートナーに結合し、ヘテロダイマーを形成する集団、を含む。
本発明の別の態様は、レシピエント多様性足場ドメインに挿入されたドナー多様性足場ドメインを含む融合タンパク質を提供し、
ドナー多様性足場ドメインがドナー足場およびドナー相互作用配列を含み、レシピエント多様性足場ドメインがレシピエント足場およびレシピエント相互作用配列を含み、必要に応じて、ドナー多様性足場ドメインのＮおよびＣ末端が、４個のアミノ酸またはそれ未満のアミノ酸のリンカーを用いてレシピエント多様性足場ドメインに連結されている。
本発明の別の態様は、本明細書に記載の融合タンパク質および融合タンパク質と結合したパートナードメインを含む結合メンバーを提供する。
本発明の他の態様は、本明細書に記載のように特定および／または単離された結合メンバー由来の単離されたドナー多様性足場ドメイン、レシピエント多様性足場ドメインまたはパートナードメイン、例えば、異種の結合メンバー、例えば、元のドナー多様性足場ドメインを含まない結合メンバーにおいて有用であり得る、単離された、本明細書に記載のように改変されたドナー多様性足場ドメインまたは単離されたレシピエント多様性足場ドメインもしくはパートナードメインを提供する。
図１Ａは、ｌａｃＩ促進剤、Ｍ１３リーダー配列、ｓｃＦｖ抗体遺伝子－ｇｅｎｅ３（正確な縮尺ではない）を含むカセットを示す、ｐＩＯＮＴＡＳ１の図である。このカセットは、ｐＵＣ１１９のＨｉｎｄ３／ＥｃｏＲ１クローニング部位内に存在し、ｐＵＣ１１９はアンピシリン耐性遺伝子およびｃｏｌｅＥ１起始部ならびにｆ１バクテリオファージ複製起点を有する。ＶＨ遺伝子は、Ｎｃｏ１およびＸｈｏ１制限酵素部位により挟まれ、ＶＬ遺伝子は、Ｎｈｅ１およびＮｏｔ１制限酵素部位により挟まれており、適合性のあるベクターへの単純なクローニングを可能とする。 図１Ｂは、フレームワーク領域（ＦＷ）およびＣＤＲ領域の位置を示すＶＬドメインの図である。ノッチンドナーがＶＬレシピエントのＣＤＲ１位置に挿入されている。Ｐｍｌ１およびＭｆｅ１部位は、ノッチンドナーライブラリーのクローニングを可能とする。ＦＲ２からＦＲ４の末端までの領域は、軽鎖のレパートリー２８に由来する。 図１Ｃは、図１Ｂで記載のものと同じであるが、ノッチンドナーがＰｓｔ１およびＢｓｐＥ１部位を使ってＶＬ遺伝子のＣＤＲ２を置換している。 ＫｎｏｔＢｏｄｙ構築に使用した合成単鎖Ｆｖ遺伝子の配列を示す。既存の抗体Ｄ１２のＶＨをＫｎｏｔＢｏｄｙ構築物中に使用した。図２Ａは、制限酵素部位Ｎｃｏ１およびＸｈｏ１を示し、これは、ＶＨ配列ならびにＶＨをＶＬに連結する可撓性リンカーに隣接する。この後に、Ｖラムダ１ａ（ＩＧＬＶ１－３６）生殖系列をコードする配列が続く。ＶＬのＣＤＲ１が示され、Ｐｍｌ１クローニング部位が前に存在する。ＳｅｒからＴｈｒへの変異を導入し、フレームワーク１の末端にＰｍｌ１部位の含有を可能とした。この部位は、ノッチンの、ＶＬのＣＤＲ１位置へのクローニングを可能とする。合成遺伝子のＶＬフレームワーク２の末端には、ノッチンの、ＣＤＲ２位置へのクローニングを可能とするＰｓｔ１部位が存在する。図２Ｂは、図２Ａと同様であるが、Ｖカッパ生殖系列配列ＩＧＫＶ１Ｄ－３９を示す。 ＥＥＴＩ－ＩＩドナーノッチンのＶＬレシピエントへの挿入を示す。図３Ａは、太字のシステイン残基およびトリプシン結合に関与する下線を引いたコア配列（「ＰＲＩＬ」）を有するノッチンドナーＥＥＴＩ－ＩＩの配列を示す。図３Ｂは、ＥＥＴＩ－ＩＩドナーの、ラムダ生殖系列遺伝子ＩＧＬＶ１－３６のＣＤＲ１またはＣＤＲ２への挿入の図である。境界は、ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（ＩＭＧＴ）２９に従って画定する。アミノ酸は、ＩＵＰＡＣの１文字アミノ酸コードにより表している。図３Ｂｉは、ノッチン挿入前のＣＤＲ１のＶラムダレシピエントドメインの配列を示す。図３ｉｉおよび３ｉｉｉは、ドナーＥＥＴＩ－ＩＩドナー挿入後の配列を示す。（図３Ｂｉｉｉは、３Ｂｉｉと比べて、ドナーとフレームワーク残基との間に追加のＧｌｙ残基を導入するプライマーにより生成される）。図３Ｂｉｖは、ＥＥＴＩ－ＩＩドナーの挿入前の、および３Ｂｖは挿入後のＣＤＲ２のＶラムダレシピエントドメインの配列を示す。抗体フレームワーク残基は下線を引いて示され、抗体レシピエント由来の残基で失われたものは、小文字で示されている。連結部では、残基のランダム化はｘとして示され、フレームワークまたはドナー残基を置換するものは、小文字のｘで示される。ドメイン間のリンカー内のいずれかの「追加の」残基は、太字の大文字（Ａ、ＺまたはＸ）で示される。Ｚは、Ｖａｌ、Ａｌａ、ＡｓｐまたはＧｌｙ由来の任意のアミノ酸を意味する。Ｘは、コドンＶＮＣ（１２個のアミノ酸をコードする）または全部で１６個のアミノ酸をコードするＶＮＳによりコードされるアミノ酸を表す。（Ｖ＝Ａ、ＣまたはＧ；Ｓ＝ＣまたはＧ）。図３Ｃ～Ｆは、ＥＥＴＩ－ＩＩノッチンドナーのそれぞれ、Ｃ：ＩＧＬＶ１－３６のＣＤＲ１、Ｄ：ＩＧＫＶ１Ｄ－３９のＣＤＲ１、Ｅ：ＩＧＬＶ１－３６のＣＤＲ２、およびＦ：ＩＧＫＶ１Ｄ－３９のＣＤＲ２、中への挿入により生ずる構築物のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。（ＩＧＬＶ１－３６は、Ｖラムダ生殖系列遺伝子であり、ＩＧＫＶ１Ｄ－３９は、Ｖカッパ生殖系列遺伝子である）。クローニングで使用した制限酵素部位は強調表示され、フレームワークおよびＣＤＲ領域は特定されている。 ラウンド２選択産物由来のポリクローナルファージの分析を示す。ＥＥＴＩ－ＩＩ ＣＤＲ１ライブラリー（Ｂ）およびＥＥＴＩ－ＩＩ ＣＤＲ２ライブラリー（Ｃ）のラウンド２パニング由来のポリクローナルファージ（Ｘ軸）のトリプシンに対する結合を試験した。ＥＥＴＩ－ＩＩを、ｇｅｎｅ－ＩＩＩのＮ－末端へ直接融合した場合（Ａ）には、トリプシン結合は達成されなかった。Ｙ軸は、蛍光単位（ＦＵ）によるトリプシン結合を示す。 ラウンド２選択産物由来のＫｎｏｔＢｏｄｙクローンのモノクローナル結合アッセイを示す図である。ＥＥＴＩ－ＩＩ ＣＤＲ１（Ａ）およびＥＥＴＩ－ＩＩ ＣＤＲ２（Ｂ）ライブラリー選択産物（ラウンド２）由来の９４個の個々のクローンを９６ウェル培養プレートに採取し、それぞれのクローンからファージを調製した。それぞれのクローン由来のファージ上清の、ニュートラアビジンコートＭａｘｉｓｏｒｐ（商標）プレートに固定したビオチン化トリプシンに対する結合を試験した。トリプシンに対するファージ結合は、マウス抗Ｍ１３抗体、これに続く、ユーロピウム標識抗マウス抗体を使って検出した。Ｘ軸はクローン数、Ｙ軸は蛍光単位（ＦＵ）によるトリプシン結合を示す。 ＫｎｏｔＢｏｄｙクローンおよびそれらのＧｌｙＡｌａ変異体のウェスタンブロット分析を示す図である。１１個（ランダムに選択）のＫｎｏｔＢｏｄｙ（Ｗ１～Ｗ１１と呼ぶ）およびそれらのＧｌｙＡｌａ変異体（Ｍ１～Ｍ１１と呼ぶ）から調製されたファージを、マウス抗ｐＩＩＩ抗体を使ってウェスタンブロットで分析した。野生型（ＷＴ）ｇｅｎｅＩＩＩおよびＫｎｏｔＢｏｄｙ（ＫＢ）－ｇｅｎｅＩＩＩ融合体を、抗マウスＩＲＤｙｅ（登録商標）６８０（ＬＩ－ＣＯＲ、カタログ番号９２６－３２２２０）二次抗体により可視化した。 ｐＩＮＴ１２ベクター系におけるＫｎｏｔＢｏｄｙ Ｆａｂ発現カセットを示す図である。このプラスミドでは、ＥＥＴＩ－ＩＩ ＶＬ融合体およびＣＬドメインをコードする軽鎖カセットの転写は、ＥＦ１アルファプロモーターの制御下にある。ＩｇＧ１定常ドメイン１（ＣＨ１）の融合したＤ１Ａ１２ ＶＨをコードする重鎖カセットの転写は、ＣＭＶプロモーターにより制御される。 ＨＥＫ－２９３Ｆ細胞中で発現したＩｇＧ１ ＫｎｏｔＢｏｄｙのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す図である（代表的な例）。ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ親和性マトリックスを用いて精製したＫｎｏｔＢｏｄｙ Ｆａｂを、クマシー染色を使ってＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで可視化した。非還元条件下で調製された試料で観察された約５０ｋＤの主要バンドは、完全なＫｎｏｔＢｏｄｙ Ｆａｂ分子に対応する（レーン２および４）。還元条件下で調製された試料で観察された上側のバンド（約２７ｋＤ）および下側のバンド（約２３ｋＤ）は、ＶＨ－ＣＨ１融合体およびノッチン－ＶＬ－ＣＬ融合体にそれぞれ対応する（レーン３および５）。レーン１は、ＢｉｏＲａｄタンパク質ラダー（ＢｉｏＲａｄ、１６１－０３７３）のロードである。 Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ ＰＣ３．２／３０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた、サイズ排除クロマトグラフィーによって分析されるＫｎｏｔＢｏｄｙのクロマトグラフプロファイルを示す図である。 ＥＥＴＩ－抗体ＶＬ ＣＤＲ２融合体の構造を示す図である。ＫＢ＿Ａ０５（Ａ）の結晶構造は１．９Åでのものであり、ＫＢ＿Ａ１２（Ｂ）の結晶構造は２．５Åでのものである。 以前に発表したリボン形式（ＰＤＢコード１Ｈ９Ｉ）で示したＥＥＴＩ－ＩＩの構造の図である。 ＶＬ ＣＤＲ２融合体としてのＥＥＴＩ－ＩＩの構造の図である。 以前に発表したＥＥＴＩ－ＩＩ構造およびＶＬ ＣＤＲ２融合体としてのＥＥＴＩ－ＩＩの重ねあわせ図である。 Ｆａｂ ＫＢ＿Ａ０５のＶＨおよびＶＬ（ＥＥＴＩ－ＩＩに融合した）の構造図である。ＶＨ ＣＤＲ残基は黒で強調され、ＶＨ ＣＤＲ３は注釈が付けられている。 ＫｎｏｔＢｏｄｙ ＶＨシャッフルライブラリーのファージディスプレイ選択由来のポリクローナルファージ産物の分析を示す図である。重鎖シャッフルＫＢ＿Ａ０７およびＫＢ＿Ａ１２（混合した）ライブラリーを、５種の異なる抗原：ｃＭＥＴ－Ｆｃ（Ａ）、ＧＡＳ６－ＣＤ４（Ｂ）、ＦＧＦＲ４－ＣＤ４（Ｃ）、ｕＰＡ（Ｄ）およびＢ－ｇａｌ（Ｅ）に対し選択した。５種の選択由来のポリクローナルファージをそれぞれ、トリプシン、選択で使用した全ての抗原、ニュートラアビジンおよびストレプトアビジンに対する結合について試験し、バックグラウンド結合を決定した。Ｘ軸は、Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）プレートに固定した抗原を示し、Ｙ軸は、蛍光単位（ＦＵ）による抗原に対するポリクローナルファージ結合を示す。 トリプシンおよびｃＭＥＴ－ＦｃまたはトリプシンおよびＧＡＳ６－ＣＤ４に対するモノクローナル二重特異性ＫｎｏｔＢｏｄｙ（ｃＭＥＴ－ＦｃおよびＧＡＳ６－ＣＤ４選択由来）結合の代表的例を示す図である。Ｍａｘｉｓｏｒｐ（登録商標）プレートに固定された抗原に対するモノクローナルファージ結合を、マウス抗Ｍ１３抗体、それに続く、ユーロピウム標識抗マウス抗体を用いて検出した。Ｘ軸はクローン数、Ｙ軸は蛍光単位（ＦＵ）による抗原結合を示す。 ビオチン化トリプシンに対し選択される「重鎖シャッフル」ＫｎｏｔＢｏｄｙライブラリーからのファージ選択カスケードを示す図である。ラウンド２およびラウンド３に対する最適な抗原濃度は、一連のトリプシン濃度に対するファージＫｎｏｔＢｏｄｙを選択し、産物数を「無抗原コントロール」と比較することにより、実験的に決定された。 ＫｎｏｔＢｏｄｙキャプチャーアッセイのフォーマットを示す図である。ＫｎｏｔＢｏｄｙ－ｓｃＦｖ－ＦＣ（Ｂ）は、抗Ｆｃ抗体（Ａ）をコートしたＭａｘｉｓｏｒｐ（登録商標）プレート上に捕捉され、ＫｎｏｔＢｏｄｙに対するビオチン化トリプシン（Ｃ）の結合は、ストレプトアビジン標識ユーロピウム（Ｄ）を用いて検出される。 ＫｎｏｔＢｏｄｙ Ｆｃキャプチャーアッセイにおける親和性改善クローンの性能の代表例を示す図である。ＫｎｏｔＢｏｄｙ－ｓｃＦｖ－Ｆｃは、抗Ｆｃ抗体をコートしたＭａｘｉｓｏｒｐ（登録商標）プレート上に捕捉され、ＫｎｏｔＢｏｄｙへのビオチン化トリプシンの結合は、ストレプトアビジン標識ユーロピウムを用いて検出される。親和性成熟選択からから単離されたクローンで観察された結合シグナルは、親クローンＫＢ＿Ａ１２およびＫＢ＿Ａ０７と比較された。Ｘ軸はＫｎｏｔＢｏｄｙのクローンＩＤ、Ｙ軸は蛍光単位によるトリプシンに対するＫｎｏｔＢｏｄｙ結合を示す。 重鎖シャッフリング後のトリプシン結合における改善を示す図である。重鎖シャッフルライブラリーから選択されたクローンＫＢ＿Ｔｒ＿Ｆ０３のオフレートが、２つの親ＫｎｏｔＢｏｄｙ ＫＢ＿Ａ０７およびＫＢ＿Ａ１２と比較される。Ｘ軸は、秒単位でのオフレート分析を示し、Ｙ軸は共鳴単位（ＲＵ）を示す。 ｐＩＮＴ３－ｈｇ１ベクター系でのＫｎｏｔＢｏｄｙ発現カセットを示す図である。このプラスミドでは、ノッチン／毒素ＶＬ融合体およびＣＬドメインをコードする軽鎖カセットの転写は、ＥＦ１アルファプロモーターの制御下にある。Ｄ１Ａ１２ ＶＨおよびＩｇＧ１定常ドメイン１（ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）をコードする重鎖カセットの転写は、ＣＭＶプロモーターにより制御される。軽鎖遺伝子（レシピエント）中のＰｓｔＩおよびＢｓｐＥＩ部位は、ノッチン（ドナー）の、ＣＤＲ２位置への挿入を可能とする。 ＨＥＫ－２９３Ｆ細胞中で発現したＩｇＧ１ ＫｎｏｔＢｏｄｙのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す図である。タンパク質－Ａ親和性クロマトグラフィーを用いて精製したＫｎｏｔＢｏｄｙを、クマシー染色を使って還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で可視化した。頂上のバンドは、抗体重鎖（ＨＣ）に対応し、底部のバンドは、ノッチン／毒素をＣＤＲ２融合体として提示する抗体軽鎖に対応する。試料１～４は、ＮａＶ１．７ブロッカー（Ｈｕｗｅｎｔｏｘｉｎ－ＩＶ、ＰｒｏＴｘ－ＩＩ、Ｓｓｍ６ａ、およびＳｓｍ６ａ＿ＧＧＳ）に融合したＫＢ＿Ａ１２抗体レシピエントである。試料５～１０は、ＫＢ＿Ａ０７抗体（５、６および７）またはＫＢ＿Ａ１２抗体（８、９および１０）に融合したＫｖ１．３ブロッカー（カリオトキシン、Ｍｏｋａ－１およびＳｈｋ）である。試料１１および１２は、それぞれ、親ＫｎｏｔＢｏｄｙクローン（ＥＥＴＩ－ＩＩ融合体）ＫＢ＿Ａ０７およびＫＢ＿Ａ１２である。 ２つのａｄｈｉｒｏｎ－抗体融合体のＬＯＸ－１タンパク質に対する特異的結合を示す図である。このアッセイでは、ＬＯＸ１に対する、ａｄｈｉｒｏｎ－抗体融合体を提示しているファージの結合を、マウス抗Ｍ１３抗体、これに続く、ユーロピウム標識抗マウス抗体を使って検出した。親ＫｎｏｔＢｏｄｙ ＫＢ＿Ａ０７およびＫＢ＿Ａ１２（ＥＥＴＩ－ＩＩ融合体）をコントロールとして含めた。タンパク質ｃＭＥＴ－Ｆｃ、ＧＡＳ６－ＣＤ４、ＦＧＦＲ４－ＣＤ４、ＵＰＡおよびＢ－ｇａｌを使って、非特異的結合を調査した。全ての抗原をＭａｘｉｓｏｒｐ（登録商標）プレート上に直接固定した。 一次配列上に重ねて置いた二次構造の図式表現を示す。図２０Ａは、フィブロネクチンの１０番目のＩＩＩ型細胞接着ドメインの配列を示す。二次構造エレメント（ベータシート）には下線をした。ドメインの上面のベータシートに結合する残基は、小文字で示している。図２０Ｂは、標識したベータシートおよびアルファらせん状領域を有するｇｐ２タンパク質の配列を示す。ドナー挿入または多様化の可能性のある部位は、小文字で示した。構造に影響を与えることなく除去されたＮおよびＣ末端残基は、イタリック体およびより小さいフォントで示している。 ＫｎｏｔＢｏｄｙによる、ｈｕＫｖ１．３チャネル電流の濃度依存阻害を示す濃度反応曲線の図である。毒素融合体ＫｎｏｔＢｏｄｙ ＫＢ＿Ａ１２＿Ｓｈｋ（Ｓｈｋ毒素、正方形）、ＫＢ＿Ａ０７＿Ｓｈｋ（Ｓｈｋ毒素、三角形）およびＫＢ＿Ａ０７＿ＫＴＸ（カリオトキシン、円形）のＬｏｇ［Ｍ］濃度（ｘ軸）に対し、％残留電流（ｙ軸）をプロットした。これらの濃度反応曲線から、５０％の電流阻害時の濃度（ＩＣ５０；総括の表１１を参照）を決定した。 ＫｎｏｔＢｏｄｙリンカーバリアントのトリプシンに対する結合比較を示す図である。ＫｎｏｔＢｏｄｙ Ｆａｂ（Ｘ軸）の、ストレプトアビジンコートＭａｘｉｓｏｒｐ（登録商標）プレートに固定されたビオチン化トリプシンに対する結合を、マウス抗ＣＨ１抗体、それに続く、ユーロピウム標識抗マウス抗体を用いて、検出した。Ｙ軸は、正規化された結合シグナル（％）を示し、この場合、Ｇｌｙ４Ｓｅｒコントロールの結合を、それらそれぞれの親クローン（すなわち、１００％結合）に対し正規化する。 ＫｎｏｔＢｏｄｙループライブラリーから選択されたクローンの、β－ガラクトシダーゼ（Ａ）およびｃＭＥＴ（Ｂ）に対するモノクローナルファージ結合を示す図である。Ｍａｘｉｓｏｒｐ（登録商標）プレートに直接固定された抗原に対するモノクローナルファージ結合を、マウス抗Ｍ１３抗体、それに続く、ユーロピウム標識抗マウス抗体を用いて検出した。Ｘ軸はクローン数、Ｙ軸は蛍光単位（ＦＵ）による抗原結合を示す。 ラットＴＦＲに対するＫｎｏｔＢｏｄｙ結合物質を選別する代表的例を示す図である。Ｍａｘｉｓｏｒｐ（登録商標）プレートに固定されたラットＴＦＲに対するモノクローナルファージ結合を、マウス抗Ｍ１３抗体、それに続く、ユーロピウム標識抗マウス抗体を用いて検出した。Ｘ軸はクローン数、Ｙ軸は蛍光単位（ＦＵ）によるＴＦＲへのファージ結合由来のシグナルを示す。 ＫｎｏｔＢｏｄｙ ＫＢ＿Ａ１２および天然の「極めて長いＶＨ ＣＤＲ３（「ウシＵＬＶＣ－Ａｂ」）」を有するウシ抗体からなるフォーマットの結合比較を示す図である。ウシＵＬＶＣ－Ａｂのシステインリッチノブを、ＥＥＴＩ－ＩＩノッチンにより置換した（「ＥＥＴＩ－ＩＩ ウシＵＬＶＣ－Ａｂ」）。これらの構築物をコードする遺伝子を、ｐＳＡＮＧ４に挿入し、ＫＢ＿Ａ１２またはＥＥＴＩ－ＩＩ ウシＵＬＶＣ－Ａｂ融合体構築物（Ｘ軸）からレスキューしたファージをＰＥＧ沈殿させた。１２．５ｘ（Ａ）および０．５ｘ（Ｂ）ファージ（初期培養体積に対して）を、ストレプトアビジンコートＭａｘｉｓｏｒｐ（商標）プレートに固定されたビオチン化トリプシンに対する結合の試験をした。トリプシンに対するファージ結合を、抗Ｍ１３抗体、これに続く、ユーロピウム標識抗マウス抗体を使って検出した。Ｙ軸は、蛍光単位（ＦＵ）によるファージ結合シグナルを示す。 哺乳動物ディスプレイベクターｐＤ６を模式的に表した図である。抗体遺伝子は、ヒトＡＡＶＳ座位を標的にしており、これは、タンパク質ホスファターゼ１、制御サブユニット１２Ｃ、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃをコードする遺伝子の第１と第２のエキソンの間の４４２８ｂｐイントロン内に位置している。この領域に向けられた１対のＴａｌｅヌクレアーゼを使って、この部位でゲノムを切断する。切断部位の５’および３’部位にある７００～８００ｂｐの配列が、左および右相同性アーム（ＨＡ）としてそれぞれドナーベクターに組み込まれる。ｐＤ６ドナーベクターを使って、ヒトＩｇＧ１のＦＣ領域と融合した単鎖Ｆｖ（ｓｃＦＶ）抗体としてフォーマットされた抗体遺伝子が挿入される。このベクターはまた、ｓｃＦｖ－Ｆｃ遺伝子および「血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ－ＴＭ）」由来の膜貫通ドメインをコードするエキソンの発現を推進するＣＭＶプロモーターも有する。ｓｃＦｖ－Ｆｃ抗体融合体をコードする導入遺伝子領域は、左および右相同性アーム（左ＨＡ、右ＨＡ）に隣接し、ＡＡＶＳ座位中の切断部位に隣接する配列を提示する。このベクターはまた、ＡＡＶＳ座位内のエキソン１に対するインフレームスプライシングにより活性化する、プロモーターレスブラストサイジン遺伝子をコードする。 細胞表面上のＫｎｏｔＢｏｄｙの機能発現を示す図である。全ての細胞をＰＥ標識抗Ｆｃ（ＦＬ２チャネル）およびＡＰＣ標識ストレプトアビジン／ビオチン化トリプシン複合体（ＦＬ４チャネル）で染色した。遺伝子導入後に、細胞をブラストサイジン中で選択し、遺伝子導入の１５日後に、フローサイトメトリーにより解析した。パネルは、（Ａ）ＫＢ＿Ａ０７、（Ｂ）ＫＢ＿Ａ１２または（Ｃ）非遺伝子導入ＨＥＫ２９３細胞に対する結果を示す。 ＥＥＴＩ－ＩＩドナーノッチンの、抗ＴＡＣＥ抗体Ｄ１Ａ１２ ｓｃＦｖのＶＨ ＣＤＲ１（Ａ）、ＶＨ ＣＤＲ２（Ｂ）、ＶＨ ＣＤＲ３（Ｃ）、ＶＬ ＣＤＲ１（Ｄ）、ＶＬ ＣＤＲ２（Ｅ）およびＶＬ ＣＤＲ３（Ｆ）への挿入の図式表現である（表２３、Ｔａｐｅ，Ｃ．Ｊ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ １０８，５５７８－５５８３（２０１１））。さらに、ＫＢ＿Ａ０７のリンカーライブラリーを作成した。この場合、ＥＥＴＩ－ＩＩドナーノッチンをＶＬ ＣＤＲ２（Ｇ）に挿入した。この例の境界は、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６４，２２０－２３２（１９９６））により定義された基準に準じて、Ｖ ＢＡＳＥデータベース（ＭＲＣ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＵＫ）に従って画定した。アミノ酸は、ＩＵＰＡＣの１文字アミノ酸コードにより表している。図２８Ａｉは、ノッチン挿入前のＣＤＲ１のＶＨレシピエントドメインの配列を示す。図２８Ａｉｉは、ドナーＥＥＴＩ－ＩＩドナー挿入後の配列を示す。図２８Ｂｉは、ノッチン挿入前のＣＤＲ２のＶＨレシピエントドメインの配列を示す。図２８Ｂｉｉは、ドナーＥＥＴＩ－ＩＩドナー挿入後の配列を示す。図２８Ｃｉは、ノッチン挿入前のＣＤＲ３のＶＨレシピエントドメインの配列を示す。図２８Ｃｉｉは、ドナーＥＥＴＩ－ＩＩドナー挿入後の配列を示す。図２８Ｄｉは、ノッチン挿入前のＣＤＲ１のＶＬレシピエントドメインの配列を示す。図２８Ｄｉｉは、ドナーＥＥＴＩ－ＩＩドナー挿入後の配列を示す。図２８Ｅｉは、ノッチン挿入前のＣＤＲ２のＶＬレシピエントドメインの配列を示す。図２８Ｅｉｉは、ドナーＥＥＴＩ－ＩＩドナー挿入後の配列を示す。図２８Ｆｉは、ノッチン挿入前のＣＤＲ３のＶＬレシピエントドメインの配列を示す。図２８Ｆｉｉは、ドナーＥＥＴＩ－ＩＩドナー挿入後の配列を示す。図２８Ｇｉは、リンカーランダム化前のＣＤＲ２の「野性型」ＫＢ＿Ａ０７ＶＬレシピエントドメインの配列を示す。図２２８Ｇｉｉは、リンカー残基のランダム化後の配列を示す。連結部では、残基のランダム化はＸとして示される。 代替フレーム化５－３ＥＥＴＩ－ＩＩノッチンドナーのＶＬレシピエントへの挿入を示す。代替フレーム化ノッチンを、Ｖカッパ（ＩＧＫＶ１Ｄ－３９）またはＶラムダ（ＩＧＬＶ１－３６）軽鎖のＣＤＲ１またはＣＤＲ２に挿入した。図２９Ａは、ＶＬレシピエントのＣＤＲ１およびＣＤＲ２へのドナーとして使われる、代替フレーム化ノッチン構築物ＥＥＴ５～３の核酸およびアミノ酸配列を示す。システイン残基を太字とし、トリプシン結合に関与するコア配列（「ＰＲＩＬ」）には下線を引いた。図２９Ｂは、５－３ＥＥＴＩ－ＩＩドナーの、ラムダ生殖系列遺伝子ＩＧＬＶ１－３６のＣＤＲ１またはＣＤＲ２への挿入を示す図である。境界は、ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（ＩＭＧＴ）２９に従って画定する。アミノ酸は、ＩＵＰＡＣの１文字アミノ酸コードにより表している。図２９Ｂｉは、ノッチン挿入前のＣＤＲ１のＶラムダレシピエントドメインの配列を示す。図２９Ｂｉｉおよび２９Ｂｉｉｉは、５－３ＥＥＴＩ－ＩＩドナーの挿入後の配列を示す。（図２９Ｂｉｉｉの配列は、２９Ｂｉｉと比べて、ドナーとフレームワーク残基との間に追加のＧｌｙ残基を導入するプライマーにより生成される）。図２９Ｂｉｖは、ＥＥＴＩ－ＩＩドナーの挿入前の、および２９Ｂｖは挿入後のＣＤＲ２のＶラムダレシピエントドメインの配列を示す。抗体フレームワーク残基は下線を引いて示され、抗体レシピエント由来の残基で失われたものは、小文字で示されている。連結部では、残基のランダム化はｘとして示され、フレームワークまたはドナー残基を置換するものは、小文字のｘで示される。ドメイン間のリンカー内のいずれかの「追加の」残基は、太字の大文字（Ａ、ＺまたはＸ）で示される。Ｚは、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｓｐ、ＧｌｙまたはＧｌｕ（ＧＮＳコドンによりコードされる）由来の任意のアミノ酸を意味する。Ｘは、コドンＶＮＣ（１２個のアミノ酸をコードする）または全部で１６個のアミノ酸をコードするＶＮＳによりコードされるアミノ酸を表す。（Ｖ＝Ａ、ＣまたはＧ；Ｓ＝ＣまたはＧ）。図２９Ｃ～Ｄは、５－３ＥＥＴＩ－ＩＩノッチンドナーのそれぞれ、ＩＧＬＶ１－３６のＣＤＲ１（Ｃ）またはＣＤＲ２（Ｄ）への挿入により生ずる構築物のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。同じ５－３ＥＥＴフォーマットはまた、Ｖカッパ生殖系列遺伝子であるＩＧＫＶ１Ｄ－３９のＣＤＲ１およびＣＤＲ２ヘも導入され、この記述は、ＥＥＴＩ－ＩＩの天然の（１－５）配向を用いて図３に示されているが、実施例１６に記載したのと同じ手法を適用し、５－３ＥＥＴＩ－ＩＩフォーマットの挿入に対し図２９で示している。クローニングで使用した制限酵素部位は強調表示され、フレームワークおよびＣＤＲ領域は特定されている。 Ｋｖ１．３ブロッキングドナードメイン（Ｓｈｋ）を含むＫｎｏｔＢｏｄｙがＴ細胞のサイトカイン分泌を減らすことを示す図である。ＰＢＭＣは、抗ＣＤ３抗体で活性化され、ドナー多様性ドメインがＳｈｋ（ＫＢ＿Ａ１２＿Ｓｈｋ）またはＥＥＴ（ＫＢ＿Ａ１２）であるＫｎｏｔＢｏｄｙと共インキュベートされた。遊離Ｓｈｋもポジティブコントロールとして使用する。グラフは、ＰＢＭＣ中でのＴ細胞活性化後のインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）（図３０Ａ）、グランザイム（図３０Ｂ）、インターロイキン７Ａ（ＩＬ１７Ａ）（図３０Ｃ）およびＴＮＦ－アルファ（図３０Ｄ）のレベルを示す。
本発明は、レシピエント多様性足場ドメイン内に挿入されたドナー多様性足場ドメインを含む結合メンバーの多様性集団およびライブラリー、およびこのような集団およびライブラリーから単離された結合メンバーに関する。
本発明者らは、全ドナー多様性足場ドメインは、レシピエント結合ドメインへの挿入後、安定な機能性高次構造に適切に折り畳まれて、両方のドメインを生物学的に活性なままに残すことができることを示した。レシピエント結合ドメインは、組み込まれるドナードメインをその構造を損なうことなく収容することが明らかになっている。さらに、複数のシステイン残基を有するドナーおよびレシピエントドメインは、融合タンパク質内で、それぞれ適切なジスルフィド結合パターンを形成する。
本明細書に記載のドナーおよびレシピエント多様性足場ドメインの組み合わせは、結合メンバーの集団およびライブラリーの多様性を増大させるのに有用である。例えば、抗体は、天然で進化した多様性足場であるが、ほとんどの多様性は、ＣＤＲ３領域、特に、抗体重鎖のＣＤＲ３領域内に集中している。ドナー多様性足場ドメインのレシピエント抗体ＶＨおよび／またはＶＬドメインへの導入は、キメラドナー／抗体結合メンバーの利用可能な多様性を大きく高める。
さらに、ドナー多様性足場ドメインが、イオンチャネルなどの特定のクラスの標的分子に結合する傾向がある場合、この傾向がドナー多様性足場ドメインを含む結合メンバーに付与される可能性がある。したがって、結合メンバーは、ドナー多様性足場ドメインの結合活性（例えば、イオンチャネルへのノッチン結合）を保持し得ると同時に、レシピエント多様性足場ドメイン（例えば、抗体）のインビボ半減期も示し得る。
本発明のキメラ結合メンバーのドナーおよびレシピエント多様性足場ドメインは、直接一緒に結合されるかまたは短いリンカーにより連結されて、ドメイン間の可撓性および相対運動を制限するか抑制し、それにより結合メンバーが比較的剛性であることが望ましい。より長い、非構造化リンカーは、タンパク分解を受け易く、また、立体配置的可撓性の増加により、不正確なジスルフィド結合の形成が促進されることもある。さらに、より長い、相対的に構造化されていないペプチドの立体配置的可撓性は相互作用の親和性を損なう。抗体と抗原などの２分子間の相互作用では、複合体形成時に立体配置的エントロピーが失われる。ドナーとレシピエントとの多様性足場ドメイン間で、より長いリンカーを用いる場合、さらに多くの利用可能な高次構造が存在し、複合体形成をエネルギー的に好ましくないものにする可能性がある。対照的に、短いリンカーまたはリンカーなしの場合のより構造化された融合タンパク質による複合体形成は、エントロピー的により好ましく、より高い親和性相互作用に繋がる可能性がある３０，３１，３２，３３。
立体配置的可撓性は、結合相互作用に対する熱力学的「エントロピーペナルティ」を有するので、本明細書に記載のドナーとレシピエントとの多様性足場ドメイン間の立体配置的関連性の制約は、相互作用のエントロピーペナルティを最小化し、その結果として、結合メンバーの相互作用の親和性における利益が得られる。
ドナーおよびレシピエント多様性足場ドメインが近接していることを考慮すれば、ドナーおよびレシピエントの両方の多様性足場ドメインの表面上のアミノ酸は、標的分子または複合体内の異なる標的分子に結合するパラトープに寄与し得る。これは、どちらかの多様性足場ドメイン単独に比べて、結合メンバーの親和性または特異性を高め得る。ドナーまたはレシピエント多様性足場ドメインのパートナードメインはまた、標的分子の結合に寄与し得る。ドナー、レシピエントまたはパートナードメインのいずれかは、標的分子または複合体上の近接して置かれた部位に接触していてもよい。
本明細書に記載の結合メンバーは、融合タンパク質を含んでよい。融合タンパク質は、２つの多様性足場ドメイン；ドナー多様性足場ドメインおよびレシピエント多様性足場ドメインを含むキメラ分子である。
ドナー多様性足場ドメインは、レシピエント多様性足場ドメイン内に位置し、すなわち、ドナー多様性足場ドメインは、そのＮおよびＣ末端でレシピエント多様性足場ドメインと隣接している。
融合タンパク質のドナーおよびレシピエントの両方の多様性足場ドメインが、融合タンパク質の結合活性に寄与する、例えば、同じまたは異なる標的分子に結合するのが好ましい。
他の実施形態では、融合タンパク質のドナーおよびレシピエントの多様性足場ドメインの１つ、好ましくは、ドナー多様性足場ドメインが融合タンパク質の結合活性、例えば、標的分子の結合に関与する。
いくつかの好ましい実施形態では、融合タンパク質は、例えば、ファージディスプレイによる選択のために、バクテリオファージの表面上に提示するのに好適する。ディスプレイ用の融合タンパク質は、ＦｆファージまたはＴ７ファージの遺伝子１０カプシドタンパク質由来のｐＩＩＩ、ｐＶＩ、ｐＶＩＩＩ、ｐＶＩＩおよびｐＩＸなどのファージコートタンパク質をさらに含み得る。ファージコートタンパク質は、融合タンパク質のＮまたはＣ末端、好ましくは、融合タンパク質のＣ末端に位置し得る。
多様性足場ドメインは、安定な三次構造を有する単独で折り畳み構造化するドメインであり、これは、多様性な相互作用配列を提供でき、標的分子に対する結合を媒介する可能性がある。多様性足場ドメインは、パラロガスまたはオルソロガス群内で発現するドメインを含み、これは、前記足場のその他の分子との相互作用を推進するための展開に利用されてきた。多様性足場ドメインはまた、多様性を提示するように改変された天然ドメインならびに安定な自己折り畳み構造を形成するように進化させたまたは設計された完全合成タンパク質を含む。
当該技術分野において既知の多様性足場ドメインの例には、免疫グロブリンドメイン４１、ノッチンおよびヘビ毒トキシンペプチドなどのシステインリッチペプチド、アフィボディ（プロテインＡドメインの改変Ｚドメイン）４２，４３、モノボディ（すなわち、改変フィブロネクチン）４４、設計アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓ）４５、ａｄｈｉｒｏｎ４６、アンチカリン４７、チオレドキシン４８、単一ドメイン抗体４９，５０およびＴ７ファージ遺伝子２タンパク質（Ｇｐ２）５１が挙げられる。
いくつかの好ましい実施形態では、多様性足場ドメインは、足場ドメイン内のシステイン残基により形成される複数のジスルフィド架橋を含み得る。
本明細書に記載の使用のために好ましい多様性足場ドメインには、抗体のＶＨおよびＶＬドメインが含まれる。Ｔ細胞受容体のそれらの標的への結合は、β鎖のＣＤＲ３に最大の多様性を有する可変Ｉｇドメイン（αおよびβ）内に存在するＣＤＲループによっても誘導される。これらは、インビトロで多様性配列を得るために使用されてきた３４，３５。抗体重鎖の定常Ｉｇドメイン（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）および軽鎖定常Ｉｇドメイン（Ｃカッパ、Ｃラムダ）などの他のＩｇドメインも多様性足場として使用し得る３６，３７。Ｉｇドメインは、抗体およびＴ細胞受容体以上に、進化的時間スケールで広がり、発展している多様性足場として機能し、また、Ｉｇドメインは、分子認識に関与する何百もの異なるタンパク質で見出されている。このようなタンパク質由来のＩｇドメインを本明細書に記載の多様性足場ドメインとして使用し得る。
多様性足場ドメインの足場は、安定なドメインのコア構造を形成するように組み合わされる、二次構造エレメントを維持するフレームワークである。足場は、ドメイン内の他の足場残基の側鎖またはペプチド主鎖と共有結合および非共有結合相互作用を形成する、複数の近接するまたは非近接足場残基を含む。相互作用は、水素結合、ジスルフィド結合、イオン相互作用および疎水性相互作用を含んでよい。足場残基は、αヘリックス、β鎖、βシートおよびその他の構造的モチーフなどのドメインの二次構造エレメントを形成し得る。それらは、多様性足場ドメインのコア構造に寄与するので、足場残基は保存され、多様性足場ドメイン内の足場残基の置換は制限される。
足場の例には、抗体可変ドメインのフレームワーク領域またはノッチンベータシートおよび３１０ヘリックスモチーフに加えて、ノッチンのシステインノットフレームワーク（例えば、特徴的なノット構造を形成する６個またはそれを超えるシステイン残基）が含まれる。
多様性足場ドメインの相互作用配列は、足場の安定なコア構造により提供される近接するまたは非近接アミノ酸配列である。相互作用配列は、他の分子と相互作用し、例えば、標的分子への結合のための、ドメインの結合活性を媒介し得る。いくつかの実施形態では、ドメインの相互作用配列は、１個または複数の多様性を有する残基を含み、ライブラリーから単離されるべき特異的結合活性を有する結合メンバーの選択を可能とし得る。
相互作用配列の残基は、完全に非構造的であってよく、また、ドメインの三次構造を支持しなくても、これに寄与しなくてもよい。例えば、相互作用残基は、二次構造エレメントまたはモチーフ間のループもしくはターンに位置してもよい。それらは、多様性足場ドメインのコア構造に寄与しないので、相互作用残基はあまり保存されず、多様性足場ドメイン内の相互作用残基の置換の制約は少ない。いくつかの実施形態では、多様性足場ドメインの相互作用配列は、タンパク質の非ループ面内に残基を含み得る４３，４４，５２。
相互作用配列の例には、抗体可変ドメインのＣＤＲおよび安定な、自己折り畳みタンパク質ドメインの二次構造エレメントを連結するループ、例えば、ＥＥＴＩ－ＩＩのループ１のＰＲＩＬモチーフなどのノッチンの連結ループを含む。足場ドメイン内の相互作用配列の他の例は、当技術分野において既知である３４－３８，４１－４８，５１，５３。
いくつかの実施形態では、ドメインは、結合および二次構造の両方に寄与する残基を含んでよい。これらの残基は、足場および相互作用配列の両方を構成し得る。これは、アフィボディ（プロテインＡドメインの改変Ｚドメイン）４３，５２およびモノボディ（フィブロネクチンドメインベースの改変足場）４４で例示される。二次構造および結合の両方に寄与する残基は、本明細書に記載の結合メンバー中で多様化され得る。二次構造を保持する結合メンバーは、例えば、ルーチン選択技術を用いたライブラリーにおいて特定され得る。いくつかの実施形態では、二次構造および結合の両方に寄与する残基は、多様化されなくてもよい。
多様性足場ドメインは、融合タンパク質中のドナーまたはレシピエント多様性足場ドメインおよび本明細書に記載の結合メンバーとして使用し得る。
ドナー多様性足場ドメインは、ドナー足場およびドナー相互作用配列を含む。
好ましくは、ドナー多様性足場ドメインは、天然のドメイン構造内で、相互に近位にあるＮおよびＣ末端を有する。ドナーの末端間の距離は、例えば、レシピエント多様性足場ドメインの挿入部位の末端間の２０％以内、より好ましくは、同じ距離であってよい。近位の末端を有するドナードメインの例には、ノッチン５４、ａｄｈｉｒｏｎ４６およびＧｐ２足場５１が含まれる。
他の実施形態では、ドナー多様性足場ドメインは、天然のドメイン構造内で、近位にはないＮおよびＣ末端を有してよい。非近位ＮおよびＣ末端を有するドナー多様性足場ドメインは、本明細書に記載のように、レシピエント多様性足場ドメインのループを有するドナードメインの末端の融合を可能とするために、充分に長いリンカーを使い、リンカーがドナーおよびレシピエントドメインの末端間の間隙を架橋して、レシピエント多様性足場ドメイン中に挿入し得る。あるいは、ドナー多様性足場ドメインは、ＮおよびＣ末端が近接にあるドナードメインを作成するために切断されるか、またはレシピエント多様性足場ドメインは、挿入部位の末端がドナードメインの末端と近位にあるレシピエントドメインを作成するために切断され得る。正味結果は、ドナーおよびレシピエント構造ドメインの融合体から生じる残基の損失であろう。リンカーまたは切断は、ドナードメインの末端間の距離をレシピエント足場の挿入部位の末端間の距離の２０％以内に減らし得る、またはより好ましくは同じ距離にし得る。
ドナー多様性足場ドメインは、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個または少なくとも４０個のアミノ酸から構成されていてよい。ドナー多様性足場ドメインは、４００以下、３００個以下、２００個以下または１００個以下のアミノ酸から構成されていてよい。例えば、ドナー多様性足場ドメインは、２０～４００個のアミノ酸から構成されていてよい。
ドナー多様性足場ドメインは、足場ドメイン中でジスルフィド結合を形成する２、４、６、８、１０個またはそれより多くのシステイン残基を含んでよい（すなわち、ドメインは１、２、３、４、５個またはそれより多くのジスルフィド結合を含んでよい）。
いくつかの実施形態では、ドナー多様性足場は、少なくとも１５個のアミノ酸から構成されてよく、また、４個以上のシステイン残基を含んでよい。
好適なドナー多様性足場ドメインの例には、免疫グロブリン、免疫グロブリンドメイン、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、アフィボディ、ヘビ毒トキシンペプチドまたはノッチンなどのシステインリッチペプチド、「設計アンキリンリピートタンパク質」（ＤＡＲＰｉｎ）、ａｄｈｉｒｏｎ、フィブロネクチンドメイン、アンチカリン、Ｔ７ファージ遺伝子２タンパク質（Ｇｐ２）、モノボディ、単一ドメイン抗体４９，５０またはアフィボディが挙げられる。
好ましいドナー多様性足場ドメインには、イオンチャネル調節ペプチド、ヘビ毒トキシンペプチドおよびノッチンなどのシステインリッチペプチドが挙げられる。
システインリッチペプチドは、コア構造エレメントとしてジスルフィド結合のネットワークを含む。システインリッチペプチドの高次構造は当該技術分野においてよく知られている５５，６。
複数のジスルフィド結合を含むイオンチャネル調節ペプチド（アゴニストおよびアンタゴニストの両方）は当該技術分野においてよく知られている。例には、クモ、ヘビ、サソリおよび有毒巻貝２６，５５などの有毒種由来のヘビ毒トキシンが挙げられる。
ヘビ毒トキシンペプチドの高次構造およびジスルフィド結合パターンも、当該技術分野においてよく知られている。例えば、クモおよびその他の動物の毒液の分析では、多数の高次構造およびジスルフィド結合パターンが明らかになっている５５，６５，６６，６７。例えば、クモ毒素ｈｕｗｅｎｔｏｘｉｎ－ＩＩは、ジスルフィド結合パターン：Ｉ－ＩＩＩ、ＩＩ－Ｖ、ＩＶ－ＶＩ６８を有し、「ヤヌス面アトラコトキシン」（Ｊ－ＡＣＴＸ）は、ジスルフィド結合パターン：Ｉ－ＩＶ、ＩＩ－ＶＩＩ、ＩＩＩ－ＩＶおよびＶ－ＶＩＩＩ（通常とは異なる２つ隣のシステイン間の「ビシナル」ジスルフィド結合を含む）５６を有し、ここで、ローマ数字の対は、それぞれのシステインが配列中で出現する順序およびジスルフィド結合を共に形成するパートナーシステインの位置を意味する。
システインリッチペプチドは、２個のジスルフィド結合により安定化された逆平行ベータヘアピンを含む「ジスルフィドに向けられたベータヘアピン（ｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｂｅｔａ ｈａｉｒｐｉｎ）」（ＤＤＨ）構造を有し得る５６。ＤＤＨコア構造は、広範にわたって研究された「阻害性システインノット」構造（以後、システイン－ノットミニタンパク質またはノッチンと呼ぶ）において発見された。
ノッチンは、織り合わされたジスルフィド結合フレームワーク、三重鎖βシート折り畳み、および１個または複数の溶媒曝露ループを有する小さいシステインリッチタンパク質である。ノッチンは通常、少なくとも３つのジスルフィド架橋を含み、システインＩＩＩとＶＩとの間のジスルフィド架橋が２つのその他のジスルフィド（ジスルフィドＩ－ＩＶおよびＩＩ－Ｖ）と相互連結する主鎖により形成された大環状分子を横切る場合に実現されるジスルフィドノットを特徴とする。これらの架橋は、逆平行βシート、いくつかの事例では、短い３１０ヘリックスから形成される通常の３次折り畳みを安定化する。（ローマ数字の対は、それぞれのシステインが配列中で出現する順序およびジスルフィド結合を共に形成するパートナーシステインの位置を意味する）。ノッチンは、２０～６０個の残基長さ、通常２６～４８残基であり、節足動物、軟体動物およびクモ形類動物からプラントまで及ぶ多様性な生物で認められる５７。イモガイから生じるノッチン（コノトキシン）は特に、広範囲わたり研究されている５４，５８－６０．数千の他のノッチンが特定されており、それらの配列および構造は公的に、例えば、オンラインデータベース（例えば、ノッチンオンラインデータベース５７、Ｃｅｎｔｒｅ ｄｅ Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ，ＣＮＲＳ，Ｆｒａｎｃｅ）から利用可能である５７，６１，６２。
いくつかの実施形態では、全体としての適切なノッチンの二次構造は、適切なシステインの分布および間隔により与えられ得る。他の実施形態では、１個または複数の追加の足場残基を適切な二次構造に付与することが必要となり得る。例えば、ＥＥＴＩ－ＩＩの残基１１～１５および２２～２５は、ジスルフィドの非存在下では、折り畳みを、それぞれ、１１～１５ ３１０ヘリックス領域および２２～２５ β－ターン領域に向ける傾向がある６３。
ノッチンは、高度の配列可撓性を示し、大量の非天然配列を収容できる。例えば、ＥＥＴＩ－ＩＩは、５０％を超える非天然配列を収容できる（ループの２をランダム化することにより）２４。
本明細書に記載の多様性足場として使用するための好適なシステインリッチペプチドは、例えば、Ｈｕｗｅｎｔｏｘｉｎ－ＩＶ、ＰｒｏＴｘ－ＩＩ、Ｓｓｍ６ａ、カリオトキシン、ｍｏｋａｔｏｘｉｎ－１、コノトキシン－ω、ＭＣｏＴＩ－ＩＩ、Ｓｈｋ、ＰｃＴＸ１またはマンバルジン（表８Ａ；配列番号７～２５に示すような）のアミノ酸配列またはノッチンデータベースに記載のその他の配列を含んでよく、または、この配列の適切な折り畳み構造を保持する断片またはバリアントであってよい。
基準ノッチンのバリアントのノッチンの配列、例えば、表８Ａ（配列番号７～２５）に示す配列またはノッチンデータベースに記載の配列は、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または、少なくとも９８％の、基準配列に対する配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。特定のアミノ酸配列バリアントは、表８Ａ（配列番号７～２５）のノッチン配列から、１個のアミノ酸、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個またはそれを超える個数のアミノ酸の挿入、付加、置換または欠失の分だけ異なり得る。
配列類似性および同一性は通常、アルゴリズムＧＡＰ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ，Ａｃｃｅｌｅｒｙｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＵＳＡ）に準拠して決定される。ＧＡＰは、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用して、一致する数が最大となり、ギャップの数が最小になる、２つの完全な配列を整列させる。通常、デフォルトパラメータを使い、ギャップ形成ペナルティー＝１２およびギャップ延長ペナルティー＝４とする。ＧＡＰの使用が好ましいが、例えば、その他の次記のアルゴリズムを使ってもよい：ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０５－４１０、の方法を用いる）、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５：２４４４－２４４８、の方法を用いる）、もしくはＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１４７：１９５－１９７）、またはＴＢＬＡＳＴＮプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）、前出）、これらには通常、デフォルトパラメータを用いる。特に、ｐｓｉ－Ｂｌａｓｔアルゴリズム（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９７）２５ ３３８９－３４０２）を使用し得る。
配列比較は、本明細書に記載に該当する配列の全長にわたりなされ得る。
ノッチンのループ内の１個または複数の残基、例えば、ノッチンのループ１、２、３、４または５内の１個または複数の残基が、多様化またはランダム化され得る。いくつかの実施形態では、ＥＥＴＩ－ＩＩのループ１のトリプシン結合モチーフＰＲＩＬ、または異なるノッチン中の対応する残基などの標的結合モチーフ中の１個または複数が多様化され得る。例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個またはそれを超える個数が多様化され得る。
ドナーおよびレシピエント全体の多様性における天然のジスルフィド結合パターンの形成および融合タンパク質の足場ドメイン内での適切な二次構造の採用に関し、下記で例示する。
他の好ましい実施形態では、ドナー多様性足場はａｄｈｉｒｏｎである。ａｄｈｉｒｏｎは、植物由来のフィトシスタチン（ｐｈｙｔｏｃｙｓｔａｔｉｎ）４６に基づく、約８０～１００アミノ酸のペプチドである。好適なａｄｈｉｒｏｎ配列は、当該技術分野で周知 であり、本明細書の別のところで記載されている。本明細書に記載の多様性足場として使用するための好適なａｄｈｉｒｏｎは、例えば、表１２（配列番号２６、２７）に示すアミノ酸配列を含み得るかまたはこの配列の断片またはバリアントであってよい。
基準ａｄｈｉｒｏｎのバリアントのａｄｈｉｒｏｎの配列、例えば、表１２（配列番号２６および２７）に示す配列は、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の、基準配列に対する配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。特定のアミノ酸配列バリアントは、表１２（配列番号２６および２７）の配列から、１個のアミノ酸、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個またはそれを超える個数のアミノ酸の挿入、付加、置換または欠失の分だけ異なり得る。
本明細書に記載の方法は、ドナー多様性足場ドメインの構造の知識を必要としない。結合メンバーの選択は、標的分子（既知の場合）への結合またはレシピエントドメインの適切な折り畳みに基づき得る。ドナー多様性足場ドメインは、レシピエント足場の適切な折り畳みを有するクローンが選択できるまたは組み込まれるドナー多様性足場を収容する既存のレシピエント多様性足場中に挿入し得るライブラリー内で提供され得る。
１つの足場ドメインの折り畳みの失敗が、得られる融合タンパク質の全体的な発現および安定性に影響を与えると思われ、そのために、構造的知識がなくても、多様化を導入すること、および折り畳まれた足場ドメインの発現を維持するための選別を行うことも可能となるであろう。しかし、ドナー多様性足場ドメインの構造が既知である場合、ライブラリーの構築における多様化のための部位は、この構造から導かれ得る。
レシピエント多様性足場ドメインおよびドナー多様性足場ドメインは、異種であるのが好ましく、すなわち、それらが組換え手段により人工的に結合され、天然に付随するものではないのが好ましい。いくつかの好ましい実施形態では、ドナーおよびレシピエント多様性足場ドメインは、異なる足場クラスに由来し、例えば、それらは、両方が免疫グロブリン由来、両方がシステインリッチタンパク質由来、両方がノッチン由来または両方がａｄｈｉｒｏｎ由来ではない。
レシピエント多様性足場ドメインは、レシピエント足場およびレシピエント相互作用配列を含む。
いくつかの実施形態では、レシピエント多様性足場ドメインは、ジスルフィド結合を形成するシステイン残基を欠いてもよい。例えば、足場ドメインは、０または１個のシステイン残基を含み得る。他の実施形態では、レシピエント多様性足場ドメインは、足場ドメイン中でジスルフィド結合を形成する２、４、６、８、１０個またはそれより多くのシステイン残基を含んでよい（すなわち、ドメインは１、２、３、４、５個またはそれより多くのジスルフィド結合を含んでよい）。
好適なレシピエント多様性足場ドメインの例には、免疫グロブリンドメイン、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、ノッチン、プロテインＡ、システインリッチペプチド、ヘビ毒トキシン、設計アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、ａｄｈｉｒｏｎ、フィブロネクチンドメイン、アンチカリンおよびＴ７ファージ遺伝子２タンパク質（Ｇｐ２）が挙げられる。
構造が既知である場合、ドナー多様性足場ドメインのための挿入部位およびリンカー配列の選択は、レシピエントドメインの構造により誘導され得る６４，５３，２３，７５，３９，４３。例えば、好適な挿入部位は、レシピエント多様性足場ドメインの二次構造エレメントを連結する領域、例えば、ベータ鎖またはアルファヘリックス中の位置であり得る。フィブロネクチンの第１０ ＩＩＩ型細胞接着ドメイン内の挿入部位として好適な領域を図２０Ａ（配列番号２８）に、Ｔ７ Ｇｐ２タンパク質内の挿入部位用の領域を図２０Ｂ（配列番号２９）に示す。好適な挿入部位の特定は、下記実施例１０にさらに詳細に記載されている。構造的知識を使用して、同様に、ライブラリーの構築における多様化を誘導し得る。
レシピエント多様性足場ドメインは、免疫グロブリンの全部または一部、最も好ましくは、抗体可変ドメインの全部または一部であるのが好ましい。例えば、レシピエント多様性足場ドメインは、抗体軽鎖可変（ＶＬ）ドメインまたは抗体重鎖可変（ＶＨ）ドメインであってよい。
組み込まれるドナー多様性足場ドメインは、レシピエント多様性足場ドメインを、レシピエントへの挿入位置で、Ｎ末端およびＣ末端部分に分離する。ドナー多様性足場ドメインは、ドナー多様性足場ドメインのＮ末端およびＣ末端が、直接にまたはリンカーを介して、それぞれレシピエント多様性足場ドメインのＮおよびＣ末端部分に連結されるように、レシピエント多様性足場ドメイン内で内部的に融合される。いくつかの実施形態では、ドナー多様性足場ドメインまたはレシピエント多様性足場ドメインのＮおよび／またはＣ末端の１個または複数の残基が、除去および／またはランダム化され得る。レシピエント多様性足場ドメインは、その元のＮおよびＣ末端を保持し、ドナー多様性足場ドメインの内部挿入部位への挿入により影響を受けない。
いくつかの実施形態では、組み込まれるドナー多様性足場ドメインのレシピエント多様性足場ドメインに対する向きは、レシピエント多様性足場ドメインを、ドナー多様性足場ドメイン内の異なる位置に連結することにより、変え得る。例えば、回転されたドナー多様性足場ドメインを、天然のＮおよびＣ末端の連結によりドナー多様性足場ドメインを環化させ、アミノ酸配列中の異なる位置を直線化して人工のＮおよびＣ末端を生成することにより設計し得る。これらの人工の末端を融合タンパク質内のレシピエント多様性足場ドメインに連結し得る。換言すれば、システインリッチペプチドなどの天然のドナー多様性足場ドメインのＮおよびＣ末端を、直接にまたはペプチド配列およびドナー多様性足場ドメインの配列の異なる位置に生成された人工のＮおよびＣ末端を介して一緒に連結し得る。これらの人工のＮおよびＣ末端を用いて生成した融合タンパク質では、ドナー多様性足場ドメインは、天然のＮおよびＣ末端を有するドナー多様性足場ドメインを含む融合タンパク質に比べて、レシピエント多様性足場ドメインに対し回転される。例えば、ドナー多様性足場ドメイン内のループの順序は変わってもよい。変わった向きを有するＥＥＴＩ－ＩＩドナー多様性足場ドメインの例を、表２８（配列番号３０２～３０７）に示す。
好ましくは、ドナー多様性足場ドメインは、レシピエント多様性足場ドメインのループ配列の一部または全部を完全に置換し、それにより、ドナー多様性足場ドメインは、レシピエント多様性足場ドメインの足場残基に直接に連結され得る。例えば、レシピエントドメイン中の二次構造エレメントを連結するループ配列（例えば、抗体可変ドメイン中のβシートフレームワークエレメントの２β鎖を連結するＣＤＲ）は、そのまま完全に除去され得る。いくつかの実施形態では、１個または複数の足場残基は、ドナー多様性足場ドメインまたはレシピエント多様性足場ドメインから除去または置換され、それらの間の距離を短くし、同時に、融合タンパク質の構成要素の折り畳みを可能とする。
好ましくは、ドナー多様性足場ドメインは、レシピエント多様性足場ドメインの相互作用配列に近い融合タンパク質中に配置される。例えば、ドナー多様性足場は、レシピエントドナー足場から２０Å未満、例えば、本明細書で例示するノッチン挿入の場合では８～１３Åに位置し得る（前のフレームワークの末端からドナー／ノットモチーフの第１のシステインまでを計算して）。この近接が、相互作用配列が、標的分子または複合体上の同じ部位または近接して置かれた部位と相互作用するのを可能とし、ドナーおよびレシピエントドメインの両方が同時に結合に寄与し得る。例えば、融合タンパク質は、ドナー多様性足場ドメイン足場ドメインをレシピエント多様性足場ドメインに連結するための剛直ストークおよび可撓性リンカーを欠いていてもよい。
いくつかの好ましい実施形態では、レシピエント多様性足場は、抗体可変ドメイン、例えば、抗体ＶＨまたはＶＬドメインである。
ＶＨ、ＶＬカッパまたはＶＬラムダレシピエントドメインの足場は、ドメインの残基１～２６、３９～５５および６６～１０４（ＩＭＧＴナンバリング）を含んでよい。足場はまた、フレームワーク４の残基を含んでもよく、これらの残基は、重鎖のＪセグメントにコードされた最後の１１個の残基により、およびカッパおよびラムダ軽鎖のＪセグメントによりコードされた最後の１０個の残基によりコードされる。ＶＨ、ＶＬカッパまたはＶＬラムダドメインの相互作用配列は、残基２７～３８（ＣＤＲ１）、５６～６５（ＣＤＲ２）および１０５～１１７（ＣＤＲ３）（ＩＭＧＴナンバリング）を含んでよい。
好ましい、挿入されたドナー多様性足場ドメインを有するレシピエント多様性足場ドメインの例を、表１に示す。
その他の好ましいレシピエント足場には、抗体定常ドメイン、例えば、重鎖または軽鎖ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３ドメインが含まれる。
ドナー多様性足場ドメインは、レシピエント抗体可変ドメイン中の、一部の、またはより好ましくは全部のＣＤＲ（すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３）を置換し得る。
好ましくは、ドナー多様性足場ドメインは、抗体可変ドメインのＣＤＲ１またはＣＤＲ２の内の全てまたは一部を置換する。これは、より多様で、中心的なＣＤＲ３が結合活性、ならびにパートナー抗体可変ドメインに寄与するのを可能とする。ドナー多様性足場ドメインのＣＤＲ１およびＣＤＲ２への挿入は、下記に例示されている。
ドナー多様性足場ドメインの相互作用配列およびレシピエント抗体可変ドメインの１個または複数のＣＤＲは、標的分子上の同じエピトープと相互作用し得る。例えば、ドナー多様性足場ドメインの相互作用配列および抗体可変ドメインのＣＤＲ３および／またはパートナードメインは、標的分子上の同じエピトープと相互作用し得る。
いくつかの好ましい実施形態では、レシピエント多様性足場ドメインは、抗体可変ドメイン、例えば、ＶＨまたはＶＬドメインであり、ドナー多様性足場ドメインは、ノッチンまたはａｄｈｉｒｏｎである。ノッチンドナー多様性足場ドメインおよびＶＬドメインレシピエント多様性足場を含む結合メンバーの例を、表１に示す。抗体可変ドメインレシピエントおよびシステインリッチドナードメインを含む結合メンバーは、本明細書では「ＫｎｏｔＢｏｄｙ」と呼ばれる。
一組の好ましい実施形態では、レシピエント多様性足場ドメインは、抗体ＶＬドメインであり、ドナー多様性足場ドメインは、ＶＬドメインのＣＤＲ２を置換するノッチンである。好適なノッチンは、イオンチャネル、例えば、Ｋｖ１．３に結合し得、これらには、Ｓｈｋおよびカリオトキシンを含めてよい。レシピエント抗体ＶＬドメインは、標的結合を示さなくてもよく、またはノッチンと同じ標的分子、ノッチン標的分子との複合体中の結合タンパク質またはノッチンに対する異なる標的分子に結合し得る。
好適な結合メンバーは、例えば、配列番号３１～３５（表８Ｂに示すような）の内のいずれか１個のアミノ酸配列を有する融合タンパク質を含んでもよく、またはこのような配列の断片またはバリアントであってよい。結合メンバーは、融合タンパク質と結合するパートナードメインをさらに含んでよい。好適なパートナードメインには、任意のＶＨドメイン、例えば、表８Ｂに示すＤ１２ Ａ１２ ＶＨドメイン（配列番号３０）が挙げられる。
好適なＶＨドメインは、非結合物質であってよく、融合タンパク質に対する異なる標的分子に結合してよく、または例えば融合タンパク質の結合親和性を高めるために融合タンパク質と同じ標的分子であってもよい。
基準配列のバリアントである融合タンパク質、例えば、表１（配列番号８４～１３９）、表８Ｂ（配列番号３１～３５）、表２９（配列番号３０８～３１７）または図２９（配列番号３４９および３５１）に示す配列は、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の、基準配列に対する配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。特定のアミノ酸配列バリアントは、表１（配列番号８４～１３９）、表８Ｂ（配列番号３１～３５）、表２９（配列番号３０８～３１７）または図２９（配列番号３４９および３５１）の融合タンパク質配列から、１個のアミノ酸、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個またはそれを超える個数のアミノ酸の挿入、付加、置換または欠失の分だけ異なり得る。
他の好ましい実施形態では、レシピエント多様性足場ドメインは、免疫グロブリン定常ドメイン、例えば、抗体重質または軽鎖由来の免疫グロブリン定常ドメインであってよく、ドナー多様性足場ドメインは、ノッチンまたはａｄｈｉｒｏｎであってよい。
好ましくは、レシピエント多様性足場ドメインフレームワーク残基と、ドナー多様性足場ドメインとの間の距離は、タンパク分解の不安定性および／またはドメイン間の相対的可撓性を低減するために、最小化される。これは、結合親和性を促進する上で有用であり得る。例えば、ドナー多様性足場ドメインのＮおよびＣ末端は、それぞれ、リンカーなしでレシピエント多様性足場ドメインに直接連結され得るか、または１、２、３または４個のアミノ酸のリンカーを介して連結され得る。同じまたは異なるリンカー配列を使って、ドナー多様性足場ドメインのＮおよびＣ末端を、レシピエント多様性足場ドメインに連結し得る。
好適なリンカー配列の例を表２、２６および２７に示す。
いくつかの実施形態では、ドナーおよびレシピエント多様性足場ドメインは、ＧＧＳＧ（配列番号２）以外のリンカー、ＧＧＧＳ（配列番号３２）以外のリンカーまたはＳＧＧもしくはＧＧなどのＧＧを含まないリンカーにより連結されるのが好ましい場合がある。
リンカー長さは、一緒に融合した場合にドナーおよびレシピエントドメインの足場エレメントから取得されるまたは失われるアミノ酸残基の数を意味する。例えば、ドナーおよびレシピエント多様性足場ドメインを連結するために、足場残基の除去および等しい数のランダム化残基の使用は、本明細書では、追加のリンカー残基の導入ではなく、除去されたフレームワーク残基のランダム化と見なされる。
いくつかの実施形態では、ドナー多様性足場ドメインのＮおよび／またはＣ末端での１、２、３または４個のアミノ酸および／またはレシピエント足場中の挿入部位の各側の１、２、３または４個のアミノ酸は、変異誘発および／またはランダム化を介して置換され得る。
融合タンパク質は、共有結合または非共有結合によりパートナードメインと結合し得る。
パートナードメインは、融合タンパク質のレシピエント多様性足場ドメインおよび／またはドナー多様性足場ドメインと結合し得る。パートナードメインは、レシピエント多様性足場ドメインと結合するのが好ましい。
いくつかの好ましい実施形態では、レシピエント多様性足場ドメインは抗体軽鎖可変（ＶＬ）ドメインであり、パートナードメインは抗体重鎖可変（ＶＨ）ドメインである。他の好ましい実施形態では、レシピエント多様性足場ドメインは抗体重鎖可変（ＶＨ）ドメインであり、パートナードメインは抗体軽鎖可変（ＶＬ）ドメインである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の結合メンバーの抗体重鎖および軽鎖可変ドメインは、可撓性リンカー、例えば、ｓｃＦｖフォーマットにより連結されてよい。
本明細書に記載の結合メンバーは、融合タンパク質を含む。結合メンバーは、融合タンパク質と結合するパートナードメインをさらに含んでよい。例えば、結合メンバーはヘテロダイマーであってよい。
いくつかの実施形態では、結合メンバーは、２つまたはそれを超える融合タンパク質またはパートナードメインを含んでよい。例えば、結合メンバーはマルチマーであってよい。いくつかの実施形態では、結合メンバーのレシピエントまたはドナー多様性足場ドメインは、ホモダイマーなどのホモマルチマーを形成し得る。結合メンバーのレシピエントまたはドナー多様性足場ドメインは、同じドメインの異なる型、例えば、ドメインの野性型または変異誘発型を有するパートナーであってよい。
融合タンパク質および任意のパートナードメインに加えて、結合メンバーは、治療薬部分、半減期延長部分または検出可能標識をさらに含んでよい。部分または標識は、融合タンパク質またはパートナードメインに共有結合でまたは非共有結合で連結してよい。
いくつかの実施形態では、結合メンバーは、例えば、スクリーニングおよび選択のために、細胞、リボソームまたはファージなどの粒子または分子複合体上に提示され得る。結合メンバーは、粒子または分子複合体上のディスプレイを促進するために、ファージコートタンパク質などのディスプレイ部分をさらに含み得る。ファージコートタンパク質は、融合タンパク質またはパートナードメインに、融合しても、または共有結合で連結してもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の結合メンバーは、単独のドナーおよび／またはレシピエント多様性足場ドメインに比較して、増大した親和性、安定性、溶解度、発現、特異性またはインビボ半減期などの有利な性質を示し得る。
本発明の他の態様は、本明細書に記載の結合メンバーのライブラリーの生成に関する。
結合メンバーのライブラリー生成方法は、
レシピエント多様性足場ドメイン中に挿入されたドナー多様性足場ドメインを含む、融合タンパク質の多様性集団またはレパートリーをコードする核酸集団を用意することであって、必要に応じて、ドナー多様性足場ドメインのＮおよびＣ末端が、それぞれの末端の４個までのアミノ酸リンカーを用いて、レシピエント多様性足場ドメインに連結されており、
ドナー多様性足場ドメインがドナー足場およびドナー相互作用配列を含み、レシピエント多様性足場ドメインがレシピエント足場およびレシピエント相互作用配列を含み、
ドナー相互作用配列、レシピエント相互作用配列およびリンカーの内の１つ、２つまたは３つ全てが、前記集団中で多様性を有し、
前記核酸集団を発現して、多様性集団またはレパートリーを生成すること、および
必要に応じて、融合タンパク質を、パートナードメインまたはパートナードメインの集団と結合させて、それにより結合メンバーのライブラリーを生成すること、を含み得る。
核酸集団は、ドナー多様性足場ドメインをコードする核酸の第１の集団を、レシピエント多様性足場ドメインをコードする第２の核酸集団中に挿入することを含む方法により用意され得、必要に応じて、第１と第２の核酸が、４個までのアミノ酸のリンカーをコードする第３の核酸集団と連結され、第１、第２および第３の核酸集団の内の１つ、２つまたは３つ全てが多様性を有する。
核酸は、ベクター、例えば、発現ベクター中に収容され得る。好適なベクターには、ファージベース７６またはファージミドベース７７ファージディスプレイベクターが挙げられる。
核酸は、細胞中またはリボソームなどの無細胞インビトロ翻訳系を用いて溶液中で組換え発現されて、ライブラリーを生成し得る。いくつかの好ましい実施形態では、ライブラリーは、結合メンバーの機能がそのコード核酸の単離を可能とする系中で発現される。例えば、結合メンバーは、粒子または分子複合体上で提示され、選択および／またはスクリーニングが可能とされてもよい。いくつかの実施形態では、結合メンバーのライブラリーは、ビーズ、無細胞のリボソーム、バクテリオファージ、原核細胞または真核細胞上で提示され得る。あるいは、コードされた結合メンバーは、結合メンバーの活性が特定可能な変化をもたらす乳剤内で提示され得る。あるいは、コードされた結合メンバーは、結合メンバーの活性が、表現型変化またはレポーター遺伝子の発現の変化をもたらす細胞内または細胞の近傍で発現され得る１６，７８，７９。
真核細胞は、分泌タンパク質ドメインの折り畳みを支援するシャペロン系８０から恩恵を受け、これらは細菌発現系内には存在しない。以降で記載のデータは、哺乳動物シャペロン系が、本明細書に記載の結合メンバーの適切な折り畳みを必要としないことを示す。さらに、原核生物ファージディスプレイ系を用いて特定した結合メンバーは、定義上、改善結合物質を作成するためのファージディスプレーシステム内でのさらなる改変を適用できる。ファージディスプレイなどの原核細胞系もまた、より大きなライブラリーの構築を促進し、このようなライブラリーからの結合メンバーの選択、スクリーニングおよび識別を促進する。対照的に、真核生物系で特定された結合メンバーは、原核細胞系内でのさらなる改変を適用できない可能性がある。
核酸は、原核細胞、例えば、大腸菌などで発現されるのが好ましい。例えば、核酸は、原核細胞中で発現されて、バクテリオファージの表面上に提示される結合メンバーのライブラリーを生成し得る。好適な原核生物ファージディスプレイ系は、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ、Ｒ ＆ Ｄｕｂｅｌ、Ｓ、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＬＬＣ；２００１、ＩＳＢＮ：３５４０４１３５４５、国際公開第９２／０１０４７号、米国特許第５９６９１０８号、米国特許第５５６５３３２号、米国特許第５７３３７４３号、米国特許第５８５８６５７号、米国特許第５８７１９０７号、米国特許第５８７２２１５号、米国特許第５８８５７９３号、米国特許第５９６２２５５号、米国特許第６１４０４７１号、米国特許第６１７２１９７号、米国特許第６２２５４４７号、米国特許第６２９１６５０号、米国特許第６４９２１６０号および米国特許第６５２１４０４号に記載されている。ファージディスプレイ系は、大きなライブラリー、例えば、１０８個以上、１０９個以上、または１０１０個以上のメンバーを有するライブラリーの生成を可能とする。
他の実施形態では、細胞は、酵母、昆虫、植物または哺乳動物細胞などの真核細胞であってよい。
結合メンバーのライブラリー、例えば、上記方法により生成したライブラリーは、
レシピエント多様性足場ドメイン中に挿入されたドナー多様性足場ドメインを含む、融合タンパク質の多様性集団であって、必要に応じて、ドナー多様性足場ドメインのＮおよびＣ末端が、それぞれ、末端の４個までのアミノ酸リンカーを用いて、レシピエント多様性足場ドメインに連結されており、
ドナー多様性足場ドメインがドナー足場およびドナー相互作用配列を含み、レシピエント多様性足場ドメインがレシピエント足場およびレシピエント相互作用配列を含み、
ドナー相互作用配列、レシピエント相互作用配列およびリンカーの内の１つ、２つまたは３つ全てが、前記集団中で多様性を有し、
必要に応じて、集団中のそれぞれの融合タンパク質がパートナードメインと結合している、融合タンパク質の多様性集団を含んでよい。
ドナー相互作用配列、レシピエント相互作用配列およびリンカーの内の１つ、２つまたは３つ全ての配列が、多様性を有し得る。例えば、ライブラリー中の結合メンバーは、多様なドナー相互作用配列および元のままのレシピエント相互作用配列；多様なレシピエント相互作用配列および元のままのドナー相互作用配列；多様なリンカー配列および元のままのレシピエントおよびドナー相互作用配列または；多様なレシピエントおよびドナー相互作用配列を有してよい。
本明細書に記載の多様性な配列は、集団のメンバー間で変化する配列、すなわち、集団の異なるメンバーで配列が異なる。多様な配列は、ランダムであり得、すなわち、多様な配列中の各位置でのアミノ酸またはヌクレオチドの固有の特性は、完全なセットの天然アミノ酸またはヌクレオチドまたはそのサブセットからランダムに選択され得る。
多様性は、オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発２２，２３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ：３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｒｕｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、およびその中の参考文献）などの当業者に既知の手法を用いて、ドナー相互作用配列、レシピエント相互作用配列、リンカーまたはパートナードメイン内の配列を標的にしてよい。例えば、レシピエント多様性足場ドメインが抗体可変ドメインであり、ドナー多様性足場ドメインが１つの置換されたＣＤＲ領域を有する場合、多様な配列などのアミノ酸変化を、レシピエントドメインまたはパートナー鎖の他のＣＤＲ中に導入し得る。ドナードメインがノッチンである場合、多様な配列は、システインノットなどのコア足場エレメントを連結する領域中に導入し得る。ノッチン構造は、５０％を超える非天然構造を収容可能２４であることが示された。ライブラリーを生成するための、ＥＥＴＩ－ＩＩ２４、カリオトキシン２５、ＰｒｏＴｘ－１２６、およびＴＲＰＡ１２６などのノッチン足場への多様性の導入は、当該技術分野において既知である。
多様な配列は、近接していてもよく、またはドメイン内に分布していてもよい。多様な配列をドメインに導入する好適な方法は、当該技術分野において十分に報告されている。例えば、多様化は、ヌクレオチドの部分的なまたは完全なランダム化により作成されたオリゴヌクレオチド混合物、またはコドン混合物を用いて、例えば、トリヌクレオチドを使用して作成されたオリゴヌクレオチド混合物を用いて生成し得る。あるいは、多様なオリゴヌクレオチドの集団は、ハイスループット遺伝子合成法を用いて合成し、組み合わせて精密に規定され、制御されたバリアントドメイン集団を作成し得る。あるいは、元のヌクレオチドが優勢で、代替ヌクレオチド（単一または複数）が低頻度で存在する「ドーピング」技術が使用され得る。別の方法として、下記の実施例２は、天然源（この実施例では抗体レパートリー）由来の多様性を用いて、ドメイン中に多様性を導入する方法を記載している。
ドナーまたはレシピエントドメインは、パートナー鎖により追加の多様性が導入される可能性を有するマルチマータンパク質の一部であり得る。全体パートナー鎖は、例えば、チェーンシャッフリング２７により置換できる。あるいは、多様性は、レシピエントまたはドナーの既存のパートナー鎖の領域、例えば、ドナーのＶＬレシピエントのＶＨパートナーの領域に導入し得る。一般に、抗体のヘテロダイマーな性質およびドナーを支持するレシピエント鎖とは独立して、パートナー鎖のバリアントを選択する能力は、この手法を強化する。
好ましくは、ライブラリーは、ディスプレイライブラリーである。ライブラリー中の結合メンバーは、粒子；またはビーズ、リボソーム、細胞またはウイルスなどの分子複合体（酵母、細菌またはバクテリオファージ（例えば、Ｆｄ、Ｍ１３またはＴ７）粒子、ウイルス、哺乳動物細胞を含む細胞、などの複製可能遺伝的パッケージを含む）；または共有結合性リボソーム性もしくはその他のインビトロディスプレーシステムの表面上に提示され得る。各粒子または分子複合体は、粒子により提示される結合メンバー、および必要に応じて、提示されるパートナードメイン（存在する場合）をコードする核酸を含み得る。
いくつかの好ましい実施形態では、ライブラリー中の結合メンバーは、バクテリオファージの表面上に提示される。ファージディスプレイライブラリーの生成およびスクリーニングの好適な方法は、当該技術分野において周知である。ファージディスプレイは、例えば、国際公開第９２／０１０４７号、米国特許第５９６９１０８号、米国特許第５５６５３３２号、米国特許第５７３３７４３号、米国特許第５８５８６５７号、米国特許第５８７１９０７号、米国特許第５８７２２１５号、米国特許第５８８５７９３号、米国特許第５９６２２５５号、米国特許第６１４０４７１号、米国特許第６１７２１９７号、米国特許第６２２５４４７号、米国特許第６２９１６５０号、米国特許第６４９２１６０号および米国特許第６５２１４０４号に記載されている。
本明細書に記載のライブラリーは、結合活性、例えば、標的分子への結合を示す結合メンバーでスクリーニングし得る。
結合は、直接に測定してもよく、または結合から生じるアゴニストまたはアンタゴニスト効果を介して間接的に測定してもよい。
標的分子に対する結合は、結合メンバーの１つまたは複数のドナー多様性足場ドメイン、レシピエント多様性足場ドメインおよびパートナードメインにより媒介され得る。
融合タンパク質のドナーおよびレシピエント多様性足場ドメインの相互作用配列は、標的分子、およびより好ましくは標的分子の同じエピトープに結合し得る。結合メンバーの融合タンパク質およびパートナードメインは、同じ標的分子または異なる標的分子に結合し得る。例えば、融合タンパク質は、第１の標的分子に結合し得、パートナードメインは第２のターゲット標的分子に結合し得る。
結合メンバーは、親ドナーまたはレシピエント多様性足場ドメインの同じ親和性で標的分子と結合し得る、またはより低いもしくはより高い親和性で標的分子と結合し得る。いくつかの実施形態では、結合メンバーは、標的分子の生物活性を中和し得る。他の実施形態では、結合メンバーは、標的分子の生物活性を活性化し得る。
好適な標的分子には、タンパク質などの生体高分子が含まれる。標的分子は、受容体、酵素、抗原またはオリゴ糖であってよい。いくつかの好ましい実施形態では、標的は、膜内在性タンパク質であってよい。いくつかの実施形態では、標的は、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）であってよい。抗体で標的化困難な標的分子、例えば、イオン輸送体は、特に好適し得る。
いくつかの好ましい実施形態では、標的分子は、イオン輸送体、例えば、イオンポンプまたはイオンチャネルであってよい。
好適なイオンチャネルは当該技術分野において周知であり、Ｋｉｒ１．１、Ｋｉｒ２．１、Ｋｉｒ６．２、ＳＵＲ２、Ｋｖ１．１、ＫＣＮＱ１、ＫＣＮＱ、ＫＣＮＱ４、ＴＲＰＰ２、ＴＲＰＡ１、ＴＲＰＣ６、ＣＮＧＡ１、ＢＫ、Ｎａｖ１．１、Ｎａｖ１．５、Ｎａｖ１．６、Ｎａｖ２．１、Ｃａｖ１．２、Ｃａｖ２．１、グリシン受容体、ＧＡＢＡ－Ａ、ＣＨＲＮＡ４８２を含む。その他の好適なイオンチャネルには、電位作動型カリウムチャネル、例えば、Ｋｖ１．３、Ｌ型電位作動型カルシウムチャネル、Ｃａｖ２．２、ｈＥＲＧ、ＡＳＩＣおよびＥａｇ１が挙げられる。
本明細書に記載の結合メンバーは、２つまたはそれを超える異なる標的エピトープに結合し得る（すなわち、結合メンバーは多重特異的であり得る）。結合メンバーにより結合される標的エピトープは、同じまたは異なる標的分子上にあってよい。例えば、多重特異的結合メンバーのドナー多様性足場ドメイン、レシピエント多様性足場ドメインおよび／またはパートナードメインの１つまたは複数は、その他のドメインに対し異なる標的エピトープに結合し得る。
いくつかの実施形態では、結合メンバーは、二重特異的であってよく、すなわち２つの異なるエピトープに結合し得る。
二重特異的結合メンバーは、２つの異なる標的エピトープに同時に結合し得る。これは、第１のおよび第２のエピトープを、例えば、架橋分子または細胞に近接して配置する場合に有用なことがある。標的エピトープが異なる標的分子に配置される場合、結合メンバーに同時に結合させることにより、標的分子を接近させ得る。標的分子が異なる細胞上に配置される場合、結合メンバーに標的分子を同時に結合させることにより、細胞を接近させて、例えば、細胞の相互作用を促進または強化し得る。例えば、腫瘍特異的抗原およびＣＤ３などのＴ細胞抗原に結合する結合メンバーは、Ｔ細胞と腫瘍細胞を接近させるのに有用であり得る。
本明細書に記載の結合メンバーによる異なる標的エピトープの同時結合はまた、標的分子の特定の高次構造または標的分子の複合体を安定化させるのにも有用である。
結合メンバーは、２つの異なる標的エピトープに順次結合し得、すなわち、結合メンバーは、１個の標的エピトープに結合し、その後もう一方に結合し得る。これは、例えば、血液脳関門（ＢＢＢ１２０）または血液神経関門（ＢＮＢ１２１）を通過するのに有用であり得る。例えば、結合メンバーは、ＢＢＢまたはＢＮＢ受容体上でエピトープに結合し得る。好適な受容体は当該技術分野において既知であり、トランスフェリン（ＴＦＲ）、インスリン（ＩＲ）、レプチン（ＬＥＰ－Ｒ）、グルコース（ＧＬＵＴ１）、ＣＤ９８（ＬＡＴ１）およびリポタンパク質（ＬＲＰ－１）受容体が含まれる。ＢＢＢまたはＢＮＢ受容体に結合すると、結合メンバーは、ＢＢＢまたはＢＮＢを通って経細胞輸送され得、その後、脳または末梢神経系中の第２の標的分子、例えば、イオンチャネルまたはプロテアーゼ上のエピトープに独立に結合し得る。
いくつかの好ましい実施形態では、結合メンバーはＴＦＲに結合し得る。例えば、結合メンバーは、ＴＦＲおよび脳または末梢神経系中の第２の標的分子に結合する融合タンパク質に結合するパートナードメインを含み得る。融合タンパク質中のレシピエント足場は、ＶＬドメインであってよく、パートナードメインは、ＶＨドメインであってよい。ＴＦＲを標的にするための好適なＶＨパートナードメインは、表２０（配列番号２３７～２４５）に示す配列またはそのバリアントを含み得る。
ＢＢＢまたはＢＮＢを通過できる二重特異的結合メンバーのライブラリーのスクリーニングに好適なインビトロ系は、当該技術分野において周知であり（Ｎａｋａｇａｗａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．５４，２５３－２６３（２００９）；Ｙｏｓｅｆ，Ｎ．ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．６９，８２－９７（２０１０））、下記でさらに詳細に記載される。
いくつかの好ましい実施形態では、結合メンバー上の第１のドメイン（例えば、ドナー多様性足場ドメイン、レシピエント多様性足場ドメインおよびパートナードメインの内の１つ）は、第１の細胞表面標的分子に向けられ得る。この第１の標的分子に対する結合は、細胞表面上の結合メンバーを隔離し、それにより細胞表面上の結合メンバーの局所濃度を高めて、第２の結合ドメイン（例えば、別のドナー多様性足場ドメイン、レシピエント多様性足場ドメインおよびパートナードメイン）の第２の標的分子に対する相互作用を促進し得る。例えば、二重特異的結合メンバーは、イオンチャネル、例えば、Ｋｖ１．３などの第２の標的分子に結合し、ブロックするＶＬノッチン融合体と結合したＴ細胞上の多くの第１の標的分子に高親和性で結合するＶＨパートナードメインから構成され得る。例えば、候補標的分子（実施例６で記載のように）を提示する組換えタンパク質の選択により、または標的細胞の細胞表面上のライブラリーを選択して、第２ドメインの結合を促進するパートナードメイン（この実施例では、ＶＨ）を探すことにより、細胞特異的結合ドメイン（この実施例では、ＶＨ）が生成され得る。第１のドメインの第１の標的分子への結合は、細胞表面上の結合メンバーを隔離し、第２の標的分子に対する第２の結合ドメインの、低親和性、低密度または相対的に低いアクセス性を克服し得る。これは、第１の結合ドメインにより認識される標的を発現する細胞上の第２の結合ドメインの効力を増大させ得る。この手法は、最適結合／ブロッキングは、両標的分子が同じ細胞上にあることを必要とするために、結合メンバーの特異性も高め得る。第１の結合分子の存在は、第２の結合分子の結合の、数桁を超える大きさの、強化を達成することが、親和性および抗原密度に基づいて示された（Ｒｈｏｄｅｎ ｅｔ ａｌ（２０１６）Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２９１ ｐ１１３３７－１１３４７）。
選択およびスクリーニングで使用するための標的分子は、任意の都合のよい技術で作製してよい。例えば、膜内在性タンパク質は、細菌、バキュロウイルスまたは哺乳動物発現系８６，８７、プロテオリポソーム８８、「ナノディスク」８９または細胞ライセート９０を用いて産生し得る。
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、初期の結合メンバーの「親」ライブラリーは、ドナーおよびレシピエントの両方の多様性足場ドメインの同時折り畳みを可能とする１個または複数の親結合メンバーを特定するために使用され得る。これらの親結合メンバーは、標的分子に対する結合などの所望の結合活性を示す、保持されたドナーおよびレシピエントドメインを選択し得る。その後のステップでは、親結合メンバーは、結合活性およびその他の特性を最適化するために、さらなる改変およびスクリーニングに供され得る。あるいは、初期の結合メンバーの「親」ライブラリーは、レシピエント多様性足場ドメイン、ドナー多様性足場ドメインおよび、必要に応じて、本明細書に記載のリンカーを連結する任意のライブラリーを含んでよく、多様性は、前記レシピエント多様性足場ドメイン、ドナー多様性足場ドメインまたはリンカー配列の内のいずれかに導入される。
本明細書に記載のスクリーニング方法は、
（ｉ）本明細書に記載のように、結合メンバーの親ライブラリーを用意することであって、
ドナー相互作用配列、レシピエント相互作用配列およびリンカーの内の１つ、２つまたは３つ全てが、前記親ライブラリー中で多様性を有すること；
（ｉｉ）結合活性を示す結合メンバーでライブラリーをスクリーニングすること、および
（ｉｉｉ）結合活性を示す、親ライブラリー中の１個または複数の結合メンバーを特定すること、を含み得る。
１個または複数の特定された結合メンバーは、親ライブラリーから回収され得る。
いくつかの好ましい実施形態では、リンカー配列はライブラリー中で多様性を有し得る。これは、ドナーおよびレシピエント多様性足場ドメインの機能性融合体の特定に有用であり得る。多様なリンカー配列の例は、本明細書で示される。いくつかの実施形態では、１、２、３、または４個のアミノ酸の多様なリンカーを、ドナー多様性足場ドメインと、レシピエント多様性足場ドメインとの間の連結部に導入し、得られたライブラリーからの最適連結配列の選択を可能とし得る。
必要に応じて、レシピエント多様性足場ドメイン内の配列はまた、ドナー多様性足場ドメインに対する機能性融合体を支持するレシピエント多様性足場ドメインの特定を容易にするために多様化され得る。いくつかの実施形態では、２つのドメイン間の片方または両方の連結部のドナー多様性足場ドメインおよび／またはレシピエント多様性足場ドメインの１個または複数のアミノ酸残基が多様化され得る（すなわち、他のドメインとの、片方または両方の連結部のすぐ隣のドメインの１個または複数の残基が多様化され得る）。ドナーおよびレシピエント足場のフレームワーク残基が多様化される例は、以下に提供される。例えば、ドナー多様性足場ドメインのＮおよびＣ末端の１、２、３または４個の残基および／またはドナードメインとの連結部のレシピエント多様性足場ドメイン内の１、２、３または４個の残基が、多様化され得る。
結合活性は、標的分子への結合であってよい。ライブラリーのスクリーニング方法は、
本明細書に記載のように、結合メンバーの親ライブラリーを用意すること、
親ライブラリーを標的分子と接触させること、および
標的分子に結合する１個または複数の親ライブラリーメンバーを選択すること、を含み得る。
１個または複数の特定または選択された結合メンバーは、回収され、さらなる選択および／またはスクリーニングに供され得る。
複数ラウンドのパニングが、結合活性を示す結合メンバーを特定するために実施され得る。例えば、結合活性に関して濃縮された結合メンバー集団は、親ライブラリーから回収または単離され、結合活性に関して、１回または複数の追加のラウンドのスクリーニングに供され、１つまたは複数のさらに濃縮された集団が産生され得る。結合活性を示す親結合メンバーは、１つまたは複数のさらに濃縮された集団から特定され、回収、単離および／またはさらに精査され得る。
結合活性を示す親結合メンバーは、さらに改変して、活性または特性を改善するかまたは新しい活性または特性、例えば、親和性および／または特異性などの結合特性、標的分子の中和の増大および／または標的分子の比活性の調節を導入し得る。結合メンバーはまた、改変されて、安定性、溶解度または発現レベルが改善され得る。
例えば、特定された親結合メンバーの特定されたリンカー配列は、適用および所望の結果に応じて、レシピエント、ドナーまたはパートナードメインの内の１個または複数中に導入された多様な配列を有する改変ライブラリー中で保持され得る。いくつかの事例では、リンカーのさらなる多様化は、結合メンバーの機能の最適化に有用であり得る。
本明細書に記載のスクリーニング方法は、
（ｉｖ）本明細書に記載の１個または複数の結合メンバー、例えば、親ライブラリーから特定された１個または複数の結合メンバー、のアミノ酸配列中の１個または複数の位置に多様なアミノ酸残基を導入し、結合メンバーの改変ライブラリーを生成すること、
（ｖ）改変ライブラリーから結合活性を示す改変結合メンバーをスクリーニングすること、および
（ｖｉ）改変ライブラリー中の、結合活性を示す１個または複数の改変結合メンバーを特定すること、をさらに含み得る。
結合活性は、標的分子への結合であってよい。ライブラリーのスクリーニング方法は、
上述のように、結合メンバーの改変ライブラリーを用意すること、
改変ライブラリーを標的分子と接触させること、および
標的分子に結合する１個または複数の改変ライブラリーメンバーを特定すること、を含み得る。
１個または複数の特定または選択された結合メンバーは、回収され、さらなるラウンドのスクリーニングに供され得る。
多様なアミノ酸は、ランダム変異誘発または部位特異的変異誘発を含む、本明細書で別の場所で記載の任意の好適な技術により、導入され得る。
ステップ（ｉｉｉ）で特定された１個または複数の親結合メンバーに比べて、増大したまたは改善された結合活性、例えば、増大した結合親和性および／または特異性、を示す１個または複数の改変結合メンバーが特定され得る。
複数のラウンドのパニングが、改善された結合活性を示す改変結合メンバーを特定するために実施され得る。例えば、改善された結合活性に関して濃縮された結合メンバー集団は、ライブラリーから回収または単離され、結合活性に関して、１回または複数の追加のラウンドのスクリーニングに供され、１つまたは複数のさらに濃縮された集団が産生され得る。改善された結合活性を示す改変結合メンバーは、１つまたは複数のさらに濃縮された集団から特定され、単離および／またはさらに精査され得る。
親または改変結合メンバーは、さらなる変異誘発にさらに供され、例えば、さらに改変されたライブラリーを生成し、改善されたまたは新規活性または特性を有する結合メンバーを選択し得る。アミノ酸残基は、ライブラリーおよび／または改変ライブラリー由来の１個または複数の特定された結合メンバーのアミノ酸配列の１個または複数の位置で変異導入され得る。例えば、１個または複数の特定された結合メンバーのドナー足場、ドナー相互作用配列、レシピエント足場、レシピエント相互作用配列、リンカーまたはパートナードメイン内のアミノ酸残基に変異導入し得る。
変異導入により、多様なアミノ酸残基を１個または複数の位置に導入して、さらに改変された結合メンバーのライブラリーを生成し得る。レシピエントおよびドナーの相互作用および足場残基の欠失または置換ならびにそれらのランダム化残基による置換の例を以下に示す。
パートナーＶＨまたはＶＬドメインなどのパートナードメインが、標的分子との追加の相互作用接触に寄与する結合メンバーを生成するためにライブラリーを生成し得る。このライブラリーでは、元のパートナードメインが全レパートリーの代替パートナードメインにより置換されて、「鎖シャッフル」ライブラリーが作成される。新規に選択されたパートナードメインの有益な寄与による改善された活性を有する結合メンバーが特定、回収および単離され得る。
本明細書に記載のスクリーニング方法は、
（ｖｉｉ）上述の、１個または複数の特定された結合メンバーまたは改変結合メンバー由来の融合タンパク質を、パートナードメインの多様性集団と結合させて、結合メンバーのシャッフルライブラリーを生成すること、
（ｖｉｉｉ）シャッフルライブラリーから結合活性を示すシャッフル結合メンバーをスクリーニングすること、
（ｉｘ）結合活性を示す１個または複数のシャッフル結合メンバーを特定すること、をさらに含み得る。
ステップ（ｉｉｉ）で特定された１個または複数の親結合メンバーおよび／またはステップ（ｖｉ）で特定された改変結合メンバーに比べて、増大した結合活性を示す１個または複数のシャッフル結合メンバーが特定され得る。
複数のラウンドのパニングまたは機能的スクリーニングが、増大または改善された結合活性を示すシャッフル結合メンバーを特定するために実施され得る。例えば、改善された結合活性に関して濃縮されたシャッフル結合メンバー集団は、シャッフルライブラリーから単離され、結合活性に関して、１回または複数の追加のラウンドのスクリーニングに供され、１つまたは複数のさらに濃縮されたシャッフル集団が産生され得る。改善された結合活性を示すシャッフル結合メンバーは、１つまたは複数のさらに濃縮された集団から特定され、単離および／またはさらに精査され得る。
親ライブラリー、改変ライブラリーまたはシャッフルライブラリーは、ライブラリー中の結合メンバーの標的分子に対する結合を測定することにより選別し得る。
結合は、任意の好適な技術により測定できる。例えば、親ライブラリー、改変ライブラリーまたはシャッフルライブラリーを、結合条件下で標的分子がライブラリーと相互作用するのに十分な時間にわたり標的分子と接触させて、少なくとも１個のそのメンバーとの結合反応複合体を形成させ得る。
結合条件は、標的分子の既知の天然の結合機能に適合する条件である。これらの適合条件は、標的分子の生物活性を維持し、それにより、その事前に選択した結合相互作用に関与する分子の能力を維持する、緩衝液、ｐＨおよび温度の条件である。通常、これらの条件には、着目標的分子に通常関連するｐＨおよびイオン強度の生理的水溶液が含まれる。
親ライブラリー、改変ライブラリーまたはシャッフルライブラリーは、不均一または均一混合物の形で標的分子と接触させてよい。したがって、ライブラリーのメンバーが固相で、標的分子が液相中に存在してよい。あるいは、標的分子が固相で、ライブラリーのメンバーが液相中に存在してもよい。またさらには、ライブラリーメンバーおよび標的分子の両方が液相中にあってもよい。
標的分子に対する結合メンバーの結合を測定する好適な方法は、当該技術分野において周知であり、ＥＬＩＳＡ、ビーズベース結合アッセイ（例えば、ストレプトアビジンコートビーズをビオチン化標的分子と組み合わせて使って）、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリー、ウェスタンブロッティング、免疫細胞化学、免疫沈殿、および親和性クロマトグラフィーが含まれる。あるいは、ＨＴ－１０８０細胞遊走アッセイなどの生化学的もしくは細胞ベースアッセイ、または蛍光ベースもしくは発光ベースレポーターアッセイを用いてよい。
いくつかの実施形態では、結合は、配位子、受容体またはイオンチャネルなどの標的分子に対する結合メンバーの結合により生ずるアゴニズムまたは拮抗作用（イオンチャネルおよび酵素の場合のブロッキング活性を含む）を検出することにより測定し得る。例えば、親ライブラリー、改変ライブラリーまたはシャッフルライブラリーは、レポーター細胞中でライブラリーを発現させて、変化した遺伝子発現または表現型を有する１個または複数のレポーター細胞を特定することによりスクリーニングし得る。結合メンバーの組換え集団をスクリーニングするための、好適な機能的スクリーニング技術は、当該技術分野において周知である１６，７８，７９，９１。
遺伝子のレパートリーをレポーター細胞中にクローニングすることによるライブラリーの構築に好適する系が報告されている１６，７８。これらの系は、１個の細胞内で、発現と、レポーティングとを組み合わせており、典型的には、（例えば、ファージまたは哺乳動物ディスプレイを用いて）所定の標的に対して選択された抗体集団を導入している。
本明細書に記載のように、結合メンバーをコードする核酸の集団を、標準的な技術を用いて、レポーター細胞中に導入し、ライブラリーを生成し得る。表現型（例えば、変化した遺伝子発現または生存）における結合メンバー誘導変化を有する集団内のクローンを特定することができる。この表現型依存選択が機能するためには、発現細胞内に存在する結合メンバー遺伝子（遺伝子型）と、結合メンバー発現の結果（表現型）とのつながりが保持されることが必要要件である。これは、例えば、抗体ディスプレイに対して説明されるような、細胞表面への結合メンバーの係留により、または産生細胞の近傍に分泌抗体を保持するための半固体媒体の使用１０５により実現され得る。あるいは、結合メンバーは、細胞内に保持され得る。細胞表面上または周辺媒体中に保持された結合メンバーは、内在性または外来性の受容体と、細胞表面で相互作用することにより、受容体の活性化を生じ得る。これは、次に、レポーター遺伝子の発現変化または細胞表現型の変化を引き起こし得る。別の方法として、結合メンバーは、受容体またはリガンドをブロックして、受容体の活性化を低減することができる。その後、細胞の挙動の変化を引き起こす結合メンバーをコードする核酸を、産生またはさらなる改変のために回収し得る。
この「標的指向」手法に対する代替として、特定の標的分子に対して事前選択されていない「ナイーブ」結合メンバー集団を細胞中に導入することが可能である。細胞レポーティングシステムを用いて、変化した挙動を有する集団のメンバーが特定される。標的分子に関する予備的知識がないために、この非標的手法では、標的分子に対して結合メンバー集団を事前に濃縮することが不可能なために、大きな抗体レパートリーに対する特別な要件が存在する。
その他の用途では、「機能的選択」手法が用いられ、これには、真核細胞、特に、哺乳類細胞などの高等真核生物のライブラリーが含まれる。例えば、結合メンバーは、標的分子への結合により受容体の活性化が生じるようなシグナル伝達ドメインに融合し得る。好適なシグナル伝達ドメインには、サイトカイン受容体ドメイン、例えば、トロンボポエチン（ＴＰＯ）受容体、エリスロポエチン（ＥＰＯ）受容体、ｇｐ１３０、ＩＬ－２受容体およびＥＧＦ受容体などが含まれる。結合メンバー－受容体キメラを使用して、標的分子依存性遺伝子発現または初代または安定レポーター細胞における表現型の変化を促進し得る。この能力を使用して、ライブラリー中の、シグナル伝達レスポンスを促進する融合結合メンバー、またはレスポンスを抑制する結合物質を特定し得る１２３－１２５。
本明細書に記載の方法を用いて特定されたレシピエントおよびリンカー配列の組み合わせを用いて、同じクラスの異なるドナー多様性足場ドメイン、例えば、同じ数のシステイン残基を有するシステインリッチタンパク質、または別のクラスの異なるドナー多様性足場ドメインを提供し得る。
ドナー多様性足場ドメインは、ライブラリー、改変ライブラリーおよび／またはシャッフルライブラリーから特定された１個または複数の結合メンバー中で、代わりのドナー多様性足場ドメインにより置換され得る。
ドナー多様性足場ドメインおよび代わりのドナー多様性足場ドメインは、同じ足場クラス由来であってよい。例えば、ドナー多様性足場ドメインおよび代わりのドナー多様性足場ドメインは、同じ足場および異なる相互作用配列を含んでよい。いくつかの実施形態では、ドナー多様性足場ドメインは、第１の標的分子に結合するノッチンであってよく、また、代わりのドナー多様性足場ドメインは、第２の標的分子に結合するノッチンであってよい。本明細書に記載のように１つのノッチンドナー多様性足場ドメインに最適化されているレシピエント多様性足場ドメインは、全てのノッチンドナー多様性足場ドメインに対し有用であり得る。例えば、以降で例示されるように、親結合メンバーのレシピエント抗体可変ドメイン内のドナーノッチンドメインは、異なるノッチンドナードメインで置換され得る。
ドナー多様性足場ドメインおよび代わりのドナー多様性足場ドメインは、異なる足場クラス由来であってよい。例えば、ドナー多様性足場および代わりのドナー多様性足場は、異なるドナー足場および異なるドナー相互作用配列を含み得る。例えば、以降で例示されるように、親結合メンバーのレシピエント抗体可変ドメイン内のドナーノッチンドメインは、ａｄｈｉｒｏｎドナー多様性足場ドメインで置換され得る。
追加のアミノ酸配列は、ライブラリーおよび／または改変ライブラリー由来の１個または複数の特定された結合メンバーの融合タンパク質またはパートナードメイン中に導入し得る。例えば、ドナー多様性足場ドメイン、例えば、ノッチンドナードメインは、例えば、合理的設計、ループグラフト化およびコンビナトリアルライブラリーベース手法により、インビトロディスプレイ技術を用いて、新規結合特異性を導入するように改変され得る。
追加のアミノ酸配列は、ＶＥＧＦ－Ａ結合配列９２またはトロンボポエチン（ＴＰＯ）結合配列５４などの標的結合配列であってよい。
いくつかの実施形態では、多様な配列が、本明細書に記載の結合メンバー中に導入されて、改善されたバリアントの選択のためのさらなるライブラリーが生成され得る。例えば、多様性は、ドナーまたはレシピエント多様性足場ドメインまたはパートナードメイン中に導入され得る。好適な多様性配列は、オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発またはランダム変異誘発２２により導入され得る。
いくつかの実施形態では、ドナー多様性足場ドメイン、レシピエント多様性足場ドメインおよびパートナードメインから結合メンバー内で選択された第１のドメインにより媒介される結合をガイドドメインとして用いて、第２のドメインもまた結合に寄与する、改変またはシャッフル結合メンバーを特定するための本明細書に記載の方法を使って、ライブラリーからの選択を誘導し得る。
第２ドメインは、第１のガイドドメインと同じ標的分子と相互作用し得るかまたはそれと密接に関連する第２の標的分子と相互作用し得る。例えば、電位開口型ナトリウムチャネルまたはカリウムチャネル（例えば、ＮａｖまたはＫｖチャネル）などのイオンチャネルのアルファサブユニットに対するノッチンドナー多様性足場ドメインによる結合は、同じアルファサブユニットまたはイオンチャネルのベータサブユニットなどの関連サブユニットへのパートナーＶＨドメインまたはレシピエントＶＬドメイン結合に由来する追加の接触により、強化または拡大され得る。
第２ラウンドでは、元のガイドドメインも同様に、改変または置換され得る。例えば、結合メンバーのドナー多様性足場ドメイン、レシピエント多様性足場ドメインまたはパートナードメインの内の１つは、標的分子に結合する第１のガイドドメインとして機能し得る。標的分子への結合に寄与する第２のドメインが特定されると、方法は、前記第１のガイドドメインを改変または置換して、第２のドメインおよび多様な第１のドメインを含む結合メンバーのライブラリーを生成することを含み得る。これにより、本明細書に記載と同様であるがガイドドメインを含んでいない開発の間に元のガイドドメインを入手できることからくる利益が得られる、最終的融合タンパク質を生じる。これは、例えば、レシピエント多様性足場ドメイン中のドナー多様性足場ドメインの融合体を含まない最終的結合メンバーが望ましい場合に有用であり得る。
例えば、第１の選択ラウンドで、結合メンバー内のノッチンドナー多様性足場ドメインを使ってパートナー抗体可変ドメイン（例えば、ＶＨドメイン）を単離した場合、このパートナー抗体可変ドメインは、次に、第２のラウンドで、代替相補可変ドメイン（例えば、ＶＬドメイン）を選択するためのガイドとして機能させることができる。この相補ドメインは、融合ドナー多様性足場ドメインを有するレシピエント多様性足場ドメインであってもよく、または通常の（すなわち、非融合の）抗体可変ドメインであってもよい。いくつかの実施形態では、イオンチャネル結合ドナー多様性足場ドメインの使用により、第１のサイクルから特定された抗体可変ドメイン（例えば、ＶＨドメイン）は、異なるアルファ鎖と相互作用するベータ鎖などのイオンチャネルの関連サブユニットに結合し得る。この抗体可変ドメインは、その後、同じβ鎖と結合する異なるアルファ鎖に対して、相補抗体可変ドメインまたはＶＬドナー多様性足場ドメイン融合タンパク質の選択を誘導し得る。
いくつかの実施形態では、第１のドメインは、低から中程度の親和性で、標的分子に結合し得る。例えば、親和性は、１００ｎＭのＫＤ未満であってよい。これは、同じタンパク質または密接に関連するサブユニットに結合し得る第２ドメインの寄与に起因して、結合における改善を可能とする。あるいは、第２ドメインは、標的細胞上の第２のドメインを隔離して標的との相互作用を促進する、同じ細胞上の非相互作用または弱い相互作用の分子に結合し得る。
いくつかの実施形態では、標的分子は、結合を測定するために、タグを付けたまたタグのない形の細胞の表面上に提示され得る９３。例えば、輸送体またはＧＰＣＲなどの膜内在性タンパク質は、タグ付で発現され得る。タグに結合するパートナードメイン（例えば、抗体ＶＨまたはＶＬドメイン）を含む結合メンバーのライブラリーおよびＶＬまたはＶＨレシピエントドメイン上に提示されたドナー多様性足場ドメインの多様性集団は、タグ付きの細胞表面発現標的タンパク質に対する改善された結合に関して選択に供せられ得る。これは、タグのない標的タンパク質に結合する、融合タンパク質およびドナー多様性足場ドメインの特定を可能とする。これらの融合タンパク質およびドナー多様性足場ドメインは、タグの付いていない標的タンパク質に結合する結合メンバーを特定するための、例えば、多様なパートナードメインの、さらなるラウンドのスクリーニングに有用であり得る。
種々の好適なタグが当技術分野において既知であり、これらには、例えば、ＭＲＧＳ（Ｈ）６（配列番号３６）、ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号３７）（ＦＬＡＧ（商標））、Ｔ７－、Ｓ－（ＫＥＴＡＡＡＫＦＥＲＱＨＭＤＳ；配列番号３８）、ポリ－Ａｒｇ（Ｒ５－６）、ポリ－Ｈｉｓ（Ｈ２－１０）、ポリ－Ｃｙｓ（Ｃ４）ポリ－Ｐｈｅ（Ｆ１１）ポリ－Ａｓｐ（Ｄ５－１６）、Ｓｔｒｅｐｔ－ｔａｇ ＩＩ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ；配列番号３９）、ｃ－ｍｙｃ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ；配列番号４０）、インフルエンザ－ＨＡタグ（Ｍｕｒｒａｙ、Ｐ．Ｊ．ｅｔ ａｌ（１９９５）Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２２９、１７０－９）、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｐｈｅタグ（Ｓｔａｍｍｅｒｓ、Ｄ．Ｋ．ｅｔ ａｌ（１９９１）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ２８３、２９８－３０２）、Ｔａｇ．１００（Ｑｉａｇｅｎ；哺乳動物ＭＡＰキナーゼ２から誘導した１２ａａタグ）、Ｃｒｕｚ ｔａｇ ０９（商標）（ＭＫＡＥＦＲＲＱＥＳＤＲ；（配列番号４１）、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．）およびＣｒｕｚ ｔａｇ ２２（商標）（ＭＲＤＡＬＤＲＬＤＲＬＡ；（配列番号４２）、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．）が挙げられる。既知のタグ配列は、Ｔｅｒｐｅ（２００３）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６０ ５２３－５３３で概説されている。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の、ライブラリー、改変ライブラリーおよび／またはシャッフルライブラリーは、結合メンバーに関して選択に供せられ得、ドナー多様性足場ドメインおよび／またはレシピエント多様性足場ドメインはそれらの天然の構造をとる、すなわち、それらは、活性な高次構造に適切に折り畳まれる。
例えば、ドナー多様性足場ドメインが既知の標的分子に結合する場合、本明細書に記載の親ライブラリー、改変ライブラリーおよび／またはシャッフルライブラリーは、標的分子に結合する結合メンバーに関して、選択に供せられ得る。標的分子に結合する結合メンバーは、活性で、その天然の構造に適切に折り畳まれたドナー多様性足場ドメインを含む。これは、例えば、ドナー多様性足場ドメインの実際の構造が既知でない場合に、有用であり得る。
ドナー多様性足場の適切な折り畳みに関する親和性ベース選択に加えて、ファージディスプレイなどの選択系は、レシピエントの適切な折り畳みに関する追加の選択性を提供し得る。理由は、ファージディスプレイが、優れた構造的健全性を有する融合体を濃縮することが示されたためである９４。レシピエント多様性足場ドメインが免疫グロブリンまたはその断片またはドメインである場合、本明細書に記載のライブラリー、改変ライブラリーおよび／またはシャッフルライブラリーは、免疫グロブリン結合分子に結合する結合メンバー９５に関して、選択に供せられ得る。免疫グロブリン結合分子に結合する結合メンバーは、ドナードメインの融合に関わらずに活性で、その天然の構造への適切に折り畳まれたレシピエント多様性足場ドメインを含む。系の厳密性は、以前に実施されたように９４，９６、提示されるエレメントの集団（例えば、ファージディスプレイ集団）を、より破壊的条件、例えば、高い温度に供することによりさらに改善され得る。
好適な免疫グロブリン結合分子は、当該技術分野において周知であり、タンパク質Ｌ、プロテインＧおよびプロテインＡの野生型および改変型、ならびに抗Ｉｇ抗体および抗体断片が含まれる。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン結合分子は、親和性クロマトグラフィー媒体中に含まれ得る。好適な親和性クロマトグラフィー媒体は、当該技術分野において既知であり、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（商標）、Ｌａｍｂｄａ Ｓｅｌｅｃｔ（商標）、ＩｇＳｅｌｅｃｔ（商標）、およびＧａｍｍａＢｉｎｄ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）が含まれる。
上述のようにして特定された１個または複数の結合メンバーは、例えば、標的分子への結合の機能性効果を測定するために、さらに試験され得る。方法は、ライブラリー、改変ライブラリーおよび／またはシャッフルライブラリーから特定された１個または複数の結合メンバーの、標的分子の活性に対する効果を測定することを含み得る。
いくつかの実施形態では、標的分子は、イオンチャネルであってよく、１個または複数の特定された結合メンバーの、チャネルを通るイオン流に対する効果が測定され得る。
チャネルを通るイオン流束は、ルーチン電気生理学的技術、例えば、パッチクランプ法を使って測定し得る。例えば、イオン流束は、イオンチャネルの内在性または異種性発現後に二電極電圧固定法を用いて測定し得る。いくつかの実施形態では、イオンチャネル機能は、蛍光ベース選別を使って測定し得る。例えば、内在性または異種性イオンチャネル、例えば、電位作動型カルシウムチャネル（Ｃａｖ）を発現している細胞を、Ｆｕｒａ３またはカルシウムグリーンなどのフルオロフォアと一緒にロードし得る。Ｋ＋誘発脱分極によるイオンチャネルの活性化は、細胞内イオン濃度の一時的増加を引き起こし、これは容易に測定できる。細胞膜を脱分極させ、応答を記録するのに好適なシステムは、当該技術分野において入手可能である（例えば、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ（商標）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｉｎｃ ＵＳＡ）。
チャネルを通るイオン流束は、蛍光タンパク質イオンセンサーを使用しても同様に測定し得る。好適な蛍光タンパク質イオンセンサーは当技術分野で入手可能である９７。
いくつかの実施形態では、１個または複数の特定された結合メンバーの一連の標的分子に対する効果が測定され得る。例えば、１個または複数の特定された結合メンバーの、一連のイオンチャネルを通るイオン流に対する効果が測定され得る。これは、例えば、結合メンバーの特異性を決定または特徴付けるのに有用であり得る。あるいは、１個または複数の特定された結合メンバーの、プロテアーゼ活性に対する効果が測定され得る。この場合標的はプロテアーゼである。あるいは、１個または複数の特定された結合メンバーの、細胞シグナル伝達に対する効果が測定され得る。この場合標的は受容体である。
上述の特定の後で、１個または複数の特定された結合メンバーは、ライブラリー、改変ライブラリーおよび／またはシャッフルライブラリーから回収、単離および／または精製され得る。
好ましい実施形態では、ライブラリー中のそれぞれの結合メンバーは、結合メンバーをコードする核酸を含むビーズ、リボソーム、細胞またはウイルスなどの粒子の表面上に提示され得る。
結合活性（例えば、標的分子に結合する）を示し、バクテリオファージまたはその他のライブラリー粒子または分子複合体上に提示される結合メンバーの選択後、核酸は、選択された結合メンバーを提示しているバクテリオファージまたはその他の粒子または分子複合体から採取され得る。
１個または複数の特定された結合メンバーを提示している粒子は、ライブラリー、改変ライブラリーおよび／またはシャッフルライブラリーから単離および／または精製され得る。１個または複数の特定された結合メンバーをコードする核酸は、粒子から単離および／または精製され得る。
１個または複数の特定された結合メンバーをコードする単離された核酸は、増幅、クローニングおよび／または配列決定され得る。
核酸増幅、クローニングおよび／またはシーケンシングの好適な方法は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、を参照されたい）。
単離された核酸の配列をその後の結合メンバーまたは融合タンパク質の産生に使用し得る。
１個または複数の特定された結合メンバーまたはコード核酸は、合成され得る。例えば、１個または複数の結合メンバーは、化学合成により全体としてまたは部分的に生成され得る。例えば、結合メンバー、または個々のドナーまたはレシピエント多様性足場ドメインまたは融合タンパク質およびそのパートナードメインは、液相または固相合成法；溶液中で；または固相、液相および溶液化学の任意の組み合わせで、例えば、最初にそれぞれのペプチド部分を完成し、その後、必要に応じ、適切な場合には、存在する任意の保護基の除去後、それぞれの炭酸またはスルホン酸またはこれらの反応性誘導体の反応による残基Ｘの導入により、合成され得る。
ポリペプチドの化学合成は、当該技術分野においてよく知られている（Ｊ．Ｍ．Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ（１９８４）；Ｍ．Ｂｏｄａｎｚｓｋｙ ａｎｄ Ａ．Ｂｏｄａｎｚｓｋｙ，Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）；Ｊ．Ｈ．Ｊｏｎｅｓ，Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ １９９１；ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３０Ａ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｍａｎｕａｌ，ＡＢＩ Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ；Ｇ．Ａ．Ｇｒａｎｔ，（Ｅｄ．）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９９２，Ｅ．Ａｔｈｅｒｔｏｎ ａｎｄ Ｒ．Ｃ．Ｓｈｅｐｐａｒｄ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ．ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ １９８９およびＧ．Ｂ．Ｆｉｅｌｄｓ，（Ｅｄ．）Ｓｏｌｉｄ－Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．２８９）．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ａｎｄ Ｌｏｎｄｏｎ １９９７））。
１個または複数の特定された結合メンバーは、コード核酸から組換え発現され得る。例えば、結合メンバーをコードする核酸は、宿主細胞中で発現され得、発現したポリペプチドは、細胞培養液から単離および／または精製され得る。
上述の核酸配列および構築物は、発現ベクター中で組み合わされ得る。プロモーター配列、ターミネーター断片、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および必要に応じてその他の配列を含む適切な調節配列を含む好適なベクターを選択または構築できる。ベクターは、宿主細胞中の核酸の発現を促進するために、適切な調節配列を含むのが好ましい。発現系における異種核酸コード配列の発現を促進するのに好適する調節配列は、当該技術分野において周知であり、構成的プロモーター、例えば、ＣＭＶまたはＳＶ４０などのウイルスプロモーター、およびＴｅｔ－ｏｎ調節プロモーターなどの誘導性プロモーターが含まれる。ベクターは、複製起点および選択可能マーカーなどの配列も含み得、これらは、その選択および複製ならびに大腸菌などの細菌性宿主中および／または真核細胞中での発現を可能とする。
細胞培養での組換え型ポリペプチドの発現のための多くの既知の技術およびプロトコルならびにそれらのその後の単離および精製は、当技術分野において既知である（例えば、Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ；Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｅｄ ＲＳ Ｔｕａｎ（Ｍａｒ １９９７）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ、を参照されたい）。
好適な宿主細胞には、細菌、哺乳動物細胞、植物細胞、糸状菌、酵母およびバキュロウイルス系ならびにトランスジェニック植物および動物が挙げられる。原核細胞中での抗体および抗体断片の発現は、当該技術分野において十分に確立されている。よく使われる細菌性宿主は大腸菌である。
培養中の真核細胞中での発現も、結合メンバーの生成のための選択肢として当業者が使用できる。異種ポリペプチドの発現のために、当該技術分野において利用可能な哺乳動物細胞株には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒーラ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＮＳ０マウス黒色腫細胞、ＹＢ２／０ラット骨髄腫細胞、ヒト胎児腎臓細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）、ヒト胎児網膜細胞（例えば、ＰｅｒＣ６細胞）およびその他多くの細胞が挙げられる。
１個または複数の特定された結合メンバーは、再フォーマットされてよい。例えば、免疫グロブリンレシピエント結合ドメインまたは免疫グロブリンパートナードメインを含む結合メンバーは、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、Ｆｃ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、またはハーフ抗体として再フォーマットされ得る。方法は、免疫グロブリンドメイン（例えば、ＶＨまたはＶＬドメイン）をコードする核酸をクローンの細胞から単離すること、前記ドメインをコードする核酸を増幅すること、および増幅した核酸をベクターに挿入して抗体分子をコードするベクターを得ることを含む。ｓｃＦｖフォーマットからＦａｂおよびＩｇＧフォーマットへの再フォーマットは下記で例示されている。
いくつかの実施形態では、１個または複数の特定された結合メンバー由来のドナー多様性足場ドメインを単離し得る。本明細書に記載の方法は、親ライブラリー、改変ライブラリーおよび／またはシャッフルライブラリー由来の１個または複数の特定された結合メンバーから単離されたドナー多様性足場ドメインを合成することまたは組み替え発現させることをさらに含み得る。
単離されたドナー多様性足場ドメインは、再フォーマットされ得る。例えば、ドナー多様性足場ドメインは、本明細書に記載の結合メンバー中の異なるレシピエント多様性足場ドメイン中に、またはＮまたはＣ末端融合体などの異なる結合メンバーフォーマット中に挿入し得る。
いくつかの実施形態では、単離されたドナー多様性足場ドメインは、いずれのレシピエントドメインまたは融合パートナーも含まない、独立した結合分子として使用し得る。
検出可能なまたは機能性標識または半減期延長部分を、１個または複数の特定された結合メンバーに取り付け得る。
標識は、限定されないが、蛍光剤、放射標識、酵素、化学発光剤または光増感剤を含むシグナルを生成するまたはこれらを生成するように誘導され得る任意の分子であってよい。したがって、結合は、蛍光または発光、放射能、酵素活性酵素活性または光吸光度が検出されことにより検出され、および／またはこれらを検出することにより測定され得る。
好適な標識には、酵素、例えば、アルカリフォスファターゼ、グルコース－６－ホスフェート脱水素酵素（「Ｇ６ＰＤＨ」）、α－Ｄ－ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコースアミラーゼ、炭酸脱水酵素、アセチルコリンエステラーゼ、リゾチーム、リンゴ酸脱水素酵素およびペルオキシダーゼ、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ；染料；蛍光標識または蛍光剤、例えば、フルオレセインおよびその誘導体、蛍光色素、ローダミン化合物および誘導体、ＧＦＰ（「緑色蛍光タンパク質」）、ダンシル、ウンベリフェロン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、オルトフタルアルデヒド、およびフルオレサミン；フルオロフォア、例えば、ランタニドクリプテートおよびキレート、例えば、ユーロピウムなど（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ａｎｄ Ｃｉｓ Ｂｉｏｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）；化学発光標識または化学発光剤、例えば、イソルミノール、ルミノールおよびジオキセタン；バイオ発光標識、例えば、ルシフェラーゼおよびルシフェリン；増感剤；補酵素；酵素基質；臭素７７、炭素１４、コバルト５７、フッ素８、ガリウム６７、ガリウム６８、水素３（トリチウム）、インジウム１１１、インジウム１１３ｍ、ヨウ素１２３ｍ、ヨウ素１２５、ヨウ素１２６、ヨウ素１３１、ヨウ素１３３、水銀１０７、水銀２０３、亜リン酸３２、レニウム９９ｍ、レニウム１０１、レニウム１０５、ルテニウム９５、ルテニウム９７、ルテニウム１０３、ルテニウム１０５、スカンジウム４７、セレン７５、硫黄３５、テクネチウム９９、テクネチウム９９ｍ、テルル１２１ｍ、テルル１２２ｍ、テルル１２５ｍ、ツリウム１６５、ツリウム１６７、ツリウム１６８およびイットリウム１９９を含む放射標識；粒子、例えば、ラテックスまたは炭素粒子；金属ゾル；微結晶；リポソーム；細胞などが含まれ、これらは、染料、触媒またはその他の検出可能な基；および分子、例えば、ビオチン、ジゴキシゲニンまたは５－ブロモデオキシウリジン；毒素部分、例えば、緑膿菌外毒素（ＰＥまたはその細胞傷害性断片または変異体）、ジフテリア毒素またはその細胞傷害性断片または変異体、ボツリヌス毒素Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥまたはＦ、リシンまたはその細胞傷害性断片、例えば、リシンＡ，アブリンまたはその細胞傷害性断片、サポリンまたはその細胞傷害性断片、アメリカヤマゴボウ抗ウイルス毒素またはその細胞傷害性断片およびブリオジン１またはその細胞傷害性断片の群から選択される毒素部分によりさらに標識され得る。
好適な酵素および補酵素は、Ｌｉｔｍａｎらの米国特許第４２７５１４９号、およびＢｏｇｕｓｌａｓｋｉらの米国特許第４３１８９８０号に開示されている。好適な蛍光剤および化学発光剤は、Ｌｉｔｍａｎらの米国特許第４２７５１４９号に開示されている。標識には、化学的部分、例えば、特異的同族の検出可能部分、例えば、標識アビジンまたはストレプトアビジンに対する結合を介して検出され得るビオチンがさらに含まれる。検出可能な標識は、当該技術分野において既知の従来の化学反応を用いて、本発明の抗体に取り付けてよい。
好適な半減期延長部には、Ｆｃドメインまたは血清アルブミンへの融合体、ＸＴＥＮ９８またはＰＡＳ９９ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非構造化ペプチドが含まれる。
本明細書に記載の方法は、ライブラリー、改変ライブラリーおよび／またはシャッフルライブラリーまたは単離されたドナー多様性足場ドメイン由来の１個または複数の特定された結合メンバーを、薬学的に許容可能な賦形剤と共に処方することをさらに含み得る。
本明細書で使用される場合、用語の「薬学的に許容可能な」は、健全な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、またはその他の問題または合併症がなく、適度な便益/リスク比に見合っており、対象（例えば、ヒト）の組織と接触して使用するのに好適する、化合物、材料、組成物、および／または剤形に関する。各キャリア、賦形剤、などは、製剤の他の成分と適合するという意味で、同様に「許容可能」でなければならない。好適なキャリア、賦形剤、などは、標準的医薬品テキスト、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０、中に見出すことができる。
本発明の別の態様は、本明細書に記載の融合タンパク質または結合メンバーをコードする核酸を提供する。
核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含んでよく、また、全体として、または部分的に合成されてもよい。本明細書に記載されるようなヌクレオチド配列への言及は、指定した配列を有するＤＮＡ分子を包含し、また、文脈上異なる解釈を要する場合を除き、ＵがＴで置換された、指定した配列を有するＲＮＡ分子を包含する。
本発明の別の態様は、本明細書に記載の核酸を含むベクター、ならびに核酸を含む転写または発現カセットを提供する。ベクターは、プラスミド、ウイルス、例えば、ファージ、または必要に応じて、ファージミドであってよい。さらなる詳細に関しては、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ：３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｒｕｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、を参照されたい。
本発明の別の態様は、本明細書に記載の結合メンバーのライブラリーをコードする核酸集団を提供する。
ライブラリーをコードする核酸は、ファージまたはファージミドベクターなどの発現ベクター中に含められていてもよい。
本発明の別の態様は、本明細書に記載のライブラリーおよび／または本明細書に記載のライブラリーをコードする核酸の集団を含む粒子集団を提供する。
ライブラリーは、ウイルス粒子の表面上に提示され得る。ライブラリー中のそれぞれの結合メンバーは、ディスプレイを促進するためのファージコートタンパク質をさらに含んでもよい。それぞれのウイルス粒子は、粒子上に提示される結合メンバーをコードする核酸を含み得る。好適なウイルス粒子には、バクテリオファージ、例えば、繊維状バクテリオファージ、例えば、Ｍ１３およびＦｄが含まれる。ファージディスプレイライブラリーの生成のための技術は、当該技術分野において周知である。
本発明の他の態様は、本明細書に記載の結合メンバー、核酸またはベクターを含む宿主細胞、および本明細書に記載の核酸ライブラリー、核酸集団および／またはウイルス粒子集団を含む宿主細胞の集団を提供する。
本発明の別の態様は、本明細書に記載の融合タンパク質または結合メンバーおよび薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
医薬組成物は、好都合にも、単位剤形で提供され得、また、薬学の技術分野においてよく知られた任意の方法で調製し得る。このような方法は、結合メンバーを担体と混合するステップを含み、担体は１種または複数の補助成分であってよい。通常、医薬組成物は、活性化合物を液体担体または微粉化固体担体またはその両方と均一かつ十分に混合し、その後、必要に応じ、生成物を成形することにより調製される。
医薬組成物は、液体、溶液、懸濁液、乳剤、エリキシル剤、シロップ、錠剤、ロゼンジ剤、顆粒、粉剤、カプセル剤、カシェ剤、丸薬、アンプル、坐剤、ペッサリー、軟膏、ゲル、ペースト剤、クリーム剤、噴霧剤、ミスト、発泡体、ローション、油剤、巨丸剤、煉薬、またはエアロゾルの形態であってよい。
結合メンバーまたは結合メンバーを含む医薬組成物は、任意の都合のよい投与経路により、対象へ、全身的に／末梢性に、または所望の作用部位に投与してよく、これらの投与経路には、限定されないが、経口（例えば、摂取により）；局所的（例えば、経皮、鼻腔内、眼、頬側、および舌下を含む）；肺（例えば、エアロゾルを使って例えば、口内または鼻を介した、吸入または吹送療法により）；直腸；腟；非経口、例えば、皮下、皮内、筋肉内、静脈内、動脈内、心臓内、クモ膜下腔内、脊髄内、関節内、嚢下、眼窩内、腹腔内、気管内、表皮下、関節腔内、クモ膜下、および胸骨内注射を含む注射により；持効性製剤の埋め込み、例えば、皮下にまたは筋肉内への埋め込みにより、投与する経路が含まれる。
経口投与（例えば、摂取による）に好適する医薬組成物は、カプセル剤、カシェ剤または錠剤などのそれぞれが所定の量の活性化合物を含む別々のユニットとして；粉剤または顆粒剤として；水性のまたは非水性液体中の溶液または懸濁液として；または水中油型液体乳剤または油中水型液体乳剤として；巨丸剤として；煉薬として；またはペースト剤として提供してよい。
非経口的投与（例えば、皮膚、皮下、筋肉内、静脈内および皮内を含む注射による）に好適する医薬組成物には、酸化防止剤、緩衝液、防腐剤、安定化剤、静菌薬、および製剤に目的のレシピエントの血液の等張性を付与する溶質を含んでもよい水性および非水性の等張性の発熱性物質非含有無菌注射溶液；および懸濁剤および増粘剤、ならびに化合物を血液成分または１つまたは複数の臓器を標的にさせるリポソームまたはその他の微粒子系を含んでもよい水性および非水性の無菌懸濁液が含まれる。このような製剤に使用するための好適な等張性ビークルには、塩化ナトリウム注射液、リンゲル溶液、または乳酸加リンゲル液が含まれる。通常、溶液中の活性化合物の濃度は、約１ｎｇ／ｍｌ～約１０μｇ／ｍｌ、例えば、約１０ｎｇ／ｍｌ～約１μｇ／ｍｌである。製剤は、単位用量または複数回投与用シール容器、例えば、アンプルおよびバイアルで提供してもよく、また、使用直前に、無菌液体担体、例えば、注射用水の添加のみが必要な、凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ－ｄｒｉｅｄ）（凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ））状態で保存してもよい。
結合メンバーの適切な投与量は、患者毎に変えることができることは理解されよう。最適投与量の決定は通常、起こり得る投与のリスクまたは有害な副作用に対する診断上の利益のレベルのバランスを必要とすることになる。選択される投与量レベルは、限定されないが、投与経路、投与時期、造影剤の排出速度、必要な造影剤の量、他の薬物、化合物および／または組み合わせて用いられる物質、患者の年齢、性別、体重、病状、総体的な健康および既往の病歴を含む種々の要因に依存するであろう。造影剤の量および投与経路は、最終的には医師の自由裁量によると思われるが、通常、投与量は、実質的に有害または有毒な副作用を生ずることなく、造影を可能とする、目的の腫瘍、組織などの部位または全身の濃度を達成するべきであろう。
インビボ投与は、１回の投与で、連続的または間欠的投与で（例えば、適切な間隔の分割量で）行うことができる。最も効果的な手段および投与量の決定方法は、当業者には周知であり、治療に使用される製剤、治療の目的、処置される標的細胞、および処置される対象により変化するであろう。単回または複数回投与は、医師により選択される用量レベルおよびパターンを用いて実施できる。
本明細書に記載の結合メンバーは、ヒトまたは動物対象、例えば、ヒトの診断または処置方法で使用し得る。標的分子、例えば、イオンチャネルに対し、結合メンバーを使って、標的分子に関連する障害を処置し得る。
本発明の他の態様は、薬物として使用するための本明細書に記載の融合タンパク質、結合メンバーまたは組成物；疼痛または自己免疫疾患の処置に使用するための本明細書に記載の融合タンパク質、結合メンバーまたは組成物；およびイオンチャネル活性または機能障害に関連する状態の処置のための薬物の製造における本明細書に記載の融合タンパク質、結合メンバーまたは組成物の使用を提供する。
本発明の別の態様は、必要に応じて、イオンチャネル活性または機能障害に関連する状態の処置のために、本明細書に記載の結合メンバーまたは組成物の、それを必要としている個体への投与を含む処置方法を提供する。
有効量の本明細書に記載の結合メンバーまたは組成物を単独でまたは別の適切な当該技術分野において既知もしくは本明細書に記載の薬物による治療法と組み合わせて用いて、それを必要としている患者の標的分子に関連するいずれかの疾患または障害の少なくとも１つの症状を処置するまたはその症状の重症度を低減するために使用し得、それにより、上記のいずれかの障害の少なくとも１つの症状の重症度が低減される。
本発明の他の態様および実施形態は、用語の「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を用語の「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」に置き換えた上記の態様および実施形態、ならびに用語の「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を用語の「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」に置き換えた上記の態様および実施形態および提供する。
文脈から別義が要求されない限り、本出願は、いずれかの上記態様および上記実施形態の相互の全ての組み合わせを開示していることを理解されたい。同様に、文脈から別義が要求されない限り、本出願は、好ましいおよび／または任意の特徴の単独でのまたは他の態様のいずれかと一緒での全ての組み合わせを開示している。
上記実施形態の修正、さらなる実施形態およびその修正は、本開示を読めば当業者には明らかであると思われ、従って、これらは本発明の範囲内にある。
そこに開示されるアミノ酸およびヌクレオチド配列を含む、本明細書で言及される全ての文献、ウェブサイト、データベースおよび配列データベース項目の内容は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書で使われる場合、「および／または」は、その他のものを含むまたは含まない２つの指定された特徴または成分のそれぞれの特殊な開示として解釈されるべきである。例えば、「Ａおよび／またはＢ」は、あたかもそれそれが個別に本明細書で列挙されているかのように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂおよび（ｉｉｉ）ＡとＢのそれぞれの特殊な開示と解釈されるべきである。
本発明の特定の態様および実施形態は、以降で、実施例により、および上記の図を参照して示される。
実験
１．概要
トリプシン阻害剤；テッポウウリトリプシン阻害剤－ＩＩ（ＥＥＴＩ－ＩＩ）を用いて、ドナー多様性足場（例えば、ノッチン）のレシピエント多様性足場ドメイン（例えば、抗体ＶＬドメイン）への融合を、本明細書で最初に例示した。このノッチン足場では、トリプシンへの親和性結合は、ノッチンの適切な折り畳みに依存する。ノッチン遺伝子を抗体軽鎖レシピエントのＣＤＲ１またはＣＤＲ２に挿入した（カッパおよびラムダ軽鎖の両方に対し実証した）。レシピエントのバリアントのライブラリーを作成し、組み込まれるドナーを収容し得るレシピエントバリアントの選択を可能とした。ドナーおよびレシピエントドメインは、近接並置されていた。下記実施例では、組み込まれるドナーは、ＣＤＲループを置換し、組み込まれるドナードメインの末端は、隣接抗体フレームワーク残基、すなわち、コア構造のβ鎖配列に融合された。下記のいくつかの実施例では、フレームワーク残基は、ランダム配列により置換された。したがって、結合メンバーは、追加の残基がほとんど加えられないか全く加えないように、ドナーおよびレシピエント足場を連結する配列長さを制限する方式で構築した。いくつかの事例では、ドナーおよびレシピエントの二次構造エレメントの直接融合により生成されるはずのものに比べて、フレームワーク残基とドナードメインとの間の接合部内に、より少ない残基であった。バリアントのライブラリーが作成され、組み込まれるドメインのＮおよびＣ末端境界のアミノ酸残基の配列は変化したが、立体配置の可撓性を制限する短いリンカー長さは維持された。このライブラリーは、ノッチン挿入物に続く領域中の天然軽鎖レパートリーから導入された多様性を有するノッチンの前に固定カッパまたはラムダ配列を有する適切な融合体組み合わせを特定するために設計された。したがって、ノッチンのＣＤＲ１への挿入に関して、フレームワーク２（ＦＷ２）からＶＬドメインの末端までの配列は、天然レパートリーに由来する。同様に、ＣＤＲ２への挿入物の後に、フレームワーク３からＶＬドメインの末端までの、天然レパートリー由来の配列が続く。
ドナーおよびレシピエント多様性足場の融合体をコードする遺伝子集団は、ファージディスプレイベクターに挿入され、融合体を提示するファージ粒子は、回収され、集団は、ファージディスプレイ技術を使って、固定されたトリプシン上に選択される２８，１００。このように、保持されたトリプシン結合、したがって、ノッチンドナーの適切な折り畳みの選択が実施された。ドナーの適切な折り畳みに関する親和性ベース選択に加えて、ファージディスプレイは、レシピエントの適切な折り畳みに関する追加の選択性を提供する。理由は、ファージディスプレイが、優れた構造的健全性を有する融合体を濃縮することが示されたためである９４。したがって、ドナーが適切に折り畳まれた（したがって、トリプシンを結合できる）が、レシピエントの折り畳みが損なわれる場合、ドナーのディスプレイもさらに損なわれるであろう（おそらく、誤って折り畳まれた融合体の分解により）。抗体レシピエントの折り畳みに対する選択性は、従って、プロテインＬまたはプロテインＡに対し事前選択することにより、さらに高められ得る。これらのタンパク質は、両方とも、適切な折り畳み要求基準を備えた、特定のＶＬおよびＶＨドメインにそれぞれ結合することが示されている９５。系の厳密性は、ファージ集団を、より破壊的条件９４，９６に供することによりさらに改善され得る。
ＥＥＴＩ－ＩＩの折り畳みおよびトリプシン結合を支持する一連の軽鎖バリアントが選択された。１つのドナー多様性足場ファミリー（この場合、ノッチン）のメンバーに対して、足場が選択されると、ドナーファミリー内で共通の構造的制約であることを考慮すれば、それは、同じドナー多様性足場ファミリーの追加のメンバーに対して使用され得る。２つの選択されたレシピエント抗体軽鎖足場を使用して、ナトリウムチャネル７１，７２，７０、カリウムチャネル２５，７３，７４および酸感受性イオンチャネル１１８，１２２をブロックする一連の他のノッチンが、以前に選択されたレシピエント抗体ドメイン内のドナーとして使用された。電位開口型カリウムチャネルＫｖ１．３および酸感受性イオンチャネル１ａの場合には、これらのいくつかは、標的イオンチャネルに対するブロッキング活性を保持することが示された。したがって、選択されたレシピエントドメインは、多様性足場の同じクラスの複数の別々のドナーに対し使用できる、汎用足場を提供することが示された。
２つの結合足場を短い非可撓性リンカーにより連結し、ドメイン間の可撓性および相対運動を制限した。融合結合足場の近接性を考慮すれば、ドナーおよびレシピエント多様性足場両方の表面上のアミノ酸が、単一タンパク質上の同じエピトープとの相互作用に関与するパラトープに寄与する機会が存在する。同様に、ドナーまたはレシピエント多様性足場のパートナードメインの表面は、標的との結合に寄与し得る。あるいは、両方の足場は、標的タンパク質複合体上の近接して置かれた部位と接触し得る。立体配置における可撓性は、結合相互作用に関し、熱力学的「エントロピーペナルティ」を有する。同じ理由から、２つの融合ドメイン間の立体配置的関連性を固定することは有利であり、そのため、２つのドメインを連結する可撓性リンカー配列を無くすことが好ましい。
レシピエント抗体可変ドメイン可変ドメイン中に挿入されたドナーノッチンを含む結合メンバーを結晶化し、タンパク質構造を決定した。これは、ノッチンの適切な折り畳みを確認し、レシピエント抗体可変ドメイン中で提示されるノッチンは、以前に遊離ノッチンで示されたのと同じ構造であることを示した。構造はまた、抗体の適切な折り畳みおよび２つのドメインの近接並置を確証した。両ドメインは、予測された構造を示し、ドメイン間の比較的剛性の高次構造の期待が結晶構造により裏付けられている。システインリッチドナードメインの抗体レシピエントドメインへの融合体は、以後、ＫｎｏｔＢｏｄｙ（商標）と呼ばれる。
実施例１：ノッチン－ＶＬ ＣＤＲ融合体ファージディスプレイライブラリーの構築
ファージディスプレイベクターのｐＳＡＮＧ４２８は、ファージミドベースファージディスプレイベクターで、これは単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フォーマット抗体の容易なクローニングを可能とする。ｓｃＦｖフォーマットでは、ＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子が、可撓性リンカーペプチドをコードするＤＮＡにより連結されている。ｐＳＡＮＧ４を用いて、ｓｃＦｖ遺伝子がＮｃｏ１およびＮｏｔ１部位に挿入され、Ｎｃｏ１部位の前に配置されるＭ１３リーダー配列およびＮｏｔ１部位の後ろに配置されるｇｅｎｅ３によりコードされるマイナーコートタンパク質を有するインフレーム融合体が作成される（図１Ａ）。
トリプシンと相互作用しない固定ＶＨ遺伝子（Ｄ１２）（図２）を包含する１対の合成ｓｃＦｖ遺伝子を合成した（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔから）。このＤ１２ ＶＨ遺伝子１０１は、「ＴＮＦアルファ変換酵素」（ＴＡＣＥ）に結合し、ＩＧＨＶ３－２３生殖細胞系列遺伝子（ＤＰ４７としても知られる）が起源である。このＩＧＨＶ３－２３生殖細胞系列遺伝子は、抗体応答で頻繁に使用される１０２。
ＶＨ遺伝子は、ＩＧＫＶ１Ｄ－３９生殖系列遺伝子（Ｖカッパ１ファミリーのメンバー）またはＩＧＬＶ１－３６生殖系列遺伝子（Ｖラムダ１ファミリーのメンバー）のＮ末端部分からＦＲ２セグメントの末端までと、その後ろのＮｏｔ１制限酵素部位をコードする合成遺伝子に結合される。
この部分的ＶＬ遺伝子を包含する合成遺伝子は、ＣＤＲ１位置またはＣＤＲ２位置でノッチン遺伝子の挿入を可能とするであろう（図１Ｂ、Ｃ）。遺伝子は、Ｐｍｌ１制限酵素部位をＦＲ１の末端に導入する。これは、それらの５’および３’末端でＰｍｌ１およびＭｆｅ１部位にそれぞれ隣接するノッチンのレパートリーをクローニングするために使用される（図１Ｂ）。Ｐｍｌ部位は、カッパ遺伝子中のサイレント変異の結果として、ＦＷ１の末端近傍に導入された。ＳｅｒからＴｈｒへの変異をラムダ遺伝子のＦＷ１領域に導入し、この同じ制限酵素部位を収容した。合成遺伝子はまた、ＦＷ２の末端にＰｓｔ１部位を導入した。これは、ノッチン遺伝子の５’および３’末端の位置に制限酵素部位Ｐｓｔ１およびＢｓｐＥ１を使って、ＣＤＲ２位置にノッチン遺伝子を導入するのに使用される（図１Ｃ）。機能性ＶＬ遺伝子の構築では、ＶＬドメインの残りの部分（ＣＤＲ１ノッチン挿入の場合には、ＦＲ２から、およびＣＤＲ２挿入の場合には、ＦＷ３から）を、軽鎖レパートリー２８からＰＣＲにより生成し、融合体を完成した（実施例２を参照）。
これらの２つのカッパまたはラムダ軽鎖生殖系列遺伝子セグメントをコードする合成遺伝子は、プライマー２５６１（ＧＧＴＡＣＣＴＣＧＣＧＡＡＴＧＣＡＴＣＴＡＧ；配列番号４３）および２５６２（ＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＴＣＴＧＣＡＧＴＣＧ；配列番号４４）を用いて増幅した。精製されたＰＣＲ産物をＮｃｏ１およびＮｏｔ１で消化した後、同じ制限酵素で切断したｐＳＡＮＧ４ベクター２８に連結した。製造業者のインストラクションに従って、連結反応物を大腸菌ＤＨ５－アルファ細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に形質転換した。Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ Ｍｉｄｉ ｐｒｅｐ ｋｉｔを使って、配列確認形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製した（製造業者のインストラクションに従った）。これらのベクターを、「ｐＩＯＮＴＡＳ１＿ＫＢ＿Ｋａｐｐａ」および「ｐＩＯＮＴＡＳ１＿ＫＢ＿ｌａｍｂｄａ」と命名し、Ｎｃｏ１部位からＮｏｔ１部位までの配列を、図２Ａおよび２Ｂにそれぞれ示す。
折り畳まれたノッチンドナーと抗体レシピエントとの融合の可能性を実証するために、トリプシン阻害活性を有する植物由来ノッチンであるテッポウウリトリプシン阻害剤－ＩＩ（ＥＥＴＩ－ＩＩ）を使用した。ＥＥＴＩ－ＩＩは、遊離のＮおよびＣ末端を有し、トリプシン結合は、ループ１中に存在する制約された配列「ＰＲＩＬ」により推進される（図３Ａ）１０３。適切に折り畳まれた状態でのトリプシンに対する高親和性１０４は、レシピエントＶＬドメインに挿入されてもトリプシン結合を保持するドナーノッチンを特定する可能性を提供する。可変融合体配列がドナーとレシピエントとの間に導入されたファージディスプレイライブラリーの構築は、トリプシン結合に基づくライブラリーからの機能性ノッチン－ＣＤＲ－ＶＬの組み合わせの選択を可能とするであろう。
このノッチンドナー多様性足場をカッパまたはラムダＶＬドメインのＣＤＲ１またはＣＤＲ２位置に融合した。これは、２つのドメイン間の限られた数の追加アミノ酸あるいは減らした数のアミノ酸になるようにして、組み込まれるノッチンドナーおよびＶＬレシピエント内の残基をランダムアミノ酸で置換することにより行った。我々はまた、挿入点の後ろに、ＶＬ遺伝子セグメントを包含する軽鎖断片レパートリーを導入した（実施例２）。
ノッチンのＣＤＲ１への挿入
合成ＥＥＴＩ－ＩＩノッチンドナー遺伝子を作製し、これを、Ｐｍｌ１およびＭｆｅ部位（これはＰＣＲにより導入された）を有するＰＣＲ断片を作成して、ｐＩＯＮＴＡＳ１＿ＫＢ＿ＫａｐｐａおよびｐＩＯＮＴＡＳ１＿ＫＢ＿ｌａｍｂｄａ中に挿入することにより、軽鎖レシピエント中のＣＤＲ１位置を置換するのに使用した。フレームワークおよびＣＤＲ表記は、ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（ＩＭＧＴ）２９により記載の通りである。ＰＣＲプライマーはまた、制限部位とノッチン遺伝子との間に可変アミノ酸配列を導入した。ＰＣＲプライマーＰｍｌ１－５ＥＥＴａおよびＰｍｌ１－５ＥＥＴｂは、それぞれ、配列ＶＮＳ（Ｖ＝ＡＣまたはＧ、Ｎ＝ＡＣＧまたはＴ、Ｓ＝ＣまたはＧ）でコードされた３個の可変コドンをＰｍｌ制限酵素部位のすぐ後ろに導入した。「ＶＮＳ」縮重コドンは、それぞれのランダム化位置で、２４のコドンの組み合わせから、１６個のアミノ酸（システイン、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニンおよび停止コドンを除く）をコードする。
Ｐｍｌ１－５ＥＥＴａ ＧＴＧＴ ＶＮＳ ＶＮＳ ＶＮＳ ＴＧＣ ＣＣＧ ＣＧＴ ＡＴＣ ＣＴＧ ＡＴＧ ＣＧＴ ＴＧＣ（配列番号４５）
Ｐｍｌ１－５ＥＥＴｂ ＧＴＧＴ ｇｇａ ＶＮＳ ＶＮＳ ＶＮＳ ＴＧＣ ＣＣＧ ＣＧＴ ＡＴＣ ＣＴＧ ＡＴＧ ＣＧＴ ＴＧＣ（配列番号４６）
これらの配列の５’末端は、配列「ＣＡＣＧＴＧ」（配列番号４７）を認識して平滑末端を作成する制限酵素であるＰｍｌ１で作成された部位を表す。ＰＣＲ産物の平滑末端クローニングを容易にするために、５’リン酸化末端を有するプライマーを合成した。
この時点でのＰＣＲ産物の導入は、ＦＷ１の最後の３個の残基およびＥＥＴＩ－ＩＩの最初の残基（これはノッチン内のβシートの一部を形成する）を３個のランダム化残基で置換する効果を有する。正味の効果は、フレームワークとドナーとの間の連結部におけるアミノ酸の減少である。プライマーＰｍｌ１－５ＥＥＴｂは、それらの間の残基の数を回復する追加のＧｌｙ残基をコードする（図３Ｂ）。
ノッチン遺伝子の３’末端に、アンチセンスプライマー１－５ＥＥＴＭｆｅ（Ｍｆｅ１部位をコードする）を使用してＥＥＴＩ－ＩＩを増幅した。クローニングに使用されたＭｆｅ１部位は、ＦＷ２の２番目および３番目のアミノ酸（Ａｓｎ－Ｔｒｐ）をコードする。このプライマーはまた、ＥＥＴＩ－ＩＩに認められる末端グリシンを保持し、Ｍｆｅ１部位の前にＶＮＳまたはＶＮＣによりコードされる２個のランダムアミノ酸を導入した。ノッチンドナー遺伝子を導入するためのこの戦略の結果は、ＦＷ２の最初のアミノ酸を除去し、２個のランダム化アミノ酸を用いて、ドナーとフレームワーク間への正味１個のアミノ酸の付加により、２つのドメインを連結することである。
１－５ＥＥＴＭｆｅ ＧＴＣＡＧＴＣＣＡＡＴＴＧＮＢＳＮＢＣＣＣＧＣＡ ＧＡＡＧＣＣＧＴＴＣＧＧＡＣＣＧＣＡ（配列番号４８）
Ｍｆｅ１をコードする配列には下線を引いた。一例として、Ｐｍｌ１－５ＥＥＴａおよびＰｍｌ１－５ＥＥＴＭｆｅを用いて増幅し、その後、ｐＩＯＮＴＡＳ１＿ＫＢ＿ｌａｍｂｄａおよびｐＩＯＮＴＡＳ１＿ＫＢ＿Ｋａｐｐａに挿入して得られた構築物をそれぞれ図３Ｃおよび３Ｄに示す。
ノッチンのＣＤＲ２への挿入
ノッチンドナーは、ＰＣＲにより導入されたＰｓｔ１およびＢｓｐＥ１部位を有するＰＣＲ断片を作成することにより、ｐＩＯＮＴＡＳ１＿ＫＢ＿ｌａｍｂｄａおよびｐＩＯＮＴＡＳ１＿ＫＢ＿ＫａｐｐａのＣＤＲ２位置に導入された。Ｐｓｔ１部位をＩＧＫＶ１Ｄ－３９Ｖカッパ遺伝子のＣＤＲ２領域の最初の２個の残基中（Ａｌａ－Ａｌａ配列内）に導入することが可能である。クローニング上の便宜上、同じ制限酵素部位およびコード残基を、Ｖラムダ生殖系列遺伝子ＩＧＬＶ１－３６のフレームワーク２の末端に導入した。ラムダ生殖系列ではまた、ＢｓｐＥ１部位を、Ｓｅｒ－ＧｌｙをコードするＦＷ３領域の４番目および５番目の残基中に導入することも可能である（図３Ｅ）。再度、この制限酵素部位およびコードアミノ酸をＶカッパ遺伝子中に導入した（図３Ｆ）。
ＰＣＲプライマーＰｓｔ１－５ＥＥＴａを使って、ＥＥＴＩ－ＩＩを増幅し、Ｐｓｔ１部位を包含する２つのＡｌａコドン、続けて、配列ＧＮＳ（Ｖａｌ、Ａｌａ、ＡｓｐまたはＧｌｙをコードする）およびＶＮＳ（２４コドンの内１６アミノ酸をコードする）によりコードされる２つの可変コドンをＰｓｔ１制限酵素部位の直後でノッチン配列の前に導入する。ＶＮＳコドンは、ＥＥＴＩ－ＩＩの最初のアミノ酸を、ドナーとレシピエントフレームワークとの間の正味３個のアミノ酸（２個のＡｌａ残基と、Ｖａｌ、Ａｓｐ、ＡｌａまたはＧｌｙの内の１個）の付加で置換する（図３Ｂ）。
ＰＳＴ１－５ＥＥＴａ ＡＴＣ ＴＡＴ ＧＣＴ ＧＣＡ ＧＮＳ ＶＮＳ ＴＧＣ ＣＣＧ ＣＧＴ ＡＴＣ ＣＴＧ ＡＴＧ ＣＧＴ ＴＧＣ（配列番号４９）
組み込まれるノッチンドナーの３’末端では、ＰＣＲプライマーの－５ＥＥＴＢｓｅを使ってＥＥＴＩ－ＩＩを増幅した。これはクローニング用のＢｓｐＥ１部位を導入する。ＰＣＲ産物は、ノッチンドナーと、それに続くグリシンを導入する。このグリシンは、天然では、ＥＥＴＩ－ＩＩの最後のシステインの後ろに存在する（図３Ａ）。これの後に、２個のランダム化アミノ酸が続き、これは、クローニング後、ＦＷ３の４番目および５番目のアミノ酸に隣接する。これは、最初のＦＷ３の３個の残基を、２個のランダム化アミノ酸で置換する効果を有し、ノッチンの末端グリシンを保持する（図３Ｂ）。正味の効果は、ドナーとフレームワーク３との間のアミノ酸の減少である。
１－５ＥＥＴＢｓｅ ＧＴＣＡＧＡＧＡＣＴＣＣＧＧＡＳＮＢＳＮＢＣＣＣＧＣＡ ＧＡＡＧＣＣＧＴＴＣＧＧＡＣＣＧＣＡ（配列番号５０）
一例として、Ｐｓｔ１－５ＥＥＴａおよび１－５ＥＥＴＢｓｅを用いて増幅し、その後、ｐＩＯＮＴＡＳ１＿ＫＢ＿ＫａｐｐａまたはｐＩＯＮＴＡＳ１＿ＫＢ＿ｌａｍｂｄａに挿入して得られた構築物をそれぞれ図３Ｅおよび３Ｆに示す。
実施例２：追加の多様性のレシピエントＶＬドメインへの導入
ヒトでは、２種の異なるクラスの抗体軽鎖（カッパまたはラムダ）があり、これらは、それぞれ、約５０および４０個の生殖系列遺伝子によりコードされている。これらはそれぞれ、配列相同性を基準にして７種の異なるカッパファミリー（Ｖカッパ１－Ｖカッパ７）に、および１１種の異なるラムダファミリー（Ｖラムダ１－Ｖラムダ１１）に分類される。生殖系列配列２９の調査により、異なる生殖系列ＶＬ遺伝子ファミリーに特異的なセンス鎖プライマー（「順方向プライマー」）の設計が可能となる。
抗体成熟の過程で、個々のＶＬ生殖系列遺伝子は、約５個の異なるカッパまたはラムダ特異的Ｊセグメントを用いて３’末端で組み替えられる。したがって、例えば、Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ（２００７）２８に記載のような、抗体ファージディスプレイライブラリーの構築のために、ヒトドナー由来の再配列されたＶＬ遺伝子の増幅を可能とする少数の順方向および逆方向プライマーの設計が可能である。この実施例では、我々は、類似の手法を使って、どのようにして、ＦＷ２またはＦＷ３から始まり、ＶＬ遺伝子の末端までの、ＶＬ遺伝子の断片を増幅できるかを示した。これは、ＣＤＲ１またはＣＤＲ２にドナー挿入を有するレシピエントＶＬドメインへの多様性の導入を可能とする。したがって、この手法は、挿入されたドナーの下流のレシピエントドメインへの追加の多様性の導入を可能とする。
フレームワーク２で始まるＶＬレパートリーの増幅。
ＶカッパおよびＶラムダ生殖系列遺伝子ファミリーの配列を整列させ（データはＩＭＧＴ２９から入手）、フレームワーク２から始まるＶＬレパートリーの増幅を可能とするＰＣＲプライマーを設計した。Ｖラムダ１、２および３のＦＷ２領域から増幅可能なラムダ特異的プライマー（「Ｍｆｅｌａｍ」）を設計した。これらのプライマーはまた、上記ノッチン遺伝子の末端に導入されたＭｆｅ１部位と適合性があり、インフレームのＭｆｅ１部位（下線）を導入するようにも設計した。同様にして、Ｖカッパ１、２および３のＦＷ２領域から増幅可能なカッパ特異的プライマー（「Ｍｆｅｋａｐ」）を設計した。
Ｍｆｅｌａｍ １ ＧＴＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＣ ＡＡＴ ＴＧＧ ＴＡＣ ＣＡＧ ＣＡＧ ＣＴＣ ＣＣＡ ＧＧ（配列番号：５１）
Ｍｆｅｌａｍ ２ ＧＴＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＣ ＡＡＴ ＴＧＧ ＴＡＣ ＣＡＡ ＣＡＧ ＣＡＣ ＣＣＡ ＧＧ（配列番号：５２）
Ｍｆｅｌａｍ ３ ＧＴＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＣ ＡＡＴ ＴＧＧ ＴＡＣ ＣＡＧ ＣＡＧ ＡＡＧ ＣＣＡ ＧＧ（配列番号：５３）
Ｍｆｅｋａｐ１ ＧＴＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＣ ＡＡＴ ＴＧＧ ＴＡＴ ＣＡＧ ＣＡＧ ＡＡＡ ＣＣＡ ＧＧ（配列番号：５４）
Ｍｆｅｋａｐ２ ＧＴＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＣ ＡＡＴ ＴＧＧ ＴＡＣ ＣＴＧ ＣＡＧ ＡＡＧ ＣＣＡ ＧＧ（配列番号：５５）
Ｍｆｅｋａｐ３ ＧＴＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＣ ＡＡＴ ＴＧＧ ＴＡＣ ＣＡＧ ＣＡＧ ＡＡＡ ＣＣＴ ＧＧ（配列番号：５６）
これらのセンス鎖順方向プライマーを使って、ファージディスプレイベクターのＮｈｅ１／Ｎｏｔ１部位に事前挿入されているライブラリー由来のＶＬ遺伝子のレパートリーを増幅した（図１に示すように）。導入されたＭｆｅ１部位は下線を引き、Ｍｆｅｌａｍ１およびＭｆｅｋａｐ１の配列は、それぞれ、図３Ｅおよび３ＦのＦＷ２の初めに示されている。カッパ軽鎖に対しては、単一の逆方向プライマー（ＪＫＦＯＲ＿Ｔｈｒ２）を設計した。これは、ファージミドベクターに対する相同性を含むＮｏｔ１を包含する元のクローニング連結部ならびに挿入されたＪカッパセグメントの先頭にまでカバーした。ラムダ軽鎖に対しては、単一のプライマー（ＪＬＦＯＲＱＰ２）を設計した。これは、ファージミドプラスミド配列内の、Ｎｏｔ１クローニング部位をまたいで、Ｊラムダセグメントの先頭までにハイブリダイズした。
ＪＬＦＯＲＱＰ２ ＴＧＡＧＡＴＧＡＧＴＴＴＴＴＧＴＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＧＣＴＧＡＣＣＴＡＧ（配列番号５７）
ＪＫＦＯＲ＿Ｔｈｒ２ ＴＧＡＧＡＴＧＡＧＴＴＴＴＴＧＴＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＴＡＣＧＴＴＴＧＡＴ（配列番号５８）
対でのカッパまたはラムダ順方向および逆方向プライマーを用いた増幅により、下記をコードするＰＣＲ産物を生成した。
Ｍｆｅ１－ＦＷ２－ＣＤＲ２－ＦＷ３－ＣＤＲ３－ＦＷ４－Ｎｏｔ１（配列番号５９）。
プライマーは、上記ノッチンＰＣＲ産物および図１に示すファージミドディスプレイベクターに適合性があり、インフレームのＭｆｅ１部位を５’末端に、およびＮｏｔ１部位を３’末端に導入する。これは、制限酵素Ｍｆｅ１およびＮｏｔ１を用いて、ＣＤＲ１でのノッチン挿入物をコードする構築物に融合できるＶＬ遺伝子のライブラリーの増幅を可能とするであろう。これは、レシピエントＶＬドメインに追加のＣＤＲ２およびＣＤＲ３多様性を導入する。ＪＬＦＯＲＱＰ２およびＪＫＦＯＲ＿Ｔｈｒ２は、アンチセンス逆方向プライマーであり、センス鎖をコードする逆相補配列は最終的構築物のＦＷ４－Ｎｏｔ１領域として、図３Ｃ、３Ｄ、３Ｅおよび３Ｆにそれぞれ示されている。
フレームワーク３で始まるＶＬレパートリーの増幅
類似の手法により、ラムダＶＬ遺伝子（「Ｂｓｐｌａｍ」プライマー）またはカッパ（「Ｂｓｐｋａｐ」プライマー）ＦＷ３の先頭部分とハイブリダイズし、同時に、上記ノッチン構築物中に導入されたＢｓｐＥ１部位と適合するＢｓｐＥ１制限酵素部位を導入するセンス鎖順方向プライマーを設計した。導入されたＢｓｐＥ１部位は下線を引き、Ｂｓｐｌａｍ１ａおよびＢｓｐｋａｐ１ａの配列は、それぞれ、図３Ｅおよび３ＦのＦＷ３の初めに示されている。
Ｂｓｐｌａｍ１ａ ＡＴＣＴＡＴＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＧＴＧＧＣ ＴＣＣ ＧＧＡ ＧＴＣ ＴＣＴ ＧＡＣ ＣＧＡ ＴＴＣ ＴＣＴ ＧＧ （配列番号６０）
Ｂｓｐｌａｍ１ｅ ＡＴＣＴＡＴＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＧＴＧＧＣ ＴＣＣ ＧＧＡ ＧＴＣ ｃＣＴ ＧＡＣ ＣＧＡ ＴＴＣ ＴＣＴ ＧＧ （配列番号６１）
Ｂｓｐｌａｍ２ ＡＴＣＴＡＴＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＧＴＧＧＣ ＴＣＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＡＡＧ ＴＣＴ ＧＧＣ ＡＡＣ ＡＣＧ ＧＧ （配列番号６２）
Ｂｓｐｌａｍ３ ＡＴＣＴＡＴＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＧＴＧＧＣ ＴＣＣ ＧＧＡ ＡＴＣ ＣＣＴ ＧＡＧ ＣＧＡ ＴＴＣ ＴＣＴ ＧＧ （配列番号６３）
ＢｓｐＫａｐ１ａ ＡＴＣＴＡＴＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＧＴＧＧＣ ＴＣＣ ＧＧＡ ＧＴＣ ＣＣＡ ＴＣＡ ＡＧＧ ＴＴＣ ＡＧＴ ＧＧ （配列番号６４）
ＢｓｐＫａｐ１ｂ ＡＴＣＴＡＴＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＧＴＧＧＣ ＴＣＣ ＧＧＡ ＧＴＣ ＣＣＡ ＴＣＡ ＡＧＧ ＴＴＣ ＡＧＣ ＧＧ （配列番号６５）
ＢｓｐＫａｐ２ ＡＴＣＴＡＴＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＧＴＧＧＣ ＴＣＣ ＧＧＡ ＧＴＣ ＣＣＡ ＧＡＣ ＡＧＧ ＴＴＣ ＡＧＴ ＧＧ （配列番号 ６６）
ＢｓｐＫａｐ３ ＡＴＣＴＡＴＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＧＴＧＧＣ ＴＣＣ ＧＧＡ ＡＴＣ ＣＣＡ ＧｃＣ ＡＧＧ ＴＴＣ ＡＧＴ ＧＧ （配列番号６７）
ラムダ特異的逆方向プライマー（ＪＩＦＯＲＱＰ２）と共にラムダ特異的順方向プライマーを使用する場合、またはカッパ特異的逆方向プライマー（ＪＬＦＯＲ＿Ｔｈｒ２）と共にカッパ特異的順方向プライマーを使用する場合、以降で配列をコードするＰＣＲ産物が産生される。
ＢｓｐＥ１－ＦＷ３－ＣＤＲ３－ＦＷ４－Ｎｏｔ１
これは、制限酵素ＢｓｐＥ１およびＮｏｔ１を使用することにより、ＣＤＲ２にノッチン遺伝子挿入物を有する構築物に融合できるＶＬ遺伝子のライブラリーの増幅を可能にした。これは、レシピエントＶＬドメイン中に追加のＣＤＲ３多様性を導入した。
標準的分子生物学技術を用いて、上述のようにして作成した遺伝子断片を使って、構築物（図３に示すように）を作成した。これらをｐＩＯＮＴＡＳ１＿ＫＢ＿ＫａｐｐａおよびｐＩＯＮＴＡＳ１＿ＫＢ＿ｌａｍｂｄａ中に挿入し、大腸菌ＴＧ１細胞中に電気穿孔により遺伝子導入し、例えば、Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ ２００７２８の標準的分子生物学技術を使って、３．５～６．６ｘ１０８のサイズのＫｎｏｔＢｏｄｙライブラリーを構築した。
実施例３：ファージディスプレイ技術を用いたＫｎｏｔＢｏｄｙライブラリー由来の機能性ノッチン抗体融合体クローンの単離および特性評価
ファージディスプレイ技術は、繊維状ファージ１０５の表面上に提示され得るタンパク質およびペプチドをベースにした大きなコンビナトリアルレパートリーからのいずれか所定の標的に対する結合物質の単離を容易にする。ＫｎｏｔＢｏｄｙライブラリーから機能性ノッチン抗体融合体を単離するために、トリプシン（ＥＥＴＩ－ＩＩドナーに対する同族抗原）に対する複数ラウンドのファージディスプレイ選択を実施した。トリプシン切断可能なヘルパーファージ１０２，１０６を使って、ＫｎｏｔＢｏｄｙライブラリーをレスキューすることにより、ストレプトアビジン（ラウンド１に対し）またはニュートラアビジン（ラウンド２に対し）コートＭａｘｉｓｏｒｐ（商標）免疫チューブ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号４４４２０２）に固定された１０μｇ／ｍｌビオチン化トリプシンに対し、２ラウンドのファージディスプレイ選択を実施した。選択の両ラウンドにおいて、ファージライブラリーをストレプトアビジンコート常磁性ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１１２０５Ｄ）と共にプレインキュベートした。これらのビーズをファージの抗原チューブに添加する前に除去し、ストレプトアビジン結合物質が選択物質中に入るのを制限した。時間分解蛍光法（ＴＲＦ）結合アッセイを使って、ラウンド２選択産物からのポリクローナルファージ調製物のトリプシン結合の分析を行った。このアッセイでは、ニュートラアビジン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号３１０００）コートＭａｘｉｓｏｒｐ（商標）プレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号４３７１１１）に固定されたビオチン化トリプシンに対するポリクローナルファージ結合を、マウス抗Ｍ１３抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号２７－９４２０－０１）、続いて、ユーロピウム標識抗マウス抗体（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号ＡＤ０１２４）を使って検出した。
このアッセイでは、両ＥＥＴＩ－ＩＩライブラリー由来のポリクローナルファージは、トリプシンに対する良好な結合を示し、トリプシンに結合するＫｎｏｔＢｏｄｙの濃縮におけるファージディスプレイ選択の成功を実証した（図４）。標準的ファージディスプレイ手法によるＥＥＴＩ－ＩＩの提示が、機能するかどうかを調べるために、ＥＥＴＩ－ＩＩ遺伝子をファージミドディスプレイベクター２８中に挿入し、これをｇｅｎｅＩＩＩのＮ－末端に直接融合した。意外にも、ファージ上に提供されたＥＥＴＩ－ＩＩは、直接Ｎ－末端ｇｅｎｅ－ＩＩＩ融合体として、検出可能なトリプシンに対する結合を示さず、一方で、両ＥＥＴＩ－ＩＩ ＣＤＲ融合体ライブラリーから選択されたポリクローナルファージは、トリプシン結合を示した。重要なのは、この結果が、抗体ＣＤＲループ（これはｇｅｎｅ－ＩＩＩに融合されている）を介したノッチンファージ上への間接的提示が、直接ノッチン－ｇｅｎｅＩＩＩ融合より優れた選択肢であり得ることを示すことである。
所望の結合特性を有するモノクローナルＫｎｏｔＢｏｄｙを特定するために、ＥＥＴＩ－ＩＩ ＣＤＲ１またはＣＤＲ２ライブラリーを使った２ラウンドの選択由来の９４個の個別クローンを９６ウェル培養プレートに採取し、それぞれのクローンからファージを調製した。モノクローナルファージＥＬＩＳＡによりスクリーニングする方法は、当技術分野において既知である１０７。それぞれのクローン由来のファージ上清の、ニュートラアビジンコートＭａｘｉｓｏｒｐ（商標）プレートに固定したビオチン化トリプシンに対する結合を、ＴＲＦアッセイ（上述のように）を使って試験した。モノクローナル結合アッセイの代表的例を図５に示す。上記バックグラウンドの３倍を超える結合シグナルを有するクローンを陽性クローンとして採取し、配列決定して、特有のクローンを特定した。１４および４２個の特有の結合物質を、ＥＥＴＩ－ＩＩ ＣＤＲ１およびＥＥＴＩ－ＩＩ ＣＤＲ２ライブラリーからそれぞれ特定した（表１）。ＥＥＴＩ－ＩＩ ＣＤＲ２ライブラリーからの１８個の結合物質およびＥＥＴＩ－ＩＩ－ＣＤＲ１からの３個の結合物質を、それらのＶＬおよびリンカー配列多様性に基づくさらなる特性評価のために選択した。これらの結合物質を新規クローン識別番号に割り付けた（表２）。
ＥＥＴＩ－ＩＩのトリプシン結合能力は、そのループ１（ＧＣＰＲＩＬＭＲＣ；配列番号６８）に存在するプロリン（Ｐｒｏ３）およびアルギニン（Ａｒｇ４）に起因する。選択ＫｎｏｔＢｏｄｙが、ＶＬ ＣＤＲ融合体として提示される完全に折り畳まれたＥＥＴＩ－ＩＩトリプシンに結合することを示すために（すなわち、その他のＣＤＲループまたはＣもしくはＮ末端融合体配列を介してではなく）、ＥＥＴＩ－ＩＩのトリプシン結合残基（Ｐｒｏ３およびＡｒｇ４）をそれぞれ、グリシン（Ｇｌｙ）およびアラニン（Ａｌａ）と置換した。２１個の選択したクローンおよびそれらの変異等価物からモノクローナルファージを調製した。それぞれのクローン由来のファージ上清の、（ストレプトアビジンコートＭａｘｉｓｏｒｐ（商標）プレートに固定した）ビオチン化トリプシンに対する結合を、ＴＲＦ結合アッセイ（上述のように）を使って試験した。ＥＥＴＩ－ＩＩのトリプシン結合残基の置換は、全てのＫｎｏｔＢｏｄｙクローンのトリプシンに結合する能力を消滅させた（図３）。トリプシン結合の減少がｐＩＩＩの発現またはディスプレイの低減が原因ではないことを確認するために、１１個の（ランダムに選択した）ＫｎｏｔＢｏｄｙおよびそれらのＧｌｙＡｌａバリアントから調製した融合ファージを、ｇｅｎｅ３（ｐＩＩＩ）の産物を認識する抗体の抗ｐＩＩＩ抗体（ＭｏＢｉＴｅｃ ＧｍｂＨ）を使ってウェスタンブロットで分析した（図６）。任意のＫｎｏｔＢｏｄｙクローンとそのＧｌｙＡｌａ置換バリアントとの間で、提示されたｐＩＩＩ融合体の量の有意差は観察されなかった。これらのデータは、これらのＫｎｏｔＢｏｄｙのトリプシン結合機能は、ノッチンドナー（ＥＥＴＩ－ＩＩ）のＶＬ ＣＤＲ融合体としての適切なディスプレイの結果として生じたものであることを確証し、トリプシン結合が、ＥＥＴＩ－ＩＩノッチンドナーにより誘導されることを確証している。
実施例４：ＥＥＴＩ－ＩＩ ＣＤＲ２ライブラリーから選択されたＫｎｏｔＢｏｄｙの結晶構造
ＫｎｏｔＢｏｄｙの結晶構造を生成するために、ＥＥＴＩ－ＩＩ ＣＤＲ２ライブラリー（表３）から単離した１８個のクローンをＦａｂとして再フォーマットした。このフォーマットでは、ＶＨ（Ｄ１Ａ１２由来）遺伝子をヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）に融合し、ＥＥＴＩ－ＩＩを含むレシピエントＶＬ鎖を軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）に融合する。哺乳動物細胞における一時的発現による抗体発現方法は、当業者に周知である１０８。哺乳動物細胞中のこれらのＫｎｏｔＢｏｄｙ Ｆａｂの発現を可能とするために、プライマーＬＬＩＮＫ２（ＣＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＧＣＴＡＧＣ；配列番号６９）およびＮｏｔＭｙｃＳｅｑ（ＧＧＣＣＣＣＡＴＴＣＡＧＡＴＣＣＴＣＴＴＣＴＧＡＧＡＴＧＡＧ；配列番号７０）を用いてノッチンをコードするＶＬ鎖をＰＣＲ増幅した。増幅したＶＬ遺伝子を制限酵素ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩで消化し、同じ酵素で予め消化したｐＩＮＴ１２ベクター（Ｄ１Ａ１２重鎖をコードする）に連結した。ｐＩＮＴ１２ベクター（図７）は、二重プロモーター発現カセットを有し、それにより重鎖発現がサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーターにより制御され、軽鎖発現が伸長因子１アルファ（ＥＦ１－アルファ）プロモーターにより推進される。
ＨＥＫ－２９３Ｆ細胞中のＫｎｏｔＢｏｄｙ Ｆａｂを発現するために、遺伝子導入品質ＤＮＡをＰｌａｓｍｉｄ Ｐｌｕｓ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号１２９４５）を使って調製した。２４μｇのプラスミドＤＮＡを４８μｇのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と共に２ｍｌのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３発現培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１２３３８－０１８）中で１５分間インキュベートした。インキュベーション後、ＤＮＡ：ＰＥＩ混合物を、１２５ｍｌの組織培養フラスコ中で１ｘ１０６細胞／ｍｌの密度で播種したＨＥＫ－２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｒ７９０－０７）の２０ｍｌに加えた。培養フラスコを３７℃で５日間インキュベートした（５％ＣＯ２、７５％湿度下、８００ｒｐｍで振盪を加えながら）。ＫＢ＿Ａ０３を除いて、全ての遺伝子導入がうまくＫｎｏｔＢｏｄｙ Ｆａｂを発現した。発現したタンパク質を、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＩｇＧ－ＣＨ１親和性マトリックス（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１９４３２０００５）を用いて、製造業者インストラクションに従って細胞培養上清から精製した。精製タンパク質を、２ｘＰＢＳに対して一晩透析し、Ｑｕｉｃｋ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ染色（Ｇｅｎｅｒｏｎ、製品参照番号ＧＥＮ－ＱＣ－ＳＴＡＩＮ）を使って、透析試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で可視化した。代表的例を図８Ａに示す。モノマー状態の精製ＫｎｏｔＢｏｄｙ Ｆａｂを、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ ２．４ｍＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７－１０８９－０１）およびＡｋｔａ Ｐｕｒｉｆｉｅｒシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて分析的サイズ排除クロマトグラフィーにより確認した。全てのＫｎｏｔＢｏｄｙ Ｆａｂが、モノマーＦａｂ種に相当するクロマトグラフプロファイルを示した（図８Ｂ）。
ＦａｂフォーマットのＫｎｏｔＢｏｄｙのトリプシン結合能力を確認するために、ＴＲＦ結合アッセイを使って精製タンパク質のトリプシンへの結合を試験した。このアッセイでは、ＫｎｏｔＢｏｄｙ Ｆａｂ（１０μｇ／ｍｌ、２．４μｇ／ｍｌおよび０．５μｇ／ｍｌでの）の、ビオチン化トリプシン（ストレプトアビジンコートＭａｘｉｓｏｒｐ（商標）プレートに固定された）に対する結合を、マウス抗ＣＨ１抗体、それに続く、ユーロピウム標識抗マウス抗体を用いて、検出した（表４）。
７個のＫｎｏｔＢｏｄｙ（ＫＢ＿Ａ０４、ＫＢ＿Ａ０１、ＫＢ＿Ａ０５、ＫＢ＿Ａ０７、ＫＢ＿Ａ０８、ＫＢ＿Ａ１０、ＫＢ＿Ａ１２）を結晶化用に選択した。これらのクローン用に調製されたＤＮＡを、以前に述べたようにして、５００ｍｌのＨＥＫ－２９３Ｆ細胞に遺伝子導入した。発現したタンパク質を、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＩｇＧ－ＣＨ１親和性マトリックスを用いて精製した。精製したタンパク質を、最初に、市販のｃｒｙｓｔａｌｌｉｓａｔｉｏｎ ｓｃｒｅｅｎ（供給業者から入手）を使って結晶化試験に供した。ＫＢ＿Ａ１２およびＫＢ＿Ａ０５に対し、明確な結晶が容易に得られた。これらの２つのクローンに対する結晶化条件をさらに最適化し、次の条件を使用して回折品質結晶を生成した。０．１Ｍ ＭＥＳ ｐＨ＝６．５、２５％ｗ／ｖ ＰＥＧ ＭＭＥ ２０００および０．１Ｍ Ｔｒｉｓ．Ｃｌ、５０％ ＰＥＧ ＭＭＥ、１０ｍＭ ＮｉＣｌ２。完全な回折データをこれらの結晶に対し、１００Ｋ、液体窒素流下で集めた。収集したデータをＰＲＯＴＥＵＭ２ソフトウェア（Ｂｒｕｋｅｒ）を使って処理した。分子置換法１０９を用い、Ｐｈｅｎｉｘソフトウェアｖ１．８．１－１１６８１１０により、ノッチン融合Ｆａｂ抗体の結晶構造を解析した。得られた構造を、Ｐｈｅｎｉｘ．Ｒｅｆｉｎｅ１１１を使って、さらに精密化した。分子置換用のテンプレートをＰＤＢウェブサイト（ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ、ＰＤＢコード：３Ｇ０４（軽鎖）および３ＱＯＳ（重鎖））からダウンロードした。ＫｎｏｔＢｏｄｙＫＢ＿Ａ１２およびＫＢ＿Ａ０５配列は以下に示した。追加のＡｌａＳｅｒ配列を、クローニングに使用したＮｈｅ１部位から軽鎖のＮ末端に導入する。
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両データセットに対し、分子置換法は成功し、ノッチン融合Ｆａｂの全体的な折り畳み半変化しなかったことを示した。高精密化時（図９）には、ノッチン融合Ｆａｂ抗体は、適切に折り畳まれ、抗体内のノッチン部分のジスルフィドパターンは、正確にＥＥＴＩ－ＩＩ（図１０Ａ）のものと同じであることが明らかであったが、このことは以前に報告されている（ＰＤＢ ＩＤ：１Ｈ９Ｉ）。さらに、ＦａｂからＥＥＴＩ－ＩＩ部分の相対的配置は、重鎖のＣＤＲ領域は他の抗原に対する生じ得る結合のためにアクセス可能であることを示している。ＶＨ ＣＤＲ３残基に対する電子密度の不足（図１０Ｂ）は、この可能性をさらに高める。ＰＤＢ座標
実施例５：ＫｎｏｔＢｏｄｙフォーマットの二重特異的結合能力の実証
２つの異なる標的抗原に結合できる二重特異的抗体の概念は、薬物開発においてますます一般的になってきている１１２。従来の二重特異的抗体は通常、異なる特異性を有する２つのＶＨ－ＶＬ対（すなわち、それぞれ異なる抗原を認識する２つのＶＨ－ＶＬ対）から構成されている。この実施例では、我々は、二重特異的ＫｎｏｔＢｏｄｙフォーマットの開発について記載する。このフォーマットでは、２つの別々の抗原の認識に必要な結合決定基は、単一のＶＨ－ＶＬ対内に組み込まれる。これは、１つの結合特異性を媒介するＶＨ、および別の結合特異性を媒介するノッチン－ＶＬ融合体を用いて達成された。
ここで、２つの十分特性解析されたＫｎｏｔＢｏｄｙトリプシン結合物質（ＫＢ＿Ａ０７およびＫＢ＿Ａ１２、実施例３を参照）を、二重特異的機能を設計するためのモデル足場として使用した。これらのＫｎｏｔＢｏｄｙは、Ｄ１Ａ１２抗体（抗ＴＡＣＥ抗体）１０１由来の共通の重鎖遺伝子およびＥＥＴＩ－ＩＩをＣＤＲ２融合体として提示する、２つの別々の軽鎖遺伝子を含む。これらのＫｎｏｔＢｏｄｙのトリプシン結合能力は、ＥＥＴＩ－ＩＩを提示しているＶＬドメインに完全に起因する。したがって、これらのレシピエントＶＬ：ドナーノッチンの融合体を、ナイーブＶＨ遺伝子の大きなレパートリー２８と組み換えて、追加のＶＨ媒介結合特異性を有する新規分子を単離できるライブラリーを生成した。
前に記載の研究では、Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄと共同研究者が、ＶＨおよびＶＬ遺伝子レパートリーの中間体抗体ライブラリー２８中への挿入について記載している。この中間体抗体ライブラリーを使って、機能性抗体ファージディスプレイライブラリー（「ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙライブラリー」および「Ｉｏｎｔａｓ抗体ライブラリー」２８）を作成した。ＫｎｏｔＢｏｄｙ重鎖シャッフルライブラリーの構築のために、同じレパートリーのＶＨ遺伝子をこの実施例で使用した。これは、プライマーＭ１３ ｌｅａｄｅｒｓｅｑ（ＡＡＡＴＴＡＴＴＡＴＴＣＧＣＡＡＴＴＣＣＴＴＴＧＧＴＴＧＴＴＣＣＴ；配列番号７５）およびＨＬＩＮＫ３（ＣＴＧＡＡＣＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＣＴＣＧＡ；配列番号７６）を使って、Ｉｏｎｔａｓ抗体ライブラリーバクテリアストック由来のＶＨ遺伝子をＰＣＲ増幅することにより達成された。増幅したＶＨ遺伝子を制限酵素ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩで消化し、同じ酵素で予め消化したｐＩＯＮＴＡＳ１＿ＫＢベクター（ＫＢ＿Ａ０１７およびＫＢ＿Ａ１２軽鎖をコードする）に連結した。連結産物を、ＭｉｎｉＥｌｕｔｅ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２８００４）を使って精製し、大腸菌ＴＧ１細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎ、カタログ番号６０５０２－２）に電気穿孔により遺伝子導入した。実施例３で記載のようにして、このライブラリーからファージをレスキューした１０７。
ＶＨドメインにより媒介される新規結合特異性を有する二重特異的ＫｎｏｔＢｏｄｙを特定するために、５個の異なる抗原（ヒト－ｃＭＥＴ－Ｆｃ融合体、マウス－ＦＧＦＲ４－ＣＤ４融合体、ヒト－ＧＡＳ６－ＣＤ４融合体、ヒト－ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子およびβ－ガラクトシダーゼ）に対し、２ラウンドのファージディスプレイ選択を実施した。ｃＭＥＴ－Ｆｃ、ＦＧＦＲ４－ＣＤ４、ＧＡＳ６－ＣＤ４およびウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ＵＰＡ）をＭａｘｉｓｏｒｐ（商標）免疫チューブに直接固定した。ビオチン化β－ガラクトシダーゼ（ｂｉｏ－Ｂ－ｇａｌ）をストレプトアビジン（ラウンド１）またはニュートラアビジン（ラウンド２）をコートしたＭａｘｉｓｏｒｐ（商標）免疫チューブに間接的に固定した。実施例３に記載のようにして、ファージ選択を実施した。ラウンド２選択産物から調製したポリクローナルファージを、５個全ての抗原、トリプシンおよび固定化パートナー（ストレプトアビジンおよびニュートラアビジン）に対しＴＲＦ結合アッセイで試験した（実施例３に記載のように）。全てのポリクローナルファージ集団は、トリプシンおよびそれらが選択された抗原に対して特異的結合を示したが、他の抗原に対しては特異的結合を示さなかった（図１１）。例えば、ｃＭＥＴ－Ｆｃ選択物から調製されたポリクローナルファージに対して得られた結合シグナルは、トリプシンおよびｃＭＥＴに対して特異的であった。この結果は、二重特異的結合物質の濃縮が、ファージディスプレイ選択により首尾よくできることを示す。モノクローナル結合物質を特定するために、４８個の個別クローンをそれぞれの選択産物から採取し、モノクローナルファージをそれぞれのクローンから調製した（実施例３で記載のようにして）。それぞれのクローンからのモノクローナルファージ上清の、トリプシンおよび選択に使用した抗原に対する結合を試験した（選別の代表的例を図１２に示す）。トリプシンおよび選択抗原の両方に対し、１５０００蛍光単位を超える結合シグナルを示したいずれのクローンも、二重特異的結合物質であると見なされた。大きな二重特異的結合物質集団をそれぞれの選択産物から特定した（表５）。
実施例６：ＫｎｏｔＢｏｄｙフォーマットの二重エビトープ結合能力の実証
前に記載の実施例では、我々は、ノッチン足場が、１つはレシピエント－ドナー融合体（すなわち、ＶＬ－ノッチン）上にある、もう１つはＶＨ上にある、別々のパラトープを介して２つの異なる抗原に結合する能力を示した。同じ原理は、単一の標的抗原内の２つの異なるエピトープを標的とするように適用でき、この場合、ＶＨ誘導結合は、元の相互作用（ノッチンにより媒介される）の親和性および／または特異性を高めるために使用し得る。この手法により、ＶＨドメインの追加の結合特性を利用して、ノッチンベース薬物の効力または特異性を改善できる。あるいは、結合に対するこのような追加の寄与は、実施例２に記載の手法を使って、ＶＬ ＣＤＲ３によっても誘導され得る。この実施例では、我々は、独立にトリプシンに結合する新規重鎖パートナーを導入して、抗トリプシンＫｎｏｔＢｏｄｙ（ＫＢ＿Ａ０７およびＫＢ＿Ａ１２、実施例３参照）の親和性を改善することにより、ノッチン足場の二重エピトープ結合能力を示した。
ＫＢ＿Ａ０７およびＫＢ＿Ａ１２は、腫瘍壊死因子－α変換酵素１０１のｄｉｓ－ｃｙｓドメインに結合する共通のＶＨドメイン（Ｄ１２）およびＥＥＴＩ－ＩＩを介してトリプシンに結合するＶＬドメイン（ＣＤＲ２位置で提示される）を含む。トリプシン上の別々のエピトープに結合する（および全体的な親和性を改善する）新規重鎖パートナーを特定するために、これらの２つのＫｎｏｔＢｏｄｙのＤ１Ａ１２ ＶＨを、ナイーブ重鎖の大きなレパートリーで置換することにより、ファージディスプレイライブラリーを生成した（実施例５参照）。親和性改善クローンを、高親和性クローンの選択濃縮に有利な厳密な条件下で、トリプシンに対する３ラウンドのファージディスプレイ選択を実施することにより、この「鎖シャッフル」ライブラリーから単離した。選択の厳密性は、各選択ラウンドで徐々に減っていく量のトリプシンを使って制御した（図１３）。各ラウンドに対する最適な抗原濃度は、一連の抗原濃度に対するＫｎｏｔＢｏｄｙを選択し、ファージ産物数を無抗原コントロールと比較することにより、実験的に決定される。実施例５に記載のように、Ｍａｘｉｓｏｒｂ免疫チューブ上に固定した抗原に対するパニングにより、ラウンド１の選択を実施した。２０ｎＭの抗原濃度で実施したラウンド２選択からの集団を、さらなる第３ラウンドのために選択した。
ラウンド２（２０ｎＭ選択）由来のＫｎｏｔＢｏｄｙ遺伝子およびラウンド３（２ｎＭおよび０．２ｎＭ選択）産物を、プライマーＭ１３ ｌｅａｄｅｒｓｅｑ（実施例４参照）およびＮｏｔＭｙｃＳｅｑ（ＧＧＣＣＣＣＡＴＴＣＡＧＡＴＣＣＴＣＴＴＣＴＧＡＧＡＴＧＡＧ；配列番号７０）を使って、ＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物をＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ制限酵素で消化し、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩを介してｐＢＩＯＣＡＭ５－３Ｆベクターに挿入した。ｐＢＩＯＣＡＭ５－３Ｆは、哺乳動物細胞中で可溶性ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質としての抗体の発現を可能とし１１３、したがって、親和性改善ＫｎｏｔＢｏｄｙ結合物質のスクリーニングを促進する。３５２個のクローン（ｐＢＩＯＣＡＭ５－３Ｆクローニングから得た）を４ｘ９６ウェル場時用プレート中に採取した。Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｌｕｓ９６キット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号１６１８１）を用いて、それぞれのクローンのために、遺伝子導入品質のプラスミドＤＮＡを調製した。６００ｎｇのそれぞれのプラスミドＤＮＡを１．４４μｇのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と共にＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３Ｆ発現培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｒ７９０－０７）中で１５分間インキュベートした後、１ｘ１０６細胞／ｍｌの濃度の５００μｌ／ウェルの指数増殖期ＨＥＫ－２９３Ｆ細胞を含む９６ウェル深いウェルプレートに加えた。プレートを気相透過性シールで密閉し、３７℃で５日間インキュベートした（５％ＣＯ２、７５％湿度下、８００ｒｐｍで振盪を加えながら）。ＫｎｏｔＢｏｄｙ－ＦＣ融合タンパク質を含む細胞培養上清を使ってスクリーニングし、親和性改善クローンを特定した。
一次結合選別（例えば、モノクローナルファージ上清を用いたＴＲＦ結合アッセイ）において、特定のクローンに対し観察される結合シグナルは、親和性と発現の組み合わせ関数である。タンパク質発現はクローン毎に大きく変化するので、一次選別におけるそれらの結合シグナルによるＫｎｏｔＢｏｄｙの順位付けは、それらの親和性とは相関するとは限らない。したがって、２種の発現非依存性スクリーニングアッセイを使用して、ＫｎｏｔＢｏｄｙクローンの親和性による順位付けを行い、それらを親クローンと比較した。それらは，（ｉ）ＴＲＦキャプチャーアッセイおよび（ｉｉ）Ｂｉａｃｏｒｅオフレート選別、であった。「ＴＲＦキャプチャーアッセイ」（図１４）では、ＫｎｏｔＢｏｄｙ－ｓｃＦｖ－Ｆｃが、抗Ｆｃ抗体（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ１１３６３６）をコートしたＭａｘｉｓｏｒｐ（登録商標）プレート上に捕捉され、ＫｎｏｔＢｏｄｙに対するビオチン化トリプシンの結合は、ストレプトアビジン標識ユーロピウム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号１２４４－３６０）を用いて検出される。ＫｎｏｔＢｏｄｙ（ｓｃＦｖ－Ｆｃ）発現の差異を正規化するために、限定量の抗Ｆｃ抗体を各ウェルにコートした。例えば、２．５μｇ／ｍｌ（３２ｎＭ）の濃度の５０μｌの抗Ｆｃ抗体でコートしたウェルは、１．６ｆｍｏｌｅのｓｃＦｖ－Ｆｃの最大（理論的）捕捉容量であった。しかし、ｐＢＩＯＣＡＭ５－３Ｆベクター系［ベクトル系］を用いたＨＥＫ－２９３Ｆ細胞中の平均ｓｃＦｖ－Ｆｃ発現は、１０～２０ｍｇ／ｌ（８３～１６６ｎＭ）であり、また、５０μｌのアッセイに使用した生の上清は、平均で４．１～８．２ｆｍｏｌｅのｓｃＦｖ－Ｆｃを有し、したがって、各ウェル上にコートした固定抗Ｆｃ抗体を飽和させていることになる。ＶＨシャッフルライブラリーから選択したＫｎｏｔＢｏｄｙの大部分は、トリプシンに対し、親クローン（代表的例を図１５に示す）より高い結合シグナルを示した。キャプチャーアッセイで最高の結合シグナルを示した９０個のＫｎｏｔＢｏｄｙの鋳物だけを選択して採取し、「Ｂｉａｃｏｒｅオフレート選別」で試験した。「Ｂｉａｃｏｒｅオフレート選別」では、ＫｎｏｔＢｏｄｙクローンの解離定数（オフレート）を表面プラズモン共鳴法（ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅからのＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００を使って）により解析した。抗体－抗原相互作用の解離定数は、濃度から独立し、従って、発現の差異に対して正規化は必要ない。このアッセイでは、ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ－１００５－３０）を約３０００共鳴単位（ＲＵ）の抗Ｆｃ抗体（ヒト抗体キャプチャーキット、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ－１００８－３９）に結合した。約１２００～１６００ＲＵのＫｎｏｔＢｏｄｙ－ｓｃＦｖ－Ｆｃを抗Ｆｃ抗体で捕捉した。トリプシン溶液（４００ｎＭ）を６０秒間注入した。それぞれのＫｎｏｔＢｏｄｙトリプシン相互作用の解離相を３００秒間モニターした。各サイクルの後で、３ＭのＭｇＣｌ２を注入することにより、チップ表面を再生した。１：１のラングミュア結合モデルを使用して（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００評価ソフトウェアを使用）、それぞれのＫｎｏｔＢｏｄｙの解離定数（ｋｄ）を決定した。親クローンより１．５倍遅い解離定数を示すクローンを、改善された親和性を有すると見なした（表６）。全体として、キャプチャーアッセイおよびオフレート選別を使用して、２２個の親和性が改善したクローンを特定した。親クローンに比べて、改善したオフレートを示すクローンの代表例を図１６に示す。重鎖シャッフリングによるＫＢ＿Ａ０７およびＫＢ＿Ａ１２クローンのこの親和性の改善は、ＫｎｏｔＢｏｄｙフォーマットの二重エピトープ結合能力を示す。
実施例７：抗体ＶＬレシピエント足場のＣＤＲ３内の種々のシステインリッチ毒素ドナーのクローニング、発現および精製
正常なイオンチャネル機能動作における異常は、疼痛性障害および自己免疫疾患を含む多くの病状の発病に関与している。例えば、電位開口型ナトリウムチャネル１．７（Ｎａｖ１．７）の機能における欠陥は、疼痛に対する過敏症および非感受性の両方において大きな役割を果たしている。電位開口型カリウムチャネル１．３（Ｋｖ１．３）は、Ｔ細胞媒介自己免疫に結びつけられている。酸感受性イオンチャネル１ａ（ＡＳＩＣ１ａ）は、疼痛シグナルの検知および処理に関与している。したがって、イオンチャネルの特異的モジュレーターは、疼痛および種々の自己免疫障害の処置において、大きな治療可能性を提供する。多くの天然ノッチンは、イオンチャネルブロッキング毒素として機能する。前で考察のように、治療薬として承認されたノッチンベース薬物（Ｚｉｃｏｎｏｔｉｄｅ）のみが、イモガイの毒液から誘導されたＮ型電位開口型カルシウムチャネルブロッカーである。
本実施例は、イオンチャネルに向けたＫｎｏｔＢｏｄｙを生成するために、以前に選択したレシピエントＶＬへの代替システインリッチ毒素ドナーの融合について記載する（表７）。これは、３つのＮａｖ１．７ブロッカー、３つのＫｖ１．３ブロッカーおよび３つの酸検知イオンチャネル１ａ（ＡＳＩＣ１ａ）ブロッカーの、２つのＫｎｏｔＢｏｄｙ ＫＢ＿Ａ０７およびＫＢ＿Ａ１２のＣＤＲ２位置への挿入により（実施例３に記載のように、その位置のＥＥＴＩ－ＩＩ遺伝子を置換することにより）達成された。全ての毒素をコードする遺伝子（表８）を遺伝子断片として合成した（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手）。それぞれの毒素遺伝子を、ＫＢ＿Ａ０７およびＫＢ＿Ａ１２に特異的な接合部配列をコードするプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅した（表９）。追加のＳｓｍ６ａ（Ｓｓｍ６ｓ＿ＧＧＳ）のバリアントを組み込んだリンカー配列（Ｎ末端のＧＧＳおよびＣ末端のＳＧＧ）もＰＣＲ増幅した。この実施例では、ＫｎｏｔＢｏｄｙ構築物をＩｇＧ分子としてフォーマットし、ＶＨ遺伝子をＩｇＧ１重鎖定常ドメイン（ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）に融合し、新規ドナー毒素を含むレシピエントＶＬ鎖を軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）に融合する。これらのＫｎｏｔＢｏｄｙ構築物を哺乳動物細胞中で発現するために、ＰＣＲ断片をＫＢ＿Ａ１２およびＫＢ＿Ａ０７ ＶＬ鎖（ｐＩＮＴ３－ｈｇ１ベクターによりコードされる、図１７）のＰｓｔＩおよびＢｓｐＥＩ部位に挿入した。ｐＩＮＴ３－ｈｇ１ベクターは、二重プロモーター発現カセットを有し、それにより重鎖発現がサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーターにより制御され、軽鎖発現が伸長因子１アルファ（ＥＦ１－アルファ）プロモーターにより推進される。
ＫｎｏｔＢｏｄｙを哺乳動物細胞中で発現するために、遺伝子導入品質ＤＮＡをＰｌａｓｍｉｄ Ｐｌｕｓ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号１２９４５）を使って調製した。６０μｇのプラスミドＤＮＡを１２０μｇのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と共に５ｍｌのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３発現培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１２３３８－０１８）中で１５分間インキュベートした後、１ｘ１０６細胞／ｍｌの濃度で２５０ｍｌの組織培養フラスコに播種したＨＥＫ－２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｒ７９０－０７）の５０ｍｌに加えた。培養フラスコを３７℃で５日間インキュベートした（５％ＣＯ２、７５％湿度下、８００ｒｐｍで振盪を加えながら）。発現したタンパク質を、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィー（タンパク質ＡセファロースはＧｅｎｅｒｏｎから入手、カタログ番号ＰＣ－Ａ５）を用いて、細胞培養上清から精製した。精製タンパク質を、２ｘＰＢＳに対して透析し、Ｑｕｉｃｋ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ染色（Ｇｅｎｅｒｏｎ、製品参照番号ＧＥＮ－ＱＣ－ＳＴＡＩＮ）を使って、透析試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で可視化した。代表的例を図１８に示す。これらのＨＥＫ２９３Ｆ細胞中で融合体分子に対し得られた平均発現レベル（７．７ｍｇ／ｌ）は、同じベクター系を用いて産生した従来の抗体のレベル（４ｍｇ／ｌ）と同等であった。精製後のタンパク質収量を表１０に示す。マンバルジン融合体の場合には、実施例１１に記載のようにＤＮＡをＣＨＯ－ＥＸｐｉ細胞中に遺伝子導入し、これらの収量を得た。
まとめると、この実施例で記載の結果は、（ｉ）イオンチャネルブロッキング毒素は、ＶＬドメインレシピエント（例えば、ＫｎｏｔＢｏｄｙ）との融合体内のドナーとして発現できる；（ｉｉ）ＥＥＴＩ－ＩＩ以外のノッチン足場は、ＫｎｏｔＢｏｄｙとしてフォーマットでき、または換言すれば、ＫｎｏｔＢｏｄｙフォーマットは、複数のノッチンの機能性提示ができる；（ｉｉｉ）これらの融合分子は、ＩｇＧとして発現および精製できる、ことを示している。
実施例８：ＫｎｏｔＢｏｄｙとして発現されたＫｖ１．３およびＡＳＩＣ１ａブロッカーの機能性検証
ＫｎｏｔＢｏｄｙフォーマット（実施例６および７を参照）で発現されたノッチン Ｋｖ１．３およびＡＳＩＣ１ａブロッカーを、イオンチャネル標的の機能を阻害するそれらの能力を試験した。これらのＫｎｏｔＢｏｄｙのヒトＫｖ１．３（ｈｕＫｖ１．３）またはヒトＡＳＩＣ１ａチャネルを発現している細胞に対する効果を、ＱＰａｔｃｈ自動化ホールセルパッチクランプ電気生理学法（Ｓｏｐｈｉｏｎ）を用いて評価した。
Ｋｖ１．３を試験するために、ｈｕＫｖ１．３を安定発現しているＣＨＯ細胞（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂ）を、ＫｎｏｔＢｏｄｙ融合体または抗体アイソタイプ（ネガティブ）コントロールの存在下または非存在下で、ＱＰａｔｃｈ電気生理学アッセイを用いて分析した。内部および外部生理的溶液をアッセイの前に新しく調製した。細胞外溶液には、１４５ｍＭのＮａＣｌ、４ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭヘペスおよび１０ｍＭのグルコースを含め；ｐＨをＮａＯＨで７．４に調節し；モル浸透圧濃度は、約３０５ｍＯｓｍ／Ｌであった。細胞内溶液には、ＫＦ（１２０ｍＭ）、ＫＣｌ（２０ｍＭ）、ヘペス（１０ｍＭ）、ＥＧＴＡ（１０ｍＭ）を含め；ｐＨをＫＯＨで７．２に調節し；モル浸透圧濃度は、約３２０ｍＯｓｍ／Ｌであった。
コントロール（細胞外溶液）を加える場合、一連の脱分極電圧（チャンネル活性化）パルスを使って、チャネル電流をモニターし、現在の活動状態のコントロールベースラインを決定した。これらの測定されたコントロール電流に対し、濃度漸増ＫｎｏｔＢｏｄｙまたは親抗体アイソタイプ（コントロール分子）を、外部浴溶液（２．２μＭ～０．５ｎＭ、細胞外の溶液中に希釈）に適用した。ＫｎｏｔＢｏｄｙ ＫＢ＿Ａ１２およびＫＢ＿Ａ０７（ＥＥＴＩ－ＩＩ融合体）を試験のためのアイソタイプコントロールとして使用した。－８０ｍＶの保持電圧から、＋３０または＋８０ｍＶの分極、活性化電圧パルスを５または１０秒毎に３００ｍｓ間印加した。それぞれの各溶液交換期間に対する活性化ステップ中に測定された、誘発最大外向き電流値を平均化し（適用したそれぞれの濃度に対しｎ＝３～８）、濃度反応曲線としてプロットした。これらの濃度反応曲線（図２１のプロット例を参照）から、ＩＣ５０値を計算した（表１１Ａにまとめた）。ＫＢ＿Ａ０７＿Ｓｈｋ、ＫＢ＿Ａ１２＿ＳｈｋおよびＫＢ＿Ａ０７＿カリオトキシン（ＫＴＸ）融合タンパク質は全て、ｈｕＫｖ１．３電流を濃度依存性的に阻害し、ＩＣ５０は、それぞれ、約２０ｎＭ、４０ｎＭおよび９００ｎＭであった。比較すると、両レシピエント足場上の親ＫｎｏｔＢｏｄｙ、ＫＢ＿Ａ１２、ＫＢ＿Ａ０７，Ｍｏｋａ－１およびＫＢ＿１２上のカリオトキシンは、測定電流の大きな減少を示さず（１０μＭ超まで外挿してほぼ同じＩＣ５０）、これは、同じ期間にわたるコントロール外液添加で作製した電流記録の減少の大きさと類似であった（４種それぞれ４分の時間で、合計１６分の適用）。
ＡＳＩＣ１ａ ＫｎｏｔＢｏｄｙを機能的に評価するために、ｈｕＡＳＩＣ１ａ（Ｓｏｐｈｉｏｎ）を安定発現しているＨＥＫ２９３細胞を、ＫｎｏｔＢｏｄｙ融合体の存在または非存在下で、ＱＰａｔｃｈ電気生理学アッセイを使って解析した（表８に示すように、ＫＢ＿Ａ１２をレシピエントとして使って、元のＥＥＴＩ－ＩＩドナーを置換して）。ＥＥＴＩ－ＩＩドナーを有する「親」ＫＢ＿Ａ１２をネガティブコントロールとして使用した。内部および外部生理的溶液をアッセイの前に新しく調製した。細胞外溶液には、１４５ｍＭのＮａＣｌ、４ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭヘペスおよび１０ｍＭのグルコースを含め；ｐＨをＮａＯＨで７．４（コントロール用、静止状態ｐＨ）、またはＭＥＳで６．０（酸性の活性化状態ｐＨ用）に調節し；モル浸透圧濃度は、約３０５ｍＯｓｍ／Ｌであった。細胞内溶液には、ＣｓＦ（１４０ｍＭ）、ヘペス（１０ｍＭ）、ＮａＣｌ（１０ｍＭ）およびＥＧＴＡ／ＣｓＯＨ（１ｍＭ／５ｍＭ）を含め；ｐＨをＣｓＯＨで７．３に調節し；モル浸透圧濃度は、約３２０ｍＯｓｍ／Ｌであった。
ＡＳＩＣ１ａ記録全体を通して、記録細胞膜電圧は－６０ｍＶにクランプされた。ＡＳＩＣ１ａベースラインコントロール電流は、外液を活性化ｐＨ６．０で３０００ｍｓ適用することにより誘発された。この活性化ｐＨ適用は、さらに３回反復され、４種のベースラインコントロールＡＳＩＣ１ａ電流を得た。その後、記録細胞を外液で希釈したＫｎｏｔＢｏｄｙと共に、ｐＨ７．４で１５～２０分間プレインキュベートした。このＫｎｏｔＢｏｄｙプレインキュベーション後に、外液中の活性化ｐＨ６．０の同じ濃度のＫｎｏｔＢｏｄｙを細胞記録に適用した。
それぞれのＫｎｏｔＢｏｄｙインキュベーションおよびその後のＡＳＩＣ１ａ電流活性化後に、完全ブロッキング濃度（３００ｎＭ）のＡＳＩＣ１ａノッチン阻害剤ＰｃＴｘ１（ポジティブコントロール）を細胞記録上に潅流し、最終活性化ｐＨ６．０外液を適用した。活性化ｐＨ６．０ベースライン（すなわち、プレＫｎｏｔＢｏｄｙインキュベーション）と、ポストＫｎｏｔＢｏｄｙインキュベーションとの間の シグナル残留パーセンテージを測定した。これらの図（表１１Ｂ参照）から、ＫｎｏｔＢｏｄｙ ＫＢ＿Ａ１２＿ＰｃＴｘ１およびＫＢ＿Ａ０７＿ＰｃＴｘ１は活性であり、ＡＳＩＣ１ａ電流を４．８％に低減させ、これは、ＰｃＴｘ１ポジティブコントロール適用で明らかになったのと同じレベル（１．９～３．８％）であることがわかる。ＫＢ＿Ａ１２＿Ｍｂａ－１およびＫＢ＿Ａ１２＿Ｍｂａ－２は、ＫＢ＿Ａ１２ネガティブコントロールまたは「緩衝液のみの」コントロールと同じレベルの電流を示した。
上記データは、治療的可能性を有するノッチン（すなわち、イオンチャネルブロッカー）を、元々異なるノッチン（すなわち、ＥＥＴＩ－ＩＩ）に対する融合に関し選択されたレシピエント抗体足場中に融合する可能性があることを示す。
実施例９：抗体のレシピエントＶＬドメインへの非ノッチンドナーの機能性融合
本実施例は、非ノッチンドナー多様性足場ドメインのレシピエントＶＬドメインへの融合について記載する。ジスルフィド結合を欠く非ノッチンドナー多様性足場ドメインは、ノッチンに対する有用な代替物であり得る。前に考察したように、多くのタンパク質足場が新規結合特異性を目的として設計されてきた３８，１１４。ここで、我々は、ａｄｈｉｒｏｎと呼ばれる小さいタンパク質足場（約、１００個のアミノ酸）を使用する。これは、植物由来フィトシスタチン（システインプロテアーゼのタンパク質阻害剤）のコンセンサス配列に基づいている。ａｄｈｉｒｏｎは高い熱的安定性を示し、大腸菌中でよく発現する４６。それらは構造上ノッチンとは別々であり、なんらシステイン残基を含まない。
我々は、ドナーとして２つの改変ａｄｈｉｒｏｎを選択し、これは、レクチン様酸化低密度リポタンパク質受容体－１（ＬＯＸ－１）に結合し、ＫＢ＿Ａ０７およびＫＢ＿Ａ１２由来のＶＬ鎖（レシピエント）のＶＬ ＣＤＲ２位置のＥＥＴＩ－ＩＩを置換する（実施例３）。これらのａｄｈｉｒｏｎの配列（Ａｄ－ＬＯＸ１－ＡおよびＡｄ－ＬＯＸ１－Ｂと呼ばれる、表１２）を、国際公開第２０１４１２５２９０Ａ１号から得て、合成のままで、遺伝子断片としてクローニング可能であった（表１３）。それぞれのａｄｈｉｒｏｎ遺伝子をＫＢ＿Ａ０７およびＫＢ＿Ａ１２（表１４）に特異的なプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ産物を、ＫＢ＿Ａ１２およびＫＢ＿Ａ０７遺伝子をコードするｐＩＯＮＴＡＳ１＿ＫＢファージディスプレイベクター（図１）のＰｓｔＩおよびＢｓｐＥＩ部位に挿入した。
これらのａｄｈｉｒｏｎ－抗体融合体の機能を試験するために、それぞれのクローンから調製したモノクローナルファージの、ＬＯＸ－１への結合をＴＲＦ結合アッセイで評価した。このアッセイでは、ファージディスプレイａｄｈｉｒｏｎ－抗体融合体のＬＯＸ－１（Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）プレート上に直接固定）結合を、マウス抗Ｍ１３抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、これに続く、ユーロピウム標識抗マウス抗体（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使って検出した。親ＫｎｏｔＢｏｄｙ ＫＢ＿Ａ０７およびＫＢ＿Ａ１２（ＥＥＴＩ－ＩＩ融合体）をコントロールとして含めた。タンパク質ｃＭＥＴ－Ｆｃ、ＧＡＳ６－ＣＤ４、ＦＧＦＲ４－ＣＤ４、ＵＰＡおよびＢ－ｇａｌを使って、非特異的結合を調査した。このアッセイの結果（図１９）は、全てのａｄｈｉｒｏｎ抗体融合体は、特異的にＬＯＸ－１に結合することを示す。親クローン、ＫＢ＿Ａ０７およびＫＢ＿Ａ１２は、ＬＯＸ－１に対する検出可能な結合を示さず、ａｄｈｉｒｏｎ－抗体融合分子により示されるＬＯＸ－１結合がａｄｈｉｒｏｎにより媒介されることを確証する（これらの抗体のＶＬ ＣＤＲ２ループ中に提示される）。
この実施例では、我々は、非ノッチンドナー多様性足場をレシピエントＶＬ足場に挿入して、代替ＫｎｏｔＢｏｄｙフォーマットを生成できることを示した。
実施例１０：ドナー配列の挿入またはドナー、レシピエントもしくはパートナー配列における多様性の導入のためのループ領域の特定
実施例１で記載のドナーノッチン配列のレシピエントＩｇドメインへの挿入方法は、可能なドナー挿入部位としての他の足場の二次構造エレメントを連結する配列の特定に適用できる。
Ｉｇドメインに対しては、フレームワークおよびＣＤＲ表記は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（ＩＭＧＴ）データベースにより記載の通りである。ＩＭＧＴ ｖ３．１．１０に従って、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列のナンバリングは、アミノ酸位置２７～３８、５６～６５および１０５～１１７をそれぞれ占める（全てのＶＨおよびＶＬ配列に対して）。ＦＷ１、ＦＷ２およびＦＷ３残基は、１～２６、３９～５５および６６～１０４を占める。再配置Ｖ遺伝子ＦＷ４の末端は、ＶＨに対して６Ｊセグメント、Ｖカッパに対して５ＪセグメントおよびＶラムダに対して７Ｊセグメントによりコードされる（それぞれのケースで、各ＦＷ４に対し、１１、１０および１０アミノ酸をそれぞれコードする）。
１つの手法では、個々のＣＤＲ全体が除去され、それぞれのＮおよびＣ末端で４個以下のアミノ酸残基のリンカーにより挟まれた組み込まれるドナー配列により置換され得る。別の手法では、一部のＣＤＲ残基が保持され得るが、組み込まれるドナー多様性足場を、レシピエントＩｇの足場に連結する、ＣＤＲ残基を含む残基の合計数が、それぞれの末端で４個のアミノ酸を超えてはいけない（ドナーとレシピエントの間の近接性を保持するために）。さらに別の手法では、接合部の境界での可変フレームワーク残基がドナーまたはレシピエント足場から除去され、一部または全てのアミノ酸を包含するランダム化コドンで置換され得る。ＮおよびＣ末端での全体的な連結（置換フレームワーク残基を除いて）は、４個のアミノ酸を超えてはいけない。
このように設計された融合体をコードする遺伝子または遺伝子集団を当業者に既知の方法を使って生成できる（本明細書の実施例でも例示される）。全て合成遺伝子として作製、または制限酵素消化もしくはＰＣＲから生じた遺伝子断片から生成され、ＰＣＲ構築または連結反応により最終的融合遺伝子中に組み込まれる。遺伝子断片および／またはＰＣＲ産物は、ライゲーション非依存クローニング、Ｇｉｂｓｏｎクローニング、ＮＥＢ Ｂｕｉｌｄｅｒ（ＮＥＢ）または当業者に既知の他の方法で連結できる。得られた遺伝子はその後、上記で考察したように、適切な発現ベクター中に挿入できる。
上記手法は、ＩＭＧＴデータベースを、Ｉｇドメインに対する精選された配列情報源として利用する。上述の同じ手法を使って、既知の構造を有する全てのドメインをカバーし得る。個々のタンパク質構造を記載したｐｄｂファイルへの参照は、元の引用で見つけることができる（例えば、本明細書で引用の文献またはその中の文献）。ＲＣＳＢ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａ ｂａｎｋ（「ｐｄｂサーバー」）は、タンパク質ドメインなどの生体高分子に対する構造的情報への入口である。ＰＤＢＳＵＭを含む構造データにアクセスするための他の情報源が概括されている１１５。また、このようなファイルに付随するデータを使って、３Ｄ構造をみることにより、またはこのようなソフトウェアを実行する１１６ＤＳＳＢまたはウェブサイトなどのソフトウェアを用いることにより、二次構造エレメントの特定が可能となる。この手法を用いて、一次アミノ酸配列上に二次構造的表現を導出し得る。あるいは、構造モデル、または所望のレシピエントドメインと既知の構造を有するオルソログもしくはパラログとの間の直接配列アラインメントを使って、二次構造エレメントを特定し得る。あるいは、二次構造エレメントの予測アルゴリズムを使用し得る。
フィブロネクチン１１７の１０番目のＩＩＩ型細胞接着ドメインの構造を使って、候補レシピエントドメイン内のドナー配列の挿入のための、可能な部位を特定する手法を例示し得る。同じ手法を使って、両ドナー、レシピエントおよびパートナー鎖における多様化を適用し得る領域を特定できる。
一例として、フィブロネクチンの１０番目のＩＩＩ型細胞接着ドメインを記載するｐｄｂファイル（ＦｎＩＩＩ－１０）は、「１ＦＮＡ」である。ｐｄｂファイルを使って（例えば、ｐｄｂサーバー上で見ることにより）、二次構造エレメントの注釈付ＦｎＩＩＩ－１０線形アミノ酸配列を生成できる（図２０Ａ）。ベータ鎖を形成する領域には下線を引き、ドメインの上面にあるそれらに連結する残基は小文字で示されている。さらなる例では、ｇｐ２５１は、ｐｄｂフィル２ＷＭＮで表される構造を有する。二次構造エレメントの線形表現は、図２０Ｂに示されている。ベータ鎖を連結する残基またはベータ鎖－アルファヘリックス接合部は下線を引いている。
小文字で示されるこれらの「連結配列」は、部分的にまたは全体的に置換され、同時に、ドナーとレシピエントとの間の短いリンカーを維持し得る領域を示す。上記で考察したように、フレームワーク残基がレシピエント足場の接合部境界で除去され、一部のまたは全てのアミノ酸を含むランダム化コドンで置換され得る。図２０に示されるこれらの同じ残基はまた、上述のように、多様性の導入に適用可能な部位を表す。
Ｇｐ２は、近接しているＮおよびＣ末端を有する６４個のアミノ酸の小さいタンパク質ドメインであり、従って、この分子はまた、ドナードメイン用の理想的候補でもある。さらに、Ｇｐ２のＮおよびＣ末端は、ドメインの折り畳みに影響することなく切断でき、レシピエントドメインに近接した状態での融合を可能とすることが示された。
実施例１１：選択リンカーは、抗体レシピエントドメイン内でのノッチンドナードメインの機能発現のために必要である
他の研究者により採用された、ドメイン連結のために長い可撓性リンカーを利用するペプチド融合手法とは対照的に、ＫｎｏｔＢｏｄｙフォーマットは、短い非可撓性リンカー配列を用いて、ドナーとレシピエントドメイン間の相対運動を制限する。これは、本発明の重要な側面である。２つの融合構造ドメインの適切な折り畳みを可能とする好適なリンカーを特定するために、我々は、リンカー中に多様性を有するライブラリーを作製する手法を採用した。実施例３および実施例１２では、我々は、ＥＥＴＩ－ＩＩ（ドナードメイン）をＶＬまたはＶＨドメイン（レシピエント）のフレームワーク残基と連結する、選択された短い非可撓性リンカー配列を有するいくつかの機能性ＫｎｏｔＢｏｄｙ分子の単離について記載した。
リンカー選択の重要性を示すために、２つのよく特徴付けられたＫｎｏｔＢｏｄｙ、ＫＢ＿Ａ０７およびＫＢ＿Ａ１２の選択された短いリンカーを、長い可撓性ＮおよびＣ末端リンカー（他の研究者により通常使われるリンカー１１，１３，１５）で置換した（表１５参照）。その後、これらのリンカーバリアントの性能を、トリプシン結合アッセイを用いてライブラリーから選択された短い非可撓性リンカーを有する元のＫｎｏｔＢｏｄｙの性能と比較した。
この実施例では、ＫｎｏｔＢｏｄｙバリアントをＦａｂとしてフォーマットし、ＶＨ遺伝子を重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）に融合し、ＫｎｏｔＢｏｄｙリンカーバリアントを含むＶＬ鎖を軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）に融合する。ノッチンおよびリンカー配列をコードするＶＬ遺伝子を、遺伝子断片として合成した（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、表１６参照）。哺乳動物細胞中でＫｎｏｔＢｏｄｙリンカーバリアントを発現させるために、これらの遺伝子断片をｐＩＮＴ１２発現ベクター（Ｄ１Ａ１２重鎖をコードする）に、ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩ制限酵素部位を使って挿入した。
ｐＩＮＴ１２ベクター（図７）は、二重プロモーター発現カセットを有し、それにより重鎖発現がサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーターにより制御され、軽鎖発現が伸長因子１アルファ（ＥＦ１－アルファ）プロモーターにより推進される。
ＫｎｏｔＢｏｄｙを哺乳動物細胞中で発現させるために、遺伝子導入品質ＤＮＡをＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ Ｘｔｒａ Ｍｉｄｉ ｐｌｕｓ ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ、カタログ番号７４０４１２．５０）を使って調製した。２５μｇのプラスミドＤＮＡを８０μｇのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＨＯ遺伝子導入試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ２９１２９）と共に２ｍｌのＯｐｔｉＰＲＯ無血清培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１２３０９０５０）中で５分間インキュベートした後、１２５ｍｌの組織培養フラスコ中で６ｘ１０６細胞／ｍｌの密度で播種したＥｘｐｉ－ＣＨＯ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ２９１３３）の２５ｍｌを加えた。培養フラスコを、遺伝子導入の１８～２２時間後に単回のフィードを加え、３７℃で７日間インキュベートした（５％ＣＯ２、７５％湿度下、８００ｒｐｍで振盪を加えながら）。フィードには、１５０μｌのエンハンサー溶液を含む６ｍｌのＥｘｐｉＣＨＯフィードを含めた。細胞培養上清由来の発現タンパク質を、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＩｇＧ－ＣＨ１親和性マトリックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１９４３２０００５）を用いて、製造業者のインストラクションに従い精製した。精製タンパク質を、２ｘＰＢＳに対して一晩透析した。２８０ｎｍの吸光度および理論的吸光係数を使って、タンパク質濃度を決定した。
短いリンカーと長いリンカーを有するＫｎｏｔＢｏｄｙの性能を比較するために、精製されたＦａｂのトリプシンに対する結合をＥＬＩＳＡによりを試験した。このアッセイでは、ＫｎｏｔＢｏｄｙ Ｆａｂ（０．５μｇ／ｍｌの濃度）の、ビオチン化トリプシン（５μｇ／ｍｌ、ストレプトアビジンコートＭａｘｉｓｏｒｐ（商標）プレートに固定）に対する結合を、マウス抗ＣＨ１抗体（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、それに続く、ユーロピウム標識抗マウス抗体（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号ＡＤ０１２４）を用いて検出した。短い選択リンカーを長い可撓性リンカーで置換した場合、ＫＢ＿Ａ０７およびＫＢ＿Ａ１２ ＫｎｏｔＢｏｄｙのトリプシン結合能力は、大きく低下した。この実施例は、最適ドナー－レシピエント融合体を生成するための、短い非可撓性リンカーの重要性を明確に示した。
実施例１２：ドナー相互作用ドメインをランダム化することによるドナードメイン中への多様性の導入
実施例５および６は、ＫｎｏｔＢｏｄｙの結合パートナードメイン内に配列多様性を生成して、追加の特異性または改善された結合動力学を有するバリアントを選択するためのＶＨシャッフリングの使用を示した。両実施例では、パートナードメイン（ＶＨドメイン）に対して多様化を実施し、ドナードメイン（ノッチン）の元の結合特異性は変化しなかった。実施例２および３では、我々は、ＶＬレシピエントドメインへの多様性の導入を示した。この実施例では、我々は、ＫｎｏｔＢｏｄｙのドナードメイン中の配列多様性の導入に対する異なる手法：ドナーノッチン中の既存のループを、ランダムアミノ酸配列で置換する手法を示す。この特許で記載のＫｎｏｔＢｏｄｙのトリプシン結合能力は、ノッチンＥＥＴＩ－ＩＩのループ１配列（ＰＲＩＬＭＲ）により付与された。ここで、我々は、ＫＢ＿Ａ１２ ＫｎｏｔＢｏｄｙのループ１配列を可変長さ（６、８、９および１０個の残基）のランダム化配列で置換して、多様性ならびに可能な結合表面を増大させた。その後、得られたループライブラリーを使い、ファージディスプレイ技術を用いて、ｃＭＥＴおよびβ－ガラクトシダーゼ結合特異性を生成した。
高比率でループが置換されたバリアントを有する大きなファージディスプレイライブラリーを生成するために、Ｋｕｎｋｅｌ変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４，３６７－３８２（１９８７））を使ったオリゴヌクレオチド指定突然変異手法、および選択的ローリングサークル増幅（Ｈｕｏｖｉｎｅｎ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７，ｅ３１８１７（２０１２））を使用した。使用したオリゴヌクレオチドは、所定の位置に、１６個のアミノ酸（システイン、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニン、および停止コドンを除く）をコードする、ＶＮＳコドン（Ｖ＝Ａ／Ｃ／Ｇ、Ｎ＝Ａ／Ｇ／Ｃ／ＴおよびＳ＝Ｇ／Ｃ）をコードした。使用したアンチセンス鎖（Ｂ＝ＴＧＣの場合）を表す変異誘発性オリゴヌクレオチドは、表１８に示した。
ＫＢ＿Ａ１２をコードするテンプレートＤＮＡ（ファージディスプレイベクター、ｐＳＡＮＧ４２８中で）を、大腸菌ＣＪ２３６（ｄｕｔ－／ｕｎｇ－株）からレスキューしたファージから、ウラシル含有単鎖ＤＮＡ（ｄＵ－ｓｓ ＤＮＡ）として精製した。上記アンチセンスオリゴヌクレオチドをｄＵ－ｓｓＤＮＡテンプレートとアニーリングし、Ｔ７ポリメラーゼを使って伸長して、相補鎖を産生する。変異体鎖を選択的に増幅するために、ランダム六量体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｓ０１４２）およびＰｈｉ２９ポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＥＰ００９１）を用いて、新しく合成したヘテロ二本鎖ＤＮＡをローリングサークル増幅に供した。ＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ ｌａｂｓ、カタログ番号Ｒ３１８９Ｓ）を使って、ローリングサークル増幅産物をプラスミドサイズ単位に切断し、自己連結により再管状化させた。連結産物を、ＭｉｎｉＥｌｕｔｅ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２８００４）を使って精製し、大腸菌ＴＧ１細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎ、カタログ番号６０５０２－２）に電気穿孔により遺伝子導入した。ｋｕｎｋｅｌ変異誘発および選択的ローリングサークル増幅方法は、当業者に既知である。実施例３で記載のようにして、このライブラリーからファージをレスキューした。
新規特異性を有するＫｎｏｔＢｏｄｙループ結合物質を単離するために、Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標））免疫チューブに直接固定したヒトｃＭＥＴおよびβ－ガラクトシダーゼに対し、２ラウンドのファージディスプレイ選択を実施した。実施例３に記載のようにして、ファージ選択を実施した。ラウンド２産物由来のＫｎｏｔＢｏｄｙ ＶＬ遺伝子を、プライマーＬＬＩＮＫ２（配列番号６９）およびＮｏｔＭｙｃＳｅｑ（配列番号７０）を用いてＰＣＲ増幅した。増幅したＫｎｏｔＢｏｄｙ ＶＬ遺伝子を制限酵素ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩで消化し、同じ酵素で予め消化したｐＳＡＮＧ４ベクター（Ｄ１Ａ１２重鎖をコードする）に連結した。連結産物を大腸菌ＴＧ１細胞に形質転換した。モノクローナル結合物質を特定するために、４７個の個別クローンをそれぞれの形質転換産物から採取し、モノクローナルファージをそれぞれのクローンから調製した（実施例３で記載のようにして）。それぞれのクローンからのモノクローナルファージ上清の、ＴＲＦ結合アッセイを用いた選択に使用した抗原に対する結合を試験した。試験した３０／４７クローンがｃ－Ｍｅｔに結合し、３７／４７クローンがβ－ガラクトシダーゼに結合した（図２３）。このアッセイからの結合物質を、プライマーＬＭＢ３（ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣ：配列番号７７）を用いて配列決定した。２３個の特有の配列がｃＭＥＴに対し特定され（表１７Ａ）、１１個の特有の配列がβ－ガラクトシダーゼに対し特定された（表１７Ｂ）。ＥＥＴＩ－ＩＩのループ１の天然の長さは６残基であるが、全ての新規結合物質は、８または９個のアミノ酸のループサイズを有するループライブラリーから単離された。
本実施例は、既存のノッチンループを可変長のランダム配列で置換することにより、追加の多様性をＫｎｏｔＢｏｄｙに導入できることを明確に示している。このループ置換／ランダム化手法を使って、新規特異性を獲得することができ（実施例５に記載のように）、またはドナーまたはレシピエントドメインにより媒介される既存の特異性または親和性を微調整することができる。
実施例１３：受容体介在性トランスサイトーシス（ＲＭＴ）により血液脳関門（ＢＢＢ）を通過可能な二重特異的ＫｎｏｔＢｏｄｙの生成
血液脳関門（ＢＢＢ）の通過は、神経障害（例えば、慢性疼痛、アルツハイマー病、多発性硬化症、てんかん）を処置するためにペプチドおよび抗体を脳に送達する際の主要な課題である。例えば、循環抗体の約０．１％が脳内へ通過する（Ｚｕｃｈｅｒｏ，Ｙ．Ｊ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｎ ８９ ｐ７０－８２（２０１５））。あるいは、ジコノチド（イモガイ毒液由来のノッチン）などの治療薬は、侵入的および高価なクモ膜下腔内注射法を用いて投与される。したがって、分子をＢＢＢを通過して送達するための有効な戦略の開発は、医薬品産業にとって長年にわたる目標となってきた（Ｎｉｅｗｏｅｈｎｅｒ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｎ ８１，４９－６０（２０１４））。近年、この研究の主要注力は、内在性栄養素輸送系、例えば、受容体介在性トランスサイトーシス（ＲＭＴ）を利用することにより、薬物部分にＢＢＢを通過させて折返し輸送できる分子の生成であった。これは通常、「分子シャトル」および活性な薬物部分を含む二重特異的フォーマットを用いて実現されている。例えば、Ｙｕおよび共同研究者は、トランスフェリン受容体（ＴＦＲ）に結合する「分子シャトル」を用いて、抗ベータ分泌酵素－１（ＢＡＣＥ）阻害剤をＢＢＢを通って輸送する従来の特異的抗体を報告している（Ｙｕ，Ｙ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ３，８４ｒａ４４－８４ｒａ４４（２０１１））。この特異的抗体フォーマットは、ＴＦＲまたはＢＡＣＥを個別に認識する２つの別々のＶＨ：ＶＬ対（すなわち、２つの異なるＦａｂアーム）からなる。実施例５では、我々は、２つの別々の抗原の認識に必要な結合決定基が単一のＶＨ－ＶＬ対内に組み込まれている、二重特異的ＫｎｏｔＢｏｄｙの生成を実証した。この実施例では、我々は、ＴＦＲに対して選択されたＶＨドメインがそれらのパートナーノッチン－ＶＬ融合体ドメインを、ＲＭＴを介してＢＢＢを通過して折り返し輸送する、同じフォーマットの二重特異的ＫｎｏｔＢｏｄｙの生成について記載する。
実施例５は、非免疫化ドナーから単離されたＶＨ遺伝子のレパートリーと組み合わされた、トリプシン結合ＫｎｏｔＢｏｄｙ軽鎖（ＫＢ＿Ａ０７およびＫＢ＿Ａ１２）から構成されるＶＨシャッフルライブラリーについて記載している。Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）免疫チューブに直接固定したＴＦＲ抗原に対して、２～３ラウンドのファージディスプレイ選択を用いて、これらのライブラリーから抗ＴＦＲ二重特異的ＫｎｏｔＢｏｄｙを選択した。マウスＴＦＲに対し、ラウンド１選択を実施し、続けて、ラットＴＦＲに対してラウンド２選択を実施した。別のケースでは、マウスＴＦＲ－マウスＴＦＲ－ラットＴＦＲ（ラウンド１、２および３で使用した抗原を表す）に対し、３ラウンドの選択を実施した。あるいは、マウスＴＦＲ－ヒトＴＦＲ－マウスＴＦＲに対し、選択を実施した。その後、７３６個の個別クローンを最終ラウンドの選択から採取し、モノクローナルファージをそれぞれのクローンから調製した（実施例３で記載のようにして）。それぞれのクローンからのモノクローナルファージ上清の、ラットＴＦＲに対する結合をＥＬＩＳＡにより試験した（選別の代表的例を図２４に示す）。１０，０００蛍光単位を超える結合シグナルを示した３７６個のクローンを採取して配列決定し、特有のクローンを特定した。ＶＨ ＣＤＲ配列の解析に基づいて、６５個の特有の結合物質を特定した。
これらのＴＦＲ結合ＫｎｏｔＢｏｄｙをＦａｂとしての発現を可能とするために、プライマーＭ１３ ｌｅａｄｅｒｓｅｑ（実施例４参照）およびＨＬＩＮＫ３（ＣＴＧＡＡＣＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＣＴＣＧＡ：配列番号７６）を用いてＶＨ遺伝子をＰＣＲ増幅した。増幅したＶＨ遺伝子を制限酵素ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩで消化し、同じ酵素で予め消化したｐＩＮＴ１２ベクター（ＫＢ＿Ａ０７またはＫＢ＿Ａ１２軽鎖をコードする）に連結した。ｐＩＮＴ１２ベクター（図７）は、二重プロモーター発現カセットを有し、それにより重鎖発現がサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーターにより制御され、軽鎖発現が伸長因子１アルファ（ＥＦ１－アルファ）プロモーターにより推進される。ＫｎｏｔＢｏｄｙ Ｆａｂを哺乳動物細胞中で発現させるために、遺伝子導入品質ＤＮＡをＰｌａｓｍｉｄ Ｐｌｕｓ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号１２９４５）を使って調製した。１５μｇのプラスミドＤＮＡを４８μｌのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＨＯ遺伝子導入試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ２９１２９）と共に１ｍｌのＯｐｔｉＰＲＯ無血清培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１２３０９０５０）中で５分間インキュベートした後、１２５ｍｌの組織培養フラスコ中で６ｘ１０６細胞／ｍｌの密度で播種したＥｘｐｉ－ＣＨＯ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ２９１３３）の１５ｍｌを加えた。培養フラスコを、遺伝子導入の１８～２２時間後に単回のフィードを加え、３７℃で７日間インキュベートした（５％ＣＯ２、７５％湿度下、８００ｒｐｍで振盪を加えながら）。フィードには、９０μｌのエンハンサー溶液を補充した３．６ｍｌのＥｘｐｉＣＨＯフィードを含めた。細胞培養上清由来の発現タンパク質を、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＩｇＧ－ＣＨ１親和性樹脂（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１９４３２０００５）を用いて、製造業者のインストラクションに従い精製した。精製タンパク質を、２ｘＰＢＳに対して一晩透析した。２８０ｎｍの吸光度および理論的吸光係数を使って、タンパク質濃度を決定した。
これらのＫｎｏｔＢｏｄｙがＢＢＢを通過する能力を評価するために、すぐに使用できるインビトロラットＢＢＢモデル系（Ｐｈａｒｍａｃｏｃｅｌｌ、カタログ番号ＲＢＴ－２４Ｈ）を使用した。このモデル系では、ラット脳内皮細胞を周皮細胞および星状膠細胞と共に同時培養し、インビボＢＢＢ解剖学的構造を模倣した（Ｎａｋａｇａｗａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．５４，２５３－２６３）。製造業者のインストラクションに従って、インビトロラットＢＢＢキットを培養し、関門の完全性を検証するために、ＫｎｏｔＢｏｄｙの試験の前に、経内皮電気抵抗値（ＴＥＥＲ）を測定した。全てのウェルは、２００Ω／ｃｍ２を超えるＴＥＥＲ測定値であった。２１個のＫｎｏｔＢｏｄｙ Ｆａｂの、インビトロＢＢＢモデル系を通過する能力を試験した。インビボモデルでＢＢＢを通過する（低レベルではあるが）ことが示されているＯＸ－２６、十分に特徴付けされた抗ラットＴＦＲ抗体をポジティブコントロールとして使用した（Ｊｅｆｆｅｒｉｅｓ，Ｗ．Ａ．，Ｂｒａｎｄｏｎ，Ｍ．Ｒ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ａ．Ｆ．＆ Ｈｕｎｔ，Ｓ．Ｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５４，３３３－３４１（１９８５），Ｍｏｏｓ，Ｔ．＆ Ｍｏｒｇａｎ，Ｅ．Ｈ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７９，１１９－１２９（２００１））。「親」ＫｎｏｔＢｏｄｙ ＫＢ＿Ａ１２をネガティブコントロールとして使用した。ポジティブおよびネガティブコントロールの両方を発現させ、上述のように、Ｆａｂフォーマットとして精製した。アッセイのために、試験ＫｎｏｔＢｏｄｙを、７種の、それぞれが３種の異なるＦａｂ抗体をアッセイバッファー（１５ｍＭのヘペス、０．５％のＢＳＡ、５００ｎＭのヒドロコルチゾンおよび１０μｇ／ｍｌのＮａＦを含むＤＭＥＭ－Ｆ１２）中の２μＭの最終濃度で含む少クローン性混合物として調製した。ポジティブおよびネガティブコントロールを同じアッセイバッファー中の１μＭの濃度で調製した。これらのＦａｂの少クローン性混合物およびコントロールを同時培養キットの上段チャンバー（血液側と呼ぶ）に加え、３７度で６時間（５％ＣＯ２および７５％湿度下）インキュベートした。下段チャンバー（脳側と呼ぶ）中の経細胞輸送されたＦａｂの濃度をサンドイッチＥＬＩＳＡを使って測定した。このＥＬＩＳＡでは、Ｆａｂを抗ＣＨ１抗体（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓにより提供された）を用いて捕捉し、ウサギ抗ヒトＩｇＧカッパ軽鎖抗体（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ１９５５７６）または抗ヒトＩｇＧラムダ軽鎖抗体（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ１２４７１９）、続けて、ユーロピウム標識抗ウサギ抗体（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号ＡＤ０１０５）を用いて検出した。ウェルＣ２、Ｃ３およびＣ４中の少クローン性ＫｎｏｔＢｏｄｙ Ｆａｂ混合物は、ネガティブコントロールに比べて、大きな量のトランスサイトーシスを示した（表１９参照）。これらのウェル中に存在するＫｎｏｔＢｏｄｙのＶＨ配列を表２０に示す。本実施例は、受容体（すなわち、ＴＦＲ）に特異的なＶＨドメインの使用が、脳への高分子輸送に関与し、異なる特異性（この実施例では、トリプシン結合）を有するノッチン－ＶＬ融合体を送達したことを示す。同じ手法を用いて、脳内で発現される標的の活性（例えば、中枢神経系内のイオンチャネル、ＢＡＣＥなどのプロテアーゼ）を調節できる機能性ノッチン－ＶＬ融合体を生成し得る。観察されたトランスサイトーシスのレベルは、当業者に既知の方法を用いて、ＶＨドメイン特異性および／または親和性を最適化することによりさらに改善できる。
実施例１４：ＫｎｏｔＢｏｄｙと、天然のノッチン挿入物（ＥＥＴＩ－ＩＩ ウシＵＬＶＣ－Ａｂ）を提示する「極めて長いＶＨ ＣＤＲ３（ウシＵＬＶＣ－Ａｂ）」を有するウシ抗体との比較
ウシ抗体は、２０Åの長さの溶媒曝露二本鎖逆平行シート（ストークと呼ばれる）を含む、３個のジスルフィド結合により安定化された折り畳まれたドメイン（ノブと呼ばれる）を提示する、天然の極めて長いＶＨ ＣＤＲ３を有するとして説明されてきた１０。Ｚｈａｎｇおよび共同研究者は、これらの極めて長いウシＶＨ ＣＤＲ３抗体（ＵＬＶＣ－Ａｂ）のノブドメインが、エリスロポエチンなどの他の折り畳まれたタンパク質で置換できることを示した１３。この実施例では、我々は、ウシＵＬＶＣ－Ａｂの、機能性ノッチン融合体をファージ上に提示する能力をＫｎｏｔＢｏｄｙと比較して評価する。ノッチン－ウシＵＣＬＡ融合体を生成するために、ウシＵＬＶＣ－Ａｂ ＢＬＶ１Ｈ１２のノブ領域の最初と最後のシステインを、トリプシン結合ノッチン；ＥＥＴＩ－ＩＩの配列と置換した（ＥＥＴＩ－ＩＩ ウシＵＬＶＣ－Ａｂ）。この構築物をコードする遺伝子断片を合成した（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、表２１）。この合成遺伝子を、制限酵素部位ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩを用いて、ファージディスプレイベクターｐＳＡＮＧ４に挿入し、大腸菌ＴＧ１細胞に形質転換した。その後、ノッチン－ウシＵＬＶＣ－Ａｂ融合体の性能を、トリプシン結合アッセイを用いて、ＫｎｏｔＢｏｄｙ ＫＢ＿Ａ１２（これは、ノッチンＥＥＴＩ－ＩＩをＶＬ ＣＤＲ２融合体として提示する）と比較した。このアッセイでは、ＥＥＴＩ－ＩＩ ウシＵＬＶＣ－Ａｂからレスキューしたファージ、およびＫＢ＿Ａ１２のトリプシンに対する結合を、抗Ｍ１３抗体、これに続く、ユーロピウム標識抗マウス抗体を使って検出した（実施例３で記載のように）。ＫｎｏｔＢｏｄｙ ＫＢ＿Ａ１２は、ＥＥＴ－ＩＩ－ウシＵＬＶＣ－Ａｂ融合体に比べて、優れたトリプシンに対する結合を示した（図２５）。
実施例１５：哺乳動物細胞の表面上のＫｎｏｔＢｏｄｙの機能性ディスプレイ
実施例１、２、３、５、６、９、１２および１３で、ファージディスプレイ技術を用いて、ＫｎｏｔＢｏｄｙまたは誘導体ライブラリーのディスプレイおよびそれらの選択を可能とした。ファージディスプレイに代えて、結合物質のディスプレイが、細菌、酵母および哺乳動物細胞上で実施された。これらの方法では、流動選別を使用して、結合分子の結合および発現ならびに標的への結合を測定することが可能である。このように、細胞、例えば、哺乳動物細胞の表面上のＫｎｏｔＢｏｄｙのライブラリーのディスプレイは、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）により、最終的ｓｃＦｖ－Ｆｃ、ＦａｂまたはＩｇＧフォーマットの数千万個のクローンの、標的に対する増大した親和性および発現レベルのスクリーニングと選択を可能とするであろう。その他の系におけるディスプレイライブラリーの構築およびディスプレイライブラリーの使用方法は、当業者に既知である。
ＫｎｏｔＢｏｄｙのライブラリー（例えば、レシピエント、ドナー、リンカーまたはパートナードメイン内）はまた、上述のように、哺乳動物細胞における変化した細胞の表現型の直接機能的スクリーニングのためにも使用可能である。したがって、哺乳動物細胞中の提示されたまたは選択されたＫｎｏｔＢｏｄｙのライブラリーは、薬剤候補またはリード分子の発見に対する効率的な道筋を提供し得る。ヌクレアーゼ誘導組み込みによる哺乳動物細胞中のライブラリーの構築方法が、例えば、国際公開第２０１５１６６２７２号中、およびその中で引用された文献中に、示されている。これらの特許、文献は、参照により、本明細書に組み込まれる。この実施例では、我々は、膜に固定されたＫｎｏｔＢｏｄｙ ｓｃＦｖ－Ｆｃを哺乳動物細胞の表面上で提示することが可能であることを示す。これは、ＫｎｏｔＢｏｄｙ ＫＢ＿Ａ０７およびＫＢ＿Ａ１２ ｓｃＦｖを標的化ベクターｐＤ６（図２６）中に挿入し、ＨＥＫ２９３細胞へのヌクレアーゼ媒介遺伝子を組み込み、続けて、フローサイトメトリー分析を実施することにより達成された。フローサイトメトリー結果は、標識抗Ｆｃによる染色した場合、発現が達成され、さらに、染色が、フルオロフォア標識トリプシンでも達成されたので、提示されたノッチンが適切に折り畳まれたことを示した。
哺乳動物ディスプレイベクター中に挿入するために、リンカーライブラリーを生成するように修正できる方法で、ＫｎｏｔＢｏｄｙ遺伝子ＫＢ＿Ａ０７およびＫＢ＿Ａ１２を調製した。３つの断片を生成し、対合を推進するように境界でのオーバーラップを使って、ＰＣＲにより構築した。Ｎ末端からＣ末端方向では、断片１は、ｓｃＦｖ遺伝子のＮ末端部分からドナー挿入位置までをコードする（この場合、Ｎｃｏ１部位、ＶＨ全体、ｓｃＦｖリンカー、ＦＷ１、ＦＷ２、オーバーラップをコードする）ＰＣＲ産物からなる。断片２は、オーバーラップ、組み込まれるノッチンドナー、オーバーラップからなる。断片３は、オーバーラップ、ＦＷ３，ＣＤＲ３、ＦＷ４、Ｎｏｔ１部位からなる。可能なリンカー寸法および部位の記述は、下記に示す。オーバーラップの位置は選択できるが、通常、抗体フレームワークまたはドナーコード領域に相同であろう（オーバーラップの内側の１つの断片またはその他の断片中に多様性を導入可能とする）。下記実施例では、断片は、ＰＣＲによるそれらの構築および増幅を可能とするために、１８～２７個のヌクレオチド相同性オーバーラップを含む。ドナーを含む最終的ｓｃＦｖ産物は、３フラグメントアセンブリにより生成される。この３フラグメントアセンブリ手法は、親ＫｎｏｔＢｏｄｙ（多様化なしの）を用いて、詳細に記載される。
記載プライマーは、表２２に記載されている。ＫＢ＿Ａ０７ ｓｃＦｖ断片１（５６９ｂｐ）を、順方向プライマー２９８５および逆方向プライマー２９９９ならびにＤＮＡテンプレートとしてＫＢ＿Ａ０７遺伝子を内部に持つｐＩＯＮＴＡＳ１を用いてＰＣＲにより作成した。ＫＢ＿Ａ０７ ｓｃＦｖ断片２を、プライマー２９７９および２９８０を用いテンプレートなしでＰＣＲにより作成した。ここで、プライマーを単純にアニーリングし、伸長して１３７ｂｐのＫＢ＿Ａ０７断片２を得た。ＫＢ＿Ａ０７ ｓｃＦｖ断片３（１７０ｂｐ）を、順方向プライマー３０００および逆方向プライマー２９９５ならびにＤＮＡテンプレートとしてＫＢ＿Ａ０７を内部に持つｐＩＯＮＴＡＳ１を用いてＰＣＲにより作成した。ＫＢ＿Ａ１２ ｓｃＦｖ断片１（５７２ｂｐ）を、順方向プライマー２９８５および逆方向プライマー３００３ならびにＤＮＡテンプレートとしてＫｎｏｔＢｏｄｙ Ａ１２を内部に持つｐＩＯＮＴＡＳ１を用いてＰＣＲにより作成した。ＫＢ＿Ａ１２ ｓｃＦｖ断片２を、プライマー２９８３および２９８４を用いテンプレートなしでＰＣＲにより作成した。ここで、プライマーを単純にアニーリングし、伸長して１３７ｂｐのＡ１２断片２を得た。ＫＢ＿Ａ１２ ｓｃＦｖ断片３（１７９ｂｐ）を、順方向プライマー３００４および逆方向プライマー３００２ならびにＤＮＡテンプレートとしてＫＢ＿Ａ１２を内部に持つｐＩＯＮＴＡＳ１を用いてＰＣＲにより作成した。断片２および３をゲル精製し、断片１をスピンカラムにより精製した。その後、３個の断片を混合し（それぞれ、１０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ８）中の１００ｎＭ）、合計１０μｌとし、これに、１０μｌのＫＯＤ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号７１８４２）を加えた。その後、断片を９５℃で２分間、続けて、９５℃（２０秒）、６０℃（１分、４０秒）および７０℃（３０秒）の２０サイクルのインキュベーションによりアセンブルした。次に、１μｌのこのアセンブリ反応産物を、アウタープライマー２９８５および２９９５（Ａ０７）または２９８５および３００２（Ａ１２）を含むＰＣＲ反応混合物中でテンプレートとして使用した。その後、ＫＢ＿Ａ０７およびＫＢ＿Ａ１２ ｓｃＦｖ遺伝子をコードするアセンブルしたＰＣＲ産物をＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで消化し、ゲル精製して、同じ酵素で予め消化した、ディスプレイ標的化哺乳動物ベクターｐＤ６に挿入した（図２６）。遺伝子導入品質プラスミドＤＮＡをＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ Ｘｔｒａ Ｍｉｄｉ ｐｌｕｓ ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ、カタログ番号７４０４１２．５０）を使って調製した。
電気穿孔は、ＤＮＡを細胞へと導入する効率的な方法であり、Ｍａｘｃｙｔｅにより開発されたプロトコルは、哺乳動物細胞の高効率遺伝子導入と高細胞生存率とを併せ持つ。ＨＥＫ２９３細胞を遠心し、製造業者の電気穿孔緩衝液（Ｍａｘｃｙｔｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ緩衝液、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＮＣ０８５６４２８））中の１０８細胞／ｍｌの最終量で再懸濁した。４ｘ１０７細胞（０．４ｍｌ）の分割量を、８８μｇのＤＮＡ（すなわち、２．２μｇ／１０６細胞）と共にＯＣ－４００電気穿孔キュベット（Ｍａｘｃｙｔｅ、カタログ番号ＯＣ４００Ｒ１０）に添加した。ＤＮＡ混合物は、ＡＡＶＳ－ＳＢＩ ＴＡＬＥＮ（ｐＺＴ－ＡＡＶＳ１ Ｌ１およびｐＺＴ－ＡＡＶＳ Ｒ１ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号ＧＥ６０１Ａ－１）をコードする、等モル混合物としての８０μｇのプラスミドＤＮＡおよび８μｇのＫＢ＿Ａ０７またはＫＢ＿Ａ１２をコードする「ドナー」プラスミドｐＤ６ ＤＮＡから構成された。ＴＡＬＥＮまたはドナーＤＮＡがｐｃＤＮＡ３．０により置換される場合は、コントロール電気穿孔も実施した。電気穿孔を製造業者（Ｍａｘｃｙｔｅ）のインストラクションに従って実施した。遺伝子導入の２日後（２ｄｐｔ）、ブラストサイジン選択を開始した（５μｇ／ｍｌ）。１３日後（１５ｄｐｔ）、細胞のｓｃＦｖ－Ｆｃ発現を抗Ｆｃフィコエリトリン（ＰＥ）標識抗体を用いて、フローサイトメトリーにより分析した。適切に折り畳まれたノッチンの存在を、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）標識ストレプトアビジンと事前結合させたビオチン化トリプシンで染色することにより検出した。分析は、前方散乱およびＦＬ３チャネルでの７ＡＡＤ染色を使用して、生存細胞に的を絞った。ＦＬ３チャネルでの染色に陽性の細胞（７－ＡＡＤを取り込んだ非生存細胞を表す）は除外した。
製造業者のインストラクションに従って、ＥＺ－Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＬＣ－Ｂｉｏｔｉｎキット（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号２１３２７）を使用し、精製トリプシンをビオチン化した。ビオチン化トリプシン（１．２５μｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、４．３μＭ）およびストレプトアビジン－ＡＰＣ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、カタログ番号ＳＡ１００５、１μｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、３．８μＭ）をＰＢＳ／１％ＢＳＡ（１００μｌ）中で３０分間、室温でプレインキュベートした。ＰＢＳで予備洗浄した、試料当たりの細胞（１０６）を、上記で調製したビオチン化トリプシン／ストレプトアビジン－ＡＰＣ混合物中に再懸濁し、これに、抗ヒトＦｃ－ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４０９３０４、２００μｇ／ｍｌ、０．５μｌ）を加え、４℃で３０分インキュベートした。細胞をＰＢＳ／０．１％ＢＳＡで２回洗浄し、７－ＡＡＤ生存率染色溶液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号００－６９９３－５０）を含むＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ中に再懸濁し、フローサイトメーター（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ ｉＱＵＥ選別機）を使って分析した。
図２７は、ブラストサイジン選択の１３日後（１５ｄｐｔ）、ＫＢ＿Ａ０７およびＫＢ＿Ａ１２遺伝子導入されるＨＥＫ２９３細胞の３４％および１１％が、Ｆｃおよびトリプシンを二重染色した。染色されない非遺伝子導入ＨＥＫ２９３が観察された。これは、哺乳動物細胞の表面上で膜に固定されたＫｎｏｔＢｏｄｙを提示することが可能であることを示す。
実施例１６：可変リンカー配列を有する抗体ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３中へのノッチンの挿入、ファージ上のそれらのディスプレイおよび機能性ＫｎｏｔＢｏｄｙの選択
実施例１、２、および３は、抗体ＶＬ ＣＤＲ１およびＶＬ ＣＤＲ２へのノッチンの挿入、ファージ表面上の得られたＫｎｏｔＢｏｄｙのディスプレイおよび機能性ＫｎｏｔＢｏｄｙの選択を実証した。実施例１、２、および３では、可変融合体配列が、ドナーとレシピエントとの間に導入されたライブラリーが生成され、その後、これがファージディスプレイにより選択され、選別されて、機能性ノッチンのディスプレイのための最適融合体配列が特定された。この特定された短いリンカー配列は、実施例１１に記載のように、機能性ノッチンのディスプレイのためには、長い可撓性リンカーより優れていた。ＶＬ ＣＤＲ１またはＶＬ ＣＤＲ２へのノッチンの挿入は、ＶＬおよびＶＨ ＣＤＲからの追加の結合への寄与を可能とする。いくつかの用途に対しては、代替立体配置の利点が存在することがあり、この場合、ノッチンは、ＶＨまたはＶＬ上の代替ＣＤＲに挿入される。実施例３で記載のように、ドナーノッチンをそれぞれのＣＤＲに連結する一部の可変融合体配列のみが、ノッチンの機能性ディスプレイを可能とする可能性がある。全ての抗体ＣＤＲで機能性ノッチンを提示することが可能であることを示すために、ｓｃＦｖとしてフォーマットされたＤ１Ａ１２のバリアント（Ｔａｐｅ、Ｃ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２０１１）ＰＮＡＳ ＵＳＡ １０８，ｐ５５７８－５５８３）を、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３中の、ノッチン挿入物で設計した。この場合、ノッチンに隣接した２つのコドンをランダム化し、図２８に示すように、「リンカーライブラリー」ノッチン構築物の生成を可能とした。親抗ＴＡＣＥ ｓｃＦｖ１０１の配列を表２３に示す。さらに、ＫＢ＿Ａ０７のリンカーライブラリーを生成し、図２８に示すように、ＥＥＴＩ－ＩＩドナーノッチンをＶＬ ＣＤＲ２に挿入した。ランダム化リンカー配列を有する、ノッチンをコードするインサートを、６個のＤ１Ａ１２のＣＤＲのそれぞれに挿入し、当業者に既知の標準的分子生物学技術（例えば、Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ ２００７２８）を用いて、実施例１５に記載の３フラグメントアセンブリによりランダム化隣接アミノ酸を有するノッチンをＶＬ ＣＤＲ２中に挿入したＫＢ＿Ａ０７のリンカーライブラリーを生成した。実施例３に記載のように、ファージディスプレイベクターｐＳＡＮＧ４中に挿入することにより、ファージディスプレイライブラリーを生成し（Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ ２００７）、トリプシンに対する結合で選択し、個々のクローンでモノクローナルファージＥＬＩＳＡを実施した。陽性クローンを得たことにより、抗体可変重鎖および軽鎖の両方において、全てのＣＤＲループ内でノッチンの機能性ディスプレイが可能であることが示された。
３フラグメントＰＣＲアセンブリによるｓｃＦｖノッチンリンカーライブラリーインサートの調製戦略および方法は、実施例１５で詳細記述され、インサートを生成するためのプライマーは、表２２および２４に記載されている。それぞれのライブラリー対し、３つのフラグメントを生成するために必要なプライマー対、ＤＮＡテンプレート（必要な場合）および産物サイズは、表２５に記載されており、個々のインサートの調製および精製方法は実施例１５に記載されている。表２５に記載のライブラリーＡ～Ｇのそれぞれに対する３つのフラグメントを、次に、等モル比で混合し（例えば、フラグメントＡ１、Ａ２およびＡ３を混合して、ライブラリーＡを生成した）、実施例１５に記載のようにアセンブルした。２フラグメントアセンブリを使って、フラグメントＥ（この場合には、多様化がｓｃＦｖ遺伝子の末端近傍に存在した）を生成することは可能であった。順方向プライマー２９８５および逆方向プライマーＤ１Ａ１２ ＮｏｔＩ ｒｅｖ（ライブラリーＡ～Ｆ）または２９９５（ライブラリーＧ）を用いて、産物をＰＣＲで増幅した。その後、ライブラリーＡ～ＧをコードするアセンブルしたＰＣＲ産物をＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで消化し、ゲル精製して、ファージディスプレイベクターｐＳＡＮＧ４（同じ酵素で予め消化した）に連結し、実施例２に記載のようにして、連結した産物を電気穿孔により大腸菌ＴＧ１細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎ、カタログ番号６０５０２－２）に遺伝子導入した。０．７～１．６ｘ１０８のサイズのライブラリーを得た。ファージをライブラリーからレスキューし、７個のライブラリー：ライブラリーＡ（Ｄ１Ａ１２ ＶＨ ＣＤＲ１に挿入したノッチンリンカーライブラリー）；ライブラリーＢ（Ｄ１Ａ１２ ＶＨ ＣＤＲ２の挿入したノッチンリンカーライブラリー）；ライブラリーＣ（Ｄ１Ａ１２ ＶＨ ＣＤＲ３に挿入したノッチンリンカーライブラリー）；ライブラリーＤ（Ｄ１Ａ１２ ＶＬ ＣＤＲ１に挿入したノッチンリンカーライブラリー）；ライブラリーＥ（Ｄ１Ａ１２ ＶＬ ＣＤＲ２に挿入したノッチンリンカーライブラリー）；ライブラリーＦ（Ｄ１Ａ１２ ＶＬ ＣＤＲ３に挿入したノッチンリンカーライブラリー）；およびライブラリーＧ（ＫＢ＿Ａ０７ ＶＬ ＣＤＲ２に挿入したノッチンリンカーライブラリー）を生成した。
機能性ノッチン－抗体融合体を単離するために、上記のそれぞれのノッチン－抗体リンカーファージディスプレイライブラリーＡ～Ｇを、実施例３に記載のようにして、ビオチン化トリプシンを用いて２ラウンドのファージディスプレイ選択に供した。個々のクローン（選択当たり４６個）を９６ウェル培養プレート中に採取し、それぞれのクローン由来の産生ファージおよびファージ上清の、ストレプトアビジンコートＭａｘｉｓｏｒｐ（商標）プレートに固定したビオチン化トリプシンに対する結合を、実施例３に記載のＴＲＦアッセイを使って結合を検出して試験した（ビオチン化トリプシンの２．５μ／ｍｌのコーティング濃度を使用）。９６ウェルプレートそれぞれのＥＬＩＳＡシグナルのバックグラウンドとして、ウェルにファージ非添加の同じプレートによる２つのネガティブコントロールの読み値の平均を差し引いた。トリプシンに対する特異性を、添加トリプシンの非存在下でのストレプトアビジンコートＭａｘｉｓｏｒｐ（商標）に対する結合の欠如により確認した。非選択ノッチンリンカー抗体ライブラリーＣ、ＥおよびＧのスクリーニングにより、それぞれ、０％、１％および３２％の陽性クローンを得た。これは、限られた比率のライブラリーメンバーが機能性ノッチンドナーを提示可能であることを示している。ライブラリーＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧに対するファージディスプレイ選択およびモノクローナルファージＥＬＩＳＡのヒット率は、それぞれ、１１％、１７％、２８％、４％、７４％、２４％および９３％であり、機能性ノッチンを提示するＫｎｏｔＢｏｄｙに対する濃縮を示した。
陽性クローンを配列決定して、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３を有する機能性ノッチンのディスプレイを可能とした隣接リンカー配列を決定した。特定されたリンカー配列を表２６および２７に記載している。特有の配列を有する機能性ＫｎｏｔＢｏｄｙの例を単離し（表２６）、それにより、機能性ノッチンの抗体ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３への挿入を実証した。
実施例１７：抗体ＶＬ ＣＤＲ１およびＶＬ ＣＤＲ２ドメインに挿入したノッチンの代替フレーミング
上記実施例では、シスリッチペプチド（以後では、構造およびジスルフィド結合パターンに関係なくノッチンと呼ぶ）の天然のＮ末端およびＣ末端が、抗体フレームワークに融合したＮおよびＣ末端を有するノッチンの天然の線形配列を保持するように、抗体ＣＤＲ残基中に挿入される。しかし、レシピエント抗体とドナーノッチンとの間の代替「フレーミング」戦略が可能であり、これは、ここで例示される。以下の説明では、ドナー中の逐次システイン間の配列は、「ループ」と呼ばれ、天然の順序に基づいて、１～５と番号が付けられる。例えば、ループ１は、第１のシステインと第２のシステインとの間に伸びる。ループ５は、５番目と６番目のシステインの間に伸びる。サイクロチドなどのいくつかのシステインリッチペプチドは、環状型で見つかり、ＮおよびＣ末端はペプチド配列により連結される。例えば、ＭｏＣｏＴは、「線形」型（すなわち、遊離ＮおよびＣ末端を有する）または環状型で見つかることがある。環状型で、第１（Ｎ末端）および６番目（Ｃ末端）のシステインを連結する追加のペプチド配列は、「ループ６」（Ｊａｇａｄｉｓｈ ｅｔ ａｌ，（２０１０）Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９４ ｐ６１１－６１６）と呼ばれ、下記実施例で、元のＮおよびＣ末端を連結するために使用される。
１つの観点から、ＫｎｏｔＢｏｄｙ中のドナーノッチンのＮおよびＣ末端が抗体により連結され、これは、環状ノッチン中のＮおよびＣ末端システインを「連結する」「ループ６」と等価と見なし得る。その同じ観点から、抗体が代替ループを置換する代替「フレーミング」を考えることができるであろう。この配置では、ドナーの天然のＮおよびＣ末端は、環状ＭｏＣｏＴＩ－ＩＩで見出される追加の「ループ６」ペプチドにより連結され得る。これらの代替フレーミング戦略は、抗体レシピエントに対する異なるループの並置における変化を可能とし、最適二重特異的配向の生成および設計戦略における潜在的利益、例えば、ドナーおよびレシピエントの両方の標的タンパク質または複合体との接触による親和性または特異性の改善がもたらされるであろう。ドナーのレシピエントに対する効果的な「回転」は、特定の重要なループの利用可能性を増大させ得、例えば、ＥＥＴ５－３のトリプシン結合ループがドナー内でＥＥＴ１－５に比べて、より中央位置に移動される（下記参照）。代替「ループ６」の追加は、標的タンパク質との追加の接触の可能性をさらに高める。最終的に、このような代替フレーミングは、いくつかの事例では、天然のＫｎｏｔＢｏｄｙ構築物に比べて、優れた発現または折り畳みを提供し得る。
以前の実施例に記載のように、ノッチンがその天然の配置中に挿入される場合、抗体レシピエントのＮ末端セグメントは、ドナーノッチンの第１のシステインおよびループ１の前にある。ループ５のドナー両端は、末端システインの前にある。個々で採用した命名法では、これは、「１－５」配置と呼ばれ、ノッチンループ１、２、３、４、５の順に表される。この場合、抗体は、環状ノッチンのループ６の等価物をみなされ得る。表２８は、ノッチンと抗体間のフレーミングを変えるための、別の可能な戦略を示す。表２８では、天然のループ１は、いずれの場合にも、下線を引いている。元のＥＥＴＩ－ＩＩのＮおよびＣ末端は、「ループ６」を生成するために連結され、ＭｏＣＯＴＩ－ＩＩのループ６のペプチド配列を使用する（イタリック体で示されている）。ＥＥＴ＿５－３構成におけるより詳細なループ配置の表現は、図２９Ａに示されている。これは、代替構成ＥＥＴ＿５－３では、ループの順が５、６、１、２および３である（抗体でループ４を「置換」）ことを示す。
一実施形態において、フレーム中に挿入したノッチンの選択を例示するために、ＥＥＴ＿５－３構成のフレーミングを有するノッチンを、カッパまたはラムダＶＬドメインのＣＤＲ１またはＣＤＲ２位置に融合した。これは、２つのドメイン間の限られた数の追加のアミノ酸になるようにして、ランダムアミノ酸を有するＶＬレシピエント内の残基を置換することにより行った（図２９Ｂ）。
改変フレーミングを有するノッチンのＣＤＲ１への挿入
５－３フレーミングを有する合成ＥＥＴＩ－ＩＩノッチンドナー遺伝子を作製し、これを、Ｐｍｌ１およびＭｆｅ部位（これはＰＣＲにより導入された）を有するＰＣＲ断片を作成して、ｐＩＯＮＴＡＳ１＿ＫＢ＿ＫａｐｐａおよびｐＩＯＮＴＡＳ１＿ＫＢ＿ｌａｍｂｄａ中に挿入することにより、軽鎖レシピエント中のＣＤＲ１位置を置換するのに使用した。フレームワークおよびＣＤＲ表記は、ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（ＩＭＧＴ）２９により記載の通りである。ＰＣＲプライマーはまた、制限部位とノッチン遺伝子との間に可変アミノ酸配列を導入した。ＰＣＲプライマーＰｍｌ５－３ＥＥＴａおよびＰｍｌ５－３ＥＥＴｂは、それぞれ、配列ＶＮＳ（Ｖ＝Ａ、ＣまたはＧ、Ｎ＝Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ、Ｓ＝ＣまたはＧ）でコードされた３個の可変コドンをＰｍｌ制限酵素部位のすぐ後ろに導入した。「ＶＮＳ」縮重コドンは、それぞれのランダム化位置で、２４のコドンの組み合わせから、１６個のアミノ酸（システイン、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニンおよび停止コドンを除く）をコードする。Ｐｍｌ５－３ＥＥＴｂはまた、Ｐｍｌ５－３ＥＥＴａに比べて、追加のグリシン残基をドナーとレシピエントの間に導入する。
Ｐｍｌ５－３ＥＥＴａ ＧＴＧＴ ＶＮＳ ＶＮＳ ＶＮＳ ＴＧＣ ＧＧＴ ＣＣＧ ＡＡＣ ＧＧＣ ＴＴＣ ＴＧＣ（配列番号７９）
Ｐｍｌ５－３ＥＥＴｂ ＧＴＧＴ ｇｇａ ＶＮＳ ＶＮＳ ＶＮＳ ＴＧＣ ＧＧＴ ＣＣＧ ＡＡＣ ＧＧＣ ＴＴＣ ＴＧＣ（配列番号８０）
これらの配列の５’末端は、配列「ＣＡＣＧＴＧ」を認識して平滑末端を作成する制限酵素であるＰｍｌ１で作成された部位を表す。ＰＣＲ産物の平滑末端クローニングを容易にするために、５’リン酸化末端を有するプライマーを合成した。
ノッチン遺伝子の３’末端に、アンチセンスプライマー５－３ＥＥＴＭｆｅ（Ｍｆｅ１部位をコードする）を使用してＥＥＴＩ－ＩＩの５－３フレームを増幅した。クローニングに使用されたＭｆｅ１部位は、ＦＷの２番目および３番目のアミノ酸（Ａｓｎ－Ｔｒｐ）をコードする。このプライマーは、Ｍｆｅ部位（下線）の前にＶＮＳまたはＶＮＣによりコードされる２個のランダムアミノ酸を導入する。
５－３ＥＥＴＭｆｅ ＧＴＣＡＧＴＣＣＡＡＴＴＧＮＢＳＮＢＧＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＧＧＣＡＧＴＣＴＧＡ（配列番号８１）
図２９Ｃは、プライマーＰｍｌ５－３ＥＥＴａを用いた、５－３フォーマットＥＥＴＩ－ＩＩのラムダ軽鎖ＩＧＫＶ１Ｄ－３９のＣＤＲ１への挿入後の配列を示す。フレームワーク２～フレームワーク４を包含する軽鎖断片のレパートリーもまた、以前に実施例２で記載のように、制限酵素部位Ｍｆｅ１およびＮｏｔ１（下線）を用いて、ノッチンドナーの後ろに挿入した。
ノッチンのＣＤＲ２への挿入
ノッチンドナーは、ＰＣＲにより導入されたＰｓｔ１およびＢｓｐＥ１部位を有するＰＣＲ断片を生成することにより、ｐＩＯＮＴＡＳ１＿ＫＢ＿ｌａｍｂｄａおよびｐＩＯＮＴＡＳ１＿ＫＢ＿ＫａｐｐａのＣＤＲ２位置に導入された。Ｐｓｔ１部位をＩＧＫＶ１Ｄ－３９Ｖカッパ遺伝子のＣＤＲ２領域の最初の２個の残基中（Ａｌａ－Ａｌａ配列内）に導入することが可能であった。クローニング上の便宜上、同じ制限酵素部位およびコード残基を、Ｖラムダ生殖系列遺伝子ＩＧＬＶ１－３６のフレームワーク２の末端に導入した。ラムダ生殖系列ではまた、ＢｓｐＥ１部位を、Ｓｅｒ－ＧｌｙをコードするＦＷ３領域の４番目および５番目の残基中に導入することも可能であった（図３Ｅ）。再度、この制限酵素部位およびコードアミノ酸をＶカッパ遺伝子中に導入した（図３Ｆ）。
ＰＣＲプライマーＰＳＴ５－３ＥＥＴａを使って、ＥＥＴＩ－ＩＩを増幅し、クローニング用Ｐｓｔ１部位（下線）を包含する２つのＡｌａコドン、続けて、配列ＧＮＳ（Ｖａｌ、Ａｌａ、ＡｓｐまたはＧｌｙをコードする）およびＶＮＳ（２４コドンの内１６アミノ酸をコードする）によりコードされる２つの可変コドンをＰｓｔ１制限酵素部位の直後でノッチン配列の前に導入する。ＶＮＳコドンは、ＥＥＴＩ－ＩＩの最初のアミノ酸を、ドナーとレシピエントフレームワークとの間の正味３個のアミノ酸（２個のＡｌａ残基と、Ｖａｌ、Ａｓｐ、ＡｌａまたはＧｌｙの内の１個）の付加で置換する（図２９Ｂ、Ｄ）。
ＰＳＴ５－３ＥＥＴａ ＡＴＣ ＴＡＴ ＧＣＴ ＧＣＡ ＧＮＳ ＶＮＳ ＴＧＣ ＧＧＴ ＣＣＧ ＡＡＣ ＧＧＣ ＴＴＣ ＴＧＣ（配列番号８２）
組み込まれるノッチンドナーの３’末端では、ＰＣＲプライマーの５－３ＥＥＴＢｓｅを使って５－３フレーム化ＥＥＴＩ－ＩＩを増幅した。これはクローニング用のＢｓｐＥ１部位を導入する。ＰＣＲ産物は、ノッチンドナーと、それに続くグリシンを導入する。このグリシンは、天然では、ＥＥＴＩ－ＩＩの最後のシステインの後ろに存在する（図３ａ）。これの後に、２個のランダム化アミノ酸が続き、これは、クローニング後、ＦＷ３の４番目および５番目のアミノ酸に隣接する。これは、最初のＦＷ３の３個の残基を、２個のランダム化アミノ酸で置換する効果を有し、ノッチンの末端グリシンを保持する（図３Ｂ）。
５－３ＥＥＴＢｓｅ ＧＴＣＡＧＡＧＡＣＴＣＣＧＧＡＳＮＢＳＮＢＣＣＣＧＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＧＧＣＡＧＴＣＴＧＡ（配列番号８３）。
フレームワーク３～フレームワーク４を包含する軽鎖断片のレパートリーもまた、以前に実施例２で記載のように、ノッチンドナーの後ろに挿入した。
図２９Ｄは、プライマー５－３ＥＥＴＢｓｅを用いた、５－３フォーマットＥＥＴＩ－ＩＩのラムダ軽鎖ＩＧＫＶ１Ｄ－３９のＣＤＲ２への挿入後の配列を示す。フレームワーク３～フレームワーク４を包含する軽鎖断片のレパートリーもまた、以前に実施例２で記載のように、制限酵素部位ＢｓｐＥ１およびＮｏｔ１を用いて、ノッチンドナーの後ろに挿入した。
当業者に既知の標準的分子生物学技術（例えば、Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．２００７２８）を用いて、上述のようにして作成した遺伝子断片を使って、構築物（図２９Ｂ、ＣおよびＤに示すように）を作成した。これらをｐＩＯＮＴＡＳ１＿ＫＢ＿ＫａｐｐａおよびｐＩＯＮＴＡＳ１＿ＫＢ＿ｌａｍｂｄａ中に挿入し、大腸菌ＴＧ１細胞中に電気穿孔により遺伝子導入し、３．５～６．６ｘ１０８のメンバー数のＫｎｏｔＢｏｄｙライブラリーを構築した。
実施例３に記載のように、トリプシンに対し選択後、モノクローナルファージＥＬＩＳＡにより陽性クローンを特定し、それらの配列を決定した。ＣＤＲ１またはＣＤＲ２およびラムダ軽鎖中の陽性クローンの例は、表２９に示す。リンカー配列を小文字で、５－３フレーム中のノッチンドナーをイタリック体で示す。モノクローナルファージＥＬＩＳＡから取得したＥＬＩＳＡシグナル値も同様に示す。トリプシンのアラニン－アラニンに対する相互作用（実施例３に示すように、これが結合を減少させる）に関与するプロリン－アルギニン残基対に変異導入することにより、相互作用の特異性をさらに確証した。
実施例１８：抗Ｋｖ１．３ ＫｎｏｔＢｏｄｙの免疫調節性機能の評価
Ｋｖ１．３は、Ｔ細胞受容体の活性化後のカルシウムシグナル伝達の維持に重要な役割を果たし、それにより、Ｔ細胞活性化、増殖およびエフェクター記憶型Ｔ（ＴＥＭ）細胞のサイトカイン放出を調節する。ＴＥＭ細胞は、Ｔリンパ球媒介自己免疫疾患の発病において重要な役割を果たし、従って、Ｋｖ１．３活性の遮断は、治療的介入ポイントとなる可能性がある。
実施例７は、ＫｎｏｔＢｏｄｙ ＫＢ＿Ａ０７およびＫＢ＿Ａ１２のＣＤＲ２位置のトリプシン結合ノッチンＥＥＴＩ－ＩＩを、システインリッチミニタンパク質Ｓｈｋまたはカリオトキシン（それぞれ、イソギンチャク毒液およびサソリ毒液由来の天然のＫｖ１．３ブロッカー）で置換することによる、Ｋｖ１．３ブロッカーの生成について記載している。実施例８は、Ｋｖ１．３に対するこれらのＫｎｏｔＢｏｄｙの、電気生理学により測定したブロッキング活性を示す。この実施例では、我々は、ＫＢ＿Ａ１２ Ｓｈｋの、活性化Ｔ細胞によるサイトカイン分泌を調節する能力を評価する。
Ｔ細胞からのサイトカイン放出を測定する方法は、当業者に周知である（例えば、Ｔａｒｃｈａ ｅｔ ａｌ，（２０１２）Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，３４２ ｐ６４２－６５３）。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を５人の健康なドナーから単離し、５００ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１６－００３７－８５）でプレコートした９６ウェルプレートでの培養により刺激した。ＰＢＭＣを２ｘ１０６細胞／ｍｌで懸濁し、１００ｕｌの細胞懸濁液を、１００ｕｌの試験試料（ＫＢ＿Ａ１２＿Ｓｈｋ）またはポジティブコントロール（遊離Ｓｈｋ毒素、Ａｌｏｍｏｎｅ ｌａｂｓ、ＳＴＳ－４００）またはネガティブコントロール（親ＫｎｏｔＢｏｄｙ ＫＢ＿Ａ１２）と、１００ｎＭの最終濃度で混合した。（試料として、ＫＢ＿Ａ１２＿Ｓｈｋでは３通り、またはＫＢ＿Ａ１２および遊離Ｓｈｋでは２通り調製した）。細胞を３７℃で７２時間インキュベートし、１５００ｒｐｍで５分間、室温で遠心分離した後、１５０ｕｌの上清を取り出した。７２時間のインキュベーション後、サイトカインおよびグランザイム－Ｂの濃度を、製造者（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）のインストラクションに従って、Ｌｕｍｉｎｅｘビーズベースアッセイを用いて測定した。
ＫＢ＿Ａ１２＿Ｓｈｋとインキュベートした場合、コントロールＫｎｏｔＢｏｄｙ（ＫＢ＿Ａ１２）でインキュベートしたコントロールと比較して、インターフェロンガンマ、グランザイムＢ、インターロイキン－１７ＡおよびＴＮＦ－アルファの、全５つの異なるドナー由来のＰＢＭＣ中の分泌が低減した。これは、ＫＢ＿Ａ１２＿Ｓｈｋが、電気生理学により測定（実施例８）してＫｖ１．３機能をブロックするのみでなく、Ｔ細胞機能アッセイで測定してＴ細胞活性化を直接妨害することをも示す。
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６．Ｋｏｇｅｌｂｅｒｇ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ３８２，３８５－４０１（２００８）．
７．Ｍａｎ，Ｙ．Ｋ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ８，ｅ７０４５２（２０１３）．
８．Ｓａｉｎｉ，Ｓ．Ｓ．ｅｔ ａｌ Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９，２４２０－２４２６（１９９９）．
９．Ｓａｉｎｉ，Ｓ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５，８４５－８５３（２００３）．
１０．Ｗａｎｇ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １５３，１３７９－１３９３（２０１３）．
１１．Ｚｈａｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．５３，１３２－１３５（２０１４）．
１２．Ｚｈａｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．５２，８２９５－８２９８（２０１３）．
１３．Ｚｈａｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．ＡＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．８，２１１７－２１２１（２０１３）．
１４．Ｌｉｕ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ＵＳＡ １１２，１３５６－１３６１（２０１５）．
１５．Ｐｅｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２２，１１３４－１１４３（２０１５）．
１６．Ｍｅｌｉｄｏｎｉ，Ａ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ＵＳＡ １１０，１７８０２－１７８０７（２０１３）．
１７．Ｂｅｔｔｏｎ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（１９９７）．
１８．Ｃｏｌｌｉｎｅｔ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．２７５，１７４２８－１７４３３（２０００）．
１９．Ｒｕｔｈ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．ＦＥＢＳ Ｊｏｕｒｎａｌ ２７５，５１５０－５１６０（２００８）．
２０．Ｖａｎｄｅｖｅｎｎｅ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ２１，４４３－４５１（２００８）．
２１．Ｃｒａｓｓｏｎ，Ｏ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．２８，４５１－４６０（２０１５）．
２２．Ｎｅｙｌｏｎ，Ｃ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３２，１４４８－１４５９（２００４）．
２３．Ｂａｎｔａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｍｅｄ Ｅｎｇ １５，９３－１１３（２０１３）．
２４．Ｋｉｍｕｒａ，Ｒ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ６，ｅ１６１１２（２０１１）．
２５．Ｔａｋａｃｓ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ １０６，２２２１１－２２２１６（２００９）．
２６．Ｇｕｉ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．（２０１４）．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｕｂ．２０１４．０１．０１３
２７．Ｄｙｓｏｎ，Ｍ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ４１７，２５－３５（２０１１）．
２８．Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．．Ｇｅｎｏｍｅ ｂｉｏｌｏｇｙ ８，Ｒ２５４（２００７）．
２９．Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．－Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４３，Ｄ４１３－２２（２０１５）．
３０．Ｋａｔｚ，Ｂ．Ａ．ｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４，１５４２１－１５４２９（１９９５）．
３１．Ｋａｔｚ，Ｂ．Ａ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｔｒｕｃｔ ２６，２７－４５（１９９７）．
３２．Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ．Ｂ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｔｒｕｃｔ ２６，４０１－４２４（１９９７）．
３３．Ｇｉｅｂｅｌ，Ｌ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４，１５４３０－１５４３５（１９９５）．
３４．Ｈｏｌｌｅｒ，Ｐ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９７，５３８７－５３９２（２０００）．
３５．Ｌｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３，３４９－３５４（２００５）．
３６．Ｗｏｚｎｉａｋ－Ｋｎｏｐｐ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．２３，２８９－２９７（２０１０）．
３７．Ｙｉｎｇ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １８４４，１９７７－１９８２（２０１４）．
３８．Ｂｉｎｚ，Ｈ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３，１２５７－１２６８（２００５）．
３９．Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８，２９５－３０４（２００７）．
４０．Ｇｅｂａｕｅｒ，Ｍ．＆ Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １３，２４５－２５５（２００９）．
４１．Ｈｕｆｔｏｎ，Ｓ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４７５，２２５－２３１（２０００）．
４２．Ｎｏｒｄ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５，７７２－７７７（１９９７）．
４３．Ｎｙｇｒｅｎ，Ｐ．－Ａ．＆ Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２９０，３－２８（２００４）．
４４．Ｋｏｉｄｅ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ４１５，３９３－４０５（２０１２）．
４５．Ｓｔｅｉｎｅｒ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３８２，１２１１－１２２７（２００８）．
４６．Ｔｉｅｄｅ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．２７，１４５－１５５（２０１４）．
４７．Ｇｅｂａｕｅｒ，Ｍ．＆ Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．５０３，１５７－１８８（２０１２）．
４８．Ｃｏｌａｓ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３８０，５４８－５５０（１９９６）．
４９．Ｄｅ Ｍｅｙｅｒ，Ｔ ｅｔ ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３２，２６３－２７０（２０１４）．
５０．Ｓｈａｏ，Ｃ．－Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４，６５６－６６５（２００７）．
５１．Ｋｒｕｚｉｋｉ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２２，９４６－９５６（２０１５）．
５２．Ｎｙｇｒｅｎ，Ｐ．－Ａ．ＦＥＢＳ Ｊ．２７５，２６６８－２６７６（２００８）．
５３．Ｊｏｓｔ，Ｃ．＆ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２７，１０２－１１２（２０１４）．
５４．Ｋｏｌｍａｒ，Ｈ．ＦＥＢＳ Ｊ．２７５，２６８４－２６９０（２００８）．
５５．Ｍｏｕｈａｔ，Ｓ．ｅｔ ａｌ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｅｓｉｇｎ １４，２５０３－２５１８（２００８）．
５６．Ｗａｎｇ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７，５０５－５１３（２０００）．
５７．Ｇｒａｃｙ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３６，Ｄ３１４－９（２００８）．
５８．Ｅｎｇｌａｎｄ，Ｓ．＆ ｄｅ Ｇｒｏｏｔ，Ｍ．Ｊ．Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１５８，１４１３－１４２５（２００９）．
５９．Ｃｌａｒｅ，Ｊ．Ｊ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ｄｒｕｇｓ １９，４５－６２（２０１０）．
６０．Ｋｏｌｍａｒ，Ｈ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｄｉａｇｎ １０，３６１－３６８（２０１０）．
６１．Ｇｅｌｌｙ，Ｊ．－Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３２，Ｄ１５６－９（２００４）．
６２．Ｃｏｍｂｅｌｌｅｓ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ７３，８７－１０３（２００８）．
６３．Ｈｅｉｔｚ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３３，８３７－８４６（１９９５）．
６４．Ｃｈｅｅｋ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ３５９，２１５－２３７（２００６）．
６５．Ｙｕ，Ｆ．Ｈ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５７，３８７－３９５（２００５）．
６６．Ｅｓｃｏｕｂａｓ，Ｐ．Ｍｏｌ．Ｄｉｖｅｒｓ．１０，５４５－５５４（２００６）．
６７．Ｋｌｉｎｔ，Ｊ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｔｏｘｉｃｏｎ ６０，４７８－４９１（２０１２）．
６８．Ｓｈｕ，Ｑ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．１１，２４５－２５２（２００２）．
６９．Ｕｅｂｅｒｈｅｉｄｅ，Ｂ．Ｍ．ｅｔ ａｌ ＰＮＡＳ ＵＳＡ １０６，６９１０－６９１５（２００９）．
７０．Ｙａｎｇ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．ＮＡＳ ＵＳＡ（２０１３）．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１３０６２８５１１０
７１．Ｐｅｎｇ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７７，４７５６４－４７５７１（２００２）．
７２．Ｘｉａｏ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ７８，１１２４－１１３４（２０１０）．
７３．Ｃｒｅｓｔ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６７，１６４０－１６４７（１９９２）．
７４．Ｔｕｄｏｒ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３，３１７－３２０（１９９６）
７５．Ｇａｌａｔ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．ＦＥＢＳ Ｊ．２７５，３２０７－３２２５（２００８）．
７６．ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｊ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３４８，５５２－５５４
７７．Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９，４１３３－４１３７（１９９１）．
７８．Ｚｈａｎｇ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ＵＳＡ １０９，１５７２８－１５７３３（２０１２）．
７９．Ｘｉｅ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ＵＳＡ １１０，８０９９－８１０４（２０１３）．
８０．Ｎｉｓｈｉｍｉｙａ，Ｄ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９８，１０３１－１０４２（２０１４）．
８１．Ｖｅｎｄｅｌ，Ｍ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．５２６，１８８－１９３（２０１２）．
８２．Ｂａｇａｌ，Ｓ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５６，５９３－６２４（２０１３）．
８３．Ｈｕｂｎｅｒ，Ｃ．Ａ．＆ Ｊｅｎｔｓｃｈ，Ｔ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１１，２４３５－２４４５（２００２）．
８４．Ｊｅｎｔｓｃｈ，Ｔ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．６，１０３９－１０４７（２００４）．
８５．Ｌｕ，Ｑ．＆ Ａｎ，Ｗ．Ｆ．Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ １１，１８５－１９４（２００８）．
８６．Ｔａｔｅ，Ｃ．Ｇ．．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５０４，９４－９８（２００１）．
８７．Ｓｈｉｎｔｒｅ，Ｃ．Ａ．ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ＵＳＡ １１０，９７１０－９７１５（２０１３）．
８８．Ｓｕｈａｒｎｉ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｎｏｃｌｏｎ Ａｎｔｉｂ Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ３３，３７８－３８５（２０１４）．
８９．Ｐａｖｌｉｄｏｕ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ８，ｅ７２２７２（２０１３）．
９０．Ｔｉｌｌｏｔｓｏｎ，Ｂ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．２６，１０１－１１２（２０１３）．
９１．Ｚｈａｎｇ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０，７３４－７４１（２０１３）．
９２．Ｇｕｎａｓｅｋｅｒａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５１，７６９７－７７０４（２００８）．
９３．Ｋｅｌｌｅｒ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．．ＰＬｏＳ ＯＮＥ １０，ｅ０１２７１６９（２０１５）．
９４．Ｊｕｎｇ，Ｓ．＆ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１０，９５９－９６６（１９９７）．
９５．Ａｋｅｒｓｔｒｏｍ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １７７，１５１－１６３（１９９４）．
９６．Ｊｅｓｐｅｒｓ，Ｌ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２，１１６１－１１６５（２００４）．
９７．Ｒｉｃｈｌｅｒ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ５，８７－９３（２００７）．
９８．Ｐｏｄｕｓｔ，Ｖ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ（２０１５）．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｃｏｎｒｅｌ．２０１５．１０．０３８
９９．Ｓｃｈｌａｐｓｃｈｙ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．２６，４８９－５０１（２０１３）．
１００．Ｐｅｒｓｈａｄ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ２３，２７９－２８８（２０１０）．
１０１．Ｔａｐｅ，Ｃ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ＵＳＡ １０８，５５７８－５５８３（２０１１）．
１０２．Ｖａｕｇｈａｎ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４，３０９－３１４（１９９６）．
１０３．Ｆａｖｅｌ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．３３，２０２－２０８（１９８９）．
１０４．Ｃｈｉｃｈｅ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ５，３４１－３４９
１０５．Ａｚｚａｚｙ，Ｈ．Ｍ．Ｅ．＆ Ｈｉｇｈｓｍｉｔｈ，Ｗ．Ｅ．．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５，４２５－４４５（２００２）．
１０６．Ｇｏｌｅｔｚ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ３１５，１０８７－１０９７（２００２）．
１０７．Ｌｅｅ，Ｃ．Ｍ．Ｙ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ２，３００１－３００８（２００７）．
１０８．Ｈａｃｋｅｒ，Ｄ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ９２，６７－７６（２０１３）．
１０９．Ｐｈａｓｅｒ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ ｓｏｆｔｗａｒｅ．４０，６５８－６７４（２００７）．
１１０．ＰＨＥＮＩＸ：ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｐｙｔｈｏｎ－ｂａｓｅｄ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ．６６，２１３－２２１（２０１０）．
１１１．Ａｆｏｎｉｎｅ，Ｐ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．６８，３５２－３６７（２０１２）．
１１２．Ｓｐｉｅｓｓ，Ｃ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６７，９５－１０６（２０１５）．
１１３．Ｆａｌｋ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ５８，６９－７８（２０１２）．
１１４．Ｈｏｓｓｅ，Ｒ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．１５，１４－２７（２００６）．
１１５．Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ－Ｓｕａｒｅｚ，Ｘ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４２，Ｄ１－６（２０１４）．
１１６．Ｒｏｃｈａ，Ｌ．．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（２０１４）．
１１７．Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｃ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ２３６，１０７９－１０９２（１９９４）．
１１８．Ｄａｗｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ３，９３６（２０１２）．
１１９．Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９（１９），５７２２－５７３０（２０００）
１２０．Ｏｂｅｒｍｅｉｅｒ，Ｂ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｄ １９，１５８４－１５９６（２０１３））
１２１．Ｕｂｏｇｕ，Ｅ．Ｅ．．Ｊ．Ｖａｓｃ．Ｒｅｓ．５０，２８９－３０３（２０１３））．
１２２．Ｄｉｏｃｈｏｔ Ｓ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ４９０，５５２－５５５（２０１２）．
１２３．Ｋａｗａｈａｒａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，３１５，１３２－１３８．（２００４）
１２４．Ｋａｗａｈａｒａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１３３，１５４－１６１ ．（２００８）．
１２５．Ｋａｗａｈａｒａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，５５，４０２－４０８．（２０１１）

Claims (46)

  1. スクリーニング方法であって、
    （ｉ）結合メンバーの親ライブラリーを用意することであって、前記ライブラリー中のそれぞれの結合メンバーは融合タンパク質であり、
    前記融合タンパク質が、レシピエント多様性足場ドメイン中に挿入されたドナー多様性足場ドメインを含み、
    前記ドナー多様性足場ドメインは、１００個以下のアミノ酸からなり、ドナー多様性足場ドメイン内の４個以上のシステイン残基によって形成される２個以上のジスルフィド架橋を含むシステインリッチペプチドであり、
    前記システインリッチペプチドは、イオンチャネル調節ペプチド、毒素ペプチド、又はノッチンであり、
    前記レシピエント多様性足場ドメインは、抗体可変ドメインであり、
    前記挿入されたとは、前記抗体可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２又はＣＤＲ３が前記システインリッチペプチドで置換されることであり、
    （ｉｉ）イオンチャネル調節ペプチド、毒素ペプチド、又はノッチンが結合する物質にに対する結合活性に基づいて前記ライブラリー中の結合メンバーをスクリーニングすること、および
    （ｉｉｉ）前記物質に対する結合活性を示す、前記親ライブラリー中の１個または複数の結合メンバーを特定すること、
    を含む、方法。
  2. 前記ドナー多様性足場ドメインのＮ末端とＣ末端は、最大４アミノ酸のリンカーで前記レシピエント多様性足場ドメインに連結されている、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ドナー多様性足場ドメインは、ノッチンである、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記レシピエント多様性足場は、抗体軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン、又は抗体重鎖可変（ＶＨ）ドメインである、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
  5. 前記レシピエント多様性足場ドメインは、抗体ＶＬドメインである、請求項４に記載の方法。
  6. 前記結合メンバーは、前記融合タンパク質と結合したパートナードメインとして抗体ＶＨドメインを含む、請求項５に記載の方法。
  7. 前記ＶＬドメイン及び前記ＶＨドメインは可撓性リンカーによって連結されている、請求項６に記載の方法。
  8. 前記ドナー多様性足場ドメインは、前記抗体可変ドメインのＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、又はＶＬ ＣＤＲ３を置換する、請求項４～７のいずれかに記載の方法。
  9. 前記ドナー多様性足場ドメインは、前記抗体ＶＬドメインのＣＤＲ１又はＣＤＲ２を置換する、請求項８に記載の方法。
  10. 下記により前記１個または複数の結合メンバーをさらに濃縮することを含む、請求項１～９のいずれかに記載の方法：
    （ａ）前記１個または複数の結合メンバーを回収すること、
    （ｂ）前記回収した結合メンバーを前記結合活性による選択に供すること、及び
    （ｃ）前記１個または複数の選択された結合メンバーを回収すること。
  11. ステップ（ｂ）および（ｃ）を１回以上繰り返すことを含む、請求項１０に記載の方法。
  12. 下記をさらに含む、請求項１～１１のいずれかに記載の方法：
    （ｉｖ）１個または複数の特定された親結合メンバーのアミノ酸配列中の、１個または複数の位置に多様なアミノ酸残基を導入し、結合メンバーの改変ライブラリーを生成すること、
    （ｖ）前記改変ライブラリーから前記物質に対する結合活性を示す改変結合メンバーをスクリーニングすること、および
    （ｖｉ）前記改変ライブラリー中の、前記物質に対する結合活性を示す１個または複数の改変結合メンバーを特定すること。
  13. 下記により前記１個または複数の結合メンバーをさらに濃縮することを含む、請求項１２に記載の方法：
    （ｅ）前記１個または複数の改変結合メンバーを回収すること、
    （ｆ）前記回収した改変結合メンバーを前記結合活性による選択に供すること、および
    （ｇ）前記１個または複数の選択された結合メンバーを回収すること。
  14. ステップ（ｆ）および（ｇ）を１回以上繰り返すことを含む、請求項１３に記載の方法。
  15. 下記を含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法：
    （ｖｉｉ）前記１個または複数の特定された結合メンバーまたは改変結合メンバー由来の前記融合タンパク質を、結合パートナーの多様性集団と結合させて、結合メンバーのシャッフルライブラリーを生成すること、
    （ｖｉｉｉ）前記シャッフルライブラリーから前記物質に対する結合活性を示すシャッフル結合メンバーをスクリーニングすること、
    （ｉｘ）前記物質に対する結合活性を示す１個または複数のシャッフル結合メンバーを特定すること。
  16. 下記により前記１個または複数のシャッフル結合メンバーをさらに濃縮することを含む、請求項１５に記載の方法：
    （ｉ）前記１個または複数のシャッフル結合メンバーを回収すること、
    （ｊ）前記回収したシャッフル結合メンバーを前記結合活性による選択に供すること、及び
    （ｋ）前記１個または複数の選択された結合改変メンバーを回収すること。
  17. ステップ（ｊ）および（ｋ）を１回以上繰り返すことを含む、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記融合タンパク質のドナーおよびレシピエントの両方の多様性足場が、前記融合タンパク質の結合活性に寄与する、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. 前記ライブラリー由来の１個または複数の特定された結合メンバーを単離および／または精製することを含む、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。
  20. 前記ライブラリー中の結合メンバーが、前記結合メンバーをコードする核酸を含むリボソーム、細胞またはウイルスの表面上に提示される、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。
  21. 前記ライブラリー由来の前記１個または複数の特定された結合メンバーを提示する前記リボソーム、細胞またはウイルスを単離および／または精製することを含む、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記ライブラリー由来の前記１個または複数の特定された結合メンバーをコードする前記核酸を単離および／または精製することを含む、請求項２０または２１に記載の方法。
  23. 前記ライブラリー由来の前記１個または複数の特定された結合メンバーをコードする前記核酸を増幅および／またはクローニングすることを含む、請求項２０～２２のいずれか１項に記載の方法。
  24. 前記ライブラリー由来の１個または複数の特定された結合メンバーを合成または組み換え発現させることを含む、請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法。
  25. 前記ライブラリーから特定された前記１個または複数の結合メンバーの標的分子の活性に対する効果を測定することを含む、請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法。
  26. 前記標的分子が、イオンチャネルであり、前記１個または複数の特定された結合メンバーの、前記チャネルを通るイオン流に対する効果が測定される、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記親ライブラリー由来の１個または複数の特定された結合メンバーから単離されたドナー多様性足場ドメインを合成または組み替え発現させることを含む、請求項１～２５のいずれか１項に記載の方法。
  28. １個または複数の前記特定された結合メンバーを、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、Ｆｃ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭまたはＩｇＧとして再フォーマットすることを含む、請求項１～２７のいずれか１項に記載の方法。
  29. 治療薬部分、半減期延長部分または検出可能な標識を、前記１個または複数の特定された結合メンバーに付加することを含む、請求項１～２８のいずれか１項に記載の方法。
  30. 結合メンバーのライブラリー生成方法であって、
    （ｉ）レシピエント多様性足場ドメインに挿入されたドナー多様性足場ドメインを含む融合タンパク質の多様性集団をコードする核酸の集団を用意することであって、前記ライブラリー中のそれぞれの結合メンバーは融合タンパク質であり、
    前記ドナー多様性足場ドメインは、１００個以下のアミノ酸からなり、ドナー多様性足場ドメイン内の４個以上のシステイン残基によって形成される２個以上のジスルフィド架橋を含むシステインリッチペプチドであり、
    前記システインリッチペプチドは、イオンチャネル調節ペプチド、毒素ペプチド、又はノッチンであり、
    前記レシピエント多様性足場ドメインは、抗体可変ドメインであり、
    前記挿入されたとは、前記抗体可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２又はＣＤＲ３が前記システインリッチペプチドで置換されることであり、
    （ｉｉ）前記核酸集団を発現させて、前記多様性集団を生成し、それにより、結合メンバーのライブラリーを生成すること、
    を含む、方法。
  31. 前記ドナー多様性足場ドメインのＮ末端及びＣ末端は、最大４アミノ酸のリンカーで前記レシピエント多様性足場ドメインに連結されている、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記核酸集団を発現させて、前記多様性集団を生成すること、及び
    前記融合タンパク質をパートナードメインの集団に連結させること、
    を含み、結合メンバーのライブラリーを生成する、
    請求項３０又は３１に記載の方法。
  33. 前記核酸が、細胞中でまたは無細胞のリボソーム中で発現される、請求項３０～３２のいずれかに記載の方法。
  34. 前記細胞が原核細胞である、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記細胞が真核細胞である、請求項３３に記載の方法。
  36. 前記真核細胞が、植物、酵母、昆虫または哺乳動物細胞である、請求項３５に記載の方法。
  37. 結合メンバーのライブラリーであって、
    前記ライブラリー中のそれぞれの結合メンバーは融合タンパク質であり、前記結合メンバーは、レシピエント多様性足場ドメインに挿入されたドナー多様性足場ドメインを含む融合タンパク質であり、
    前記ドナー多様性足場ドメインは、１００個以下のアミノ酸からなり、ドナー多様性足場ドメイン内の４個以上のシステイン残基によって形成される２個以上のジスルフィド架橋を含むシステインリッチペプチドであり、 前記システインリッチペプチドは、イオンチャネル調節ペプチド、毒素ペプチド、又はノッチンであり、
    前記レシピエント多様性足場ドメインは、抗体可変ドメインであり、
    前記挿入されたとは、前記抗体可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２又はＣＤＲ３が前記システインリッチペプチドで置換されることである、
    ライブラリー。
  38. 前記ドナー多様性足場ドメインのＮ末端及びＣ末端は、最大４アミノ酸のリンカーで前記レシピエント多様性足場ドメインに連結されている、請求項３７に記載のライブラリー。
  39. 前記融合タンパク質が結合パートナーに結合してヘテロダイマーを形成する、請求項３７又は３８に記載のライブラリー。
  40. 結合メンバーの生成方法であって、
    前記結合メンバーは融合タンパク質であり、
    （ｉ）ドナー多様性足場ドメインをコードする核酸を、レシピエント多様性足場ドメインをコードする核酸に挿入して、融合タンパク質をコードするキメラ核酸を生成すること、
    ここで、前記ドナー多様性足場ドメインは、１００個以下のアミノ酸からなり、ドナー多様性足場ドメイン内の４個以上のシステイン残基によって形成される２個以上のジスルフィド架橋を含むシステインリッチペプチドであり、
    前記システインリッチペプチドは、イオンチャネル調節ペプチド、毒素ペプチド、又はノッチンであり、
    前記レシピエント多様性足場ドメインは、抗体可変ドメインであり、
    前記挿入されたとは、前記抗体可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２又はＣＤＲ３が前記システインリッチペプチドで置換されることであり、 及び
    （ｉｉ）前記キメラ核酸を発現させて、前記融合タンパク質を生成すること、
    を含む、方法。
  41. 前記融合タンパク質をパートナードメインに付加することを更に含む、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記レシピエント多様性足場ドメインが、抗体軽鎖可変（ＶＬ）ドメインである、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記パートナードメインが、抗体重鎖可変（ＶＨ）ドメインである、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記ＶＬドメインおよび前記ＶＨドメインが可撓性リンカーにより連結されている、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記ドナー多様性足場ドメインが、前記抗体ＶＬドメインのＣＤＲ１またはＣＤＲ２の全体またはその一部を置換する、請求項４２～４４のいずれかに記載の方法。
  46. 請求項３７～３９のいずれか１項に記載のライブラリーをコードする核酸の集団。
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