ITMI940727A1 - Vettore plasmidico e suo impiego per la produzione di proteine eterologhe - Google Patents
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Description
Descrizione
La presente invenzione riguarda un vettore plasmidico, microorganismi trasformati con detto vettore e loro impiego per la preparazione di proteine eterologhe.
Più in particolare, la presente invenzione riguarda un vettore plasmidico stabile in Escherichia coli e/o Bacillus subtilis, comprendente un promotore sintetico capace di dirigere con elevata efficienza l'espressione di un gene eterologo posto sotto il suo controllo.
E' noto nella tecnica preparare proteine mediante procedimenti di fermentazione che utilizzano particolari sistemi di produzione, dove con questo termine si intende la combinazione di un vettore ad espressione contenente il gene che codifica per la proteina e dell'ospite che lo contiene .
Da un punto di vista industriale, un sistema di produzione ideale dovrebbe consentire la preparazione di un prodotto ricombinante facilmente purificabile, in rese elevate, con una attività biologica identica a quella della proteina naturale ed a costi economicamente interessanti.
Un tale sistema dovrebbe essere costituito da: 1) un vettore che contenga degli elementi di regolazione (promotore, RBS e terminatore) forti, cioè in grado di dirigere una efficiente espressione di un gene eterologo; che sia presente nelle cellule in copie multiple e che sia mantenuto stabilmente all'interno delle cellule in modo da consentire una elevata produzione del prodotto di interesse; ed
2) un ospite che esegua correttamente le istruzioni fornite per il gene eterologo così da consentire l'ottenimento di una prodotto identico a quello naturale; che sia adatto per una coltura in scala commerciale, cioè resistente, capace di moltiplicarsi a densità elevate e poco esigente per quanto riguarda la richiesta di elementi nutritivi .
E' stato ora trovato che tali esigenze della tecnica nota possono essere soddisfatte mediante il vettore plasmidico della presente invenzione.
In accordo con ciò, secondo un primo aspetto, la presente invenzione riguarda un vettore plasmidico stabile in Escherichia coli e Bacillus subtilis caratterizzato .dal fatto di contenere un promotore sintetico in grado di dirigere con elevata efficienza l'espressione di un gene eterologo.
Costituisce inoltre uno scopo della presente invenzione un microorganismo scelto tra Escherichia coli o Bacillus subtilis trasformato con detto vettore plasmidico.
Costituisce ancora uno scopo della presente invenzione un procedimento per la produzione di una proteina eterologa di interesse mediante la fermentazione di un microorganismo scelto tra Escherlchia coli o Bacillus subtilis trasformato con detto vettore plasmidico.
In particolare, il vettore plasmidico secondo la presente invenzione comprende:
1. le origini di replicazione funzionali in B. subtilis ed E coli;
2. i geni che codificano per la selezione dei ceppi trasformati con detto vettore plasmidico; 3. un promotore sintetico avente la sequenza
4. un sito di riconoscimento ribosomale;
5. un sito di clonaggio multiplo a valle del promotore utile per l'inserimento di geni eterologhi ,
6. il terminatore tg del fago lambda.
Il vettore plasmidico, indicato qui di seguito pSM671, secondo la presente invenzione viene ottenuto mediante un procedimento che comprende :
(a) il sintetizzare un polinucleotide comprendente il promotore sintetico avente la sequenza sopra riportata, il sito di legame deil'mRNA al ribosoma (RBS) ed il sito di clonaggio multiplo (MCS) del plasmide pUC18;
(b) l’isolare dal plasmide pSM143 il frammento Hindi II-XbaI di circa 5700 bp contenente le origini di replicazione funzionanti in E.coli e B.subtilis ed il gene della resistenza alla Kanamicina;
(c) il ligare il polinucleotide al frammento ottenuto nello stadio (b) ed isolare il plasmide PSM143-A;
(d) l'introdurre a valle del sito di clonaggio multiplo del plasmide pSM143-A un frammento di circa 1000 bp contenente il gene Cat (cloramfenicolo acetil transferasi) ed il terminatore
sintetico tQ del fago lambda; ed infine
(e) l'isolare il vettore plasmidico pSM671 mediante selezione di cellule di E.coli trasformate con la miscela di ligasi ottenuta nello stadio d).
Il polinucleotide secondo la presente invenzione ha la sequenza
Detto polinucleotide, che comprende dei siti di restrizione utili per il legame con il frammento isolato da pSM143 (ATCC 53038), è stato sintetizzato utilizzando una apparecchiarura commerciale operando secondo metodiche convenzionali.
Il vettore pSMl,43 è stato digerito con gli enzimi di restrizione.HindiII e XbaI ottenendo due frammenti, rispettivamente di circa 5700 bp e di 1650 bp, quest'ultimo contenente la regione promotore della resistenza all'eritromicina di pE194 ed il gene Bla che conferisce la resistenza all 'AmpiciLLina.
Il frammento di 5700 bp, contenente le origini di replicazione funzionanti in E.coli e B. subtilis ed il gene per la resistenza alla Kanamicina, è stato quindi purificato e ligato al polinucleotide sintetico avente la sequenza sopra riportata in condizioni tali da facilitare la condensazione di un singolo frammento a ciascuna molecola del polinucleotide. La reazione di ligazione è stata effettuata secondo tecniche convenzionali in presenza dell'enzima T4 DNA ligasi . La miscela di ligasi è stata utilizzata per trasformare cellule di E.coli rese competenti come riportato ad esempio da Dagert, M. e Ehrlich (Gene (1979), 6:23).
Da una delle colonie positive selezionate su terreno contenente Kanamicina è stato estratto il DNA plasmidico e sequenziato secondo la metodica di Sanger F. et al. (Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1977), 74: 5463).
E' stato così possibile verificare l'esatto inserimento nel pSM143 del frammento sintetico, al posto della regione che comprendeva il promotore della resistenza all'eritromicina ed il gene Bla. Il nuovo plasmide è stato denominato pSM143-A.
Quindi il frammento di DNA di circa 1000 bp, contenente il gene Cat, che conferisce la resistenza al Cloramfeniolo, privo del proprio promotore ed il terminatore to del fago lambda, è stato isolato dal plasmide pSM213 descritto nel brevetto Italia No 19.551 A/87. Tale frammento è stato ligato al plasmide pSM143-A digerito con gli enzimi di restrizione Xhol e HindlII. La miscela di ligasi è stata utilizzata per trasformare cellule di E.coli rese competenti come riportato ad esempio da Dagert, M. e Ehrlich (Gene (1979), 6:23).
Da una delle colonie positive (Km<r >Cm<r>) selezionate su terreno contenente Kanamicina e Cloramfenicolo è stato estratto un plasmide che all'analisi di sequenza mostrava le caratteristiche attese, ossia la presenza del promotore sintetico, del sito RBS, del sito di clonaggio multiplo di puC18, del gene Cat, del terminatore tg di lambda e della doppia resistenza agli antibiotici Kanamicina e Cloramfenicolo.
Questo plasmide.è stato denominato pSM671.
La stabilità segregazionale e strutturale del vettore pSM671 in E.coli e B.subtilis è stata determinata operando come riportato nell'esempio 2. I risultati hanno evidenziato che il plasmide viene mantenuto in più del 95 % della popolazione cellulare anche dopo successivi passaggi in coltura, dimostrando così una notevole stabilità segregazionale .
Inoltre l'analisi dei plasmidi isolati dai ceppi trasformati ha evidenziato che anche dopo diverse generazioni in coltura liquida detto plasmide si mantiene strutturalmente stabile sia in E. coli che in B. subtilis.
Il vettore plasmidico pSM671 secondo la presente invenzione può essere utilizzato per l'espressione di geni che codificano per un polipeptide procariotico quale, ad esempio, un enzima come idantoinasi, carbamilasi, a-amilasi, β-amilasi, isoamilasi, o per un polipeptide eucariotico scelto ad esempio tra interleuchina, antagonista naturale di IL-1(5, ormone della crescita, interferone, anticorpi ricombinanti, etc. .
La capacità del promotore di dirigere una elevata espressione del gene eterologo posto a valle è stata verificata mediante inserimento nel sito di clonaggio multiplo (MCS) di geni che codificano per diverse proteine quali: carbamilasi, un anticorpo ricombinante a singola catena, ormone della crescita umano (hGH),
interleuchina-lfi (IL-Ιβ) ed antagonista naturale di IL-Ιβ (IL-lro). Sono stati quindi coltivati ceppi di B.subtilis ed E.coli trasformati con dette molecole di DNA ricombinanate. I risultati hanno evidenziato la presenza di queste proteine eterologhe che vengono espresse nei due microorganismi in elevata quantità (> 5% delle proteine totali).
Il vettore plasmidico pSM671 è stato depositato presso il Centraalbureau Voor Schimmelcultures come Escherichia coli SMC309 dove ha ricevuto il numero CBS 205.94.
DESCRIZIONE DELLE FIGURE
Figura 1
A) Mappa di restrizione del plasmide pSM143.
B) Mappa di restrizione del plamide pSM213.
Figura 2
Mappa di restrizione del plasmide pSM671.
Figura 3
A) DNA plasmidico estratto, dopo 16 ore di coltura, da 3 cloni di E. coli 71/18 e tagliato con l'enzima di restrizione BamHI.
1-14) 1 Kb DNA ladder; 2-4) cloni 1, 2 e 3: precoltura; 5-7) cloni 1, 2 e 3: I coltura; 8-10) cloni 1, 2, e 3: II coltura; 11-13) cloni 1, 2 e 3: III coltura.
B) DNA plasmidico estratto, dopo 16 ore di coltura, da 3 cloni di B. subtilis SMS003 e tagliato con l'enzima di restrizione BamHI.
1-14) 1 Kb DNA ladder; 2-4) cloni 1, 2 e 3: precoltura; 5-7) cloni 1, 2 e 3: I coltura; 8-10) cloni 1, 2, e 3: II coltura; 11-13) cloni 1, 2 e 3: III coltura.
Figura 4
Analisi elettroforetica delle proteine totali estratte da B. subtilis SMS003 trasformato con pSM671 contenente geni codificanti per diverse proteine eterologhe.
A) pSM671 gene della carbamilasi di A. radiobacter . (1) carbamilasi purificata, (2) SMS003 (pSM671/carbamilasi).
B) pSM671 gene dell'anticorpo ricombinante ScFv anti a hCG. (1) ScFv anti a hCG purificato, (2) SMS003 (pSM671), (3) SMS003. (pSM671/ScFv anti a hCG) .
C) pSM671 gene dell'ormone della crescita umano (hGH). (1) SMS003 (pSM671), {2) hGH purificato, (3) SMS003 (pSM671/hGH).
D) pSM671 gene dell'interleuchina-ΐβ (IL-1P). (1) SMS003 (pSM671), (2) standard di pesi molecolari, (3) IL-Ιβ purificata, (4) SMS003 (pSM671/Il-lp).
E) pSM671 gene dell'antagonista naturale di IL-13 (IL-lra). (1) SMS003 (pSM671), (2) SMS003 (pSM671/Il-lra), la proteina di interesse è indicata dalla freccia.
Gli esempi sperimentali che seguono hanno lo scopo di illustrare meglio la presente invenzione senza volerla limitare.
Esempio 1
Costruzione del vettore di clonaggio pSM671
A) Inserimento in pSM143 di un promotore sintetico e del sito di clonaggio multiplo di pUC18.
1 μg del plasmide pSM143 (ATCC 53038) (figura 1A) è stato risospeso in 20 μΐ di soluzione tampone contenente 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 5 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 1 mM β-mercaptoetanolo, 2 U di ciascuno degli enzimi di restrizione XbaI e
HindlII (Boehringer). La reazione è stata condotta a 37°C per 1 ora e quindi inattivata a 65°C per 10 minuti .
Operando in tale modo si sono ottenuti due frammenti, rispettivamente di circa 5700 bp e di 1650 bp, quest'ultimo contenente la regione promotore della resistenza all 'eritromicina di pE194 ed il gene Bla che conferisce la resistenza all 'Ampiciliina. Il frammento di 5700 bp è stato purificato per elettroeluizione su gel di agarosio allo 0,8% {Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 1989). Parallelamente è stato sintetizzato un polinucleotide la cui sequenza viene di seguito riportata:
una sequenza che funge da promotore forte, in grado di dirigere con elevata efficienza la trascrizione dell'RNA messaggero, (ii) il sito di legame dell'mRNA al ribosoma (RBS) ed il sito di clonaggio multiplo (MCS) del plasmide pUC18 (Boehringer).
10 ng del frammento XbaI-HindiII di 5700 bp e 10 ng del polinucleotide sintetico sono stati sospesi in 20 μΐ di soluzione tampone contenente 66 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mM MgCl2, 1 mM ditiotreitolo (DTT), 1 mM ATP e legati i presenza di 0,1 U di T4 DNA ligasi a 16°C per 18 ore.
Cellule di E.coli HB101 (BRL), rese competenti secondo la procedura descritta da Mandel e Higa (1970),(J. Mol. Biol., 53:159-162) sono state trasformate con 2 μΐ della miscela di ligazione ed i trasformanti sono stati selezionati su piastre di LB agar (Bacto Triptone 10 g/1, yeast extract 5 g/1, NaCl 10 g/1, 16 g/1 agar) contenenti 5 pg/ml di Kanamicina.
Da una colonia Km è stato estratto il DNA plasmidico e sequenziato secondo la metodica di Sanger F. et al.(1977) (Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 74: 5463)
E' stato così possibile verificare l'esatto inserimento in pSM143 del polinucleotide sintetico, al posto della regione che comprendeva il promotore della resistenza all'eritromicina di pE194 ed il gene Bla. Il nuovo plasmide è stato denominato pSM143-A.
B) Inserimento del frammento di DNA di pSM213 contenente il gene CAT ed il terminatore sintetico tg lambda in pSM143-A.
10 μg del plasmide pSM213 (figura 1B), descritto nella domanda di brevetto Italia No 19.551 A/87, sono stati digeriti con 30 U dell'enzima BamHI (Boehringer) in 100 μΐ di soluzione tampone contenente 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 5 mM MgC^ , 100 mM NaCl, 1 mM β-mercaptoetanolo, a 37°C per 1 ora.
La reazione è stata inattivata estraendo la miscela di digestione con ugual volume di fenolocloroformio e cloroformio-alcol isoamilico; il DNA è stato quindi precipitato, separato e portato a secco sotto vuoto.
11 DNA così ottenuto è stato risospeso in 250 μΐ di soluzione tampone contenente 50 mM Tris-HCl pH 7,2, 10 mM MgS04, 0,1 mM DTT, 50 μg/ml BSA, 80 μΜ di dGTP, 80 μΜ di dATP e 10 U di DNA polimerasi Klenow. La miscela risultante è stata incubata a temperatura ambiente (20-25°C) per 30 minuti e quindi inattivata con EDTA 25 mM e le proteine estratte con fenolo-cloroformio e cloroformioalcol isoamilico.
Il DNA è stato precipitato dalla fase acquosa, separato per centrifugazione, seccato sotto vuoto ed infine risospeso in 200 μΐ di soluzione tampone contenente 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM NaCl, 5 mM MgCl 21 mM 0-mercaptoetanolo e 20 U dell'enzima di restrizione HindlII (Boehringer). La reazione di digestione è stata condotta a 37°C per 1 ora e successivamente inattivata a 65°C per 10 minuti.
L'intera miscela di digestione è stata quindi caricata su gel di poliacrilammide al 6% e corsa a 120 Volt per 3 ore. Il frammento di DNA corrispondente alla banda di circa 1000 bp, contenente 11 gene Cat privo del proprio promotore ed il terminatore tQ del fago lambda, è stato elettroeluito come descritto da Maxam e Gilbert (Methods in Enzymology (1980), voi. 65, 499-560).
Parallelamente, 10 μg di pSM143-A sono stati digeriti con 30 U dell'enzima di restrizione Xhol (Boehringer) in 100 μΐ di soluzione tampone contenente 50 mM Tris-HCl pH 7;52, 10 mM MgCl 2 100 mM NaCl, 1 mM DTT, a 37°C per 1 ora. Dopo inattivazione della reazione a 65°C per 10 minuti, il DNA è stato precipitato, separato e quindi risospeso in 250 μl di soluzione tampone contenente 50 mM Tris-HCl pH 7,2, 10 mM MgSO4, 0,1 mM DTT, 50 Mg/ml BSA, 80 μΜ di dGTP, 80 μΜ di dATP e 10 U di DNA polimerasi Klenow. La miscela risultante è stata incubata a temperatura ambiente (20-25°C) per 30 minuti e quindi inattivata con EDTA 25 mM e le proteine estratte con fenolo-cloroformio e cloroformio-alcol isoamilico. Il DNA è stato precipitato dalla -fase acquosa, separato per centrifugazione, seccato sotto vuoto ed infine risospeso in 200 μΐ di soluzione tampone contenente 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM NaCl, 5 mM MgCl 2 1 mM 3-mercaptoetanolo e 20 U dell'enzima di restrizione HindiII. La reazione di digestione è stata condotta a 37°C per 1 e successivamente inattivata a 65°C per 10 minuti.
Si sono così ottenuti due frammenti di DNA, rispettivamente di circa 5600 bp e di 250 bp, quest'ultimo contenente il terminatore del fago fd; il frammento di 5600 bp è stato purificato per elettroeluizione su gel di agarosio allo 0,8%.
2 μg di detto frammento sono stati ligati con 1 μ9 del frammento di 1000 bp derivato da pSM213. La reazione è stata condotta in 100 μl di soluzione tampone contenente 66 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mM MgCl2, 1 mM ditiotreitolo (DTT), 1 mM ATP e legati i presenza di 2,0 U di T4 DNA ligasi a 16°C per 18 ore.
Cellule competenti di E.coli 71/18 (Messing, J.B. et al.(1977) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 74: 3642) sono state trasformate con aliquote diverse della miscela di ligazione ed i trasformanti sono stati selezionati su piastre di LB agar contenenti 5 μg/ml di Kanamicina e 20 μg/ml di Cloramfenicolo .
Da una colonia KmIT Cmr è stato isolato, mediante procedura rapida, un plasmide di cui è stata definita la mappa di restrizione.
L'analisi di sequenza di detto plasmide ha evidenziato le caratteristiche attese, ossia la presenza del promotore sintetico, del sito RBS, del sito di clonaggio multiplo di puC18, del gene Cat, del terminatore to di lambda e della doppia resistenza agli antibiotici kanamicina e Cloramfenicolo. Detto plasmide è stato denominato pSM671 (figura 2). Il clone di E.coli contenente detto plasmide è stato contrassegnato con la sigla SMC309 .
Il plasmide pSM671 è stato quindi impiegato per trasformare cellule di B. subtilis SMS003 NRLLB 15897, rese competenti come descritto da Contenete e Dubnau, (1979), (Mol. Gen. Genet., 167,
251-258). La selezione dei trasformanti è stata effettuata mediante piastramento su terreno Tryptose Blood Agar Base (TBAB) della DIFCO, contenente 5 μg/ml di Kanamicina e 5 μg/ml di Cloramf enicolo.
Esempio 2
Controllo della stabilità segregazionale e strutturale del vettore pSM671
A) Stabilità segregazionale.
Lo scopo di questo esperimento è quello di verificare la stabilità del plasmide pSM671 nei ceppi trasformati di E. coli e di B. subtilis dopo un prolungato periodo in coltura.
Tre cloni indipendenti di E. coli SMC309 sono stati fatti crescere a 37° C, 200 rpm per 16 ore in beute da 100 mi, contenenti 10 mi di terreno LB (Bacto Triptone 10 g/1, yeast extract 5 g/1, NaCl 10 g/1), contenente 20 mg/ml di Cloramfenicolo.
Parallelamente tre cloni indipendenti di B.subtilis SMS003, trasformati con pSM671, sono stati fatti crescere a 37° C, 200 rpm per 16 ore in beute da 100 mi, contenenti 10 mi di terreno VY (yeast extract 5 g/1, veal infusion broth 25 g/1), contenente 5 mg/ml di Cloramfenicolo.
Le tre colture di entrambi i microorganismi (0,1 mi) sono state utilizzate per inoculare ulteriori 10 mi dei medesimi terreni più antibiotico. Le nuove colture sono state fatte crescere a 37° C, 200 rpm per 16 ore e questa procedura è stata ripetuta per altre 2 volte; la crescita cellulare è stata seguita come incremento della densità ottica misurata a 600 nm (O.D.600).
Al termine dell'esperimento, aliquote delle colture sono state prelevate, opportunamente dilute e quindi piastrate sui seguenti terreni: - LB agar /- 20 mg/ml Cloramfenicolo (E.coli) - VY agar /- 5 mg/ml Cloramfenicolo (B.subtilis). Le piastre sono state incubate a 37° C per 16 ore e quindi si è proceduto al conteggio delle colonie colonie (CFU/ml) cresciute in assenza od in presenza dell'antibiotico. Si è potuto così determinare la percentuale di cellule che avevano mantenuto il plasmide ed erano perciò Cm<r>.
Come mostrato in tabella 1 (media di tre esperimenti ± SD) il plasmide viene mantenuto in più del 95 % della popolazione cellulare, dimostrando così una notevole stabilità segregazionale anche dopo successivi passaggi in coltura.
B) Stabilità strutturale.
Al termine di ogni singolo passaggio (16 ore di coltura) sono state raccolte aliquote di ognuna delle colture di E. coli e di B. subtilis e normalizzate per la 0. D·600. Dall’equivalente di 1.5 mi di coltura ad O.D.600 = 3.0, è stato estratto il DNA plasmidico, mediante lisi alcalina (Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual , 1989 ) e quindi purificato su colonnine QIAGENR Tip 20 (Promega). X DNA ottenuti sono stati digeriti con 1 U dell'enzima BamHI (Boehringer) in 10 μΐ di soluzione tampone contenente 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 5 mM MgCl2 , 100 mM NaCl, 1 mM β-mercaptoetanolo. La reazione è stata condotta a 37°C per 1 ora e successivamente inattivata a 65°C per 10 minuti.
I plasmidi digeriti sono stati caricati su gel di agarosio e corsi per 2 ore a 90 V, 90 mA; i gel sono stati colorati con Bromuro di Etidio 1 mg/ml e quindi visualizzati su un transilluminatore a luce UV. Come mostrato in figura 3A e 3B, il taglio con l'enzima di restrizione in BamHI produce le bande attese di circa 4300 e 2300 bp anche dopo diverse generazioni in coltura liquida, dimostrando che pSM671 si mantiene strutturalmente stabile sia in E. coli che in B. subtilis.
Esempio 3
Espressione di proteine ricombinanti in B.
subtilis.
Allo scopo di verificare la capacità di espressione di questo vettore, i geni che codificano per: la carbamilasi di Agrobacterium radiobacter , un anticorpo ricombinante a singola catena anti α-gonadotropina corionica umana (ScFv anti o-hCG), l'ormone della crescita umano (hGH), 1'interleuchina-ΐβ (IL-Ιβ) e l'antagonista naturale di IL-Ιβ (IL-lra) sono stati clonati nei siti di restrizione EcoRI/HindlII oppure EcoRI/PstI di pSM671. I vettori ricombinanti ottenuti sono stati utilizzati per trasformare cellule di B.subtilis SMS003 . I trasformanti Cm , selezionati come riportato nell'esempio 1, sono stati quindi coltivati in 10 mi di terreno VY addizionati con 5 μg/ml di d oramienicolo. Le beute sono state incubate, sotto agitazione (200 rpm), a 37°C per 16 ore.
1 mi di coltura per ogni trasformante è stato raccolto per centrifugazione (12000 rpm per 2 minuti a 4° C, in microcentrifuga). Le cellule sono state lavate con 1 mi di: 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 2 mM EDTA e quindi risospese in 150 mi di : 50 mM Tris-HCl pH 7,2, 15 % saccarosio, 1-2 mg/ml lisozima. I campioni sono stati incubati a 37° C per circa 10 minuti. Alla sospensione cellulare sono stati poi aggiunti 150 mi di "SAMPLE BUFFER 2x<n >(125 mM Tris-HCl pH 6,8, 20 % glicerolo, 4 % sodiododecilsolfato (SDS), 4 % 3-mercaptoetanolo, 0,02 % blu di bromofenolo (BBF)). I campioni sono stati bolliti per 5 minuti e quindi 20 mi degli estratti (pari a 67 mi di coltura) sono stati caricati su un gel di poliacrilammide al 12,5 % e separati mediante SDS-PAGE (Laemmli, U. K.(1970) Nature, 227: 680) per 3 ore a 30 mA.
Dopo la corsa elettroforetica i gel sono stati colorati con Comassie Brilliant Blue R250 ed è stata così verificata l’espressione delle proteine di interesse come illustrato in figura 4.
Claims (5)
- RIVENDICAZIONI 1. Vettore plasmidico stabile in Escherichia coli e Bacillus subtilis comprendente un promotore sintetico in grado di dirigere l'elevata espressione di un gene eterologo posto sotto il suo controllo depositato presso il Centraalbureau Voor Schimmelcultures dove ha ricevuto il numero CBS 205.94.
- 2. Il vettore plasmidico in accordo alla rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che il gene eterolgo codifica per un polipeptide procariotico scelto tra gli enzimi idantoinasi, carbamilasi, a-amilasi, β-amilasi, isoamilasi, o per un polipeptide eucariotico scelto tra interleuchina, interferone, ormoni, anticorpi ricombinanti.
- 3. Un microorganismo scelto tra Escherichia coli e Bacillus subtilis trasformato con il vettore plasmidico della rivendicazione 1.
- 4. Il microorgansimo in accordo alla rivendicazione 1, che è Escherichia coli SMC309 CBS 205.94.
- 5. Un metodo per la produzione di proteine eterologhe caratterizzato dal fatto di utilizzare un ceppo di Bacillus subtilis e/o Escherichia coli trasformato con il vettore plasmidico in accordo alla rivendicazione 1.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| TA | Fee payment date (situation as of event date), data collected since 19931001 |
Effective date: 19970415 |