JPH07289271A - プラスミドベクターおよび異種タンパク質を製造するためのその使用 - Google Patents
プラスミドベクターおよび異種タンパク質を製造するためのその使用Info
- Publication number
- JPH07289271A JPH07289271A JP7115212A JP11521295A JPH07289271A JP H07289271 A JPH07289271 A JP H07289271A JP 7115212 A JP7115212 A JP 7115212A JP 11521295 A JP11521295 A JP 11521295A JP H07289271 A JPH07289271 A JP H07289271A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- plasmid vector
- plasmid
- gene
- protein
- escherichia coli
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 Escherichia coliおよびBacillus subtilis
中で操作可能な新規なプラスミドベクターであって、異
種遺伝子を極めて効率的に制御しながら発現することを
指令することができる合成プロモーターを含んでなるプ
ラスミドベクターを記載する。 【効果】 このベクターは形質転換した菌株中で高い安
定性を有し、Escherichia coliおよび／またはBacillus
subtilis 中で異種タンパク質を産生するのに特に有用
である。
中で操作可能な新規なプラスミドベクターであって、異
種遺伝子を極めて効率的に制御しながら発現することを
指令することができる合成プロモーターを含んでなるプ
ラスミドベクターを記載する。 【効果】 このベクターは形質転換した菌株中で高い安
定性を有し、Escherichia coliおよび／またはBacillus
subtilis 中で異種タンパク質を産生するのに特に有用
である。
Description
【０００１】
【発明の背景】発明の分野 本発明は、プラスミドベクター、このベクターで形質転
換した微生物、および異種タンパク質の製造のためのそ
れらの使用に関する。更に詳細には、本発明は、Escher
ichia coliおよびBacillus subtilis 中で安定なプラス
ミドベクターであって、異種遺伝子を制御しながら極め
て効率的に発現させることができる合成プロモーターを
含んでなる、プラスミドベクターに関する。
換した微生物、および異種タンパク質の製造のためのそ
れらの使用に関する。更に詳細には、本発明は、Escher
ichia coliおよびBacillus subtilis 中で安定なプラス
ミドベクターであって、異種遺伝子を制御しながら極め
て効率的に発現させることができる合成プロモーターを
含んでなる、プラスミドベクターに関する。
【０００２】背景技術 当該技術分野では、特定の産生系を用いる発酵法により
タンパク質を製造することは以前から知られており、こ
の特定の産生系という用語はタンパク質をコード化する
遺伝子を含む発現ベクターとタンパク質を含む宿主との
組み合わせを意味するものである。
タンパク質を製造することは以前から知られており、こ
の特定の産生系という用語はタンパク質をコード化する
遺伝子を含む発現ベクターとタンパク質を含む宿主との
組み合わせを意味するものである。
【０００３】工業的観点からは、理想的な産生系は、容
易に精製することができる組換え生成物を、高収率で、
天然のタンパク質の生物学的活性と同等な生物学的活性
を有しかつ経済的に興味ある経費で製造することができ
るものであるべきである。
易に精製することができる組換え生成物を、高収率で、
天然のタンパク質の生物学的活性と同等な生物学的活性
を有しかつ経済的に興味ある経費で製造することができ
るものであるべきである。
【０００４】このような系は、(1) 強力な制御要素
（プロモーター、ＲＢＳ、およびターミネーター）、す
なわち異種遺伝子を効率的に発現させることができる要
素を含み、多重コピーで細胞に含まれ、これらの細胞内
部で安定に維持され、特定の生成物を多量に産生するこ
とができるベクター、および(2) 異種遺伝子の供給さ
れた指示を正確に実行して、天然物と同じ生成物を得る
ことができ、商業的規模での培養に適しており、すなわ
ち耐性を有し、高濃度で増殖することができ、栄養素の
要件に関しては要求が少ない宿主とからなっている。
（プロモーター、ＲＢＳ、およびターミネーター）、す
なわち異種遺伝子を効率的に発現させることができる要
素を含み、多重コピーで細胞に含まれ、これらの細胞内
部で安定に維持され、特定の生成物を多量に産生するこ
とができるベクター、および(2) 異種遺伝子の供給さ
れた指示を正確に実行して、天然物と同じ生成物を得る
ことができ、商業的規模での培養に適しており、すなわ
ち耐性を有し、高濃度で増殖することができ、栄養素の
要件に関しては要求が少ない宿主とからなっている。
【０００５】
【発明の概要】今般、既存技術のこれらの要件を、本発
明によるプラスミドベクターによって満足させることが
できることを見出した。
明によるプラスミドベクターによって満足させることが
できることを見出した。
【０００６】これによれば、本発明の第一の態様は、Es
cherichia coliおよびBacillus subtilis 中で安定なプ
ラスミドベクターであって、極めて効率的に異種遺伝子
の発現を指示することができる合成プロモーターを含む
ことを特徴とするプラスミドベクターに関する。本発明
のもう一つの態様は、前記のプラスミドベクターで形質
転換された、Escherichia coliまたはBacillus subtili
s から選択される微生物に関する。本発明の更にもう一
つの態様は、前記のプラスミドベクターで形質転換され
たEscherichia coliまたはBacillus subtilis から選択
される微生物の発酵によって特定の異種タンパク質を産
生する方法に関する。
cherichia coliおよびBacillus subtilis 中で安定なプ
ラスミドベクターであって、極めて効率的に異種遺伝子
の発現を指示することができる合成プロモーターを含む
ことを特徴とするプラスミドベクターに関する。本発明
のもう一つの態様は、前記のプラスミドベクターで形質
転換された、Escherichia coliまたはBacillus subtili
s から選択される微生物に関する。本発明の更にもう一
つの態様は、前記のプラスミドベクターで形質転換され
たEscherichia coliまたはBacillus subtilis から選択
される微生物の発酵によって特定の異種タンパク質を産
生する方法に関する。
【０００７】特に、本発明のプラスミドベクターは、 １． B. subtilis およびE. coli 中で作動可能な複製
起源と、 ２． 前記のプラスミドベクターで形質転換された菌株
の選択をコードする遺伝子と、 ３． 下記の配列を有する合成プロモーターと、
起源と、 ２． 前記のプラスミドベクターで形質転換された菌株
の選択をコードする遺伝子と、 ３． 下記の配列を有する合成プロモーターと、
【化１】 ４． リボソーム結合部位と、 ５． 異種遺伝子を挿入するのに有用なプロモーターの
下流の多重クローニング部位と、そして ６． ラムダバクテリオファージのターミネーターｔ０
とを含んでなる。
下流の多重クローニング部位と、そして ６． ラムダバクテリオファージのターミネーターｔ０
とを含んでなる。
【０００８】本発明によるプラスミドベクター（以後、
「ｐＳＭ６７１」と呼ぶ）は、下記の方法から得られ
る。すなわち、（ａ） 上記配列を有する合成プロモー
ターと、リボソームにおけるｍＲＮＡの結合部位（ＲＢ
Ｓ）と、そしてプラスミドｐＵＣ１８の多重クローニン
グ部位とを含んでなるポリヌクレオチドを合成し、
（ｂ） プラスミドｐＳＭ１４３から、E. coli および
B. subtilis 中で作動可能な複製起源およびカナマイシ
ン耐性遺伝子を含む約５７００ｂｐのフラグメントＨｉ
ｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩを単離し、（ｃ） 工程（ｂ）で
得たフラグメントに、上記ポリヌクレオチドを連結さ
せ、プラスミドｐＳＭ１４３−Ａを単離し、（ｄ） プ
ラスミドｐＳＭ１４３−Ａの多重クローニング部位の下
流に、Ｃａｔ遺伝子（クロラムフェニコールアセチルト
ランスフェラーゼ）とラムダバクテリオファージの合成
ターミネーターｔ０を含む約１０００ｂｐのフラグメン
トを導入し、最後に（ｅ） 工程（ｄ）で得たリガーゼ
混合物で形質転換されたE. coli を選択することによっ
てプラスミドベクターｐＳＭ６７１を単離することから
なる方法によって得られる。
「ｐＳＭ６７１」と呼ぶ）は、下記の方法から得られ
る。すなわち、（ａ） 上記配列を有する合成プロモー
ターと、リボソームにおけるｍＲＮＡの結合部位（ＲＢ
Ｓ）と、そしてプラスミドｐＵＣ１８の多重クローニン
グ部位とを含んでなるポリヌクレオチドを合成し、
（ｂ） プラスミドｐＳＭ１４３から、E. coli および
B. subtilis 中で作動可能な複製起源およびカナマイシ
ン耐性遺伝子を含む約５７００ｂｐのフラグメントＨｉ
ｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩを単離し、（ｃ） 工程（ｂ）で
得たフラグメントに、上記ポリヌクレオチドを連結さ
せ、プラスミドｐＳＭ１４３−Ａを単離し、（ｄ） プ
ラスミドｐＳＭ１４３−Ａの多重クローニング部位の下
流に、Ｃａｔ遺伝子（クロラムフェニコールアセチルト
ランスフェラーゼ）とラムダバクテリオファージの合成
ターミネーターｔ０を含む約１０００ｂｐのフラグメン
トを導入し、最後に（ｅ） 工程（ｄ）で得たリガーゼ
混合物で形質転換されたE. coli を選択することによっ
てプラスミドベクターｐＳＭ６７１を単離することから
なる方法によって得られる。
【０００９】
【発明の具体的説明】本発明のポリヌクレオチドは、下
記の配列を有する。
記の配列を有する。
【化２】
【００１０】ｐＳＭ１４３（ＡＴＣＣ ５３０３８）か
ら単離されたフラグメントとの結合に有用な制限部位を
含んでなる前記ポリヌクレオチドは、常法に従って作動
する市販の装置を用いて合成した。
ら単離されたフラグメントとの結合に有用な制限部位を
含んでなる前記ポリヌクレオチドは、常法に従って作動
する市販の装置を用いて合成した。
【００１１】ベクターｐＳＭ１４３を制限酵素Ｈｉｎｄ
ＩＩＩおよびＸｂａＩで消化して、それぞれ約５７００
ｂｐおよび１６５０ｂｐの２個のフラグメントを得た。
後者はｐＥ１９４のエリスロマイシンに耐性のプロモー
ター領域とアンピシリン耐性を生じるＢｌａ遺伝子とを
含むものである。
ＩＩＩおよびＸｂａＩで消化して、それぞれ約５７００
ｂｐおよび１６５０ｂｐの２個のフラグメントを得た。
後者はｐＥ１９４のエリスロマイシンに耐性のプロモー
ター領域とアンピシリン耐性を生じるＢｌａ遺伝子とを
含むものである。
【００１２】次に、E. coli およびB. subtilis 中で作
動可能な複製起源と、カナマイシン耐性を生じるための
遺伝子とを含む５７００ｂｐフラグメントを精製して、
単一フラグメントのポリヌクレオチドのそれぞれの分子
への縮合を促進するような条件下で前記配列を有する合
成ポリヌクレオチドに連結した。連結反応は、酵素Ｔ４
ＤＮＡリガーゼの存在下にて従来の手法を用いて行っ
た。リガーゼ混合物を用いて、例えばDagert, M. and E
hrlich (Gene (1979), 6:23)によって報告されたように
コンピテントにしたE. coli 細胞を形質転換した。
動可能な複製起源と、カナマイシン耐性を生じるための
遺伝子とを含む５７００ｂｐフラグメントを精製して、
単一フラグメントのポリヌクレオチドのそれぞれの分子
への縮合を促進するような条件下で前記配列を有する合
成ポリヌクレオチドに連結した。連結反応は、酵素Ｔ４
ＤＮＡリガーゼの存在下にて従来の手法を用いて行っ
た。リガーゼ混合物を用いて、例えばDagert, M. and E
hrlich (Gene (1979), 6:23)によって報告されたように
コンピテントにしたE. coli 細胞を形質転換した。
【００１３】プラスミドＤＮＡを、Sanger F. らの方法
(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1977), 74: 5463）に従
ってカナマイシンを含む培地で選択した陽性コロニーの
一つから抽出して、配列決定した。
(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1977), 74: 5463）に従
ってカナマイシンを含む培地で選択した陽性コロニーの
一つから抽出して、配列決定した。
【００１４】従って、エリスロマイシン耐性のプロモー
ターとＢｌａ遺伝子とからなる領域の位置におけるｐＳ
Ｍ１４３中に合成フラグメントが精確に挿入されること
を立証することができた。新規なプラスミドをｐＳＭ１
４３−Ａと命名した。
ターとＢｌａ遺伝子とからなる領域の位置におけるｐＳ
Ｍ１４３中に合成フラグメントが精確に挿入されること
を立証することができた。新規なプラスミドをｐＳＭ１
４３−Ａと命名した。
【００１５】クロラムフェニコール耐性を与えるＣａｔ
遺伝子を含み、それ自身のプロモーターおよびラムダバ
クテリオファージのターミネーターｔ０を持たない約１
０００ｂｐのＤＮＡフラグメントを、イタリア国特許第
１９，５５１Ａ／８７号明細書に記載のプラスミドｐＳ
Ｍ２１３から単離した。このフラグメントを、制限酵素
ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化したプラスミドｐ
ＳＭ１４３−Ａに連結した。リガーゼ混合物を用いて、
例えばDagert, M.およびEhrlich(Gene (1979),6:23)に
よって報告された方法によってコンピテントにしたE. c
oli 細胞を形質転換した。
遺伝子を含み、それ自身のプロモーターおよびラムダバ
クテリオファージのターミネーターｔ０を持たない約１
０００ｂｐのＤＮＡフラグメントを、イタリア国特許第
１９，５５１Ａ／８７号明細書に記載のプラスミドｐＳ
Ｍ２１３から単離した。このフラグメントを、制限酵素
ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化したプラスミドｐ
ＳＭ１４３−Ａに連結した。リガーゼ混合物を用いて、
例えばDagert, M.およびEhrlich(Gene (1979),6:23)に
よって報告された方法によってコンピテントにしたE. c
oli 細胞を形質転換した。
【００１６】プラスミドをカナマイシンおよびクロラム
フェニコールを含む培地で選択した陽性コロニー（Ｋｍ
ｒＣｍｒ）の一つから抽出し、配列分析を行ったとこ
ろ、これは予想された特徴を示し、すなわち合成プロモ
ーター、ＲＢＳ部位、ｐＵＣ１８の多重クローニング部
位、Ｃａｔ遺伝子、ラムダターミネーターｔ０、および
抗生物質カナマイシンおよびクロラムフェニコールに対
する二重耐性の存在を示した。
フェニコールを含む培地で選択した陽性コロニー（Ｋｍ
ｒＣｍｒ）の一つから抽出し、配列分析を行ったとこ
ろ、これは予想された特徴を示し、すなわち合成プロモ
ーター、ＲＢＳ部位、ｐＵＣ１８の多重クローニング部
位、Ｃａｔ遺伝子、ラムダターミネーターｔ０、および
抗生物質カナマイシンおよびクロラムフェニコールに対
する二重耐性の存在を示した。
【００１７】このプラスミドをｐＳＭ６７１と呼ぶこと
とした。E. coli およびB. subtilis 中でのベクターｐ
ＳＭ６７１の分離および構造安定性を、実施例２と同様
に操作して測定した。これらの結果は、このプラスミド
が培養を更に継続した後でも細胞個体数の９５％以上に
保持されていることを示しており、従ってかなりの分離
安定性を示していた。
とした。E. coli およびB. subtilis 中でのベクターｐ
ＳＭ６７１の分離および構造安定性を、実施例２と同様
に操作して測定した。これらの結果は、このプラスミド
が培養を更に継続した後でも細胞個体数の９５％以上に
保持されていることを示しており、従ってかなりの分離
安定性を示していた。
【００１８】更に、形質転換した菌株から単離したプラ
スミドを分析したところ、様々な世代の液体培養を行っ
た後でも、前記プラスミドはE. coli およびB. subtili
s のいずれでも構造安定性を保持していることを示して
いた。
スミドを分析したところ、様々な世代の液体培養を行っ
た後でも、前記プラスミドはE. coli およびB. subtili
s のいずれでも構造安定性を保持していることを示して
いた。
【００１９】本発明のプラスミドベクターｐＳＭ６７１
を用いて、例えばヒダントイナーゼ、カルバミラーゼ、
α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、イソアミラーゼなど
の酵素から選択される原核性ポリペプチド、または例え
ばインターロイキン、ＩＬ−１βの天然拮抗物質、成長
ホルモン、インターフェロン組換え抗体などから選択さ
れる真核性ポリペプチドをコードする遺伝子を発現させ
ることができる。
を用いて、例えばヒダントイナーゼ、カルバミラーゼ、
α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、イソアミラーゼなど
の酵素から選択される原核性ポリペプチド、または例え
ばインターロイキン、ＩＬ−１βの天然拮抗物質、成長
ホルモン、インターフェロン組換え抗体などから選択さ
れる真核性ポリペプチドをコードする遺伝子を発現させ
ることができる。
【００２０】下流に置かれた異種遺伝子の高発現を指令
するプロモーターの能力は、カルバミラーゼ、組換え一
本鎖抗体、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、インターロイ
キン−１β（ＩＬ−１β）およびＩＬ−１βの天然の拮
抗物質（ＩＬ−１ｒα）などの目的とするタンパク質を
コードする遺伝子の多重クローニング部位（ＭＣＳ）へ
の挿入によって立証された。次に、前記の組換えＤＮＡ
分子で形質転換したB.subtilis およびE. coli の菌株
を培養した。これらの結果は、２種類の微生物で多量に
発現している（総タンパク質の＞５％）これらの異種タ
ンパク質の存在を示していた。
するプロモーターの能力は、カルバミラーゼ、組換え一
本鎖抗体、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、インターロイ
キン−１β（ＩＬ−１β）およびＩＬ−１βの天然の拮
抗物質（ＩＬ−１ｒα）などの目的とするタンパク質を
コードする遺伝子の多重クローニング部位（ＭＣＳ）へ
の挿入によって立証された。次に、前記の組換えＤＮＡ
分子で形質転換したB.subtilis およびE. coli の菌株
を培養した。これらの結果は、２種類の微生物で多量に
発現している（総タンパク質の＞５％）これらの異種タ
ンパク質の存在を示していた。
【００２１】プラスミドベクターｐＳＭ６７１はCentra
albureau Voor SchimmelculturesにEscherichia coli S
MC309 として寄託され、CBS 205.94という寄託番号を受
けた。
albureau Voor SchimmelculturesにEscherichia coli S
MC309 として寄託され、CBS 205.94という寄託番号を受
けた。
【００２２】
【実施例】下記の実験例により本発明を更に詳しく説明
するが、本発明を制限するものではない。実施例１ クローニングベクターｐＳＭ６７１の構築 Ａ） ｐＳＭ１４３への合成プロモーターおよびｐＵＣ
１８の多重クローニング部位の挿入 プラスミドｐＳＭ１４３（ＡＴＣＣ ５３０３８）（図
１Ａ）１μｇを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ
８．０、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ ＮａＣｌ、
１ｍＭ β−メルカプトエタノール、制限酵素ＸｂａＩ
およびＨｉｎｄＩＩＩ(Boehringer)をそれぞれ２Ｕを含
む緩衝液２０μｌに再懸濁した。反応は３７℃で１時間
行った後、６５℃で１０分間不活性化した。
するが、本発明を制限するものではない。実施例１ クローニングベクターｐＳＭ６７１の構築 Ａ） ｐＳＭ１４３への合成プロモーターおよびｐＵＣ
１８の多重クローニング部位の挿入 プラスミドｐＳＭ１４３（ＡＴＣＣ ５３０３８）（図
１Ａ）１μｇを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ
８．０、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ ＮａＣｌ、
１ｍＭ β−メルカプトエタノール、制限酵素ＸｂａＩ
およびＨｉｎｄＩＩＩ(Boehringer)をそれぞれ２Ｕを含
む緩衝液２０μｌに再懸濁した。反応は３７℃で１時間
行った後、６５℃で１０分間不活性化した。
【００２３】このように操作を行い、それぞれ約５７０
０ｂｐおよび１６５０ｂｐの２種類のフラグメントを得
たが、後者はｐＥ１９４のエリスロマイシン耐性のプロ
モーター領域と、アンピシリン耐性を生じるＢｌａ遺伝
子とを含んでいた。５７００ｂｐのフラグメントを、ア
ガロースゲル上で電気溶出(electroelution)により０．
８％で精製した（Sambrook et al., Molecular Clonin
g: a laboratory manual, 1989)。同時に、下記の配列
を有するポリヌクレオチドを合成した。
０ｂｐおよび１６５０ｂｐの２種類のフラグメントを得
たが、後者はｐＥ１９４のエリスロマイシン耐性のプロ
モーター領域と、アンピシリン耐性を生じるＢｌａ遺伝
子とを含んでいた。５７００ｂｐのフラグメントを、ア
ガロースゲル上で電気溶出(electroelution)により０．
８％で精製した（Sambrook et al., Molecular Clonin
g: a laboratory manual, 1989)。同時に、下記の配列
を有するポリヌクレオチドを合成した。
【００２４】
【化３】
【００２５】この合成ポリヌクレオチドは、次を含んで
なる。すなわち、（ｉ） メッセンジャーＲＮＡの転写
を効率的に指令することができる強力なプロモーターと
して作用する配列、（ｉｉ） リボソーム（ＲＢＳ）お
よびプラスミドｐＵＣ１８(Boehringer)の多重クローニ
ング部位へのｍＲＮＡの結合部位。
なる。すなわち、（ｉ） メッセンジャーＲＮＡの転写
を効率的に指令することができる強力なプロモーターと
して作用する配列、（ｉｉ） リボソーム（ＲＢＳ）お
よびプラスミドｐＵＣ１８(Boehringer)の多重クローニ
ング部位へのｍＲＮＡの結合部位。
【００２６】５７００ｂｐのフラグメントＸｂａＩ−Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ１０ｎｇと合成ポリヌクレオチド１０ｎｇ
とを、６６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、５ｍ
ＭＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）、
１ｍＭ ＡＴＰを含む緩衝液２０μｌに懸濁させ、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼ０．１Ｕの存在下で１６℃で１８時間
反応を行った。
ｉｎｄＩＩＩ１０ｎｇと合成ポリヌクレオチド１０ｎｇ
とを、６６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、５ｍ
ＭＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）、
１ｍＭ ＡＴＰを含む緩衝液２０μｌに懸濁させ、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼ０．１Ｕの存在下で１６℃で１８時間
反応を行った。
【００２７】MandelとHigaが報告した方法(1970)(J. Mo
l. Biol., 53:159-162) に従ってコンピテントにしたE.
coli HB101 細胞（ＢＲＬ）をライゲーション混合物２
μｌで形質転換し、形質転換体をカナマイシン５μｌ／
ｍｌを含むＬＢ寒天プレート（Bacto Triptone１０ｇ／
ｌ、酵母エキス５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ １０ｇ／ｌ、寒天
１６ｇ／ｌ）上で選別した。プラスミドＤＮＡをＫｍｒ
から抽出し、Sanger F. らの方法(1977)(Proc. Natl. A
cad. Sci. USA, 74: 5463)に従って配列決定を行った。
l. Biol., 53:159-162) に従ってコンピテントにしたE.
coli HB101 細胞（ＢＲＬ）をライゲーション混合物２
μｌで形質転換し、形質転換体をカナマイシン５μｌ／
ｍｌを含むＬＢ寒天プレート（Bacto Triptone１０ｇ／
ｌ、酵母エキス５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ １０ｇ／ｌ、寒天
１６ｇ／ｌ）上で選別した。プラスミドＤＮＡをＫｍｒ
から抽出し、Sanger F. らの方法(1977)(Proc. Natl. A
cad. Sci. USA, 74: 5463)に従って配列決定を行った。
【００２８】従って、合成ポリヌクレオチドをｐＳＭ１
４３のｐＥ１９４のエリスロマイシン耐性のプロモータ
ーとＢｌａ遺伝子とからなる領域の位置に正確に挿入さ
れていることを証明することができた。新規なプラスミ
ドをｐＳＭ１４３−Ａと命名した。
４３のｐＥ１９４のエリスロマイシン耐性のプロモータ
ーとＢｌａ遺伝子とからなる領域の位置に正確に挿入さ
れていることを証明することができた。新規なプラスミ
ドをｐＳＭ１４３−Ａと命名した。
【００２９】Ｂ） ＣＡＴ遺伝子と合成ターミネーター
ｔ０ラムダを含むｐＳＭ２１３のＤＮＡフラグメントの
ｐＳＭ１４３−Ａへの挿入 イタリア国特許出願第１９，５５１Ａ／８７号明細書に
記載されているプラスミドｐＳＭ２１３（図１Ｂ）１０
μｇを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、５
ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ β
−メルカプトエタノールを含む緩衝液１００μｌ中で、
ＢａｍＨＩ酵素(Boehringer)３０Ｕを用いて３７℃で１
時間消化した。
ｔ０ラムダを含むｐＳＭ２１３のＤＮＡフラグメントの
ｐＳＭ１４３−Ａへの挿入 イタリア国特許出願第１９，５５１Ａ／８７号明細書に
記載されているプラスミドｐＳＭ２１３（図１Ｂ）１０
μｇを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、５
ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ β
−メルカプトエタノールを含む緩衝液１００μｌ中で、
ＢａｍＨＩ酵素(Boehringer)３０Ｕを用いて３７℃で１
時間消化した。
【００３０】等容のフェノール−クロロホルムおよびイ
ソアミルアルコール−クロロホルムで消化混合物を抽出
することによって、反応を不活性化した後、ＤＮＡを沈
澱させ、分離して、真空で乾燥した。
ソアミルアルコール−クロロホルムで消化混合物を抽出
することによって、反応を不活性化した後、ＤＮＡを沈
澱させ、分離して、真空で乾燥した。
【００３１】このようにして得たＤＮＡを５０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．２、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４、
０．１ｍＭ ＤＴＴ、５０μｇ／ｍｌＢＳＡ、８０μＭ
ｄＧＴＰ、８０μＭ ｄＡＴＰ、およびポリメラーゼ
クレノウＤＮＡ１０Ｕを含む緩衝液２５０μｌに再懸濁
した。生成する混合物を室温（２０〜２５℃）で３０分
間インキュベーションした後、２５ｍＭ ＥＤＴＡで不
活性化し、タンパク質をフェノール−クロロホルムおよ
びイソアミルアルコール−クロロホルムで抽出した。
ｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．２、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４、
０．１ｍＭ ＤＴＴ、５０μｇ／ｍｌＢＳＡ、８０μＭ
ｄＧＴＰ、８０μＭ ｄＡＴＰ、およびポリメラーゼ
クレノウＤＮＡ１０Ｕを含む緩衝液２５０μｌに再懸濁
した。生成する混合物を室温（２０〜２５℃）で３０分
間インキュベーションした後、２５ｍＭ ＥＤＴＡで不
活性化し、タンパク質をフェノール−クロロホルムおよ
びイソアミルアルコール−クロロホルムで抽出した。
【００３２】ＤＮＡを水性相から沈澱させ、遠心分離に
よって分離し、真空で乾燥し、最後に１０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ
ＭｇＣｌ２、１ｍＭ β−メルカプトエタノールおよ
び制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（Boehringer) ２０Ｕを含む
緩衝液２００μｌに再懸濁させた。消化反応を３７℃で
１時間行った後、６５℃で１０分間不活性化した。
よって分離し、真空で乾燥し、最後に１０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ
ＭｇＣｌ２、１ｍＭ β−メルカプトエタノールおよ
び制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（Boehringer) ２０Ｕを含む
緩衝液２００μｌに再懸濁させた。消化反応を３７℃で
１時間行った後、６５℃で１０分間不活性化した。
【００３３】次に、全消化混合物を６％でポリアクリル
アミドゲル上に仕込み、１２０ボルトで３時間泳動させ
た。約１０００ｂｐのバンドに対応し、Ｃａｔ遺伝子を
含み、そのプロモーターおよびラムダバクテリオファー
ジのターミネーターｔ０は含まないＤＮＡフラグメント
を、Maxam とGilbert (Methods in Enzymology (1980),
vol. 65, 499-560)が報告した方法に従って電気溶出し
た。
アミドゲル上に仕込み、１２０ボルトで３時間泳動させ
た。約１０００ｂｐのバンドに対応し、Ｃａｔ遺伝子を
含み、そのプロモーターおよびラムダバクテリオファー
ジのターミネーターｔ０は含まないＤＮＡフラグメント
を、Maxam とGilbert (Methods in Enzymology (1980),
vol. 65, 499-560)が報告した方法に従って電気溶出し
た。
【００３４】同時に、ｐＳＭ１４３−Ａ １０μｇを、
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５２、１０ｍＭ
ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ
を含む緩衝液１００μｌ中で、制限酵素ＸｈｏＩ(Boehr
inger)３０Ｕで、３７℃で１時間消化した。反応を６５
℃で１０分間不活性化した後、ＤＮＡを沈澱させ、分離
した後、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．２、１
０ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ ＤＴＴ、５０μｇ／
ｍｌ ＢＳＡ、８０μＭ ｄＧＴＰ、８０μＭｄＡＴＰ
およびポリメラーゼクレノウＤＮＡ １０Ｕを含む緩衝
液２５０μｌに再懸濁した。生成する混合物を室温（２
０〜２５℃）で３０分間インキュベーションした後、２
５ｍＭ ＥＤＴＡで不活性化し、タンパク質をフェノー
ル−クロロホルムおよびイソアミルアルコール−クロロ
ホルムで抽出した。ＤＮＡを水性相から沈澱させ、遠心
分離によって分離し、真空で乾燥し、最後に１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＮａＣｌ、
５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ β−メルカプトエタノー
ルおよび制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ ２０Ｕを含む緩衝液
２００μｌに再懸濁した。消化反応を３７℃で１時間行
った後、６５℃で１０分間不活性化した。
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５２、１０ｍＭ
ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ
を含む緩衝液１００μｌ中で、制限酵素ＸｈｏＩ(Boehr
inger)３０Ｕで、３７℃で１時間消化した。反応を６５
℃で１０分間不活性化した後、ＤＮＡを沈澱させ、分離
した後、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．２、１
０ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ ＤＴＴ、５０μｇ／
ｍｌ ＢＳＡ、８０μＭ ｄＧＴＰ、８０μＭｄＡＴＰ
およびポリメラーゼクレノウＤＮＡ １０Ｕを含む緩衝
液２５０μｌに再懸濁した。生成する混合物を室温（２
０〜２５℃）で３０分間インキュベーションした後、２
５ｍＭ ＥＤＴＡで不活性化し、タンパク質をフェノー
ル−クロロホルムおよびイソアミルアルコール−クロロ
ホルムで抽出した。ＤＮＡを水性相から沈澱させ、遠心
分離によって分離し、真空で乾燥し、最後に１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＮａＣｌ、
５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ β−メルカプトエタノー
ルおよび制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ ２０Ｕを含む緩衝液
２００μｌに再懸濁した。消化反応を３７℃で１時間行
った後、６５℃で１０分間不活性化した。
【００３５】このようにして５６００ｂｐおよび２５０
ｂｐの２種類のＤＮＡフラグメントを得たが、後者はバ
クテリオファージｆｄのターミネーターを含み、５６０
０ｂｐのフラグメントはアガロースゲル上で電気溶出に
よって０．８％で精製した。このフラグメント２μｇ
を、ｐＳＭ２１３に由来の１０００ｂｐのフラグメント
１μｇと連結した。反応は、６６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ ｐＨ７．５、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオト
レイトール（ＤＴＴ）、１ｍＭ ＡＴＰを含む緩衝液１
００μｌ中で行い、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ２．０Ｕの存
在下にて１６℃で１８時間結合させた。
ｂｐの２種類のＤＮＡフラグメントを得たが、後者はバ
クテリオファージｆｄのターミネーターを含み、５６０
０ｂｐのフラグメントはアガロースゲル上で電気溶出に
よって０．８％で精製した。このフラグメント２μｇ
を、ｐＳＭ２１３に由来の１０００ｂｐのフラグメント
１μｇと連結した。反応は、６６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ ｐＨ７．５、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオト
レイトール（ＤＴＴ）、１ｍＭ ＡＴＰを含む緩衝液１
００μｌ中で行い、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ２．０Ｕの存
在下にて１６℃で１８時間結合させた。
【００３６】E. coli 71/18(Messing, J. B. et al. (1
977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA,74: 3642)のコンピ
テント細胞を様々な量のライゲーション混合物で形質転
換し、形質転換体をカナマイシン５μｇ／ｍｌおよびク
ロラムフェニコール２０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天のプ
レート上で選別した。
977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA,74: 3642)のコンピ
テント細胞を様々な量のライゲーション混合物で形質転
換し、形質転換体をカナマイシン５μｇ／ｍｌおよびク
ロラムフェニコール２０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天のプ
レート上で選別した。
【００３７】制限地図が画定されているプラスミドを、
ＫｍｒＣｍｒコロニーから迅速法によって単離した。
ＫｍｒＣｍｒコロニーから迅速法によって単離した。
【００３８】このプラスミドの配列分析を行ったとこ
ろ、予想された特徴が示され、または合成プロモータ
ー、ＲＢＳ部位、ｐＵＣ１８の多重クローニング部位、
Ｃａｔ遺伝子、ラムダターミネーターｔ０および抗生物
質カナマイシンおよびクロラムフェニコールに対する二
重耐性が存在することを示した。これプラスミドをｐＳ
Ｍ６７１（図２）と命名した。前記プラスミドを含むE.
coli のクローンを略号ＳＭＣ３０９で表した。
ろ、予想された特徴が示され、または合成プロモータ
ー、ＲＢＳ部位、ｐＵＣ１８の多重クローニング部位、
Ｃａｔ遺伝子、ラムダターミネーターｔ０および抗生物
質カナマイシンおよびクロラムフェニコールに対する二
重耐性が存在することを示した。これプラスミドをｐＳ
Ｍ６７１（図２）と命名した。前記プラスミドを含むE.
coli のクローンを略号ＳＭＣ３０９で表した。
【００３９】次に、プラスミドｐＳＭ６７１を用いて、
B. subtilis SMS003 NRLLB 15897の細胞を形質転換し、
Contenete とDubnau (1979) (Mol. Gen. Genet., 167,
251-258)により記載された方法でコンピテントにした。
形質転換体の選別は、カナマイシン５μｇ／ｍｌおよび
クロラムフェニコール５μｇ／ｍｌを含むDIFCO 社製の
Triptose Blood Agar Base (TBAB) 上で細胞培養するこ
とによって行った。
B. subtilis SMS003 NRLLB 15897の細胞を形質転換し、
Contenete とDubnau (1979) (Mol. Gen. Genet., 167,
251-258)により記載された方法でコンピテントにした。
形質転換体の選別は、カナマイシン５μｇ／ｍｌおよび
クロラムフェニコール５μｇ／ｍｌを含むDIFCO 社製の
Triptose Blood Agar Base (TBAB) 上で細胞培養するこ
とによって行った。
【００４０】実施例２ ベクターｐＳＭ６７１の分離および構造安定性の制御 Ａ） 分離安定性 この実験の目的は、長時間の培養を行った後のE. coli
およびB. subtilis の形質転換した菌株におけるｐＳＭ
６７１の安定性を立証することである。E. coli SMC309
の３種類の独立なクローンを、クロラムフェニコール２
０ｍｇ／ｍｌを含むＬＢ培地（Bacto Triptone １０ｇ
／ｌ、酵母エキス ５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ １０ｇ／ｌ）
１０ｍｌが入っている１００ｍｌフラスコ中で、３７
℃、２００ｒｐｍで１６時間培養した。
およびB. subtilis の形質転換した菌株におけるｐＳＭ
６７１の安定性を立証することである。E. coli SMC309
の３種類の独立なクローンを、クロラムフェニコール２
０ｍｇ／ｍｌを含むＬＢ培地（Bacto Triptone １０ｇ
／ｌ、酵母エキス ５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ １０ｇ／ｌ）
１０ｍｌが入っている１００ｍｌフラスコ中で、３７
℃、２００ｒｐｍで１６時間培養した。
【００４１】いずれの微生物についても３つの培養物
（０．１ｍｌ）を用いて、同じ培地に抗生物質を加えた
もの更に１０ｍｌを接種した。新たな培養物を３７℃、
２００ｒｐｍで１６時間培養し、この工程を更に２回繰
り返した。６００ｎｍで測定した光学濃度（Ｏ．Ｄ．
600 ）の増加として細胞の成長を追跡した。
（０．１ｍｌ）を用いて、同じ培地に抗生物質を加えた
もの更に１０ｍｌを接種した。新たな培養物を３７℃、
２００ｒｐｍで１６時間培養し、この工程を更に２回繰
り返した。６００ｎｍで測定した光学濃度（Ｏ．Ｄ．
600 ）の増加として細胞の成長を追跡した。
【００４２】実験の最後に、培養物の一部を取り出し、
適当に希釈した後、下記の培地上で細胞培養を行った。 ＬＢ寒天±２０ｍｇ／ｍｌクロラムフェニコール（E. c
oli) ＶＹ寒天±５ｍｇ／ｍｌクロラムフェニコール（B. sub
tilis)
適当に希釈した後、下記の培地上で細胞培養を行った。 ＬＢ寒天±２０ｍｇ／ｍｌクロラムフェニコール（E. c
oli) ＶＹ寒天±５ｍｇ／ｍｌクロラムフェニコール（B. sub
tilis)
【００４３】これらのプレートを３７℃で１６時間イン
キュベーションした後、抗生物質の存在下または非存在
下で成長したコロニー（ＣＦＵ／ｍｌ）を計数した。こ
の方法では、プラスミドを保持した細胞の割合、それ故
Ｃｍｒを決定することができた。
キュベーションした後、抗生物質の存在下または非存在
下で成長したコロニー（ＣＦＵ／ｍｌ）を計数した。こ
の方法では、プラスミドを保持した細胞の割合、それ故
Ｃｍｒを決定することができた。
【００４４】
【表１】
【００４５】第１表（３回の実験の平均値±ＳＤ）に示
されているように、プラスミドは細胞個体数の９５％以
上で保持されており、従って更に培養を行った後でもか
なりの分離安定性を示している。
されているように、プラスミドは細胞個体数の９５％以
上で保持されており、従って更に培養を行った後でもか
なりの分離安定性を示している。
【００４６】Ｂ） 構造安定性 それぞれの１回の実験の終了時（培養１６時間）に、E.
coli およびB. subtilis のそれぞれの培養物の一部を
回収して、Ｏ．Ｄ．600 について規格化した。Ｏ．Ｄ．
600 ＝３．０で培養物１．５ｍｌと同等なものから、プ
ラスミドＤＮＡをアルカリリーシスにより抽出した後
（Sambrook et al., Molecular Cloning:a laboratory
manual, 1989)、QIAGENＲ型２０本のカラム(Promega)
上で精製した。得られたＤＮＡを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ ｐＨ８．０、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ β−メルカプトエタノールを含
む緩衝液１０μｌ中で酵素ＢａｍＨＩ(Boehringer)１Ｕ
で消化した。反応を３７℃で１時間行った後、６５℃で
１０分間不活性化した。
coli およびB. subtilis のそれぞれの培養物の一部を
回収して、Ｏ．Ｄ．600 について規格化した。Ｏ．Ｄ．
600 ＝３．０で培養物１．５ｍｌと同等なものから、プ
ラスミドＤＮＡをアルカリリーシスにより抽出した後
（Sambrook et al., Molecular Cloning:a laboratory
manual, 1989)、QIAGENＲ型２０本のカラム(Promega)
上で精製した。得られたＤＮＡを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ ｐＨ８．０、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ β−メルカプトエタノールを含
む緩衝液１０μｌ中で酵素ＢａｍＨＩ(Boehringer)１Ｕ
で消化した。反応を３７℃で１時間行った後、６５℃で
１０分間不活性化した。
【００４７】消化したプラスミドを寒天ゲル上に仕込
み、９０Ｖ、９０ｍＡで２時間泳動し、ゲルを臭化エチ
ジウム１ｍｇ／ｍｌで着色した後、トランスイルミネー
ター上でＵＶ光線で可視化した。図３Ａおよび図３Ｂに
示されるように、制限酵素ＢａｍＨＩで切断すると、多
数の世代の液体培養を行った後でも約４３００ｂｐおよ
び２３００ｂｐの予想されたバンドを生じ、ｐＳＭ６７
１がE. coli およびB. subtilis のいずれにおいても構
造的に安定であることを示している。
み、９０Ｖ、９０ｍＡで２時間泳動し、ゲルを臭化エチ
ジウム１ｍｇ／ｍｌで着色した後、トランスイルミネー
ター上でＵＶ光線で可視化した。図３Ａおよび図３Ｂに
示されるように、制限酵素ＢａｍＨＩで切断すると、多
数の世代の液体培養を行った後でも約４３００ｂｐおよ
び２３００ｂｐの予想されたバンドを生じ、ｐＳＭ６７
１がE. coli およびB. subtilis のいずれにおいても構
造的に安定であることを示している。
【００４８】実施例３ B. subtilis における組換えタンパク質の発現 このベクターの発現能力を立証するため、Agrobacteriu
m radiobacter カルバミラーゼ、組換え抗ヒト絨毛膜α
−ゴナドトロピン一本鎖抗体（ｈＧＨ）、インターロイ
キン−１β（ＩＬ−１β）およびＩＬ−１βの天然の拮
抗物質（ＩＬ−１ｒα）をコード化する遺伝子を、ｐＳ
Ｍ６７１の制限部位ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩまたは
ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩでクローニングした。得られた組
換えベクターを用いてB. subtilis SMS003の細胞を形質
転換した。次に、実施例１に記載した方法で選別したＣ
ｍｒ形質転換体を、クロラムフェニコール５μｇ／ｍｌ
を加えたＶＹ培地１０ｍｌ中で培養した。フラスコを攪
拌下（２００ｒｐｍ）にて、３７℃で１６時間インキュ
ベーションした。
m radiobacter カルバミラーゼ、組換え抗ヒト絨毛膜α
−ゴナドトロピン一本鎖抗体（ｈＧＨ）、インターロイ
キン−１β（ＩＬ−１β）およびＩＬ−１βの天然の拮
抗物質（ＩＬ−１ｒα）をコード化する遺伝子を、ｐＳ
Ｍ６７１の制限部位ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩまたは
ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩでクローニングした。得られた組
換えベクターを用いてB. subtilis SMS003の細胞を形質
転換した。次に、実施例１に記載した方法で選別したＣ
ｍｒ形質転換体を、クロラムフェニコール５μｇ／ｍｌ
を加えたＶＹ培地１０ｍｌ中で培養した。フラスコを攪
拌下（２００ｒｐｍ）にて、３７℃で１６時間インキュ
ベーションした。
【００４９】それぞれの形質転換体について培養物１ｍ
ｌを遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、４℃で２分間、ミ
クロ遠心分離機中）によって回収した。細胞を２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、２ｍＭ ＥＤＴＡ
１ｍｌで洗浄した後、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ
７．２、１５％スクロース、１〜２ｍｇ／ｍｌのリゾチ
ームをふくむもの１５０ｍｌに再懸濁した。次に、「SA
MPLE BUFFER 2x) （１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐ
Ｈ６．８、２０％グリセロール、４％ドデシル硫酸ナト
リウム（ＳＤＳ）、４％β−メルカプトエタノール、
０．０２％ブロモフェノールブルー（ＢＢＦ））を細胞
懸濁液に加えた。試料を５分間煮沸した後、抽出物２０
ｍｌ（培養物６７ｍｌに等しい）をポリアクリルアミド
ゲルに充填して１２．５％とし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（La
emmli, U.K. (1970) Nature, 227:680）によって３０ｍ
Ａで３時間分離した。
ｌを遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、４℃で２分間、ミ
クロ遠心分離機中）によって回収した。細胞を２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、２ｍＭ ＥＤＴＡ
１ｍｌで洗浄した後、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ
７．２、１５％スクロース、１〜２ｍｇ／ｍｌのリゾチ
ームをふくむもの１５０ｍｌに再懸濁した。次に、「SA
MPLE BUFFER 2x) （１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐ
Ｈ６．８、２０％グリセロール、４％ドデシル硫酸ナト
リウム（ＳＤＳ）、４％β−メルカプトエタノール、
０．０２％ブロモフェノールブルー（ＢＢＦ））を細胞
懸濁液に加えた。試料を５分間煮沸した後、抽出物２０
ｍｌ（培養物６７ｍｌに等しい）をポリアクリルアミド
ゲルに充填して１２．５％とし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（La
emmli, U.K. (1970) Nature, 227:680）によって３０ｍ
Ａで３時間分離した。
【００５０】電気泳動の後、ゲルをコマシーブリリアン
トブルーＲ２５０で着色することにより、目的のタンパ
ク質の発現を図４に示すようにして立証した。
トブルーＲ２５０で着色することにより、目的のタンパ
ク質の発現を図４に示すようにして立証した。
【００５１】
配列番号：１ 配列の長さ： ４９塩基対 配列の型： 核酸 鎖の状態：一本鎖 トポロジー：線状 配列の種類：ＤＮＡ 配列の特徴： 特徴を表す記号：プロモーター 配列 CTAGAAAAAT TTATTTGCTT TCAGGAAAAT TTTTTATGTA TAATAGATT 49
【００５２】配列番号：２ 配列の長さ： １２５塩基対 配列の型： 核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：線状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 CTAGAAAAAT TTATTTGCTT TCAGGAAAAT TTTTTATGTA TAATAGATTC ATAAATTTGA 60 GAGCTCAAAG GAGGAATTCG AGCTCGGTAC CCGGGGATCC TCTAGAGTCG ACCTGCAGGC 120 ATGCA 125
【図１】図１ＡはプラスミドｐＳＭ１４３の制限地図
を、図１ＢはプラスミドｐＳＭ２１３の制限地図を示
す。
を、図１ＢはプラスミドｐＳＭ２１３の制限地図を示
す。
【図２】プラスミドｐＳＭ６７１の制限地図を示す。
【図３】図３Ａは、E. coli 71/18 の３種類のクローン
を１６時間培養した後に抽出し、制限酵素ＢａｍＨＩで
切断したプラスミドＤＮＡの電気泳動分析の結果を示す
写真であり、 １〜１４）１Ｋｂ ＤＮＡラダー；２〜４）クローン
１、２および３：前培養；５〜７）クローン１、２およ
び３：Ｉ培養；８〜１０）クローン１、２および３：Ｉ
Ｉ培養；１１〜１３）クローン１、２および３：ＩＩＩ
培養。図３Ｂは、B. subtilis SMS003の３種類のクロー
ンを１６時間培養した後に抽出し、制限酵素ＢａｍＨＩ
で切断したプラスミドＤＮＡ、 １〜１４）１Ｋｂ ＤＮＡラダー；２〜４）クローン
１、２および３：前培養；５〜７）クローン１、２およ
び３：Ｉ培養；８〜１０）クローン１、２および３：Ｉ
Ｉ培養；１１〜１３）クローン１、２および３：ＩＩＩ
培養。
を１６時間培養した後に抽出し、制限酵素ＢａｍＨＩで
切断したプラスミドＤＮＡの電気泳動分析の結果を示す
写真であり、 １〜１４）１Ｋｂ ＤＮＡラダー；２〜４）クローン
１、２および３：前培養；５〜７）クローン１、２およ
び３：Ｉ培養；８〜１０）クローン１、２および３：Ｉ
Ｉ培養；１１〜１３）クローン１、２および３：ＩＩＩ
培養。図３Ｂは、B. subtilis SMS003の３種類のクロー
ンを１６時間培養した後に抽出し、制限酵素ＢａｍＨＩ
で切断したプラスミドＤＮＡ、 １〜１４）１Ｋｂ ＤＮＡラダー；２〜４）クローン
１、２および３：前培養；５〜７）クローン１、２およ
び３：Ｉ培養；８〜１０）クローン１、２および３：Ｉ
Ｉ培養；１１〜１３）クローン１、２および３：ＩＩＩ
培養。
【図４】様々な異臭タンパク質をコード化する遺伝子を
含むｐＳＭ６７１で形質転換したB. subtilis SMS003か
ら抽出した総タンパク質の電気泳動分析の結果を示す写
真であり、図４Ａは、ｐＳＭ６７１＋A. radiobacterの
カルバミラーゼの遺伝子： （１） 精製したカルバミラーゼ、（２） ＳＭＳ００
３（ｐＳＭ６７１／カルバミラーゼ）、図４Ｂは、ｐＳ
Ｍ６７１＋組換え抗αｈＣＧ ＳｃＦｖ抗体の遺伝子： （１） 精製した抗αｈＣＧ ＳｃＦｖ、（２） ＳＭ
Ｓ００３（ｐＳＭ６７１）、（３） ＳＭＳ００３（ｐ
ＳＭ６７１／抗αｈＣＧ Ｓ ｃＦｖ）、図４Ｃは、ｐ
ＳＭ６７１＋ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）： （１） ＳＭＳ００３（ｐＳＭ６７１）、（２） 精製
したｈＧＨ、（３） ＳＭＳ００３（ｐＳＭ６７１／ｈ
ＧＨ）、図４Ｄは、ｐＳＭ６７１＋インターロイキン−
１β（ＩＬ−１β）の遺伝子： （１） ＳＭＳ００３（ｐＳＭ６７１）、（２） 標準
分子量、（３） 精製したＩＬ−１β、（４） ＳＭＳ
００３（ｐＳＭ６７１／ＩＬ−１β）、図４Ｅは、ｐＳ
Ｍ６７１＋ＩＬ−１βの天然の拮抗物質（ＩＬ−１ｒ
α）の遺伝子： （１） ＳＭＳ００３（ｐＳＭ６７１）、（２） ＳＭ
Ｓ００３（ｐＳＭ６７１／ＩＬ−１ｒα）、目的のタン
パク質は矢印で示す。
含むｐＳＭ６７１で形質転換したB. subtilis SMS003か
ら抽出した総タンパク質の電気泳動分析の結果を示す写
真であり、図４Ａは、ｐＳＭ６７１＋A. radiobacterの
カルバミラーゼの遺伝子： （１） 精製したカルバミラーゼ、（２） ＳＭＳ００
３（ｐＳＭ６７１／カルバミラーゼ）、図４Ｂは、ｐＳ
Ｍ６７１＋組換え抗αｈＣＧ ＳｃＦｖ抗体の遺伝子： （１） 精製した抗αｈＣＧ ＳｃＦｖ、（２） ＳＭ
Ｓ００３（ｐＳＭ６７１）、（３） ＳＭＳ００３（ｐ
ＳＭ６７１／抗αｈＣＧ Ｓ ｃＦｖ）、図４Ｃは、ｐ
ＳＭ６７１＋ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）： （１） ＳＭＳ００３（ｐＳＭ６７１）、（２） 精製
したｈＧＨ、（３） ＳＭＳ００３（ｐＳＭ６７１／ｈ
ＧＨ）、図４Ｄは、ｐＳＭ６７１＋インターロイキン−
１β（ＩＬ−１β）の遺伝子： （１） ＳＭＳ００３（ｐＳＭ６７１）、（２） 標準
分子量、（３） 精製したＩＬ−１β、（４） ＳＭＳ
００３（ｐＳＭ６７１／ＩＬ−１β）、図４Ｅは、ｐＳ
Ｍ６７１＋ＩＬ−１βの天然の拮抗物質（ＩＬ−１ｒ
α）の遺伝子： （１） ＳＭＳ００３（ｐＳＭ６７１）、（２） ＳＭ
Ｓ００３（ｐＳＭ６７１／ＩＬ−１ｒα）、目的のタン
パク質は矢印で示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:25）
Claims (5)
- 【請求項１】Escherichia coliおよびBacillus subtili
s 中で安定なプラスミドベクターであって、異種遺伝子
を制御しながら高発現させることができる合成プロモー
ターを含んでなり、Centraalbureau Voor Schimmelcult
ure に寄託され、寄託番号ＣＢＳ ２０５．９４であ
る、プラスミドベクター。 - 【請求項２】異種遺伝子が、ヒダントイナーゼ、カルバ
ミラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、もしくは
イソアミラーゼである酵素から選択される原核性ポリペ
プチド、またはインターロイキン、インターフェロン、
ホルモン、もしくは組換え抗体から選択される真核性ポ
リペプチドをコードするものであることを特徴とする、
請求項１に記載のプラスミドベクター。 - 【請求項３】請求項１のプラスミドベクターで形質転換
されたEscherichia coliおよびBacillus subtilis から
選択される、微生物。 - 【請求項４】Escherichia coli SMC309 CBS 205.94であ
る、請求項３に記載の微生物。 - 【請求項５】異種タンパク質の製造法であって、請求項
１に記載のプラスミドベクターで形質転換したBacillus
subtilis および／またはEscherichia coliの菌株を用
いることを特徴とする、方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ITMI940727A IT1274168B (it) | 1994-04-15 | 1994-04-15 | Vettore plasmidico e suo impiego per la produzione di proteine eterologhe |
| IT94A000727 | 1994-04-15 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07289271A true JPH07289271A (ja) | 1995-11-07 |
Family
ID=11368613
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7115212A Pending JPH07289271A (ja) | 1994-04-15 | 1995-04-17 | プラスミドベクターおよび異種タンパク質を製造するためのその使用 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5721137A (ja) |
| EP (1) | EP0681027A3 (ja) |
| JP (1) | JPH07289271A (ja) |
| IT (1) | IT1274168B (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6770475B1 (en) * | 1999-03-08 | 2004-08-03 | Showa Sangyo Co., Ltd. | Promoters |
| US8232081B2 (en) * | 1999-09-21 | 2012-07-31 | Basf Se | Methods and microorganisms for production of panto-compounds |
| ATE510908T1 (de) | 2000-09-28 | 2011-06-15 | Bioriginal Food & Science Corp | Fad5-2, mitglied der desaturase-familie und verwendungen davon |
| EP2285967B1 (en) | 2008-06-03 | 2016-12-21 | BASF Plant Science GmbH | Fatty acid dehydratases and uses thereof |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IT1208514B (it) * | 1985-03-19 | 1989-07-10 | Eniricerche Spa | Vettori plasmidici ad espressione in escherichia coli e/o bacillussubtilis. |
| ES2061524T3 (es) * | 1986-05-07 | 1994-12-16 | Eniricerche Spa | Un vector plasmidico para la expresion en bacillus y empleado para la clonacion del gen estructural que codifica la hormona de crecimiento humana y un metodo para la produccion de la hormona. |
| IT1202612B (it) * | 1987-03-03 | 1989-02-09 | Eniricerche Spa | Plasmidi ricombinanti utili per l'espressione in bacillus di proteine eterologhe |
| IT1269321B (it) * | 1994-04-15 | 1997-03-26 | Eniricerche Spa | Mutanti stabili della d-n- -carbamilasi |
-
1994
- 1994-04-15 IT ITMI940727A patent/IT1274168B/it active IP Right Grant
-
1995
- 1995-03-01 EP EP95102876A patent/EP0681027A3/en not_active Withdrawn
- 1995-03-08 US US08/400,864 patent/US5721137A/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-04-17 JP JP7115212A patent/JPH07289271A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0681027A3 (en) | 1999-06-30 |
| EP0681027A2 (en) | 1995-11-08 |
| ITMI940727A1 (it) | 1995-10-15 |
| ITMI940727A0 (it) | 1994-04-15 |
| IT1274168B (it) | 1997-07-15 |
| US5721137A (en) | 1998-02-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU567031B2 (en) | Glucoamylase cdna | |
| US4663280A (en) | Expression and secretion vectors and method of constructing vectors | |
| US4792523A (en) | 3'Expression enhancing fragments and method | |
| EP0073657A1 (en) | Preparation of hepatitis B surface antigen in yeast | |
| US5559007A (en) | Bacterial shuttle vectors | |
| Kovacevic et al. | Secretion of staphylococcal nuclease by Bacillus subtilis | |
| US4987078A (en) | Plasmid vectors for expression in Escherichia coli and/or Bacillus subtilis | |
| US4803164A (en) | Preparation of hepatitis b surface antigen in yeast | |
| US5015574A (en) | DNA sequence involved in gene expression and protein secretion, expression-secretion vector including the DNA sequence and the method of producing proteins by using the expression-secretion vector | |
| JPH07289271A (ja) | プラスミドベクターおよび異種タンパク質を製造するためのその使用 | |
| JPH0576375A (ja) | 改良された酵母ベクター | |
| EP0179786B1 (en) | High copy number expression vectors | |
| EP0196375A1 (en) | Gene coding for signal peptides and utilization thereof | |
| US4585739A (en) | Plasmid for foreign gene expression in B. subtilis | |
| CA1275954C (en) | 3'-expression enhancing fragments and method | |
| JPH05284973A (ja) | 組換プラスミドおよびこれをベクターとして用いる異種蛋白質の分泌生産方法 | |
| RU1660388C (ru) | Рекомбинантная плазмидная днк pvgib, кодирующая гамма-интерферон быка, способ ее получения и штамм дрожжей saccharomyces cerevisiae - продуцент гамма-интерферона быка | |
| Ohnishi et al. | Cloning of a 1.1‐kb Fragment Including srnB+ Gene in the F Plasmid and Isolation of an srnB Mutant | |
| EP0493926A1 (en) | A method for enhancing the structural stability of recombinant DNA expression vectors | |
| US5576190A (en) | Bacteriophage Lambda pL promoters | |
| US4757021A (en) | Recombinant plasmid and microbial strain transformed by said plasmid | |
| JP3520322B2 (ja) | 低温細菌由来の新規なプラスミドｐＰＳ１Ｍ２及びその誘導体 | |
| EP0471514A2 (en) | Improved bacteriophage lambda pL promoters | |
| JPH0665307B2 (ja) | バチルスズブチリスのグルコン酸オペロンおよびプロモ−タ− | |
| RU1770359C (ru) | Рекомбинантна плазмидна ДНК pJDB (MSIL), обеспечивающа синтез интерлейкина-2 человека в клетках дрожжей SасснаRомUсеS ceReUISIaL, способ ее получени и штамм дрожжей SасснаRомYсеS ceReUISIaL - продуцент интерлейкина-2 человека |