JPS61181383A - ペニシリン−ｇ−アミダ−ゼの発現に好適なプラスミドそれを有する微生物及び該プラスミドの製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ペニシリン−〇−アミダーゼを発現させるた
めに好適なプラスミド、このプラスミドを含有する微生
物、該プラスミドの製法及びこれを用いるペニシリン−
Ｇ−アミダーゼの製法に関する。

従来の技術 べ゛ニジリンアシラーゼとも称されるペニシリン−Ｇ−
アミダーゼ（ペニシリン−Ｇ−アミドヒドロラーゼＥ、
Ｃ，３，５，１，ｌ　１　）は、ペニシリンＧｔ６−ア
ミノペニシラン酸及びフェニル酢酸に分解することに接
触作用をする。６−アミノペニシラン酸は、一連の工業
的に製造される半合成抗生物質の前駆物質である。従っ
て、多量のこの酵素の需要がある。

これを得る１つの可能性は、このペニシリン−Ｇ−アミ
ダーゼ−コード遺伝子を細胞中に高いコピー数（約５０
）で存在するプラスミド中１クローン化すること！ある
。しかしながら、この際、導入された出発菌株ＡＴＣＣ
１１１０５に対して５倍だけの増加が認められたにすぎ
なイ〔メイ−２−（Ｍａｙｅｒ　）　、　Ｈ，コリンズ
（Ｃｏｌ　Ｉ　１ｎｓ）、Ｊ、７グｆ　−（Ｗａｇｎｅ
ｒ　）　、　Ｆ、　（１９７９年）によるプラスミド・
オブ・メディカル、エンライロンメンタル・アンド・コ
マ−シャＪＬｔ・インポーｐ　：ｙ　ス（ｐｌａｓｍｉ
ｄｓ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ　、　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅ
ｎｔａｌ　ａｎｄ　Ｃｏｒｒｒｎｅｒｃｉａｌ　　Ｉｍ
ｐｏｒｔａｎｃｅ　；　Ｔｉｍｍ１ｓ　。

Ｋ、Ｎ、　ｕｎｄＰｉｊｈｌｅｒ　、　Ａ、　、Ｅｄｓ
、　）　４５９〜４６９頁エルスピア／ノースーホーラ
ンド・ビオケミカル−プＬ／　ス（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　
／　Ｎｏｒｔｈ　−ＨｏｌａｎｄＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ
　Ｐｒｅｓｓ　、　Ａｍｓｔｅｒｄａｍ　）参照〕。ペ
ニシリン−Ｇ−アミダーゼ−コード遺伝子全適当な表現
ベクター中！高い合成効率でもたらす試みは、これが宿
主細胞を溶解する結果を示した。このことは、ペニシリ
ン−Ｇ−アミダーゼ−コード遺伝子の野性型対立遺伝子
の高められた発現により、高い合成効率の努力目標は達
成１きないことを示している。

酵素に関する情報は、デンキシリセ核酸（ＤＮＡ）中に
含有されている。このＤＮＡはＤＮＡ−依存性ＲＮＡ−
ポリメラーゼにより、ｍＲＮＡ（メッセンジャーリゼ核
酸）に翻訳される。このように合成されたｍＲＮＡはリ
セソームに接して蛋白質に翻訳され、この際、それぞれ
３個のヌクレオチド（トリプレット又はコドン〕−遺伝
暗号の規則により−が特定のアミノ酸の構造を決定する
。

ＤＮＡ−面上の統御領域は、どの位置？ＤＮＡの１本の
鎖がｍＲＮＡに移行され（プロモーター配列〕、もしく
はどの位置でｍＲＮＡの合成が停止される（ターミネー
タ−配列）かを決める。

終止−及び開始−配列は、同様に、蛋白質合成（翻訳）
のその平面上で公知である。この際一般に、ＡＴＧ（こ
れはｆ−メチオニンに翻訳される）は、蛋白質の開始部
を決め、例えばＴＡＡ又はＴＡＧはこの翻訳の終シを決
定する。

遺伝子表現のための知識は、例えばＢ、レウイｙ　（Ｌ
ｅｗ　ｉ、ｎ　）　（Ｄ　’Ｉン・エクスプレッション
（Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　）第１巻１９７４
年（ＪｏｈｎＷｉ　Ｉｅｙ　＋　５ｏｎｓ　Ｌ　ＴＤ発
行）に記載されテイル。

ＤＮＡ−断片の組換えは、まず特定のＤＮＡ−配列を認
識するヌクレアーゼでＤＮＡをこの配列を有する位置で
切断する方式フ行なうことは公知である。それぞれ特定
のＤＮＡ−位置を切断する制限エンドヌクレアーゼの多
くは公知ｆあるから、ＤＮＡ−配列は、まったく特定の
方法で適当なヌクレアーゼの選択により所望に応じて切
断することができる。このような制限エンドヌクレアー
ゼは平滑又は突出末端を二本鎖ＤＮＡ中に形成する。平
滑もしくは突出末端の結合は、リガーゼと称される酵素
により、大抵は酵素Ｔ４−ＤＮＡ−リガーゼを用いて行
なう。

ところで、本発明は、酵素ペニシリン−〇−アミドヒド
ロラーゼを多量に得る前記の問題を解決することを課題
としている。

殊に、本発明の目的は、宿主細胞を溶解することなく高
い合成効率をもだらすペニシリン−Ｇ−アミドヒトロラ
ーぜの表現ベクターを得ることｔある。

この課題は、本発明により、ペニシリン−Ｇ−アミダー
ゼの表現に好適なプラスミドにより解決され、これは、
完全な遺伝子の５′末端側で翻訳された部位の最初の７
８塩基が欠失している不完全なペニシリン−Ｇ−アミダ
ーゼ−遺伝子を有する。

プラスミドは、染色体外ＤＮＡ−分子″ｒ！ある。　　
　゛この分子は、それ自体増殖することの１きる情報（
複製源）及び付加的に、１種以上の選択可能な特性例え
ば抗生物質に対する抵抗を有する。

これらの特性は、有利に、所望のプラスミドを有するよ
うな宿主細胞を認識させる。更に、これらプラスミドは
、特異的に１種以上の制限酵素により特定の位置↑切断
されうる特性を有する。引続き、例えば制限酵素で切断
された他のＤＮＡ−断片の付与により、末端の連結下に
、新しいプラスミドを得ることが１きる。特にこの種の
操作に好適なプラスミドのいくつか例えばプラスミドｐ
ＢＲ３２２は、既に市場で入手できる。

ＤＮＡ−組換え法の使用即ちＤＮＡ−切断及び適当なり
ＮＡ−フラグメントの融合による本発明の新しいプラス
ミドにすることは、細胞の外で、試験管内で行なう。生
じる新しい表現プラスミドは、形質転換として公知の方
法で新しい宿主細胞（微生物〕中に移すことができる。

所望の生成遺伝子をコードするＤＮＡ−断片は、適当な
転写−及び翻訳−開始の制御下に存在するという前提の
もとで、この微生物により、酵素のポリペプチド配列を
表出させることができる。この生成遺伝子は、必要な場
合には、宿主細胞の溶解及び更に精製工程の後に、他の
蛋白質を除いて得ることができる。

本発明は、天然のペニシリン−Ｇ−アミダーゼ−遺伝子
は、ポリペプチドを８４６のアミノ酸でコードする遺伝
子断片及び前接続されたプロモーター配列よシなシ、こ
の際、１個のプラスミド中への予めの組込の後の微生物
による表現の際の完全遺伝子の不充分な合成効率に関し
て、みかけ上は、特に２３６〜２８９の位置を占める５
４個のアミノ酸のペプチドに依るという意想外の認識に
基ずく。従って、遺伝子のこれに関してコードする塩基
７０５〜８６７を除くと、発現抑制は除かれる。

２個の短かいメチオニンで始まるポリペプチドをコード
する２個の遺伝子断片が得られる。

これらの短かいポリペプチドは、これらが−緒に表現さ
れる際に、相互に生物学的に活性で、天然に存在する２
個のサブユニットよシなる酵素に相応すると思われる。

従って、本発明によるプラスミドは、不完全なペニシリ
ン−Ｇ−アミダーゼ−遺伝子を、これら双方の遺伝子断
片により表わされる２個の別個の断片の形で包埋して含
有していてもよく、この際、これら断片は完全遺伝子の
５′末端から数えて７９番もしくは８６８番の塩基ｆ開
始し、７０５〜８６７のコード塩基を欠失している。完
全な遺伝子は塩基２５６８個を有するから、以後、塩基
７９で開始し、塩基７０５で終止する遺伝子断片及び生
物学的に活性の本発明により得られる酵素のサブユニッ
トをコードする遺伝子断片を小さいサブユニット（α）
の遺伝子断片と称し、塩基８６８で開始し、塩基２５４
１（終止コドンを包含〕又は２５３８（翻訳された部位
のみ）で終止する遺伝子断片（これは本発明により得ら
れる活性酵素の第２のサブユニットをコードする）を大
きいサブユニット（β〕の遺伝子フラグメントと称する
。

いわゆる蛋白質成熟の分野における天然酵素においては
、まず、生物学的に活性の酵素は、１次的に得られる蛋
白質の切断及び２個のサブユニットの形成、次いでこれ
らが集まって活性酵素になることにより生じると仮定さ
れる。蛋白質成熟は、酵素発現のための１つの限られた
現象１あるから、α−及びβ−サブユニットに関する２
個の別個の遺伝子断片を配置することにより、生物学的
活性酵素の発現を更に高めることが本発明により達成で
きる。次いで、各遺伝子断片の前に開始コドンを一般に
コドンＡＴＧの形１新たに導入する。このコドンと共に
、本発明によるそれぞれの不完全遺伝子の５′末端に、
ｍＲＮＡへの翻訳を可能にするプロモーター配列有利に
Ｉａｃ−プロモーター又はｔｒｐ−プロモーターをも導
入すべき〒ある。しかしながら、他のプロモーターも同
様に使用フきる。

本発明によるプラスミＰは、このプラスミドを含有する
微生物の良好な認識可能性のために、クロラムフェニコ
ール、テトラサイクリン及び／又はカナマイシンに対す
る抵抗因子少なくとも１個を有するのが有利−ｒ！ある
。従って、それぞれ存在する抵抗因子に相応する抗生物
質を含有する培地中受は、本発明によるプラスミドを有
するような微生物のみが生長する。しかしながら、この
ような抵抗因子は本発明にとってはそれ自体必要ではな
い。

本発明のもう１つの目的物は、特許請求の範囲１〜９項
の１項に記載のプラスミド少なくとも１個を有する微生
物である。この際、本発明によるプラスミドは、大きい
又は小さいサブユニットに関する遺伝子断片のみを有す
ると、本発明による生物学的に活性な酵素の形成のため
には、この微生物は小さいサブユニットに関する遺伝子
フラグメントを有するプラスミドも、α−サブユニット
に関する遺伝子７ラグメントを有するプラスミドもしく
は双方のサブユニットをコードするプラスミドを有する
ことが必要である。しかしながら、選択的に、１種の微
生物が双方のサブユニットの１つに関する１種のプラス
ミドのみを有することもできる。この場合には、この微
生物の培養は、他のサブユニットに関するプラスミドを
有する他の微生物と混合して行なうことが１きる。この
際＼後者の場合には、双方のプラスミドに関して同じ宿
主微生物を使用するのが有利である。各々１種の酵素サ
ブユニットを形成する双方の微生物の培養を別個に行な
うことも１きる。次いｆｌその抽出物を混合すると、は
じめて活性酵素が形成される。宿主微生物としては、遺
伝子工学に一般的に使用されている宿主微生物有利にＥ
、コＩＪ−（Ｃｏｌｉ）Ｋ１２−菌株の誘導物を使用す
ることが１きる。特に、Ｅ、コリー菌株５４−２Δ（ｌ
ａｃ　、　ｐｒｏ　）　ｒｅｃ　Ａ　、　ｑｐｓｌ　、
　Ｆ’　Ｉａｃ　ｉＱ　、　ＤＳＭ３０６６及びｏｓ４
１０　、　ｍ１ｎＡ　、　ｍ１ｎｅ　。

ｒｐｓｌ　、　　ｓｕｐ＋、　ＤＳＭ　３０６５及びＤ
ＳＭ３０５８を用いて特に良好な結果が得られた。

有利な１実施形では゛、Ｅ、コリー菌株３ｏ５８が本発
明によるプラスミドｐ８Ｔ２１２を有スる。

従って、この細胞の溶解の後及び細胞抽出物の４〜８時
間インキュベーションの後ニ、α−及びβ−サブユニッ
トからなる活性ペニシリン−〇−アミダーゼを得ること
ができる。

本発明によるプラスミドの製造のために、特定の微生物
中１の発現に特に好適〒ある公知のかつ大部分市販の出
発プラスミドを使用するのが有利！ある。例えばプラス
ミドｐＢＲ３２２即ち市販のプラスミドは、特にすべて
のＥ、コリー菌株中での表現のために特に好適であシ、
従って、本発明の範囲でも有利に使用される。従って、
本発明によるプラスミドの製造の以後の記載は、プラス
ミドｐＢＲ３２２の誘導物（１部は市販されているか又
は公知方法ｔこのプラスミドから製造することができる
）から出発する。

しかしながらＥ、コリー以外の宿主微生物に関しては、
他の基本プラスミドがよシ好適ｆあり、スミドから出発
するのが有利である。このようなプラスミドは当業者に
とって公知であシ、ここで詳述する必要はない。これら
は、例えばＡＴＣＣカタログ中（ＤＣ）　Ｌ／（７ズ（
５ｔｒａｉｎｓ　）■中に記載されている。

本発明によるプラスミドの製造は、公知方法で行ない、
この際、適当な天然に存在するか又は合成リンカ−（Ｌ
ｉｎｋｅｒ　）により得られた制限切断部位を、１機能
のあるプロモーターの制御下に不完全なペニシリン−Ｇ
−アミダーゼ−遺伝子を牛用させるために使用する。好
適なプロモーターの例は、ｔａｃ−プロモーター（Ｆ、
アマ７　（Ａｍａｎｎ　）、Ｊ、　フｏ　グラス（Ｂｒ
ｏｓｉｕｓ　）、Ｍ。

グタシュネ（Ｐｔａｓｈｎｅ　）によるゲン（Ｇｅｎｅ
　）　１９８３年参照〕及びｌａｃ−プロモーター〔Ｌ
、グア１／７テ（Ｇｕａｒｅｎｔｅ　）等によるセル（
Ｃｅ１ｌ　）（ＩＧ）８０年）２０．５４３〜５５３頁
参照〕である。

次に本発明を第１表及び添付図面につき説明する。次の
第１表は、完全なペニシリン−Ｇ−７ミドヒドロラーゼ
ー遺伝子のヌクレオチド−及び蛋白質配列を示すもので
ある。

＋＋　Ｍ　　　　＋”１９−１　　　−＋＋　　　　Ｍ
　＋　　　　ｍ　％　　　　ｖ−−＋＋　Ｆ＋ぐの　　
　Ｉフぐ　　　フロ　　　０．７：＋　　　ぐ■　　　
く■　　　ωｑム１＋Ｌ）Ｉ＋′）い、　　　−０り　
　　（ロ　　　−さ　　　くさ　　　−ローＨ＋＋−Ｆ
＋−１’ｌＪ 第１図の上方には、クローン化に重要な制限エンドヌク
レアーゼ−切断位置が図示されており、下方には成熟ペ
ニシリン−アミドヒドロラーゼの小さいサブユニット及
び大きいサブユニットのアミノ−及びカルダキシ末端の
重要なアミノ酸配列が図示されている。

第２図は、ペニシリン−Ｇ−アミダーゼ及びβ−ガラク
トシダーゼの配列によりコードされる融合蛋白質の構成
を示す図″ｒ！ある。

第３図〜第５図には、ペニシリン−Ｇ−アミダーゼの配
列を有し、成熟して活性、酵素になシうる、蛋白質の発
現に好適なプラスミドｐＢＴ　２１２の構成が示されて
いる。

第６図〜第７図は、ペニシリン−Ｇ−アミダーゼの大き
いサブユニットをコードし、その発現に作用することの
！きる本発明によるプラスミドｐＢＴ１００　、ＤＳＭ
３０６８ｐＣ１構成を示す図である。

第８図はペニシリン−〇−アミダーゼの小さいサブユニ
ットをコードし、その発現に作用することのできる、本
発明によるプラスミドｐＢＴ７０２　、ＤＳＭ３０６７
ｐの構成を示す図である。

以下に記載のＤＮＡ−プレＡレーションの製造、制限ヌ
クレアーゼを用いるＤＮＡの切断、ＤＮＡ−フラグメン
トの融合及び宿主微生物の形質転換の条件は公知であシ
、例えばＲ，Ｗ、デビス（Ｄａｖｉｓ　）、ｏ、、Ｉ？
トスタイン（８ｏｔｓｔｅｉｎ　）及びＪ。

Ｒ，ロス（Ｒｏｔｈ　）によるアドバンスト・バクチリ
アル・ジエネテイクス（１９８０）、コールド・スプリ
ング・ハーバ−・ラゼラトリイ（Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｂ
ａｃｔｅｒｉａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　、　１９８０　
、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ　）並びにＴ、マニアｆ、＜　（Ｍａｎｉａ
ｔｉｓ　）、Ｅ、Ｆ、７リツチ（Ｆｒ１ｔｓｃｈ　）及
ヒＪ、　サムフルー　り（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　）による
モレキュラー・クローニング（１９８２）コールド・ス
プリング・ハーバ−・ラゼラトリイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒＣｌｏｎｉｎｇ、１９８２　、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉ
ｎｇ　）−１ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に記
載されている。

第１表は、５′から３′への方向で翻訳されたヌクレオ
チド２５３８からなる即ちコードｍＲＮＡに相応する完
全なペニシリン−Ｇ−アミダーゼ−遺伝子が示されてい
る。可能な４種のヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ及びＴのそれ
ぞれ３個（トリプレット〕が１個のアミノ酸を決定して
いる（上列）。本発明によるプラスミド中に含有する不
完全なペニシリン−Ｇ−アミダーゼ−遺伝子は、Ｇｌｕ
をコードする７９〜８１の位置のトリプレットＧＡＧで
開始している。この位置フ小さイサブユニットをコード
するフラグメントも開始している。この酵素の大きいサ
ブユニットをコードするフラグメントは、アミノ酸Ｓｅ
ｒをコードするトリプレットＡＧＣを有する位置８６８
フ開始し、Ａｒｇに関するトリプレットＡＧＡを有する
位置２５３８で終止している。これに、なお終止コドン
ＴＡＡが接続しているが、これは本発明のプラスミド中
に含有していてよいが必須ではない。小さいサブユニッ
トをコードする遺伝子フラグメントは７０３〜７０５の
位置のトリプレットＯＣＡを有するアミノ酸Ａｌａで終
止している。

本発明により製造されたプラスミドは、ＤＮＡ−面の構
成に関し、正確に、成熟したサブユニットの蛋白質配列
に基づき得られるカルゼキシー及びアミノ−末端を考慮
している。しかしながら、多くの場合に、カルゼキシー
もしくはアミノ−末端でのアミノ酸の導入又は除去はこ
の酵素活性に影響を及ぼさない。従って、例えば、第２
図に記載のペニシリン−Ｇ−アミダーゼとβ−ガラクト
シダーゼとの間１製造された融合蛋白質は、β−ガラク
トシダーゼのアミノ酸と共にアミン末端になおｐｅｎ　
−Ｇ−アミダーゼの約１２０のアミノ酸を含有する。こ
の融合蛋白質は、β−ガラクトシダーゼの酵素活性を示
している。従って、本発明は、酵素活性が保持されるか
ぎシ、このような変更をも包含している。

第１図は、このことを詳説しておシ、下方にはそれぞれ
小さいサブユニット及び大きいサブユニットの開始、そ
れらの分子量及び終止が図示されている。上方には例に
記載の構成フ利用される一連のヌクレアーゼに関する切
断位置が示されている。

前記のことから、本発明のプラスミドは、第１表に記載
の塩基７９で開始するヌクレオチド配列、塩基７９もし
くは８６８フ開始し、塩基７０５もしくは２５３８で終
止する２個の断片をコードする２種の７ラグメントの１
種又は双方の断片を相互に分れて含有することが明らか
である。本発明によれば、このプラスミドはペニシリン
−Ｇ−アミダーゼの製造のために使用され、この際、本
発明によるプラスミドを含有する微生物を、酵素の発現
下に培養し、この酵素を微生物及び／又は培養液から取
得する。この際微生物としてＥ、コＩＪ−Ｋ１２５４−
２又はｏｓ４１０が有利である。後者菌株は、周辺質性
酵素ペニシリン−〇−アミダーゼの過形成により溶解に
対する安定性で優れている。

実施例 更に次の実施例につき本発明を説明する。

例１ プラスミドｐＢＴ２１２（第２図〜第５図）及出発プラ
スミドとして、ｐＢＴＥｌ−１１、ＤＳＭ３０６１を使
用する。このプラスミドは、約３　ｋｂの大きさのペニ
シリン−Ｇ−アミダーゼコード遺伝子Ｃ（これは第２図
１太く黒い線として示されている）を有する。この遺伝
子の塩基配列は第１表に示されている。これは、第１表
に示されているアミノ酸８４６の酵素活性ポリペプチド
も同様にコードする。このポリペプチドは、天然の完全
な遺伝子の場合には、翻訳後に３回切・断される。この
場合、１〜２６の位置から切断除去されたペプチドはリ
ーダーペプチド（信号ペプチドとも称される）の大きさ
及び特性を有する。このリーダーペプチドなしでのペニ
シリン−Ｇ−アミダーゼの本発明による構成のためには
、プラスミドｐ８Ｔ１４２．ＤＳＭ３０５９から出発す
る。このプラスミドは、アミン末端でペニシリン−〇−
アミダーゼの約１２０個のアミノ酸よりなシ、この末端
の、第５番目のアミノ酸で開始するβ−ガラクトシダー
ゼを融合している蛋白質をコードする。

プラスミドル８Ｔ−１１（第２図）を制限エンドヌクレ
アーゼＨｐａ　Ｉ−ｖ切断し、５ｋｂ大のフラグメント
を低融点アガロースゲル中でノ分級（ＧｒＯｐｅｎｔｒ
ｅｎｎｕｇ　）により単離すル。コノＤＮＡ−フラグメ
ントの各末端からエキソヌクレアーゼ８ａｌ　３１によ
り約５００個の塩基対（Ｂｐ　）　カ除去される。

プラスミドｐＢＴ１１７　、ＤＳＭ３０６３（第２図）
は、β−ガラクトシダーゼ−遺伝子を有し、調節配列即
ちプロモーター及びオペレーター及び開始信号（ＡＴＧ
）を有しない。プラスミドｐ８Ｔ１１７から、ＢａｍＨ
Ｉ及びＰｓｔ　ｌを用いる切断及び４種のデソキシーリ
Ｉヌクレオチドー三燐酸（ｄＡＴＰ　、ｄＴＴＰ　、ｄ
ＣＴＰ及びｄＧＴＰ）の存在におけるＤＮＡ−ポリメラ
ーゼ■（クレノフーフラグメント）Ｋよる突出末端の補
充もしくは離脱の後に、低融点アガロースゲル中１の分
級により　５．５　ｋｂフラグメントが単離される（第
２図〕。このフラグメント１μＩをｐ８Ｔ　Ｅ　１−１
１からの５　ｋｂ　７ラグメント０．２μｓと共にＴ４
−リガーゼ１０単位と共に１昼夜インキユベートする。

この結合突起は菌株Ｅ、コ！Ｊ−に１２５４−２中に移
行される。その選択は、Ｘ−ガル（Ｘ−Ｇａ１　：　ミ
ラー（Ｍｉｌｌｅｒ　）　、　Ｊ、Ｈ，（１９７２）Ｋ
ヨルエクス、ヘリメンツ・イン・モレキュラー・・クエ
ネテイクス、コールＰ・スプリングＨバー　、ｓ　−＊
ラゼラトリイ（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｉｎ　Ｍｏ１ｅ
ｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ
ｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　）　４７
〜５５頁参照〕及びアンピシリン（Ａｍｐｉｃｉｌｌｉ
ｎ　）を含有するインジケータープレート上１行なう。

β−ガラクトシダーゼーボジチプクローンのプラスミド
はＥｃｏ　Ｒｌでの切断により特徴付けられ、このプラ
スミドの１つはｐｅＴ１４２（第２図）フある。

このプラスミドｐＢＴ１４２　＋０ｔｔｌｉをＨｉｎｄ
■及びＨｉｎｄＩ［″ｔ＠完全に切断し、分級により８
００ＢＰ−フラグメントを単離し、このフラグメントを
Ｄｄｅ　Ｉで切断すると、４８０Ｂｐの大きさのフラグ
メントが得られた（第３図）。この７ラグメントを低融
点アガロースゲル中での分級による精製の後に、後退末
端にＤＮＡ−、ｔ？ＩＪメラーゼＩ（クレノフーフラグ
メント〕及びデソキシーリゼヌクレオチドー三燐酸ｄＴ
ＴＰ及びｄＣＴＰで２個のヌクレオチドを補充した。こ
のフラグメント０．１μｇを１単位のＳ１ヌクレアーゼ
と共に、ＮａＣｌ２００ｍモル／ｌ、酢酸Ｎａ　５０　
ｍモに／１（ｐＨ４，５）、ｚｎｓＯ４１ｍモル／ｌ及
ヒクリセリン０．５チを含有する緩衝液中３０℃で３０
分間インキュベートした。これにより、５′−末端で突
出しているリゾヌクレオチドｄＴＭＰは離脱される。

生じるＤＮＡ−フラグメントは、平滑末端を有し、最初
のトリプシン）　（ＧＡＧ　）ｔｒｉ、ぺ＝　シＩＪン
ーＧ−アミダーゼのｌトさいサブユニットの成熟形の最
初のアミノ酸（Ｇｌｕ　）をコートスル。

蛋白質合成の開始を確保するため、このトリプシン）Ｇ
ＡＧの前にＡＴＧを付加する。

ホスホトリエステル法〔フレア（Ｃｒｅａ　）　、　Ｒ
。

カゼシスキイ（ＫａＳＺｅＷＳｋｉ　）　、　Ａ　、　
、ヒｃｙ　ス（Ｈｉｒｏｓ　）　、Ｔ、　イタクラＣ１
ｔａｋｕｒａ　）　、に−によるプロシーデインダス・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オツ・サイエンシ
ス・オプ・ゼ・ＵＳＡ　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ
ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　）　７５　。

（１９７８）、５７６５〜５７６９頁参照〕により、次
の塩基配列： ５’ＣＡＴＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧ３’ ３’ＧＴＡＣＣＴＴＡＡＧＴＡＣ５’ を有するＥｃｏ　−ＡＴＧ−リンカ−が合成される。

このリンカ−を、ポリヌクレオチドキナーゼ！ホスホリ
ル化し、このリンカ−の１００倍過剰を、Ｔ４−リガー
ゼを用いて、前記のＤｄｅ　Ｉ　−フラグメントの平滑
末端に連結させる。引続きＥｃｏ　ＲＩ　Ｉ　ＯＯ単位
で完全ニ切断シ、０．２７ｋｂ−フラグメントをアガロ
ース−ゲルを通して単離する。

シラスミ）’Ｉ）ＫＫ１７７−３　、ＤＳＭ３０６２を
ＥＣＯＲＩ及びＰｓｔ　Ｉを用いて完全に切断する。

アガロース−ゲル中１の寸法分別によ、り２．９ｋｂ−
フラグメントを単離する。

ｐＢＴ１１７はＥｃｏＲＩで制限され、完全にＰｓｔ　
Ｉで切断される。アガロースゲル中での分級により、こ
れから５．５ｋｂの大きさの７ラグメントが単離される
（第４図参照）。

ｐＫＫ１７７−３からの２．９ｋｂベクターフラグメン
トの約１００　ｎｇを、ｐ８Ｔ１１７からの５．５ｋｂ
ｌａｃＺ−フラグメント（７）　２００　ｎｇ及び２７
０Ｂｐ　Ｅｃｏ　ＲＩ　−フラグメント（７）１００ｎ
、９と１昼夜かかつて、Ｔ４−’）ガーゼ１ｏ単位を用
いて連結させる（第牛図参照）。Ｅ６コ＋Ｊ−５４−２
の形質転換の後に、β−ガラクトシダニゼーボジチプク
ローンは、Ｘ−ガル（Ｘ−ｇａ＋）インジケータグレー
ト〔ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ　）　Ｊ　、　　Ｈ，にヨル
エクスヘリメンツ・イン・モレキュラー・ジエネテイク
ス、コールド・スゲリング°バーツク−・　　　ラ　鱈
？　ラ　　ト　リ　　（Ｅｘｐｒｅｒｉｍｅｎｔｓ　　
　ｉｎ　　Ｍｏ１ｅｃｕｆａｒ　ＧｅｎｅｔｉＣ５、Ｃ
ｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　ＬａｂＯｒａｔ
Ｏｒｌ（１９７２）４７〜５５頁参照〕上で同定された
。プラスミド−ＤＮＡのＥｃｏＲＩ−切断及び配列分析
により、プラスミドｐＢＴＩＩ／３゜ＤＳＭ３０６０中
の所望構成が確認される（第４図〕。Ｅｃｏ　ＲＶ−切
断部位の上方で、β−ガラクトシダーゼ−コードＤＮＡ
は除去フき、ペニシリン−アミドレダクターゼ−コード
部位が復元される（第５図）。プラスミドｐＢＴＩｆ／
３をＨｉｎｄＩＩＩで完全に切断し、突出末端に一すメ
ラーゼ■（クレノフーフラグメント）及び４種のデソキ
シーリゼヌクレオチドー三燐酸を補充し、Ｅｃｏ　ＲＶ
で完全に切断し、引続き分級により３゜１　ｋｂ−フラ
グメントを単離する。ｐ８ＴＥ１−１１から、２．５ｋ
ｂ−クラクメン）カ、Ｅｃｏ　ＲＶ　−及びＡｖａ　ｒ
−切断を経て単離される。このＥｃ。

ＲＶ−切断の前に、突出Ａｖａ　Ｉ−末端をポリメラー
ゼ■（クレノフーフラグメント）及び全４種のデツキシ
ーリゾヌクレオチド−三燐酸を用いて平滑にした。双方
の７ラグメン）（３，１ｋｂ及び２．５ｋｂ）を同量比
−？Ｔ４−リガーゼを用いて連結させる。生じるプラス
ミドは１）ＢＴ２１２゜ＤＳＭ３０５８′ｔ％ある。こ
のプラスミドは、ペニシリン−Ｇ−アミダーゼを信号配
列なしにコードする（第５図）。

プラスミドｐＢＴ２１２から、Ｅｃｏ　ＲＴ　及ヒＨｐ
ａ　Ｔを用いる切断により、約７２０　Ｂｐの７ラグメ
ントが単離され、このフラグメントから、一方では、Ｄ
ｄｅＩを用いる切断の後に約４００８ｐＯＥｃｏＲＩ、
Ｄｄｅ　Ｉ　７ラグメントが単離され、他方、Ａｌｕ　
ｌ及びＥｃｏ　ＲＶを用いる切断の後に４１０８ｐフラ
グメントが単離される。

このＥｃｏ　ＲＶ　、Ａｌｕ　Ｉフラグメントに、二本
鎖の変性の後に次の配列 ５’ＣＣＡ　ＡＧＣＴＴＡ　ＴＴＡ　ＴＧＣＴＧＴ　Ｔ
ＴＧ　ＣＧＡ　ＧＴＴ３’を有する２７ｍｅｒ−プライ
マーを交雑させる。

ホスホトリエステル法で合成されたこのプライマー〔フ
レア（Ｃｒｅａ　）等による！ロシーデインダス・オプ
・ザ・ナショナル・アヵデミイ・オブ・サイエンス・Ｕ
、Ｓ、Ａ、　７５　（１９７８）、５７６５〜５７６９
頁参照〕は、６９１〜７゜５の位置の対向鎖に対して相
同フあシ、終止コドンＴＡＡ２個及び１個のＨｉｎｄ　
ｍ−認識配列を有する。

ＤＮＡ−ポリメラーゼ（クレノフーフラグメント）及び
ＤＮＡ合成に必要なデンキシ三燐酸を用いて、非交雑３
′−末端をエキソヌクレオ分解により離脱させ、鎖を５
′から３′の方向に補充する。

このＤＮＡをＨｉｎｄ　■及ヒＤｄｅｌｌ’切断し、約
２５０　Ｂｐの７ラグメントを単離する。Ｅｃｏ　Ｒｉ
及びＨｉｎｄｌｌ［で切断されたベクター分子ｐＫに１
７７−３、約０．４　ｋｂｏＥｃｏＲＩ　ＸＤｄｅ　Ｉ
　７　ラクメント及び約０，２５ｋｂのＤｄｅ　ＩＸＨ
ｉｎｄ　［［７ラフ）ントを、酵素Ｔ４−リガーゼを用
いて結合させる（第８図参照〕。

こうして形成されたプラスミドは、ペニシリン−アミド
ヒドロラーゼの小さいサブユニット（α）をコードし、
ｐＢＴ７０２　、ＤＳＭ３０６７ｐの名称を有する。

例２ プラスミドｐＢＴ２１２を有するＥ、コリー菌株ＤＳＭ
３０５８を完全培地中、誘導原イソプロピルチオガラク
トシド（ＩＰＴＧ）の存在下に、３７℃〒１昼夜培養す
る。細胞を収穫し、溶解させ、この細胞抽出物を３０℃
で４〜８時間イン！−＝−ベートｆる。３０℃での後イ
ンキュベーションにより生じた生成物の５ＤＳ−アクリ
ルアミド−ゲル中での分析の結果は、ペニシリン−Ｇ−
アミダーゼのα−及びβ−サブユニットへのこの前駆蛋
白質の成熟が起こることを示している。双方のサブユニ
ットのｍ現に伴ない、酵素活性を測定することができ、
即ち、細胞抽出物中で蛋白分解性切断及び正確なしゆう
曲が起こシ活性酵素が生じる。

従って、特異的なプロテアーゼの富化により、前駆蛋白
質を定量的に切断して活性酵素にすることが可能である
。

例３ ペニシリン−Ｇ−アミダーゼの大きいサブユニット（β
）の発現のだめのプラスミドの構成大きいサブユニット
の始端における新しい開始信号（ＡＴＧ）の構成のため
に、プライマー開始ＤＮＡ−合成法を使用した。この大
きいサブユニットは、アミノ酸順序Ｓｅｒ　、　ＡＳｎ
’、　Ｍｅｔを有する配列遺伝子の８６８の位置ｆ開始
する。ホスホトリエステル法〔フレア（Ｃｒｅａ　）、
Ｒ，カスゼフスキイ（Ｋａｓｚｅｗｓｋｉ　）、Ａ、　
ヒｏ　ス（Ｈｉｒｏｓ）、Ｔ１イタクラ（Ｉｔａｋｕｒ
ａ　）、Ｋ、によるプロシーデインダス・オプ・ザ・ナ
ショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス・Ｕ、Ｓ、Ａ
、　（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、Ｕ、Ｓ、Ａ、　
）（１９７８）　７５．５７６５〜５７６９頁参照〕に
より、次の塩基順序： Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｍｅｔ　Ｔｒｐ　Ｖａ１５’
ＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧ　ＡＧＣＡＡＴ　ＡＴＧ　ＴＧＧ
　ＧＴＴ　３’を有する２　５　ｍｅｒプライマーが合
成された。

このプライマーは、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏ　Ｒ
Ｉに対する認識配列、ＡＴＧ−開始コドン及びペニシリ
ン−Ｇ−アミドヒドロラーゼの大きいサブユニットの最
初の５個のアミノ酸に関する塩基配列を有する（第６図
参照）。

プラスミ）’ｐＢＴＥ１−１１から、Ｈｐａ　Ｉによる
切断及びアガロースゲル中での分級の後に、１．７ｋｂ
−フラグメントが単離され、このフラグメントはＴａｑ
　Ｉにより完全に後切断され、０．３０　ｋｂ−フラグ
メントが単離される。このフラグメント約０．５μＪを
１００℃で５分間加熱することにより変性し、このパッ
チに未処理の２５　ｍａｒプライマー３００ｐモルを加
え、室温まで冷却させる。ＤＮＡ−ポリメラーゼ１（ク
レノフーフラグメント）１０単位及び全牛種のデソキシ
ーリセヌクレオチドー三燐酸の添加の後に、室温１３時
間インキュベートし、引続き、ＡｖａＩＩ及びＥｃｏ　
ＲＩ↑完全に切断する。２５％の低融点アガロース−ゲ
ル中での分級の後に、６ＱＢｐの大きさのフラグメント
と結合するはずの領域を切断し、フェノール化し、試料
をエーテル抽出し、ＤＮＡをエタノールで沈殿させる。

プラスミドｐＫＫ　１７７−３をＨｉｎｄ　ｍ及びＥｃ
ｏ　ＲＩで完全に切断する。０．８％アガロースゲル中
での分級によＪ　２．９　ｋｂの大きさのＨｉｎｄＩＩ
Ｉ　−Ｅｃｏ　ＲＩ−フラグメントが単離される。

プラスミドｐＢＴＥ　１−１１をＨｉｎｄＩ［Ｉ及びＡ
ｖａＩＩで完全に切断する。０．８％アガロース・−ゲ
ル中テ１７）分級により、２，５　ｋｂ　ｏＨｉｎｄ　
Ｉ［Ｉ　−Ａｖａ　ＩＩ−フラグメントが単離される（
第７図参照）。

このフラグメント各０．１μＩをエタノール−沈殿した
６０Ｂｐ−ＥｃｏＲＩ　−Ａｖａ　Ｉｆ−７ラグメ／ト
に加える。１昼夜にわたる連結の後に、Ｅ、コリー菌株
５４−２は形質転換され、このコロニーヲシュライヒア
／シュルＢＡ８５ニトロセルロースＦ紙（５ｃｈｌｅｉ
ｃｈｅｒ／５ｃｈｉｊｌ　Ｉ　Ｂ　Ａ　６５　Ｎ１ｔｒ
。

−ｚｅｌｌｕｌｏｓｅ　−Ｆｉｌｔｅｒｐａｐｉｅｒ　
）上に押し付け、この濾紙をアンピシリン２０μｋｔを
含有するＬＢ寒天プレート上に移した。６時間成長の後
に、この濾紙をアンピシリン２０μｇ／＝ｄ及びクロラ
ムフェニコール１２．５μｌ／Ｉｔを含有するＬＢ−寒
天プレート上に重ね：１昼夜生長させた。

このコロニーのＤＮＡを変性させ、ニトロセルロース−
濾紙に固定させ、引続き放射能標識された２　５　ｍａ
ｒゾライマーと交雑させた〔デービス（Ｄａｖｉｓ　）
　Ｒ，、Ｗ、Ｊ　トスｌ！イｙ（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ　）
　。

Ｄ、ロス（Ｒｏｔｈ　）　、　Ｊ、Ｒ，によるアドノ々
ンスド・ノ２クチリアル・ジエネテイクス、コールド・
スプリング・バー・ζ−・ラゼラトリイ（Ａｄｖａｎｃ
ｅｄＢａｃｔｅｒｉａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　、　Ｃｏ
１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ　）　（１９８０）による変更を伴ない〕。

濾紙１枚当り、１１０６ｃｐをこの交雑のために使用し
た。室温及び４２℃での洗浄の後に、乾燥した濾紙を室
温で３時間フジＲＸレントゲンフィルムに露呈した。ポ
ジチプ信号を有する１５クローンが同定され、Ｅ′Ｃ０
ＲＩ−切断により新形成された制限位置を検査し、所望
のＤＮＡ−配列を、配列付けにより確認した。生じるグ
ラスミトハ、名称１）ＢＴｌｏｏＯ、ＤＳＭ３０６８ｐ
を有する（第７図参照〕０これは、大きいサブユニット
（β）をコードする。これは、５ＤＳ−ゲルクロマトグ
ラフィ（６４ｋＤ　）及び免疫学的同定により立証され
た。クマシー・ブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　ｂｌｕｅ
　）　テｔｖ着色ハ、β−＋７”ユニ７トは全蛋白質の
約３０〜４０チを成すことを示した。

例蛋 ペニシリン−アミドヒドロラーゼ・のα−・サブユニッ
トの発現ニ プラスミドｐＢＴ　７０２を有するＥ、コリー菌株に１
２５４−−２を３０℃でＬＢ−培地中で１２時間培養し
、引続き、ＩＰＴＧ２ｍＭを含有する媒体中で１：２で
稀釈する。４時間生長の後に、細胞を収穫し、超音波で
溶解させ、α−サブユニットの形成を５ＤＳ−ゲル上フ
クロマドグラフィ及び免疫学的に検出する。

この結果は、ｐＢＴ７０２中に含有される不完全遺伝子
によりベニシリンーＧ−アミダーゼのα−サブユニット
はコードされることを示している。

例５ 例１及び３で得たプラスミドを相容性のプラスミドｐＡ
ＣＹＣ１８４及びｐＢＲ３２２中にクローン化し、−緒
に宿主細胞Ｅ、コリーＫ１２５４−２中にトランス７オ
ームサセタ。ベンジル−ペニシリン−切断性活性は、細
胞抽出物の変性−及び再生により立暉フきる。

本明細書中及び図面において、フラグメントの大きさは
、アガロースゲル中での寸法マーカーとの比較により得
られた大略の値である。フラグメント中の正確なヌクレ
オチド数は、当業者にとっては、ＤＮＡ−配列及びこれ
で認識しつる制限切断部位に依シ測定することが１きる
。

【図面の簡単な説明】

第１図は成熟ペニシリン−アミドヒドロラーゼのアミノ
酸配列と制限エンドヌクレアーゼ切断部位及びサブユニ
ットとの関係を示す図、第２図は、ペニシリン−Ｇ−ア
ミダーゼとβ−ガラクトシダーゼの配列でコードされる
融合蛋白質の構成を示す図、第３図、第４図及び第５図
は、ペニシリン−Ｇ−アミダーゼの配列を有し、活性酵
素に成熟す名ことのできる、蛋白質の発現に好適なプラ
スミドｐＢＴ２１２の構成を示す図、第６図及び第７図
は、ペニシリン−〇−アミダーゼの大きいサブユニット
をコードし、その発現に作用することの１きる本発明に
よるｐＢＴｌｏｏｏ　、ＤＳＭ３０６８ｐの構成を示す
図、第８図は、ペニシリン−Ｇ−アミダーゼの小さいサ
ブユニットをコードし、その発現に作用することのでき
る本発明によるプラスミドｐＢＴ７０２　、ＤＳＭ３０
６７１）の構成を示す図である。 ＦＩＧ、２ ＦＩＧ、：５ ↓Ｘ・■ ４８０８ｐ−フラグメント 単離２７０　Ｂｐ−フラグメント ＦＩＧ、４ ＋　２７０８ｐ　Ｅｃｏ　Ｒ１フラグメントＦＩＧ、５ ＬＴ−リガーゼ ＦＩＧ、Ｇ 単離１．７ｋｂ−フラグメント 単離３００　Ｂｐ−フラグメント 単離６ｏＢＰ−フラグメント ６０Ｂｐ−フラグメント ↓Ｔ４リガーぜ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、完全な遺伝子の５′末端で翻訳部位の最初の７８塩
   基が欠失している不完全なペニシリン−Ｇ−アミダーゼ
   −遺伝子を有することを特徴とする、ペニシリン−Ｇ−
   アミダーゼの発現に好適なプラスミド。 ２、不完全なペニシリン−Ｇ−アミダーゼ−遺伝子は、
   遺伝子の５′末端で、翻訳部位のはじめから数えて塩基
   ７９もしくは８６８で開始している２個の分れた切断片
   の形で構成されて存在し、コードされた塩基７０５〜８
   ６７の欠失を有している、特許請求の範囲第１項記載の
   プラスミド。 ３、翻訳された不完全なペニシリン−Ｇ−アミダーゼ−
   遺伝子は塩基７９で開始し、塩基７０５で終止している
   、特許請求の範囲第１項記載のプラスミド。 ４、翻訳された不完全なペニシリン−Ｇ−アミダーゼ−
   遺伝子は塩基８６８で開始し、塩基２５３８の後に終止
   しているか又は塩基２５４１で終止している、特許請求
   の範囲第１項記載のプラスミド。 ５、不完全なペニシリン−Ｇ−アミダーゼ−遺伝子もし
   くはその切断片の５′末端と塩基配列ＡＴＧが結合して
   いる、特許請求の範囲第１項から第４項までのいずれか
   １項記載のプラスミド。 ６、付加的にクロラムフェニコール、テトラサイクリン
   及び／又はカナマイシンに対する抵抗因子及び細菌性プ
   ロモーターを有する、特許請求の範囲第１項から第５項
   までのいずれか１項記載のプラスミド。 ７、ｌａｃ−プロモーター又はｔａｃ−プロモーターを
   翻訳された新形成された遺伝子区分の開始部の直前に有
   する、特許請求の範囲第６項記載のプラスミド。 ８、プラスミドｐＢＴ７０２、ＤＳＭ３０６７ｐである
   特許請求の範囲第１項記載のプラスミド。 ９、プラスミドｐＢＴ１０００、ＤＳＭ３０６８ｐであ
   る、特許請求の範囲第１項記載のプラスミド。 １０、プラスミドｐＢＴ２１２、ＤＳＭ３０５８ｐであ
   る特許請求の範囲第１項記載のプラスミド。 １１、完全な遺伝子の５′末端で翻訳部位の最初の７８
   塩基が欠失している不完全なペニシリン−Ｇ−アミダー
   ゼ−遺伝子を有するペニシリン−Ｇ−アミダーゼの出現
   に好適なプラスミド少なくとも１個を有する微生物。 １２、寄託番号ＤＳＭ３０５７（ｐＢＴ１０００）、Ｄ
   ＳＭ３０６４（ｐＢＴ７０２）及びＤＳＭ３０５８（ｐ
   ＢＴ２１２）である、特許請求の範囲第１１項記載の微
   生物。 １３、完全な遺伝子の５′末端で翻訳部位の最初の７８
   塩基が欠失している不完全なペニシリン−Ｇ−アミダー
   ゼ−遺伝子を有するペニシリン−Ｇ−アミダーゼの出現
   に好適なプラスミドを製造するため、プラスミドｐＢＴ
   II／３をヌクレアーゼＨｉｎｄIIIで完全に切断し、突
   出末端にポリメラーゼ I 、クレノフ−フラグメント及
   びｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰを充填し
   、その後ヌクレアーゼＥｃｏＲＶで完全に切断し、生じ
   た３．１ｋｂ−フラグメントを単離し、プラスミドｐＢ
   ＴＥ１−１１をヌクレアーゼＡｖａ I で切断し、突出
   末端にポリメラーゼ I クレノフ−フラグメント及びｄ
   ＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰを充填させ、
   その後、ヌクレアーゼＥｃｏＲＶで切断し、生じた２．
   ５ｋｂ−フラグメントを単離し、３．１ｋｂ−フラグメ
   ントと２．５ｋｂ−フラグメントを同じ量比でＴ＿４−
   リガーゼで連結させ、プラスミドｐＢＴ２１２を得るこ
   とを特徴とするプラスミドの製法。 １４、１）プラスミド中に存在するｐｅｎ−Ｇ−アミダ
   ーゼ−遺伝子の７７〜８１位のＤｄｅ I −認識配列を
   開裂し、ＤＮＡ−ポリメラーゼの存在で、デソキシチミ
   ジン−及びデソキシシトシン−三燐酸で、後退配列に充
   填し、５′−末端で突出しているデソキシチミジンをヌ
   クレアーゼＳ＿１で離脱させ、この平滑になつた配列に
   、Ｔ＿４−リガーゼでＡＴＧ−開始コドン及び制限酵素
   認識配列を有するリンカーを付加させ、２）ペニシリン
   −Ｇ−アミダーゼ−遺伝子から制限エンドヌクレアーゼ
   ＥｃｏＲＶ及びＡｌｕ I を用いる切断の後に０．２１
   ｋｂ−フラグメントを単離し、変性し、次いで特定のヌ
   クレアーゼに関する認識配列、これに結合した１個以上
   の終止コドン及びこれにアミノ酸２３５〜２３１又は場
   合によつてはより少ない又はより多い引続くアミノ酸を
   コードする塩基配列を加えるプライマーと共に、かつポ
   リメラーゼ I （クレノフ−フラグメント）及びＤＮＡ
   −合成に必要な４種のデソキシリボヌクレオチド−三燐
   酸と共にインキュベートし、得られるＤＮＡをＤｄｅ
   I 及びプライマー認識性のヌクレアーゼで切断し、得ら
   れる約０．２０ｋｂのフラグメントをペニシリン−Ｇ−
   アミダーゼの適当なフラグメントと連結させて、 ａ）Ｄｄｅ I での切断により生じた突出末端をＤＮＡ
   −配列の４５５位に結合させかつ ｂ）表現ベクターと結合させることにより、塩基７９で
   開始し、塩基７０５で終止している翻訳された不完全な
   ペニシリン−Ｇ−アミダーゼ−遺伝子を有するプラスミ
   ドを得る、特許請求の範囲第１３項記載の方法。 １５、プラスミドｐＢＴ２１２をＥｃｏＲ I 及びＤｄ
   ｅ I で切断し、０．４０ｋｂ−フラグメントを単離さ
   せ、１個のＨｉｎｄIII−認識配列及び２個の終止コド
   ンを有するプライマーを用い、表現プラスミドとしてＥ
   ｃｏＲ I 及びＨｉｎｄIIIで切断されたプラスミドｐＫ
   Ｋ１７７−３を使用する、特許請求の範囲第１４項記載
   の方法。 １６、ペニシリン−Ｇ−アミダーゼ−遺伝子をＨｐａ
   I 及びＴａｑ I で切断し、３００Ｂｐ−フラグメント
   を単離し、変性し、次いで、特定ヌクレアーゼに関する
   認識配列、これに結合して開始コドンＡＴＧ及び後者に
   アミノ酸２９０〜２９４及び場合によつては他の又は僅
   かな引続くアミノ酸をもコードする塩基配列を加えるプ
   ライマー１種と共にかつポリメラーゼ I クレノフ−フ
   ラグメント及び４種のデソキシ−リボヌクレオチド−三
   燐酸と共にインキュベートし、得られるＤＮＡをＡｖａ
   II及びプライマー認識性のヌクレアーゼで切断し、得ら
   れる約６０Ｂｐ長さのフラグメントを ａ）プラスミドｐＢＴＥ１−１１からのＡｖａII−Ｈｉ
   ｎｄIII−フラグメント及び ｂ）ＨｉｎｄIII及びプライマー認識性のヌクレアーゼ
   を用いる切断により生じたプラスミドフラグメントと連
   結させて、塩基８６８で開始して塩基２５３８の後でも
   しくは塩基２５４１で終止している翻訳された不完全な
   ペニシリン−Ｇ−アミダーゼ−遺伝子を有するプラスミ
   ドを得る、特許請求の範囲第１３項記載の方法。 １７、ｐＫＫ１７７−３のＨｉｎｄIII−ＥｃｏＲ I −
   フラグメント及びこのＥＣｏＲ I −認識配列を有する
   プライマーを使用する、特許請求の範囲第１６項記載の
   方法。 １８、完全な遺伝子の５′末端で翻訳部位の最初の７８
   塩基が欠失している不完全なペニシリン−Ｇ−アミダー
   ゼ遺伝子を有するペニシリン−Ｇ−アミダーゼの発現に
   好適なプラスミドを有する微生物中で酵素を発現させる
   ことを特徴とする、ペニシリン−Ｇ−アミダーゼを得る
   方法。 １９、共通の宿主微生物中に表現する塩基７９で開始し
   、塩基７０５０で終止している翻訳された不完全なペニ
   シリン−Ｇ−アミダーゼ遺伝子を有するプラスミド及び
   塩基８６８で開始し、塩基２５３８の後で又は塩基２５
   ４１で終止している翻訳された不完全なペニシリン−Ｇ
   −アミダーゼ−遺伝子を有するプラスミドを使用する、
   特許請求の範囲第１８項記載の方法。 ２０、第１の宿主微生物中に表現する塩基７９で開始し
   、塩基７０５で終止している翻訳された不完全なペニシ
   リン−Ｇ−アミダーゼ−遺伝子を有するプラスミド及び
   第２の宿主微生物中に表現する塩基８６８で開始し、塩
   基２５３８の後で又は塩基２５４１で終止している翻訳
   された不完全なペニシリン−Ｇ−アミダーゼ−遺伝子を
   有するプラスミドの抽出物を混合して使用する、特許請
   求の範囲第１８項記載の方法。 ２１、１宿主微生物中に表現する、完全な遺伝子の５′
   末端で翻訳部位の最初の７８塩基が欠失している不完全
   なペニシリン−Ｇ−アミダーゼ−遺伝子を有するか又は
   不完全なペニシリン−Ｇ−アミダーゼ−遺伝子が遺伝子
   の５′末端で翻訳部位のはじめから数えて塩基７９もし
   くは８６８で開始している２個の分れた切断片の形で構
   成されて存在し、コードされた塩基７０５〜８６７の欠
   失を有しているプラスミドを使用する、特許請求の範囲
   第１８項記載の方法。 ２２、Ｅ・コリ−５４−２、ＤＳＭ３０６６又はＤＳ４
   １０、ＤＳＭ３０６５、ＤＳＭ３０５８を微生物として
   使用する、特許請求の範囲第１８項記載の方法。