CS275831B6

CS275831B6 - Process for preparing penicillin-g-amidase

Info

Publication number: CS275831B6
Application number: CS857794A
Authority: CS
Inventors: Gunter Dr Schumacher; Petr Dr Buckel
Original assignee: Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date: 1984-10-31
Filing date: 1985-10-31
Publication date: 1992-03-18
Also published as: EP0180225A3; EP0180225B1; ES548457A0; EP0180225A2; DK501185D0; DK501185A; PT81403A; DE3439843A1; CA1283068C; JPS61181383A; ATE64153T1; DE3583107D1; PT81403B; ES8802248A1; JPH0521552B2; US5053335A

Description

Vynález se týká způsobu výroby penicilín G-amidázy. K expresi tohoto enzymu dochází v mikroorganismech, které obsahuji plasmid nesoucí příslušný gen.

Penicilin-G-amidáza, která se označuje také jako penicilinacyláza (penicilín G amidohydroláza E.C. 3.5,1,11), katalyzuje štěpeni penicilinu G na kyselinu 6-aminopenicilanovou a na kyselinu fenyloctovou. Kyselina 6-aminopenicilanová je výchozí látkou pro velkou řadu průmyslově vyráběných polosyntetických antibiotik, Z tohoto důvodu je zapotřebí mít k dispozici velké množství svrchu uvedeného enzymu.

□ednou z možnosti dosáhnout vysoké produkce uvedeného enzymu js klonováni genu, který je kódem pro penicílin-G-amidázu v plasmidu, který se nachází v buňce ve velkém množství kopii (přibližně 50). I v tomto případě dochází pouze k pětinásobnému zvýšení proti produkci, k niž dochází ve výchozím kmenu ATCC 11105, který byl popsán v publikaci Mayer H., Collins 3., Wagner F., (1979) v: Plasmids of Medical, Environmetal and Commercial Importance, vydavatelé Timmis, K.N. a POhler A., str. 459 až 459 Elsevier/ North-Holland Biomedical Press, Amsterdam, Pokus přivést k expresi gen, který je kódem pro penicilin-G-amidázu ve vhodném vektoru pro expresi, a tim dosáhnout vysoké syntézy uvedeného enzymu, vedly pouze k rozrušeni buněk. 3e tedy zřejmé, že při zvýšené expresi genu, který je kódem pro penicilin-G-amidázu v allelách přírodního typu, není možno dosáhnout požadovaného cíle, tj, zvýšeni výroby enzymů.

Informace pro tvorbu enzymu se nachází v kyselině desoxyribonukleovó (DNA). DNA se převádí RNA-polymerázou, závislou na DNA do mRNA. Takto syntetizovaná mRNA se v rlbogomech převádí na bílkovinu, přičemž vždy tři nukleotidy (triplett nebo kodon) znamenají podle genetického kódu výstavbu jedné určité aminokyseliny.

Řídicí oblasti na rovině DNA stanoví, na kterém místě se začne řetězec DNA měnit na mRNA (sled promotoru), popřípadě na kterén místě se syntéza mRNA zastaví (terminačni slad).

Sledy pro začátek a konec přenosu jsou známé také ze syntézy bílkovin (translace). Přitom obvykle obecně znamená kodon ATG, který se přepisuje jako f-methionin začátek bílkoviny a například kodony TAA nebo TAG konec translace.

Poznatky, týkající se exprese genu jsou popsány například v publikaci B.Lewín, Gene Expression, svazek 1, 1974, 3ohn Wiley + Sons LTD,

Opětné spojováni části DNA po štěpeni je v oboru známo, dochází k němu tak, že se. používá nukleáz, pro které jsou specifické místa působeni v řetězci DNA. Z tohoto důvodu dochází k rozštěpeni ONA na těchto předem určených místech. Dosud je známo veliké množství restrikčních endonukleáz, které vždy štěpí DNA v určitém místě, takže je možno získat části sledu DNA podle přáni určitým způsobem pouze volbou příslušného enzymu. Po působeni těchto restrikčních endonukleáz vznikají zakončeni, která mohou být bu3 přesně s dvojitým řetězcem, nsbo některé zakončeni může být delší než zakončení druhá. Opětným spojováním těchto zakončeni pomoci ligázy dochází ke vzniku různých dalších řetězců, ve většině případů se používá T^-DNA-ligázy.

Vynález si klade za úkol vyřešit problém získání většího množství penicilin-G-amidohydrolázy.

Vynález si klade za cil zvláště navrhnout vektor pro expresi penicilin-C-amidohydrolázy, který by zajišťoval vysokou tvorbu tohoto enzymu, aniž by docházelo k současnému rozrušení buněk.

Předmětem vynálezu je způsob výroby penicilín G-amidázy, vyznačující se tim, že ee dosáhne exprese enzymu v mikroorganismu E. coli 54-2, OSM 3 066 nebo DS 410, DSM 3 065,

DSM 3 058 s obsahem plasmidu, nesouciho neúplný gen pro penicilin-G-amidázu, znázorněný na obr. 1, v němž chybí prvních 78 bázi přenášené oblasti směrem od 5'-zakončení, gen končí bázi 705, nebo gen, který začíná baží 868 a konči bázi 2 538 nebo bázi 2 541.

Plasmid představuje extraxhromosomálni molekulu DNA. Tato molekula nese mimo jiná informaci, která zajišťuje jeji rozmnoženi (replikaci) a mimoto Jednu nebo větší počet zvolených vlastnosti, například odolnost proti některému antibiotiku. Tyto vlastnosti dovoluji poznat buňky, které obsahuji požadovaný plasmid. Uvedené plasmidy máji mimo to vlastnost, že je možno je specificky štěpit některými reetrikčnimi enzymy na zcela určiCS 275831 B6 tých místech. Tímto způsobem je možno po přidáni dalších řetězců, vzniklých po štěpeni jiného plasmidu restrikČnlm enzymem získat nový plasmid. Celá řada plasmidů, které jsou vhodné pro tyto postupy se již běžně obchodně dodává, jde například o plasmid pBR 322.

Použití svrchu uvedeného způsobu štěpeni a opětné vazby řetězců, vzniklých tímto « štěpením na nový plasmid se provádí mimo buňku v reakčních nádobách. Výsledný nový plasmid, vhodný pro expresi, je možno převést do nové buňky mikroorganismu pochodem, který se nazývá transformace. Za předpokladu, že úsek DNA, který je kódem pro požadovaný pro* dukt, se nachází pod řízením vhodného počátku pro transkripci a pro translaci, je možno dosáhnout exprese polypeptidového enzymu při použiti tohoto mikroorganismu. Produkt exprese uvedeného genu Je v případě potřeby možno získat po rozrušeni buněk mikroorganismu a po dalších reakčních a čisticích 3tupnich v čistém stavu bez přítomnosti dalších bílkovin.

Vynález je založen na překvapujícím zjištěni, že přírodní penicilín G-amidázový gen je možno rozdělit na úsek genu, který je kódem pro polypeptid o 845 aminokyselinách a na předřazený sled promotoru, přičemž pro nedostatečnou syntézu úplného genu při expresi mikroorganismem je zodpovědný peptid, který obsahuje 54 aminokyselin v polohách 236 až 289. V případě, že se odstraní baze 705 až 867 genů, které jsou kódem pro tento peptid, je možno odstranit zábranu exprese.

Tímto způsobem se získají dva úseky genů, které jsou kódem pro dva kratší polypeptidy, které začínají methioninem. Tyto kratší polypeptidy jsou při společné expresi biologicky aktivní a odpovídají přírodně se vyskytujícímu enzymu, který se také skládá ze dvou podjednotek. Plasmid vyrobený způsobem podle vynálezu také umožňuje získání penicilin-G-amidázy a jejího genu také ve formě dvou od sebe oddělených řetězců, které se skládají se svrchu uvedených dvou úeeků genu, přičemž tyto sledy začínají bázemi číslo 79 až 868 při deleci bázi 705 až 867, počítáno od 5'-zakonČeni úplného genu. Oplný gen . obsahuje 2 568 baží, první úsek tohoto genu začíná bázi 79 a konci bázi 705 a je kódem pro podjednotku biologicky účinného enzymu jako menši úsek (¢6 ) genů a druhý úsek začíná bázi 868 a konči baží 2 541 včetně kodonu pro ukončení translace nebo bázi 2 538 bez tohoto kodonu. Jde o fragment pro větěi podJednotku (0 ).

3e známo, že při použiti přírodního enzymu ae nejprve vytvoří biologicky účinný enzym štěpením primárně získané bílkoviny za vzniku dvou podjednotek, které se potom spoji na účinný enzym. Protože tento postup Je omezený, při expresi enzymu, je možno dosáhnout získáním dvou oddělených úseků genu pro podjednotku <£ a podjednotku á dalšího zvýšeni exprese biologicky účinného enzymu způsobem podle vynálezu. Před každý úsek genu je dále potřeba znovu zařadit kodon pro počátek translace, obvykle ve formě kodonu ATG, Kromě těchto kodonů je zapotřebí 5'-zakončeni každého z těchto neúplných genů zařadit také sled promotorů, který umožňuje přepis do mRNA, s výhodou běží o lac-promotor nebo o trp-promotor. 3e však možno užit také jiné promotory.

^v Plasmid získaný způsobem podle vynálezu obsahuje k lepšímu poznáni mikroorganismů, které tento plasmid obsahují, alespoň jeden gen pro odolnost proti chloramfenikolu, tetra cykllnu a/nebo kanamycinu. V prostředí, které obsahuje antibiotikum, proti němuž je mikro organismus odolný, roste pouze tento mikroorganismus, který tudiž obsahuje požadovaný plasmid. Gen pro tento typ odolnosti však neni nutný pro provádění způsobu podle vynálezu jako takového, neni tedy bezpodmínečně nutno jej použit.

Tímto způsobem je možno získat mikroorganismy, které obsahují alespoň Jednu kopii svrchu uvedeného plasmidu. V případě, že buňky mikroorganismu obsahuji pouze gen pro některou ze svrchu uvedených podjednotek enzymu, je k tvorbě biologicky účinného enzymu podle vynálezu zapotřebí buč, aby mikroorganismus obsahoval plasmid s genem pro fragment malé podjednotky a také plasmid s genam pro fragment druhé podjednotky nebo plasmid, který obsahuje kády pro obě podjednotky.Lze postupovat tak, že mikroorganismus obsahuje pouze jeden plaemid pro jednu z obou podjednotek. V tomto případě je výhodné pěstovat buňky tohoto mikroorganismu společně s Jinými buňkami, které obsahují plasmid s genem pro druhou podjednotku. Při tomto způsbbu je výhodné použit pro oba plasmidy téhož mikroorga3 nismu. De také možno postupovat tak, že se od sebe oddělené pěstuji dva mikroorganismy, z nichž každý vytváří jednu podjednotku uvedeného enzymu,Získané extrakty se emisi, čimž se ziská účinný enzym. Oako produkční organismy Je možno užit mikroorganismy, které ee běžně k těmto účelům uživaji, například deriváty kmene E. coli K12. Zvléětě dobré výsledky byly získány při použiti kmenů E. coli 54-2-Δ -(lac, pro) rec. A, rpsl, F.'lac i^q., DSM 3 066 a DS 410, min,A, min 8, rpsl, eup⁺, DSM 3 065 a DSM 3 058.

Při výhodném provedeni způsobu podle vynálezu obsahuje kmen E, coli 3 058 plasmid pBT 212, vyrobený způsobem podle vynálezu. Potom je možno získat po rozrušeni buněk a po následné čtyřhodinové až osmihodinové inkubaci buněčného extraktu účinnou penicilin-G-amidázy, složenou z podjednotek oG a /2 .

Pro výrobu plasmidu způsobem podle vynálezu se s výhodou užije známých a většinou běžně dodávaných výchozích plasmidů, které jsou zvláště vhodné pro expresi v určitých mikroorganismech. Zvláště běží o plasmid pBR 322, který se zvláště hodí pro expresi ve všech kmenech E. coli, proto i k prováděni způsobu podle vynálezu. Dalši popis výroby plasmidu tedy vychází z derivátu plasmidu pBR 322, tyto deriváty je buď možno běžně získat, nebo je lze vyrobit z uvedeného plasmidu známým způsobem. Pro jiné organismy než E. coli jsou vhodnější jiné základní plasmidy, takže v případě, že nemá být užit kmen E. coli, vychází se s výhodou z některého plasmidu, k jehož expresi snadno dochází ve zvoleném organismu. Tyto plasmidy jsou v oboru známé a neni zapotřebí je bliže uvádět.

□sou uvedeny například v katalogu sbírky mikroorganismů ATCC I.

Výroba plasmidů se provádi známým způsobem tak, že se užije vhodných přírodních nebo syntetických vazných řetězců k vyplněni mist po působeni restrikčnich endonukleáz, a tak se postaví gen pro neúplnou penicilin-G-amidózu pod řízeni funkčního promotoru. Příkladem vhodného promotoru může být tac-promotor, popsaný v publikaci F.Amann, □. Brosius, M, Ptashne, Gene 1983, a lac-promotor, popsaný v publikaci L. Guarente a dalši. Cell (1980 ) 20 , 543 až 553. .

Vynález bude popsán v souvislosti s výkresy.

Na obr. 1 je znázorněn sled nukleotidů a sled aminokyselin v genu pro penicilin-G-amidohydrolázu, na obr. 2 je v horní části schematicky znázorněn sled, v němž jsou označena místa pro působeni restrikčnich endonukleáz, které přicházej! v úvahu při klonování a ve spodní části jsou znázorněny sledy aminokyselin malé i větši podjednotky penicilin-G-amidohydrolázy. Na obr. 3 je schematicky znázorněna konstrukce proteinu, který vzniká ze sledu, který je kódem pro penicilin-G-amidázu a /?-galaktosidázu. Na obr. 4 až 6 je znázorněna konstrukce plasmidu pBT 212, který je vhodný pro expresi bílkoviny se sledem penicilin-G-amidázy a kterou je možno převést na úplný a účinný enzym. Na obr. 7 a 8 je znázorněna konstrukce plasmidu pBT 1 000, DSM 3 068 P, vyrobeného způsobem podle vynálezu, který je kódem pro větši podjednotku penícilin-G-amidázy a zajišťuje expresi této podjednotky. Na obr. 9 je znázorněna konstrukce plasmidu pBT 702, DSM 3067P, který je kódem pro menší podjednotku penicilin-G-amidázy a zajišťuje expresi této podjednotky.

Dále popisované způsoby výroby DNA a částí DNA, štěpeni DNA působením restrikčnich endonukleáz, spojování získaných fragmentů DNA a podmínky pro transformaci produkčních organismů jsou samy o sobě známy a jsou popsány například v publikaci Advanced Bacterial Genetics (1980), Gold Spring Harbor Laboratory R.W. Davis, D. Botstein a 3.R. Roth a v Molecular Cloning (1982) Cold Spring Harbor Laboratory T. Maniatis, E.F. Fritsch a □. Sambrook.

Na obr. 1 je znázorněn úplný gen pro penicilin-G-amidázu z 2 538 nukleotidů v orientaci 5'- až 3'- při translaci, což znamená ták, jak odpovídá příslušné mRNA, Vždy tři baze (triplet) ze čtyř možných nukleotidů A, G, C a T znamenají jedinou aminokyselinu, jak je znázorněno v horni řadě. Neúplný gen pro penicilin-G-amidázu, získaný způsobem podle vynálezu začíná tripletem GAG v poloze 79 až 81 a tento triplet je kódem pro Glu.

Na tomto mi9tě začíná také fragment, který je kódem pro menši podjednotku enzymu. Fragment, který je kódem pro větši podjednotku enzymu začíná v poloze 868 tripletem AGC, který je kódem pro aminokyselinu ser a konči v poloze 2 538 tripletem AGA, který je kódem

CS 275831 BS pro Arg. Potom následuje ještě kodon TAA pro ukončeni translace, který může být obsažen v plasmidu, vyrobeném způsobem podle vynálezu, ale nemusi. Fragment genu, který je kódem pro menši podjednotku končí aminokyselinou Ala, běží o triplet GCA v poloze 703-705,

Plasmidy vyrobené způsobem podle vynálezu jsou zkonstruovány na úrovni DNA přesně tak, aby vznikly podjednotky úplného enzymu s karboxylovou skupinou na jedné straně a aminoskuplnou na straně druhé. Oe známo, že v mnoha případech odstraňují aminokyseliny na karboxylové skupině nebo na aminoterminálnim zakončeni neni ovlivněna účinnost enzymu. Protein, který je znázorněn na obr. 3 a který znamená spojeni penicilin-G-amidázy a /? -galaktosidázy tedy například obsahuje kromě aminokyselin /3-galaktosldázy na aminoterminálnim zakončeni ještě přibližně 120 aminokyselin penicilin-G-amidázy. Tento protein má enzymatickou účinnost /?-galaktosidázy. Vynález zahrnuje další změny tohoto typu, pokud zůatává zachována enzymatická účinnost.

Na obr. 2 je znázorněno další vysvětleni této skutečnosti a je schematicky uveden vznik menši a větší podjednotky, molekulová hmotnost těchto podjednotek ia ukončeni syntézy. V horni části Jsou znázorněna mieta pro štěpeni celou řadou nukleáz, které budou použity v následujících příkladech.

výše uvedeného vyplývá, že plasmid vyrobený způsobem podle vynálezu má sled, znázorněný na obr. 1, začínající bázi č. 79, kterou začíná jeden z obou fragmentů genu, které jsou kódem pro jednotlivé úseky požadovaného enzymu. Tento fragment je ukončen bázi 858, dalši fragment začíná až bázi 705 a konči bázi 2 538, Při provádění způsobu podle vynálezu je možno tyto plasmidy užit pro výrobu penicilin-G-amidázy tak, že se pěstuje mikroorganismus, který tento plasmid nebo plasmidy obsahuje tak, že dojde k expresi enzymu a tento enzym se pak ziská z mikroorganismu a/nebo ze živného prostředí. Oako mikroorganismus je zvláště výhodný kmen E. coli Kl2 54-2 nebo DS 410. Druhý z uvedených kmenů má zvláště velkou stálost proti lýzi buněk při veliké produkci penicilin-G-amidázy·

Vynález bude osvětlen následujícími příklady.

Přiklad 1

Způsob výroby plasmidů pBT 212, viz obr. 3 až 6, a pBT 702, viz obr. 9.

Výchozím plasmidem js plasmid pST El-11, OSM 3061. Tento plasmid obsahuje gen C, o přibližně třech kilobazích, který je kódem pro penicilin-G-amidázu, a který Je na obr. 3 schematicky znázorněn jako silnější černá křivka. Základní sled bázi tohoto genu je znázorněn na obr. 1, Tento fragment je kódem pro enzymatický účinný polypeptld o 845 aminokyselinách, který je rovněž znázorněn na obr. 1. Tento polypeptid je možno v případě přírodního úplného genu po translaci rozštěpit na tři části. Peptid v poloze 1 až 26 má velikost i vlastnosti signálního peptidu. Při prováděni způsobu podle vynálezu pro výrobu penicilin-G-amidázy je možno vycházet z plasmidu pBT 142, DSM 3 059 bez tohoto sledu. Tento plasmid js kódem pro bílkovinu, která se skládá na aminoterminálnim zakončeni z přibližně 120 aminokyselin penicilin-G-amidázy a na distálnim zakončení je navázána /í-galaktosidáza od své páté aminokyseliny,

Plasmid pBT El-11, znázorněný na obr. 3, se štěpí restrikčni sndonukleázou Hpa I a izoluje se fragment o velikosti 6 kilobazi v agarosovóm gelu s nízkou teplotou táni.

Z každého konce tohoto fragmentu se odstraní působeni exonukleázy Bal 31 přibližně 500 párů baží,

Plasmid pBT 117, OSM 3 063, znázorněný na obr. 3, obsahuje gen pro /? -galaktosidézu bez řídicích sledů, tj. bez promotoru a operátoru a bez signálu pro počátek translace (ATG). Z tohoto plasmidu se po rozštěpeni enzymem Bam HI a Pst I a po vyplněni nebo odštěpeni přečnívájicich zakončeni působením DNa-polymerázy I (Klenowův fragment) za přítomnosti 4-dssoxyribonukleotidtrifosfátu (dATP, dTTP, dCTP a dGTP) izoluje frakcionaci na agarosovém gelu s nízkou teplotou táni fragment o 5,5 kilobazích, znázorněný na obr,3. □eden mikrogram fragmentu se inkubuje s 0,2 mikrogramů fragmentu velikosti 5 kilobazi z plasmidu pBT El-11 přes noc s deseti jednotkami T₄-ligázy. Materiál se dále užije k transformaci kmene E. coli K12 54-2. Selekce se provádi na indikátorových plotnách, kte5

CS 275831 86 ró obsahuji X-Gal a amplcilin a byly popsány v publikaci Miller 3.H., (1972) v Experimente in Molecular Genetics, Gold Spring Harbor Laboratory, 47 až 55, Plasmidy z klonů, pozitivních na /?-galaktosidázu se projevuji na těchto plotnách tak, že je možno je rozštěpit enzymem Eco RI, jedním z těchto plaemidů je pBT 142, znázorněný na obr. 3.

mg plasmidu pBT 142 se úplně rozštěpí působením enzymu Hind III a Hind II a po frakcionaci se izoluje fragment o 800 párech bázi, který se rozštěp! enzymem Dde I, čimž se ziská fragment o 480 párech bázi, znázorněný na obr. 4. Po čištěni tohoto fragmentu na agarosovém gelu s nízkou teplotou táni se konec výplni za působeni DNA-polymerázy I (Klenowův fragment) a užije se desoxynukleotidtrisfosfátů dTTP a dCTP. 0,1 mikrogramu tohoto fragmentu se inkubuje s Jednou jednotkou S1 nukleázy v pufru, který obsahuje 200 mmol/1 NaCl, 50 mmol/1 octanu sodného o pH 4,5, 1 mmol/1 síranu zinečnatého a 0,5 % glycerolu 30 minut při teplotě 30 °C. Timto způsobem se odstraní ribonukleotid dTMP na 5'-zakončeni.

Výsledný fragment DNA má hladký konec a první triplet GAG je kódem pro prvni aminokyselinu Glu úplné formy malé podjednotky penicilin-G-amidázy, Aby bylo možno zajistit počátek translace, zařadi se před triplet GAG triplet ATG.

Fosfotriesterovou metodou podle publikace Grea R,, Kaszewski A., Hiros T., Itakura K., (1978) Proč. Nati. Acad, Sci., USA, 75, str. 5 765 až 5 769 se syntetizuje Eco-ATG-linker se sledem

5'CATGGAATTCATG3'

3'GTACCTTAAGTAC5'

Tento vazný řetězec se fosforyluje působením polynukleotidkinázy a stonásobný přebytek tohoto řetězce se pomoci T₄-ligázy naváže na svrchu uvedený hladký konec fragmentu po Štěpeni enzymem Dde I, Pak se úplně rozštěpí 100 jednotkami enzymu Eco RI a na agarozovém gelu se izoluje fragment o velikosti 0,27 kilobazi.

Plasmid pKKl77-3, OSM 3 062 se úplně rozštěp! působením enzymu Eco RX a Pšt I. Frakcionace na agarosovém gelu se izoluje fragment o velikosti 2,9 kilobazi.

Plasmid pBT 117 se omez! působením enzymu Eco RI a potom se úplně rozštěp! enzymem Pst I, Frakcionaci na agarozovém gelu se izoluje fragment o velikosti 5,5 kilobazi, znázorněný na obr, 5,

Přibližně 10 ng fragmentu vektoru o velikosti 2,9 kilobazi z plasmidu pKKl77-3 se váže s 200 ng lac Z-fragmentů o velikosti 5,5 kilobazi z plasmidu pBT117 a 100 ng fragmentu po působeni enzymu Eco RI o velikosti 270 párů bázi přes noc při přítomnosti 10 jednotek T₄-ligázy, jak je znázorněno na obr. 5. Po transformaci E. coli 54-2 se identifikuji klony, pozitivní na -galaktosidázu pomoci indikátorových ploten s obsahem X-gal, popsaných v publikaci Miller □ H., (1972) v Experimente in Molecular Genetics,

Cold Spring Harbor Laboratory, 47 až 55. Štěpením DNA plasmidu enzymem Eco RI s následnou analýzou sledu je možno ověřit požadovanou konstrukci plasmidu pBT II/3, DSM 3 060, Jak je znázorněno na obr. 5. V místě pro působeni enzymu Eco RV je možno odstranit DNA, která Je kódem pro $ -galakrosidázu a znovu vytvořit oblast, která je kódem pro penicilinamidohydrolázu, jak je znázorněno na obr. 6. Plasmid pBT 11/3 se úplně rozštěpí enzymem Hind III, přečnívající konce se výplni působením polymerázy I (Klenowův fragment.) a 4-desoxyribonukleotidtrifosfátu, načež se materiál úplně rozštěp! enzymem Eco RV a nakonec se izoluje frakcionaci fragment o velikosti 3,1 kilobazi. Z plasmidu pBT El-11 se izoluje štěpením enzymy Eco RV a Ava I fragment o velikosti 2,5 kilobazi. Před štěpením enzymem Eco RV se přečnívající konce po působeni enzymu Ava I výplni působením polymerázy I (Klenowův fragment) a 4-desoxyribonukleotidtrifosfátu tak, že vzniknou hladké kon ce. Oba fragmenty o velikosti 3,1 a 2,5 kilobazi se dále ve stejném množstvi na sebe váží působením T₄-ligázy. Výsledným plasmidem je plasmid pBT 212, DSM 3 058. Tento plasmid je kódem pro penicilin-G-amxdázu bez signálního sledu, jak je znázorněno na obr. 6.

Z plasmidu pBT 212 se štěpením enzymy Eco RI a Hpa I izoluje fragment o přibližně 720 párech bázi, z tohoto fragmentu se na Jedné straně izoluje po štěpení enzymem Dde I fragment o přibližně 400 párech bázi při současném štěpeni enzymem Eco RI a na druhé straně působením enzymu Alu I a Eco RV se izoluje fragment o velikosti 410 párů bázi.

Na fragment po štěpeni enzymy Eco RV a Alu X se po denaturaci dvojitého řetězce hybridizuje sled o 27 baží

5'CCA AGC TTA TTA TGC TGT TTG CGA GTT 3'

Tento primer, syntetizovaný fosfotriesterovou metodou podle publikace Crea a dalši, 1978, Proč. Nati. Acad. Sci., USA,75, 5 765 až 5 769, je homologni v obráceném směru ke sledu v poloze 691 až 705 a obsahuje kodon TAA pro ukončeni translace (dvakrát) a sled s místem pro působeni enzymu Hind XIX.

Působením DNA polymerázy (Klenowův fragment a desoxytrifosfátu se odštěpí exonukleoticky nehybridizpjici 3'- zakončeni a výplni se řetězec v místě 5've směru 3'. DNA se rozštěp! enzymy Hind XXI Ode I a izoluje se fragment o přibližně 250 párech bázi. Molekula vektoru kPPk 77-3,rozštěpená enzymem Eco RI a Hind III, fragment o přibližně 0,4 kilogazich po štěpeni enzymy Eco RI a Ode I a fragment o velikosti 0,25 kilobazí po štěpeni enzymy Dde I a Hind III ae navzájem spoji působením T₄-ligázy, jak je znázorněno na obr. 9.

Takto získaný plasmid je kódem pro malou podjednotku (oC) penicilinamidohydrolázy a byl označen pBT 702, DSM 3067P.

Přiklad 2

E. coli kmen DSM 3 058, který nese plasmid pBT 212, se inkubuje přes noc při teplotě 37 °C za přítomnosti induktoru isopropylthiogalaktosidu (IPTG), Buňky se oddělí, rozruší a buněčný extrakt se inkubuje 4 až 8 hodin při teplotě 30 °C. Analýza produktu, vzniklého po inkubaci přes noc při teplotě 30 °C na SDS-akrylamidovém gelu ukazuje, že došlo k doplněni bílkoviny na podjednotky cC a penicilin-G-amylázy. 2a přítomnosti obou podjednotek je možno měřit účinnost enzymu, což znamená, že dochází k proteolytickému štěpeni v buněčném extraktu, protože došlo ke správné sestavě za vzniku účinného enzymu.

Při obohaceni specifické proteázy je tedy možno zajistit kvantitativní úplné štěpení předběžné bílkoviny za vzniku účinného enzymu.

Přiklad 3

Konstrukce plasmidu pro expresi větší podjednotky penicilin-G-amidázy.

Při konstrukci nového signálu pro počátek translace (ATG) na začátku velké podjednotky se užije syntézy DNA, při níž se používá primeru. Velká podjednotka začíná v poloze 868 úplného genu sledem aminokyselin Ser, Asn, Met. Při použiti fosfotriesterové metody, popsané v publikaci Crea R., Kaszewski A., Oiros T,, Itakura K,, (1978) Proč.

Nati. Acad. Sci., USA, 75, 5 765 až 5 769 byl.syntetizován primer o počtu 25 bázi s následujícím vzorcem , Met Ser Asn Met Trp Val 5'GGAATTC ATG AGC AAT ATG TGG GTT3'.

Tento primer obsahuje misto působení restrikčni endonukleázy Eco RI, kodon ATG pro počátek translace a základní sled bázi pro prvních pět aminokyselin větší podjetnotky penicilin-G-amidohydrolázy, jak je znázorněno na obr, 7.

Z plasmidu pBT El-11 se izoluje po štěpeni enzymem Hpa I a po rozděleni řetězců podle velikosti na agarosovóm gelu fragment o velikosti 1,7 kilobazí, tento fragment se dále úplně rozštěpí enzymem Taq I a izoluje se fragment o velikosti 0,3 kilobaze. Přibližně 0,5 jjg tohoto fragmentu se denaturuje zahřátim na 5 minut na teplotu 100 °C, přidá se 300 pmol primeru o 25 bazích a směs se nechá zchladnout na teplotu místnosti. Po přidáni 10 jednotek DNA-polymerázy I (Klenowův fragment) a všech čtyř desoxyribonukleotidrifosfá7

CS 275831 86 tů se směs inkubuje tři hodiny při teplotě místnosti a nakonec se úplně rozětěpi působením enzymů Ava II a Eco Rl. Po rozděleni na 2,5% agarosovém gelu 8 nízkou teplotou táni se vyjme oblast, v niž ae nachází fragment o velikosti 60 párů bázi, materiál se vymyje etherem a DNA ae z etherového roztoku vyaráži ethanolem.

Plasmid pKI<l77-3 ae úplně rozštěpí enzymy Hind III a Eco Rl. Po rozděleni na 0,8% agarosovém gelu podle velikosti ae izoluje fragment o velikosti 2,9 kilobazi se zakončeními po štěpeni enzymy Hind III a Eco Rl.

Plasmid pBT El-11 ee úplně rozštěpí působením enzymů Hind III a Ava II. Frakcionaci na 0,8% agarosovém gelu se izoluje fragment o velikosti 2,5 kilobazi se zakončeními po štěpeni enzymy Hind III a Ava II, který je znázorněn na obr, 8.

Vždy 0,1 mikrogramů každého z těchto fragmentů se přidá k fragmentu o velikosti 60 párů bázi po štěpeni enzymy Eco Rl a Ava II po vysrážení ethanolem. Po vazbě přes noc se tímto materiálem transformuje E. Coli kmen 54-2, kolonie se přenesou na nitrocelulozový filtrační papír (Schlaicher/SchUll BA 85) a filtr se přenese na LB agarové plotny, které obsahuji 20 jjg/ml ampicilinu. Po 6 hodinách růstu se filtr přenese na LB-agarové plotny, které obsahují 20'pg/ml amplicilinu a 12,5 >jg/ml chloramfanikolu a plotny se inkubuji přes noc. Potom se DNA těchto kolonii denaturuje a fixuje na nitrocelulozový filtrační papir a nakonec se hydridizuje a radioaktivně značeným primerem po 25 bazích, jak je popsáno v publikaci Davis R. W., Botstein D., Roth O.R., (1980) v Advanced Bacterial Genetice, Cold Spring Harbor Laboratory. Na jeden filtr se užije materiál, který má 10® impulsů za minutu. Po promyti při teplot* místnosti a při teplotě 42 °C se suěi, načež se uvede na 3 hodiny do styku při teplotě místnosti s rtg filmem (Fuji RX). Bylo identifikováno 15 klonů s pozitivním signálem, u těchto klonů byla zkontrolována nově konstruovaná mista pro působení restrikčnich enzymů a byl potvrzen očekávaný DNA-sled jeho sekvenovánim. Výsledný plasmid byl označen pBT 1 000, DSM 3 068 P a je znázorněn na obr. 8. Nese kód větši podjednotky 4. Tato skutečnoet byla dále potvrzena chromatografii na SDS-gelu (64kD) a také imunologicky. Po zbarveni modři Cooma9Sie bylo prokázáno, že větší podjednotka β je 30 až 40 % celkového podílu bílkovin.

Přiklad 4

Exprese /tf-podjednotky penicilinamidohydrolázy

Kmen E.coli K12 54-2, který obsahuje plasmid pBT 702, se inkubuje 12 hodin při teplotě 30 °C v prostřed! LB, dále ae zředi v poměru 1 s 2 prostředím, které obsahuje 2 mM IPTG. Po 4 hodinách růstu se buňky oddělí, rozruší ae ultrazvukem a vytvořením βύ-podjednotky je možno prokázat chromatografleky při použiti SDS-gelu nebo imunologicky.

Výsledek ukazuje, že neúplný gen, který se nachází v plasmidu pBT 702, je kódem pro podjednotku penlcilln-G-amidázy.

Přiklad 5

Plasmidy, získané způsobem podle příkladů 1 a 3, byly klonovány v kompatibilních plasmidech pACYC 184 a pBR322 a potom byly použity společně k transformaci E. coli kmene K12 54-2. Po denaturaci a renaturaci buněčných extraktů je možno prokázat, že materiál štěpí benzylpenicilin.

Ve svrchu uvedených příkladech a na výkresech jeou velikosti uvedených fragmentů přibližné a byly získány srovnáním s označením velikosti na agarosovém gelu. Přesný počet nukleotidů ve fragmentu může stanovit každý odborník podle uvedeného sledu DNA a podle mist působením restrikčnich enzymů.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob výroby penicilin-G-amidázy, vyznačujíc! se tím, že se dosáhne exprese enzymy v mikroorganismu E. coli 54-2, OSM 3 066 nebo DS 410, DSM 3 065, DSM 3 058 s obsahem plasmidu, nesoucího neúplný gen pro penicilin-G-amidázu, znázorněny na obr. 1, v němž chybí prvních 78 baží přenášené oblastí směrem od 5'-zakončeni, gen konči baží 705, nebo gen, který začíná baží 868 a konči bázi 2 538 nebo bázi 2 641.
2. Způsob podle bodu 1, vyznačující setím, že se dosáhne exprese enzymu v mikroorganismu, který obsahuje současně plásmid, nesoucí neúplný gen pro penicilin-G-amidázu, který začíná bázi 79 a konči bázi 705, a plasmid, nesoucí neúplný gen pro penicilin-G-amidázu, který začíná baží 868 a konci baží 2 538 nebo baží 2 541.
3. Způsob podle bodu 1, vyznačujici sě tim, že se dosáhne v jednom mikroorganismu exprese plasmidu, nesoucího gen pro penicilin-G-amidázu, začínající bázi 79 a končící baží 705 a ve druhém mikroorganismu se dosáhne exprese plasmidu, nesoucího gen pro penicilin-G-amidázu, který začíná bázi 868 a konči baží 2 538 nebo baží 2 541 a získané produkty se smísí.